WO1992005281A1 - Method of detecting mesitylene-cephem-resistant staphylococcus aureus - Google Patents

Method of detecting mesitylene-cephem-resistant staphylococcus aureus Download PDF

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WO1992005281A1
WO1992005281A1 PCT/JP1991/001225 JP9101225W WO9205281A1 WO 1992005281 A1 WO1992005281 A1 WO 1992005281A1 JP 9101225 W JP9101225 W JP 9101225W WO 9205281 A1 WO9205281 A1 WO 9205281A1
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WO
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probe
methicillin
staphylococcus aureus
resistant staphylococcus
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PCT/JP1991/001225
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Inventor
Keiichi Kamisango
Takeshi Yokota
Keiichi Hiramatsu
Original Assignee
Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria

Definitions

  • the present invention fights against a method for detecting methicillin / cephum-resistant Staphylococcus aureus and a reagent kit therefor.
  • Methicillin a ceph-resistant Staphylococcus aureus (inethici I 1 in-resistant S, aureus; hereinafter abbreviated as “MRSA”), is simply resistant to narrow-semi-synthetic penici 1 I in (PC). Rather than S. aureus, a narrow area that has been effective against mul tidru resistant S. aureus, which was feared as a cause of nosocomial and intractable infections in the 1950s Resistance to semi-synthetic PC and cefum antibiotics (CE CE) is added as a result of chromosomal alterations (Ken Yokota, Fanoremasia, Vol. 26, No. 3, 226). -230 0 990).
  • MRSA is infected in a patient who suffers from local or systemic burns with reduced protective ability, postoperatively, immunodeficiency, etc.
  • the disease shifts to deep infections such as sepsis, meningitis, pulmonary pulp, and brain abscess
  • deep infections such as sepsis, meningitis, pulmonary pulp, and brain abscess
  • the present inventors have conducted intensive research to develop a method that can detect MRSA more accurately and in a shorter time than the conventional method, and as a result, have decided to use the HPA method (hybridization protection assay). Therefore, they have found that it is possible to more specifically detect MRSA in less time than conventional detection methods, and based on this finding, completed the present invention.
  • the present invention provides the following via a linker arm represented by the general formula (I).
  • a linker arm represented by the general formula (I) We will fight against the method of detecting MRSII using a recognition probe labeled with an acridinium ester represented by the general formula (II). That is,
  • R represents an aliphatic hydrocarbon chain having 0 carbon atoms
  • R. 2 »— C — C 1 represents a protecting group for X
  • m represents an integer of 1 to 3 to obtain Ri R 2 Gato
  • R 2 is (R 2) omega - C one X, 1 or 2 or more carbon with O UNA electron withdrawing that protects the An atom, an oxygen atom, a nitrogen atom, or a halogen atom, or a combination thereof.
  • ⁇ represents 1 or 2.
  • X is a sulfur atom
  • ⁇ represents 1
  • X is an amino group
  • ⁇ represents 1 or 2.
  • X 2 represents a halogen atom or an amino group having a substituent
  • X 3 represents a halogen atom, an amino group or 10-
  • R 3 represents an optionally substituted lower alkyl group or lower alkoxy group.
  • R represents a lower alkyl group, a lower alkoxy group, or an aryloxy group, or R represents a hydrogen atom when X 3 is —0—.
  • R s is an optionally substituted lower alkyl group, lower alkenyl group or aryl group
  • R 6 and R 7 are the same or different and each represents a hydrogen atom, an amino group, a hydroxyl group, a thiol group, or a halogen atom.
  • atom a nitro group, Asechiru group, a lower alkyl group, a lower alkenyl group, Ariru group, a substituted Asechiru group, a substituted lower alkyl group, location ⁇ grade alkenyl group, a substituted Ariru group, a lower alkoxy group or Ariruokishi group
  • R 8 is
  • P represents an integer of 0 to 10.
  • the labeled probe labeled with the atherdymester shown in ⁇ is present in the gene DNA that regulates methicillin resistance in the MRSA in the sample or in the MRSA extracted and amplified from the sample.
  • Hybridized with a gene DNA that defines methicillin resistance, followed by a non-hybridized probe and a hybridized but having one or more base mismatches in the intersection A method for detecting MRSA comprising measuring the amount of chemiluminescence after selectively degrading the labeled part of the probe. It is.
  • the present invention also provides a hybridizer comprising a DNA amplification reagent, and a labeled probe labeled with an acridinium ester represented by the general formula (II) via a linker arm represented by the general formula (I).
  • the present invention relates to a reagent kit for MRSA detection, which comprises a selection reagent for a reaction solution after hybridization and a reaction solution after hybridization.
  • a reagent kit for MRSA detection which comprises a selection reagent for a reaction solution after hybridization and a reaction solution after hybridization.
  • a gene DNA that defines methicillin resistance is extracted from the blood or pus of a patient, and an appropriate region of the obtained DNA is specifically amplified. This is achieved by performing an HPA method using a 25- to 35-mer (for example, 30-mer) oligonucleotide labeled with) as a probe.
  • a PCR method polymerase chain reaction; for the PCR method, see “RK. Saik ⁇ ⁇ et. A 1. Science, 239, 487— 491 (19898) ”), and a method using T7 polymerase and reverse transcriptase.
  • the target and probe for detection can be synthesized with a DNA synthesizer (Affaird Biosystems, Model 380B).
  • the probe is labeled with AE (acrylonismester).
  • AE acrylonismester
  • an amino group having an amino group at its center is introduced into the base sequence width.
  • the synthesized oligonucleotide is purified by a conventional method, and mixed with AE having an active ester dissolved in an organic solvent in a reaction solution containing dimethyl sulfoxide and a buffer such as heptase. .
  • the active ester reacts with the amino group of the linker to produce an AE label of the oligonucleotide.
  • the label position of A E from the end to 5 m er is inappropriate, and insertion between two adjacent bases near the center increases the sensitivity of detection.
  • the amplified target is heated to After reprocessing into single strands, the mixture is mixed with a probe and subjected to hybridization by a conventional method. Hybridization is performed in an acidic buffer, and in order to shorten the reaction time, the reaction is performed in an acidic buffer containing lithium salt, at a temperature of 50 to 70 and a time of 3 to several tens of hours. Do it in minutes. After hybridization, a weak alkaline solution containing a surfactant is added, and if the base sequence of the target and the probe are completely identical, the acrylic ester is hydrolyzed. However, if there is a mismatch, hydrolysis occurs and the amount of chemiluminescence decreases. .
  • the linker represented by the general formula (I) used in the present invention is disclosed, for example, in European Patent Publication No. EP 0 311 312.
  • the AE shown is disclosed in WO 89/024 776 if it is very cool.
  • FIG. 1 is a diagram showing the ⁇ H relationship of the probe and the amplification region of the present invention with respect to the DNA of the mecA gene that defines the methicillin resistance of MRSA.
  • FIGS. 2 to 4 show the degree of target V and the chemiluminescence of the conjugate of the two when the synthetic target was reacted with the seed of the present invention and the monoclonal label probe. It is a graph which shows the fighter with quantity.
  • FIG. 5 shows that, using various strains, the three amplification regions of the mecA M gene in FIG.
  • FIG. 4 is a graph showing the intensity of the amount of chemiluminescence of the strain for each probe when the 3 ⁇ 4 ′ probe was reacted.
  • the analysis of the DNA base sequence was performed using SDC-GENETYX (transmission information processing software) (SDC Software Development Co., Ltd.).
  • a primer having the following nucleotide sequence, a probe, and a target were each synthesized with Trityl 0FF using the above DNA synthesizer, and then separated on an 8% polyacrylamide gel. -Purified on an 18-sep pack column (Millipore).
  • Probe PMECA1-2 CCTAATCTCATATGTGTTC CTGTATTGGCC
  • the present inventors have found that such a combination of primer and probe is particularly suitable for detecting MRSII.
  • the regions to be amplified using the above primers and probes are the following three regions.
  • Amplification region (1) PCR1 (311-637) 327fne.r
  • Primer PRHEC1-1 (311 -330), P HEC1 -2 (618-637) Amplification region (2) PCR2 (719-1110) 392iner
  • the mouth is complementary to the DNA sequence of the mecA gene (the value of force ⁇ ).
  • the primers PRHEC1-1, 2-1,3-1 are the same as the DNA sequence of the mec A gene (values in katakana), and MEC1-2,2-2,3-2 is It is a sequence complementary to the corresponding DNA sequence.
  • the target array is as follows.
  • FIG. 1 shows the genes that regulate the methicillin resistance of MRSA.
  • the position of the primer and the probe with respect to the DNA of (mecA) is shown.
  • the mecA gene used was a plasmid (pMR111) provided by Yokota Laboratory, School of Medicine, Juntendo University.
  • PCR (olymerase chain reaction) The PCR was used to amplify the mecA gene. Specifically, the test was performed under the following conditions. First, the following mixture containing the mec A gene was prepared.
  • the sample was heated at 94 C for 3 min.
  • the solution containing the target 5/1 target solution was diluted to prepare with appropriate distilled water 0 -. 5 containing 0 0 0 0 1 degree), the probe solution 5 1 (1 - 4 X 1 0 5 RLU about ), 2X Hybrid Buffer (0.2M lthium succinate L pH5.E], 183 ⁇ 4 111 h l u in 1 aury I sul fate, 2 mM EDTA / EGTA) 20 ⁇ ⁇ Rlf 2 X Transport Hedia (63 ⁇ 4 1Z li thium 1 aury 1 sul fate, 60 in H sodi um hos hate buffer [pH 6.8], 2fnH EDTA / EGTA) 20 ⁇ ⁇ 1 were mixed and heated at 60 ° C for 15 min.
  • a Selection Buf fer 201 (0.2 H sodium tetraborate [pH 7.6], 5% triton X-100) was further subjected to heat treatment at 60 ° C. for 15 min. The reaction solution was cooled to 0, cooled to 1 minute, and returned to room temperature. The amount of chemiluminescence in the remaining reaction solution was measured with Reader I (Gen-Probe Inc).
  • the primers and probes used in the PCR method are either too short or too long.
  • the length of the primer may be 17 m er or more, and the probe is preferably 25 to 35 m er.
  • primers, probes, and targets were synthesized with the lengths of the primer and probe being 20 m er and 30 m er, respectively.
  • the reaction position (target sequence) of the probe was selected from a region having a relatively high GC content (40 or more), as described above. Was introduced at a position near the center of the probe, and labeled with an acrylic ester.
  • Amplification by the PCR method was performed 30 times using 0.1 g of plasmid (pMR.111). The primer used at this time
  • the HP method was used between the target and the acrylidine ester-labeled probe.
  • the RLU amount of each acrylidine ester-labeled probe added to the reaction system is shown in Table 1. The same RLU amount was used
  • the target star was 0-5000 fmo 1 / ⁇ ss a. Y Although the sensitivity and detection efficiency were slightly different, the target of each probe was 5 — 50 fmo 1 or more. (2) to (4) (Fig. 2 to Fig. 4).
  • the MRS A strain used in this example was cultured and adjusted from a clinical isolate provided by the Department of Bacteriology, Juntendo University School of Medicine.
  • the culture was performed using BHI (Brain Heart)
  • a t — MRSAN o.23 and 52 are more resistant to drugs than normal P, SA m strains, Acceptability is as shown in Table 3.
  • HRSA 35 0.4 ⁇ 10 8 0.05 0.8 0.2 0.2
  • the drug-sensitive strains JU 5 and Sinith C used as controls were provided by the Department of Bacteriology, Juntendo University School of Medicine.
  • the product manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd., and the positive control pMR-111 used were those described in the Journal of the Bacteriological Society of Japan, 45 (1), 373, 199.
  • Probe 1-1 has high specificity and good sensitivity.
  • a reagent kit for MRS A detection comprising the following chemicals was prepared.
  • Taq Buf fer 10mH Tris-Cl (pH8.3), 50ffiH C1, 1.5r «H MgCl:, 0.00n (w / v) gelatin], 2.5U Arnpl i T aq (Perkin Elmer Cetus), Includes each primer. )
  • Hybridization reagent including 15 ⁇ 1 2xHybridization Buffer, 5 // 1 2X Transport Media, 1 ⁇ .1 A ⁇ labeled probe

Description

明 細 書
メチシ リ ン · セフエム耐性黄色ブドゥ球菌の検出方法
[技術分野 ]
本発明はメチシリ ン · セフ ム耐性黄色ブドゥ球菌の検出方 法およびそのための試薬キ ッ トに鬨する 。
[背景技術 ]
メ チシ リ ン . セ フ エ ム耐性黄色ブ ド ウ球菌 （ ine t h i c i I 1 i n - resistant S, aureus:以下 「 M R S A 」 と略す） は単に狭域半 合成 penici 1 I in(P C ) に耐性の S · a u r e u sではなく 、 1 9 5 0 年代に院内感染、 難治感染の原因と して恐れられた多剤耐性黄 色ブドウ球菌 ( mul tidru resistant S · a u r e u s )に対して効果 を示してきた狭域半合成 P C及びセ フ ム系抗生物質（ C E Γ ) に対する耐性が、 染色体変化の結果加わった ものである （横田 健， フ ァ ノレマ シア ， V o l . 2 6 , N o . 3 , 2 2 6 - 2 3 0 1 9 9 0 ) 。 M R S Aの臨床分離率が急昇して きた理由と して は抗ブドゥ球菌作用が不十分な第 3世 ft C E Pが感染症の治療 や術後惑染亍防に-汎用されてきたためと考え られている （ 同丄 の文献〉 。 M R S A感染症で危険なものは深部感染であ り 、 M R S Aに対して抗菌力を示す薬剤を使い早期に冶療を開始し ないと救命は難しいと されている 。 も έつて M R S Αの早期診断 は重要な意味を もつと考え られる 。
メチシリ ン耐性を規定する遺伝子 （ mecA)は既に Matsuhas! らによ り クローン化されている （ Sons， M D..Wachi ,H. ,Doi J'l. , I s li l n o , F . a n d Matsuhashi ,H. ,FEDb Letter, . 2 1 , 1 ι 一 1 7 1 , 1 9 8 7 ) 。 また、 横田らは最近臨床分離したメ チ リ ン - セフエム耐性 C N S ( coagulase (-） staphylococci)株に ついて m e c A遺伝子の有無を検討したと ころ分離株 1 3 0株 中 1 2 7株が陽性であり 、 メチシリン · セフエム耐性の発現と m e c A遺伝子の有無に強い相鬨が認められるこ と を報告した
(鈴木映子， 平松啓一，横田健，日本細菌学雑誌， 4 5 , 3 7 3 ,
1 9 9 0 ) „
局所的ないし全身的に感染防御力が低下した火傷， 術後， 免 疫不全等の患者に M R S Aが感染したと きは、 敗血症、 髄膜炎、 肺膽瘍、 脳膿瘍等の深部感染に移行しやすく 、 このよ うな深部 感染症に対する治療薬剤が少ないため患者は重篤な状態に陥り 特に危険である。 したがって、 M R S Aの診断を早期にかつ的 確に行なう こ とが M R S Aの深部感染を防ぐために極めて重要 な意味を持っている 。
現在、 M R S Aの診断は臨床分離株の感受性試験によ り行なつ ている。 しかしこの方法は、 臨床分離及び感受性試験にかなり 時間がかかり 、 特異性も必ずしも高いとは言えない問題点があ る。
[発明の開示 ]
本発明者らは、 M R S Aを従来法よ り も短時間でかつ的確に 検出するこ とができ る方法を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、 H P A法 ( hybridization protection assay)を用いるこ とに よって、 従来の検出方法よ り も少ない時間でよ り特異的に MRSA を検出するこ とができ るこ と を見い出し、 この知見に基づいて 本発明を完成した。
本発明は、 一般式 （ I ) に示すリ ンカ一アームを介して 、 一 般式 （ Π ) に示すァク リ ジニゥムエステルが標識されている檩 識プローブを用いる M R S Αの検出方法に鬨する。 すなわち、
「一般式
O
II
[ ( R 2 ) »- C - C ] η- Χ , - , - Υ ( I )
(式中、 X tは硫黄原子又はアミ ノ基を、 Yは式
X 2 Ο
I II
一 0— Ρ — R 3又は式— Ο— Ρ — Χ 3 を示す。
R 4
R ,は炭素数 0の脂肪族炭化水素鎖を、
0
( R.2 ) »— C — C 一は X ,の保護基を示す。 但し、 mは R 2がと り得る 1〜 3の整数を示し、 R 2は （ R 2 ) ω— C 一 X ,を保護す る よ うな電子吸引性を持つ 1個又は 2個以上の炭素原子、 酸素 原子、 窒素原子又はハロゲン原子か、 ある いはこれらの組合せ である。 ηは 1又は 2 を示すが、 X ,が硫黄原子である時は η は 1 を示し、 X ,がァ ミ ノ基である時は ηは 1 又は 2 を示す。 X 2はハロゲン原子又は置換基を有するアミ ノ基を示し、 X 3は ハロゲン原子、 アミ ノ基又は一 0—を示し、 R 3はそれぞれ置 換されていて もよい低級アルキル基、 低級ァルコキシ基又はァ リールォキシ基を示し、 R ま低級アルキル基、 低級アルコキ シ基又はァリールォキシ基を示すか、 X 3がー 0 —の時は水素 原子を示す。 ） で表される リ ンカ一アームを介して一般式
Figure imgf000006_0001
0
上 、."- -
(式中 R sはそれぞれ置換されていてもよい低級ァルキル基、 低級アルケニル基又はァリール基を、 R 6 , R 7は同一又は異 なって、 水素原子、 アミ ノ基、 水酸基、 チオール基、 ハロゲン 原子、 ニトロ基、 ァセチル基、 低級アルキル基、 低級アルケニ ル基、 ァリール基、 置換ァセチル基、 置換低級アルキル基、 置 換低級アルケニル基、 置換ァリール基、 低級アルコキシ基又は ァリールォキシ基を、 R 8は
式
式 を示す,
Figure imgf000007_0001
Pは 0〜 1 0の整数を示す。 〉 で表されるアタ リ ジ二ゥムェス テルが標識されている標識プローブを、 試料中の M R S Aに存 在するメチシリ ン耐性を規定する遣伝子 D N A又は試料中から 抽出 し増幅させた M R S Aに存在するメチシリ ン耐性を規定す る遣伝子 D N Aとハイ ブリ ダィズさせ、 次いでハィ ブリ ダィ ズ していないプローブ及びハィ ブリ ダィ ズしているがその交 に おいて一塩基以上のミスマッチを有するプローブの標識部分を 選択的に分解させた後、 化学発光量を測定する こ とからなる M R S Aの検出方法。 」 である。
本発明はまた、 D N A増幅試薬、 一般式 （ I ) で表される リ ンカーアームを介して一般式 （ Π ) で表されるァク リ ジニゥム エステルが標識されている標識プローブを含むハイ ブリ ダィ ゼ ーシヨ ン試薬、 及びハイ ブリ ダィ ゼーシ ヨ ン後の反応液に対す るセレクシ ョ ン試薬を包含するこ と を特徴とする M R S A検出 用試薬キッ トに関する 。 以下、 本発明について詳細に説明する 。 本発明による M R S Aの検出は、 患者の血液又は膿からメチ シリ ン耐性を規定する遺伝子 D N Aを抽出し、 得られた D N A の適当な領域を特異的に増幅し、. A E (アタ リ ジニゥムエステ ル'） で標識した 2 5〜 3 5 m e r (例えば、 3 0 m e r ) のォ リ ゴヌ ク レオチドをプローブと し、 H P A法を行う こ と によ つ て達成される 。 -
D N Aを増幅させる方法と しては、 P C R法 （ polyme ase chain reac t i on；なお、 P C R法については 「 R . K . Sa i k ι· et . a 1. Science, 2 3 9 , 4 8 7 — 4 9 1 ( 1 9 8 8 ) 」 参照） や、 T 7ポリメ ラーゼと逆転写酵素を用いる方法等で行う こ とがで き る 。 また、 G C含量の比較的高い領域 （ 4 0 %以上） から ローブの反応位置 （ ターゲッ ト配列〉 及び増幅する ^域を選択 する こ とが好ま しい。
検出用のターゲッ ト及びプローブは D N A合成機 （ァフ 'ラィ ド ' バイ オシステム社製， モデル 3 8 0 B ) によ り合成でき る プローブには A E (ァク リ ジニゥムェステル ） 標識を行な う た めその中心にアミ ノ基を も ったア ミ ノ リ ン力一を塩基配列巾に 導入する 。 合成したオリ ゴヌ ク レォチドは、 常法によ り精製を 行い、 ジメチルスルホキシ ド及びへぺス等の緩衝液を含む反応 液中で、 有機溶媒に溶解した活性エステルを持つ A E と混合す る 。 その結果、 活性エステルが、 リ ンカ一のァ ミ ノ基と反応し オリ ゴヌ ク レオチの A Eラベルが行える 。 なお、 A Eのラベ 位置は端から 5 m e r までの部分は不適当で、 中央付近にある 二つの隣接する塩基間に揷入する と検出の惑度が上昇する 。
実際の検出では、 増幅させたターゲッ トを高温またはァ凡 力 リ処理で一本鎖に した後、 プローブと混合し 、 常法によ りハイ ブリ ダィ ゼ一シヨ ンを行う 。 ハィ ブリ ダイ ゼー ョ ンは酸性緩 衝液中で行い、 反応時間を短縮するためには、 リ チウム塩を き む酸性緩衝液中で行い、 温度は 5 0〜 7 0 、 時間は 3〜数十 分の間で行う 。 ハィ ブリ ダィ ゼ一シ ョ ン後は、 界面活性剤を含 む弱ァルカ リ液を加え、 ターゲッ ト とプロ一ブの塩基配列が完 全に一致する場合は、 ァク リ ジニゥムエステルは加水分解され ないが、 不一致がある と加水分解を受け、 化学発光量が减衰す る。.
又、 本発明で用いられる一般式 （ I ) で示される リ ンカ一ァ —ムは、 咧えば欧州特許公開 E P 0 3 1 0 3 1 2号に開示され てお り 、 一般式 （ Π ) で示される A Eは冽えば囯際特許出願公 開 W O 8 9 / 0 2 4 7 6 に開示されている 。
[図面の簡単な説明 ]
第 1 図は、 M R S Aのメ チシリ ン耐性を規定する m e c A造 伝子の D N Aに対する本発明のプロ一ブ及び増幅領域の ίί π H 係を示す図である 。
第 2図〜第 4図は、 合成タ一ゲッ 卜に本発明の種 ' ひ、マ ク リ ジニゥム標識プローブを反応させたと きの、 タ一ゲ V トの 度 と両者の結合物の化学発光量との鬨係を示すグラフである。 第 5図は、 種々の菌株を用いて、 第 1 図における m e c A M 伝子の 3 つの増幅領域で本発明の種々のァク リ ジニゥム標！¾'プ ローブを反応させたと きの、 各々のプロ一ブに対する これ 、 菌株の化学発光量の強さ を示すグラフである 。
[発明を実施するための最良の形態〕 以下、 実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、 これら の記載は本発明を限定するものではない。
(実施例 1 〉
材料と 法
( 1 ) D N A塩基配列の解析
D N A塩基配列の解析は S D C — G E N E T Y X (遣伝情報 処理ソフ 卜ウェア） （ S D C ソフ トウェア開発株式会社） を用 いた。
( 2 ) プライ マー、 プローブ及びターゲッ トの作製
一例と して下記の塩基配列を有するプライ マー、 及びプロ一 ブ並びにターゲッ トをそれぞれ、 ト リチル 0 F Fにて上記の D N A合成機で合成後、 8 %ポリ アク リルアミ ド ゲルで分離し、 C- 1 8セップパッ クカラム （ ミ リポア） にて精製した。
ァク リ ジニゥムエステル化のためのリ ンカ一は、 アミ ノ モディ フ ァ.ィヤー Π ( ク ロンテッ ク · ラボラ ト リーズ社製） を用いた。 エステル化反応後、 Sephadex G - 2 5 ( 1 >'S T E (P H 6 .0 )) を用いた Spun -Column法によ り精製した。
プライ マー P R M E C 1 — 1 ：
311 330
A C T A C G G T A A C A T T G A T C G C プライ マー P R M E C 1 — 2 ：
618 637
G T T C T A C T A T G G A A G C A A G Cx プライ マー P R M E C 2 — 1 ：
719 738
G T C G T A A C T A T C C T C T A G G A プライ マー P R M E C 2 — 2 ：
1091 1110
C G T G T G G A A G T A T A C T G C A G プライ マ一 P R M E C 3— 1 ：
1562 1581
A C G G A C A A G G T G A A A丁 A C T G プライ マー P R M E C 3
1924 1943
C C T T A C C G A T C G A T G T T A C G
AE
389 Λ 418 プローブ PMECAl-1： GGTCTTTCTGCATTC CTGGAATAATG ACCC
ΛΕ
486 A 515 フ ローブ PMECA1-2： CCTAATCTCATATGTGTTC CTGTATTGGCC
AE
870 A 899 アローブ PMECA2- 1 : GTGACACGATAGC CATCTTCATGTTGGAGC
AE
1039 Λ 106S プロ一ブ PMECA2-2： TGTTTGAGGGTGGATAC CAGTACCTGAGCC
AE
17S6 \ 1S15 アロ ー ブ' PMECA3-1 : GAGTTCTGCAGTACC GGATTTGCCAATTAA
ΛΕ
1825 ハ 1854 プローブ PMECA3-2: CCACCCAATTTGTCTG CCAGTTTCTCCTTG
(注） A E ： ァク リ ジニゥムェステル
このよ う なプライ マーとプローブの組合せが、 M R S Λの検 出に特に好適である こ とが本発明者によ って発見された。 上記のプライ マーとプローブを用いて増幅する領域は次の三 つの領域である 。
増幅領域（1) PCRl(311-637) 327fne.r
Primer :PRHEC1-1 (311 -330) , P HEC1 -2 (618-637) 増幅領域（2) PCR2 (719-1110) 392iner
Primer :PRMEC2-l(719-738) , PRHEC2-2 (1091 -
1110)
増幅領域（3) PC 3 (1562-1943) 382rner
Primer :PRMEC3-1 (1562-1581) , PRHEC3 - 2 ( 192 - 1943)
フ 口一ブは m e c A遺伝子の D N A配列 （力 コ內の数値） に 対して相補的である。 プライ マ一 PRHEC1- 1 , 2-1,3- 1は m e c A遣伝子の D N A配列（カ ツ コ内の数値）と同 じであ り 、 MEC1 - 2, 2- 2,3- 2は対応する D N A配列に対して相補的配列である。
タ一ゲッ ト配列は次の通りである。
ターゲッ ト配列 THECA1- 1(389-418)
' THECA1-2(4S6-515)
THECA2-1 (870-S99)
TMECA2-2(1039-1068)
THECA3-1 (1786-1815)
THECA3-2(1825-1854)
第 1 図に M R S Aのメチシリ ン耐性を規定する遺伝子
( m e c A ) の D N Aに対する上記プライ マー及びプロ一ブの 位置鬨係を示す。 なお、 m e c A遺伝子はプラス ミ ド ( p M R 1 1 1 ) と して順天堂大学医学部横田研究室よ り供与された のを使用した。
( ) P C R法 ( olymerase chain reaction) m e c A遣伝子の増幅は P C R法を用いた。 具体的には次の 条件で行なった。 まず、 m e c A遺伝子を含む次の混合物を調 製した。
m e c A遣伝子を含むアラスミ ド 0.1〃 g 前後 2種類のプライ マー lOOpmol d N T P m i X t u r e (各塩基混合物） 1 0 rri M 2 u i
P C R buf fer( 1 0倍漉度） 10 1
蒸留水 残余
計 100 1 上記混合物に Taq polymerase 2 . 5単位を加え、 更に鉱物 油を 2滴加えた。 これを次の温度条件で 3 0回増幅した。
r→7rc,8分→ - 20°Cで保存
94。C , 4分→55eC , 2分" 2。C , 2分→94。C , 1.5分
t I
30回増幅
( 4 ) H P A法
ターゲッ ト と して卩 C R増幅サンプルを用いる場合には、 あ らかじめサンプルを 9 4 C， 3 m i n加熱処理した。 ターゲッ トを含む溶液 5 / 1 (ターゲッ ト液を適宜蒸留水にて希釈し調製 した。 0 — 5 0 0 0 0 1 程度を含む）、プローブ溶液 5 1 ( 1 - 4 X 1 0 5 R L U程度を含む） 、 2 X Hybrid Buffer ( 0.2M l i thium succinate L pH5. E ] , 18¾ 111 h ι u in 1 aury I sul fate ,2mM EDTA/EGTA) 20 ^ \Rlf 2 X Transport Hedia(6¾ 1Z l i thium 1 aury 1 sul fate , 60 in H sodi um hos hate uffer [pH 6.8] ,2fnH EDTA/EGTA)20乂 ί 1を混合し 6 0 °C 、 1 5 m i n加温 処理した。 次に Se l ect ion Buf fer 2 0 0 1 ( 0.2H sodi um tetraborate [pH7.6] ,5% tri ton X - 100 )を力 [Jえ更に 6 0 'C ， 15 m i n加溫処理した。 反応液を 0て、 1 m i n冷却後室温に戻 した。 残った反応液中の化学発光量を Reader I (Gen-Probe Inc) にて測定した。
結果と者察
( 1 ) プライ マー、 プローブ及びターゲッ トの合成
P C R法において用いるプライ マ一及びプロ一ブは短過ぎて も長過ぎて も不適当である 。 プラィ マーの長さは 1 7 m e r以 上であれば良く 、 プローブは 2 5 〜 3 5 m e rであるこ とが好 ま しい。 本実施例においては、 プライ マ 一及びプ'口一ブの長さ をそれぞれ 2 0 m e r及び 3 0 m e r と し、 プラ イ マ 一 、 プロ ーブ、 ターゲッ 卜を合成した。 また、 プローブの反応位置 （ タ 一ゲッ ト配列〉 は、 G C含量の比較的高い領域 （ 4 0 以上〉 から選択した。 前記したよ う に、 プロ一ブの合成の際にァ ミ ノ リ ンカ一をプローブの中央付近となる よ うな位置に導入し 、 ァ ク リ ジニゥムエステル標識を行なつた。
( 2 ) m e c A遣伝子の増幅
プラス ミ ド （ p M R. 1 1 1 ) を 0.1 g用い P C R法によ る 増幅を 3 0 回行なった。 なお、 この際用いるプライ マ 一位置
G C含量の比較的高い領域 （ 4 0 %以上） から選択した。· 増幅. したサンプルを 2 %ァガロースゲルで電気泳動した結果、 目的 とするバン ド (増幅領域 P C R l : 3 2 7 m e r ， P C R 2 : 3 9 2 m e r ， P C R 3 ： 3 8 2 m e r ) が得られたこ と を確 認した。 また、 p H yマーカー （分子量マーカー） と各バン ド との比較から、 目的のバン ドは増幅したサンプル中に 1 0 — 2 0 n g / t 1程度含まれている ものと推察された。
( 3 ) 純系での H P A法
タ "ゲッ 卜 とァク リ ジニゥムエステル標識プローブとの H P Α法を行なつた。 反応系に加えた各ァク リ ジニゥムエステル標 識プローブの R L U量を第 1 表に示す。 尚以後の実験において も同一 R L U量を用いた。 ターゲッ ト星は 0-5000 f m o 1 / ει s s a. y と した。 感度及び検出効率は多少異なるが、 各プ口 —ブと も 5 — 5 0 f m o 1 以上のターゲッ ト を検出する こ と力 ί 可能であつた (第 2図〜第 4図） 。
第 1 表
反応系 力 Q_えたプローブの 発光量 ( R. L II Ζ 5 u \ )
Figure imgf000015_0001
(注） R L Uは Re I a t i ve Light Knit の略であ り 、 単位はない ( 4 ) P C R増幅サンプルでの H P A法
P C R増幅サンプル 2〃 1 ( 目的バン ドを 2 0 — 4 0 n g程 度含む） を用い、 アタ リ ジニゥムエステル標識プローブによ る H P A法を行なった。 結果を第 2表に示す。 これによれば、 そ れぞれのプローブは P C R法によ り増幅したサンアルを十分検 出してお り 、 特に P M E C A 1 — 1及び P M E C A 2 — 1 が比 較的良好なプローブと考え られる 。
第 2表 増幅した m e c A遣伝子とプローブとの反応
P C Rサン 加 た
増幅サ プル ブランク プロ一ブ ンプル プロ一ブ ( 2 ^ 1 ) (水） の R L U量
PCR1 PHECA1-1 79755 1948 75260
1-2 39654 3502 171524
PCR2 2-1 168635 3903 269478
1-1 45549 4946 356147
PCR3 3-1 34916 2106 167164
3-2 32541 1655 285594
(実施例 2 )
本実施例に供した M R S A菌株は、 順天堂大学医学部細菌学 教室よ り供与された臨床分離株よ り培養 · 調節したものを川い た。
培養は供与された臨床分離株を B H I ( Brain Heart
Infusion) brotli培 ί也にて、 ； 5 7 eC · —夜行なった。 その後、 P B Sで一回洗浄し、 菌株が 1 0 8 C F U ," m 1となる よ う に P B Sで希釈して調節した。
A t — M R S A N o . 2 3及び 5 2は、 通常の P, S A m 株よ り薬剤耐性の強いものであ り 、 主な抗菌剤に対する薬剤 受性は第 3表に示す通りである。
第 3表 種々の M R S A菌株の薬剤感受性
薬剤感受性（MIC) g rnl
No. 菌株 CFU/ml Q- 35 NFLX OFLX CPFX ABPC DMPPC
MRSA 1 0. 1 0.8 0.4 0.2 6.3
HRSA 35 0.4χ108 0. 05 0.8 0.2 0.2
At - MRSA 23 6. 3 200 50 100 50 200
At-M SA 52
Figure imgf000017_0001
6. 3 200 25 100 50 200 また対照と して用いた薬剤感受性株の J U 5及び Sini th C 順天堂大学医学部細菌学教室よ り供与を受けた ものである さ らに、 C S J 1 9 2 3は三光純薬製のものを 、 またポジテ ブコン トロールである p M R— 1 1 1 は日本細菌学雑誌， 4 5 ( 1 ) , 3 7 3 , 1 9 9 0 に記載された も を用いた。
上記 8種類の菌株を用いて、 実施例 1 と 同様方法によ り m e c A遺伝子の検出を行なつた。 結果を第 5図に示す。
第 5図によれば、 特に P r o b e 1 — 1 が、 高い特異性を示 し感受性も良いこ とがわかる 。
(実施例 3 ) ·
次の薬品類からなる M R S A検出用試薬キ ッ ト を作製した。
( 1 ) 0 . 2規定 N a O H 5 0 u I
( 2 ) 0 . 2規定 11 ( 1 5 0 〃 1
( 3 ) 増幅試薬 （ 2 0 0 z M d N T P s , 2 0 0 M
Taq Buf f er[10mH Tr is-Cl (pH8.3) ,50ffiH C1 , 1.5r«H MgCl： , 0.00n(w/v)gelatin] ,2.5U Arnpl i T a q ( P e r k i n Elmer Cetus) , 各 プライマーを含む。 ）
( 4 ) ハイ ブリ ダィ ゼーシヨ ン試薬 （ 15〃 1の 2xHybridization Buffer ,5// 1の 2 X Transport Media, 1 μ.1の A Ε標識フ "ローブ を含む。 〉
( 5 ) セレク シ ョ ン試薬 1 0 0 1
この試薬キッ トを用いて、 M R S Αに感染した恐れのある入 院患者の血液を次のよ う にして分析した。
1 . 患者の血液 5 0 1に 0 .2規定 N a O Hを 5 0〃 1加え 混和後、 3 7でで 1 時間放置する 。
2 . これに 5 0 〃 1の 0 .2規定 H C 1 を加え混和後、 〜 5000 r p mで〜 2秒間遠心する （変性した蛋白は沈澱〉 。
3 . この試料 3 0 1にミネラルオイ ル 5 0 1を加え混和し 9 5 で 1 0分間放置後氷冷する 。
4 . 5 0 Iの増幅試薬を加える。
5 . P C Rによる増幅を行う 。 最初に 9 4でで 3 分間加熱し て D Ν Αを変性させた後、 9 4 eCで 2分， 5 5 で 2分， 7 2 でで 1分を 1サイ クルと して、 これを ： 3 5〜 4 0サイ クル繰り 返し、 最後に 7 2 で 8分閭加熱する 。
6 . P C R.後の反応液 2 1.を取り 、 9 5でで 5 分間加熟後、 氷中で急冷する 。
7 . 4 8 1のハイ ブリ ダィ ゼ一シ ヨ ン試薬を加え 、 6 0。C で 1 5分間加温する。
8 . ノヽィ ブリ ダィ ゼーシヨ ンの後、 反応液に 2 0 0 〃 1のセ レクシヨ ン試薬を加え、 6 0 °Cで 1 5分間加温する。
9 . 氷冷後室温に戻してから、 化学発光を測定する 。 なお、 上記のキッ トはあく までも一例であって、 本発明方法 を実施するためには、 他に様々なキッ ト化が考え られる 。
[産業上の利用可能性 ]
H P A法による D N Aプローブを用いた本発明方法によ って メチシリ ン耐性を規定する M R S Aの m e c A逍伝子を検出す る手段が確立された。 本発明の検出方法を利用する こ と によ つ て M R S A感染症の的確な早期診断が可能となった。

Claims

請 求 の 範 囲
一般式
0
[ ( R 2 ) « - C - C ] „ - X , - R , - Y
(式中、 X ,は硫黄原子又はアミ ノ基を、 Yは式
X 2 0
I II
一 O— P — R 3又は式一 O— P — X 3 を示す。
R 4
R ,は炭素数 0の脂肪族炭化水素鎖を、
O
( R 2 ) »— C— C 一は X ,の保護基を示す。 但し、 mは R. 2がと り得る 1 〜 3の整数を示し、 R 2は （ R 2 ) ω— C — X ,を保護す る よ うな電子吸引性を持つ 1個又は 2個以上の炭素原子、 酸素 原子、 窒素原子又はハロゲン原子か、 あるいはこれらの組合せ である 。 ηは 1又は 2 を示すが、 X ,が硫黄原子である時は η は 1 を示し、 X ,がアミ ノ基である時は ηは 1又は 2 を示す。 X 2はハロゲン原子又は置換基を有するアミ ノ基を示し、 X 3は ハロゲン原子、 アミ ノ基又は一 0—を示し、 R 3はそれぞれ置 換されていてもよい低級アルキル基、 低級ァルコキシ基又はァ リールォキシ基を示し、 R ま低級アルキル基、 低級ァルコキ シ基又はァリールォキシ基を示すか、 X 3がー Ο—の時は水素 原子を示す。 〉 で表される リ ンカ一アームを介して一般式
Figure imgf000021_0001
(式中 R sはそれぞれ置換されていても よい低級アルキル基、 低級アルケニル基又はァリール基を、 R 6 , R 7は同一又は異なつ て、 水素原子、 アミ ノ基、 水酸基、 チオール基、 ハロゲン原子、 ニ トロ基、 ァセチル基、 低級アルキル基、 低級アルケニル基、 ァリール基、 置換ァセチル基、 置換低級アルキル基、 置換低級 アルケニル基、 置換ァリール基、 低級アルコキシ基又はァリー ルォキシ基を、 お βは
式 -
式 - を示す,
Figure imgf000022_0001
Pは 0 1 0の整数を示す。 ） で表されるァク リ ジニゥムエス テルが標識されている標識プローブを、 試料中のメチシリ ン ' セフ エム耐性黄色ブドウ球菌に存在するメチシリ ン耐性を規定 する遣伝子 D N A又は試料中から抽出し増幅させたメチシリ ン セフ Xム耐性黄色ブドウ球菌に存在するメチシ リ ン耐性を規定 する遣伝子 D N Aとハイ ブリダィ ズさせ、 次いでハイ ブリ ダィ ズしていないアローブ及びハイ ブリ ダィ ズしているがその交雑 において一塩基以上の ミスマッチを有するプローブの標識部分 を選択的に分解させた後、 化学発光量を測定するこ とからなる メチシリ ン · セフエム耐性黄色ブドウ球菌の検出方法。
2 . 標識されたァク リ ジニゥムエステルが、 プローブの中心 付近にある二つの隣接する塩基に結合しているこ と を特徴とす る請求項 1 又は 2に記載の方法。
3 - プローブが、 メチシリ ン · セフ ヱム耐性黄色ブドウ球菌 のメチシリ ン耐性を規定する遣伝子 D N Aの 3 8 9 — 4 1 8位 中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなるこ と を特徴とする請求項 1 又は 2記載の検出方法。
389 418
GGTCTTTCTGCATTCCTGGAATAATGACGC '
4 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記遺伝子 D N Aの 4 0 3 , 位と 4 0 4位に対応するプローブの二つの塩基間に結合してい ' るこ と を特徴とする請求項 3記載の検出方法。
5 . プローブが、 メチシリ ン · セフヱム耐性黄色ブドゥ球菌 のメ チシリ ン耐性を規定する遣伝子 D N Aの 4 S 6 — 5 1 5 β 中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなる こ と を特徴とする請求項 1 又は 2記載の検出方法。
0
486 515
CCTAATCTCATATGTGTTCCTGTATTCGCC
6 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記遺伝子 D Ν Αの 5 〇 4 位と 5 0 5 位に対応するプローブの二つの塩基間に結合して い るこ と を特徴とする請求項 5記載の検出方法。
5 7 . ァローブが、 メチシ リ ン · セフ ヱム耐性黄色ブ ド ウ球菌 のメチシ リ ン耐性を規定する遺伝子 D N Aの S 7 0 - S 9 位 中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなる こ と を特徴とする請求項 1 又は 2記載の検出方法。
870 899
GTGACACGATAGCCATCTTCATGTTGGAGC
0
8 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記遺伝子 D N Aの 8 8 2 位と 8 8 3位に対応するプローブの二つの塩基間に結合してい る こ と を特徴とする請求項 7記載の検出方法。
9 . プローブが、 メチシリ ン · セフ ヱム耐性黄色ブドゥ球菌 のメチシリ ン耐性を規定する遺伝子 D N Aの 1 0 3 9 - 1 0 65 II
8位中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなる こ と を特徴とする請求項 1又は 2記載の検出方法。
1039 1068
TGTTTCACGGTGGATAGCAGTACCTGAGCC
1 0 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記逍伝子 D N Aの 1 0 5
5位と 1 0 5 6位に対応するプローブの二つの塩基間に結合し ているこ と を特徴とする請求項 9記載の検出方法。
1 1 · プローブが、 メチシリ ン ' セフエム耐性黄色ブドウ球菌 のメチシリ ン耐性を規定する遺伝子 D N Aの 1 7 8 6 — 1 8 1
5位中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなる こ と を特徴とする請求項 1又は 2記載の検出方法。
1786 1815
GAGTTCTGCAGTACCGGATTTGCCAATTAA
1 2 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記遣伝子 D N Aの 1 8 0 0位と 1 8 0 1位に対応するプローブの二つの塩基間に結合し ているこ と を 徴とする請求項 1 1記載の検出方法。
1 3 . プローブが、 メチシリ · セフヱム耐性黄色ブドウ球菌 のメチシリ ン耐性を規定する遣伝子 D N Aの 1 8 2 5 - 1 S 5
4位中の塩基配列に相補的である下記の 3 0塩基配列からなる こ と を特徴とする請求項 .1又は 2記載の検出方法。
1825 1854
CCACCCAATTTGTCTGCCAGTTTCTCCTTG
1 4 . ァク リ ジニゥムエステルが、 前記遣伝子 D N Aの 1 84 0位と 1 84 1 位に対応するプローブの二つの塩基間に結合し ているこ と を特徴とする請求項 1 3記載の検出方法。
1 5 . 次の （ 1 ) 〜 （ 3 ) を構成要素と して包含するこ と を特 徴とするメチシリ ン · セフ ム耐性黄色ブドウ球菌検出用試薬 キッ 卜。
( 1 ) D N A増幅試薬
( 2 ) —般式
O
II
[ ( R 2 ) ■»— C — C ] - X , - R , - Y
(式中、 X ,は硫黄原子又はアミ ノ基を、 Yは式
X 2 0
I II
一 0— P — R 3又は式一 O— P — X 3 を示す。
R 4
R ,は炭素数 1 〜 1 0の脂肪族炭化水素鎖を 、
o
II
( R 2 ) ra— C一 C—は X ,の保護基を示す。 但し、 mは R 2がと り得る 1 〜 3 の整数を示し、 R 2は （ R 2 ) »— C — X ,を保護す る よ う な電子吸引性を持つ 1個又は 2個以上の炭素原子、 S 素 原子、 窒素原子又はハロゲン原子か、 ある いはこれらの組合せ である。 nは 1スは 2 を示すが、 X ,が硫黄原子である時は n は 1 を示し、 X ,がァ ミ ノ基である時は n 1 又は 2 を示す。 X 2はハロゲン原子又は置換基を有するアミ ノ基を示し、 X 3は ハロゲン原子、 アミ ノ基又は— 0—を示し、 R 3はそれぞれ置 換されていても よい低級アルキル基、 低級アル コキシ基スはァ リ一ルォキシ基を示し、 R Jま低級アルキル基、 低級ア コキ シ基又はァリールォキシ基を示すか、 X 3がー O—の時は水素 原子を示す。 ） で表される リ ンカ一アームを介して一般式
R5
へ
し 、 .. ク
C-0
0
Figure imgf000026_0001
(式中 R. sはそれぞれ置換されていてもよい低級アルキル基、 低級アルケニル基又はァリール基を、 R R 7は同一又は異なつ て、 水素原子、 アミ ノ基、 水酸基、 チオール基、 ハロゲン原子、 ニ トロ基、 ァセチル基、 低級アルキル基、 低級アル ケニル基、 ァリール基、 置換ァセチル基、 置換低級アルキル基、 置換低級 アルケニル基、 置換ァリール基、 低級ァルコキシ基又はァ リ一 ノレォキシ基を 、 R Bは
0
II
式 -(CH2)p-C-0-N; 又は
oシ
式 (CH2)C- を示す.
Figure imgf000027_0001
Pは 0〜 1 0の整数を示す。 ） で表されるアタ リ ジニゥムエス テルが標識されている標識プローブを含有するハイ ブリ ダィ ゼ ーシヨ ン試薬
( 3 〉 セレクシ ョ ン試薬
1 6 . ァク リ ジニゥムエステル標識プローブと して次の 6種の 標識プローブのう ち少なく と も 1種を含む請求項 1 5記載のメ チシリ ン · セフ エム耐性黄色ブドウ球菌検出用試薬キ ッ ト 。
AE
389 /\ 418
(1) GGTCTTTCTCCATTC CTGG A AT AATGACGC
AE
486 l\ 515
(2) CCTAATCTCATATGTGTTC CTGTATTGGCC
AE
870 /\ 899
(3) GTGACACGATAGC CATCTTCATCTTGG AGC
AE
1039 /\ 1068
(4) TGTTTGAGGGTGGATAG CAGTACCTG AGCC AE
1786 /\ 1815
(5) GAGTTCTGCAGTACC GGATTTGCCAATTAA
AE
1825 八 1854
(6) CCACCCAATTTGTCTG CCAGTTTCTCCTTG
(上記式中、 A Eはァク リ ジニゥムエステルをあらわす）
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