WO1992002823A1 - Determination des thrombopenies - Google Patents

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WO1992002823A1
WO1992002823A1 PCT/FR1991/000659 FR9100659W WO9202823A1 WO 1992002823 A1 WO1992002823 A1 WO 1992002823A1 FR 9100659 W FR9100659 W FR 9100659W WO 9202823 A1 WO9202823 A1 WO 9202823A1
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heparin
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hep
proteoglycan
complexes
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Jean Amiral
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Serbio
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    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides

Definitions

  • the present invention relates to the use of a particular antigenic substance in the determination of thrombocytopenia (also called thrombocytopenia). It also relates to an improved method for determining these diseases, in particular those induced by various inducing drugs, in particular by quinine / quinidine (that is to say induced by quinine, its diastereoisomer quinidine, and their mixtures) and especially with heparin.
  • heparin is administered, as an anticoagulant, to people hospitalized to prevent any risk of venous or arterial thrombus.
  • heparin is administered, as an anticoagulant, to people hospitalized to prevent any risk of venous or arterial thrombus.
  • thrombocytopenia which can develop particularly severe between the 5th and 15th days of heparin therapy.
  • a new technical solution is proposed for the determination of thrombocytopenia induced by an inducing drug (Z).
  • This new technical solution is based on the detection, (i) by means of a specific antigenic substance (Ag), (ii) of an antibody immunological material contained in the plasma of the subject to be tested and chosen from the group consisting by anti (Y) antibodies (where Y is in particular Z or the Z-Ag complexes) directed in particular against the inducing drug Z and its complexes with Ag.
  • the new technical solution according to the invention for the determination of thrombocytopenia uses an antigenic substance (Ag) obtained in particular by the cleavage or the lysis of blood platelets and having a strong affinity with respect to the inducing drug, said substance antigen being intended to react with an anti antibody (inducing drug), according to the mechanism
  • anti (Y) denotes an anti-body material contained in the plasma to be tested and directed against the inducing drug Z and the complexes containing it (in particular the complexes Z-Ag- ⁇ , Z- platelet, Z- Agi-platelet) producing a aggregation or activation of blood platelets causing thrombocytopenia.
  • reaction (1) above can be detected, reported or amplified by a method known per se (in particular by agglutination, EIA, RIA or FIA).
  • a method is recommended for the reliable and rapid determination of thrombocytopenia induced by any inducing drug, in particular quinine / quinidine and especially heparin.
  • an antigenic substance is therefore proposed in the determination of thrombocytopenia induced by an inducing drug (Z), said use being characterized in that said antigenic substance is chosen from the group consisting of the fractions which (i) are present in blood platelets and released from said blood platelets by cleavage "i lyse, and (ii) have a strong affinity with respect to the inducing drug (Z) and / or complexes of said drug inducing with platelets; and in that said antigenic substance is intended to react with an anti-antibody material (Y) contained in the plasma to be tested and directed against the inducing drug, its fragments or the products containing said inducing drug or one of its fragments.
  • Y anti-antibody material
  • Such a use is suitable for any drug inducing (Z) thrombocytopenia of immune origin, in particular paracetamol, acetazolamide, aspirin, alylisopropylcarbamide, alprenolol, amrinone, antazoline , bleomycins, carbamazepine, cephalothin, chlorothiazide, chlorpropamide, cimetidine, clonazepam, sulfonamides (including sulfamethoxazole, sulfamethazine, sulfamethoxypyridazine, etc.) sulfonamide-trimethoprim combinations (including combination sulfamethoxazole-trimethoprim in the 5/1 weight ratio), DDT, desipramine, diazepam, digitoxin, diphenylhydantoin, fenoprofen, heroin, hydrochlorothiazide, isonia
  • inductor Z - substances containing said induced drug- trice (in particular less complexes Z-Ag- Z-plate or Z-Ag - ⁇ - plate and the polymers of Z),
  • kits, kits or assay kits for the determination of thrombocytopenia characterized in that they comprise at least one sample of said abovementioned antigenic substance or one of its complexes, and, where appropriate , suitable dilution media and / or other reagents.
  • Ag denotes the antigenic substance according to the invention having a strong affinity with respect to the inducing drug Z; 5
  • Ag ⁇ _ denotes said antigenic substance Ag and the complexes comprising it;
  • anti (Z) denotes an antibody generated against the inducing drug (Z);
  • anti (X) denotes any antibody generated against substance X, thus anti (Z), anti (Ig), anti (IgA), anti (IgG) and respectively anti (IgM) denote any antibody generated against the inducing drug Z, the immuno- globulins Ig, IgA, IgG and respectively IgM;
  • EIA designates an enzyme immunoassay (in English: “enzyme immunoassay”); ELISA abbreviation of the English expression “enzyme-lin ed immunosorbent assay”, indicates a particular EIA technique;
  • F (ab) denotes a first fragment of an antibody obtained by cleavage of said antibody by papain;
  • F (ab ') 2 denotes a second fragment of an antibody obtained by cleavage of said antibody by pepsin;
  • Fc denotes any antibody fragment, separated from the F (ab) fragment by cleavage using papain or separated from the F ⁇ ab ' ⁇ fragment by cleavage using pepsin; said Fc fragments are homologous but slightly structurally different depending on whether they have been cleaved by papain or pepsin (the structure and the method of obtaining F (ab), F (ab ') 2 and Fc is illustrated in French patent application No 89 04 589 filed on April 7, 1989);
  • FIA designates a fluoroimmunoassay (in English: "fluorescent immunoassay")
  • FR stands for Rheumatoid Factor
  • Hep means heparin, its derivatives or analogs (including their complexes with platelets)
  • HRGP denotes a histidine-rich glycoprotein (in English: "histidine-rich glycoprotein”); S. denotes any immunoglobulin;
  • IgA denotes any immunoglobulin A
  • IgG denotes any immunoglobulin G
  • IgM denotes any immunoglobulin M
  • LA-pF4 denotes a ⁇ TG precursor (in English: "low-affinity pF4");
  • OD denotes the optical density (measured in particular at a wavelength of 492 nm);
  • OPD denotes ortho-phenylenediamine
  • PBP designates the precursor of LA-pF4, namely the basic platelet protein (in English: "platelet basic protein")
  • pF3 designates the platelet factor 3
  • pF4 designates the platelet factor 4
  • POD denotes peroxidase
  • Qn / Qnd denotes (i) quinine, quinidine, their mixtures, the corresponding derivatives or analogs denotes a labeling means;
  • RIA stands for radioimmunoassay (in English: "radio immunoassay"
  • RT indicates the ambient temperature (15-25 ° C); TG denotes beta-thromboglobulin and results from the degradation or partial cleavage of LA-pF4; denotes the inducing drug Z, the products containing it and its derivatives and / or analogs; denotes the drug inducing thrombocytopenia.
  • the present invention relates to the determination of thrombocytopenia of immune origin.
  • the Ag ] _ antigenic substance according to the invention includes the Ag antigenic material which is constituted by platelet fragments (including the walls), intraplatelet fractions releasable from blood platelets by cleavage or lysis, and optionally plasma or blood substances, d on the one hand, and the complexes of said platelet fragments, of said intra-platelet fractions and of said plasma or blood substances, on the other hand.
  • the expression “having a strong affinity with respect to the inducing drug Z" applied to the antigenic substance is meant the fact that the antigenic substance that Ag reacts easily with the inducing drug Z, the derivatives of Z, analogues of Z and products containing Z.
  • an antigenic substance in the determination of thrombocytopenia induced by an inducing drug such as (a) heparin or (b) quinine / quinidine, said use being characterized in that said antigenic substance is chosen from the group consisting of the fractions which (i) are platelet fractions in particular obtained by cleavage or the lysis of blood platelets and (ii) have a strong affinity for ( a) Hep or (b) Qn / Qnd.
  • an inducing drug such as (a) heparin or (b) quinine / quinidine
  • said antigenic substance is intended to react with an antibody material (a) anti-heparin or respectively (b) anti-quinine / quinidine contained in the plasma to be tested and directed against (a) Hep, the Hep-platelet complexes, Hep- antigenic substance and / or Hep- antigenic substance-platelet, or respectively (b) Qn / Qnd, the complexes Qn / Qnd-platelet, Qn / Qnd-antigenic substance and / or Qn / Qnd-antigenic substance-platelet, where Hep represents heparin, compounds derived from heparin, heparin-like compounds or mixtures thereof, Qn / Qnd represents quinine / quinidine, compounds derived from quinine / quinidine, quinine-like compounds / quinidine or mixtures thereof, said antibody material producing aggregation or activation of blood platelets causing thrombocytopenia.
  • an antibody material (a) anti-heparin or respectively (b) anti-
  • heparin derivatives in particular metallic heparinates (Ca 2+ , Li + , Na + , Hg ⁇ , etc.) and heparin fragments;
  • heparin analogues in particular heparinoids (heparamine and its salts, chondroitins and their salts, etc.), and heparins having a weight average molecular mass lower than 6000 daltons;
  • the method according to the invention for the determination of thrombocytopenia induced by an inducing drug (Z) is characterized in that it comprises the reaction (A) of an antigenic substance (Ag- ⁇ ) chosen from the group consisting of
  • the anti-antibody material (Y) will be chosen from the group consisting of anti (Z), anti (Z-platelet), anti (Z-Ag) and anti (Z-Ag-platelet) antibodies; in practice, the patient's plasma to be tested will be used as a source of anti (Y) material which generally contains anti (Z) and especially anti (Z-Ag).
  • the Ag-Z complex will first be prepared by reaction of Ag-Z with Z, then the reaction will be carried out
  • Ag-Z-anti (Y) We have also found that when we start with an Ag j _ antigenic substance comprising the Ag-Z complex, we improve the sensitivity of the assay by adding to the said complex an appropriate amount of the inducing drug Z.
  • a method is recommended according to the invention, which involves the reaction of an antigen (1) specific for the autoantibody (2) generated by the inducing drug after administration thereof, with said autoantibody (2), said method being characterized in that said antigen (1) is an antigenic substance (Ag- j _) chosen from the group consisting of
  • the autoantibody (2) is as indicated above chosen from anti (Hep), anti (Hep- platelet) anti ⁇ Hep-Ag- ⁇ ) and anti (Hep-Ag -plaquette) or respectively among anti (Qn / Qnd), anti (Qn / Qnd-platelet), anti ⁇ Qn / Qnd-Ag- ⁇ ) and anti (Qn / Qnd-Ag 1 ⁇ plate), the preferred ones being the autoantibodies directed against at least one complex of the inducing drug with the Ag means.
  • antigenic substance Ag for the determination of heparin-induced thrombocytopenia said antigenic substance Ag will be chosen from the group consisting of
  • fractions containing pF4 referred to as means (B) above, there may be mentioned in particular the polymers of pF4 comprising several parallel chains of the monomeric pF4.
  • fractions containing at least one substance eluted at the same time as pF4, which are referred to as means (C) above there may be mentioned in particular the substances PBP, LA-pF4, ⁇ TG and their mixtures. 1 6
  • proteoglycan-pF4 complexes referred to as means (G ) above, there may be mentioned in particular the complex constituted by the dimeric proteoglycan in which each proteoglycan group is linked to four tetrameric pF4 groups and having an average molecular weight of 368,000 daltons, said complex also being called "form
  • the Ag antigenic substances which are particularly preferred for determining the thrombocytopenia induced by heparin are chosen from the group consisting of
  • proteoglycan-pF4 complexes in particular the complex consisting of the dimeric proteoglycan in which each proteoglycan group is linked to 4 tetrameric pF4 groups and having an average molecular weight of 368,000 daltons, and
  • reaction (1) As part of the determination of heparin-induced thrombocytopenia, the implementation of the above-mentioned reaction (1) comprises:
  • Hep is defined as indicated above, and Ag is pF4, one of its polymers, proteoglycan, a proteoglycan-pF4 complex or a mixture thereof.
  • the platelets are cleaved or lysed.
  • pF4 its polymers and the proteoglycan-pF4 complexes are collected from lysed blood platelets, by fixation on heparin-agarose gel and then elution of said gel at a temperature of 15-25 ° C, using an aqueous eluent having, at a pH of 6.5-7.5, an ionic strength greater than or equal to 0.60.
  • the formation of the complex resulting from the reaction of said antigenic substance with said antibody material is detected by a method chosen from the group consisting of EIA, RIA, FIA and agglutination methods.
  • reaction (1) or, in the specific case of the determination of heparin-induced thrombocytopenia, of reactions (3) - (5), it is possible to use an EIA method called competition or ⁇ another so-called sandwich EIA method, according to a mechanism which comprises the reaction of said antigenic substance (1) with said antibody material (2), then the reaction of the complex thus formed with a labeled anti-antibody (Ig), in particular an anti-antibody Labeled (IgA), labeled anti (IgG) antibody or labeled anti (IgM) antibody.
  • Ig labeled anti-antibody
  • R comprises an enzyme detectable by an appropriate substrate; thus R can be POD and the corresponding suitable substrate can be OPD.
  • the antigenic substance Agi according to the invention will be reacted according to the so-called competition method (advantageously fixed on an appropriate support ) with a mixture consisting of the anti-antibody (Y) from the plasma to be studied and an antibody
  • marking means R comprises a
  • R possibly being POD and the corresponding suitable substrate possibly being OPD as indicated above.
  • an agglutination method may be used according to which the antigenic substance Ag- ⁇ fixed on a suitable support is reacted. (latex particles, liposome, liposome fragment, bentonite, carbon, colloidal gold or any other inert particles known in immunochemistry) with the patient's plasma containing the anti-antibody (Y).
  • the agglutination can be measured by pnotometry or read directly on a slide or by tube.
  • the antigen / antibody complex thus obtained in which the antigen is fixed on an appropriate support (preferably a wall), may be revealed by reaction with a suitable labeled antibody (antibody labeled with an enzyme, a fluorogenic means, a radioisotope, a colored latex particle, colloidal gold, etc.).
  • a suitable labeled antibody antibody labeled with an enzyme, a fluorogenic means, a radioisotope, a colored latex particle, colloidal gold, etc.
  • the dilution medium used for carrying out reaction (1) and its revelation, when the variation in optical density is measured by means of a photometer is an aqueous medium having, for normal plasma, an optical density less than or equal to 0.2 and better still less than or equal to 0.1.
  • a plasma dilution medium which is a phosphate buffer containing goat serum
  • the conditions used being a dilution of the plasma of normal subject and of the pathological plasma to be studied from 1/50 to 1/100 (v / v) and a quantity of goat serum of 5 to 10% by volume relative to said dilution medium.
  • a dilution medium for the plasma to be studied which has an optical density less than or equal to 0.2 and better still less than or equal to 0 , 1.
  • the anti (Ig) and anti (Ag ⁇ ) antibodies which come into play in the implementation of the invention can be polyclonal or monoclonal antibodies.
  • monoclonal antibodies one can (if desired but not essential) in the practice of the present invention) to use their F (ab) or F (ab ') 2 to prevent inte ⁇ raction possible with EN since said FR is very sensitive vis-à-vis the Fc fragments.
  • a kit is proposed for the determination of heparin-induced thrombocytopenia, characterized in that it comprises at least one sample of said antigenic substance chosen from the group consisting of: - the monomeric pF4 having a average molecular weight of 8,000 daltons,
  • the polymeric pF4 in particular the tetrameric pF4 having an average molecular weight of 32,000 daltons, the proteoglycan having an average molecular weight of 56,000 daltons,
  • proteoglycan-pF4 complexes in particular the complex consisting of the dimeric proteoglycan in which each proteoglycan group is linked to 4 tetrameric pF4 groups and having an average molecular weight of 368,000 daltons, or at least a sample of a complex of said substance antigen with heparin, and, where appropriate, dilution media and other reagents.
  • FIG. 1 shows a timing diagram of the separation of platelet fractions for obtaining pF4; and FIG. 2 represents the ODs of thrombocytopenic and normal plasmas diluted to 1/50 (part A) or to 1/100 (part B) and shows the advantage of adding goat serum to the dilution medium said plasmas.
  • EXAMPLE 1 Obtaining pF4 We start with a platelet lysate which is washed and thawed three times in succession. The lysate thus treated is brought into contact with an aqueous solution containing ammonium sulfate (60% w / v); a precipitate is formed. The supernatant is collected and subjected to a dialysis operation. The dialysate is deposited on a column of heparin-agarose gel then eluted at RT using an aqueous eluent (salt gradient) having, at a pH of 6.5-7.5, an ionic strength greater than or equal at 0.60.
  • aqueous eluent salt gradient
  • Elution with a salt gradient using an automatic analyzer-separator, provides the chromatogram (1) of FIG. 1 below in the 0D system (on the ordinate) at 280 ran eluted volume expressed in ml (on the abscissa) in which a denotes the volume "dead"; b denotes a first peak for 30 ml (injection of the salt gradient); c denotes a first fraction of 60 to 90 ml relating to glycoproteins and traces of thrombospondin, having a maximum peak for 70 ml; d denotes a second fraction of 90 to 132 ml relative main ⁇ ' _.
  • thrombos ⁇ pondine having a maximum peak for 100 ml (thrombospondin + glycoprotein) and a maximum peak for 112 ml (thrombos ⁇ pondine); e a third fraction of 132 to 180 ml relating mainly to ⁇ TG comprising a maximum peak for 142 ml (glycoprotein) and a maximum peak for 170 ml (3TG), and f a fourth fraction relating to pF4.
  • the fractions of peaks 70 (ie 70 ml), 100, 112, 142, 170 and pF4 were tested with the supernatant before deposition and the dead volume after coating ("coating") on the walls or bottoms of microcuvettes, opposite -vis pathological plasmas of subjects suffering from well characterized thrombocytopenia induced by heparin, calcium heparinate or magnesium heparinate and plasmas of normal subjects, said plasmas being diluted to l / 50è- l / 100è by means dilution medium (phosphate buffer supplemented with 10% v / v goat serum).
  • dilution medium phosphate buffer supplemented with 10% v / v goat serum
  • An immunoconjugate an anti (Ig) antibody labeled with peroxidase [in particular anti (IgA) -POD, anti (IgG) -P0D and anti (IgM) -POD], was used for the revelation (techni ⁇ that EIA sandwich) then development of the coloration using the OPD / H2O2 pair.
  • Hep here designating heparin and / or its metal salts
  • heparin pF4-Hep
  • a human antidg antibody in particular anti (IgA) -POD, anti (IgG) -POD or anti (IgM) -POD
  • development of the coloration by means of the pair OPD / H 2 0 2 . 5 Reagents
  • the kit, kit or assay kit includes the following reagents:
  • the cable 6 blocks ( "ships") of 16 wells each, coated with the antigen pF4 in the presence of Hep, in a proportion of 2 to 8 -g / ml (distinfé ⁇ No. 5- ⁇ g / ml) pF4 for 0.02 to 1 IU / ml (preferably 0.1 IU / ml) of Hep;
  • anti (human IgA, G or M) coupled to peroxidase namely: anti (IgA) -P0D, anti (IgG) -P0D or anti (IgM) -P0D; 0 - dilution medium: phosphate buffer containing
  • TWEEN 20 surfactant 25 a TWEEN 20 surfactant, 20 times concentrated (to be diluted at the time of use);
  • the plasmas to be tested are collected and treated as follows: plasma sampling on citrate l 0.109 M trisodium, centrifugation for 10 minutes at 3000 rpm and recovery of the supernatant. - The plasma sample to be tested must be diluted to l / 50è-l / 100è using the dilution medium. Procedure
  • the determination according to the invention makes it possible to compensate for the diagnostic errors of the aggregation test for patients No 14 and 16 who clearly had no heparin-induced thrombocytopenia) and patients No 17 and 22 (who were clearly suffering from heparin-induced thrombocytopenia); and
  • a second series of clinical trials was carried out according to the protocol of Example 2 on a batch of plasmas from patients with heparin-induced thrombocytopenia compared to a batch of plasma from normal subjects .
  • the plasmas of 21 thrombocytopenic patients and 32 normal subjects were used, with the pF4-heparin complex as antigenic substance produced from the following proportions: 5 g / ml of pF4 and 0.1 IU / ml calcium heparinate.

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Abstract

La présente invention a trait à la détermination de thrombopénies induites par une drogue inductrice. Selon l'invention, on utilise pour ladite détermination une substance antigénique choisie parmi l'ensemble constitué par les fractions qui (i) sont présentes dans les plaquettes sanguines et libérées desdites plaquettes sanguines par lyse, et (ii) ont une forte affinité vis-à-vis de la drogue inductrice (Z) et/ou des complexes de ladite drogue inductrice avec les plaquettes, ladite substance antigénique étant destinée à réagir avec un matériau anticorps anti(Y) contenu dans le plasma à tester et dirigé contre la drogue inductrice, ses fragments ou les produits contenant ladite drogue inductrice ou l'un de ses fragments. L'invention concerne également un procédé pour la détermination desdites thrombopénies, notamment celles induites par l'héparine.

Description

DETERMINATION DES THROMBOPENIES
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'utilisation d'une substance antigénique particulière dans la détermination des thrombopénies (également dénommées thrombocytopénies). Elle concerne aussi un procédé amélioré pour la détermination de ces maladies, notamment celles induites par diverses drogues inductrices, en par¬ ticulier par la quinine/quinidine (c'est-à-dire induites par la quinine, son diastéréoisomère la quinidine, et leurs mélanges) et surtout par l'héparine.
ART ANTERIEUR
On sait, notamment de l'article de .C. BERNDT et al., Blood Reviews l_, pages 111-118, (1987), que les thrombopénies peuvent être induites par de nombreux médicaments, et que les plus fréquentes sont provoquées par la quinine/quinidine et surtout l'héparine.
On sait que l'on administre l'héparine, en tant que moyen anticoagulant, aux personnes hospitalisées pour prévenir tout risque de thrombus veineux ou artériel. Statistiquement, on sait que (i) au moins 50 % des patients hospitalisés reçoivent de -'héparine par injection, et que (ii) 1 à 5 % des patients soumis à une héparino-thérapie sont atteints de thrombopénies pouvant se développer de façon particulièrement sévère entre le 5ème et le 15ème jours de 1'héparino-thérapie. Voir à cet effet les articles de - J.G. KELTON et al., Blood 12 (No 2), pages 925-930, (1988) ;
- B.H. CHONG et al., British Journal of Haematology 49, pages 531-540, (1981) ; - B.H. CHONG, Blood Reviews 2 , pages 108-114, (1986) ;
- D. SHERIDAN et al., Blood _67 (No 1), pages 27-30, (1986) ;
- Y. GRUEL, Sang Thrombose Vaisseaux, l_ (No 4), pages 233-236, (1989) ; - M. SAMAMA et al., Journal des Maladies Vasculaires 1_, pages 237-242, (1982) ; et
- J. C0NARD et al., intitulé : "Les thrombopénies à l'héparine" et publié dans l'ouvrage "Progrès en Hématologie 4, Les Plaquettes Sanguines", pages 107-118, Doin Editeurs, Paris (1983).
Chez les patients bénéficiant d'une héparino- thérapie et développant des thrombopénies, on connaît deux formes :
- les thrombopénies dites légères ou modérées qui sont asymptomatiques, et
- les thrombopénies dites sévères fréquemment accompagnées de complications thromboemboliques artériel¬ les ou veineuses résultant de l'apparition d'anticorps dirigés contre les plaquettes en présence d'héparine. Cette apparition d'anticorps est notamment illustrée par l'article de D.M. LYNCH et al., Blood ββ_ (No 5), pages 1176-1181, (1985) et par les articles précités de M.C. BERNDT et al., J.G. KELTON et al., B.H. CHONG et al., B.H. CHONG, D. SHERIDAN et al., et J. CONARD et al. (voir en particulier le mécanisme des thrombopénies induites par l'héparine présenté dans le tableau III, page 115 dudit article de J. CONARD et al.).
Le problème de la prophylaxie des accidents thrombopéniques n'est pas encore résolu. Il existe néan- moins le besoin d'une méthode de αosage rapide et fiable permettant d'apprécier le risque de développement de thrombopénies afin de stopper sufisamment tôt l'adminis¬ tration du médicament inducteur. A l'heure actuelle, les méthodes utilisées pour le diagnostic des thrombopénies sont celles qui comportent
(1) la recherche de l'absence d'une étiologie différente des thrombopénies (infections, autres thérapies, etc..) qui est longue et fastidieuse,
(2) la numération des plaquettes sanguines avant, pendant et après traitement, qui est longue et peu spécifique, ou
(3) les tests biologiques (énoncés ci-après) recherchant l'apparition d'anticorps dirigés contre les plaquettes en présence du médicament inducteur ou de la drogue inductrice.
Il se trouve que les examens biologiques les plus fréquemment utilisés sont les tests d'agrégation plaquettaire, qui nécessitent un appareillage adapté et mettent en oeuvre des modalités opératoires longues et manquant dans certains cas de sensibilité.
Les autres méthodes visées au point (3) ci- dessus, qui ont été décrites (voir en particulier les articles de J.G. KELTON et al., B.H. CHONG et al., B.H. CHONG, D. SHERIDAN et al., D.M. LYNCH et al. et Y. GRUEL précités), mettent en oeuvre l'étude de la fixation plaquettaire des IgG sériques, la libération de la sérotonine -^C-radiomarquée à deux concentrations diffé- rentes d'héparine, la disponibilité du facteur plaquet¬ taire 3, la fixation du complément, l'inhibition de la lyse du complément, et l'agglutination d'hématies (notam¬ ment de mouton) sensibilisées. Il se trouve que ces mé¬ thodes d'essais biologiques sont ou bien peu sensibles ou peu fiables, ou bien, si elles sont sensibles, longues à réaliser.
BUT DE L'INVENTION Selon un premier aspect de l'invention, on propose une nouvelle solution technique pour la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice (Z). Cette nouvelle solution technique repose sur la détection, (i) au moyen d'une substance antigénique (Ag) spécifique, (ii) d'un matériau immunolo- gique anticorps contenu dans le plasma du sujet à tester et choisi parmi l'ensemble constitué par les anticorps anti(Y) (où Y est notamment Z ou les complexes Z-Ag) dirigés notamment contre la drogue inductrice Z et ses complexes avec Ag.
Eu égard aux résultats des travaux entrepris par la Demanderesse, il a été trouvé que, chez les animaux à sang chaud, notamment l'homme et les mammifères, l'admi¬ nistration d'une drogue inductrice de thrombopénie produit des anticorps anti(Z), anti(Z-plaquette), anti(Z- Ag) et anti(Z-Ag-plaquette) conduisant à une agrégation ou une activation des plaquettes sanguines provoquant la thrombopénie.
La nouvelle solution technique selon l'invention pour la détermination des thrombopénies met en oeuvre une substance antigénique (Ag) obtenue notamment par le clivage ou la lyse de plaquettes sanguines et ayant une forte affinité vis-à-vis de la drogue inductrice, ladite substance antigénique étant destinée à réagir avec un anticorps anti(drogue inductrice), suivant le mécanisme
Agχ + anti(Y) > Ag1~anti(Y) (1) où
Ag désigne ladite substance antigénique
Ag ou les complexes contenant ladite substance antigénique, anti(Y) désigne un matériau anti-corps contenu dans le plasma à tester et dirigé contre la drogue inductrice Z et les complexes la contenant (notamment les complexes Z-Ag-^, Z- plaquette, Z- Agi-plaquette) produisant une agrégation ou une activation des plaquettes sanguines provoquant la thrombopénie.
Cette nouvelle solution technique offre l'avantage, à la différence des solutions antérieurement connues, d'être fiable, très sensible et rapide de mise en oeuvre.
Le résultat de la réaction (1) ci-dessus peut être détecté, signalé ou amplifié selon une méthode connue en soi (notamment par agglutination, EIA, RIA ou FIA).
Selon un second aspect de l'invention, on préconise un procédé pour la détermination fiable et rapide des thrombopénies induites par toute drogue inductrice, en particulier la quinine/quinidine et surtout l'héparine.
OBJET DE L'INVENTION
Suivant l'invention, on propose donc une utilisation d'une substance antigénique dans la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice (Z), ladite utilisation étant caractérisée en ce que ladite substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les fractions qui (i) sont présentes dans les plaquettes sanguines et libérées des¬ dites plaquettes sanguines par clivage "i lyse, et (ii) ont une forte affinité vis-à-vis de la drogue inductrice (Z) et/ou des complexes de ladite drogue inductrice avec les plaquettes; et en ce que ladite substance antigénique est destinée à réagir avec un matériau anticorps anti(Y) contenu dans le plasma à tester et dirigé contre la dro¬ gue inductrice, ses fragments ou les produits contenant ladite drogue inductrice ou l'un de ses fragments.
Une telle utilisation convient pour toute drogue inductrice (Z) de thrombopénies d'origine immune notam¬ ment le paracétamol, 1'acétazolamide, l'aspirine, l'al- lylisopropylcarbamide, 1'alprénolol, l'amrinone, l'anta- zoline, les bléomycines, la carbamazépine, la céphalothine, le chlorothiazide, le chlorpropamide, la cimétidine, le clonazépam, les sulfonamides (notamment le sulfaméthoxazole, la sulfaméthazine, la sulfaméthoxypy- ridazine, etc.) les associations sulfonamide-triméhoprim (notamment l'association sulfaméthoxazole-triméthoprim dans le rapport pondéral 5/1), le DDT, la désipramine, le diazépam, la digitoxine, la diphénylhydantoine, le fénoprofen, l'héroine, 1'hydrochlorothiazide, l'isoniazi- de, le L-(-)-tétramisole, la lévodopa, la lignocaine, le méprobamate, la méthicilline sodique, le minoxidil, la morphine, la novobiocine, les dérivés organiques de l'arsenic, l'oxyphenbutazone, l'oxprénolol, l'acide p- aminosalicylique, les pénicillines, le procainamide, la prochlorpérazine, le propylthiouracil, la rifampicine, la spironolactone, le stibophen, le sulindac et le tolbutamide. Cette utilisation est particulièrement intéressante dans la détermination des thrombopénies les plus fréquentes qui sont induites par la quinine/ quinidine et surtout l'héparine.
On préconise un procédé pour la détermination des thrombopénies induite par toute drogue inductrice (Z), ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend la réaction (1) précitée, dans laquelle le matériau anticorps anti(Y) est dirigé contre - la drogue inductrice Z, - les substances contenant ladite drogue indue- trice (notamment less complexes Z-Ag- Z-plaquette ou Z-Ag-^-plaquette et les polymères de Z),
- les substances dérivant ou analogues à Z (no¬ tamment les fragments de Z et les métabolites de Z),
- les produits contenant lesdites substances dé¬ rivant ou analogues à Z (notamment leurs com¬ plexes), ou
J.U - leurs mélanges.
Selon l'invention on propose enfin des nécessaires, trousses ou kits de dosage pour la détermination des thrombopénies caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins un échantillon de ladite substance 15 antigénique précitée ou l'un de ses complexes, et, le cas échéant, des milieux de dilution appropriés et/ou d'autres réactifs.
ABREVIATIONS 0 Dans ce qui suit, par commodité les abréviations suivantes ont été utilisées.
Ag désigne la substance antigénique selon l'invention ayant une forte affinité vis-à-vis de la drogue inductrice Z ; 5
Agι_ désigne ladite substance antigénique Ag et les complexes la comprenant; anti(Z) désigne un anticorps généré contre la drogue inductrice (Z) ; 0 anti(X) désigne tout anticorps généré contre la substance X, ainsi anti(Z), anti(Ig), anti (IgA), anti(IgG) et respectivement anti (IgM) désignent tout anticorps généré contre la drogue inductrice Z, les immuno- globulines Ig, les IgA, les IgG et respec¬ tivement les IgM;
EIA désigne un essai enzymo-immunologique (en anglais : "enzyme immunoassay"); ELISA abréviation de l'expression anglaise "enzyme-lin ed immunosorbent assay", désigne une technique EIA particulière ;
F(ab) désigne un premier fragment d'un anticorps obtenu par clivage dudit anticorps par la papaine;
F(ab')2 désigne un second fragment d'un anticorps obtenu par clivage dudit anticorps par la pepsine;
Fc désigne tout fragment d'anticorps, séparé du fragment F(ab) par clivage au moyen de la papaine ou séparé du fragment Fζab'^ par clivage au moyen de la pepsine ; les- dits fragments Fc sont homologues mais légèrement structurellement différents selon qu'ils ont été clivés par la papaine ou la pepsine (la structure et le mode d'obtention du F(ab), du F(ab')2 et des Fc est illustré dans la demande de brevet français No 89 04 589 déposée le 7 avril 1989) ;
FIA désigne un essai fluoroimmunologique (en anglais : "fluorescent immunoassay")
FR désigne le Facteur Rhumatoïde ; Hep désigne l'héparine, ses dérivés ou ses analogues (y compris leurs complexes avec les plaquettes)
HRGP désigne une glycoprotéine riche en histidine (en anglais : "histidine-rich glycoprotein") ; S. désigne toute immunoglobuline ;
IgA désigne toute immunoglobuline A IgG désigne toute immunoglobuline G IgM désigne toute immunoglobuline M LA-pF4 désigne un précurseur de βTG (en an¬ glais : "low-affinity pF4") ;
OD désigne la densité optique (mesurée notam¬ ment à une longueur d'onde de 492 nm) ;
OPD désigne 1'ortho-phénylènediamine ; PBP désigne le précurseur du LA-pF4, à savoir la protéine basique de plaquette (en an¬ glais : "platelet basic protein") pF3 désigne le facteur plaquettaire 3 pF4 désigne le facteur plaquettaire 4
PM désigne le poids moléculaire ;
POD désigne la peroxydase ;
Qn/Qnd désigne (i) la quinine, la quinidine, leurs mélanges, les dérivés ou analogues correspondants désigne un moyen de marquage ; RIA désigne un essai radio-immunologique (en anglais : "radio immunoassay")
RT désigne la température ambiante (15-25°C) ; TG désigne la béta-thromboglobuline et résulte de la dégradation ou du clivage partiel de LA-pF4 ; désigne la drogue inductrice Z, les pro¬ duits la contenant et ses dérivés et/ou analogues; désigne la drogue inductrice de thrombopé¬ nies. DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La présente invention concerne la détermination de thrombopénies d'origine immune.
La substance antigénique Ag]_ selon l'invention englobe le matériau antigénique Ag qui est constitué par des fragments plaquettaires (y compris les parois), des fractions intraplaquettaires libérables des plaquettes sanguines par clivage ou lyse, et éventuellement des substances plasmatiques ou sanguines, d'une part, et les complexes desdits fragments plaquettaires, desdites frac¬ tions intraplaquettaires et desdites substances plasmati¬ ques ou sanguines, d'autre part.
Par l'expression "ayant une forte affinité vis-à- vis de la drogue inductrice Z" appliquée à la substance antigénique, on entend le fait que la substance antigéni¬ que Ag réagit aisément avec la drogue inductrice Z, les dérivés de Z, les analogues de Z et les produits conte¬ nant Z.
Eu égard à l'affinité de Ag pour la drogue inductrice Z, les dérivés de Z (notamment les métaboli- tes), les analogues de Z (notamment les héparinoides quand Z est Hep), et les produits contenant Z, on obtient l'ensemble des produits et complexes inclus dans la défi¬ nition de Agτ_. On préconise en particulier pour la détermination des thrombopénies les plus fréquentes, une nouvelle utilisation d'une substance antigénique dans la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice telle que (a) l'héparine ou (b) la quinine/quinidine, ladite utilisation étant caractérisée en ce que ladite substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les fractions qui (i) sont des fractions plaquettaires notamment obtenues par clivage ou la lyse de plaquettes sanguines et (ii) ont une forte affinité vis-à-vis (a) de Hep ou (b) de Qn/Qnd. et en ce que ladite substance antigénique est destinée à réagir avec un matériau anticorps (a) anti-héparine ou respectivement (b) anti-quinine/quinidine contenu dans le plasma à tester et dirigé contre (a) Hep, les complexes Hep-plaquette, Hep-substance antigénique et/ou Hep- substance antigénique-plaquette, ou respectivement (b) Qn/Qnd, les complexes Qn/Qnd-plaquette, Qn/Qnd-substance antigénique et/ou Qn/Qnd-substance antigénique-plaquette, où Hep représente l'héparine, les composés qui dérivent de l'héparine, les composés analogues à l'héparine ou leurs mélanges, Qn/Qnd représente la quinine/quinidine, les composés qui dérivent de la quinine/ quinidine, les composés analogues à la quinine/quinidine ou leurs mélanges, ledit matériau anticorps produisant une agrégation ou une activation des plaquettes sanguines provoquant la thrombopénie. Compte tenu des définitions données ci-dessus, lorsque la drogue inductrice Z est l'héparine, le terme Hep englobe tout produit choisi parmi l'ensemble consti¬ tué par
- l'héparine proprement dite ayant un PM moyen de 6 000-30 000 daltons et un pou¬ voir rotatoire [^j?0 d'environ + 55°;
- les dérivés de l'héparine, notamment les héparinates métalliques (Ca2+, Li+, Na+, HgΔ , etc..) et les fragments d'hépari¬ ne;
- les analogues de l'héparine, notamment les héparinoïdes (héparamine et ses sels, les chondroitines et leurs sels, etc..), et les héparines ayant un poids moléculaire moyen inférieur à 6 000 dal- tons;
- les substances contenant l'héparine, ses dérivés et analogues, notamment les com- plexes de l'héparine et de ses dits dé¬ rivés et analogues; et
- leurs mélanges.
Comme indiqué plus haut, le procédé selon l'in¬ vention pour la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice (Z), est caractérisé en ce qu'il comprend la réaction (A) d'une substance antigéni¬ que (Ag-^) choisie parmi l'ensemble constitué par
(i) les fractions (Ag) qui ont une forte affinité vis-à-vis de l'ensemble cons- titué par (a) la drogue inductrice,
(b) ses dérivés, (c) ses analogues, (d) les produits contenant Z, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, et qui sont notamment obtenues par le clivage ou la lyse des plaquettes sanguines; et (ii) les substances renfermant au moins un complexe Ag-Z, avec (B) un matériau anticorps anti(Y), où anti(Y) repré- sente un matériau anticorps dirigé contre (a) Z, (b) les dérivés de Z, (c) les analogues de Z, ( d) les produits contenant Z, ses dérivés ou ses analogues, ou (e) leurs mélanges.
De façon préférée, le matériau anticorps anti(Y) sera choisi parmi l'ensemble constitué par les anticorps anti(Z), anti(Z-plaquette), anti(Z-Ag) et anti(Z-Ag- plaquette); en pratique on utilisera le plasma du patient à tester comme source de matériau anti(Y) qui contient en général les anti(Z) et surtout les anti(Z-Ag). Pour la mise en oeuvre de la réaction (1) préci¬ tée, on préparera d'abord le complexe Ag-Z par réaction de Ag-Z avec Z, puis on mettra en oeuvre la réaction
Ag-Z + anti(Y) > Ag-Z-anti(Y) On a par ailleurs, constaté que lorsqu'on part d'une substance antigénique Agj_ comprenant le complexe Ag-Z, on améliore la sensibilité du dosage en ajoutant au dit complexe une quantité appropriée de la drogue induc¬ trice Z. Pour la détermination des thrombopénies induites par (a) l'héparine ou respectivement (b) la quinine/qui¬ nidine, on préconise selon l'invention un procédé, qui comporte la réaction d'un antigène (1) spécifique de l'auto-anticorps (2) généré par la drogue inductrice après administra¬ tion de celle-ci, avec ledit auto-anticorps (2), ledit procédé étant caractérisé en ce que ledit antigène (1) est une substance antigénique (Ag-j_) choisie parmi l'ensemble constitué par
(i) les fractions (Ag) qui ont une forte activité vis-à-vis de l'ensemble constitué par (a) l'hépa¬ rine, (b) ses dérivés, (c) ses analogues, (d) les produits contenant l'héparine, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, ou respective¬ ment vis-à-vis de l'ensemble constitué par (a) la quinine/quinidine, (b) ses dérivés, (c) ses analogues, (d) les produits contenant la quinine/ quinidine, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, et qui sont notammer „ obtenus par le clivage ou la lyse des plaquettes sanguines; et (ii) les substances renfermant au moins un com¬ plexe de ladite fraction (Ag) avec Hep ou respec¬ tivement Qn/Qnd, où Hep et Qn/Qnd sont définis comme indiqué ci-dessus. Dans ce procédé particulier relatif à la détermi¬ nation des thrombopénies induites par l'héparine ou la quinine/quinidine, l'auto-anticorps (2) est comme indiqué ci-dessus choisi parmi les anticorps anti(Hep), anti(Hep- plaquette) antiζHep-Ag-^) et anti(Hep-Ag -plaquette) ou respectivement parmi les anticorps anti(Qn/Qnd) , anti(Qn/ Qnd-plaquette) , antiζQn/Qnd-Ag-^) et anti(Qn/Qnd-Ag1~pla- quette), les préférés étant les auto-anticorps dirigés contre au moins un complexe de la drogue inductrice avec le moyen Ag.
Pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine ladite substance antigénique Ag sera choisie parmi l'ensemble constitué par
(A) le facteur plaquettaire 4 (pF4), (B) les fractions contenant le pF4,
(C) les fractions contenant au moins une sub¬ stance éluée en même temps que le pF4,
(D) le pF4 recombinant et ses variants,
(E) les peptides synthétiques reprenant tout ou une partie de la séquence des aminoacides du pF4 (en particulier les peptides carboxy-ter- minaux 1-13 ou 13-24) ,
(F) le protéoglycan,
(G) les complexes protéoglycan-pF4 , et (H) leurs mélanges.
Parmi les fractions contenant le pF4 visées en tant que moyen (B) ci-dessus, on peut mentionner notamment les polymères du pF4 comprenant plusieurs chaînes parallèles du pF4 monomère. Parmi les fractions contenant au moins une substance éluée en même temps que le pF4, qui sont visées en tant que moyen (C) ci-dessus, on peut notamment mentionner les substances PBP, LA-pF4, βTG et leurs mélanges. 1 6
Parmi les complexes protéoglycan-pF4 visés en tant que moyen (G) ci-dessus, on peut notamment citer le complexe constitué par le proteoglycan dimère dans lequel chaque groupe proteoglycan est lié à quatre groupes pF4 tétramère et ayant un poids moléculaire moyen de 368 000 daltons, ledit complexe étant également dénommé "forme
native du pF4" et présentant une forte affinité pour l'héparine. Ledit complexe peut être représenté par la formule suivante
tons;
tons;
Figure imgf000018_0001
Les substances antigéniques Ag particulièrement préférées pour la détermination des thrombopénies indui¬ tes par l'héparine sont choisies parmi l'ensemble cons- titué par
- le pF4 monomère ayant un poids moléculaire moyen de 8 000 daltons,
- le pF4 polymère, notamment le pF4 tétramère ayant un poids moléculaire moyen de 32 000 daltons,
- le proteoglycan ayant un poids moléculaire moyen de 56 000 daltons,
- les complexes protéoglycan-pF4, notamment le complexe constitué par le proteoglycan dimère dans lequel chaque groupe proteoglycan est lié à 4 groupes pF4 tétramère et ayant un poids moléculaire moyen de 368 000 daltons, et
- leurs mélanges. Selon le meilleur mode de mise en oeuvre de l'invention, on préfère avantageusement utiliser des substances antigéniques Ag-^ qui sont des complexes desdites substances Ag sus-visées avec Hep. λτ
Dans le cadre de la détermination des thrombopé¬ nies induites par l'héparine, la mise en oeuvre de la réaction (1) précitée comprend :
1°) la formation et/ou l'activation de la substance antigénique selon le mécanisme :
Ag + Hep > Ag-Hep (2)
2°) l'une des réactions correspondantes :
Ag-Hep + anti(Hep) > Ag-Hep-anti(Hep) (3)
Ag-Hep + anti(Hep-Ag) >Ag-Hep-anti(Hep-Ag) (4) Ag-Hep + anti(Hep-Ag-plaquette) >
Ag-Hep-anti(Hep-Ag-plaquette) (5) où
Hep est défini comme indiqué ci-dessus, et Ag est pF4, un de ses polymères, le proteoglycan, un complexe protéoglycan-pF4 ou un de leurs mélanges.
Pour l'obtention des moyens A-H sus-visés, on procède au clivage ou à la lyse de plaquettes sanguines. De façon avantageuse, le pF4, ses polymères et les complexes protéoglycan-pF4 sont recueillis à partir de plaquettes sanguines lysées, par fixation sur gel d'héparine-agarose puis élution dudit gel à une tempéra¬ ture de 15-25° C, au moyen d'un éluant aqueux ayant, à un pH de 6,5-7,5, une force ionique supérieure ou égale à 0,60.
Selon l'invention, la formation du complexe résultant de la réaction de ladite substance antigénique avec ledit matériel anticorps est détectée par une méthode choisie parmi l'ensemble constitué par les méthodes EIA, RIA, FIA et agglutination.
Pour la révélation de la réaction (1) ou, dans le cas spécifique de la déterminat-on des thrombopénies induites par l'héparine, des réactions (3)-(5), on peut mettre en oeuvre une méthode EIA dite de compétition ou λ encore une méthode EIA dite sandwich, selon un mécanisme qui comprend la réaction de ladite substance antigénique (1) avec ledit matériau anticorps (2), puis la réaction du complexe ainsi formé avec un anticorps anti(Ig) marqué, notamment un anticorps anti(IgA) marqué, anticorps anti(IgG) marqué ou anticorps anti(IgM) marqué.
A titre d'exemple, pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, l'on fera réagir selon la méthode sandwich le produit des réactions (3)- (5), à savoir Ag-Hep-anti(Hep) , Ag-Hep-anti(Hep-Ag) ou Ag-Hep-anti(Hep-Ag-plaquette), avec un anticorps de
*fr -k formule anti(Ig)-R , où le moyen de marquage R comprend un enzyme détectable par un substrat approprié; ainsi R peut être POD et le substrat approprié correspondant peut être OPD.
A titre d'exemple pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine ou l'une des autres drogues inductrices, l'on fera réagir selon la méthode dite de compétition la substance antigénique Agi selon l'invention (avantageusement fixée sur un support approprié) avec un mélange constitué par l'anticorps anti(Y) provenant du plasma à étudier et un anticorps
-k -t anti(Agi )-R , où le moyen de marquage R comprend un
-k enzyme détectable par un substrat approprié, R pouvant être POD et le substrat approprié correspondant pouvant être OPD comme indiqué ci-dessus.
Egalement à titre d'exemple pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine ou toute autre drogue inductrice, l'on pourra utiliser une méthode d'agglutination selon laquelle l'on fait réagir la substance antigénique Ag-^ fixée sur un support approprié (particules de latex, liposome, fragment de liposome, bentonite, charbon, or colloidal ou toutesautresparticules inertes connues en immunochimie) avec le plasma du malade contenant l'anticorps anti(Y). L'agglutination peut être mesurée par pnotometrie ou lue directement sur lame ou en tube.
En variante, le complexe antigène/anticorps ainsi obtenu, dans lequel l'antigène est fixé sur un support approprié (de préférence une paroi), pourra être révélé par réaction avec un anticorps marqué convenable (anticorps marqué par un enzyme, un moyen fluorogène, un radio-isotope, une particule de latex colorée, de l'or colloidal, etc..).
D'un point de vue pratique, le milieu de dilution utilisé pour la mise en oeuvre de la réaction (1) et sa révélation, quand on mesure au moyen d'un photomètre la variation de densité optique, est un milieu aqueux ayant, pour un plasma normal, une densité optique inférieure ou égale à 0,2 et mieux inférieure ou égale à 0,1. De préférence, une telle densité optique initiale est obtenue avec un milieu de dilution du plasma qui est un tampon phosphate contenant du sérum de chèvre, les conditions utilisées étant une dilution du plasma de sujet normal et du plasma pathologique à étudier de 1/50 à 1/100 (v/v) et une quantité de sérum de chèvre de 5 à 10 % en volume par rapport audit milieu de dilution. En d'autres termes, pour une détermination selon une méthode photométrique, l'on fera appel à un milieu de dilution pour le plasma à étudier qui a une densité optique infé- rieure ou égale à 0,2 et mieux inférieure ou égale à 0,1.
Avec les milieux de dilution classiques, on obtient dans les mêmes conditions une densité optique pour le plasma normal supérieure ou égale à 0,6 qui ne permet pas d'apprécier correctement l'augmentation de la variation de densité optique lors de l'analyse relative aux plasmas pathologiques.
Les anticorps anti(Ig) et anti(Ag^) qui inter¬ viennent dans la mise en oeuvre de l'invention peuvent être des anticorps polyclonaux ou monoclonaux. Quand on utilise des anticorps monoclonaux, on peut (si on le souhaite mais cela n'est pas essentiellement nécessaire dans la pratique de la présente invention) faire appel à leurs fragments F(ab) ou F(ab')2 pour éviter toute inte¬ raction possible avec FR dès lors que ledit FR est très sensible vis-à-vis des fragments Fc. Selon l'invention, on propose enfin un nécessaire pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un échantillon de ladite substance antigénique choisie parmi l'ensemble constitué par : - le pF4 monomère ayant un poids moléculaire moyen de 8 000 daltons,
- le pF4 polymère, notamment le pF4 tétramère ayant un poids moléculaire moyen de 32 000 daltons, - le proteoglycan ayant un poids moléculaire moyen de 56 000 daltons,
- les complexes protéoglycan-pF4, notamment le complexe constitué par le proteoglycan dimère dans lequel chaque groupe proteoglycan est lié à 4 groupes pF4 tétramère et ayant un poids moléculaire moyen de 368 000 daltons, ou au moins un échantillon d'un complexe de ladite substance antigénique avec l'héparine, et, le cas échéant, des milieux de dilution et d'autres réactifs.
D'autres avantages et caractéristiques de l'in¬ vention seront mieux compris à la lecture des exemples de réalisation et des dessins qui suivent. L'ensemble de ces éléments n'est nullement limitatif mais est donné à titre d'illustration.
Dans les dessins :
- la figure 1 représente un chrorna ogramme de la séparation de fractions plaquettaires pour l'obtention du pF4; et - la figure 2 représente les OD de plasmas throm- bopéniques et normaux dilués au l/50è (partie A) ou au l/100è (partie B) et montre l'intérêt de l'addition de sérum de chèvre dans le milieu de dilution desdits plasmas.
EXEMPLE 1 Obtention de pF4 On part d'un lysat plaquettaire qu'on lave et décongèle trois fois de suite. Le lysat ainsi traité est mis en contact avec une solution aqueuse contenant du sulfate d'ammonium (60 % p/v) ; il se forme un précipité. On recueille le surnageant et on le soumet à une opéra¬ tion de dialyse. Le dialysat est déposé sur une colonne de gel d'héparine-agarose puis élue à RT au moyen d'un éluant aqueux (gradient de sel) ayant, à un pH de 6,5- 7,5, une force ionique supérieure ou égale à 0,60.
L'élution avec un gradient de sel, à l'aide d'un analyseur-séparateur automatique, fournit le chromato- gramme (1) de la figure 1 ci-après dans le système 0D (en ordonnées) à 280 ran volume élue exprimé en ml (en abscisses) dans lequel a désigne le volume "mort"; b désigne un premier pic pour 30 ml (injec¬ tion du gradient de sel); c désigne une première fraction de 60 à 90 ml relative à des glycoprotéines et des traces de thrombospondine, présentant un pic maximal pour 70 ml; d désigne une seconde fraction de 90 à 132 ml relative principaleme~'_. à la thrombos¬ pondine, présentant un pic maximal pour 100 ml (thrombospondine + glycoprotéine) et un pic maximal pour 112 ml (thrombos¬ pondine) ; e une troisième fraction de 132 à 180 ml re¬ lative principalement à βTG comprenant un pic maximal pour 142 ml (glycoprotéine) et un pic maximal pour 170 ml (3TG), et f une quatrième fraction relative au pF4.
Les fractions des pics 70 (i.e. 70 ml), 100, 112, 142, 170 et pF4 ont été testées avec le surnageant avant dépôt et le volume mort après revêtement ("coating") sur les parois ou fonds de microcuvettes, vis-à-vis de plasmas pathologiques de sujets atteints de thrombopénies bien caractérisées induites par l'héparine, l'héparinate de calcium ou l'héparinate de magnésium et de plasmas de sujets normaux, lesdits plasmas étant dilués au l/50è- l/100è au moyen d'un milieu de dilution (tampon phosphate additionné de 10 % v/v de sérum de chèvre).
Un immunoconjugué, un anticorps anti(Ig) marqué à la peroxydase [notamment anti(IgA)-POD, anti(IgG)-P0D et anti(IgM)-POD] , a été utilisé pour la révélation (techni¬ que EIA sandwich) puis développement de la coloration au moyen du couple OPD/H2O2.
La réactivité comparée des plasmas normaux et des plasmas pathologiques a mis en évidence que la fraction contenant le pF4 était la plus efficace pour fixer l'auto-anticorps anti(Y) responsable de la thrombopénie. EXEMPLE 2
Détermination des thrombopénies induites par l'héparine On préconise le protocole suivant pour la déter¬ mination des thrombopénies induites par l'héparine et ses sels métalliques.
On procède directement sur plasma selon une technique EIA sandwich. Les auto-anticorps générés par
Hep (désignant ici l'héparine et/ou ses sels métalliques) et contenus dans le plasma, sont fixés par l'antigène d'origine plaquettaire en présence d'héparine (pF4-Hep) ε^ et révélés par un anticorps antidg humaine)-POD [notam¬ ment anti(IgA)-POD, anti(IgG)-POD ou anti(IgM)-POD] puis développement de la coloration au moyen du couple OPD/H202. 5 Réactifs
Le nécessaire, kit ou trousse de dosage comprend les réactifs suivants :
- plaque préenduite ("precoated") : plaque séca-
l ble en 6 blocs ("ships") de 16 cupules chacun, revêtue par l'antigène pF4 en présence d'Hep, selon une proportion de 2 à 8 -g/ml (de préfé¬ rence 5 μ-g/ml) de pF4 pour 0,02 à 1 Ul/ml (de préférence 0,1 Ul/ml) de Hep;
15 - anti(Ig) marqué : immunoglobulines de chèvre
anti(IgA, G ou M humaines) couplées à la pero- xydase [à savoir : anti(IgA)-P0D, anti(IgG)-P0D ou anti(IgM)-P0D; 0 - milieu de dilution : tampon phosphate contenant
10 % (v/v) de sérum de chèvre;
- solution de lavage : solution aqueuse contenant
25 un agent tensioactif TWEEN 20, 20 fois concen¬ tré (à diluer au moment de l'emploi);
- substrat OPD : 5 à 10 comprimés renfermant cha-
cun 2 mg de OPD; et
30 - le cas échéant, des échantillons de référence standardisés pour étalonnage, et une source de H202.
Principes opératoires
- Les plasmas à tester, qu'ils soient pathologi¬ ques ou normaux sont recueillis et traités comme suit : prélèvement du plasma sur citrate l trisodique 0,109 M, centrifugation pendant 10 minutes à 3000 tours/minute et récupération du surnageant. - L'échantillon de plasma à tester doit être dilué au l/50è-l/100è au moyen du milieu de di¬ lution. Procédure
1. "Coating" La fixation de la substance antigénique pF4-Hep est réalisée dans chaque cupule au moyen de 5 u.g/m.1 de pF4 et de 0,1 Ul/ml d'Hep.
2. Addition de l'anticorps
On ajoute 200 μ . du milieu de dilution contenant le plasma à tester (dans lequel est présent le matériau auto-anticorps responsable de la thrombopénie induite par Hep) par cupule.
3. Incubâtion/lavage
On incube pendant 2 h à RT, puis procède à 3 la¬ vages successifs au moyen de la solution de lavage après avoir diluée celle-ci.
4. Addition de 1'immunocon ugué
On introduit dans chaque cupule 200 u-1 d'immuno¬ conjugué marqué à la peroxydase.
5. Incubation/lavage On incube le milieu réactionnel résultant pendant
2 h à RT, puis procède à 3 lavages successifs au moyen de la solution de lavage diluée.
6. Coloration
On ajoute 200 μ-1 du couple 0PD/H 02 par cupule; incube pendant 3 minutes à RT; stoppe la réaction par addition de 50 u1 de H SO 3M par cupule; et lit la valeur de OD à 492 nm. •>*._ ~*
EXEMPLE 3
Corrélation Des essais cliniques ont été réalisés en parallèle selon le protocole de l'exemple 2 par comparaison avec la technique antérieure faisant appel à l'agglutination des plaquettes sanguines par l'héparine. Dans cette optique, le plasma de chaque patient hospitalisé présumé atteint de thrombopénie induite par l'hépa rine, a été séparé en deux lots, un pour chaque technique. Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau I ci-après. Ces résultats mettent en évidence que (i) quand le test d'agrégation des plaquettes à l'héparine est douteux, la détermination se¬ lon l'invention permet de lever le doute : thrombopénie pour les patients No 4 et 15, absence de thrombopénie pour les patients No 2 et 25;
(ii) la détermination selon l'invention permet de pallier les erreurs de diagnostic du test d'agrégation pour les patients No 14 et 16 qui n'avaient manifestement pas de thrombopé¬ nie induite par l'héparine) et les patients No 17 et 22 (qui étaient manifestement at¬ teints de thrombopénie induite par l'hépari- ne); et
(iii) il existe une bonne corrélation pour les ré¬ sultats obtenus pour le reste des autres pa¬ tients. Ces essais cliniques mettent en évidence l'intérêt de la détermination des thrombopénies selon l'invention, en ce qui concerne la rapidité et la fiabi"__.té, par rapport à la technique antérieure d'agrégation des plaquettes. 2.
EXEMPLE 4
Autres essais cliniques Une seconde série d'essais cliniques a été réali¬ sée selon le protocole de l'exemple 2 sur un lot de plasmas de patients atteints de thrombopénie induite par l'héparine par rapport à un lot de plasma de sujets nor¬ maux. Dans cette seconde série d'essais on a utilisé les plasmas de 21 patients thrombopéniques et de 32 sujets normaux, avec comme substance antigène un complexe pF4- héparine élaboré à partir des proportions suivantes : 5 g/ml de pF4 et 0,1 Ul/ml d'héparinate de calcium.
Les résultats consignés dans la figure 2 ci-après où la partie "a"concerne une dilution au l/50è de chaque plasma à tester, et la partie "b"une dilution au l/100è de chacun desdits plasmas, montrent l'intérêt de l'addition de 10 % v/v de sérum de chèvre dans le milieu de dilution pour avoir une 0D toujours inférieure à 0,1 pour les plasmas normaux. Lorsque l'OD des plasmas normaux dilués au l/50è ou au l/100è est supérieure à 0,3 voire 0,6, il devient difficile d'apprécier les OD des plasmas thrombo¬ péniques avec un photomètre.
TABLEAU I
Patient Détermination test d'agrégation selon l'invention à l'héparine (a) (b) (c)
A B C B A A A A A A A A A A B A (d) C A A C A C
Figure imgf000029_0001
A
.../ TABLEAU I (fin)
Patient Détermination test d'agrégation selon l'invention à l'héparine (a) (b) (c)
24 1,64 1,30 A 25 0,13 0,10 B
Contrôle. 0,12 0,08 (e) ;
(0,06-0,21). (0,04-0,13)
Notes
(a) avec plasma dilué au l/50è; (b) avec plasma dilué au l/100è; (c) avec la notation suivante :
A résultat positif;
B résultat douteux;
C résultat négatif;
(d) résultat évalué à tort positif (erreur due à la grossesse de la patiente); (e) effectué sur plasma de sujet normal valeur moyenne et intervalle.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une substance antigénique dans la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice (Z), ladite utilisation étant caractérisée en ce que ladite substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les fractions qui (i) sont présentes dans les plaquettes sanguines et libérées des¬ dites plaquettes sanguines par clivage ou lyse, et (ii) ont une forte affinité vis-à-vis de la drogue inductrice (Z) et/ou des complexes de ladite drogue inductrice avec les plaquettes; et en ce que ladite substance antigénique est destinée à réagir avec un matériau anticorps anti(Y) contenu dans le plasma à tester et dirigé contre la dro¬ gue inductrice, ses fragments ou les produits contenant ladite drogue inductrice ou l'un de ses fragments.
2. Utilisation suivant la revendication 1 d'une sub¬ stance antigénique dans la détermination des thrombopé¬ nies induites par une drogue inductrice telle que (a) l'héparine ou (b) la quinine/quinidine, ladite utilisa- tion étant caractérisée en ce que ladite substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les fractions qui (i) sont des fractions plaquettaires notamment obtenues par le clivage ou la lyse de plaquettes sanguines et (ii) ont une forte affinité vis- à-vis (a) de Hep ou (b) de Qn/Qnd et en ce que ladite substance antigénique est destinée à réagir avec un matériau anticorps (a) anti-héparine ou respectivement (b) anti-quinine/quinidine contenu d-*ιs le plasma à tester et dirigé contre (a) Hep, les complexes Hep- plaquette, Hep-substance antigénique et/ou Hep-substance antigénique-plaquette, ou respectivement (b) Qn/Qnd, les complexes Qn/Qnd-plaquette, Qn/Qnd-substance antigénique et/ou Qn/Qnd-substance antigénique-plaquette, où
Hep représente l'héparine, les composés qui dérivent de l'héparine, les composés analogues à l'héparine ou leurs mélanges, Qn/Qnd représente la quinine/quinidine, les composés qui dérivent de la quinine/ quinidine, les composés analogues à la quinine/quinidine ou leurs mélanges, ledit matériau anticorps produisant une agrégation ou une activation des plaquettes sanguines provoquant la throm¬ bopénie.
3. Utilisation suivant la revendication 2, carac¬ térisée en ce que, pour la détermination des thrombo- pénies induites par l'héparine, ladite substance anti¬ génique est choisie parmi l'ensemble constitué par
(A) le facteur plaquettaire 4 (pF4),
(B) les fractions contenant le pF4,
(C) les fractions contenant au moins une sub- stance éluée en même temps que le pF4,
(D) le pF4 recombinant et ses variants,
(E) les peptides synthétiques reprenant tout ou une partie de la séquence des aminoacides du pF4 (en particulier les peptides carboxy-ter- minaux 1-13 ou 13-24) ,
(F) le proteoglycan,
(G) les complexes protéoglycan-pF4, et
(H) leurs mélanges, ladite substance antigénique étant activée par réaction avec Hep tel que défini ci-dessus.
4. Utilisation suivant la revendication 3, caracté¬ risée en ce que la substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les complexes : (A) du facteur plaquettaire 4 (pF4),
(B) des fractions contenant le pF4,
(C) des fractions contenant au moins une sub¬ stance éluée en même temps que le pF4, (D) du pF4 recombinant et ses variantes,
(E) des peptides synthétiques reprenant tout ou une partie de la seσuence des aminoacides du pF4 (en particulier les peptides carboxy-ter- mmaux 1-13 ou 13-24) ,
(F) du proteoglycan,
(G) des complexes protéoglycan-pF4 , et
(H) de leurs mélanges, avec Hep tel que défini ci-dessus.
5. Utilisation suivant l'une quelconque des revendi- cations 3 et 4, caractérisée en ce que Hep est choisi parmi l'ensemble constitué par
- l'héparine proprement dite ayant un PM moyen de 6 000-30 000 daltons et un pou¬ voir rotatoire [^l^ d'environ + 55°; - les dérivés de l'héparine, notamment les héparinates métalliques (notamment Ca 9+, Mg +, Li+ et Na+), et les fragments d'héparine;
- les analogues de l'héparine, notamment les héparinoïdes (héparamine et ses sels, les chondroitines et leurs sels), et les héparines ayant un poids molécu¬ laire moyen inférieur à 6 000 daltons;
- les substances contenant l'héparine, ses dérivés et analogues, notamment les com¬ plexes de l'héparine et de ses dits dé¬ rivés et analogues; et
- leurs mélanges.
6. Utilisation suivant la revendication 3, carac¬ térisée en ce que ladite substance antigénique a été recueillie, à partir de plaquettes sanguines lysées, par fixation sur gel d'héparine-agarose puis élution dudit gel à une température de 15-25° C, au moyen d'un éluant aqueux ayant, à un pH de 6,5-7,5, une force ionique supé¬ rieure ou égale à 0,60.
7. Procédé pour la détermination des thrombopénies induites par une drogue inductrice (Z), ledit procédé, qui comporte une réaction du type antigène/anticorps, étant caractérisé en ce qu'il comprend la réaction (A) d'une substance antigénique (Ag^) choisie parmi l'ensem¬ ble constitué par
(i) les fractions (Ag) qui ont une forte affinité vis-à-vis de l'ensemble cons¬ titué par (a) la drogue inductrice, (b) ses dérivés, (c) ses analogues, (d) les produits contenant Z, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, et qui sont notamment obtenues par le clivage ou la lyse des plaquettes sanguines; et (ii) les substances renfermant au moins un complexe Ag-Z, avec (B) un matériau anticorps anti(Y) où anti(Y) repré- sente un matériau anticorps dirigé (a) contre Z, (b) les dérivés de Z, (c) les analogues de Z, (e) les produits contenant Z, ses dérivés ou ses analogues, ou (e) leurs mélanges.
8. Procédé suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le matériau anticorps anti(Y) est choisi parmi l'ensemble constitué par les anticorps anti(Z), anti(Z- plaquette), anti(Z-Ag), anti(Z-Ag-plaquette) et leurs mélanges.
9. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 7 et 8, pour la détermination des thrombopénies induites par (a) l'héparine ou respectivement (b) la quinine/quinidine, ledit procédé, qui comporte la réac¬ tion d'un antigène (1) spécifique de l'auto-anticorps (2) généré par la drogue inductrice après administra¬ tion de celle-ci, avec ledit auto-anticorps (2), étant caractérisé en ce que ledit antigène (1) est une substance antigénique (Ag-^) choisie parmi l'ensemble constitué par
(i) les fractions (Ag) qui ont une forte activité vis-à-vis de l'ensemble constitué par (a) l'hépa-
5 rine, (b) ses dérivés, (c) ses analogues, (d) les produits contenant l'héparine, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, ou respective¬ ment vis-à-vis de l'ensemble constitué par (a) la quinine/quinidine, (b) ses dérivés, (c) ses 0 analogues, (d) les produits contenant la quinine/ quinidine, ses dérivés ou analogues, ou (e) leurs mélanges, et qui sont notamment obtenus par le clivage ou la lyse des plaquettes sanguines; et (ii) les substances renfermant au moins un com- plexe de ladite fraction (Ag) avec Hep ou respec¬ tivement Qn/Qnd, où Hep et Qn/Qnd sont définis comme indiqué ci-dessus.
10. Procédé selon la revendication 9 pour la déter- ° mination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce que ladite substance antigénique (Ag) est choisie parmi l'ensemble constitué par
(A) le facteur plaquettaire 4 (pF4),
(B) les fractions contenant, le ,ftF4, 5 (c) les fractions contenant: au moins une sub¬ stance éluée en même temps que le pF4,
(D) le pF4 recombinant et ses variants,
(E) les peptides synthétiques reprenant tout ou une partie de la séquence des aminoacides du 0 pF4 (en particulier les peptides carboxy-ter- minaux 1-13 ou 13-24) ,
(F) le proteoglycan,
(G) les complexes protéoglycan-pF4, et (H) leurs mélanges.
11. Procédé suivant la revendication 9 pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, ledit procédé étant caractérisé en ce que la substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par les complexes :
(A) du facteur plaquettaire 4 (pF4),
(B) des fractions contenant le pF4,
(C) des fractions contenant au moins une sub¬ stance éluée en même temps que le pF4, (D) du proteoglycan,
(E) des complexes protéoglycan-pF4, et
(F) de leurs mélanges, avec Hep tel que défini ci-dessus.
12. Procédé suivant la revendication 10 ou 11, carac¬ térisé en ce que ladite substance antigénique est choisie parmi l'ensemble constitué par :
(A) - le pF4 monomère ayant un poids moléculaire moyen de 8 000 daltons, - le pF4 polymère, notamment le pF4 tétramère ayant un poids moléculaire moyen de 32 000 daltons,
- le proteoglycan ayant un poids moléculaire moyen de 56 000 daltons,
- les complexes protéoglycan-pF4, notamment le complexe constitué par le proteoglycan dimère dans lequel chaque groupe proteoglycan est lié à 4 groupes pF4 tétramère et ayant un poids moléculaire moyen de 368 000 daltons,
- leurs mélanges; et
(B) - les complexes de ces produits avec Hep, où Hep est défini comme indiqué ci-dessus.
13. Procédé suivant l'une quelconque des revendica- tions 9 à 12, caractérisé en ce que la formation du complexe résultant de la réaction de ladite substance antigénique (1) avec ledit matériau anticorps (2) est détectée par une méthode choisie parmi l'ensemble constitué par les méthodes EIA, RIA, FIA et agglutina- tion. 3>
14. Procédé suivant l'une quelconque des revendi¬ cations 9 à 13 pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de ladite substance antigénique (1) avec ledit matériau anticorps (2) pour l'obtention d'un complexe substance antigénique-matériau anticorps, puis la réaction du complexe, ainsi formé, avec un anticorps anti(Ig) marqué.
15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que l'anticorps anti(Ig) marqué est choisi parmi l'ensemble constitué par les anticorps anti(IgA), anti(IgG) et anti(IgM) marqués à la peroxydase.
16. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 9 à 13, pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction de ladite substance antigénique (1) avec un mélange contenant ledit matériau anticorps (2) et un an- ticorps anti(substance antigénique) marqué.
17. Procédé suivant l'une quelconque des revendi¬ cations 9 à 16 pour la détermination selon une méthode photométrique des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce que le milieu de dilution du plasma à étudier est tel qu'il présente, pour un plasma de sujet normal à une concentration de 1/50-1/100 (v/v) dans ledit milieu, une densité optique inférieure ou égale à 0,2 et mieux inférieure ou égale à 0,1.
18. Procédé suivant la revendication 17, caractérisé en ce que ledit milieu de dilution du plasma est un tampon phosphate contenant du sérum de chèvre.
19. Procédé suivant l'une quelconque des revendica¬ tions 9 et 10 pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce que ladite substance antigénique est mise en réaction en présence d'Hep, où Hep est tel que défini ci-dessus.
20. Nécessaire pour la détermination des thrombopénies induites par l'héparine, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un échantillon de ladite substance antigénique choisie parmi l'ensemble constitué par :
- le pF4 monomère ayant un poids moléculaire moyen de 8 000 daltons,
- le pF4 polymère, notamment le pF4 tétramère ayant un poids moléculaire moyen de 32 000 daltons,
- le proteoglycan ayant un poids moléculaire moyen de 56 000 daltons,
- les complexes protéoglycan-pF4, notamment le complexe constitué par le proteoglycan dimère dans lequel chaque groupe proteoglycan est lié à 4 groupes pF4 tétramère et ayant un poids moléculaire moyen de 368 000 daltons, ou au moins un échantillon d'un complexe de ladite substance antigénique avec l'héparine, et, le cas échéant, des milieux de dilution et d'autres réactifs.
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