WO1992002627A1 - Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue - Google Patents

Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue Download PDF

Info

Publication number
WO1992002627A1
WO1992002627A1 PCT/FR1991/000656 FR9100656W WO9202627A1 WO 1992002627 A1 WO1992002627 A1 WO 1992002627A1 FR 9100656 W FR9100656 W FR 9100656W WO 9202627 A1 WO9202627 A1 WO 9202627A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
integron
sequences
corynebacterium
corynebacteria
sequence
Prior art date
Application number
PCT/FR1991/000656
Other languages
English (en)
Inventor
Armel André Yves GUYONVARCH
Oscar Julio Reyes Alvarado
Jean Christian Jocelyn Labarre
Céline Anne-Marie BONAMY
Gérard Louis André LEBLON
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority to BR919105857A priority Critical patent/BR9105857A/pt
Priority to KR1019920700810A priority patent/KR920702423A/ko
Publication of WO1992002627A1 publication Critical patent/WO1992002627A1/fr
Priority to FI921527A priority patent/FI921527A0/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/77—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Corynebacterium; for Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/60—Vectors containing traps for, e.g. exons, promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/90—Vectors containing a transposable element

Definitions

  • CORYNEBACTERIA INTEGRON
  • the present invention relates to the integration of predetermined DNA sequences into the genome of corynebacteria.
  • This integration can have two main purposes. On the one hand, it may involve producing a particular protein from a corynebacterium strain, either that this protein is not normally expressed by the strain in question, or else making it overproduce a homologous protein. But, on the other hand, it can be a question of blocking the expression of a gene by carrying out an interruption of this one, which will lead to the cancellation of the corresponding enzymatic activity and to the accumulation of the substrate of the reaction in the cell.
  • corynebacteria which group, in addition to Corynebacterium, Brevibacterium, are bacteria whose handling has so far proved to be rather delicate:
  • selection gene a gene ensuring selection, hereinafter called “selection gene”, effective in said corynebacterium
  • integron is intended to denote a non-replicating vector having the property of integrating into the genome of a corynebactery. This integron can be in linear or circular form.
  • the integron generally comes from a self-replicating piasmide which allows synthesis in a different host, Escherichia coli for example.
  • the integration step it is preferable to delete all traces of DNA of non-corynebacterial origin, except the selection gene, and in particular all the sequences involved in replication.
  • genes can be used, notably resistance to erythromycin.
  • homologous sequence is intended to denote sequences which correspond to those present in the transformed corynebacterium or which have a homology rate greater than 80%, they may be sequences of the same species or not, these sequences may moreover be synthetic.
  • sequences will have to be adapted or not, that is to say to take into account the problems of restriction barriers existing in corynebacteria, by methods some of which are described below.
  • this integron comes from a piasmid which comprises, in addition to the integron, a replicative part, the integron being flanked by restriction sites allowing its excision, and preferably from reverse repeat sequences corresponding to a restriction site not present in the integron. for example Notl, BstXI or SacI.
  • restriction sites for example Notl, BstXI or SacI.
  • the integron therefore preferably forms part of a piasmidic vector which is capable of replicating with the aid of rephcation origins. or repiicon, placed in the repiicative part.
  • the composite plasmid can replicate either only in corynebacteria, if it consists of a single endogenous replicon, or both in corynebacteria and in a foreign host, Eschericnia coii for example, when associated with the plasmid two different rephcons, each allowing rephcation in its own host.
  • the construction of the piasmid may be carried out in different systems these corynebacteria, which can sometimes be advantageous given the difficulties of this construction ⁇ ans Corynebacterium and Brevibacterium.
  • the integron v has to merge by recombination in the chromosome.
  • Amsi. in the primary transformant the gene initially cloned at the multiple site of integration of the integron is found to be duplicated in the bacterial chromosome (see Figure 2a).
  • duplication can be of technical interest insofar as the doubling of the gene can lead to an increase in the activity created by this gene, in particular the corresponding enzymatic activity.
  • the structure of the primary integrant corresponds to a direct tandem duplication of the homologous sequences flanking the selection gene, it is possible to provide for an amplification of this structure by selecting the growth of the primary integrant on a medium making it possible to detect the marigolds overexpressing the selection gene.
  • the selection gene is the antibiotic resistance gene
  • the most resistant strains can be selected, on media with an increasing antibiotic content, which strains must correspond to an overexpression of the genes corresponding to the homologous sequences, but also any gene or DNA sequence that has been inserted into the integron.
  • the integron will preferably comprise, in addition to the homologous sequence or sequences, a sequence coding for a sequence of interest, in particular for a peptide or protein of interest which may be homologous, that is to say come from a corynebacterium, or else heteroiogue, that is to say come from other bacterial species, but also be of eukaryotic or synthetic origin.
  • sequences will preferably include the elements ensuring their expression in the corynebacteria or else will be inserted in phase so as to be able to be expressed by the expression elements of the host bacterium.
  • the integron will be designed in the form of an integration cassette, that is to say that in addition to the selection gene and the homologous sequence, which in certain cases may be confused, provision will be made for sequence comprising several cloning sites which will allow the insertion of DNA sequences and / or genes at will.
  • sequences of transposable elements can be all of the sequences in. ensure the transposition, with the exception of the proteins coded by the corynebacterium, but they can also be transposables which are devoid of the sequences coding for the transposases.
  • transposable elements include phage Mu, in particular in the form of a miniMu phage.
  • markers have been used which may be part of the toll or of different origin, for example colored markers.
  • the invention also relates to integrons using transposable elements originating from different corynebacteria. in particular this Brevibacterium. in particular ISaBl as described in figure 9.
  • Example 10 presents the characterization of the ISaBi element and Example 11 gives a general method for selecting and identifying this type of transposable element.
  • the present invention also relates to integrons comprising a sequence providing transposed elements, in particular elements coding for transposases and / or transposition repressors.
  • the integrons according to the inv ention can understand all or part of these sequences in question, in particular that corresponding to ISaBi.
  • This type of integration structure comprising a miniMu phage fragment. a homologous DNA sequence and a gene this selection can make it possible, as with the structures described above, to obtain either an overexpression of a particular gene, or the disruption of a gene when this proves necessary.
  • the present invention also relates to strains of corynebacteria obtained by integrative transformation using the integrons described above, in particular when the integron has been introduced by electrotransformation.
  • the transfer of the integron can take advantage of the possible replicative properties of the construction in the corynebacterium in order to adapt the integron to the corynebacterium.
  • the piasmide comprising, in addition to the integron, a replicative part, in the same strain where the integration will take place, then this integron thus adapted will be recovered by extraction of the piasmide then digestion -by the enzyme (s) which release the integron, the purified fragment then being self-ligated or not and the ligation product used for the integrative transformation; in this case the restriction barriers no longer constitute a difficulty.
  • the invention relates to the use of Corynebacteria according to the invention in the context of industrial processes, in particular for the preparation of proteins or me ⁇ abolites involving the integron according to the invention.
  • FIG. 1 shows diagrammatically the preparation of an integron starting from a replicative piasmid
  • Figure 2 shows schematically the insertion of an integron.
  • FIG. 3 diagrams the structure of pCGL519
  • FIG. 4 diagrams the percentage of resistance to kanamycin as a function of time for two transformed strains.
  • Figure 5 shows schematically the structure of the miniMu.
  • FIG. 7 shows schematically the integration of the desired integrons whether or not containing the miniMu.
  • FIG. 8 represents the restriction map of the insertion element of Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B 115) cloned from an insertion in the 3 'terminal end of the lac operon,
  • FIG. 9 represents the ISaBi sequence
  • FIG. 10 represents the restriction map of ISaBi
  • the chromosomal DNA of the C. melassecola ATCC 17965 strain was prepared according to the method adapted from Ausubel et al. (1987). Digestion managed by the restriction enolonuclease Mbol (Boehringer) was carried out on 10 ⁇ g of this DNA following the protocol described in Maniatis et al. (1982). The DNA fragments were separated according to their size on a sucrose gradient as described by Ausubel et al. (1987). Fragments between 6 and 15 kb in size were used for the construction of the library.
  • the cloning plasmid pUN 121 (Nilsson et al., 1983) was prepared by the method of Birnboim and Doly, (1979) from the strain of E. coli GM2199 available freely.
  • the piasmid was linearized by the Bell restriction endonuclease (Boehringer).
  • the bank was built by hgation with T4 DNA iigase
  • the E. coli W620 strain deficient for citrate synthase activity was transformed with the DNA library of C. melassecola ATCC17965.
  • a transforming clone of E. coli W620 capable of growing on minimum selection medium containing tetracycline was selected.
  • This clone carries a recombinant plasmid pCGL508.
  • Different subcloning made it possible to shorten the DNA fragment of C. melassecola carrying the complete gltA gene to a DNA fragment of 3.5 kb delimited by two HindIII restriction sites.
  • the aphlll gene was chosen as the selection gene; it confers resistance up to 600 ⁇ g / ml of kanamycin when it is integrated into a copy in the chromosome. We usually work at 25 ⁇ g / ml.
  • the 3.5 kb HindIII fragment carrying the structural gene gltA coding for the citrate synthase of C. melassecola obtained in Example 1 was initially chosen as a DNA fragment homologous to the genome of the Corynebacteria and inserted into one unique sites of the multiple cloning site (the HindIII site).
  • the restriction sites bordering the integron intended to be the most used in the integration strategy are the NotI sites which correspond to an 8 nucleotide sequence, and the BstXI sites.
  • the enzyme BstXI recognizes the sequence (CCAN 5 NTGG); therefore it cuts as frequently as a 6 nucleotide enzyme and we can expect to generate several fragments. However, the fragments released are reassociated according to the nature of the internal sequences of the different BstXI sites, which must ultimately lead to the only reconstitution of the starting fragment.
  • the pCGL519 piasmid ( Figure 3) is an example of a versatile piasmid capable of generating an integron.
  • pCGL519 consists of two replicative and integrative fragments bordered by the NotI sites.
  • the first fragment corresponding to the integron which comprises a multiple cloning site, the selection gene aph111 and a HindIII fragment homologous to the chromosome carrying the gltA gene which codes for citrate synthase.
  • the second fragment includes the replicative part of the piasmid pBLI (SspI-HpaI fragment of 3 kb) which replicates in corynebacteria, the replicative part of the piasmid pACY184 which replicates in E. coli, ori p15A, and the origin of replication of the phage M13 complementable in trans.
  • the plasmid pCGL519 was constructed in E. coli by insertion of a HindIII fragment of 3.5 kb containing the glt.A gene in a vector pCGL243.
  • the model involves the duplication of the wild copy of the gltA gene: the enzymatic activity has been measured, it is multiplied by a factor of 1.82 in agreement with the interpretation of the blots and shows that the integrated copy is not inactivated .
  • the results are collated in Table 1 with respect to the wild strain and to the strain transformed with a replicating plasmid.
  • the stability of the integrated structure was measured as for the percentage of resistant Kanamycin cells after about thirty generation ( Figure 4) and as for the enzymatic activity of the citrate synthase which remain stable.
  • the amplification of the integrated structure was carried out by growth selection on a dish containing an excess of kanamycin, selection at 800 ⁇ g / ml then i000 ⁇ g / ml then 1000 ⁇ g / ml of kanamycin and neomycin. Direct tandem amplification was obtained. Despite. the stability of the amplified structure and of the resistance to kanamycin, the high level of enzymatic activity obtained at the start in the case of citrate synthase was not maintained subsequently. It is possible that a specific inactivation of the gltA gene has occurred.
  • the Mu derivatives chosen in this example are MudII 1681 and
  • MudII 1681-Cat (respectively Km R and Cm R ) which have a size of 14.8 kb and 16.6 kb respectively (Figure 5).
  • the miniMu MudII 1681-Cat is a derivative of the MudII 1681 transposon (Castilho et al., 1984). They have the elements necessary for transposition stated above (except HU) as well as the gene for the heat-sensitive repressor C (regulator of the expression of transposases A and B), a gene for resistance to antibiotics (respectively aphll and cat) and the genes lacA lacY and lacZ '. The latter begins at the 8th codon and makes it possible to detect translational fusions of proteins when Mud fits into a reading frame.
  • transposons We transferred these transposons to the Corynebacteria. After integration of the transposons into the chromosome, a method, described in Example 8, made it possible to amplify the integrated copy. Associated with this amplification, the target gene for the integration event (the structural gene for glutamate dehydrogenase) has in many cases also been amplified with an increase up to a factor of 25 in the corresponding enzymatic activity.
  • the target gene for the integration event the structural gene for glutamate dehydrogenase
  • the integrative vector (pCGL 107 - Figure 6) contains the gdhA gene (Gdh ') interrupted by the kanamycin resistance marker
  • Km (aphlll), the replicon (ori) of pUN121 (Nilsson et al., 1983) and the genes conferring resistance to tetracycline (Tet R ) and to ampicillin (Amp R ).
  • This vector is not replicative in Brevibacterium lactofermentum and integrates by simple "crossing-over" at the site of homology of the gdhA gene.
  • MudII 16S l-Cat was introduced into the integrative vector pCGL107 by minimuduction from E. coli OR 1836 in the strain
  • MudII 1681 was introduced in Corynebacteria by placing the transposon on two other types of vectors:
  • Suicide vector (non-replicative, non-integrative) pEV11 is a derivative of pUC 18 lacking d3S lac genes into which MudII 168 1 has been introduced.
  • MudII 1681 was introduced into the shuttle vector by minimuduction in E. coli Rec +. Among the various insertions obtained, one of them was selected giving a Lac- phenotype (pCGL229 :: Mud +). From this vector, a disarmed pCGL229 :: Mud- Mud was prepared in which the genes of transposases A and B were deleted by Pst1 digestion.
  • Km R Cm S and type 2 may correspond respectively to the substitution of the gdh A gene by double crossing-over event and to the integration of the complete piasmid at the gdhA site by single event
  • K2 conforms to a gene substitution. It also confirms that the gdh + transformants (type 2 events (KC2 and KC4) and some type 1 (K l) are obtained by integration of the piasmide at the gdhA site.
  • the type 2 transformants do not sufficiently express the chloramphenicol resistance gene to obtain the growth of isolated colonies in the presence of chloramphenicol 5 ⁇ g / ml.
  • An insert was isolated by recovering plasmids in E. coli DH5aipha from the amplified DNA of KC3T4.
  • the 3.5 kb PvuII fragment internal to Mu derived from DNA amplified in KC3T4 and containing the insertion element, was used to probe the initial blot which contains the digests of DNA by BamHI various integrants and amplified strains (including KC3T4).
  • Brevibacterium lactofermentum CGL2005 B1 15
  • (ii) Brevibacterium lactofermentum CGL2002 two common bands appear in size 18 kb and 4.5 kb; on the other hand, the CGL2002 strain has no other bands. This reflects mobility of the element.
  • the strains of Corynebacterium melassecola give weak hybridization signals with the insertion reflecting the existence of other different but related sequences in this species.
  • ISaB1 lactofermentum has been identified and cloned; called ISaB1, it can be present in several copies (2 to 5 copies) in the genome. It is capable of transposing several times to different sites in an amplified region. Its fine restriction map is known. Different but related sequences exist in the genome of other corynebacteria.
  • ISaBi consists of 1288 base pairs; the ends can be identified because ISaBi is inserted into a fragment which corresponds to the terminal region (3 ') of the lac operon which has been sequenced by Hediger et al. (Biochemistry Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985). ISaBi was inserted between nucleotide 5575 and 5576 by duplicating a target sequence of 5 bp (CCGAT) ( Figure 8). The entire sequence of ISaBi is given in Figure 9 and the restriction map in Figure 10. Two open reading phases have been identified which could correspond, given the sequence analyzes, to the transposase structural gene and to the gene transposition repressor.
  • the ISaBi insertion was obtained during gene amplification studies in the chromosome of B. lactofermentum (B1 15).
  • B1 15 B. lactofermentum
  • pCGL330 and pCGL331 Figures 11 and 12. These two vectors consist of a first fragment derived from the vector pUN 121.
  • the piasmide pUN 121 is replicative in E.
  • coli and carries resistance to ampicillin; it carries a sequence coding for the repressor cI of phage lambda which inhibits the expression of an operon fusion between the promoter P L of phage lambda and a resistance gene of tetracycline. Insertion into the cl gene will thereby inactivate the repressor which will then allow expression of the tetracycline resistance gene which is expressed in corynebacteria under the control of P L. The insertion events can thus be selected by resistance to tetracycline.
  • the EcoRI fragment derived from pCGL 107 contains a selection gene for the direct transformation of coryneoacteria (the aphlll gene which confers resistance to kanamycin) and a fragment containing a homologous part of the gdhA gene (structural gene for ia glutamate dehydrogenase) which will serve as a point of integration into the chromosome of corynebacteria.
  • the B. lactofermentum CGL2005 (BL 15) and CGL2002 strains were electrotransformed for resistance to kanamycin by the plasmids pCGL330 and pCGL331.
  • the transformation frequency was approximately 103 per ⁇ g in each of the cases, which is compatible with integration of the plasmids.
  • the transformants (like
  • CGL2005 :: pCGL330 and CGL2005 :: pCGL331) are sensitive to tetracycline, which confirms that the regulation of P L by cl works well in transformants.
  • the frequency of tetracycline resistant segregants was measured after approximately 10 generations.
  • Mutations inactivating the C1 gene appear in strains with the integrated plasmids pCGL330 and pCGL331 at a frequency of 2 ⁇ 10 6 per generation.
  • a piasmid recovery was carried out from genomic DNA extracted from resistant tetracycline segregants isolated from the CGL2005 :: pCGL331 and CGL2005 :: pCGL330 strains and digested with the enzyme Pstl. These digested DNAs were ligated and the ligation product was used to transform the DH5alpha strain of E. coli for resistance to tetracycline. The recovered plasmids were analyzed and in 7 cases out of 9 tetracycline-resistant clones, an insert was identified. In one case (from CGL2005 :: pCGL331), an insertion element identical to ISaBl was identified (1.2 kb in size, having the unique AccI sites,
  • the transposon trap vector works; in the majority of cases, the mutation obtained is an insertion; the frequencies of resistance to tetracycline therefore fairly correctly measure the transposition frequencies; the most mobile elements have therefore been identified; of these, ISaBl has been re-isolated and another element of insertion different from ISaBl has been identified.
  • ATCC17965 ORSAN
  • ATCC 17965 :: gltA: (this request)
  • the DH5alpha strainer is available in the catalog of
  • NADPH 2 consumed / min / mg protein
  • KC2T1 7.4 2.73 TABLE 5: DETERMINATION OF CAT, BGA1 and GDH ACTIVITIES

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

La présente invention concerne un intégron de corynébactérie caractérisé en ce qu'il comporte: un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie, une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie. Application notamment à la production de protéines par culture de corynébactéries transformées par ledit intégron lorsqu'il comporte une séquence codant pour une protéine d'intérêt.

Description

INTEGRON DE CORYNEBACTERIE, PROCEDE DE TRANSFORMATION D'UNE CORYNEBACTERIE PAR LEDIT INTEGRON ET CORYNEBACTERIE OBTENU
La présente invention concerne l'intégration de séquences d'ADN prédéterminées dans le génome des corynébactéries.
Cette intégration peut avoir deux grandes finalités. Il peut, d'une part, s'agir de faire produire par une souche de corynébactérie une protéine particulière, soit que cette protéine ne soit pas normalement exprimée par la souche en cause, ou bien de lui faire surproduire une protéine homologue. Mais, d'autre part, il peut s'agir de bloquer l'expression d'un gène en effectuant une interruption de celui-ci, ce qui conduira à l'annulation de l'activité enzymatique correspondante et à l'accumulation du substrat de la réaction dans la cellule.
Les corynébactéries qui regroupent, outre Corynebacterium, Brevibacterium, sont des bactéries dont la manipulation s'est révélée jusqu'à présent assez délicate :
tout d'abord car il n'existait que peu ou pas de métnode permettant leur transformation, et
des barrières de restriction très importantes existent qui font que les transformations mettant en oeuvre de l'ADN provenant d'autres sources bactériennes sont la plupart du temps inefficaces.
Récemment, on a pu mettre en évidence la possibilité de transformer des corynébactéries par des méthodes d'électroporation. Toutefois, si les techniques de transformation par vecteur autoréplicatif sont intéressantes, il est préférable la plupart du temps, et au niveau industriel, de disposer de bactéries qui ont été transformées par intégration dans le chromosome, c'est-à-dire des souches qui sont stables dans le temps, tant quant au nombre de copies de l'élément intégré que quant à sa localisation.
C'est l'objet de la présente invention de proposer des systèmes d'intégration dans le génome des corynébactéries.
La présente invention concerne des intégrons de corynébactéries caractérisés en ce qu'ils comportent :
un gène assurant une sélection, appelé ci-après "gène de sélection", efficace dans ladite corynébactérie,
une séquence homologue du génome de ladite corynèbacterie.
lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie. Par "integron", on entend désigner un vecteur non réplicatif ayant la propriété de s'intégrer dans le génome d'une corynèbacterie. cet integron pouvant être sous forme linéaire ou circulaire.
Toutefois, l'integron provient, en général, d'un piasmide autoreplicatif qui permet la synthèse dans un hôte différent, Escherichia coli par exemple. Mais avant l'étape d'intégration, on supprimera, de préférence, toute trace d'ADN d'origine non corynébactérienne, sauf le gène de sélection, et en particulier toutes les séquences impliquées dans la réplication.
Les gènes de sélection efficaces dans lesdites corynébactéries sont :
- soit des gènes de résistance à une substance particulière, antibiotique notamment,
- soit des gènes conférant un phénotype clairement identifiable, coloration et/ou complémentation par exemple.
Dans le cas présent, la sélection par résistance à un antibiotique est plus particulièrement intéressante. Ainsi, on pourra utiliser :
- les gènes AphlII conférant la résistance à la kanamyone. noté KmR , - les gènes Cat conférant la résistance au chloramphénicol, noté CmR.
Mais, d'autres gènes peuvent être utilisés, notamment ia résistance à l'érythromycine.
Par "séquence homologue", on entend désigner des séquences qui correspondent à celles présentes dans ia corynébactérie transformée ou qui présentent un taux d'homoiogie supérieur à 80 %, il peut s'agir de séquences de la même espèce ou non, ces séquences peuvent d'ailleurs être synthétiques.
Les séquences devront être adaptées ou non, c'est-à-dire tenir compte des problèmes de barrières de restriction existant chez les corynébactéries, par des procédés dont certains sont décrits ci-après.
De préférence, cet integron provient d'un piasmide qui comporte, outre l'integron, une partie replicative, l'integron étant flanqué de sites de restriction permettant son excision, et de préférence de séquences répétées inverses correspondant à un site de restriction non présent dans l'integron. par exemple Notl, BstXI ou SacI. Ainsi, par digestion à l'aide de l'enzyme qun reconnaît ledit site de restriction, on peut obtenir directement l'integron, lequel peut, si besoin est, être circularisé, puisque les extrémités obtenues sont complémentaires, avant d'être utilisé pour la transformation de la corynébactérie.
Dans le système selon ia présente invention, l'integron fait donc, de préférence, partie d'un vecteur piasmidique qui est susceptible de se répliquer à l'aide d'origines de réphcation. ou répiicon, placées dans la partie répiicative. Selon la nature du réphcon présent dans cette cassette replicative. le plasmide composite peut se répliquer soit uniquement dans les corynebacteries, s' il est constitue d'un seul replicon endogène, soit à ia fois dans les corynebactéries et dans un hôte étranger, Eschericnia coii par exemple, lorsqu'on l'associe au plasmide deux rephcons différents, chacun permettant la réphcation dans son hôte propre.
Dans ce cas, la construction du piasmide pourra être effectuée dans des systèmes différents ces corynébactéries, ce qui peut parfois présenter des intérêts compte tenu des difficultés ce construction αans Corynebacterium et Brevibacterium.
Grâce à la présence ce séαuences homologues présentes simultanément αans l'integron et dans le génome. l'integron v a s'mserer par recombinaison dans le chromosome. Amsi. dans le transformant primaire, le gène clone initialement au site multiple de cionage de l'integron se retrouve dupliqué dans ie cnromosome bactérien uoir schéma Figure 2a).
Une telle duplication peut présenter un intérêt tecnnoiogique dans ia mesure où le doublement du gène peut entraîner un accroissement de l'activité coéée par ce gène, notamment l'activité enzymatique correspondante.
Comme ia structure de l'intégrant primaire correspond à une duplication en tandem directe des séquences homologues encadrant le gène de sélection, il est possible de prévoir une amplification de cette structure par sélection de la croissance de l'intégrant primaire sur un milieu permettant de détecter les soucnes surexprimant le gène de sélection. Ainsi, lorsque le gène de sélection est ie gène de résistance à un antibiotique, on peut sélectionner les souches les plus résistantes, sur milieux avec une teneur croissante en antibiotique, lesquelles souches devront correspondre à une surexpression des gènes correspondant aux séquences homologues, mais également à tout gène ou séquence d'ADN qui aurait été inséré dans l'integron.
Bien entendu, l'integron comportera, de préférence, outre la ou les séquences homologues, une séquence codant pour une séquence d'intérêt, notamment pour un peptide ou une protéine d'intérêt qui pourra être homologue, c'est-à-dire provenir d'une corynébactérie, ou bien hétéroiogue, c'est-à-dire provenir d'autres espèces bactériennes, mais également être d'origine eucaryote ou synthétique.
Ces séquences comporteront, de préférence, les éléments assurant leur expression dans les corynébactéries ou bien seront insérées en phase pour pouvoir être exprimées par les éléments d'expression de ia bactérie hôte.
Dans le cas de Corynebacterium, il peut être intéressant par exemple d'obtenir une surexpression de certaines enzymes, notamment gltA ou gdhA.
Comme cela a été indiqué précédemment, il est possible d'utiliser ce système pour assurer l'interruption d'un gène en utilisant un integron selon l'invention. Par interruption ou par substitution, comme cela est décrit à la figure 2b, le gène correspondant est inactivé, ceci conduit à une surproduction du substrat de l'enzyme codée par ie gène correspondant.
En général, l'integron sera conçu sous forme d'une cassette d'intégration, c'est-à-dire qu'en plus du gène de sélection et de la séquence homologue, qui dans certains cas peuvent être confondus, on prévoira une séquence comportant plusieurs sites de clonage qui permettra d'insérer desséquences d'ADN et/ou des gènes à volonté.
Dans tous les cas, à des fins de confinement génétique, on essaiera de prévoir un integron dépourvu d'ADN répiicatif d'une autre espèce.
Il est également possible de prévoir des systèmes d'intégration plus complexes, en particulier des systèmes d'intégration qui comportent en outre les séquences d'un élément transposable. Les secuences d'éléments transposables peuvent être l'ensemble des séquences au. assurent la transposition, à l'exception des protéines codées par la corynébactérie, mais il peut également s'agir de transposables qui sont dépourvus des séquences codant pour les transposases.
Parmi les éléments transposables. il faut citer ie phage Mu, en particulier sous la forme d'un phage miniMu. Dans le cas des éléments transposables comme ie phage miniMu. comme on le verra ci-après, on a utilisé des marqueurs qui peuvent faire partie du pnage ou d'origine différente, par exemple des marqueurs colorés.
L'invention concerne également des intégrons utilisant des éléments transposables prov enant de diff érentes corynebacteries. notamment ce Brevibacterium. en particulier ISaBl tel que decrit dans la figure 9.
L'exemple 10 présente la caractérisation de l'élément ISaBi et l'exemple 11 donne une metnode générale permetta nt de sélectionner et d'identifier ce type d'élément transposable.
La présente invention concerne également les intégrons comportant une séquence prov enant des éléments transposes, notamment des éléments codant po ur le s transposases et/ ou les represseurs de la transposition.
Les intégrons selon l'inv ention peuv ent comprendre tout ou partie ces séquences en cause, notamment celle correspondant à ISaBi.
Ce type de structure d'intégration comportant un fragment de phage miniMu. une séquence d'ADN homologue et un gène ce sélection peut permettre, comme à l'aice des structures décrites précédemment, d'obtenir soit une surexpression d'un gène particulier, soit ia disruption d'un gène lorsque cela se révèle nécessaire.
Ces dernières structures, bien que différentes des structures précédentes seront néanmoins appelées par simplification "integron".
La présente invention concerne également des souches de corynébactérie obtenues par transf ormation integrative à l'aide des intégrons décrits précédemment, notamment lorsque l'integron a été introduit par électrotransf ormation.
Parmi les soucnes ce corynébactéries utiiisacles. il faut citer plus particulièrement : B. lactofermentum,
B. flavum,
C. glutamicum,
C. melassecola,
pour leur intérêt industriel.
Dans le cas où le clonage est réalisé chez un hôte différent de la corynèbacterie hôte final de l'integron, le transfert de l'integron peut mettre à profit les propriétés réplicatives éventuelles de la construction dans la corynébactérie afin d'adapter l'integron à la corynébactérie. Ainsi on commencera par introduire le piasmide comportant, outre l'integron, une partie replicative, dans la souche même où s'effectuera l'intégration, puis cet integron ainsi adapté sera récupéré par extraction du piasmide puis digestion -par la ou les enzymes qui libèrent l'integron, le fragment purifié étant alors autoligué ou non et le produit de ligation utilisé pour la transformation integrative ; dans ce cas les barrières de restriction ne constituent plus une difficulté.
Dans certains cas il peut être utile de passer par une corynébactérie intermédiaire, notamment dans le cas où l'ADN est d'origine E. coli, il peut être intéressant d'adapter l'integron à Brevibacterium lactofermentum avant de l'adapter à Corynebacterium melassecola.
Enfin, l'invention concerne l'utilisation des Corynébactéries selon l'invention dans le cadre de procédés industriels, notamment pour la préparation de protéines ou de meτabolites mettant en jeu l'integron selon l'invention.
Les exemples ci-après permettront de mieux mettre en évidence les avantages de ia présente invention.
Sur les figures annexées :
- la figure 1 schématise ia préparation d'un integron en partant d'un piasmide réplicatif,
_ la figure 2 schématise l'insertion d'un integron.
. par simple recombinaison (a)
. par double recombinaison ((b),
la figure 3 schématise la structure de pCGL519,
la figure 4 schématise le pourcentage de résistance à la kanamycine en fonction du temps pour deux souches transformées. - la figure 5 schématise ia structure des miniMu.
. MudII 1681 ,
. MudII 168 1 -Cat.
- la figure 6 schématise les plasmides
. pCGL107 et
. pCGL 107::Mud+,
- la figure 7 schématise l'intégration des intégrons désirés contenant ou non le miniMu.
- ia figure 8 représente la carte de restriction de l'élément d'insertion de Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B 115) clone à partir d'une insertion dans l'extrémité terminale 3' de l'operon lac,
- la figure 9 représente la séquence ISaBi,
- ia figure 10 représente la carte de restriction de ISaBi,
- la figure 11 représente la carte de restriction du piasmide pCGL330, - la figure 12 représente la carte de restriction du piasmide pCGL331. EXEMPLE 1
Construction d'une banque d'ADN chromosomique de Corynebacterium melassecola ATCC 17965 et clonage du gène gltA
L'ADN chromosomique de la souche de C. melassecola ATCC 17965 a été préparé suiv ant la méthode adaptée de Ausubel et al. ( 1987). Une digestion ménagée par i'enαonucléase de restriction Mbol (Boehringer) a été réalisée sur 1 0 μg de cet ADN en suivant le protocole décrit dans Maniatis et al. ( 1982). Les fragments d'ADN ont été séparés en fonction de leur taille sur gradient de sucrose comme décrit par Ausubel et al. ( 1987). Les fragments d'une taille comprise entre 6 et 1 5 kb ont été retenus pour la construction de la banque.
Le piasmide de clonage pUN 121 (Nilsson et al., 1983) a été préparé par la méthode de Birnboim and Doly, ( 1979) à partir de la souche de E. coli GM2199 disponible librement. Le piasmide a été linéarisé par l'endonucléase de restriction Bell (Boehringer).
La banque a été construite par hgation avec la T4 DNA iigase
(Boehringer) dans les conditions décrites par Ausubel et al. ( 1987), de 1 μg de piasmide pUN 121 linéarisé par Bell et de 2 μg des fragments d'ADN de 6 à 1 5 kb décrits ci-dessus. Le mélange de ligation a été introduit dans la souche de E. coli DH5alpha par électroporation en suiv ant le protocole décrit par Dower et al. (1988). Les clones de E. coli portant les plasmides recombinants ont été sélectionnés directement par leur capacité à croître sur milieu LB contenant 10 μg/ml de tétracycline. Les plasmides de la totalité des clones résistants à la tétracycline ont été préparés par la méthode de Birnboim et Doly (1979). L'ensemble de ces plasmides correspond à la banque d'ADN.
La souche de E. coli W620 déficiente pour l'activité citrate synthase a été transformée avec la banque d'ADN de C. melassecola ATCC17965. Un clone transformant de E. coli W620 capable de croître sur milieu minimum de sélection contenant de la tétracycline a été sélectionné. Ce clone est porteur d'un piasmide recombinant pCGL508. Différents sous-clonages ont permis de raccourcir le fragment d'ADN de C. melassecola portant le gène gltA complet à un fragment d'ADN de 3,5 kb délimité par deux sites de restriction HindIII.
EXEMPLE 2
Integron pCGL519
Le schéma de préparation de l'integron est représenté à la Figure 1.
Le gène aphlll a été choisi comme gène de sélection ; il confère la résistance jusqu'à 600 μg/ml de kanamycine lorsqu'il est intégré à une copie dans le chromosome. On travaille habituellement à 25 μg/ml. Le fragment HindIII de 3,5 kb portant le gène de structure gltA codant pour la citrate synthase de C. melassecola obtenu à l'exemple 1 a été choisi au départ comme fragment d'ADN homologue du génome des Corynébactéries et inséré dans l'un des sites uniques du site multiple de clonage (le site HindIII). Les sites de restriction bordant l'integron prévus pour être les plus utilisés dans la stratégie d'intégration sont les sites Notl qui correspondent à une séquence à 8 nucléotides, et les sites BstXI. L'enzyme BstXI reconnaît la séquence (CCAN5NTGG) ; de ce fait elle coupe aussi fréquemment qu'une enzyme à 6 nucléotides et on peut s'attendre à générer plusieurs fragments. Mais les fragments libérés se réassocient en fonction de la nature des séquences internes des différents sites BstXI, ce qui doit conduire finalement à la seule reconstitution du fragment de départ.
Le piasmide pCGL519 (Figure 3) est un exemple de piasmide versatile susceptible de générer un integron. On a testé l'intégration dans C. melassecola de sa cassette integrative à partir d'un piasmide issu au départ de E. coll. pCGL519 est constitué des deux fragments réplicatifs et intégratifs bordés par les sites Notl. Le premier fragment correspondant à l'integron qui comprend un site multiple de clonage, le gène de sélection aphlll et un fragment HindIII homologue du chromosome portant ie gène gltA qui code pour la citrate synthase. Le second fragment comprend la partie replicative du piasmide pBLI (fragment SspI-HpaI de 3 kb) qui se réplique chez les corynébactéries, la partie replicative du piasmide pACY184 qui se réplique chez E. coli, ori p15A, et l'origine de réplication du phage M13 complémentable en trans. Le piasmide pCGL519 a été construit dans E. coli par insertion d'un fragment HindIII de 3,5 kb contenant le gène glt.A dans un vecteur pCGL243.
Comme représenté - dans la Figure 1, après clonage pCGL519 est utilisé pour transformer B. lactofermentum. Au moment du transfert de pCGL519 dans Brevibacterium lactofermentum CGL2002, le fragment Notl contenant les origines de réplication a été substitué car la partie replicative de pBLI s'était inactivée dans E. coli. Ceci montre un avantage supplémentaire de la structure en cassette.
EXEMPLE 3
Intégration
Le transfert de pCGL519 dans Corynebacterium melassecola ATCC 17965 très restrictive vis-à-v is de E. coli a été réalisé à partir du même piasmide extrait de B. lactofermentum. Le système proposé permet d'isoler le piasmide pCGL519 de la souche de C. melassecola ATCC 17965 qui est totalement restrictive vis-à-vis de E. coli mais seulement partiellement vis-à-vis de B. lactofermentum. Ainsi, une cassette integrative possédant la modification de la souche réceptrice a été préparée.
Après digestion du piasmide pCGL519 issu de C. melassecola ATCC 17965 par l'endonucléase de restriction NotI (Boehringer), l'integron contenant ie gène gltA et ie gène de sélection AphIII a été isolé et purifié à partir d'un gel d'agarose à bas point de fusion. L'integron ainsi purifié a ensuite été soumis à une autorecircularisation par iigation. Le mélange de ligation a ensuite été introduit dans la souche de C. melassecola ATCC 17965 par électroporation (Bonamy et al., 1990). Les clones de C. melassecola résistant à 25 μg/ml de kanamycine ont été soumis à l'analvse. 500 transformants ont été obtenus. 31 parmi les 50 analysés ne possédaient pas le piasmide pCGL519 et 20 d'entre eux ont été analysés par southern biot après digestion XbaI. Tous correspondent à un même événement d'intégration s'effectuant par recombinaison homologue dans la région gltA. Selon la nature du produit de ligation (molécule mortomérique circulaire ou molécule polymérique linéaire ou circulaire), les intégrants primaires peuvent être interprétés comme issus d'un "crossing-over" simple ou double. Une analyse en champ puisé après digestion NotI suivi d'une hyridation par une sonde correspondant au fragment HindIII de 3,5 kb contenant gltA a été réalisée. L'intégration d'une seule copie de l'integron est confirmée par cette analyse.
Le modèle implique la duplication de la copie sauvage du gène gltA : l'activité enzymatique a été mesurée, elle est multipliée d'un facteur 1,82 en accord avec l'interprétation des blots et montre que la copie intégrée n'est pas inactivée. Les résultats sont rassemblés au tableau 1 par rapport à la souche sauvage et à la souche transformée par un piasmide réplicatif. La stabilité de la structure intégrée a été mesurée quant au pourcentage de cellules Kanamycine résistantes après une trentaine de génération (Figure 4) et quant à l'activité enzymatique de ia citrate synthase qui restent stables.
L'amplification de la structure intégrée a été réalisée par sélection de croissance sur boîte contenant une excès de kanamycine, sélection à 800 μg/ml puis i 000 μg/ml puis 1 000 μg/ml de kanamycine et de néomycine. Une amplification en tandem direct a été obtenue. Malgré. la stabilité de ia structure amplifiée et de la résistance à la kanamycine, le haut niveau d'activité enzymatique obtenu au départ dans le cas de la citrate synthase ne s'est pas maintenu ultérieurement. Il est possible qu'une inactivation spécifique du gène gltA se soit produite.
EXEMPLE 4
Construction à base de miniMu
Les dérivés de Mu choisis dans cet exemple sont MudII 1681 et
MudII 1681-Cat (respectivement KmR et Cm R ) qui ont une taille de 14,8 kb et 16,6 kb respectivement (Figure 5). Le miniMu MudII 1681-Cat est un dérivatifjdu transposon MudII 1681 (Castilho et al., 1984). Ils possèdent les éléments nécessaires à la transposition énoncés précédemment (excepté HU) ainsi que le gène du répresseur thermosensible C (régulateur de l'expression des transposases A et B), un gène de résistance aux antibiotiques (respectivement aphll et cat) et les gènes lacA lacY et lacZ'. Ce dernier commence au 8ème codon et permet de détecter des fusions traductionnelles de protéines lorsque Mud s'insère dans un cadre de lecture.
On a transféré ces transposons dans les Corynébactéries. Après intégration des transposons dans le chromosome, une méthode, décrite à l'exemple 8, a permis d'amplifier la copie intégrée. Associée à cette amplification, le gène cible de l'événement d'intégration (le gène de structure de la glutamate deshydrogenase) a dans de nombreux cas été également amplif ié avec une augmentation jusqu'à un facteur 25 de l'activité enzymatique correspondante.
EXEMPLE 5
Construction de vecteurs pour le transfert des miniMu
Le vecteur intégratif (pCGL 107 - Figure 6) contient le gène gdhA (Gdh') interrompu par le marqueur de résistance à la kanamycine
Km (aphlll), le réplicon (ori) de pUN121 (Nilsson et al., 1983) et les gènes conférant la résistance à la tétracycline (TetR) et à l'ampicilline (AmpR).
Ce vecteur n'étant pas réplicatif dans Brevibacterium lactofermentum s'intègre par simple "crossing-over" au site d'homoiogie du gène gdhA.
MudII 16S l-Cat a été introduit dans le vecteur intégratif pCGL107 par minimuduction à partir de E. coli OR 1836 dans ia souche
MC4100. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été retenue donnant un phénotype lac- en E. coli (pCGL 107::Mud+, Figure 6). A partir de ce même piasmide, a été préparé un Mud désarmé pCGL 107::Mud-,
Figure 6) chez lesquels les gènes des transposases A et B ont été délétés par digestion HindIII.
D'autres stratégies de transfert ont été testées ; MudII 1681 a été introduit chez les Corynébactéries en plaçant le transposon sur deux autres types de vecteurs:
Vecteur suicide (non réplicatif, non intégratif) pEV11::Mud, il s'agit d'un dérivé de pUC 18 dépourvu d3S gènes lac dans lequel MudII 168 1 a été introduit. Vecteur navette (pCGL229) possédant le réplicon de pBL1 (fragment HindIII-HpaI), le réplicon p15A et le gène cat de Tn9.
MudII 1681 a été introduit sur ie vecteur navette par minimuduction chez E. coli Rec+. Parmi les diverses insertions obtenues, une d'entre elles a été retenue donnant un phénotype Lac- (pCGL229::Mud+). A partir de ce vecteur, a été préparé un Mud désarmé pCGL229::Mud- chez lequel les gènes des transposases A et B ont été délétés par digestion Pstl.
EXEMPLE 6
Efficacité d'électrotransformation des constructions et leur transfert dans Brevibacterium lactofermentum
Avec les vecteurs précédemment décrits, on éiectrotransforme une . souche d'E. coli (DH5alpha) et deux souches de Brevibacterium lactofermentum CGL2002 et CGL2005 (B115). Ces deux souches sont partiellement permissives vis à vis de l'ADN issu de E. coli. Ces expériences ont apporté les résultats présentés dans le tableau 2. On peut faire les observations suivantes :
Dans E. coli, que ce soit dans le cas du vecteur navette pCGL229 ou dans le cas du vecteur pCGL 107 (qui peut s'y répliquer), l'efficacité de transformation est nettement diminuée lorsque Mud+ est présent sur le vecteur ce qui n'est pas le cas lorsque les gènes de transposition ont été délétés. Ce phénomène typique des plasmides réplicatifs portant des dérivés de Mu actifs peut être attribué à une très forte expression de la transposase de Mu dans son hôte naturel. Ceci montre que dans les constructions présentées ci-dessus, les Mud+ utilisés (MudII 1681 et
MudII 1681-Cat) sont bien actifs.
Dans aucune des souches de Corynébactérie testées il n'est possible d'obtenir de transformants avec les vecteurs navettes pCGL229::Mud+ ou - (ni avec le vecteur suicide pEV11::Mud). Dans le cas des dérivés de pCGL229, il est possible que lors de la minimuduction dans E. coli Rec+ le réplicon pBLI ait été inactivé expliquant l'incapacité du vecteur à se multiplier dans B. lactofermentum.
Des transformants ont été obtenus dans B. lactofermentum CGL2005 (B115) avec le vecteur intégratif pCGL107 et ses dérivés. L'efficacité de transformation obtenue avec pCGL107:;Mud- et pCGL107::Mud- est semblable, ce qui indique que le MiniMu MudII 1 681 -Cat A+B+ ne se transpose pas à haute efficacité lorsqu'il est introduit dans
B. lactofermentum à l 'aide d'un vecteur intégratif.
La diminution observée (facteur 20) dans l'efficacité de transformation des deux dérivés de pCGL l 07 comparés à pCGL 107 lui-même est vraisemblablement due à l'augmentation de taille du piasmide transformant ( 1 0 kb dans le cas de pCGL 107, 26,7 kb dans le cas de pCGL 107::Mud+ et 22, 1 kb dans ie cas de pCGL 1 07::Mud-).
EXEMPLE 7
Etude des événements d'intégration de pCGL107:;Mud+ dans
B. lactofermentum CGL2005 (B115)
La transformation αe la souche CGL20C 5 (B1 1 5) par pCGL 1 07::Mud- (ci-après dénommé pCGL320) a permis d'obtenir 1 47 clones résistant à la kanamycine (25 μg/ml) mais aucun transformant en sélectionnant pour ia résistance au chloramphenicol ( 5 μg/ml). Cependant, après réplique sur chloramphenicol, 103 de ces clones sont résistants au chloramphenicol. II s'avère donc que ie gène cat αe Tn9 ne s'exprime pas suffisamment à une seule copie pour permettre une sélection primaire en colonies ; par contre, cette expression est suffisante pour déterminer un phenotype résistant par des tests ultérieurs en strie. Tous les clones obtenus sont de phenotype lac-, ce qui correspond au phenotype observé chez E. coll.
Les ceux types d 'intégrants obtenus (les transformants de type
I . Km R CmS et de type 2. Km R Cm R) peuvent correspondre respectivement à la substitution du gène gdh A par év énement de double "crossing-over" et à l'intégration du piasmide complet au site gdhA par événement de simple
"crossing-over" (Figure 7). Les données en faveur de cette interprétation sont les suivantes :
Le dosage de la glutamate déhydrogénase (selon la technique de Meers et al., 1970) chez les transformants de type 1 et 2 (Tableau 3) : 5 sur 7 transformants de type 1 (pour exemple K2 et K3, Tableau 3) ont une activité gdh nulle, ce qui est en accord avec ia substitution du gène gdh.A par le gène interrompu, 4 des 5 transformants de type 2 ont une activité gdh semblable au témoin (KC2 et KC4- par exemple, Tableau 3). Les analyses moléculaires en Southern Blot correspondant à ia digestion BamHI des transformants de type 1 (K2) et de type 2 (KC2 et KC4) et révélation des bandes caractéristiques (visualisées sur la Figure 7) par la sonde plasmidique pCGL107 (résultats non présentés). Celles-ci indiquent que la structure moléculaire des transformants gdh-
(K2) est conforme à une substitution de gène. Elle confirme aussi que les transformants gdh+ (événements de type 2 (KC2 et KC4) et quelques uns de type 1 (K l) sont obtenus par intégration du piasmide au site gdhA.
EXEMPLE 8
Sélection des éventuelles transpositions
Les transformants de type 2 (KmR et CmR) n'expriment pas suffisamment le gène de résistance au chloramphenicol pour obtenir la croissance de colonies isolées en présence de chloramphenicol 5 μg/ml. Nous avons donc recherché chez ces transformants des sous-clones CmR en espérant sélectionner des transpositions de Mud (qui porte le gène cat). Ces sous-clones ont été obtenus à une fréquence voisine de 1 pour 10 cellules. Après réplique sur Xgal, ces clones présentent toute une graduation de couleurs du blanc au bleu (30 % sont nettement bleus). Ce résultat est confirmé par la mesure des activités béta-galactosidase (Tableau 4). Ceci pourrait indiquer une transposition de Mud, amplifiant la résistance au chloramphenicol et faisant apparaître des activités béta-galactosidase par fusion de protéine au site d'insertion. En fait, les mêmes expériences réalisées avec ie pCGL107::Mud- ont abouti au même résultat indiquant que ces événements ne sont pas dus à des événements de transposition. EXEMPLE 9
Mise en évidence de l'amplification en tandem sur le chromosome du piasmide pCGL107;:Mud+
Il s'avère que la quasi totalité de ces clones Lac+ isolés précédemment (à l'exception de KC3T4) ont aussi une activité gdh amplifiée (Tableau 4). De plus, sauf une exception (KC3T4), les activités béta-galactosidase (dosée selon Miller, 1972) et gdh sont quasi proportionnelles. La même observation peut être faite concernant le dosage de ia chloramphenicol acétyl transférase (selon la méthode de Shaw, 1975, Tableau 5). Ce résultat est contradictoire avec la transposition de Mud qui n'emporte jamais de séquences adjacentes lors de sa transposition. Il indique plutôt une amplification en tandem sur le chromosome de l'unité de répétition pUN-Mud-gdh qui est bordée par des homologies de séquence. Ce point a été confirmé par digestion de l'ADN génomique des souches KC3, KC3T1 et KC3T3 par BamHI, Notl et Xbal. Non seulement la bande BamHI interne à Mud (et égale à 7 kb) est amplifiée mais aussi les bandes contenant les extrémités de Mud ( 11 kb et 2,4 kb) ce qui est conforme à une amplification en tandem et ce qui s'oppose à un événement de transposition. De plus, les digestions Notl (qui coupe une seule fois dans MudII 168 1-Cat) et Xbal (qui coupe une seule fois dans gdh') amplifient nettement la bande de 24 kb de l'unité de répétition.
Cette amplification semble relativement stable dans la mesure où l'activité béta-galactosidase reste à un niveau de 70 % de l'activité de départ après 15 générations sans pression de sélection. Les activités Cat et Gdh présentent également une perte de 30 % après 25 générations. Cette amplification en tandem rappelle des résultats d'Albertini et al. ( 1985) et de 3annière et al. ( 1985) chez Bacillus subtilis. On attribue l'activité béta-galactosidase des clones amplifiés à une traduction parasite amplifiée (hors du cadre de lecture du gène de résistance à l'ampicilline où l'opéron lac est fusionné) présente chez B. lactofermentum et indétectable chez E. coll.
EXEMPLE 10
Etude et caractérisation de l'élément d'insertion ISaBl
Un élément d'insertion a été isolé par récupération de plasmides dans E. coli DH5aipha à partir de l'ADN amplifié de KC3T4. L'ADN génomique de la souche de B. lactofermentum CGL2005 (B1I 5), de quelques dérivés et d'autres souches de corynébactéries, a été sondé par une sonde contenant l'élément d'insertion précédemment isolé. Tout d'abord, le fragment PvuII de 3,5 kb interne à Mu, issu de l'ADN amplifié chez KC3T4 et contenant l'élément d'insertion, a servi pour sonder le blot initial qui contient les digestions d'ADN par BamHI d'intégrants et de souches amplifiées variées (dont KC3T4). Comme l'insertion ne contient pas de site BamHI, cette expérience permet de révéler les fragments génomiques BamHI contenant au moins une insertion ou un fragment d'insertion. Dans la souche K l - (qui correspond à un intégrant substitué de type 1 obtenu à partir de pCGL 107:Mud-), cinq bandes apparaissent révélant la présence de plusieurs copies (entières ou non) de l'insertion. La digestion BamHI des ADN génomiques issus de
B. lactofermentum CGL2005 (BI15) a montré quatre bandes communes avec K l- (de taille respective 18 kb, 5,9 kb, 5 kb et 4,5 kb) ; la cinquième bande présente dans les autres souches K1-, KC 1- et KC3 (de taille 6,5 kb) peut traduire une transposition dans un ségrégant de la souche CGL2005 (B115) à l'origine de ces souches.
Entre deux lignées de brévibactéries différentes (i)
Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B1 15), et (ii) Brevibacterium lactofermentum CGL2002, deux bandes communes apparaissent de taille 18 kb et 4,5 kb; par contre la souche CGL2002 n'a pas d'autres bandes. Ceci traduit une mobilité de l'élément. Les souches de Corynebacterium melassecola donnent des signaux d'hybridation faibles avec l'insertion traduisant l'existence d'autres séquences différentes mais apparentées chez cette espèce.
Un premier élément d'insertion mobile spécifique de
B. lactofermentum a été identifié et clone ; nommé ISaBl, il peut être présent à plusieurs copies (2 à 5 copies) dans ie génome. Il est susceptible de se transposer plusieurs fois en des sites différents dans une région amplifiée. Sa carte de restriction fine est connue. Des séquences différentes mais apparentées existent dans le génome des autres corynébactéries.
ISaBi est constituée de 1288 paires de bases ; les extrémités peuvent être identifiées car ISaBi s'est insérée dans un fragment qui correspond à la région terminale (3') de l'opéron lac qui a été séquence par Hediger et al. (Biochemistry Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1985). ISaBi s'est inséré entre ie nucléotide 5575 et 5576 en duplicant une séquence cible de 5 bp (CCGAT) (Figure 8). La séquence entière de ISaBi est donnée dans la Figure 9 et la carte de restriction dans la Figure 10. Deux phases ouvertes de lecture ont été identifiées qui pourraient correspondre, étant donné les analyses de séquence, au gène de structure de la transposase et au gène répresseur de la transposition.
EXEMPLE 11
Vecteur piège pour les éléments d'insertion et les transposons
L'insertion ISaBi a été obtenue au cours des études d'amplification de gène dans ie chromosome de B. lactofermentum (B1 15). Afin d'isoler tous les éléments d'insertion susceptibles de se transposer dans les corynébactéries, on a construit des vecteurs intégratifs particuliers : pCGL330 et pCGL331 (Figures 11 et 12). Ces deux vecteurs sont constitués d'un premier fragment dérivé du vecteur pUN 121. Le piasmide pUN 121 est réplicatif dans E. coli et porteur de ia résistance à l'ampicilline ; il porte une séquence codant pour le répresseur cI du phage lambda qui inhibe l'expression d'une fusion d'opéron entre le promoteur PL du phage lambda et un gène de résistance de la tétracycline. L'insertion dans le gène cl inactivera de ce fait le répresseur qui permettra alors l'expression du gène de résistance à la tétracycline qui s'exprime chez les corynébactéries sous le contrôle de PL . On peut ainsi sélectionner les événements d'insertion par la résistance à ia tétracycline. On a linéarisé pUN 121 au site Sspl et fusionné à un deuxième fragment obtenu par digestion du vecteur pCGL 107 par EcoRI rempli à la Klenovv pour donner après transformation de E. coli DH5alpha, les vecteurs pCGL330 et pCGL331 qui diffèrent entre eux par le sens du clonage. Le fragment EcoRI dérivé de pCGL 107 contient un gène de sélection pour la transformation directe des corynéoactéries (le gène aphlll qui confère la résistance à la kanamycine) et un fragment contenant une partie homologue du gène gdhA (gène de structure de ia glutamate deshydrogenase) qui servira de point d'intégration dans le chromosome des corynébactéries.
Les souches de B. lactofermentum CGL2005 (BL 15) et CGL2002 ont été électrotransformées pour la résistance à la kanamycine par les plasmides pCGL330 et pCGL331. La fréquence de transformation a été a peu près de 103 par μg dans chacun des cas, ce qui est compatible avec une intégration des plasmides. Les transformants (comme
CGL2005::pCGL330 et CGL2005::pCGL331) sont sensibles à la tétracycline ce qui confirme que la régulation de PL par cl fonctionne bien chez les transformants. La fréquence des ségrégants résistants à la tétracycline a été mesurée après environ 10 générations.
Des mutations inactivant le gène cl apparaissent dans les souches possédant les plasmides intégrés pCGL330 et pCGL331 à une fréquence de 2× 10 6 par génération.
Une récupération de piasmide a été réalisée à partir de l'ADN génomique extrait de ségrégants tétracycline résistants isolés à partir des souches CGL2005::pCGL331 et CGL2005::pCGL330 et digéré par l'enzyme Pstl. Ces ADN digérés ont été ligaturés et le produit de la ligation a servi à transformer la souche DH5alpha de E. coli pour la résistance à la tétracycline. Les plasmides récupérés ont été analysés et dans 7 cas sur 9 clones résistants à la tétracycline, un élément d'insertion a été identifié. Dans un cas (issu de CGL2005::pCGL331), un élément d'insertion identique à ISaBl a été identifié (1,2 kb de taille, possédant les sites uniques AccI,
EcoRV et XhoI) avec une localisation interne à cI. Dans un autre cas (issu de CGL2005::pCGL330), un élément d'insertion différent d'ISaBl (taille de 1,0 kb, possédant un site AccI mais pas de site EcoRV ni Xhol) a été identifié.
Le vecteur de piège à transposon fonctionne ; dans la majorité des cas, la mutation obtenue est une insertion ; les fréquences de résistance à la tétracycline mesurent donc assez correctement les fréquences de transposition ; les éléments les plus mobiles ont donc été identifiés ; parmi ceux-ci, ISaBl a été réisolée et un autre élément d'insertion différent d'ISaBl a été identifié.
Les souches citées ont les origines suivantes :
Escherichia coli
. DH5alpha : Gibco BRL
. MC4100 : Casadaban ( 1976)
. OR 1836 : Reyes
Brevibacterium lactofermentum
. CGL2002 : Bonamy et al. ( 1990)
. CGL2005 (BU 5) : Bonnassie et al. (1990)
Corynebacterium melassecola
. ATCC17965 : ORSAN
. ATCC 17965::gltA : (la présente demande)
Quatre de ces souches ont été déposées dans la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) de l'Institut Pasteur (Paris) le 23 juillet 1991 :
- Corynebacterium melassecola ATCC 17965::gltA : n° 1- 1124
- Escherichia coli OR 1836 : n° 1-1125
- Brevibacterium lactofermentum CGL2005 (B115) : n° I- 1126
- Brevibacterium lactofermentum CGL2002 : n° I- 1127.
La so uche DH5alpha est disponible dans le catalogue de
Clontech Laboratories, n° C 1021- 1, (Palo Alto, CA. USA) et la souche MC4100 à l'ATCC sous le n° 35695.
Figure imgf000021_0001
Tableau 2: Efficacité de transformation des vecteurs portant les MiniMu
Souches bactériennes
E.coli DH5α B .lactofermentum B .lactofermentu
CGL2002 CGL2005 (B115 ) pCGL229 5×107 105 106
pCGL229::Mud+ 2×104 0 n.d.
pCGL229::Mud- 4×106 0 n.d.
pCGL107 102 3×103 104 pCGL107::Mud+ 5×102 0 4×102 pCGL107::Mud- 105 n.d. 5×102
TABLEAU 3: DOSAGE DE LA GLUTAMATE DESHYDROGENASE
DANS LES TRANSFORMANTS PRIMAIRES Activité specifique Gdh en μmole de
Souche bactérienne
NADPH2 consommé/min/mg protéine
souche de départ KmSCmS
CGL2005 (B115) 2,18 transformant KmSCmS
K1 2,0
K2 10,06
K3 10.06
K4 10,06
K5 10,06
K6 2,18
K7 10,06 transformant KmSCmS
KC2 2,24
KC3 2,12
KC4 2,18
KC5 3,45
KC7 2,06 TABLEAU 4: DOSAGE DES ACTI VITES BGALACTOSIDASE ET
GLUTAMATE DESHYDROGENASE DANSlES INTEGRANTS AMPLIFIES
Souche bactérienne Activité Activité spécifique ßgalactosidase glutamate deshydroge
souche de départ Kms Cms
CGL2005 (B115 ) 3,7 2,48 intégrants primaires KmR CmR
KC2 6,2 2,24
KC3 4,5 2,06
intégrants amplifiés
KC3T1 27,9 18,2
KC3T2 20,7 16,0
KC3T3 48,2 49,6
KC3T4 32,2 2,24
KC3T5 19,7 8,55
KC3T6 19,0 11,9
KC3T7 34,5 28,0
KC2T1 7,4 2,73 TABLEAU 5: DOSAGE DES ACTIVITES CAT, BGA1 et GDH
DANS LES SOUCHES AMPLIFIEES
Souche bactérienne Activité ßgal Activité Activité
spécifique Cat spécifique Gdh
souche de départ Kmscms
CGL2005 (BH5) 3,7 ≤0,07 2,18 intégrant primaire KmRCm s
K2 10,07 10,006
K3 10,07 10,006 intégrant primaire KmRCm R
KC3 4,5 2,72 2,06
KC7 5,4 1,82 intégrants amplifiés
KC3T1 27,9 19,7 18,2
KC3T3 48,2 55,5 49,6
KC3T4 32,2 18,4 2,24
KC3T5 19,7 13,6 8,55
REFERENCES
Albertini A. M. and Galizzi A. ( 1985). Amplification of a chromosomal région in Bacillus subtilis; 3. Bacteriol., 162: 1203-1211)
Ausubel M. A., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J. A. and Struhl K. (1987) in "Current protocols in Molecular Biology", Greene Publishing Associates and Wiley - Interscience Birnboim H.C. and Doly 3., (1979) A rapid alkaline extraction procédure for screening recombiriant piasmid DNA. Nucleic Acid Res. 7: 1513- 1523
Bonamy . C, Guyonvarch A., Reyes O., David F. and Leblon G. ( 1990) Interspecies eiectro-transformation in Corynebacteria. FEMS Microbiology Letters 66:263-270
Bonnassie S. Oreglia 3. Trautwetter A. and Sicard A. M. ( 1990) Isolation and characterization of a restriction and modification déficient mutant of Brevibacterium lactofermentum, FEMS Microbiol. Letters, vol. 72: 143-146
Casadaban M. J. Transposition and fusion of the lac gènes to selected promoters in E. coli using bacteriophages lambda and Mu. 3. Mol. Bioi: 104 ( 1976) 541-555 Castilho B.A., Olfson P. and Casabadan M.3. ( 1984) Plasmid insertion mutagenesis and lac gène fusion with miniMu bacterïophage transposons, 3. Bacteriol. 158:488-495
Dower W.3., Miller 3.F. and Ragsdale C.W., High Efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acid Res. 16 ( 1988) 6127-6145
Jannière L., Niaudet B., Pierre E., Ehrlich S.D. ( 1985) Stable gène amplification in the chromosome of Bacillus subtilis, Gène 40:47-55 Maniatis T., Fritsch Ed. and Sambrook 3. ( 1982). Molecular cloning : A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laborator\ Press, Cold Spring Harbor, NY Meers 3.L. Tempest D. W. and Brown CM. Glutamine (amιde):2-Oxoglutaraτe Amino Transferase Oxido-reductase (NADP), an Enzyme Involved in the Synthesis of Glutamate by Some Bacteria 3. General Microbiology 64 (1970) 187-194
Miller 3. (1972) Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)p352-355
Nilsson B., Uhlén M., 3osephson S.. Gatenbeck S. et Pnilipson L., 1983. An improved positive sélection plasmid vector constructed by oligonucleotide mediated mutagenesis. Nuc. Acid. Res. 11, 8019-8030
Shaw W.V. (1975) Chloramphenicol acety l transferase from chloramphenicol résistant bacteria. Metho. in Enz. 43: 737-755
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000031_0001

Claims

REVENDICATIONS
1) Integron de Corynébactérie caractérisé en ce qu'il comporte :
- un gène assurant une sélection efficace dans ladite corynébactérie, - une séquence homologue du génome de ladite corynébactérie, lesdites séquences ayant été adaptées à ladite bactérie.
2) Integron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il provient d'un piasmide qui comporte, outre l'integron, une partie replicative, l'integron étant flanqué de séquences répétées inverses correspondant à un site de restriction non présent dans l'integron.
3) Integron selon la revendicaτon 2, caractérisé en ce que la partie replicative comprend une origine de réplication efficace dans une bactérie non Corynéforme.
4) Integron selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'origine de réplication est efficace dans E. coli.
5) Integron selon l'une des revendications 2 à k, caractérisé en ce que la partie replicative comprend une origine de réplication efficace dans les bactéries Corynéformes.
6) Integron selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les séquences d'un élément transposable.
7) Integron selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'élément transposable comporte des séquences provenant d'une corynébactérie.
8) Integron selon ia revendication 7, caractérisé en ce que la séquence provient de Brevibacterium.
9) Integron selon la revendication 8, caractérisé en ce que la séquence provient de ISaBl telle que décrite dans la Figure 9.
10) Integron selon l'une des revendications 6 à 9, caractérisé en ce qu'il comporte en outre les séquences d'un élément transposable assurant la transposition à l'exception des protéines codées par la bactérie corynéforme.
11) Integron selon l'une des revendications 6 à 10, caractérisé en ce que les séquences de l'élément transposable sont dépourvues des séquences codant pour les transposases.
12) Integron selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'intérêt. 13) Integron selon la revendication 12, caractérisé en ce que la séquence d'intérêt code pour un peptide ou une protéine d'intérêt.
14) Integron selon ia revendication 13, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine homologue.
15) Integron selon la revendication 14, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une protéine hétérologue.
16) Integron selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que la protéine d'intérêt est une enzyme.
17) Integron selon la revendication 16, caractérisé en ce que la séquence codant pour une protéine d'intérêt est choisie parmi les gènes : - gltA
- gdhA.
18) Integron selon l'une des revendications 2 à 17, caractérisé en ce que ie site de restriction non présent dans l'integron est choisi parmi :
- NotI
- BstXI.
19) Integron selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisé en ce que lesdites séquences ont été adaptées pour une souche de Corynébactérie.
20) Integron selon la rev endication 19, caractérisé en ce que lesdites séquences ont été transférées dans une souche de Brevibacterium avant d'être adapté chez Corynebacτerium.
21) Integron selon la revendication 20, caractérisé en ce que lesdites séquences ont ete amplifiées.
22) Integron amplifié selon la revendication 21, caractérisé en ce que l'amplification a donné des séquences amplifiées stables.
23) Integron selon ia revendication i. caractérisé en ce qu'il contient une séquence homologue de Corynebacterium melassecola qui s'intègre dans le chromosome de Brevibacterium lactofermentum.
24) Procédé de transformation d'une souche de bactérie corynéforme par un integron selon l'une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce que l'integron est introduit dans ladite souche par electroporation. 25) Corynébactérie susceptible d'être obtenue par le procédé selon la revendication 24.
26) Corynébactérie selon la revendication 25, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une souche de :
- B. lactofermentum
- B. flavum
- C. glutamicum
- C. melassecola.
PCT/FR1991/000656 1990-08-08 1991-08-08 Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue WO1992002627A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BR919105857A BR9105857A (pt) 1990-08-08 1991-08-08 Integron de corinebacteria,processo de transformacao de uma cepa de bacteria com corineforma e corinebacteria
KR1019920700810A KR920702423A (ko) 1990-08-08 1991-08-08 코리네박테리아 인테그론, 상기 인테그론에 의한 코리네박테리아의 형질전환 방법 및 수득 코리네박테리아
FI921527A FI921527A0 (fi) 1990-08-08 1992-04-07 Integron av korynebakterier, foerfarande foer transformation av korynebakterier med naemnda integron och erhaollna korynebakterier.

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR90/10126 1990-08-08
FR9010126A FR2665711B1 (fr) 1990-08-08 1990-08-08 Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1992002627A1 true WO1992002627A1 (fr) 1992-02-20

Family

ID=9399530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1991/000656 WO1992002627A1 (fr) 1990-08-08 1991-08-08 Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0495078A1 (fr)
JP (1) JPH05502797A (fr)
KR (1) KR920702423A (fr)
CN (1) CN1061624A (fr)
AU (1) AU646886B2 (fr)
BR (1) BR9105857A (fr)
CA (1) CA2067240A1 (fr)
FI (1) FI921527A0 (fr)
FR (1) FR2665711B1 (fr)
HU (1) HUT63656A (fr)
IE (1) IE912791A1 (fr)
IL (1) IL99126A0 (fr)
MX (1) MX9100560A (fr)
NZ (1) NZ239309A (fr)
PT (1) PT98602B (fr)
WO (1) WO1992002627A1 (fr)
ZA (1) ZA916216B (fr)

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0584375A1 (fr) * 1992-03-11 1994-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Element transposable originaire d'une bacterie du genre brevibacterium
FR2736066A1 (fr) * 1995-06-30 1997-01-03 Ajinomoto Kk Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie
WO1997046691A1 (fr) * 1996-06-03 1997-12-11 Universite Laval Cassette d'integration permettant d'ameliorer la transgenese dans des eucaryotes
WO2002024917A2 (fr) * 2000-09-20 2002-03-28 Basf Aktiengesellschaft Procede pour modifier le genome de corynebacteries
CN101503670B (zh) * 2008-02-04 2011-12-14 复旦大学附属华山医院 一种含有整合子的工程菌株
US8202706B2 (en) 2006-07-13 2012-06-19 Evonik Degussa Gmbh Method of production of L-amino acids
EP2479279A1 (fr) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Procédé de fabrication fermentative d'acides aminés contenant du soufre
US8323933B2 (en) 2008-04-10 2012-12-04 Cj Cheiljedang Corporation Vector for transformation using transposons, microorganisms transformed by the vector, and method for producing L-lysine using the same
US8426165B2 (en) 2007-01-24 2013-04-23 Cj Cheiljedang Corporation Process for producing fermentation product from carbon sources containing glycerol using Corynebacteria
EP2628792A1 (fr) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Cellule dotée d'une activité ppGppase moindre
EP2700715A1 (fr) 2012-08-20 2014-02-26 Evonik Degussa GmbH Procédé de fabrication fermentative dýacides aminés L en utilisant des souches améliorées de la famille des enterobacteriaceae
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4035855B2 (ja) † 1996-06-05 2008-01-23 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0127328A2 (fr) * 1983-04-28 1984-12-05 Genex Corporation L'emploi d'une intégration dans des chromosomes pour stabiliser des gènes hétérologues
EP0231608A1 (fr) * 1985-11-28 1987-08-12 WHITBREAD & COMPANY PLC Procédés de préparation d'ADN recombinant et produits s'y rapportant
EP0273660A2 (fr) * 1986-12-26 1988-07-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. ADN codant pour une IMP-déshydrogénase inactivée
FR2615527A1 (fr) * 1987-05-22 1988-11-25 Lesaffre Soc Ind Procede d'integration d'une sequence connue d'adn dans les levures ascosporogenes, vecteurs mis en oeuvre et nouvelles souches de levures
EP0299552A1 (fr) * 1987-06-22 1989-01-18 Solvay Procédé de transformation de cellules
WO1991009129A1 (fr) * 1989-12-18 1991-06-27 Novo Nordisk A/S Integration stable d'adn dans des genomes bacteriens

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57183799A (en) * 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
IL67510A (en) * 1981-12-17 1988-08-31 Kyowa Hakko Kogyo Kk Recombinant vector plasmids autonomously replicable in microorganisms belonging to the genus corynebacterium or brevibacterium and process for the production thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0127328A2 (fr) * 1983-04-28 1984-12-05 Genex Corporation L'emploi d'une intégration dans des chromosomes pour stabiliser des gènes hétérologues
EP0231608A1 (fr) * 1985-11-28 1987-08-12 WHITBREAD & COMPANY PLC Procédés de préparation d'ADN recombinant et produits s'y rapportant
EP0273660A2 (fr) * 1986-12-26 1988-07-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. ADN codant pour une IMP-déshydrogénase inactivée
FR2615527A1 (fr) * 1987-05-22 1988-11-25 Lesaffre Soc Ind Procede d'integration d'une sequence connue d'adn dans les levures ascosporogenes, vecteurs mis en oeuvre et nouvelles souches de levures
EP0299552A1 (fr) * 1987-06-22 1989-01-18 Solvay Procédé de transformation de cellules
WO1991009129A1 (fr) * 1989-12-18 1991-06-27 Novo Nordisk A/S Integration stable d'adn dans des genomes bacteriens

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FEMS MICROBIOLOGY LETTERS, vol. 66, no. 1/3, 1 January 1990 (Amsterdam, NL); BONAMY C. ET AL.: "Interspecies electro-transformation in corynebacteria", pages 263-270 *
MOLECULAR MICROBIOLOGY. vol. 3, no. 12, 12 December 1989; STOKES H.W. ET AL.: "A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions: integrons", pages 1669-1683 *

Cited By (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0584375A1 (fr) * 1992-03-11 1994-03-02 Ajinomoto Co., Inc. Element transposable originaire d'une bacterie du genre brevibacterium
EP0584375A4 (en) * 1992-03-11 1996-07-03 Ajinomoto Kk Transposable element originating in bacterium of the genus brevibacterium
US5591577A (en) * 1992-03-11 1997-01-07 Ajinomoto Co., Inc. Mobile genetic element originated from brevibacterium strain
FR2736066A1 (fr) * 1995-06-30 1997-01-03 Ajinomoto Kk Procede d'amplification d'un gene par transposon artificiel, bacterie coryneforme obtenue par ce procede et procede de production d'un acide amine a l'aide de cette bacterie
EP0756007A2 (fr) * 1995-06-30 1997-01-29 Ajinomoto Co., Ltd. Methode d'amplification d'un gene utilisant un transposon artificiel
EP0756007A3 (fr) * 1995-06-30 1997-10-29 Ajinomoto Kk Methode d'amplification d'un gene utilisant un transposon artificiel
US5804414A (en) * 1995-06-30 1998-09-08 Ajinomoto Co., Inc. Method of amplifying genes using artificial transposons in coryneform bacteria
WO1997046691A1 (fr) * 1996-06-03 1997-12-11 Universite Laval Cassette d'integration permettant d'ameliorer la transgenese dans des eucaryotes
EP1921151A1 (fr) * 2000-09-20 2008-05-14 Basf Se Procédé de modification du génome de corynebactéries
WO2002024917A3 (fr) * 2000-09-20 2002-06-27 Basf Ag Procede pour modifier le genome de corynebacteries
WO2002024917A2 (fr) * 2000-09-20 2002-03-28 Basf Aktiengesellschaft Procede pour modifier le genome de corynebacteries
US8202706B2 (en) 2006-07-13 2012-06-19 Evonik Degussa Gmbh Method of production of L-amino acids
US8426165B2 (en) 2007-01-24 2013-04-23 Cj Cheiljedang Corporation Process for producing fermentation product from carbon sources containing glycerol using Corynebacteria
CN101503670B (zh) * 2008-02-04 2011-12-14 复旦大学附属华山医院 一种含有整合子的工程菌株
US8323933B2 (en) 2008-04-10 2012-12-04 Cj Cheiljedang Corporation Vector for transformation using transposons, microorganisms transformed by the vector, and method for producing L-lysine using the same
US8932861B2 (en) 2008-04-10 2015-01-13 Cj Cheiljedang Corporation Transformation vector comprising transposon, microorganisms transformed with the vector, and method for producing L-lysine using the microorganism
WO2012098042A1 (fr) 2011-01-20 2012-07-26 Evonik Degussa Gmbh Procédé de production, par fermentation, d'acides aminés soufrés
EP2479279A1 (fr) 2011-01-20 2012-07-25 Evonik Degussa GmbH Procédé de fabrication fermentative d'acides aminés contenant du soufre
EP2628792A1 (fr) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Cellule dotée d'une activité ppGppase moindre
WO2013120685A1 (fr) 2012-02-17 2013-08-22 Evonik Industries Ag Cellule ayant une activité ppgppase réduite
EP2700715A1 (fr) 2012-08-20 2014-02-26 Evonik Degussa GmbH Procédé de fabrication fermentative dýacides aminés L en utilisant des souches améliorées de la famille des enterobacteriaceae
WO2014029592A1 (fr) 2012-08-20 2014-02-27 Evonik Degussa Gmbh Procédé de production par fermentation de l-aminoacides au moyen de souches améliorées de la famille des entérobactériacées

Also Published As

Publication number Publication date
IL99126A0 (en) 1992-07-15
EP0495078A1 (fr) 1992-07-22
JPH05502797A (ja) 1993-05-20
AU8442391A (en) 1992-03-02
FR2665711A1 (fr) 1992-02-14
FR2665711B1 (fr) 1993-08-13
NZ239309A (en) 1993-07-27
AU646886B2 (en) 1994-03-10
BR9105857A (pt) 1992-09-29
FI921527A (fi) 1992-04-07
IE912791A1 (en) 1992-02-12
ZA916216B (en) 1992-04-29
CA2067240A1 (fr) 1992-02-09
HUT63656A (en) 1993-09-28
PT98602B (pt) 1999-01-29
MX9100560A (es) 1992-04-01
PT98602A (pt) 1992-08-31
CN1061624A (zh) 1992-06-03
KR920702423A (ko) 1992-09-04
FI921527A0 (fi) 1992-04-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5874259A (en) Conditionally amplifiable BAC vector
Youngman et al. Construction of a cloning site near one end of Tn917 into which foreign DNA may be inserted without affecting transposition in Bacillus subtilis or expression of the transposon-borne erm gene
Cornillot et al. The genes for butanol and acetone formation in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 reside on a large plasmid whose loss leads to degeneration of the strain
Wild et al. Conditionally amplifiable BACs: switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones
DE69631118T2 (de) Dna-integration durch transposition
Marx Development of a broad-host-range sacB-based vector for unmarked allelic exchange
WO1992002627A1 (fr) Integron de corynebacterie, procede de transformation d'une corynebacterie par ledit integron et corynebacterie obtenue
EP0628082B1 (fr) Souches d'agrobacterium capables d'une recombinaison specifique de site
JP4303597B2 (ja) Ｔｎ５結合Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ切除システムによる最小化ゲノムを含む新規菌株の構築
Flannagan et al. Conjugative transfer of Tn916 in Enterococcus faecalis: trans activation of homologous transposons
Huang et al. Convenient and reversible site-specific targeting of exogenous DNA into a bacterial chromosome by use of the FLP recombinase: the FLIRT system
US4713337A (en) Method for deletion of a gene from a bacteria
JP2004121248A (ja) 複数遺伝子組換えベクターコンストラクトの作成方法とその応用
EP1974037A2 (fr) Vecteurs linéaires, cellules hôtes et procédés de clonage
US6864087B2 (en) Method for converting single-copy BAC vectors to conditional high-copy pBAC/oriHC vectors
Lewin et al. Gene expression in bacteria directed by plant-specific regulatory sequences
EP0841402B1 (fr) Vecteur navette binaire d'une grande capacité
EP0631626A1 (fr) Plasmide thermosensible
US6376192B1 (en) Method for screening of DNA libraries and generation of recombinant DNA constructs
Dempsey Regulation of R100 conjugation requires traM in cis to traJ
WO2002068670A1 (fr) Methode de transfert de segments d'adn
CN114990148B (zh) 应用于简单类诺卡氏菌的质粒及其筛选和测试方法
JP2002508669A (ja) 所望の遺伝子の複数コピー、及び選択マーカーではなく、スクリーニング可能マーカーを含むタンパク質産生細胞
Twyman et al. Gene transfer in bacteria
WO2003064623A2 (fr) Methodes et vecteurs permettant de faciliter la recombinaison a un site specifique

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU BR CA FI HU JP KR SU US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1991915423

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 921527

Country of ref document: FI

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2067240

Country of ref document: CA

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1991915423

Country of ref document: EP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Ref document number: 1991915423

Country of ref document: EP