WO1991012327A1 - Glutathion-s-transferase sm26 de s. mansoni - Google Patents

Glutathion-s-transferase sm26 de s. mansoni Download PDF

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WO1991012327A1
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François TROTTEIN
André Capron
Doris Schmitt
Jean-Pierre Lecocq
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a glutathione S-transferase (GST) from Schistosoma mansoni, having a molecular weight of 26 Kd, called p26 or Sm26, as well as the means for producing this protein in a substantially purified form.
  • GST glutathione S-transferase
  • Schistosomes are worms that are the agents of a parasitic disease in the tropics and subtropics, called schistosomiasis (or bilharziasis). This disease affects around 200 to 400 million people. There is a drug effective against the adult parasite, praziquantel, but its cost is too high to consider its widespread use in developing countries. The only serious hope for preventing the disease to date lies in the development of an effective vaccine against the parasite.
  • S. mansoni has at least two glutathione-S-transferases; one with a molecular weight of 26 Kd, the other, predominant, with a molecular weight of 28 Kd, called p28 or Sm28.
  • the existence of these two proteins has been demonstrated on SDS-polyacrylamide gel after electrophoresis of the sample of an eluate obtained by affinity chromatography of an extract of S. mansoni on a glutathione-agarose column (Tiu et al, Parasite Immunol., (1988) OJ: 693).
  • this article does not explain how to obtain from the eluate, preparations containing each of the two glutathione-S-transferases in separate form.
  • Sm28 as obtained by recombinant DNA techniques, could be a candidate of choice as a schistosomiasis vaccine agent.
  • Sm26 as well as analogues thereof. Like Sm26, these analogs could be characterized by glutathione-S-transferase activity or by the ability to induce in an mammal an immunological response which protects this mammal against infection by schistosomes.
  • the analog (45-80) is cited, starting with the lysine residue in position 45 and ending with the histidine residue in position 80.
  • a protein according to the invention in particular the Sm26 protein whose amino acid sequence is as shown in the sequence identifier can exist in monomeric or multimeric form.
  • the dimeric form which may advantageously be maintained by inter-chain disulphide bridges is cited by way of example.
  • Glutathione-S-transferase activity can be demonstrated by the method described by Hahig & Ja oby, Methods in Enzymology, 77: 398.
  • a test solution preferably prepared in a buffer medium close to neutrality
  • 820 ⁇ l of a 50 mM potassium phosphate buffer solution pH 6.5 which also contains 4.7 mM of reduced glutathione and 360 ⁇ M of l-chloro-2,4-din ⁇ trobenzene.
  • a negative control is carried out.
  • the appearance of the reaction product is followed by spectrophotometry at 340 nm until complete transformation of the substrate. Glutathione-S-transferase activity is given in ⁇ M / min / mg.
  • the invention also relates to:
  • isolated DNA fragment which codes for a protein according to the invention.
  • a particular example of a DNA fragment according to the invention is shown in the sequence identifier.
  • isolated DNA fragment is meant a DNA fragment which is no longer associated with the regions which control its expression in the organism from which it originates, that is to say in the present case S.mansoni.
  • an expression cassette which comprises a DNA fragment according to the invention as well as elements necessary for its expression (transcription and translation) in a host cell.
  • These elements are essentially an appropriate transcription promoter as well as the start and end of translation codons. In some cases, it is also advantageous to add a transcription terminator.
  • This expression cassette can either be integrated into the genome of the cell, or carried by an expression vector suitable for autonomous replication, e.g. a plasmid.
  • a process for preparing a protein according to the invention which comprises the act of cultivating a cell according to the invention and of harvesting said protein from the culture.
  • composition intended for the prevention or treatment of schistosomiasis which comprises, as therapeutic agent, at least one protein whose amino acid sequence has at least 90% homology with the sequence as shown in the sequence identifier, starting with the alanine residue in position 1 and ending with the lysine residue in position 217.
  • a pharmaceutical composition intended to prevent or treat schistosomiasis • which comprises, as therapeutic agent, at least one protein whose amino acid sequence is as shown in the sequence identifier, starting with the alanine residue in position 1 and ending with the lysine residue in position 217, or a fragment of said protein containing at least 22 amino acids.
  • a method for preventing or treating schistosomiasis which comprises the act of administering a therapeutically effective amount of a protein according to the invention to a patient in need of such treatment.
  • a protein according to the invention or a fragment thereof has a therapeutic activity, for example a vaccine activity, and therefore is useful as a pharmaceutical product. This activity can be demonstrated in a test identical or similar to that described in Example 3.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a protein according to the invention or a fragment of said protein is combined with a diluent or a support which is acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • the protein may advantageously be in monomeric or dimeric form, the latter form being particularly advantageous.
  • a composition according to the invention may also contain other compounds such as other glutathione-S-transferases from schistosomes eg Sp26, Sp28, Sm28, preferably in dimeric form, or one of the analogs thereof.
  • a composition according to the invention may contain a vaccination adjuvant such as alum.
  • this adjuvant can be added to a composition according to the invention just before use.
  • a composition according to the invention can be administered by any conventional route in use in the field of vaccines, in particular by the subcutaneous route, for example in the form of a solution or suspension for injection. The administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval. The appropriate dosage will vary depending on various parameters, for example, the individual being treated and the mode of administration.
  • a protein according to the invention or a fragment thereof can in particular be useful as an agent exhibiting glutathione transferase activity. Therefore, it can be used for example in bioconversion processes.
  • Figure 1 shows the vector pTG959.
  • Figure 2 shows a polyacrylamide-SDS gel revealed by staining with Coomassie blue after electrophoresis.
  • Columns a, b and c correspond respectively to the non-purified soluble and insoluble fractions of the TGE901 / pTG4l70 extracts after induction for 5 h at 42 ° C. and to the preparation purified on a glutathione-agarose column.
  • Figure 3 compares the amino acid sequences of the Sm26 and Sj26 proteins. In these, spaces are schematically introduced so as to obtain an optimal alignment.
  • EXAMPLE 1 Cloning of a complementary DNA coding for Sm26
  • the supernatant is recovered and then applied to a gluthation-agarose column (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo) equilibrated with the buffer described above. After intensive washing with this same buffer, the fixed fraction is eluted with an elution buffer (50 mM Tris-HCl, pH 9.1, 7 mM reduced gluthation and 0.1 mM dithiotreitol). The eluted fraction is then neutralized using the 0.5 M potassium phosphate buffer, pH 7, then dialyzed against 10 mM potassium phosphate, pH 7 and finally concentrated with aquacid II (Calbiochem -Behring Corp, CA) .
  • an elution buffer 50 mM Tris-HCl, pH 9.1, 7 mM reduced gluthation and 0.1 mM dithiotreitol.
  • the eluted fraction is then neutralized using the 0.5 M potassium phosphate buffer, pH 7, then dialyzed against 10 mM potassium phosphate, pH 7 and finally concentrated with aqua
  • the total S-mansoni gluthation S-transferases thus purified are fractionated on a preparative polyacrylamide gel (13%) according to the technique described by Laemmli et al, Nature, (1970) 227: 680. After staining with Coomassie blue, the strip migrating at 26 kDa is recovered. Sm26 is electro-eluted according to the protocol described by Balloul et al., Mol. Biochem. ParasitoL, (1985) Yh 105. It is dialyzed against water and then concentrated using aquacid II.
  • Rabbits receive by multi-site intradermal injection (40 points) 100 ⁇ g of Sm26 in a total volume of 1 ml purified in the presence of complete Freund's adjuvant. Two weeks later, 20 ⁇ g of Sm26 are injected in the presence of incomplete Freund's adjuvant for subclavicular administration.
  • RNA from adult schistosomes is extracted by the method described by Chirgwin et al., Biochemistry (1979) Jjî: 5294 and modified by Gausz et al., Mol. Biochem. ParasitoL, (1983) 7: 293.
  • the poly A + RNA is obtained by affinity chromatography on an oligo (dT) cellulose column 12-18 (Collaborative Research, Lexington, MA).
  • a complementary DNA library expressed in the lambda gt 11 vector is constructed using the Amersham kit as follows. From purified poly A + RNAs, complementary DNAs (cDNAs) are synthesized according to the method of G ⁇ bler and Hoffman, Gene (1983) 25: 263.
  • EcoRI adapters are attached to the cDNA fragments. These are then digested with EcoRI and the excess adapters are removed by column chromatography. These cDNA fragments are inserted into the EcoRI site of phage lambda gt 11 (Young and Davis, 1983). The EcoRI inserts are thus fused with the sequence coding for ⁇ -galactosidase and are therefore placed under the control of the lactose promoter. Recombinant phages are packaged in vitro.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • the filters are incubated in the presence of anti-p26 rabbit antiserum (previously adsorbed on an extract of E.colQ antigens.
  • the fixed antibodies are recognized by a second anti-rabbit IgG antibody labeled with biotin; a streptavidin -peroxidase then binds to biotin, and this complex is revealed by a reaction of peroxidase on a colored reagent called "HRP color development reagent", marketed by Bio Rad.
  • This antibody detection makes it possible to identify the recombinant phages whose cDNA insert directs the synthesis of a protein or a protein fraction carrying epitopes recognized by specific anti-Sm26 antibodies.
  • the vector M13TG4116 is thus obtained.
  • the cDNA sequence is presented in the sequence identifier.
  • the vector M13TG4116 is digested with EcoRI and BglII, and the DNA fragments are separated by electrophoresis on agarose gel.
  • the 0.75 Kb fragment comprising the Sm26 cDNA is eluted by the Geneclean method.
  • the vector pTG959 described in EPA 292 404 and shown schematically in Figure 1 is digested with EcoRI and BglII. These cuts result in the loss of a fragment containing the 5 'part of the lacZ gene.
  • the 0.75 Kb fragment is ligated into the vector pTG959 as previously prepared to give the vector pTG4170.
  • the DNA fragment coding for Sm26 is therefore placed downstream and under the control of the pL promoter of phage lambda which is inducible at 42 ° C.
  • E.coli TGE901 (F-sup-his ilv bio (lambda-ci 857 delta-Bam delta-Hl)) transformed by the plasmid pTG4170 is cultured in 11 LB medium - ampicillin. The culture is continued, firstly at 30 ° C until an OD ⁇ of 0.2 and secondly at 42 ° C for 5 hours.
  • the cells are harvested by centrifugation and then lysed both by sonication and by enzymatic treatment in an equilibration buffer of formula: 10 mM potassium phosphate, pH7; 1.15% w / v KCI; 0.5 mM Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride; 1 mM EDTA, additionally containing 100 ⁇ g / ml of lysosyme and 0.1% of newt
  • the lysate is then centrifuged at 10,000 rpm at 4 ° C for 20 min.
  • the supernatant is recovered and then deposited in a continuous stream (30 ml / h) on a glutathione-agarose column (Sigma Chemicals Co., St Louis, Mo) previously equilibrated with the equilibration buffer described above.
  • the fixed fraction is eluted with 10 ml of elution buffer of formula: 50 mM Tris-HCl, pH9.1; 7 mM glutathione in reduced form; 0.1 mM dithiothreitol.
  • the glutathione-S-transferase activity of the preparation thus purified is controlled as follows: 10 ⁇ l of the preparation are added to 820 ⁇ l of a 50 mM potassium phosphate buffer solution; pH 6.5; which also contains 4.7 mM of reduced glutathione and 360 ⁇ M of l-chloro-2,4-dinitrobenzene. In parallel, a negative control is carried out. The appearance of the reaction product (yellow coloring) is followed at 340 nm until complete transformation of the substrate. The activity measured is of the order of 30 to 50 ⁇ M / min / mg.
  • the method of preparation of Sm26 previously described makes it possible to obtain approximately 1 to 2 mg of purified protein from a liter of culture.
  • the rats receive 25 ⁇ g of Sm26 subcutaneously as obtained in Example 2 (group 1), 25 ⁇ g of Sm28 purified from adult worms (group 2) or 25 ⁇ g of bovine serum albumin (group 3).
  • Each antigen is injected in a volume of 1 ml in the presence of 1.25 mg of aluminum hydroxide adjuvant (Serva alum gel).
  • the rats of group 4 receive only 1.25 mg of aluminum hydroxide adjuvant in the same volume.
  • the rats of group 5 receive nothing.
  • the corresponding treatment is repeated 15 days after the first injection.
  • the rats of each group are anesthetized, then infested by transcutaneous passage of 1000 cercariae.
  • 21 days after the infestation the livers are ligated and perfused with physiological fluid containing 1% heparin and 0.1% Tween. This makes it possible to recover the worms which are then counted under the binocular magnifier.
  • the results are presented in the table below.
  • Group n ° 2 (positive control) and group n ° 1 show a reduction in parasitic load of 45% and 16% respectively compared to group n ° 4
  • Sm26 The amino acid sequence of the glutathione-S-transferase of 26 Kd from S.mansoni, called Sm26 as well as the nucleotide sequence of the complementary DNA fragment coding for the protein cited above.

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Abstract

L'invention concerne une glutathion-S-transférase de Schistosoma mansoni, ayant un poids moléculaire de 26 Kd, appelée p26 ou Sm26 ainsi que les moyens de production de cette protéine sous une forme substantiellement purifiée.

Description

GLUTATHION-S-TRANSFERASE SM26 DE S.MANSONI
La présente invention concerne une glutathion S-transférase (GST) de Schistosoma mansoni, ayant un poids moléculaire de 26 Kd, appelée p26 ou Sm26 ainsi que les moyens de production de cette protéine sous une forme substantiellement purifiée.
Les schistosomes sont des vers qui sont les agents d'une maladie parasitaire des régions tropicales et sub-tropicales, appelée schistosomiase (ou bilharziose). Cette maladie affecte environ 200 à 400 millions d'êtres humains. Il existe un médicament efficace contre le parasite adulte, le praziquantel, mais son coût est trop élevé pour qu'on puisse envisager son usage généralisé dans les pays en voie de développement. Le seul espoir sérieux de prévention de la maladie réside, à ce jour, dans la mise au point d'un vaccin efficace contre le parasite.
Il est déjà connu que S. mansoni possède au moins deux glutathion-S-transférases; l'une d'un poids moléculaire de 26 Kd, l'autre, prédominante, d'un poids moléculaire de 28 Kd, appelée p28 ou Sm28. L'existence de ces deux protéines a été mise en évidence sur gel SDS-polyacrylamide après electrophorese de l'échantillon d'un éluat obtenu par chromatographie d'affinité d'un extrait de S. mansoni sur une colonne de glutathion- agarose (Tiu et al, Parasite Immunol., (1988) JO: 693). Toutefois, cet article n'indique pas comment obtenir à partir de l'éluat, des préparations contenant chacune des deux glutathion-S-transférases sous forme séparée. De plus, il est aussi connu que Sm28, telle que obtenue par les techniques de l'ADN recombinant, pourrait être un candidat de choix à titre d'agent vaccinal contre la schistosomiase.
Enfin, des travaux parallèles sur S. japonicum ont mis de même en évidence des antigènes similaires, i.e. Sp26 et Sp28, chez ce dernier organisme (Smith et al, Mol. Biochem. Parasitol. (1988) 27- 249)
Le fragment d'ADN codant pour Sm26 ayant maintenant été trouvé, il est donc possible de produire cette protéine par les techniques de l'ADN recombinant. Ceci permet entre autre d'obtenir la Sm26 en l'absence de Sm28 et en quantité suffisante pour être purifiée.
Par conséquent, la présente invention propose
(i) une protéine dont la séquence en acides aminés présente au moins 90 %, avantageusement au moins 95 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position
1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ; ladite protéine étant sous forme substantiellement pure ; ainsi que
(ii) une protéine dont la séquence en acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217, ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés ; ladite protéine ou ledit fragment étant sous une forme substantiellement pure.
Ceci inclut notamment la Sm26 ainsi que des analogues de celle-ci. Tout comme la Sm26, ces analogues pourraient être caractérisés par une activité glutathion-S-transférase ou par la capacité d'induire chez un mammifère une réponse immunologique qui protège ce mammifère contre une infection par des schistosomes. A titre d'exemple, on cite l'analogue (45-80) commençant avec le résidu lysine en position 45 et finissant avec le résidu histidine en position 80.
Une protéine selon l'invention, en particulier la protéine Sm26 dont la séquence en acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence peut exister sous forme monomère ou multimère. Pour illustrer ce dernier cas on cite, à titre d'exemple, la forme dimérique qui peut être avantageusement maintenue par des ponts disulphures inter¬ chaînes. Une activité glutathion-S-transferase peut être mise en évidence par la méthode décrite par Hahig & Ja oby, Methods in Enzymology, 77: 398. Environ 10 μl d'une solution à tester, de préférence préparée en milieu tampon proche de la neutralité, sont ajoutés à 820 μl d'une solution tampon de phosphate de potassium 50mM ; pH 6,5 qui contient en outre 4,7 mM de glutathion réduit et 360 μM de l-chloro-2,4-dinιtrobenzène. En parallèle, on effectue un contrôle négatif. L'apparition du produit de la réaction est suivie par spectrophotométrie à 340 nm jusqu'à transformation complète du substrat. L'activité glutathion-S-transférase est donnée en μM/min/mg.
Sous un autre aspect, l'invention concerne aussi :
i) un fragment d'ADN isolé qui code pour une protéine selon l'invention. Un exemple particulier d'un fragment d'ADN selon l'invention est montré dans l'identificateur de séquence. Par fragment d'ADN isolé, on entend un fragment d'ADN qui n'est plus associé aux régions qui contrôlent son expression dans l'organisme dont il est issu, c'est-à-dire dans le cas présent S.mansoni.
ii) une cassette d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon l'invention ainsi que des éléments nécessaires à son expression (transcription et traduction) dans une cellule hôte. Ces éléments sont essentiellement un promoteur de transcription approprié ainsi que les codons d'initiation et de fin de traduction. Dans certains cas, il est aussi avantageux d'ajouter un terminateur de transcription.
iii) une cellule qui est transformée par une cassette d'expression selon l'invention.
Cette cassette d'expression peut être soit intégrée dans le génome de la cellule, soit portée par un vecteur d'expression approprié à replication autonome e.g., un plasmide.
iv) un procédé de préparation d'une protéine selon l'invention qui comprend l'acte de cultiver une cellule selon l'invention et de récolter ladite protéine à partir de la culture.
Les technologies permettant le clonage et l'expression d'un gène étranger dans des cellules hôtes procaryotes ou eucaryotes sont connues de l'homme du métier. Elles seront illustrées dans les exemples ci-après, étant entendμ que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés. Enfin l'invention concerne de même :
i) une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de la schistosomiase qui comprend à titre d'agent-thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217.
ii) une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou traiter la schistosomiase • qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217, ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés.
iii) une méthode pour prévenir ou traiter la schistosomiase qui comprend l'acte d'administrer une quantité thérapeutiquement effective d'une protéine selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
iv) l'usage d'une protéine selon l'invention à titre d'agent thérapeutique destiné à prévenir ou traiter la schistosomiase.
Une protéine selon l'invention ou un fragment de celle-ci possède une activité thérapeutique par exemple une activité vaccinale, et par conséquent est utile en tant que produit pharmaceutique. Cette activité peut être mise en évidence dans un test identique ou similaire à celui décrit dans l'Exemple 3.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une protéine selon l'invention ou un fragment de ladite protéine avec un diluant ou un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. On indique de plus que, pour usage dans une composition selon l'invention, la protéine peut être avantageusement sous forme monomérique ou dimérique, cette dernière forme étant particulièrement intéressante. Une composition selon l'invention peut en outre contenir d'autres composés tels que d'autres glutathion-S-transférases de schistosomes e.g. Sp26, Sp28, Sm28, de préférence sous forme dimérique, ou un des analogues de celles-ci. Enfin, une composition selon l'invention peut contenir un adjuvant de vaccination tel que l'alun. De manière alternative, cet adjuvant peut être ajouté à une composition selon l'invention juste avant usage. Une composition selon l'invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins, en particulier par voie sous- cutanée, par exemple sous forme de solution ou de suspension injectable. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. Le dosage approprié varie en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu traité et du mode d'administration.
Sous un dernier aspect de l'invention, une protéine selon l'invention ou un fragment de celle-ci peut être notamment utile à titre d'agent présentant une activité glutathion transférase. De ce fait, elle peut être employée par exemple dans des procédés de bioconversion.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention, en prenant les figures suivantes en référence.
La Figure 1 représente le vecteur pTG959.
La Figure 2 représente un gel de polyacrylamide-SDS révélé par coloration au bleu de Coomassie après electrophorese. Les colonnes a, b et c correspondent respectivement aux fractions non purifiées solubles et insolubles des extraits TGE901/pTG4l70 après induction 5h à 42°C et à la préparation purifiée sur colonne de glutathion-agarose.
La Figure 3 permet de comparer les séquences d'acides aminés des protéines Sm26 et Sj26. Dans celles-ci, des espaces sont schématiquement introduits de manière à obtenir un alignement optimal.
EXEMPLE 1 : clonage d'un ADN complémentaire codant pour Sm26
1A. Préparation d'antisérum anti-Sm26
Une souche du parasite S.mansoni est maintenue dans Biomphalaria glabrata
(escargot aquatique) puis dans des hamsters dorés. La forme adulte du parasite est récoltée à partir du sang prélevé dans la veine porte de hamsters infectés depuis 40 jours. Après lavage en milieu d'Eagle minimum (MEM), les vers sont repris dans un tampon de formule : 10 mM de phosphate de potassium à pH 7,0; 1,15% KC1; 0,5 mM de PMSF (Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride) et 1 mM d'EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetic acid disodium sait). Cette préparation, soumise aux ultrasons, est homogénéisée puis centrifugée pendant 20 min à 10000 tours par minute à 4°C en utilisant un rotor Sorvall HB-4. Le surnageant est récupéré puis appliqué sur une colonne de gluthation-agarose (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo) équilibrée avec le tampon décrit ci-dessus. Après lavage intensif avec ce même tampon, la fraction fixée est éluée avec un tampon d'élution (50 mM de Tris-HCl, pH 9,1, 7 mM de gluthation réduit et 0,1 mM de dithiotréitol). La fraction éluée est ensuite neutralisée à l'aide du tampon phosphate de potassium 0,5 M, pH 7 puis dialysée contre du phosphate de potassium lOmM, pH 7 et enfin concentrée avec de I'aquacide II (Calbiochem -Behring Corp, CA).
Les gluthation S-transférases totales de S. mansoni ainsi purifiées sont fractionnées sur gel préparatif de polyacrylamide (13%) suivant la technique décrite par Laemmli et al, Nature, (1970) 227: 680. Après coloration au bleu de Coomassie, la bande migrant à 26 kDa est récupérée. La Sm26 est electro-éluée suivant le protocole décrit par Balloul et al., Mol. Biochem. ParasitoL, (1985) Yh 105. Elle est dialysée contre de l'eau puis concentrée à l'aide d'aquacide II.
Des lapins reçoivent par injection intradermale multi-site (40 points) 100 μg de Sm26 sous un volume total de 1 ml purifiée en présence d'adjuvant complet de Freund. Deux semaines plus tard 20 μg de Sm26 sont injectés en présence d'adjuvant incomplet de Freund en administration sous-claviculaire.
1B. Préparation de la banque d'ADN complémentaire
L'ARN total des schistosomes adultes est extrait par la méthode décrite par Chirgwin et al., Biochemistry (1979) Jjî: 5294 et modifiée par Gausz et al., Mol. Biochem. ParasitoL, (1983) 7: 293. L'ARN poly A+ est obtenu par chromatographie d'affinité sur colonne de cellulose oligo (dT)12-18 (Collaborative Research, Lexington, MA). Une banque d'ADN complémentaire exprimée dans le vecteur lambda gt 11 est construite en utilisant la trousse Amersham de la façon suivante. A partir des ARN poly A+ purifiés, on synthétise des ADN complémentaires (cADN) suivant la méthode de Gϋbler et Hoffman, Gène (1983) 25: 263. Après protection des sites EcoRI internes des cADN, des adaptateurs EcoRI sont accrochés aux fragments de cADN. Ceux-ci sont alors digérés par EcoRI et les adaptateurs en excès sont éliminés par chromatographie sur colonne. Ces fragments de cADN sont insérés dans le site EcoRI du phage lambda gt 11 (Young et Davis, 1983). Les inserts EcoRI sont ainsi fusionnés avec la séquence codant pour la β- galactosidase et sont donc placés sous le contrôle du promoteur lactose. Les phages recombinants sont empaquetés in vitro.
1C. Sélection d'un ADNc codant pour Sm26
1,5 . 106 phages indépendants de la banque d'ADN complémentaire sont testés par la méthode décrite par Huynh et al., DNA cloning, a Practical Approach, (1985) Glover D.M., éd., _1: 49, modifiée de la façon suivante : un échantillon de cette banque en lambda gtll est inoculé sur la souche E. coli Y1090 à une dilution représentant 5000 phages par boîte de 85 mm de diamètre et incubée à 42°C. Les plages sont transférées pendant 5 h à 37°C sur des filtres de nitrocellulose (Schleicher et Schuell) préalablement imprégnés d'isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 10 mM; l'IPTG permet d'induire l'expression de la protéine de fusion qui est sous contrôle du promoteur lac. Les filtres sont incubés en présence de l' antisérum de lapin anti-p26 (préalablement adsorbé sur un extrait d'antigènes de E.colQ. Les anticorps fixés sont reconnus par un second anticorps anti-IgG de lapin marqué à la biotine; une streptavidine-peroxidase se fixe alors à la biotine, et ce complexe est révélé par une réaction de la peroxydase sur un réactif coloré nommé "HRP color development reagent", commercialisé par Bio Rad.
Cette détection par anticorps permet d'identifier les phages recombinants dont l' insert de cADN dirige la synthèse d'une protéine ou une fraction de protéine portant des épitopes reconnus par les anticorps spécifiques anti-Sm26.
Quatre clones phagiques capable d'exprimer une protéine réagissant avec l'antisérum anti-Sm26 sont récoltés séparément. Leur ADNs sont purifiés et digérés par EcoRI. Puis les fragments issus de la digestion sont séparés par electrophorese sur gel d'agarose. Un des inserts d'ADNc, de taille suffisante pour coder pour une Sm26 complète, est électro élue par la méthode de Geneclean (Bio 101 Inc. La Jolla, CA) puis sous-cloné dans le site EcoRI de la région d'insertion multiple du vecteur M13TG130 (Kieny et al, Gène (1983) 26 : 91). La séquence nucléotidique de cet ADNc est établie par la méthode de Sanger et al, PNAS (1977) 74 : 5463. L'étude de la séquence permet d'établir que cet ADNc particulier code bien pour une protéine de 26 Kd. Cet ADNc n'ayant pas la base A du codon d'initiation ATG, celle-ci doit donc être rajoutée. De plus, on désire remplacer le site EcoRI par un site BglII. Ces deux opérations sont réalisées conjointement par mutagénèse dirigée en utilisant l'oligonucléotide OTG2467 de séquence :
5 ' -GCTCTCCCGGAGATCTATGGC ACCTAAGTT-3 ' .
On obtient ainsi le vecteur M13TG4116. La séquence du cADN est présentée dans l'identificateur de séquence.
EXEMPLE 2 : Production et purification de Sm26
Le vecteur M13TG4116 est digéré par EcoRI et BglII, et les fragments d'ADN sont séparés par electrophorese sur gel d'agarose. Le fragment de 0,75 Kb comportant le cADN de la Sm26 est élue par la méthode de Geneclean. En parallèle, le vecteur pTG959 décrit dans EPA 292 404 et représenté schématiquement à la Figure 1 est digéré par EcoRI et BglII. Ces coupures entraînent la perte d'un fragment contenant la partie 5' du gène lacZ.
Le fragment de 0,75 Kb est ligué dans le vecteur pTG959 tel que précédemment préparé pour donner le vecteur pTG4170. Dans cette dernière construction, le fragment d'ADN codant pour la Sm26 est donc placé en aval et sous le contrôle du promoteur pL du phage lambda qui est inductible à 42°C.
E.coli TGE901 (F-sup-his ilv bio (lambda-ci 857 delta-Bam delta-Hl)) transformée par le plasmide pTG4170 est cultivée dans 11 de milieu LB - ampicilline. La culture est poursuivie, dans un premier temps à 30°C jusqu'à une DO^ de 0,2 et dans un deuxième temps à 42°C pendant 5 heures.
En fin de culture, les cellules sont récoltées par centrifugation puis lysées à la fois par sonication et par traitement enzymatique dans un tampon d'équilibration de formule : lOmM phosphate de potassium, pH7 ; 1,15 % p/v KCI ; 0,5 mM Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride ; 1 mM EDTA, contenant en outre 100 μg/ml de lysosyme et 0,1 % de triton
X100 (Sigma).
Le lysat est ensuite centrifugé à 10 000 tr/min à 4°C pendant 20 min. Le surnageant est récupéré puis déposé en flux continu (30 ml/h) sur une colonne de glutathion-agarose (Sigma Chemicals Co., St Louis, Mo) préalablement équilibrée avec le tampon d'équilibration décrit ci-dessus. Après lavage intensif avec ce même tampon, la fraction fixée est éluée avec 10 ml de tampon d'élution de formule : 50 mM Tris-HCl, pH9,l ; 7 mM glutathion sous forme réduite ; 0,1 mM dithiothreitol. La totalité de l' éluat est récupérée, neutralisée à l'aide de phosphate de potassium 0,5 M pH 7, puis dialysée toute la nuit à 4°C contre un tampon de dialyse de formule : 10 mM phosphate de potassium pH 7 ; 1 mM EDTA. Le dialysat est finalement concentré sous un volume d'environ 2 ml avec de l'aquacide -Q (Calbiochem - Behring Corp. CA).
La pureté de la préparation ainsi obtenue est vérifiée après electrophorese d'un échantillon en gel de polyacrylamide. Tel que montré à la Figure 2, l'apparition d'une seule bande d'environ 26 Kd indique que la Sm26 est obtenue sous forme substantiellement pure.
D'autre part, l'activité glutathion-S-transférase de la préparation ainsi purifiée est contrôlée comme suit : 10 μl de la préparation sont ajoutés à 820 μl d'une solution tampon de phosphate de potassium 50 mM ; pH 6,5; qui contient en outre 4,7 mM de glutathion réduit et 360 μM de l-chloro-2,4-dinitrobenzène. En parallèle, on effectue un - contrôle négatif. L'apparition du produit de la réaction (coloration jaune) est suivie à 340 nm jusqu'à transformation complète du substrat. L'activité mesurée est de l'ordre de 30 à 50 μM/min/mg.
Le mode de préparation de la Sm26 précédemment décrit permet d'obtenir environ 1 à 2 mg de protéine purifiée à partir d'un litre de culture.
EXEMPLE 3 : Mise en évidence de Peffet immuno-protecteur de Sm26
3 A. Expérience n° 1
Des rats Fisher mâles de 8 semaines (Iffa-Credo) sont répartis en 5 groupes de 4 à
7 rats chacun. Les rats reçoivent par voie sous-cutanée 25 μg de Sm26 tel que obtenue à l'exemple 2 (groupe 1), 25 μg de Sm28 purifiée à partir de vers adultes (groupe 2) ou 25 μg de serumalbumine bovine (groupe 3). Chaque antigène est injecté sous un volume de 1 ml en présence de 1,25 mg d'adjuvant hydroxyde d'aluminium (alun gel Serva). En parallèle, les rats du groupe 4 reçoivent seulement 1,25 mg d'adjuvant hydroxyde d'aluminium sous le même volume. Enfin, les rats du groupe 5 ne reçoivent rien. Pour chacun des groupes 1 à 4, le traitement correspondant est renouvelé 15 jours après la première injection.
30 jours après la deuxième injection, les rats de chacun des groupes sont anesthésiés, puis infestés par passage transcutané de 1 000 cercaires. 21 jours après l'infestation, les foies sont ligaturés et perfusés avec du liquide physiologique contenant 1 % d'héparine et 0,1 % de Tween. Ceci permet de récupérer les vers qui sont ensuite comptés sous la loupe binoculaire. Les résultats sont présentés dans le tableau ci-dessous.
Figure imgf000012_0001
Le groupe n° 2 (contrôle témoin positif) et le groupe n° 1 présentent respectivement une réduction de charge parasitaire de 45 % et de 16 % par rapport au groupe n° 4
(contrôle témoin adjuvant). Le résultat du groupe n° 1, bien que inférieur à celui du groupe n° 2, est tout à fait significatif en raison de la faiblesse de l'écart-type (p = 0,03).
3B. Expérience n° 2
Une nouvelle expérience dont les conditions d'expérimentation sont en tous points similaires à celles décrites sous 3A est conduite de manière indépendante. Le groupe des rats immunisés avec la Sm26 présentent une réduction de la charge parasitaire de 25 %.
IDENTIFICATEUR DE SEQUENCE
Objet : La séquence d'acides aminés de la glutathion-S-transférase de 26 Kd de S.mansoni, appelée Sm26 ainsi que la séquence nucléotidique du fragment d'ADN complémentaire codant pour la protéine citée ci-dessus.
GCA CCT AAG TTC GGT TAT TGG AAA GTC AAA GGC CTT GTA CAA CCA 45 Ala Pro Lys Phe Gly Tyr Trp Lys Val Lys Gly Leu Val Gin Pro 1 5 10 15
ACT CGA CTT CTT TTG GAA CAC CTT GAA GAA ACT TAT GAG GAA CGT 90 Thr Arg Leu Leu Leu Glu His Leu Glu Glu Thr Tyr Glu Glu Arg
20 25 30
GCG TAT GAT CGC AAT GAA ATC GAT GCC TGG AGC AAC GAT AAA TTT 135 Ala Tyr Asp Arg Asn Glu Ile Asp Ala Trp Ser Asn Asp Lys Phe
35 40 45
AAA TTA GGC CTG GAG TTC CCA AAT CTT CCT TAT TAT ATT GAT GGT 180 Lys Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly
50 55 60
GAT TTT AAA TTA ACA CAA TCT ATG GCT ATC ATA CGT TAT ATA GCT 225 Asp Phe Lys Leu Thr Gin Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala
65 70 75
GAC AAA CAC AAC ATG TTG GGG GCT TGT CCA AAA GAA CGT GCG GAA 270 Asp Lys His Asn Met Leu Gly Ala Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu
80 85 90
ATT TCG ATG CTT GAA GGA GCG GTT TTG GAT ATT AGG ATG GGT GTT 315 Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Met Gly Val
95 100 105
TTA AGA ATC GCA TAC AAT AAG GAA TAT GAA ACC CTC AAA GTT GAT 360 Leu Arg Ile Ala Tyr Asn Lys Glu Tyr Glu Thr Leu Lys Val Asp
110 115 120 TTT CTC AAC AAA CTT CCT GGG AGG CTG AAA ATG TTC GAA GAT CGT 405 Phe Leu Asn Lys Leu Pro Gly Arg Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg 125 130 135
TTG TCT AAC AAA ACT TAT TTG AAC GGT AAT TGT GTA ACT CA .CCT 450 Leu Ser Asn Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asn Cys Val Thr His Pro 140 145 150
GAC TTT ATG TTA TAC GAT GCC CTT GAT GTG GTT TTA TAC ATG GAG 495 Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp 155 160 165
TCA CAG TGC TTG AAC GAG TTT CCA AAA TTA GTT TCT TTC AAA AAG 540 Ser.Gin Cys Leu Asn Glu Phe Pro Lys Leu Val Ser Phe Lys Lys 170 175 180 f TGT ATT GAA GAT TTA CCA CAA ATC AAG AAC TAC TTA AAT TCT AGC 585
Cys Ile Glu Asp Leu Pro Gin Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Ser Ser
185 190 195
AGG TAC ATA AAA TGG CCT CTG CAA GGT TGG GAT GCC ACG TTT GGT 630 Arg Tyr Ile Lys Trp Pro Leu Gin Gly Trp Asp Ala Thr Phe Gly 200 205 210
GGT GGA GAT ACT CCT CCA AAA 651
Gly Gly Asp Thr Pro Pro Lys 215

Claims

- 13 - REVENDICATIONS
1. Une protéine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ; la dite protéine étant sous forme substantiellement pure.
2. Une protéine dont la séquence en acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés ; la dite protéine étant sous forme substantiellement pure.
3. Un fragment d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou pour une protéine ou un fragment de celle-ci selon la revendication 2.
4. Une cassette d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon la revendication 3 et les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte.
5. Une cellule transformée par une cassette d'expression selon la revendication 4.
6. Une cellule selon la revendication 5, qui est de l'espèce E.coli.
7. Un procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 1 ou 2 qui comprend l'acte de cultiver une cellule selon la revendication 5 ou 6 et de récolter ladite protéine à partir de la culture.
8. Application d'une protéine selon la revendication 1 ou 2 à titre d'agent présentant une activité glutathion-transférase.
9. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217. - 14 -
10. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés.
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