WO1991006675A1 - New oligonucleotide probe - Google Patents
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Definitions
- the present invention relates to a novel mini-satellite DNA which can be used as a DNA probe for diagnosis of shrines.
- Shosho diagnosis is 1) Early diagnosis of Shosho disease, 2) Application to the so-called DNA Bingerprint method for paternity and criminal investigation, 3) causes of viral and bacterial infections Diagnosis of bacteria with high sensitivity.
- the DNA finger print method can be widely used for individual identification.
- all or part of the target gene can be used as a DNA probe to directly detect mutations in the gene, and mutations in restriction enzyme sites around the gene are used.
- Restriction fragment length polymorphism RFLP
- RFLP Restriction fragment length polymorphism
- minisatellite DNA can be used for personal identification and family identification (for example, ucleic Acid Research. Vol. IB, 10953-10971. 1988; Science, Vol. 235, 1B1BlG22, 1987).
- Mini satellite DNA is a so-called repetitive sequence DNA in which one to ten base sequences are repeated in one unit, and these units are repeated in tandem.
- the repetition rate is as high as 1000 times, and the repetition rate is different for each contraceptive gene, thus obtaining a variety (Review: Ryo Konan, Experimental Medicine, Vol. 7, No. 2,
- the patterns of mutations in the gene that can be detected by the DNA finger print method are transmitted from the parent to the child by means of center transmission.
- PCR DNA polymerase chain reaction
- hair roots, semen, blood From small samples such as skin fragments, it is possible to apply criminal investigations that can identify criminals and victims using patterns that differ for each individual.
- the minisatellite DNA provided by the present invention is a kind of protease inhibitor involved in the regulation of the fibrinolytic system contained in human plasma.
- -Plasmid inhibition This is a base sequence found by the present inventors near the gene of Yuichi.
- Human ⁇ . -Plasmin inhibitors are normally detected in the blood of normal subjects at about 6 mg ZcW and inhibit plasmin, which has a thrombolytic effect, to suppress the progress of thrombolysis, and eventually to cause inflammation and cancer metastasis. It is thought to contribute to the prevention of various abnormal physiological phenomena.
- the present inventors have isolated the gene for the human “ 2- plasmin inhibitor” and analyzed the upstream region that regulates the expression of the gene. As a result, the D- D sequence of 45 nucleotides was identified.
- Oligonucleotides having this sequence are labeled and used as probes.
- Human chromosomal DNA is digested with appropriate restriction enzymes and electrophoresed in agarose gel, and Southern blot hybridisation is performed.
- restriction it is possible to detect a difference in the pattern of the restriction enzyme digested fragments and to determine the number of copies of the repetitive sequence.
- the present inventors have determined human ⁇ .
- the minisatellite array found near the plasmin inhibitor gene consists of 45 nucleotides, and at least seven heterogass sites are found in the sub-branches. This could be used to identify more specific individuals and families by direct sequencing by the polymerase chain reaction method. You.
- Human alpha 2 - JP 64 as a plus Mi N'i down human bitter gene fragments - but 2577 discloses the nucleotide sequence disclosed in this application the first Mechionin residues it is and leader sequence of c D New alpha (mature alpha eta - the Asuparagin residues of a Mi - terminal of plus Mi N'i down arsenide Vita one protein + 1 and the time - 39 th ⁇ Mi (Corresponding to the acid residue).
- the present inventor has alpha 2 - bra scan Mi Ni Nhi and click port-learning the ⁇ Ko chromosome bitter, the Minisate Lai bets DNA sequences disclosed in the present invention the upstream of these first E click Seo down Found out and completed the present invention.
- RI radioisotope
- non-RI methods for labeling with an enzyme or chemiluminescent luminescent material are used. Have been used because of their high operational safety and because they do not require special facilities.
- RI labeling method and the 32 [rho using T 4 port I J click Reochi Dokinaze is 5 '- how to label the end or D New Alpha polymerase I and D Nase l by combining 32 P, - labeling Dokishi DOO
- nickel transduction method for labeling oligonucleotides there is a nickel transduction method for labeling oligonucleotides, and these labeling methods are commercially available using dedicated kits (eg, Bethesda Research Laboratories of Ameri Power Co., Ltd.).
- Non-RI labeling and detection methods include horseradish pero idase (HRP) tDNA.
- HRP horseradish pero idase
- these probe DNAs are chemically synthesized using a commercially available DNA synthesizer (for example, ABI 381A of Applied Biosystems, USA). Can also be synthesized. When the base chain is long, an appropriate gene fragment can be cloned and separated and purified. In order for the labeled DNA probe to form a stable hybridisation and generate a specific signal, more than 12 oligonucleotides are detectable, but more non-specific. 12 to 17 or more, preferably 20 or more oligonucleotides to control the background of the reaction and to detect sharp and accurate patterns Can be used.
- the starting point may be anywhere in the base sequence of GCAGCG 'or its complementary strand, but it is sufficient if it contains at least 12 base sequences. Examples are shown below to explain the present invention more specifically. However, the present embodiment does not limit the present invention. ⁇ Example 1
- FIG. 1 shows a restriction enzyme map of the 2-plasmin inhibitor gene, exon positions, 45 bp repeat sequences, and their nucleotide sequences.
- DNA prepared from human liver was partially digested with restriction enzyme Sau3AI, and fractionated by sucrose density gradient centrifugation. A DNA fragment corresponding to 10 to 20 kb was incorporated into IL-47.1 vector (purchased from Amersham) and described in Maniatis. T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab., (1982). In vitro packaging according to went. As a result of the titration, there were approximately 1 ⁇ 10 6 independent phage mosquitoes.
- the human gene library was screened by the plaque hybridization method. Basically, the method described in Mani at is, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., (1982) was followed. Probe is, Tone et al, J. Biochem, 102, 1033- 1041 (1987), human alpha 2 - Using flops la scan Mi emissions Lee down heat Vita over c DNA. Labeling of probes, - it was carried out by Stevenage click tiger Nsuresho emissions with [alpha 32 [rho] d CTP. Approximately 1 ⁇ 10 6 plaques were transferred to a nitrocellulose filter, hybridized with the probe, washed, and autoradiographed to detect positive clones.
- DNA is prepared from the above positive clones, digested with appropriate restriction enzymes, and subjected to restriction enzyme mapping. Fragments of each restriction enzyme are then converted to PUC118, pUC119, pHSG398, or pHSG. Cloned to a part of polylinker of 399 (all manufactured by Takara Shuzo). Using a delay kit for kilo-sequence (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), a delay mutant of the above-mentioned recombinant plasmid is prepared and cloned to pUC118 or pUC119. See Vieira, J. et al., Methods in Enzymolgy, 152.
- Leukocytes obtained from 3 Oml of blood by dextran specific gravity centrifugation were subjected to lOOm MEDTA, 50mM Tris ⁇
- 45-mer oligonucleotide having the following base sequence CAGGACAGTGAGGGTGGGAAGGAGCCTGATGCAGGGAGTGAGGCG
- Table 1 shows the chain length and number of copies of each sample (a to i).
- FIG. 2 is an autoradiogram obtained by performing Southern blot hybridization using a 45nier nucleic acid probe after chromosomal DNA of 9 people was converted with Bst. Arrows indicate band positions and numbers indicate their length.
- the oligonucleotide probe of the present invention can be used as a DNA probe for gene diagnosis, and as a diagnostic agent for personal identification, family identification, or shoal disease. Used.
Abstract
An oligonucleotide probe for use as a DNA probe for gene diagnosis, wherein a new minisatellite DNA sequence and repeated structures thereof are described. This minisatellite DNA comprises sequences of 45 nucleotides repeated in the same direction, found on the upstream region of the genes of α2-plasmin inhibitor, which is one of protease inhibitors contained in human plasma and participating in the control of a fibrinolytic system. The number of repeated sequences depends on an individual and a kindred and can be transferred in a genetically stable manner. Therefore it is possible to discriminate between individuals or kindreds by conducting the Southern blot analysis with the use of the DNA fragment comprising 45 nucleotides as a probe.
Description
明 細 書 新規なオ リ ゴヌ ク レオチ ドプローブ 技 術 分 野 Description New Oligonucleotide Probe Technology
本発明は逍伝子診断の D N Aプローブと して使用できる 新規な ミニサテライ ト D N Aに閱する。 The present invention relates to a novel mini-satellite DNA which can be used as a DNA probe for diagnosis of shrines.
背 景 技 術 Background technology
近年 D N Aプローブを用いた種々の逍伝子診断法が開発 されてきている。 逍伝子診断の目的には 1)逍伝病の早期診 断、 2)いわゆる D N Aブイ ンガープリ ン ト法とよばれる親 子鑑別や犯罪捜査への応用、 3)ウイルスや細菌感染症の原 因菌の高感度の診断などがあげられる。 In recent years, various diagnostic methods using DNA probes have been developed. The purpose of Shosho diagnosis is 1) Early diagnosis of Shosho disease, 2) Application to the so-called DNA Bingerprint method for paternity and criminal investigation, 3) Causes of viral and bacterial infections Diagnosis of bacteria with high sensitivity.
これらのうち、 D N Aフィ ンガープリ ン ト法はひろく個 人識別に用いることができる。 その方法と しては、 目的の 遣伝子の全部又は一部を D N Aプローブと して、 その遺伝 子上の変異を直接検出する方法、 遣伝子周辺の部位の制限 酵素部位の変異を利用した制限酵素断片多形 （R F L P ： restriction fragment length polymorphism) 解折法力、あ げられ、 また遣伝子の非コ一 ド部分にしばしば見い出され る反復配列 D N Aをプローブと して利用することもできる c このような、 いわゆる ミニサテライ ト D N Aは、 個人識 別や家系識別にも利用できることが報告されている （例え ば、 ucleic Acid Research . Vol .IB, 10953-10971. 1988; Science, Vol .235 , 1 B 1 B-l G 22 , 1987 ) 。 ミ ニサテライ ト
D N Aとは、 10から 100塩基配列が一つの反復単位で、 そ れらがタンデムに繰り返したいわゆる反復配列 D N Aであ る。 反復度は、 多いものでは 1000回にも及び、 この反復度 が個々の対立遣伝子で異なることにより、 バリエーショ ン を獲得している （総説 ： 小南凌， 実験医学， Vol. 7, No.2,
Of these, the DNA finger print method can be widely used for individual identification. As a method, all or part of the target gene can be used as a DNA probe to directly detect mutations in the gene, and mutations in restriction enzyme sites around the gene are used. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) has been used for the analysis of DNA fragments, and the repetitive sequence DNA often found in the non-coding part of the gene can be used as a probe. c It has been reported that such so-called minisatellite DNA can be used for personal identification and family identification (for example, ucleic Acid Research. Vol. IB, 10953-10971. 1988; Science, Vol. 235, 1B1BlG22, 1987). Mini satellite DNA is a so-called repetitive sequence DNA in which one to ten base sequences are repeated in one unit, and these units are repeated in tandem. The repetition rate is as high as 1000 times, and the repetition rate is different for each contraceptive gene, thus obtaining a variety (Review: Ryo Konan, Experimental Medicine, Vol. 7, No. 2,
これらの D N Aフィ ンガ一プリ ン 卜法によって検出可能 な遺伝子上の変異のパターンはメ ンデル遣伝により親か ら子に伝え られていく 。 これを利用 して、 より正確な親 子診断が可能と され、 ま た D N A ポ リ メ ラ ーゼ增幅 (polymerase chain reaction; PCR) と組み合わせた高感 度測定法により、 毛根や精液、 血液、 皮膚片等の微量サン プルからこれら個人ごとに異なるパターンを利用して犯罪 者や被害者の同定ができる犯罪捜査への応用が可能となる。 The patterns of mutations in the gene that can be detected by the DNA finger print method are transmitted from the parent to the child by means of center transmission. By utilizing this, more accurate parent-child diagnosis is possible, and by using a high-sensitivity measurement method combined with DNA polymerase chain reaction (PCR), hair roots, semen, blood, From small samples such as skin fragments, it is possible to apply criminal investigations that can identify criminals and victims using patterns that differ for each individual.
発 明 の 開示 Disclosure of the invention
本発明により提供される ミニサテライ ト D N Aはヒ 卜血 漿中に含まれる、 線溶系の制禦に関与するプロテアーゼ イ ンヒ ビターの一種である、 な。 - プラ ス ミ ン イ ン ヒ ビ 夕一の遣伝子の近傍に本発明者により見い出された塩基配 列である。 The minisatellite DNA provided by the present invention is a kind of protease inhibitor involved in the regulation of the fibrinolytic system contained in human plasma. -Plasmid inhibition This is a base sequence found by the present inventors near the gene of Yuichi.
ヒ ト α。 - プラス ミ ンイ ンヒビ夕一は、 正常人の血液中 に通常 6 mgZcW程度検出され、 血栓溶解作用を持つブラス ミ ンを阻害して、 血栓溶解の ¾進を抑え、 ひいては炎症や 癌の転移などの様々な ¾常な生理現象の防止に寄与してい ると考えられている。
本発明者等は、 ヒ ト " 2 - プラス ミ ンイ ン ヒ ビターの遣 伝子を単離 し、 その発現を調節する上流領域を解析した と こ ろ、 45ヌ ク レオチ ドの D Ν Α配列がタ ンデムに繰り 返 している領域を兒ぃ出 した。 さ らに、 その領域を含む X ba I / B am H I 断片を C A Tア ツセィ用のプラス ミ ドべ ク ターにク ローニングし、 ヘルぺス 純ウィルスのチ ミ ジンキナーゼのプロモータ一活性に与える影響を調べたと ころ、 その活性を抑制するサイ レ ンサ一様の機能を見い出 した。 その配列は、 Human α. -Plasmin inhibitors are normally detected in the blood of normal subjects at about 6 mg ZcW and inhibit plasmin, which has a thrombolytic effect, to suppress the progress of thrombolysis, and eventually to cause inflammation and cancer metastasis. It is thought to contribute to the prevention of various abnormal physiological phenomena. The present inventors have isolated the gene for the human “ 2- plasmin inhibitor” and analyzed the upstream region that regulates the expression of the gene. As a result, the D- D sequence of 45 nucleotides was identified. Identified a region repetitive in tandem, cloned the Xba I / B am HI fragment containing the region into a plasmid vector for CAT assembly, Investigating the effect of pure virus on the activity of the promoter of thymidine kinase, we found a uniform function of the silencer to suppress that activity.
CNGGACAGTGAGGGTGGGAXGYXGCYTGATGCAGGGAGTGAGGZX CNGGACAGTGAGGGTGGGAXGYXGCYTGATGCAGGGAGTGAGGZX
(式中、 Nは、 A , Gまたは C、 Xは、 Aまたは G、 Yは、 Cまたは G、 Zは、 Aまたは Cである） (Where N is A, G or C, X is A or G, Y is C or G, and Z is A or C)
である。 It is.
この配列を持つオ リ ゴヌ ク レオチ ドを標識してプローブ と し、 ヒ ト染色体 D N Aを適当な制限酵素で消化してァガ ロースゲル中で電気泳動したものとサザンブロ ッ トハイブ リ ダィゼ一シ ヨ ンを行う こ とによ り、 制限酵素切断断片の パター ンの違いを検出 したり、 この反復配列のコ ピー数を 測定する こ とができる。 Oligonucleotides having this sequence are labeled and used as probes.Human chromosomal DNA is digested with appropriate restriction enzymes and electrophoresed in agarose gel, and Southern blot hybridisation is performed. By performing the restriction, it is possible to detect a difference in the pattern of the restriction enzyme digested fragments and to determine the number of copies of the repetitive sequence.
本発明者等がヒ 卜 α。 プラス ミ ンイ ンヒ ビター遣伝子の 近隣に見い出 した ミ ニサテライ 卜配列は、 45ヌ ク レオチ ド からなり、 その屮には少な く と も 7か所のへテロガスな部 位がみ られる。 こ れは、 ポ リ メ レ一スチヱ イ ン リ ア ク シ ヨ ン法によって、 直接的に配列を決定する ことにより、 より特異性の Sい個人、 家系識別に利用できる可能性もあ
る。 ヒ ト α 2 - プラ ス ミ ンイ ン ヒ ビターの遺伝子断片とし て特開昭 64 - 2577 (昭和 64年 ] 月 6 日公開） が開示され ているが、 この出願において開示されている塩基配列は c D Ν Αのそれであり リーダ配列の最初のメチォニン残基 (成熟 α η - プラ ス ミ ンイ ン ヒ ビタ一蛋白のア ミ ノ末端の ァスパラギン残基を + 1 としたとき— 39番目のァ ミ ノ酸残 基に相当する） から下流に関する。 本発明者は α 2 - ブラ ス ミ ンィ ンヒ ビターの染色体の逍伝子をク口一ニングし、 第 1ェク ソ ンのさ らに上流に本発明で開示されたミニサテ ライ ト D N A配列を見い出し、 本発明を完成させたもので あ Ο ο The present inventors have determined human α. The minisatellite array found near the plasmin inhibitor gene consists of 45 nucleotides, and at least seven heterogass sites are found in the sub-branches. This could be used to identify more specific individuals and families by direct sequencing by the polymerase chain reaction method. You. Human alpha 2 - JP 64 as a plus Mi N'i down human bitter gene fragments - but 2577 (Showa 64 years] Month 6 days published) discloses the nucleotide sequence disclosed in this application the first Mechionin residues it is and leader sequence of c D New alpha (mature alpha eta - the Asuparagin residues of a Mi - terminal of plus Mi N'i down arsenide Vita one protein + 1 and the time - 39 th § Mi (Corresponding to the acid residue). The present inventor has alpha 2 - bra scan Mi Ni Nhi and click port-learning the逍伝Ko chromosome bitter, the Minisate Lai bets DNA sequences disclosed in the present invention the upstream of these first E click Seo down Found out and completed the present invention.
これらの D N Aプローブの標識は、 一般にはラジオアイ ソ ト一プ （R I ) が感度の良さから最も用いられている力く、 最近では酵素や化学ルミ ネ ッセ ンス発光体で標識する非 R I 法も操作上の安全の高さ、 特別な施設を必要と しな いこ となどから用いられるようになった。 R I 標識法と しては Τ 4 ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼを用いて32 Ρを 5 ' -端に標識する方法、 あるいは D Ν Αポリ メラーゼ I と D Nase l を組み合わせて32 P -標識デォキシ ト リ ヌク レオチ ドを標識するニ ッ ク ト ラ ンス レー シ ョ ン法があり、 これらの標識方法は市販の専用キッ ト （例えばァメ リ力の Bethesda Research Laboratories, 曰本で（まコスモノくィォ 株式会社より市販されている） を用いて実施できる。 また、 非 R I標識および検出方法にはホースラディ ッ シュペルォ キシダ一セ ( H R P ： horse radish pero idase) t D N A
を標識し H R Pにより触媒されるルミ ノール酸化反応に伴 なうケ ミ カルルミ ネ ッセンスを検出する方法、 ピオチン化 d U T Pで標識した D N Aをア ビジ ン ― アルカ リ フ ォス ファターゼコ ンプレッ クスによる化学呈色反応で検出する 方法があげられ、 これら標識方法は市販のキッ ト （例えば アマシャム社より市販されている） を用いて実施すること ができる。 In general, radioisotope (RI) is most commonly used because of its high sensitivity. Recently, non-RI methods for labeling with an enzyme or chemiluminescent luminescent material are used. Have been used because of their high operational safety and because they do not require special facilities. RI labeling method and the 32 [rho using T 4 port I J click Reochi Dokinaze is 5 '- how to label the end or D New Alpha polymerase I and D Nase l by combining 32 P, - labeling Dokishi DOO There is a nickel transduction method for labeling oligonucleotides, and these labeling methods are commercially available using dedicated kits (eg, Bethesda Research Laboratories of Ameri Power Co., Ltd.). Non-RI labeling and detection methods include horseradish pero idase (HRP) tDNA. For detecting the chemical luminescence associated with the luminol oxidation reaction catalyzed by HRP, and the chemical presentation of DNA labeled with piotinylated d UTP by avidin-alkaline phosphatase complex Methods for detection by color reaction can be mentioned, and these labeling methods can be carried out using a commercially available kit (for example, commercially available from Amersham).
またこれらのプローブ D N Aは、 数 10個の塩基長を有す る比較的短いオリ ゴヌ ク レオチ ドの場合は市販の D N A合 成機 （例えば米国アプライ ドバイオシステム社の A B I 381 A ) により化学合成もできる。 また塩基鎖が長い場合 には適当な遣伝子の断片をクローン化して分離精製するこ ともできる。 標識 D N Aプローブが、 安定したハイブリダ ィズを形成し、 特異的なシグナルを発生させるためには、 12個以上のォリ ゴヌ ク レオチ ドであれば、 検出可能だが、 よ り 非特異的な反応のバ ッ ク グラ ウ ン ドをおさえて、 シャープで正確なパターンを検出させるためには 12〜； 17個 以上、 好ま しく は 20個以上の長さを有するォリ ゴヌ ク レオ チ ドが使用できる。 In the case of relatively short oligonucleotides having a length of several tens of bases, these probe DNAs are chemically synthesized using a commercially available DNA synthesizer (for example, ABI 381A of Applied Biosystems, USA). Can also be synthesized. When the base chain is long, an appropriate gene fragment can be cloned and separated and purified. In order for the labeled DNA probe to form a stable hybridisation and generate a specific signal, more than 12 oligonucleotides are detectable, but more non-specific. 12 to 17 or more, preferably 20 or more oligonucleotides to control the background of the reaction and to detect sharp and accurate patterns Can be used.
したがって、 本発明のプローブは、 Therefore, the probe of the present invention
GGGAAGGA.GC GGGAAGGA.GC
GC GQ GC GC GQ GC
C C
•GCAGCG' の塩基配列またはその相補鎖のうち、 どこを開始点として もよいが少なく とも 12個の塩基配列を含んでいればよい。 本発明をより具体的に説明するために以下に実施例を示 す。 しかし、 本実施例は、 本発明を限定するものではない < 実施例 1 • The starting point may be anywhere in the base sequence of GCAGCG 'or its complementary strand, but it is sufficient if it contains at least 12 base sequences. Examples are shown below to explain the present invention more specifically. However, the present embodiment does not limit the present invention. <Example 1
ヒ ト a Q - プラス ミ ンイ ンヒ ビタ一遗伝子のク ローニン グおよび同遣伝子上流域による繰り返し D N A配列の決 ヒ ト肝臓 D N Aから調製した D N Aからフ ァージ Human a Q - plus Mi N'i Nhi Vita one遗伝Ko clauses Ronin grayed and Doya gene upstream region due to repetitive DNA sequences determined human DNA was prepared from the liver DNA carafe Aji
47.1を用いて、 ヒ ト逍伝子ライ ブラ リ 一を作成し、 ヒ ト α 0 - プラス ミ ンィ ンヒ ビ夕一 c D N Aをプローブと し、 スク リ ーニングを行った。 得られたポジティ ブク ローンの 制限酵素マツ ビング、 塩基配列の決定を行い、 ヒ ト α 2 " プラ ス ミ ンイ ン ヒ ビター c D N A (Toneら， J .Biochera'
102, 1033-1041 ( 1987)) の配列と比較し、 ヒ ト ひ 2 - プラ ス ミ ンイ ンヒビター遺伝子のェク ソ ンの位匿を決定した。 ェクソンの D N A配列は c D N Aのそれと 1か所を除いて 完全に一致した。 その 1か所とは、 コーディ ング領域の 1 番目の A T Gの Aから数えて 22番目のヌ ク レオチ ドで、 c D N Aでは Tであるのが、 染色体遺伝子では Cであった。 こ の領域は、 リ ーダーペプチ ドに相当する部分である。 また、 同逍伝子の上流域に 45bpを 1反復単位と してタ ン デムに繰り返している領域を見い出した。 その位置は、 コーディ ング領域の 1 番目の A T Gの Aを + 1 とする と、 一 3861から一 2887にかけての領域であった。 図 1 に、 2 - プラス ミ ンイ ンヒ ビター遺伝子の制限酵素地図、 ェ クソンの位置、 45bp反復配列の位置及びその塩基配列を示 した。 47.1 was used to create a human逍伝child line bra Li and foremost, human α 0 - plus Mi Ni Nhi bi evening one c DNA as a probe was carried out the risk cleanings. The resulting Pojiti Buk loan restriction enzyme pine Bing performs determination of the base sequence, human alpha 2 "plus Mi N'i down human bitter c DNA (Tone et al., J .Biochera ' 102, 1033-1041 (1987)) to determine the exon location of the human 2- plasmin inhibitor gene. The exon DNA sequence was completely identical to that of the cDNA except for one. One of them was the 22nd nucleotide from the A of the first ATG in the coding region, where T was for cDNA but C for chromosomal genes. This area is a part corresponding to a leader peptide. In addition, we found a region in which tandem repeats 45 bp as one repetition unit in the upstream region of the shrine. The position was from 3861 to 2887, where A of the first ATG in the coding region was +1. FIG. 1 shows a restriction enzyme map of the 2-plasmin inhibitor gene, exon positions, 45 bp repeat sequences, and their nucleotide sequences.
D N Aの調製 Preparation of DNA
ヒ 卜肝臓力、ら、 Maniatis. Τ·ら， Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab. (1982) に記載された方法に従つ て調製した。 Human liver strength, et al., Maniatis. Τ · et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab. (1982).
ヒ ト遺伝子ライ ブラ リ 一の作成 Creation of human gene library
ヒ ト肝臓から調製した D N Aを制限酵素 S au3 A I で部 分消化し、 ショ糖密度勾配遠心法により分画した。 10kbか ら 20kbに相当する D N A断片を ； I L 47.1ベク ター （ァ マ シ ャ ム よ り 購入） に組み込み、 Maniatis . T.ら， Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab. , (1982) に記載されている方法に従って、 in vitro packagingを
行った。 タイ ト レ一シ ヨ ンの結果、 約 1 X 106 個の独立な ファージカ《存在した。 DNA prepared from human liver was partially digested with restriction enzyme Sau3AI, and fractionated by sucrose density gradient centrifugation. A DNA fragment corresponding to 10 to 20 kb was incorporated into IL-47.1 vector (purchased from Amersham) and described in Maniatis. T. et al., Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Lab., (1982). In vitro packaging according to went. As a result of the titration, there were approximately 1 × 10 6 independent phage mosquitoes.
スク リ ーニング Screening
プラークハイブリ ダィゼ一シ ョ ン法によって前記のヒ ト 遣伝子ライブラ リ ーのスク リ 一ニングを行つた。 基本的に は、 Mani at i s , T.ら， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. , (1982) に記載されている方法に従った。 プ ローブは、 Toneら， J. Biochem, 102, 1033— 1041 (1987)に 記載されている、 ヒ ト α 2 - プ ラ ス ミ ン イ ン ヒ ビタ ー c D N Aを使用 した。 プローブの標識は、 〔 α - 32Ρ〕 d C T Pを用いたニッ ク トラ ンスレーショ ンにより行った。 約 1 X 106 個のプラークをニ トロセルロースフィ ルターに 転写した後、 プローブとハイブリ ダィゼ一ショ ンを行い、 洗浄後、 オー トラジオグラフィ ーを行う ことによって、 ポ ジティ ブク ローンを検出した。 The human gene library was screened by the plaque hybridization method. Basically, the method described in Mani at is, T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab., (1982) was followed. Probe is, Tone et al, J. Biochem, 102, 1033- 1041 (1987), human alpha 2 - Using flops la scan Mi emissions Lee down heat Vita over c DNA. Labeling of probes, - it was carried out by Stevenage click tiger Nsuresho emissions with [alpha 32 [rho] d CTP. Approximately 1 × 10 6 plaques were transferred to a nitrocellulose filter, hybridized with the probe, washed, and autoradiographed to detect positive clones.
D N A塩基配列の決定 Determination of DNA base sequence
上記のポジティ ブク ローンより D N Aを調製し、 適当な 制限酵素で消化 し、 制限酵素マ ッ ピングを行った後、 各々 の制限酵素による断片を P U C 118 ， p U C 119 , p H S G 398,または p H S G 399 (全て宝酒造社製） のポリ リ ンカ一部位にク ローニングした。 キロシークェンス用デ レーシ ヨ ンキッ 卜 （宝酒造社製） を用いて、 前記リ コ ン ビ ナン トプラス ミ ドのデレ一シ ヨ ン ミ ュータ ン トを作成し、 p U C 118または p U C 119にク ローニングした ものに関 しては、 Vieira, J.ら， Methods in Enzymol ogy , 152.
3-H (1987)に記載されている方法に従って 1本鎖 D N Aを 調製し、 p H S G 398 または p H S G 399 にク ローニング したものに関しては、 Μ13πιρ18または Μ13πρ19 (宝酒造社 製） に再ク ロ ーニ ング した後 1 本鍍 D N Aを調製し、 Sanger. P. , Science. 214. 1205-1210 (1981) に記鉞され た方法に従って、 D N Aの塩基配列を決定した。 DNA is prepared from the above positive clones, digested with appropriate restriction enzymes, and subjected to restriction enzyme mapping. Fragments of each restriction enzyme are then converted to PUC118, pUC119, pHSG398, or pHSG. Cloned to a part of polylinker of 399 (all manufactured by Takara Shuzo). Using a delay kit for kilo-sequence (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.), a delay mutant of the above-mentioned recombinant plasmid is prepared and cloned to pUC118 or pUC119. See Vieira, J. et al., Methods in Enzymolgy, 152. For single-stranded DNA prepared according to the method described in 3-H (1987) and cloned into pHSG398 or pHSG399, re-cloned to Μ13πιρ18 or Μ13πρ19 (Takara Shuzo). After plating, single-plated DNA was prepared, and the nucleotide sequence of the DNA was determined according to the method described in Sanger. P., Science. 214. 1205-1210 (1981).
実施例 2 Example 2
ミニサテライ 卜 D N A配列をプローブと したヒ ト逍伝子 の解析 Analysis of human mites using the minisatellite DNA sequence as a probe
ヒ 卜 《。 - プラス ミ ンイ ンヒ ビター遺伝子塩 S配列の解 析によ り、 45bpミニサテライ 卜 D N Aの 99bp上流と 15bp下 流に B stXI認識部位が存在することがわかつた。 血漿中の a 2 - プラス ミ ンイ ン ヒ ビタ一濃度に関する健常者で血縁 関係の知られていない者 9人の染色体 D N Aを B stXlで消 化した後、 45mer の核酸プローブを用い、 サザンブロ ッ 卜 ハイブリダイゼ一シ ョ ンを行い、 コ ピー数および制限酵素 切断断片の電気泳動バターンを解析した。 Hit <<. -Analysis of the plasmin inhibitor gene salt S sequence revealed that a BstXI recognition site was present 99 bp upstream and 15 bp downstream of the 45 bp minisatellite DNA. A in plasma 2 - After the chromosomal DNA of the 9 people who have not known the blood relationship turned into consumption in the B stXl plus Mi N'i down human Vita healthy subjects for one concentration, using a nucleic acid probe of the 45mer, Southern blot Bok Hybridization was performed to analyze copy number and electrophoresis pattern of restriction fragments.
D N Aの調製 Preparation of DNA
デキス 卜 ラ ン比重差遠心により、 3 Omlの血液から得ら れた白血球を、 lOOm M E D T A , 50m M T ris ♦ Leukocytes obtained from 3 Oml of blood by dextran specific gravity centrifugation were subjected to lOOm MEDTA, 50mM Tris ♦
H C J? pH8.0, 500〃gZmlプロテイ ンキナーゼ K， 0.5% S D S溶液中に懸濁し、 55°Cで一晚ィ ンキュベーショ ンし た。 フエノール及びク ロ口ホルムで抽出した後、 D N Aを エタノールで沈澱させ、 T E緩銜溶液中に溶解した。
- 1 u - 核酸プロ―ブ It was suspended in HCJ ™ pH 8.0, 500 µg Zml protein kinase K, 0.5% SDS solution and incubated at 55 ° C. After extraction with phenol and black form, the DNA was precipitated with ethanol and dissolved in TE bite solution. -1 u-nucleic acid probe
下記の塩基配列を有する 45mer のオリ ゴヌ ク レオチ ド CAGGACAGTGAGGGTGGGAAGGAGCCTGATGCAGGGAGTGAGGCG 45-mer oligonucleotide having the following base sequence CAGGACAGTGAGGGTGGGAAGGAGCCTGATGCAGGGAGTGAGGCG
を D N A合成機 （ A B I , 380 A ) で合成した。 こ の 45 raer, 50pmoj? を、 〔 7 - 3ώ Ρ 〕 A T P 3.7M B q ( 185 T Β q/ramoi ) 、 Τ 4ポ リ ヌ ク レオチ ドキナーゼ 10 -位、 50m M T ris ♦ H C £ ρΗ8.ϋ , 10m M M g C j? 2 , 5 mMジチオス レィ トールを含む最終容量 の溶液中で、 37°C, 1時間イ ンキュベーシ ョ ンする ことによって、 5 ' 末端を3 Pで標識した。 標識後、 この溶液を Sephadex G50 カラムク ロマ トグラフィ に力、け、 遊離のヌ ク レオチ ド及び C r - 3 P〕 A T Pを、 標識した 45mer と分離した。 Was synthesized using a DNA synthesizer (ABI, 380 A). This 45 raer, 50pmoj? Was converted to [ 7-3ώ ] ATP 3.7MB q (185TΒq / ramoi), Τ4 polynucleotide kinase 10-position, 50m MT ris ♦ HC £ ρΗ8.ϋ, in 10m MM g C j? 2, of 5 mM Jichiosu Rei final volume containing tall solution by 37 ° C, 1 hour Lee Nkyubeshi ® main routine, was labeled at the 5 'end with 3 P. After labeling, the force the solution to Sephadex G50 Karamuku Roma Togurafi, only the free j click Reochi de and C r - a 3 P] ATP, and separated with a labeled 45 mer.
サザンブロ ッ トハイブリ ダィゼ一ショ ン Southern blot hybridization
前記、 白血球から調製したゲノム D N A15 gを BstXIで 消 化 し 、 0.8 %ァ ガロ ー ス ゲル板中で電気泳動 し 、 Biodyne ナイ ロ ン膜 （Pall Bio Support , East Hil ls, N.Y.)へ、 その説明書に記載された方法に従って移した。 80°Cで 2時間イ ンキュべ一シ ョ ンし、 ナイ ロ ン膜に D N A を固定した後、 同説明書に従って、 45mer の核酸プロ一プ と 42てでー晚ハイブリ ダィゼ一ショ ンを行った。 15 g of the genome DNA prepared from the leukocyte was digested with BstXI, electrophoresed in a 0.8% agarose gel plate, and transferred to Biodyne nylon membrane (Pall Bio Support, East Hills, NY). Transferred according to the method described in the instructions. Incubate at 80 ° C for 2 hours, fix DNA on nylon membrane, and perform hybridization with 45mer nucleic acid probe and 42 according to the instructions. Was.
洗浄及び露出 Cleaning and exposure
ナイ 口 ン膜を同説明書に記載された方法に従って洗浄し、 サラ ンラ ップで覆った後、 フィ ルム、 增感スク リ ーンと に一 80。Cで 24〜66時 f j露出下においた。
B s t X [で消化したゲノ ム D N Aのパター ンと して、 各 サンプルそれぞれ 2本のバン ドが見られた。 バン ドの位置 からその長さを算出する と、 Ifi長が約 8.0, 3.8. 3.4. 1.6, 1.5kbの 5種類であった （図 2に示した） 。 45bpのコ ピー数は以下のようにして計算した。 45bpミニサテライ 卜 D N Aの両末端から B stXI切断部位までの長さ （上流側 90 bp、 下流側 22bp) をそれぞれの鎖長から引いて、 これを 45 で割った。 この計算によると、 コ ピー数は大きい方から、 約 175 , 82, 73 , 33 , 31 となり、 これらの値は、 それぞれ のバン ドの X線フィ ルム上の黒化度とほぼ一致した。 Clean the membrane according to the method described in the instruction manual, cover with a Saran wrap, and then remove the film and heat-sensitive screen. 24 to 66 o'clock at C fj exposed. Two bands were observed for each sample as a pattern of genomic DNA digested with BstX [. When the length was calculated from the band position, there were five Ifi lengths of about 8.0, 3.8. 3.4. 1.6, and 1.5 kb (as shown in Fig. 2). The number of 45 bp copies was calculated as follows. The length from both ends of the 45 bp minisatellite DNA to the BstXI cleavage site (90 bp upstream, 22 bp downstream) was subtracted from each chain length and divided by 45. According to this calculation, the number of copies was approximately 175, 82, 73, 33, 31 from the largest, and these values almost coincided with the degree of blackening on the X-ray film of each band.
検体 （ a 〜 i ) のそれぞれの鎖長及びコ ピー数を表 1 に 示す。 Table 1 shows the chain length and number of copies of each sample (a to i).
1 1
また、 各個人から得られた制限酵素切断断片のパターン
は各々いく つかのグループに分かれた。 In addition, the pattern of restriction fragments obtained from each individual Were divided into several groups.
図面の簡単な説明 BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
図 1 は α 2 - プラス ミ ンイ ンヒ ビタ一遣伝子の制限酵素 マップ、 ェク ソ ンの位置、 45bpミニサテライ ト D N Aの位 置及びその塩基配列を示しており、 黒い長方形はェク ソ ン を、 白い長方形はミ ニサテライ ト D N Aを表している。 図 2 は、 9人の染色体 D N Aを B s t で' 化した後、 45nierの核酸プローブを用い、 サザンブロ ッ トハイ ブリ ダ ィゼ一シ ョ ンを行ったときのォー トラジオグラムである。 矢印はバン ドの位置を、 数字はその長さを示している。 産業上の利用可能性 1 alpha 2 - plus Mi N'i Nhi Vita one Yadenko restriction enzyme map, the position of E click Seo down, shows the position and the nucleotide sequence of 45bp Minisaterai bets DNA, black rectangles E click Seo down , And the white rectangle represents the minisatellite DNA. FIG. 2 is an autoradiogram obtained by performing Southern blot hybridization using a 45nier nucleic acid probe after chromosomal DNA of 9 people was converted with Bst. Arrows indicate band positions and numbers indicate their length. Industrial applicability
以上述べたように、 本発明のオリ ゴヌ ク レオチ ドプロ一 ブは遣伝子診断の D N Aプローブと して使用する ことがで き、 個人識別や家系識別または逍伝病の診断剤と して利用 される。
As described above, the oligonucleotide probe of the present invention can be used as a DNA probe for gene diagnosis, and as a diagnostic agent for personal identification, family identification, or shoal disease. Used.
Claims
(1) 下記の塩基配列またはその相補鎖のうち、 少なく と も連続した 12個の好ま しく は 20個以上の塩基配列を含む こ とを特徴とする標識ォリ ゴヌ ク レオチ ドプローブ。 (1) A labeled oligonucleotide probe comprising at least 12 continuous, preferably 20 or more base sequences of the following base sequences or their complementary strands.
(2) 下記の塩基配列またはその相補鎖を有することを特 徴とする請求項 1 の標識オリ ゴヌ ク レオチ ドプローブ。 (2) The labeled oligonucleotide probe according to claim 1, wherein the probe has the following nucleotide sequence or its complementary strand.
CNGGACAGTGAGGGTGGGAXGYXGCYTGATGCAGGGAGTGAGGZX CNGGACAGTGAGGGTGGGAXGYXGCYTGATGCAGGGAGTGAGGZX
(式中、 Nは、 A , Gまたは C、 Xは、 Aまたは G、 Y は、 Cまたは G、 Zは、 Aまたは Cである） (Where N is A, G or C, X is A or G, Y is C or G, and Z is A or C)
(3) 下記の塩基配列を有することを特徴とする請求 ¾ 2 の標識オ リ ゴヌ ク レオチ ドプローブ。 (3) The labeled oligonucleotide probe according to claim 2, wherein the probe has the following nucleotide sequence.
CAGGACAGTGAGGGTGGGAAGGAGCCTGATGCAGGGAGTGAGGCG CAGGACAGTGAGGGTGGGAAGGAGCCTGATGCAGGGAGTGAGGCG
(4) 酵素、 ラ ジオアイ ソ トープ、 および化学ルミ ネ ッ
センス発光体により標識されたことを特徴とする請求項 1 ~ 3のいずれかの項に記載の標識オリ ゴヌ ク レオチ ド プローブ。 (4) Enzymes, radioisotope, and chemiluminescent 4. The labeled oligonucleotide probe according to claim 1, wherein the probe is labeled with a sense luminescent material.
(5) 請求項 1 〜 4のいずれかの項に記載の標識ォリ ゴヌ ク レオチ ドプローブを含む遺伝子診断キッ ト。
(5) A gene diagnosis kit comprising the labeled oligonucleotide probe according to any one of claims 1 to 4.
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| JP1284909A JPH03147799A (en) | 1989-11-02 | 1989-11-02 | Novel oligonucleotide probe |
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Cited By (2)
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- 1990-10-31 WO PCT/JP1990/001404 patent/WO1991006675A1/en unknown
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