WO1991002982A1 - Verfahren zur strukturbestimmung von peptiden - Google Patents

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Helmut BLÖCKER
Stephen C. Emery
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GESELLSCHAFT FüR BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF)
Sander, Christian
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Definitions

  • Peptides are substances that are isolated from natural sources, either directly or after genetic modification of the genes of the natural sources, or are synthesized chemically or enzymatically and are widely used in basic or applied research, for example axs pharmaceuticals.
  • Nuclear magnetic resonance spectroscopic and X-ray crystallographic methods are preferably used for the structural analysis of peptides.
  • the effect can occur that the intermolecules in the crystal Their interactions are significantly increased beyond the natural conditions, so that among the possible conformations there are increasingly those which best do justice to the close packing in the peptide crystal.
  • peptides are more difficult to crystallize than proteins.
  • the measurement in often highly concentrated solutions, as are required for NMR spectroscopy Here too, the occurrence of non-natural intermolecular interactions easily leads to artifacts.
  • the disadvantages mentioned can now be avoided by covalently linking the desired peptide to a protein and by structural analysis of the product, and thus the peptide.
  • the X-ray structure analysis of the cocrystallizate of peptide and protein and also the nuclear magnetic resonance spectroscopy of preferably a solution of the product are suitable for this.
  • the peptide is bound to the optionally modified C-terminal protein end.
  • Native ROP was used as protein. The spatial structure of this protein has already been determined and published in high resolution. It is a protein with a bundle of four ⁇ -helices. The sequence of the native ROP was changed only slightly. only the 5 C-terminal amino acids were removed and amino acid 58 was converted into glycine for flexibility.
  • a partial sequence (7 amino acids) from a PSTI4 variant was used as the peptide; for the sequence cf. the German patent application P 38 27 145.1. Two adjacent glycine residues were provided as linkers. With the help of this linker, the PSTI4 variant could be bound to the protein at the C-terminal.
  • the product formed was purified according to the literature for native ROP.
  • the isolated and purified product was then crystallized and subjected to X-ray structural analysis and nuclear magnetic resonance spectroscopy under standard ROP conditions. In this way the structure of the peptide could be clarified.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Strukturbestimmung eines Peptids, das mit einem Protein kovalent verknüpft ist, auf röntgenkristallographischem oder kernresonanzspektroskopischem Wege.

Description

Verfahren zur Strukturbestimmung von Peptiden
Peptide sind Substanzen, die aus natürlichen Quellen isoliert werden, und zwar direkt oder nach gentechnologischer Verände¬ rung der Gene der natürlichen Quellen, oder chemisch oder enzy matisch synthetisiert werden und eine breite Verwendung in der grundlegenden oder angewandten Forschung finden, beispielsweis axs Pharmaka.
In den letzten Jahren eröffnet eine Kombination von Techniken der elektronischen Datenverarbeitung mit modernen Methoden der Biologie Wege, modifizierte Peptide vorzusehen, die an eine vorgegebene Aufgabe angepaßt sind ("Drug-Design" und "Protein- Design" ) . Zur Beurteilung dieser Anpassung der Peptide sind je doch Informationen über ihre Struktur und Funktion erforder¬ lich. Es besteht daher ein starkes Bedürfnis, auf elegante Weise die Struktur von Peptiden zu bestimmen.
Zur Strukturanalyse von Peptiden werden vorzugsweise kernreso- nanzspektroskopische und röntgenkristallographische Methoden eingesetzt. Bei der direkten Kristallisation von Peptiden kann jedoch der Effekt auftreten, daß im Kristall die intermolekula ren Wechselwirkungen wesentlich über die natürlichen Bedingun¬ gen hinaus verstärkt werden, so daß sich unter den möglichen Konformationen vermehrt jene einstellen, die am besten der engen Packung im Peptidkristall gerecht werden. Außerdem lassen sich der Erfahrung nach Peptide schwerer als Proteine kristal¬ lisieren. Ähnliches gilt für die Vermessung in oft hochkonzen¬ trierten Lösungen, wie sie für die NMR-Spektroskopie benötigt werden: Auch hier führt das Auftreten von nicht natürlichen in¬ termolekularen Wechselwirkungen leicht zu Artefakten.
Erfindungsgemäß lassen sich nun die angesprochenen Nachteile dadurch vermeiden, daß man das gewünschte Peptid mit einem Pro¬ tein kovalent verknüpft und das Produkt - und damit das Peptid - strukturanalytisch vermißt. Hierfür bietet sich die Röntgen- strukturanalyse des Kokristallisats von Peptid und Protein und auch'die Kernresonanzspektroskopie von bevorzugt einer Lösung des Produkts an.
Es ist von Vorteil, für das erfindungsgemäße Verfahren ein Pro¬ tein bekannter Raumstruktur zu verwenden, beispielsweise nati- ves ROP (repressor of primer).
Gemäß einer speziellen Ausführungsfor des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Peptid an das ggf. modifizierte C-terminale Proteinende gebunden.
Nachstehend wird die Erfindung durch ein Beispiel näher erläu¬ tert.
Beispiel 1
Als Protein wurde natives ROP verwendet. Die Raumstruktur dieses Proteins ist bereits in hoher Auflösung bestimmt und veröffentlicht worden. Es handelt sich um ein Protein mit einem Bündel von vier α-Helices. Die Sequenz des nativen ROP wurde nur unwesentlich geändert. wurden lediglich die 5 C-terminalen Aminosäuren entfernt und die Aminosäure 58 zur Flexibilisierung in Glycin umgewandelt.
Als Peptid wurde eine partielle Sequenz (7 Aminosäuren) aus einer PSTI4-Variante eingesetzt; zur Sequenz vgl. man die deutsche Patentanmeldung P 38 27 145.1. Als Linker wurden zwe benachbarte Glycin-Reste vorgesehen. Mit Hilfe dieses Linkers konnte die PSTI4-Variante C-terminal an das Protein gebunden werden.
Das gebildete Produkt wurde gemäß den Literaturangaben für na tives ROP gereinigt. Danach wurde das isolierte und gereinigt Produkt kristallisiert und unter ROP-Standardbedingungen eine Röntgenstrukturanalyse und einer Kernresonanzspektroskopie un terworfen. Auf diese Weise konnte die Struktur des Peptids au geklärt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur StrukturbeStimmung eines Peptids, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß man das Peptid kovalent an ein Protein bindet und das gebildete Produkt Strukturanal tisch untersucht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Struktur des Peptids kernresonanzspektroskopisch bestimmt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Struktur des Peptids röntgenkristallographisch bestimmt.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid an ein Protein bekannter Raumstruktur bindet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid an das ggf. modifizierte C- terminale Proteinende bindet.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet," daß man als Protein natives ROP verwendet.
PCT/EP1990/001352 1989-08-18 1990-08-17 Verfahren zur strukturbestimmung von peptiden WO1991002982A1 (de)

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