WO1991002979A1 - Procede et dispositif de dosage rapide d'une pluralite d'echantillons contenant une substance d'interet clinique reactive immunologiquement - Google Patents

Procede et dispositif de dosage rapide d'une pluralite d'echantillons contenant une substance d'interet clinique reactive immunologiquement Download PDF

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WO1991002979A1
WO1991002979A1 PCT/FR1990/000623 FR9000623W WO9102979A1 WO 1991002979 A1 WO1991002979 A1 WO 1991002979A1 FR 9000623 W FR9000623 W FR 9000623W WO 9102979 A1 WO9102979 A1 WO 9102979A1
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Pierre François SERRES
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Indicia Societe Civile D'etudes Et De Recherches (Scer)
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

Definitions

  • the present invention relates to the general technical field of methods and devices for dosing a chemical, biological or biochemical substance contained in any natural or artificial medium.
  • the present invention applies, more particularly but not exclusively, to assay methods and devices which aim to assay immunologically reactive substances of clinical interest, such as the assay of an antigen by an antibody and vice versa.
  • the present invention is part of a development and improvement of the method and of the metering device described in patent application FR-A-2604526.
  • immunologically reactive substance mainly all the antigens (including haptens) and the monoclonal or polyclonal antibodies obtained by cell fusion and natural or induced immunization.
  • subject of clinical interest which is immunologically reactive is meant mainly all the antigenic molecules or antibodies whose assay, in a biological sample of human or animal origin, may be of interest in medical diagnosis, The clinical research or Monitoring of a pathological process, or of a therapy implemented.
  • the prior application FR-A-2604526 describes a method for assaying, in particular for assaying an antigen with an antibody, in which particular phases of agitation and result reading. Synthetic or natural micro-particles or micro-spheres are thus used which, during a stirring phase of determined amplitude and frequency, lead to the immunological and specific agglutination of the antibodies and antigens.
  • the microparticles or microspheres chosen have the particularity of offering, for a determined wavelength, visible ultraviolet light, a maximum absorption called ⁇ max.
  • US Pat. No. 4,240,751 discloses a method for reading samples having some automation and using a reading device, of the colo ⁇ ' meter type with optical fiber and double beams, provided with a reading head. which is moved manually by the operator above each of the samples to be assayed, which are contained in micro-wells of a micro-plate.
  • the method of Reading revealed teaches to use a wide reading band, the upper limits of wavelength of which are less than the average diameter of the microparticles likely to be used. It is therefore not mentioned to have recourse to a specific Reading wavelength, such an approach being even discouraged.
  • the dosing method described operates on a principle unrelated to that of FR-A-2604526 and requires numerous manipulations in addition to the manual displacement of the read head leading to a relatively long dosing.
  • reading devices are already known which are capable of performing automatic reading, in particular by spectrophotometry, of a large number of samples to be assayed.
  • These reading devices are for example used in the field of immunoenzymology and make it possible to read the result of the assay specific to each sample, by means of a micro-plate comprising a series of micro-cups in which the series of samples to be assayed is inserted • and held vertically.
  • These may be, for example, micro-plates of the ELISA type, the usual function of which is to allow the reading of a series of metric colo ⁇ ' reactions.
  • These micro-plates are usually provided to allow the automatic reading of 96 sample tubes.
  • the appropriate reading devices ensure, once the microplate provided with the plurality of tubes to be read is placed in the apparatus, the automatic processing Individualized reading of the sample tubes, by emission of a set of optical beams generally passing vertically through each of the tubes. In most cases, a printer is connected to the reading device to allow immediate printing of the reading results.
  • This automatic reading technique is, of course, perfectly suited to the rapid reading of a large series of samples, but its use is currently limited to reading colorimetric reactions. In fact, the optical possibilities of the commonly used automatic reading devices are reduced to a limited number of reading wavelengths characteristic of the reading head or crown of each type of device.
  • the reading methods known up to now and using micro-plates consist of resorting, in a conventional manner, to sample tubes placed on the micro-plate, or to successive uses for the same dosage of several micro-plates including washes.
  • the reading methods known to date therefore do not allow a rapid reading of a large number of samples, insofar as there remains a series of manipulation operations which lead to the reckless lengthening of the dosing phases and reading, due in particular to the washing phases.
  • the difficulty of washing the micro-cups leads to an impaired reliability of the Reading results.
  • the object of the invention is to propose an improvement to the method and to the device for assaying substances of clinical interest which are immunologically reactive according to the request FR-A-2604526 which makes it possible to ensure the automatic reading of the assay of a plurality of 'samples.
  • Another object of the invention is to propose a method and an implementation device allowing the adaptation of the method and the device according to the request FR-A-2604526 to the automatic reading techniques allowed by automatic microplate readers. .
  • a secondary object of the invention is to propose a method and its implementation device in which the set of operations for preparing and handling the samples to be assayed and for determining the standard range is reduced and simplified, with a view to reduce the total dosing time.
  • the object of the invention is achieved by means of a method for assaying a substance of clinical interest which is immunologically reactive with other substances of the same type, of the type assaying of an antigen by an antibody and vice versa, of the type in which :
  • an immunologically active substance acting as a metering agent, is grafted beforehand onto natural or synthetic micro-particles to form a metering reagent
  • the dosing reagent is mixed with the substance to be measured diluted in an appropriate manner and in a known manner,
  • the sample by comparison with the visible ultra-violet absorption results measured at the same wavelength ⁇ max obtained, under the same conditions, on a standard range, characterized in that, with a view to carrying out the assay a plurality of samples in a single pass in the Reading device:
  • a dosing reagent is chosen beforehand, the microparticles of which have at least one ⁇ max corresponding substantially to at least one reading wavelength authorized by the reading apparatus,
  • mixtures of the dosing reagent are carried out with the plurality of samples to be assayed diluted in a known manner in a series of individual volumes, consisting of a series of micro-wells formed in a micro-plate,
  • the plurality of results is read by inserting the micro-plate into a reader spectro-photometric and automatic micro-plate programmed on a Reading wavelength close to the ⁇ max characteristic of the micro-particles chosen.
  • the object of the invention is also achieved thanks to a device for implementing the method comprising:
  • a dosing reagent comprising micro-particles grafted on an immunologically active substance and capable of exhibiting at least an absorption maximum ( ⁇ max) for at least one reading wavelength authorized by an automatic reading device, of the type spectrophotometer,
  • Fig. 1 shows a general schematic and perspective view of a micro-plate used in the method and the device according to the invention.
  • FIG. 2 shows a top view of a micro-plate and FIG. 2_a shows a partial view of a specific form of distribution of the standard range.
  • Fig. 3 shows a general top view of a box according to the invention.
  • the main Reading wavelengths that can be displayed are: 340 nanometers, 405 nanometers, 414 nanometers, 450 nanometers, 492 nanometers, 540 nanometers, 620 nanometers, 690 nanometers.
  • patent application FR-A-2604526 has shown that if by visible ultraviolet absorption spectrophotometry by placing itself at a wavelength which corresponds to the absorption max ⁇ of the non-aggregated microspheres , a solution containing a mixture of non-agglutinated microspheres and microparticles and a mixture of agglutinates is read. These, the measurement carried out only concerns, and therefore detects, only the non-agglutinated particles, because the latter are the only ones to absorb at this maximum.
  • the maximum absorption ⁇ max is therefore a characteristic of the disaggregated microspheres, and this characteristic is directly related either to the size of the particles, or to their constituent material, or to their color.
  • micro-particles or micro-spheres have made it possible to demonstrate that, for commonly used reading wavelengths, the size of the micro-particles or micro-spheres, likely to have a max ⁇ at the Reading wavelengths of micro-plate Reading devices, should be between 0.4 and 0.7 micrometers on the one hand, and between 0 , 8 and 1, 2 micrometers on the other hand, for Reading respectively, for example, in the vicinity of 340 nanometers and 405 nanometers.
  • Micro-particles or micro-spheres with a diameter of 1 micrometer having, for example, maximum absorption at a Reading wavelength of exactly 405 nanometers.
  • microparticles or microspheres with a diameter of 0.5 to 0.6 micrometers in polystyrene, or 0.6 micrometer in vinyl butadiene are also suitable.
  • sizes between 0.1 and 0.5 micrometers are also suitable.
  • a diameter of 0.9 to 1.2 micrometers is also suitable.
  • the adjustment of the max ⁇ of a given microsphere over a wavelength imposed by the reading device does however have a certain tolerance, insofar as i L has been noted that the microparticles or microspheres of a given size could have a ⁇ max varying by plus or minus 5 nanometers around the displayed reading value without harming significantly to the result.
  • non-colored synthetic polystyrene microspheres or microparticles with a diameter substantially equal to 0.1, 0.3, 0.3 to 0.7, 0.8 to 0 , 85, 1, 1.4 micrometers respectively allowed the readings in the vicinity of 300, 310, 320 to 350, 380, 405, 414, 420 and 450 nanometers.
  • the ratio ⁇ . max of the maximum absorption of d micro-particles on The average diameter of the micro-particles will be between 0.4 and 0.8 and advantageously substantially equal to 0.65.
  • the ratio ⁇ max can, in some cases and for certain types of particles, be between 0.3 and 1.
  • micro-spheres or micro-particles on their color characteristic and, in this case, The blue color has been found to give good results in the vicinity of 340 nanometers.
  • micro-particles or micro-spheres of blue polystyrene with a diameter of between 0.4 and 0.7 micrometers, allow a reading between 320 and 360 nanometers.
  • the microparticles must have a spherical shape, must be synthetic, and chosen from the group consisting of synthetic polymers of vinyl toluene, acrylo-nitri Le, styrene butadiene, acrylo-nitrile derivatives- acrylic acid, acrylic esters, silicones, vinyl butadiene and, preferably, polystyrene.
  • synthetic polymers of vinyl toluene, acrylo-nitri Le, styrene butadiene, acrylo-nitrile derivatives- acrylic acid, acrylic esters, silicones, vinyl butadiene and, preferably, polystyrene are preferred.
  • an immunologically active substance is grafted, in known manner, playing the role of dosing agent, onto said microparticles or microspheres, in view of constituting a dosing reagent.
  • micro-plates 1 are generally in the form of a volume defined in the shape of a rectangular parallelepiped comprising a series of micro-cups 2, preferably of cylindrical shape distributed regularly in the mass of the micro-plate 1.
  • the volumes defined by the micro-cups are also preferably constant and equal with respect to each other and have an opening, for example circular, opening at the level of the upper face 3 of the micro-plate 1. It It is obvious that other forms of micro-cups 2 are possible.
  • These plates are generally made of a transparent plastic material of the polystyrene type.
  • the micro-plates 1 comprise a series of eight rows numbered from A to H, distributed over twelve columns, which leads to micro-plates 1 comprising 96 micro-wells.
  • the method according to the invention has the particularity of carrying out the mixing of the dosing reagent, therefore containing grafted synthetic microspheres, with the plurality of samples to be assayed (previously diluted in known manner) directly in each of the individualized volumes defined by the micro-wells 2 of the micro-plate 1.
  • Each micro-well 2 is thus capable of containing a mixture of a known amount of dosing reagent, with an also known amount of samples to be assayed, without using tubes of reading.
  • certain micro-cups are reserved, advantageously three rows distributed over nine columns, to constitute the standard reading range.
  • the points of the standard range 4 are present at the bottom of the micro-cups 2 which are reserved for them, in freeze-dried form and in quantity also pre-calibrated.
  • the The user task CONSI 'ste simply reconstitute the standard range of microplate by simply rehydrating the micro-wells 2 containing the points of the standard range 4.
  • the points of standard ranges 4 Lyophilized deposited at the bottom of a micro-cup had the particularity, first of all to be distributed naturally in the form of circular rings (fig.
  • micro-cups not occupied by the points of Standard range 4
  • pre-calibrated quantities of the dosing reagent under dehydrated or even freeze-dried form distributed in a ring or crescent. The user then only has to deposit at the bottom of said micro-wells the required quantities of each of the samples to be assayed.
  • a system for closing the microplate 1 which may, for example, consist of a cover 5 held by any means known to those skilled in the art and, for example, by bonding to the upper face 3 from The micro-plate. By simply detaching this cover 5, the user obtains a ready-to-use micro-plate.
  • the microplate 1 is subjected to a periodic movement of frequency between 4 and 40 Hertz, preferably between 5 and 25 Hertz and advantageously close to 16 or 20 Hertz, and of amplitude varying from a few millimeters to a few centimeters , preferably of the order of 4 millimeters.
  • the purpose of this periodic agitation movement is to carry out the specific immunological agglutination of said micro-particles or micro-spheres contained in each of the incubation media present in each of the micro-wells.
  • recourse is had to conventional agitation apparatus well known to those skilled in the art.
  • the blocking of each of the solutions is carried out using a blocking solution which is introduced directly into each of the micro-wells.
  • a rest time of the order of, for example, 10 minutes the user can then read directly the plurality of concentration results relating to the plurality of samples by direct introduction of the microplate 1 into a reader. spectro-photomét ⁇ 'and that automatic microplate.
  • the user must first select
  • the spectrophotometric reading apparatus then ensures, by itself automatically and in a single pass of the microplate 1, the individualized reading of each of the samples by emission of vertical optical rays through each of the micros -cupules 2 of the micro-plate.
  • the device for implementing the method according to the invention must therefore consist of at least one microplate 1 wherein is provided a plurality of micro-wells 2, and comprise a reagent doser containing micro-particles or micro-spheres grafted onto an immunologically active substance, able to act as dosing agent and capable of present at least an absorption maximum ( ⁇ max) for at least one reading wavelength authorized by an automatic reading device, of the spectro-photometer type.
  • ⁇ max absorption maximum
  • the implementation device is in the form of a box 6 (fig. 3) containing at least one and, preferably, three micro-plates 1, each of the micro-plates having a standard range 4 which is originally deposited in lyophilized form and pre-calibrated at the bottom of 27 micro-cups.
  • the box 6 also preferably presents bottles of a lyophilized buffer solution 7 for the final dilution of the sample.
  • the buffer solution is reconstituted by simple rehydration.
  • the box 6 can, in addition, include bottles of a blocking solution 8, as well as tubes of control serum 9, for example two, and, finally, tubes of reagents 10 ready for use for the mixing of samples.
  • the points of the standard range 4 are not distributed at the bottom of a series of micro-cups, it is obviously necessary to provide, in the box 6, bottles or tubes containing the points of the range standard.
  • the kit will not include reagent tubes 10.
  • the closure cap 5 it is also possible, if the liquid channel is chosen, to ' distribute the original ready-to-use reagent at the bottom of the micro-wells, the closure cap 5 then ensuring the tightness of the assembly.
  • the dosing reagent can finally, of course, be in dehydrated or lyophilized form and be presented in box 6 in tubes or vials.
  • the technique used is, moreover, considerably simplified, insofar as the microplate itself is used as a support element for agitation leading to agglutination.
  • the automatic reading of the concentration of each of the samples in an automatic reading device allows the user to obtain, almost simultaneously, the concentration results for a large number of samples.
  • Example of execution n_ ° _ 1 - The box intended for the simultaneous dosing of a plurality of samples is delivered with three micro-plates, each micro-plate comprising 27 micro-cups reserved for the standard range points distributed over three rows, that is to say 9 points of standard range in triple pre-lyophilized.
  • the other 69 micro-wells on each plate, totaling 207 micro-wells, are blank and available for incubation of diluted biological samples. All fluid or liquid distributions can be do this very quickly using multichannel pipettes (8 channels).
  • the user simply rehydrates the micro-wells of the standard range, - the user proceeds to the distribution of the biological samples, diluted beforehand, in the virgin micro-wells, at the rate for example of 10 microliters per micro-wells.
  • the user distributes, by an eight-channel pipette, the blocking liquid in each of the micro-wells, for example at the rate of 100 microliters.
  • the user has, of course, selected the reading filter of the device on the wavelength corresponding to the maximum absorption characteristic of the microparticles of the reagent used.
  • Example of realization n ° _2 - Determination of human albumin 1) Distribution of the biological samples: One distributes, in duplicate, in the virgin cups, 10 ⁇ l of the diluted biological samples. For the distribution of 10 ⁇ l of the diluted samples, we use a precision micropipette (capillary pipettes recommended).
  • the B2 M SPHEROTEST reagent is vigorously vortexed (1 min).
  • the vortexed reagent is placed in a gutter.
  • 30 ⁇ l of reagent are distributed, column by column, in all of the columns, except for column 12.
  • the microplate is stirred (rotary shaker) immediately after dispensing the reagent:
  • the micro-plate is read at a Reading wavelength of 340 nanometers for example.
  • NB stability of the micro-plate (crimped with the adhesive film ) : 5 hours (4-8 ° C) a reading made after 5 hours (up to 8 hours) requires rehomogenization of the micro-plate ( stirring 600 rpm - 1 minute).
  • n_ ° _3 Determination of human microglobular B2: We proceed exactly as for example n ° 1, making sure to dispense 20 ⁇ l of the reagent (step 3), to incubate for 2 minutes at 1,000 rpm (step 4) and shake the microplate for 2 minutes at 600 rpm (step 5).
  • n ° _ 4 Assay of native anti DNA: We proceed as for example n ° 3 taking care, to distribute 20 ⁇ l of biological samples (step 1), and to rehydrate ( step 2) with 20 ⁇ l of water.
  • step 4 by distributing 20 ⁇ l of biological samples (step 1) and by rehydrating (step 2) The micro-wells with 20 ⁇ l of water.
  • the incubation time (step 4) is exactly 15 seconds at 1,000 rpm, the shaking time of the blocking phase (step 5) being exactly 4 minutes at 600 rpm.
  • the invention applies to the assay of antibodies by antigens and vice versa.

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Abstract

Dosage d'échantillons. Le procédé conforme à l'invention consiste à: choisir un réactif doseur dont les micro-particules présentent au moins un μ max correspondant sensiblement à une longueur d'onde de lecture autorisée par l'appareil de lecture; effectuer les mélanges du réactif doseur avec la pluralité des échantillons dans une série de micro-cupules ménagées dans une micro-plaque; incuber simultanément la totalité desdits mélanges en soumettant à agitation ladite micro-plaque; effectuer la lecture de la pluralité des résultats par introduction de la micro-plaque dans un lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque programmé sur une longueur d'ondes de lecture voisine du μ max caractéristique des micro-particules choisies. Application au dosage rapide d'antigène ou d'anticorps dans une pluralité d'échantillons.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF DE DOSAGE RAPIDE D'UNE PLURALITE D'ECHANTILLONS CONTENANT UNE SUBSTANCE D'INTERET CLINIQUE REACTIVE IMMUNOLOGIQUEMENT
DOMAINE TECHNIQUE :
La présente invention concerne le domaine technique général des procédés et dispositifs de dosage d'une substance chimique, biologique ou biochimique contenue dans un milieu quelconque naturel ou artificiel.
La présente invention s'applique, plus particulièrement mais non exclusivement, aux procédés et dispositifs de dosage qui ont pour but de doser des substances d'intérêt clinique réactives immunologiquement, du genre dosage d'un antigène par un anticorps et réciproquement.
La présente invention s'inscrit dans le cadre d'un développement et d'une amélioration du procédé et du dispositif de dosage décrit dans la demande de brevet FR-A-2604526.
Ainsi, par "substance réactive immunologiquement", on entend principalement tous les antigènes (incluant les haptènes) et les anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par fusion cellulaire et immunisation naturelle ou provoquée.
De la même façon, par "substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement", on entend principalement toutes les molécules antigèniques ou anticorps dont le dosage, dans un échantillon biologique d'origine humaine ou animale, peut présenter un intérêt dans le diagnostic médical, La recherche clinique ou Le suivi d'un processus pathologique, ou d'une thérapeutique mise en oeuvre.
TECHNIQUE ANTERIEURE
La demande antérieure FR-A-2604526 décrit un procédé de dosage, notamment de dosage d'un antigène par un anticorps, dans lequel on procède à des phases particulières d'agitation et de lecture de résultat. On a ainsi recours à des micro-particules ou micro-sphères synthétiques ou naturelles qui, lors d'une phase d'agitation d'amplitude et de fréquence déterminée, conduisent à l'agglutination immunologique et spécifique des anticorps et des antigènes. Les micro-particules ou micro-sphères choisies présentent la particularité d'offrir, pour une Longueur d'onde déterminée, de la lumière ultra-violet visible, un maximum d'absorption dénommée λ max. Cette propriété particulière d'absorption vraie est alors utilisée dans la pratique pour déterminer, par spectro-photométrie classique, la concentration d'échantillons à doser, puisque seules les micro-sphères ou micro-particules non agglutinées dans un échantillon à doser présentent, par lecture spectro-photométrique au voisinage du λ max caractéristique desdites micro-particules ou micro-sphères, un maximum d'absorption.
Par comparaison avec une courbe étalon obtenue par lecture à la même longueur d'ondes caractéristique λ max, on peut ainsi obtenir, par simple lecture d'un échantillon traversé par un rayon de longueur d'ondes λ max, la concentration dudit échantillon après la mise en oeuvre de dilutions appropriées, et Le recours à des solutions de blocage. Le procédé ainsi décrit ne requiert, au préalable, que la connaissance ou la vérification de La longueur d'ondes λ max caractéristique du maximum d'absorption des micro-sphères ou micro-particules utilisées. Le procédé et son dispositif de mise en oeuvre se sont révélés d'une utilisation pratique certaine, puisqu'ils sont susceptibles d'être employés par tout type de laboratoire possédant un appareil classique de Lecture par spectro-photométrie. Cette technique est comparable aux Lectures traditionnelles par spectro-photométrie utilisées dans d'autres domaines et est donc d'un usage facile, d'une exécution rapide et d'un coût final d'analyse relativement faible.
Un tel procédé souffre cependant d'un inconvénient majeur relatif à la nécessité de procéder à la lecture individuelle et successive de chacun des tubes à lire, puisque ces derniers doivent être introduits dans l'appareil de Lecture, puis lus et enfin retirés par L'utilisateur. Le nombre de manipulations est, en conséquence, directement proportionnel au nombre de tubes à doser, alors que le procédé de Lecture en Lui-même est instantané, ce qui conduit à rendre La technique globale de dosage d'une longueur sans rapport avec la technique même de lecture. Cette situation est d'autant plus préjudiciable que, dans La pratique, L'utilisateur est confronté à la nécessité de procéder au dosage d'un grand nombre d'échantillons, à savoir une ou plusieurs centaines par exemple.
On connaît d'après le brevet US-A-4240751 un procédé de Lecture d'échantillons présentant une certaine automatisation et utilisant un appareil de lecture, du type coloπ'mètre à fibre optique et à double faisceaux, muni d'une tête de lecture qui est déplacée manuellement par l'opérateur au-dessus de chacun des échantillons à doser, lesquels sont contenus dans des micro-cupules d'une micro-plaque. Le procédé de Lecture révélé enseigne d'utiliser une large bande de lecture, dont Les limites supérieures de longueur d'onde sont inférieures au diamètre moyen des micro-particules susceptibles d'être utilisées. Il n'est donc pas mentionné d'avoir recours à une longueur d'onde de Lecture spécifique, une telle démarche étant même déconseillée. Le procédé de dosage décrit fonctionne selon un principe sans rapport avec celui du FR-A-2604526 et nécessite de nombreuses manipulations en plus du déplacement manuel de la tête de lecture conduisant à un dosage relativement long.
On connaît, par ailleurs, déjà des appareils de lecture susceptibles d'effectuer la Lecture automatique, par spectro-photométrie notamment, d'un grand nombre d'échantillons à doser. Ces appareils de lecture, utilisant généralement le principe des fibres optiques, sont par exemple utilisés dans le domaine de l' immuno-enzymologie et permettent de lire Le résultat du dosage propre à chaque échantillon, par le biais d'une micro-plaque comportant une série de micro-cupules dans Lesquelles est insérée • et maintenue verticalement la série des échantillons à doser. IL peut s'agir, par exemple, de micro-plaques du type ELISA dont la fonction habituelle est de permettre la Lecture d'une série de réaction coloπ'métrique. Ces micro-plaques sont habituellement prévues pour permettre La lecture automatique de 96 tubes d'échantillons. Les appareils de lecture appropriés, plus communément désignés sous Le terme de "lecteurs automatiques de micro-plaques" assurent, une fois mise en place dans L'appareil la micro-plaque munie de la pluralité des tubes à lire, la mise en oeuvre automatique de La Lecture individualisée des tubes d'échantillons, par émission d'un ensemble de faisceaux optiques traversant généralement verticalement chacun des tubes. Dans la plupart des cas, une imprimante est reliée à l'appareil de lecture pour permettre une impression immédiate des résultats de lecture. Cette technique de Lecture automatique est, bien évidemment, parfaitement adaptée à la lecture rapide d'une grande série d'échantillon, mais son utilisation est actuellement limitée à la lecture de réaction colorimétrique. En effet, Les possibilités optiques des appareils de Lecture automatique communément utilisés sont réduites à un nombre limité de Longueur d'ondes de lecture caractéristiques de La tête ou de la couronne de lecture de chaque type d'appareil. Ces caractéristiques sont en nombre fini et les longueurs d'ondes discontinues, à savoir par exemple 340 nanomètres, 405 nanomètres, 414 nanomètres, 450 nanomètres, etc.. Cette particularité ne rend pas Le procédé de lecture, décrit dans la demande de brevet FR-A-2604526, directement adaptable à la Lecture par ces appareils automatiques, dans la mesure où i L est nécessaire que la longueur d'onde λ max des micro-particules ou micro-sphères utilisées dans le procédé selon la demande précitée présente un maximum d'absorption correspondant à la Longueur d'onde de lecture de l'appareil.
Par ailleurs, les procédés de lecture connus jusqu'à présent et mettant en oeuvre des micro-plaques consistent à avoir recours, de manière classique, à des tubes d'échantillons mis en place sur La micro-plaque, ou à des utilisations successives pour un même dosage de plusieurs micro-plaques incluant des lavages. Les procédés de Lecture connus à ce jour ne permettent donc pas de procéder à une lecture rapide d'un grand nombre d'échantillons, dans la mesure où subsiste une série d'opérations de manipulations qui conduisent à l'allongement inconsidéré des phases de dosage et de lecture, dû notamment aux phases de Lavage. En outre, la difficulté de lavage des micro-cupules conduit à une fiabilité altérée des résultats de Lecture.
EXPOSE DE L'INVENTION
L'objet de l'invention est de proposer un perfectionnement au procédé et au dispositif de dosage de substances d'intérêt clinique réactive immunologiquement selon La demande FR-A-2604526 qui permette d'assurer La lecture automatique du dosage d'une pluralité d'échantillons.
Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé et un dispositif de mise en oeuvre permettant l'adaptation du procédé et du dispositif selon la demande FR-A-2604526 aux techniques de lecture automatique permises par les lecteurs automatiques de micro-plaques.
Un objet secondaire de l'invention est de proposer un procédé et son dispositif de mise en oeuvre dans lequel l'ensemble des opérations de préparation et de manipulation des échantillons à doser et de détermination de la gamme étalon est réduit et simplifié, en vue de réduire le temps total de dosage.
L'objet de l'invention est atteint grâce à un procédé de dosage d'une substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement par d'autres substances du même type, du genre dosage d'un antigène par un anticorps et réciproquement, du type dans lequel :
- on greffe préalablement une substance active immunologiquement, jouant le rôle d'agent doseur, sur des micro-particules naturelles ou synthétiques pour constituer un réactif doseur,
- on détermine le maximum d'absorption de la lumière ultra-violet visible, soit d'une suspension en milieu Liquide desdites micro-particules non agglutinées, soit du réactif doseur en suspension liquide, la détermination étant effectuée en faisant Le spectre d'absorption ultra-violet visible de l'une ou l'autre desdites suspension, la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption étant dénommée λ max,
- on mélange le réactif doseur avec la substance à doser diluée de façon appropriée et de manière connue,
- on incube ledit mélange, par agitation, pour réaliser l'agglutination im unoLogique desdites micro-particules dans le milieu d'incubation,
- on effectue ensuite la lecture du résultat dans un appareil de lecture de type spectro-photomètre, par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible, en se plaçant au voisinage de ladite longueur d'onde λ max, - on calcule les concentrations de La substance à doser dans
L'échantillon, par comparaison avec les résultats d'absorption ultra-violet visible mesurés à La même longueur d'onde λ max obtenus, dans les mêmes conditions, sur une gamme étalon, caractérisé en ce que, en vue d'effectuer le dosage d'une pluralité d'échantillons en un seul passage dans l'appareil de Lecture :
- on choisit préalablement, pour réaliser L'ensemble des opérations de dosage, un réactif doseur dont Les micro-particules présentent au moins un λ max correspondant sensiblement à au moins une longueur d'onde de lecture autorisée par l'appareiL de Lecture,
- on effectue Les mélanges du réactif doseur avec la pluralité des échantillons à doser dilués de manière connue dans une série de volumes individualisés, consistant en une série de micro-cupules ménagées dans une micro-plaque,
- on incube simultanément la totalité desdits mélanges en soumettant à agitation ladite micro-plaque.
- on effectue la lecture de La pluralité des résultats par introduction de la micro-plaque dans un lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque programmé sur une longueur d'ondes de Lecture voisine du λ max caractéristique des micro-particules choisies. L'objet de L'invention est également atteint grâce à un dispositif de mise en oeuvre du procédé comportant :
- au moins une micro-plaque dans laquelLe est ménagée une pluralité de micro-cupules,
- un réactif doseur comprenant des micro-particules greffées sur une substance active immunologiquement et susceptibles de présenter au moins un maximum d'absorption (λ max) pour au moins une longueur d'onde de lecture autorisée par un appareil de lecture automatique, du type spectro-photomètre,
- une solution de blocage de la réaction d'agglutination, - une gamme étalon de la substance active immunoLogiquement. Diverses autres caractéristiques ressortent de la description faite ci-dessous en référence aux dessins annexés qui montrent, à titre d'exemples non limitatifs, des formes de réalisation de l'objet de l'invention.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS :
La fig. 1 représente une vue générale schématique et en perspective d'une micro-plaque utilisée dans le procédé et le dispositif conforme à l'invention.
La fig. 2 montre une vue de dessus d'une micro-plaque et la fig. 2_a montre une vue partielle d'une forme de répartition spécifique de la gamme étalon. La fig. 3 représente une vue générale de dessus d'un coffret conforme à L'invention.
MEILLEURE MANIERE DE REALISER L'INVENTION :
Dans La description qui suit, il ne sera fait que succinctement référence à l'étape relative au greffage de la substance active immunologiquement sur des micro-particules ou micro-sphères ou à l'étape de détermination du maximum d'absorption λ max d'une suspension en milieu liquide desdites micro-particules non agglutinées ou du réactif doseur Lui-même. Pour plus de détails sur La réalisation pratique, on se reportera utilement à la demande FR-A-2604526.
La plupart des appareils de Lecture automatique de micro-plaques actuellement présents sur le marché sont munis d'un réseau de filtres interférentiels de Lecture montés sur une couronne rotative permettant de sélectionner, par rotation de la couronne, une longueur d'onde de lecture spécifique à chacun des filtres. En pratique, les principales longueurs d'ondes de Lecture qui peuvent être affichées sont : 340 nanomètres, 405 nanomètres, 414 nanomètres, 450 nanomètres, 492 nanomètres, 540 nanomètres, 620 nanomètres, 690 nanomètres.
En vue de pouvoir assurer, de manière significative, la mesure de l'absorption d'une suspension aqueuse contenant des micro-particules ou micro-sphères non aggLutinées, par spectro-photométrie d'absorption aux longueurs d'ondes autorisées par les appareils classiques de lecture de micro-plaques correspondant aux valeurs ci-dessus mentionnées, l s'est avéré nécessaire d'utiliser des réactifs doseurs dont les micro-particules ou micro-sphères présentent une λ max d'absorption pour au moins une de ces mêmes valeurs de lecture et plus généralement présentent un λ max compris entre 340 et 690 nanomètres. En pratique, compte tenu des appareils disponibles, on se limitera, la plupart du temps, à la plage comprise entre 340 et 450 nanomètres. En effet, la demande de brevet FR-A-2604526 a montré que si par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible en se plaçant à une longueur d'ondes qui correspond au λ max d'absorption des micro-sphères non aggLutinées, on effectue La lecture d'une solution contenant un mélange de micro-sphères ou micro-particules non agglutinées et un mélange d'agglutinats de celles-ci, la mesure effectuée ne concerne, et donc ne détecte, que les particules non agglutinées, car ces dernières sont Les seules à absorber à ce maximum.
Le maximum d'absorption λ max est donc une caractéristique des micro-sphères désagglutiπées, et cette caractéristique est directement reliée soit à la taille des particules, soit à Leur matière constituti e, soit à leur couleur.
Les investigations menées sur les micro-particules ou micro-sphères naturelles ou synthétiques actuellement disponibles, et notamment pour des micro-particules en polystyrène, ont permis de mettre en évidence que, pour des Longueurs d'ondes de Lecture couramment utilisées, la taille des micro-particules ou micro-sphères, susceptibles de présenter un λ max aux Longueurs d'onde de lecture des appareils de Lecture à micro-plaque, devait être comprise entre 0,4 et 0,7 micromètres d'une part, et entre 0,8 et 1, 2 micromètres d'autre part, pour Lire respectivement, par exemple, au voisinage de 340 nanomètres et 405 nanomètres. Les micro-particuLes ou micro-sphères d'un diamètre de 1 micromètre présentant, par exemple, un maximum d'absorption a une longueur d'onde de Lecture de 405 nanomètres exactement.
Pour des Longueurs d'onde de Lecture de 340 nanomètres, des micro-particules ou micro-sphères d'un diamètre de 0,5 à 0,6 micromètres en polystyrène, ou de 0,6 micromètre en vinyl butadiène conviennent également bien. Pour des longueurs d'ondes inférieures, des tailles comprises entre 0,1 et 0,5 micromètres conviennent également bien.
Pour une autre Longueur d'ondes de lecture par exemple 405 nanomètres, un diamètre de 0,9 à 1,2 micromètres convient également bien. L'ajustement du λ max d'une micro-sphère donnée sur une longueur d'onde imposée par l'appareil de lecture présente cependant une certaine tolérance, dans la mesure où i L a été noté que les micro-particules ou micro-sphères d'une taille donnée pouvait présenter un λ max variant de plus ou moins 5 nanomètres autour de La valeur affichée de lecture sans nuire significativement au résultat.
En résumé, il a été noté que des micro-sphères ou micro-particules synthétiques en polystyrène non colorées, d'un diamètre sensiblement égal à 0,1, 0,3, 0,3 à 0,7, 0,8 à 0,85, 1, 1,4 micromètres permettaient respectivement les lectures au voisinage de 300, 310, 320 à 350, 380, 405, 414, 420 et 450 nanomètres. Préférentiellement, quelque soit le matériau des micro-particules, le rapport λ. max du maximum d'absorption des d micro-particules sur Le diamètre moyen des micro-particules sera compris entre 0,4 et 0,8 et avantageusement sensiblement égal à 0,65. Ces données étant expérimentales, le rapport \ max peut, dans d certains cas et pour certains types de particules, être compris entre 0,3 et 1. Comme cela est également bien décrit dans la demande de brevet FR-A-2604526, il est possible de sélectionner les micro-sphères ou micro-particules sur leur caractéristique de couleur et, dans le cas présent, La couleur bleue s'est avérée donner de bons résultats au voisinage de 340 nanomètres. Avantageusement, des micro-particules ou micro-sphères en polystyrène bleu, d'un diamètre compris entre 0,4 et 0,7 micromètres, permettent une lecture entre 320 et 360 nanomètres.
Il s'est également révélé qu'avantageusement les micro-particules devaient présenter une forme sphérique, devaient être synthétiques, et choisies dans le groupe constitué par les polymères synthétiques de vinyl toluène, acrylo-nitri Le, styrène butadiène, dérivés acrylo-nitriles-acide acrylique, esters acryliques, silicones, vinyl butadiène et, de préférence, du polystyrène. Parmi ces matériaux, on préférera Les micro-particules contituées par des polymères de vinyl toluène, de styrène butadiène, de vinyl butadiène et de polystyrène.
La sélection des tailles ou couleurs de micro-particules ou micro-sphères utilisables étant effectuée, on greffe, de manière connue, une substance active immunologiquement, jouant le rôle d'agent doseur, sur lesdites micro-particules ou micro-sphères, en vue de constituer un réactif doseur.
Le procédé selon l'invention consiste, ensuite, à utiliser une micro-plaque standard pour les cultures de cellules ou, par exemple du type ELISA dont un exemple de réalisation est montré schématiquement aux fig. 1 et 2. Ces micro-plaques 1 se présentent généralement sous la forme d'un volume défini en forme de parallélépipède rectangle comportant une série de micro-cupules 2, de préférence, de forme cylindrique répartie régulièrement dans la masse de la micro-plaque 1. Les volumes définis par les micro-cupules sont également, de préférence, constants et égaux Les uns par rapport aux autres et présentent une ouverture, par exempLe circulaire, débouchant au niveau de la face supérieure 3 de la micro-plaque 1. Il est bien évident que d'autres formes de micro-cupules 2 sont envisageables. Ces plaques sont généralement réalisées en un matériau plastique transparent du genre polystyrène. De manière courante, les micro-plaques 1 comportent une série de huit rangées numérotées de A à H, réparties sur douze colonnes, ce qui conduit à des micro-plaques 1 comportant 96 micro-cupules. Le procédé selon l'invention présente La particularité d'effectuer le mélange du réactif doseur, contenant donc des micro-sphères synthétiques greffées, avec la pluralité des échantillons à doser (au préalable dilués de manière connue) directement dans chacun des volumes individualisés définis par les micro-cupules 2 de la micro-plaque 1. Chaque micro-cupule 2 est ainsi susceptible de contenir un mélange d'une quantité connue de réactif doseur, avec une quantité également connue d'échantillons à doser, sans avoir recours à des tubes de lecture.
De préférence, on réserve certaines micro-cupules, avantageusement trois rangées réparties sur neuf colonnes, pour constituer la gamme étalon de lecture.
Dans une réalisation particulièrement avantageuse de l'invention, les points de la gamme étalon 4 sont présents d'origine au fond des micro-cupules 2 qui Leur sont réservées, sous forme Lyophilisée et en quantité également pré-étalonnée. La tâche de L'utilisateur consi'ste simplement à reconstituer la gamme étalon d'une micro-plaque par simple réhydratation des micro-cupules 2 contenant les points de la gamme étalon 4. De manière surprenante, il a été en effet constaté que les points de gammes étalon 4 Lyophilisés déposés au fond d'une micro-cupule présentaient la particularité, d'abord de se répartir naturellement sous forme d'anneaux circulaires (fig. 2a) au fond des micro¬ cupules hydrophiles, puis en cas de choc mécanique ou de mouvement quelconque imparti à La micro-plaque, avaient une tendance naturelle à demeurer naturellement liés et fixés au fond de ladite micro-cupule. Inversement, les points de gamme étalon se répartissent naturellement sous forme de croissant (fig. 2) dans des micro-cupules hydrophobes. Même en cas de choc important ou de manipulation intempestive de la micro-plaque 1, y compris son retournement, les quantités de points de La gamme étalon ainsi déposées conservent constamment leur position au fond de La micro- cupule 2 et leur forme en croissant ou circulaire, et ce même si des quantités minimes de points de gamme étalon sont Lyophilisées. De la même façon, il peut être envisagé de prévoir, de manière préférentielle, de déposer, au fond de tout ou partie des micro-cupules restantes non occupées par les points de La gamme étalon 4, des quantités pré-étalonnées du réactif doseur sous forme deshydratée ou même Lyophilisée réparties en anneau ou en croissant. L'utilisateur n'a plus alors qu'à déposer au fond desdites micro-cupules les quantités requises de chacun des échantillons à doser.
Avantageusement, on prévoit un système de fermeture de la micro-plaque 1 qui peut, par exemple, consister en un opercule 5 maintenu par tout moyen connu de L'homme de l'art et, par exemple, par collage sur la face supérieure 3 de La micro-plaque. Par simple détachement de cet opercule 5, l'utilisateur obtient une micro-plaque prête à l'emploi.
Une fois réalisé Le mélange du réactif doseur avec la substance à doser, laquelle a été diluée de manière appropriée et de manière connue directement dans Les micro-cupules, et dès Lors que Les points de La gamme étalon ont été reconstitués par réhydratation dans les micro-cupules réservés à cette effet au sein de la micro-plaque, on procède à l'incubation desdits mélanges par agitation simultanée de La pluralité des mélanges en soumettant à agitation La micro-plaque elle-même.
Avantageusement, on soumet la micro-plaque 1 à un mouvement périodique de fréquence comprise entre 4 et 40 Hertz, de préférence compris entre 5 et 25 Hertz et avantageusement voisin de 16 ou 20 Hertz, et d'amplitude variant de quelques millimètres à quelques centimètres, de préférence de L'ordre de 4 millimètres. Ce mouvement périodique d'agitation a pour but de réaliser l'agglutination immunologique spécifique desdites micro-particules ou micro-sphères contenues dans chacun des milieux d'incubation présents dans chacune des micro-cupules. Pour réaliser cette agitation, on a recourt à des appareils d'agitation classique bien connus de l'homme de L'art. Après la phase d'agitation, on procède à l'aide d'une solution de blocage qui est introduite directement dans chacune des micro-cupules, au blocage de chacune des solutions. Après un temps de repos de l'ordre par exemple de 10 minutes, l'utilisateur peut aLors procéder à La Lecture directe de la pluralité des résultats de concentration relatifs à La pluralité des échantillons par introduction directe de La micro-plaque 1 dans un lecteur spectro-photométπ'que et automatique de micro-plaque. L'utilisateur doit cependant, au préalable, sélectionner
La Longueur d'onde de lecture de l'appareil sur une longueur d'onde de Lecture voisine du λ max caractéristique des micro-particules ou micro-sphères choisies en tant que réactifs doseurs.
L'appareil de Lecture par spectro-photométrie assure, ensuite, par lui-même de manière automatique et en un seul passage de la micro-plaque 1, la lecture individualisée de chacun des échantillons par émission de rayons optiques verticaux à travers chacune des micro-cupules 2 de La micro-plaque.
Le dispositif de mise en oeuvre du procédé selon L'invention doit, en conséquence, être constitué d'au moins une micro-plaque 1 dans laquelle' est ménagée une pluralité de micro-cupules 2, et comprendre un réactif doseur contenant des micro-particules ou micro-sphères greffées sur une substance active immunologiquement, aptes à jouer Le rôle d'agent doseur et susceptibles de présenter au moins un maximum d'absorption (λ max) pour au moins une longueur d'onde de lecture autorisée par un appareil de lecture automatique, du type spectro-photomètre. Ces micro-particules ou micro-sphères sont, bien évidemment, choisies en fonction des possibilités de lecture de l'appareil à utiliser, et leurs caractéristiques de matière constitutive, de taille et de couleurs correspondent à celles mentionnées précédemment. Une solution de blocage de la réaction d'agglutination, ainsi qu'une gamme étalon de la substance active immunologiquement doivent compléter le dispositif. De manière avantageuse, le dispositif de mise en oeuvre se présente sous La forme d'un coffret 6 (fig. 3) contenant au moins une et, de préférence, trois micro-plaques 1, chacune des micro-plaques possédant une gamme étalon 4 qui est déposée d'origine sous forme lyophilisée et pré-étalonnée au fond de 27 micro-cupules. Le coffret 6 présente, en outre, de manière préférentielle, des flacons d'une solution tampon 7 lyophilisée pour la dilution finale de l'échantillon. La solution tampon est reconstituée par simple réhydratation. Le coffret 6 peut, en outre, comporter des flacons d'une solution de blocage 8, ainsi que des tubes de sérum de contrôle 9, par exemple deux, et, enfin,' des tubes de réactifs 10 prêts à l'emploi pour le mélange des échantilions.
Dans le cas où les points de La gamme étalon 4 ne sont pas distribués au fond d'une série de micro-cupules, il est bien évidemment nécessaire de prévoir, dans le coffret 6, des flacons ou des tubes contenant Les points de la gamme étalon. De même, si le réactif destiné aux échantillons est distribué d'origine dans les micro-cupules, le coffret ne comprendra pas de tubes de réactif 10. A titre de variante, il est également envisageable, si La voie liquide est choisie, de'distribuer le réactif prêt à l'emploi d'origine au fond des micro-cupules, l'opercule de fermeture 5 assurant alors l'étanchéité de l'ensemble. Le procédé et le dispositif de mise en oeuvre qui ont été décrits permettent ainsi à l'utilisateur de disposer d'une technique de dosage et de lecture qui permet de réduire considérablement les temps de préparation et de manipulation, puisque la micro-plaque est prête à l'emploi et est apte à contenir les points de la gamme étalon et au besoin même le réactif doseur. En outre, Le mélange du réactif doseur et des échantillons à doser se faisant directement au sein des micro-cupules de la micro-plaque, il n'est plus nécessaire d'avoir recours à des séries de tubes supplémentaires, ce qui, une nouvelle fois, réduit le temps de manipulation. Le réactif doseur peut enfin, bien évidemment, êt re sous forme déshydratée ou lyophilisée et être présenté dans le coffret 6 dans des tubes ou flacons.
La technique utilisée est, par ailleurs, considérablement simplifiée, dans la mesure où la micro-plaque elle-même est utilisée en tant qu'élément support pour l'agitation conduisant à l'agglutination.
Enfin, la Lecture automatique de la concentration de chacun des échantillons au sein d'un appareil de lecture automatique permet à L'utilisateur d'obtenir, de manière quasi simultanée, les résultats de concentration pour un grand nombre d'échantilions.
Exemple de réalisation n_°_ 1 - Cas général : Le coffret destiné au dosage simultané d'une pluralité d'échantillons est livré avec trois micro-plaques, chaque micro-plaque comprenant 27 micro-cupules réservées aux points de gamme étalon réparties sur trois rangées, soit 9 points de gamme étalon en triple pré-lyophi lises. Les 69 autres micro-cupules de chaque plaque, soit au total 207 micro-cupules, sont vierges et disponibles pour l'incubation d'échantillons biologiques dilués. Toutes les distributions de fluide ou liquide peuvent se faire très rapidement à L'aide de pipettes multicanaux (8 canaux).
1) Distribution :
- l'utilisateur réhydrate simplement les micro-cupules de la gamme étalon, - l'utilisateur procède à la distribution des échantillons biologiques, dilués au préalable, dans les micro-cupules vierges, à raison par exemple de 10 microlitres par micro-cupules.
2) L'utilisateur procède ensuite à la distribution par des pipettes huit canaux du réacif prêt à l'emploi dans les micro-cupuLes, à raison par exemple de 20 microlitres de réactif.
3) L'ut lisateur procède ensuite à la phase d'incubation et d'agitation pendant, par exemple, 6 minutes à la température ambiante et aux fréquence et amplitude mentionnées précédemment dans la description.
4) Après la phase d'incubation, L'utilisateur distribue, par une pipette huit canaux, le liquide de blocage dans chacune des micro-cupules, à raison par exemple de 100 microlitres.
5) L'utilisateur n'a plus alors qu'à procéder à la lecture simultanée des 96 puits correspondant à chacune des micro-cupules en introduisant la micro-plaque dans un lecteur de micro-plaque, du type par exemple FL0W MCC 340.
Auparavant, l'utilisateur a, bien évidemment, sélectionné le filtre de lecture de l'appareil sur la Longueur d'ondes correspondant au maximum d'absorption caractéristique des micro-particules du réactif utilisé.
Il doit également être noté que l'appareil de vibration utilisé pour la phase d'incubation et d'agitation pouvant agiter quatre micro-plaques simultanément, il devient possible de doser très rapidement un grand nombre d'échantillons.
Exemple de réalisation n°_2 - Dosage d'albumine humaine : 1 ) Distribution des échantillons biologiques : On distribue, en duplicata, dans Les cupules vierges, 10 μl des échantillons biologiques dilués. Pour la distribution de 10 μl des échantillons dilués, on utilisera une micropipette de précision (pipettes à capillaire consei LLées) .
On veilLera à ne pas distribuer d'échantillon dans La colonne 12 de la micro-plaque. 2 ) Réhydratation de la gamme étalon :
A l'aide d'une pipette multicanaux de précision, on réhydrate successivement Les 3 colonnes de gamme de La micropLaque par 10 μl d'eau pour préparation injectable. Protocole : a) On injecte les 10 μl d'eau contre la paroi de la micro-cupule, juste au-dessus de L'anneau Lyophilisé, b) Pour une complète dissolution, on agite la plaque sur L'agitateur rotatif pendant 30 secondes à 1 400 trs/min. 3) Distribution du réactif B2 SPHEROTEST :
On vortexe vigoureusement Le réactif B2 M SPHEROTEST (1 min).
On dispose Le réactif vortexé dans une gouttière. A l'aide d'une pipette multicanaux de précision, on distribue, colonne par colonne, 30 μl de réactif dans toutes des colonnes, à l'exception de la colonne 12.
4) Incubation :
Pour effectuer la réaction immunologique, on agite la micro-plaque (agitateur rotatif) immédiatement après la distribution du réactif :
- durée : exactement 15 secondes
- Vitesse de rotation : 1.000 trs/min.
5) Blocage de la réaction :
On effectue successivement les deux manipulations suivantes :
. 1) Enlèvement de la micro-plaque de L'agitateur rotatif, puis, à l'aide d'une pipette multicanaux de précision, on distribue, colonne par colonne, 100 μl de solution de blocage dans toutes Les colonnes (y compris la colonne 12). . 2) Agitation (agitateur rotatif) de La micro-plaque ayant reçu la solution de blocage :
- Durée : exactement 30 secondes
- Vitesse de rotation : 600 trs/min. 6) Lecture du résultat :
On effectue la lecture de La micro-plaque à une longueur d'onde de Lecture de 340 nanomètres par exemple. N.B. : stabilité de la micro-plaque (sertie avec Le film adhésif) : 5 heures (4-8 ° C) une lecture effectuée au-delà de 5 heures (jusqu'à 8 heures) impose une réhomogénéisation de la micro-plaque (agitation 600 trs/min - 1 minute).
Exemple de réalisation n_°_3 : Dosage de la B2 microglobulaire humaine : On procède exactement comme pour l'exempLe n° 1 en veillant,, à distribuer 20 μl du réactif (étape 3), à incuber pendant 2 minutes à 1.000 trs/min (étape 4) et à agiter La micro-plaque pendant 2 minutes à 600 trs/min (étape 5).
Exemple de réalisation n°_ 4 : Dosage d'anti DNA natif : On procède comme pour l'exempLe n° 3 en veillant, à distribuer 20 μl d'échantillons biologiques (étape 1), et à réhydrater (étape 2) avec 20 μl d'eau.
Exemple de réalisation n°_ 5 : Dosage d'IgG onoclonales de souris : On effectue des manipulations identiques aux exemples 2 à
4 en distribuant 20 μl d'échantillons biologiques (étape 1) et en réhydratant (étape 2) Les micro-cupules avec 20 μl d'eau. La durée d'incubation (étape 4) est exactement de 15 secondes à 1.000 trs/min, la durée d'agitation de La phase de blocage (étape 5) étant de 4 minutes exactement à 600 trs/min.
L'invention n'est pas Limitée aux exemples décrits et représentés, car diverses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre. POSSIBILITE D'APPLICATION INDUSTRIELLE :
L'invention s'applique au dosage d'anticorps par des antigènes et inversement.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Procédé de dosage d'une substance d'intérêt clinique réactive immunologiquement par d'autres substances du même type, du genre dosage d'un antigène par un anticorps et réciproquement, du type dans lequel :
- on greffe préalablement une substance active immunologiquement, jouant Le rôle d'agent doseur, sur des micro-particuLes naturelles ou synthétiques pour constituer un réactif doseur,
- on détermine le maximum d'absorption de la lumière ultra-violet visible, soit d'une suspension en milieu liquide desdites micro-particuLes non agglutinées, soit du réactif doseur en suspension liquide, la détermination étant effectuée en faisant Le spectre d'absorption ultra-violet visible de l'une ou L'autre desdites suspension, la Longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption étant dénommée λ max,
- on mélange le réactif doseur avec la substance à doser diluée de façon appropriée et de manière connue,
- on incube ledit mélange, par agitation, pour réaliser l'agglutination îmmunologique desdites micro-particules dans le milieu d'incubation,
- on effectue ensuite La Lecture du résultat dans un appareil de lecture de type spectro-photomètre, par spectro-photométrie d'absorption ultra-violet visible, en se plaçant au vpisinage de Ladite Longueur d'onde λ max, - on calcule les concentrations de la substance à doser dans
L'échantillon, par comparaison avec Les résultats d'absorption ultra-violet visible mesurés à La même Longueur d'onde λ max obtenus, dans les mêmes conditions, sur une gamme étalon, caractérisé en ce que, en vue d'effectuer le dosage d'une pluralité d'échantillons en un seul passage dans l'appareil de lecture :
- on choisit préalablement, pour réaliser l'ensemble des opérations de dosage, un réactif doseur dont les micro-particules présentent au moins un λ max correspondant sensiblement à au moins une longueur d'onde de Lecture autorisée par l'appareil de lecture,
- on effectue les mélanges du réactif doseur avec La pluralité des échantillons à doser dilués de manière connue, dans une série du volumes individualisés, consistant en une série de micro-cupules ménagées dans une micro-plaque,
- on incube simultanément la totalité desdits mélanges en soumettant à agitation ladite micro-plaque.
- on effectue La Lecture de la pluralité des résultats par introduction de la micro-plaque dans un Lecteur spectro-photométrique et automatique de micro-plaque programmé sur une longueur d'ondes de lecture voisine du λ max caractéristique des micro-particules choisies,
2 - Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à distribuer les dilutions des échantillons à doser dans une série de micro-cupules appartenant à La même micro-plaque que les micro-cupules contenant les points de gamme étalon.
3 - Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste à reconstituer la gamme étalon d'une micro-plaque par simple réhydratation de micro-cupules contenant les points de gamme étalon (4) lyophilisés dans la micro-cupule.
4 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le réactif doseur est déshydraté ou lyophilisé dans les micro-cupules (2) de la micro-plaque (1). 5 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que Les micro-particules naturelles ou synthétiques utilisées présentent un maximum d'absorption ultra-violet visible (λ max) entre 300 et 690 nanomètres et, de préférence, entre 300 et 450 nanomètres, au voisinage des longueurs d'onde suivantes : 340 nm - 405 nm - 414 nm - 450 nm.
6 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la micro-plaque (1) utilisée est, soit une micro-plaque standardisée du type ELISA dont la fonction habituelle est de permettre la lecture d'une série de réactions colorimétriques, soit une micro-plaque de cultures de cellules. 7 - Procédé selon La revendication 1, caractérisé en ce que les micro-particules sont synthétiques et choisies dans le groupe constitué par des polymères synthétiques d'acrylonitriLe, par des dérivés acrylo-nitri les-acide acrylique, par des esters acryliques, par des silicones et de préférence parmi des polymères constitués de polystyrène, de vinyl toluène, de styrène butadiène et de vinyl butadiène, lesdites particules étant choisies parmi celles présentant un diamètre moyen compris entre 0,1 et 1,4 micromètres pour lire entre 300 et 450 nanomètres. 8 - Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les micro-particules sont choisies pour que le rapport λ_ max d du maximum d'absorption des micro-particules sur Le diamètre moyen des micro-particules soit compris entre 0,4 et 0,8 et soit, avantageusement, sensiblement égal à 0,65.
9 - Procédé selon La revendication 7, caractérisé en ce que Les micro-particules synthétiques sont des micro-particules de polystyrène de diamètre compris entre 0,4 et 0,7 micromètres et entre 0,8 et 1,2 micromètres pour lire respectivement au voisinage de 340 nm et 405 nm, ou de diamètre d'environ 0,1., 0,3, 0,8, 1 et 1,4 micromètres pour lire respectivement au voisinage de 300, 310, 380, 405 et 420 nanomètres.
10 - Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que, lors de l'incubation, on soumet la micro-pLaque à une fréquence d'agitation comprise entre 5 et 25 Hertz et, de préférence, proche de 16 à 20 Hertz.
11 - Dispositif de mise en oeuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 10, comportant : - au moins une micro-plaque (1) dans laquelle est ménagée une pluralité de micro-cupules (2) : - un réactif doseur comprenant des micro-particules greffées sur une substance active immunologiquement et susceptibles de présenter au moins un maximum d'absorption (λ max) pour au moins une Longueur d'onde de Lecture autorisée par un appareil de Lecture automatique, du type spectro-photomètre,
- une solution de blocage de La réaction d'agglutination,
- une gamme étalon (4) de la substance active i munologiquement.
12 - Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que la gamme étalon (4) est constituée d'une série de points de gamme Lyophilisés pré-déposés d'origine au fond des micro-cupules (2) en quantité pré-étalonnées, Les points de gamme étant prêts à L'emploi après réhydratation.
13 - Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que le réactif doseur et La gamme étalon sont liquides ou lyophilisés et conservés en flacons (7, 8).
14 - Dispositif selon La revendication 11, caractérisé en ce que le réactif doseur est liquide et pré-déposé dans Les micro-cupules, lesquelles sont recouvertes d'une opercule de fermeture (5). 15 - Dispositif selon La revendication 11, caractérisé en ce que le réactif doseur est déshydraté ou Lyophilisé et pré-déposé à l'origine en quantité constante et prête à l'emploi par réhydratation au fond d'une série de micro-cupules.
16 - Dispositif selon Les revendications 12 et 15, caractérisé en ce que les points de gamme étalon (4) et Le réactif doseur sont répartis en anneau ou en croissant au fond des micro-particules (2).
17 - Dispositif selon La revendication 11, caractérisé en ce que La micro-plaque (1) est munie d'une opercule de fermeture (5) étanche et déchirable apte à fermer Les micro-cupules.
18 - Dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que Le réactif doseur contient des micro-particules qui présentent au moins un maximum d'absorption (λ max) entre 300 et 690 nanomètres et, de préférence, au voisinage des longueurs d'ondes suivantes : 340, 405, 414, 450, 492, 540 nanomètres. 19 - Coffret (6) destiné au dosage simultané d'une pluralité d'échantillons comprenant un dispositif conforme aux revendications 10 à 18.
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