Verfahren zum Nachweis und zur Identifikation toxischer Substanzen mit Hilfe klonierter Mikroorganismen Methods for the detection and identification of toxic substances using cloned microorganisms
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis toxischer Substanzen in einer flüssigen oder gasförmigen Umgebung mit Hilfe spezifisch sensitiver und/oder resistenter Mikroorga¬ nismen-Stämme, welcheThe invention relates to a method for the detection of toxic substances in a liquid or gaseous environment with the help of specifically sensitive and / or resistant microorganism strains which
1. natürlicherweise vorkommen,1. occur naturally,
2. durch wiederholte Labor-Selektion an bestimmte toxische Substanzen adaptiert oder2. adapted to certain toxic substances by repeated laboratory selection or
3. durch molekulare Klonierung mit bestimmten Eigenschaften ausgestattet worden sind.3. have been given certain properties by molecular cloning.
Dabei sind alle Mikroorganismen durch Einführen eines plas- mid-enkodierten Luciferase-Gens zur Emission von Licht (Bio¬ lumineszenz) befähigt. Die Biolumineszenz der Indikatororga¬ nismen ermöglicht, schnell und mit großer E pfindlicheit Än¬ derungen in ihrem Metabolismus oder den Verlust ihrer Le¬ bensfähigkeit als Auswirkung einer toxischen Substanz im Testmedium zu erfassen.All microorganisms are capable of emitting light (bio-luminescence) by introducing a plasmid-encoded luciferase gene. The bioluminescence of the indicator organisms enables changes in their metabolism or the loss of their viability as an effect of a toxic substance in the test medium to be detected quickly and with great sensitivity.
Be s chre ibung- tz> e r <***** i -b s b l- amn- ier Me ß ¬ ve rf ahren mit H uf e von Mikroorgan i s ¬ menDescribe ibung- tz> er < **** * i -bsb l- amn- ier Me ß ¬ ve rf ehr with heaps of microorganisms
Die Verwendung von Mikroorganismen zur Messung kritischer Be¬ lastungen durch toxische Substanzen (US-PS 3 981 777) sowie zur Bestimmung von Antibiotika-Konzentrationen (EP. No. 0200 226) ist etabliert. Bei den Anwendungen liegt die Erfas¬ sung des Wachstums der Test-Organismen durch Auszählen von Kolonien, Trübungsmessungen, Nephelometrie etc. zugrunde. Diese Meßverfahren erfordern die Kultivierung großer Mengen von Mikroorganismen, so daß verläßliche Messungen erst nach
einem Zeitraum von 16 bis 72 Stunden durchgeführt werden kön¬ nen. Demgegenüber erlaubt das im folgenden beschriebene Ver¬ fahren die Auswertung von Meßergebnissen bereits nach weni¬ ger als 2 Stunden.The use of microorganisms for measuring critical loads caused by toxic substances (US Pat. No. 3,981,777) and for determining antibiotic concentrations (EP. No. 0200 226) has been established. The applications are based on the detection of the growth of the test organisms by counting colonies, turbidity measurements, nephelometry, etc. These measuring methods require the cultivation of large amounts of microorganisms, so that reliable measurements are only possible after can be carried out over a period of 16 to 72 hours. In contrast, the method described below allows the evaluation of measurement results after less than 2 hours.
Natürlich vorkommende zur Biolumineszenz fähige Mikroorga¬ nismen sind nach Resistenz-Adaption im Labor zum Nachweis bestimmter Toxine eingesetzt worden (PCT/US84/01217) ; dieses Verfahren weist jedoch einige Nachteile auf, welche einen ge¬ nerellen Einsatz dieser Methode nicht erwarten lassen:Naturally occurring microorganisms capable of bioluminescence have been used for resistance detection in the laboratory to detect certain toxins (PCT / US84 / 01217); However, this method has some disadvantages which cannot be expected from the general use of this method:
1. Natürlich vorkommende biolumineszierende Mikroorganismen sind marinen Ursprungs und benötigen deshalb eine hohe Ionenstärke im Testmedium. Die Herstellung der erforder¬ lichen Osmolarität bedeutet einen möglicherweise verfäl¬ schenden Eingriff in die Messung.1. Naturally occurring bioluminescent microorganisms are of marine origin and therefore require a high ionic strength in the test medium. The production of the required osmolarity means a possibly falsifying intervention in the measurement.
2. Die Adaption dieser Mikroorganismen an bestimmte Substan¬ zen durch wiederholte Selektion im Labor ist aufgrund der statistischen Seltenheit eines nützlichen Mutations¬ ereignisses sehr zeitaufwendig, oder2. Because of the statistical rarity of a useful mutation event, the adaptation of these microorganisms to specific substances by repeated selection in the laboratory is very time-consuming, or
3. sogar unmöglich.3. even impossible.
4. Die Verwendung von natürlicherweise biolumineszierenden Bakterien schließt die Anwendung des Meßprinzips für etablierte und international standardisierte Tests aus, die den Gebrauch eines definierten Bakterienstammes vor¬ schreiben.4. The use of naturally bioluminescent bacteria precludes the use of the measuring principle for established and internationally standardized tests which prescribe the use of a defined bacterial strain.
Beschreibunσ der E findungDescription of the invention
Die hier beschriebene Erfindung macht sich die Methoden ex-
perimenteller Genetik zunutze, um prinzipiell jeden gewünsch¬ ten Bakterienstamm durch Einführung eines speziell konstru¬ ierten Plasmid-Vektors (pGL3, s.u.) in einen zur Biolumines¬ zenz befähigten Organismus zu verwandeln. Während das Prin¬ zip der Transformation eines Bakterienstammes mit einem plas- id-enkodierten Luciferase LUX-Gen bereits beschrieben wur¬ de (US-PS 4 581 335), stellt die vorliegende Erfindung eine entscheidende Verbesserung dar: Die Expression des LUX-Gens und damit die Fähigkeit zur Biolumineszenz ist nicht mehr permanent (konstitutiv) , sondern in einer temperaturabhängi¬ gen Art und Weise an- und abschaltbar. Die Eigenschaft der Regulierbarkeit wird durch Konstruktion eines Plasmid-Vek¬ tors erreicht, der sowohl den Luciferase-Gen-Komplex von Vi- • brio Harveyi (LUX-Gene A und B), als auch das CIg57-Allel des Phagen Lambda Repressorgens (thermolabiles Genprodukt1 ) enthält. Die durch diese Konzeption erreichte induzierbare Biolumineszenz hat verglichen mit permanent Licht emittieren¬ den Testorganismen zwei wichtige Vorteile:The invention described here makes the methods ex- use experimental genetics to transform in principle any desired bacterial strain by introducing a specially constructed plasmid vector (pGL3, see below) into an organism capable of bioluminescence. While the principle of transforming a bacterial strain with a plasmid-encoded luciferase LUX gene has already been described (US Pat. No. 4,581,335), the present invention represents a decisive improvement: the expression of the LUX gene and the ability to bioluminescence is no longer permanent (constitutive), but can be switched on and off in a temperature-dependent manner. The feature of adjustability is achieved by construction of a plasmid Vek¬ catalyst which both the luciferase gene complex of Vi • brio harveyi (lux genes A and B), and the C allele Ig57 of phage lambda repressor gene ( contains thermolabile gene product1). The inducible bioluminescence achieved by this concept has two important advantages compared to permanently light-emitting test organisms:
1. Das Signal- zu Rauschverhältnis der Einzelmessung wird verbessert.1. The signal to noise ratio of the individual measurement is improved.
2. Der für das Bakterium energetisch aufwendige Prozeß der Lichtemission kann auf den kurzen Meßzeitraum beschränkt werden; dies hat zur Folge, daß auch schlecht wachsende Organismen eingesetzt werden können, die durch permanente Biolumineszenz in ihrem Wachstum besonders beeinträchtigt würden, für Tests aber gerade aufgrund ihrer hohen Empfind¬ lichkeit interessant sind.2. The process of light emission, which is energy-intensive for the bacterium, can be limited to the short measuring period; the consequence of this is that poorly growing organisms can also be used, the growth of which would be particularly impaired by permanent bioluminescence, but are interesting for tests precisely because of their high sensitivity.
Ein weiteres Charakteristiku der erfindungsgemäßen Entwick¬ lung ist die Möglichkeit zur Einführung von zusätzlicher Re¬ sistenz- oder Hypersensitivität gegenüber spezifischen Toxi-
nen vermittelnden Genen in den skizzierten Plasmid-Vektor; dies wird durch molekulare Klonierung eines entsprechenden Gens in vorhandene spezifische Restriktions-Endonuklease- Schnittstellen ermöglicht.Another characteristic of the development according to the invention is the possibility of introducing additional resistance or hypersensitivity to specific toxic mediating genes in the plasmid vector outlined; this is made possible by molecular cloning of a corresponding gene into existing specific restriction endonuclease sites.
Bisher wurde die Einführung verschiedener Antibiotika-Resi¬ stenzgene (z.B. Tetrazvklin) in Plasmid pGL3 erfolgreich durchgeführt. Mikroorganismen, die mit Genen ausgestattet sind, welche eine a priori festgelegte, spezifische Reaktivi¬ tät gegenüber einer toxischen Substanz aufweisen (z.B. Resi¬ stenz gegenüber dem Antibiotikum Tetrazvklin) , können schlie߬ lich zur Identifikation und Konzentrationsabschätzung der fraglichen Substanz im Testmedium eingesetzt werden.So far, various antibiotic resistance genes (e.g. tetrazvklin) have been successfully introduced into plasmid pGL3. Microorganisms that are equipped with genes that have an a priori defined, specific reactivity to a toxic substance (e.g. resistance to the antibiotic tetrazvklin) can finally be used to identify and estimate the concentration of the substance in question in the test medium.
Weitere Vorteile der hier vorgestellten Entwicklung sind, daßFurther advantages of the development presented here are that
1. Meßergebnisse mit etwa zehnfach geringerem Zeitaufwand als durch konventionelle mikrobiologische Kultivierungs- und Meßmethoden zustande kommen und1. Measurement results take about ten times less time than conventional microbiological cultivation and measurement methods and
2. prinzipiell jeder geeignete, empfohlene oder in standar¬ disierten Referenztests vorgeschriebene Bakterienstamm für Biolumineszenz-Messungen eingerichtet werden kann.2. In principle, any suitable, recommended or prescribed in standardized reference tests bacterial strain for bioluminescence measurements can be set up.
Als Beispiel eines Bakterienstammes, der zu letzterer Katego¬ rie zählt, sei E.coli ATCC 25922 angeführt; dieser Stamm ist der offizielle (WHO) Referenzstamm für standardisierte Anti¬ biotika-Hemmhoftests. E. coli ATCC 25922 und andere in klini¬ schen und industriellen Tests häufig eingesetzten Stämme (E. coli K- und B; chi 1776 etc.) sind von der Anmelderin durch Einführung des Plasmids pGL3 erfolgreich in zur Biolumines¬ zenz fähige Spezies überführt worden.E.coli ATCC 25922 may be mentioned as an example of a bacterial strain which belongs to the latter category; this strain is the official (WHO) reference strain for standardized antibiotic inhibition tests. E. coli ATCC 25922 and other strains frequently used in clinical and industrial tests (E. coli K- and B; chi 1776 etc.) have been successfully converted by the applicant into the species capable of bioluminescence by introducing the plasmid pGL3 .
Zusammenfassend ist festzustellen, daß die hier vorgestellte
Toxizitäts-Testung vermittels Licht emittierender Mikroorga¬ nismen gegenüber herkömmlichen Meßmethoden eine Weiterent¬ wicklung darstellt, welche die folgenden Vorteile in sich ver¬ eint:In summary, it should be noted that the one presented here Toxicity testing by means of light-emitting microorganisms is a further development compared to conventional measuring methods, which combines the following advantages:
1. Biologische Relevanz.1. Biological relevance.
2. Hohe Geschwindigkeit.2. High speed.
3. Bei geeigneter Konstruktion des Klonierungs-Vektors Spezi- fität gegenüber bestimmten Substanzen und dadurch die Mög¬ lichkeit zu deren Identifikation und Konzentrationsab¬ schätzung.3. With a suitable construction of the cloning vector, specificity towards certain substances and thereby the possibility of their identification and concentration estimation.
4. Jede durch das LUX-Plasmid tranεformierbare Spezies ist als Indikator-Organismus einsetzbar, was eine erhebliche Ausweitung möglicher Anwendung bedeutet.4. Any species that can be transformed by the LUX plasmid can be used as an indicator organism, which means a considerable expansion of possible use.
5. Biolumineszenz-Messungen sind mit geringem apparativen Aufwand durchzuführen, deshalb kostengünstig und5. Bioluminescence measurements can be carried out with little equipment, therefore inexpensive and
6. unter "Feldbedingungen", d.h. dezentral, durchzuführen.6. under "field conditions", i.e. decentralized.
Funktionsweise -von. Plasmid pGL3 im Vergleich mit LUX-Genkonstruktionen des Standes der TechnikHow it works -from. Plasmid pGL3 in comparison with LUX gene constructions of the prior art
Die molekulare Klonierung der LUX-Genkomplexe verschiedener mariner Bakterien sowie deren Transfer in normalerweise nicht zur Biolumineszenz befähigte Mikroorganismen ist sowohl in der wissenschaftlichen als auch in der Patentliteratur beschrie¬ ben (US-PS 4 581 335; EP 0168933). Bei diesen Dokumentationen handelt sich um Plasmid-Vektoren, die LUX-Gene entweder kon-
stitutiv durch ihren ursprünglichen Promotor oder unter Kon¬ trolle des Beta-Galaktosidase-(lac Z-) Gen Promotors von E. coli exprimieren. Plasmid pGL3 hingegenThe molecular cloning of the LUX gene complexes of various marine bacteria and their transfer into microorganisms which are normally not capable of bioluminescence is described both in the scientific and in the patent literature (US Pat. No. 4,581,335; EP 0168933). These documentations are plasmid vectors that either LUX genes expressed expressively by their original promoter or under the control of the beta-galactosidase (lac Z) gene promoter from E. coli. However, plasmid pGL3
1. transkribiert den Luciferase-Genkomplex unter der Kon¬ trolle des P^-Promotors des Phagen Lambda,1. transcribes the luciferase gene complex under the control of the P ^ promoter of phage lambda,
2. enkodiert gleichzeitig das C^-Repressorgen des Phagen- Lambda, dessen Genprodukt der sog. Lambda-Repressor, den Ppj.-Promotor negativ reguliert,2. at the same time encodes the C ^ repressor gene of the phage lambda, the gene product of which is known as the lambda repressor, negatively regulates the P pj . Promoter,
3. die Regulation erfolgt durch Verwendung des Allels 857 des Lambda-Repressors in temperaturabhängiger Weise.3. The regulation takes place by using the allele 857 of the lambda repressor in a temperature-dependent manner.
Durch Erhöhung der Temperatur auf über 37°C wird das Repres- sorprotein inaktiviert, der LUX-Genkomplex zur Transkription in mRNA freigegeben, woraus schließlich eine um mehr als drei Zehnerpotenzen erhöhte Biolumineszenz-Aktivität des Indika- tororganismus resultiert. Der Unterschied in der Größe des Biolumineszenzsignals zwischen reprimiertem und transkri¬ biertem Zustand des LUX-Genkomplexes - und damit das Signal- zu Rauschen-Verhältnis der Messungen - ist bei Testorganis¬ men, die mit pGL3 ausgestattet sind, um mehr als eine Zehner¬ potenz besser als bei solchen, welche durch chemische Induk¬ tion des lacZ-Gens zur Biolumineszenz angeregt werden (vgl. US-PS 4 581 335). Der Grund für diese Eigenschaft von pGL3 liegt darin, daß der Lambda P„-,-Promotor, der die Expression der LUX-Gene reguliert, einerseits einen der stärksten, in E. coli funktionstüchtigen, prokaryontischen Promotoren dar¬ stellt, zum anderen aber im repri ierten Zustand etwa eine Zehnerpotenz "dichter" geschlossen ist als alle bisher be¬ kannten bakterieneigenen Promotoren. Diese fast absolute Un¬ terdrückung der Biolumineszenz durch pGL3 im reprimierten
Zustand der LUX-Gene, d.h. bei Inkubationen unter 35°C, ist eine wichtige Voraussetzung, auch sehr fragile Mikroorganis¬ men für Biolumineszenzmessungen einzusetzen: Der das ohnehin mäßige Wachstum solcher Bakterien durch zusätzlichen Energie¬ verbrauch stark beeinträchtigende Prozeß der Biolumineszenz kann so auf den kurzen MeßZeitraum eingeschränkt werden.By increasing the temperature to above 37 ° C, the repressor protein is inactivated and the LUX gene complex is released for transcription in mRNA, which ultimately results in an increase in the bioluminescence activity of the indicator organism by more than three orders of magnitude. The difference in the size of the bioluminescence signal between the repressed and transcribed state of the LUX gene complex - and thus the signal-to-noise ratio of the measurements - is more than a factor of ten in test organisms equipped with pGL3 better than those which are induced to bioluminescence by chemical induction of the lacZ gene (cf. US Pat. No. 4,581,335). The reason for this property of pGL3 is that the lambda P "-, - promoter, which regulates the expression of the LUX genes, is on the one hand one of the strongest prokaryotic promoters that are functional in E. coli, but on the other hand in represented state is about a power of ten "more densely" closed than all previously known bacterial promoters. This almost absolute suppression of bioluminescence by pGL3 in the repressed The condition of the LUX genes, ie in the case of incubations below 35 ° C., is an important prerequisite for using even very fragile microorganisms for bioluminescence measurements short measurement period.
Beschreibung einzelner Aspekte <_-{&--- Ent icklunqDescription of individual aspects <_- {& --- Ent icklunq
I. Konstruktion des Plasmid-Vektors pGL3I. Construction of plasmid vector pGL3
Das für die Erzeugung regulierbarer Biolumineszenz in Mikroor¬ ganismen konzipierte Plasmid pGL3 wurde durch Anwendung gängi¬ ger molekularbiologischer Klonierungstechniken konstruiert; es enthält:The plasmid pGL3, which was designed for the generation of controllable bioluminescence in microorganisms, was constructed by using conventional molecular biological cloning techniques; it contains:
1. den Luciferase-Genkomplex (LUX A; LUX B) von Vibrio Harvey1. the Luciferase gene complex (LUX A; LUX B) from Vibrio Harvey
2. den PL-Promotor des Bakteriophagen Lambda,2. the PL promoter of the bacteriophage lambda,
3. das Lambda CIg57-Repressorgen unter Kontrolle des3. the Lambda C Ig57 repressor gene under the control of
4. P_-Promotors des Bakteriophagen Lambda,4. P_ promoter of bacteriophage lambda,
5. ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum Ampicillin,5. a resistance gene against the antibiotic ampicillin,
6. incl. seines Promotors und6. incl. Its promoter and
7. eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease Pst 1.7. an interface for the restriction endonuclease Pst 1.
Der LUX-Genkomplex ist 3', d.h. "hinter" den P-j.-Promotor klo- niert und wird deshalb von diesem transkribiert; der P R_M..-Pro-
motor seinerseits wird negativ vom Genprodukt des C--Gens - dem Lambda-Repressor - kontrolliert; dieser Lambda-Repressor wird zwar durch konstitutive Expression des P_-abhängigen Cχ-Gens immer in ausreichender Menge synthetisiert, ist aber durch Verwendung des CIg57-Allels hitzelabil. So bleibt der P_M-Promotor durch Bindung des Repressors solange blockiert, bis durch 5- bis 15minütige Temperaturerhöhung auf 37° bis 42°C das Repressor-Protein denaturiert wird und vom P_-.-Pro- motor abfällt. An den freien Promotor bindet dann die DNA- abhängige RNA-Polymerase und bewirkt die massive Transkrip- , tion des LUX-Genkomplexes. Insgesamt führt diese Konstruktion von pGL3 zu einer regulierbaren, da temperaturabhängigen Syn¬ these des Enzyms Luciferaεe, welches für die Biolumineszenz der Indikatororganismen verantwortlich ist.The LUX-gene complex is 3 ', ie "behind" promoter. J the P Loo defined and is therefore transcribed therefrom; the P R_M ..- pro- For its part, motor is negatively controlled by the gene product of the C gene - the lambda repressor; Although this lambda repressor is always synthesized in sufficient quantity by constitutive expression of the P_-dependent C χ gene, it is heat-labile by using the C Ig57 allele. The P_ M promoter remains blocked by binding the repressor until the repressor protein is denatured by increasing the temperature to 37 ° to 42 ° C for 5 to 15 minutes and the P _-.- promotor falls off. The DNA-dependent RNA polymerase then binds to the free promoter and causes the massive transcription of the LUX gene complex. Overall, this construction of pGL3 leads to an adjustable, since temperature-dependent synthesis of the enzyme luciferase, which is responsible for the bioluminescence of the indicator organisms.
Die Konstruktionsbasis von pGL3 ist das Plasmid pLK915 (s. K. K. Stanley, und J. P. Luzio, EMBO J. 3: 1429 bis 1434, 1984). In die Barn Hl Restriktions-Schnittstelle von pLK915 wurde ein 3,1 Kilobasenpaare großes Sal 1-Bam Hl Restrik¬ tionsfragment aus dem Genom von Vibrio Harveyi, das den kom¬ pletten Luciferase-Genkomplex (allerdings ohne Promotor) ent¬ hält, durch molekulare Klonierung eingefügt; Kompatibilität der Sal 1 Schnittstelle mit Bam Hl wurde durch vorheriges An- ligieren des 45 Basenpaare langen Bam Hl - Sal 1- Restrik¬ tionsfragments aus der Polylinkerregion des Plasmides "pBlue- script" (Firma "STRATAGENE"; San Diego, Cal., USA) an das Sal 1-Ende und anschließender Restriktionsspaltung mit dem Enzym Bam Hl hergestellt. Zuletzt wurde ein Oleonukleotid mit der Länge von 16 Basenpaaren, welches Translationε-Stoppsi- gnale in allen 3 Leserastern enthält (Firma Pharmazia, Schwe¬ den), in die Sma 1-Schnittstelle des Bam Hl-Sal 1 Polylinker- Fragments einkloniert, um jegliche Proteintranslation ober¬ halb, d.h. 5', des LUX-Genkomplexes auszuschließen.
II. Herstellung, Aufbewahrung und Handhabung transformierter MikroorganismenThe construction base of pGL3 is the plasmid pLK915 (see KK Stanley, and JP Luzio, EMBO J. 3: 1429 to 1434, 1984). A 3.1 kilobase pair Sal 1-Bam HI restriction fragment from the genome of Vibrio Harveyi, which contains the complete luciferase gene complex (but without a promoter), was inserted into the Barn HI restriction site of pLK915 by molecular means Cloning inserted; Compatibility of the Sal 1 interface with Bam Hl was determined by previously attaching the 45 base pair long Bam Hl - Sal 1 restriction fragment from the polylinker region of the plasmid "pBluescript" (company "STRATAGENE"; San Diego, Cal., USA ) at the Sal 1 end and subsequent restriction cleavage with the enzyme Bam HI. Finally, an oleonucleotide with the length of 16 base pairs, which contains translation stop signals in all 3 reading frames (company Pharmazia, Sweden), was cloned into the Sma 1 site of the Bam HI-Sal 1 polylinker fragment in order to avoid any Exclude protein translation above, ie 5 ', of the LUX gene complex. II. Production, storage and handling of transformed microorganisms
Das oben beschriebene Plasmid pGL3 kann durch Standardtech¬ niken in prinzipiell jede gewünschte Spezies von Mikroorganis¬ men eingeführt werden, um schließlich in großen Mengen kul¬ tiviert zu werden. Es ist möglich, Bakterien als Glycerin¬ Kulturen bei -20°C oder nach Gefriertrocknung bei Umgebungs¬ temperatur aufzubewahren. Die Gefriertrocknung wird entweder in Glasampullen oder speziell angefertigten Kunststoffbehäl¬ tern durchgeführt, die z.B. in zwei voneinander abgetrennten Kammern die lyophilisierten Mikroorganismen bzw. die Kompo¬ nenten für das zur Revitalisierung der Bakterien notwendige . Nährmedium enthalten. Um Messungen toxischer Substanzen in einer Gasphase durchzuführen, ist die permanente Trennung der Indikatororganiεmen von einem Meßkompartiment durch eine für Wasserdampf impermeable Membran vorgesehen. Auf diese Weise wird die konstante Zusammensetzung des Wachstumsmediums und damit auch die Messung über eine längere Meßperiode, wie für Toxizitättests von Gasen erforderlich, gewährleistet.The above-described plasmid pGL3 can in principle be introduced into any desired species of microorganism by standard techniques in order finally to be cultured in large quantities. It is possible to store bacteria as glycerol cultures at -20 ° C or after freeze-drying at ambient temperature. Freeze-drying is carried out either in glass ampoules or in specially made plastic containers, e.g. in two separate chambers the lyophilized microorganisms or the components necessary for the revitalization of the bacteria. Contain nutrient medium. In order to carry out measurements of toxic substances in a gas phase, the indicator organisms are permanently separated from a measuring compartment by a membrane impermeable to water vapor. In this way, the constant composition of the growth medium and thus the measurement over a longer measurement period, as required for toxicity tests of gases, is ensured.
III. Anwendung des VerfahrensIII. Application of the procedure
Um das beschriebene Biolumineszenz-Toxizitätsmeßverfahren de¬ zentral einsetzen und automatisieren zu können, ist das Auf¬ bringen der lyophilisierten Indikatororganismen auf ein geeig¬ netes Trägermaterial in Form eines Teststreifens eine bevor¬ zugte Anwendungsform. Bei diesem Verfahren werden die Mikroor¬ ganismen in definierter Menge auf die Trägermatrix aufgebracht, durch ein Spezialverfahren fixiert, gefriergetrocknet und schließlich als Teststreifen versiegelt. Vor der Durchführung der Biolumineszenz-Tests werden die Indikatorbakterien durch ein- bis zweistündige Inkubation in wässerigem Nährmedium bei
Umgebungstemperatur revitalisiert.In order to be able to use and automate the described bioluminescence toxicity measurement process centrally, the application of the lyophilized indicator organisms to a suitable carrier material in the form of a test strip is a preferred form of application. In this process, the microorganisms are applied to the carrier matrix in a defined amount, fixed by a special process, freeze-dried and finally sealed as a test strip. Before carrying out the bioluminescence tests, the indicator bacteria are incubated for one to two hours in aqueous nutrient medium Ambient temperature revitalized.
Das Meßprinzip der hier beschriebenen Toxizitätstestung be¬ ruht auf der Anwendung eines Zweischritt-Verfahrens:The measuring principle of the toxicity test described here is based on the use of a two-step method:
Zunächst wird ein "screening" mit einer Reihe verschiedener Testorganismen definierter Empfindlichkeit zum Nachweis gene¬ reller Toxizität in einer Probe durchgeführt. Danach können weitere Nachweisreakionen mit Stämmen, die mit einer bestimm¬ ten, genetisch vorhandenen bzw. durch Transformation eingeführ¬ ten Eigenschaft der Resistenz bzw. (Hyper-)Sensitivität aus¬ gestattet sind, durchgeführt werden. Ein Toxin, gegen .das ein Stamm spezifisch resistent ist, wird bei diesem zu einem nicht- oder nur partiell reduzierten Biolumineszenz-Signal führen; demgegenüber ist ein nicht resistenter Kontrollstamm gravierender in seiner Lebensfähigkeit und, damit korreliert, der Fähigkeit zur Biolumineszenz beeinträchtigt. Das Meßver¬ fahren gemäß der Erfindung ist also einerseits dazu geeignet, das Maß generell vorhandener Toxizität einer Probe durch das Wachstumsverhalten von Mikroorganismen zu erfassen, anderer¬ seits ist es darüber hinaus möglich, alle Substanzen, gegen¬ über welchen eine spezifische Reaktivität bestimmter Testor- ganismen besteht, zu identifizieren und deren Konzentration näherungsweise einfach und schnell zu bestimmen.First, a "screening" is carried out with a number of different test organisms of defined sensitivity for the detection of general toxicity in a sample. Thereafter, further detection reactions can be carried out with strains which are provided with a specific, genetically present or introduced by transformation property of resistance or (hyper) sensitivity. A toxin to which a strain is specifically resistant will lead to an un or only partially reduced bioluminescence signal; in contrast, a non-resistant control strain is more serious in its viability and, correlated with it, its ability to bioluminescence. The measuring method according to the invention is therefore suitable on the one hand for determining the degree of generally present toxicity of a sample through the growth behavior of microorganisms, and on the other hand it is also possible to use all substances with which a specific reactivity of certain test agents ganisms exists to identify and determine their concentration approximately easily and quickly.
IV. Durchführung eines ToxizitätstestsIV. Carrying out a toxicity test
IV. 1 Nachweis genereller Toxizität in einer wässerigen Pro¬ be mit Hilfe verschieden sensitiver IndikatorstämmeIV. 1 Detection of general toxicity in an aqueous sample using different sensitive indicator strains
Ein Aliquot (0,01 bis 1 ml) einer Suspension je eines Indika¬ torstammes in flüssigem Nährmedium wird mit dem gleichen Vo- lumen (etwa 10 3 bis 107 Zellen) der zu testenden Probeflüs-
sigkeit versetzt, gemischt und 1 bis 60 min bei 10° bis 34°C inkubiert. Danach wird durch 5- bis 15minütige Erwärmung der Probe auf 37° bis 42°C die Transkription des LUX-Genkomplexes und dadurch die Biolumineszenz in den Mikroorganismen initi¬ iert. Die Messung der Lichtsignale erfolgt in einem geeigne¬ ten Lumineszenz-Photometer entweder als Endpunkt- oder als kontinuierliche Messung über einen Zeitraum von 1 bis 60 Mi¬ nuten. Das Maß genereller Toxizität in einer Testflüssigkeit wird bestimmt durch das abnehmende Biolumineszenz-Meßsignal verschiedener Indikatorstämme im Vergleich untereinander wie mit einer Kontrolle, deren Nährmedium keine Probenflüssigkeit zugesetzt wurde.An aliquot (0.01 to 1 ml) of a suspension of each indicator strain in liquid nutrient medium is mixed with the same volume (about 10 3 to 107 cells) of the sample flow to be tested. added, mixed and incubated for 1 to 60 min at 10 ° to 34 ° C. Thereafter, the transcription of the LUX gene complex and thereby the bioluminescence in the microorganisms is initiated by heating the sample to 37 ° to 42 ° C. for 5 to 15 minutes. The light signals are measured in a suitable luminescence photometer either as an end point or as a continuous measurement over a period of 1 to 60 minutes. The degree of general toxicity in a test liquid is determined by the decreasing bioluminescence measurement signal of different indicator strains in comparison with one another as with a control, the nutrient medium of which no sample liquid was added.
IV. 2 Identifikation spezifischer SubstanzenIV. 2 Identification of specific substances
Wie unter IV. 1 beschrieben, werden Indikator-Organismen - diesmal jedoch ausgestattet mit spezifischer Resistenz oder Sensitivität gegenüber bestimmten toxischen Substanzen - mit der Probenflüssigkeit inkubiert, um schließlich Biolumineszenz- Mesεungen durchzuführen. Ist das Biolumineszenz-Signal nur bei einem der Testorganismen unverändert, etwa in der Höhe des Kontrollwertes," -während alle anderen Mikroorganismen eine Reduktion meßbarer Biolumineszenz erfahren, εo iεt jenes To¬ xin, gegen welches der betreffende Stamm resistent ist, iden¬ tifiziert.As described under IV.1, indicator organisms - this time endowed with specific resistance or sensitivity to certain toxic substances - are incubated with the sample liquid in order to finally carry out bioluminescence measurements. If the bioluminescence signal is unchanged only in one of the test organisms, for example at the level of the control value, " while all other microorganisms experience a reduction in measurable bioluminescence, the toxin to which the strain in question is resistant is identified.
V. Anwendungsbeispiel 1V. Application example 1
Das in Abbildung 2 gezeigte Beispiel verdeutlicht die Anwen¬ dung der hier vorgestellten Meßmethode zur Testung von Anti¬ biotika-Konzentration in roher Milch:The example shown in Figure 2 illustrates the application of the measurement method presented here for testing the antibiotic concentration in raw milk:
Ein Stamm des gram-negativen Bakteriu s E. coli ATCC 25922 wurde mit einem Plasmid [(pGL3.T, das zusätzlich zu den Korn-
ponenten von pGL3 (s.o.) ein Tetrazyklin-Resistenzgen enthält (Stamm "T" in Abb. 2)] transformiert. Als Kontroll-Stamm (Stamm "C") wurde ein Derivat von ATCC 25922 - ausgestattet mit pGL3 - verwendet. Mehrere 0,5 ml-Proben roher Milch mit verschiedenen Konzentrationen des Antibiotikums Tetrazyklin wurden mit je 0,1 ml (etwa 2 x 10 Bakterien) Suspensionen der Stämme C und T versetzt und 20 Minuten bei Raumtempera¬ tur inkubiert. Nach lOminütiger Erwärmung der Kulturen auf 40°C zur Induktion der Biolumineszenz wurden 0,01 ml einer 0,lprozentigen Lösung des Aldehyds Decanal als Substrat der Luciferaεe zugesetzt und die Proben in einem Lumineszenz-Pho¬ tometer über einen Zeitraum von 50 Minuten in 4-Minuten-In¬ tervallen gemesεen. In Abbildung 2 sind die Meßergebnisεe von Proben mit fünf verschiedenen Antibiotikakonzentrationen als relative Lichtsignale (RLU; Ordinate) als Funktion der Zeit aufgetragen.A strain of the gram-negative bacterium E. coli ATCC 25922 was treated with a plasmid [(pGL3.T, which in addition to the grain components of pGL3 (see above) contains a tetracycline resistance gene (strain "T" in Fig. 2)]. As a control strain (strain "C") a derivative of ATCC 25922 - equipped with pGL3 - was used. Several 0.5 ml samples of raw milk with different concentrations of the antibiotic tetracycline were mixed with 0.1 ml (about 2 x 10 bacteria) suspensions of the strains C and T and incubated for 20 minutes at room temperature. After heating the cultures at 40 ° C. for 10 minutes to induce bioluminescence, 0.01 ml of a 0.1% solution of the aldehyde decanal as substrate of the luciferase was added and the samples in a luminescence photometer over a period of 50 minutes in 4- Minute intervals measured. Figure 2 shows the measurement results of samples with five different antibiotic concentrations as relative light signals (RLU; ordinate) as a function of time.
Das Biolumineszenzsignal des tetrazyklin-resistenten Stamms T ist über den Meßzeitraum relativ konstant, während Stamm C ein Abnehmen der emittierten Lichtmenge in einer konzentra¬ tionsabhängigen Weise erkennen läßt. Die Tatsache, daß die Wachstumseigenschaften des Indikator-Stammes T durch Tetra¬ zyklin nicht wesentlich beeinträchtigt werden, ermöglicht seine Anwendung auch zur Identifikation dieses Antibiotikums in Proben (z.B. Milch) unbekannter Herkunft. Die Bestimmung absoluter Konzentrationen dieses Antibiotikums, oder anderer toxischer Substanzen, gegen die ein Indikatorstamm spezifisch resistent iεt, ist in guter Näherung durch Einbeziehen von Referenzwerten bekannter Konzentration deε Toxins in die Me߬ reihe möglich.The bioluminescence signal of the tetracycline-resistant strain T is relatively constant over the measurement period, while strain C shows a decrease in the amount of light emitted in a concentration-dependent manner. The fact that the growth properties of the indicator strain T are not significantly impaired by tetracycline makes it possible to use this antibiotic in samples (e.g. milk) of unknown origin. The determination of absolute concentrations of this antibiotic or other toxic substances against which an indicator strain is specifically resistant is possible to a good approximation by including reference values of known concentration of the toxin in the measurement series.
VI. Weitere Anwendungen des VerfahrensVI. Further applications of the method
Das oben angeführte Beispiel erläutert nur eine der möglichen
Anwendungen des hier vorgestellten Toxizitäts-Meßverfahrens mittels Biolumineszenz. Analog ist die Toxizitätεbeεtimmung flüεεiger Proben im Hinblick auf deren Belastung mit anderen Antibiotika, Schwermetallen, Fluorchlorkohlenwasserstoff-Ver¬ bindungen (FCKW) wie Dioxinen, PCB etc. durchzuführen, voraus¬ gesetzt, daß mit entsprechenden Resistenz- bzw. Hypersenεi- tivitäts-Genen ausgestattete Mikroorganismen zur Verfügung stehen.The example above only explains one of the possible ones Applications of the toxicity measurement method presented here using bioluminescence. Analogously, the toxicity determination of liquid samples with regard to their exposure to other antibiotics, heavy metals, chlorofluorocarbon compounds (CFCs) such as dioxins, PCBs etc. must be carried out, provided that they are equipped with the appropriate resistance or hypersensitivity genes Microorganisms are available.
Effekte toxischer Substanzen in gasförmiger Umgebung können in ähnlicher Weise - wie im Beispiel für flüssige Proben be¬ schrieben - erfaßt werden. Bei dieser Anwendungsform bringt man die gasförmige Probe über eine nur für Gase, nicht aber für Wasserdampf, durchläsεige Membran in Kontakt mit den In¬ dikator-Organismen. Dieεe Meßanordnung erlaubt die Erfaεsung toxischer Substanzen in der Gasphase über längere Meßzeiten, ohne daß durch Verdunstung von Wasserdampf das Nährmedium der Testbakterien in seiner Zusammensetzung verändert wird.Effects of toxic substances in a gaseous environment can be recorded in a similar manner - as described in the example for liquid samples. In this form of application, the gaseous sample is brought into contact with the indicator organisms via a membrane which is permeable only for gases, but not for water vapor. This measuring arrangement allows the detection of toxic substances in the gas phase over longer measuring times without the nutrient medium of the test bacteria being changed in its composition by evaporation of water vapor.
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