WO1989001160A1 - Nouveaux reactifs bifonctionnels photoactivables, leur preparation et leur application, notamment au marquage de photoaffinite - Google Patents

Nouveaux reactifs bifonctionnels photoactivables, leur preparation et leur application, notamment au marquage de photoaffinite Download PDF

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WO1989001160A1
WO1989001160A1 PCT/FR1988/000384 FR8800384W WO8901160A1 WO 1989001160 A1 WO1989001160 A1 WO 1989001160A1 FR 8800384 W FR8800384 W FR 8800384W WO 8901160 A1 WO8901160 A1 WO 8901160A1
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compounds
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Maurice Goeldner
Christian Georges Etienne Hirth
Benoît CHATRENET
Philippe Bernard Etienne Klotz
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Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
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    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label

Definitions

  • New bifunctional photoactivable reagents their preparation and their application, in particular to photoaffinity labeling.
  • the present invention relates to the use of bifunctional photoactivatable reagents, as bridging agents of biological ligands, as well as new bifunctional photoactivable reagents and their preparation.
  • the bifunctional reagents used according to the invention comprise on the one hand a conventional electrophilic or nucleophilic reactive group which allows grafting onto a biological ligand, and on the other hand, a photoactivable group which is a diazonium salt initially protected in the form of azosulfone. Photochemical activation leads to the formation of an extremely reactive carbocation which will react without discrimination with any chemical function located nearby.
  • the photoaffinity labeling technique consists in grafting a biological ligand onto a photoactivable reagent, so as to obtain a probe which is specifically recognized by a receptor for said ligand. The photochemical reaction then makes it possible to establish an irreversible link between the probe and the receptor.
  • This photoaffinity labeling technique is used in particular as a means for isolating or characterizing an unknown receptor or as a means of analyzing the structure of a given receptor site. In both cases, the bifunctional reagent must itself be labeled with radioactive isotopes to allow tracking of its location.
  • the photoactivable groups of the photoaffinity labeling reagents currently used are essentially azide groups and diazo groups. However, under the action of light, these compounds give rise respectively to nitrene groups and to carbene groups. The lifetime of nitrene and certain carbenes is relatively long, and can lead to rearrangements in less reactive species, so that photochemical fixation can fail in the absence of sufficiently nucleophilic residues or will take place at a site relatively distant from the receptor site, especially when the lingand-receptor affinity is relatively low ; see for example Vinay Chowdry and FH Westheimer, ANN. Rev. Biochem. 1979, 48, 233-325.
  • the photoactivatable reagents of the invention which are diazonium salts, have the advantage of giving rise, by photochemical reaction, to aryl carbocations whose lifespan is much shorter, which are not subject to any rearrangement and which therefore allow more precise labeling of the receiver.
  • the diazonium group can be temporarily protected in the form of azosulfone, which has several advantages.
  • the reagent is stable and there is no need to handle it away from light. This temporary blocking of the diazonium group will allow the synthesis of modified ligands which would be sensitive to the conditions of the diazotization reaction (acid medium or presence of other chemical functions capable of reacting with the nitrosation agent).
  • the deprotection reaction carried out under extremely mild conditions (neutral aqueous medium), is quantitative.
  • the photoactivatable bifunctional reagents can also be used as bridging agents between a biological ligand and a polymeric support, making it possible, for example, to prepare immunogens intended for obtaining antibodies against haptens, or also making it possible to prepare chromatography supports for 'affinity.
  • the subject of the present invention is therefore the use, as bridging agents of biological ligands, of the compounds of general formula I:
  • X represents a reactive nucleophilic or electrophilic functional group, in free or protected form; m, p and q independently represent the numbers 0 or 1, it being understood that:
  • X represents -CHO, -NH 2 , -OH, -CO 2 H or halogen
  • a ⁇ is a mineral anion such as a halide, tetrafluoroborate anion, etc. or an organic anion such as the trifluoroacetate anion;
  • R 2 is an alkyl group having from 1 to 8 carbon atoms, or else R 2 is an aryl group, in particular phenyl, optionally substituted for example by one or more alkyl groups (having for example 1 to 3 atoms of carbon);
  • Ar is a p-phenylene group, optionally substituted by one or more electron donor groups such as alkyl or alkoxy groups having 1 to 3 carbon atoms;
  • R or R 1 represents -H, an alkyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyl or phenethyl group;
  • E is an alkylene having from 1 to 10 carbon atoms
  • said alkylene may be substituted by one or more free or protected amino or carboxylic groups and / or may be interrupted by one or more heteroatoms or heteroatomic groups such as
  • Alk being a lower alkyl group
  • arylene groups such as optionally substituted phenylene such as the Ar group
  • X represents a halogen (preferably chlorine or bromine)
  • Alk being a lower alkyl
  • diazonium group in particular a phenyldiazonium group
  • bridging agents of the reagents of formula I encompasses both their use as photoaffinity labeling reagents and as bridging agents between a biological ligand and a polymeric support.
  • the use of the reagents of formula I includes in particular the implementation of a process for bridging a biological ligand on a polymeric support or on a receptor or a partner of said ligand, this process being characterized in that one reacts after possible deprotection of group X, a compound of formula I, in which the diazonium group is protected in the form of azosulfone, with a biological ligand containing a functional group capable of reacting with the reactive group -X to establish a covalent bond between the ligand and the reagent, which is deprotected, according to known methods, the diazonium salt, which is brought into contact with the deprotected product obtained with a polymeric support or with a receptor or partner of said ligand, to obtain , by photochemical reaction, an irreversible coupling between said polymeric support or receptor or partner and said ligand.
  • the product obtained by attachment to a polymeric support can be used as an immunogen, to prepare antibodies against the ligand in question.
  • the polymeric support is a solid
  • the product obtained can serve as an affinity chromatography support, which can serve to purify either the ligand receptor or partners of said ligand (for example antibodies directed against this ligand).
  • affinity chromatography support which can serve to purify either the ligand receptor or partners of said ligand (for example antibodies directed against this ligand).
  • the use of the compounds of formula I is an application of labeling by photoaffinity of the receptor or partner of the ligand.
  • RNA or DNA polynucleotides
  • antigens antibodies, including anti-antibodies, and enzyme inhibitors and substrates.
  • Photochemical coupling with a polymeric support is carried out in an organic solvent (isopropanol or acetonitrile for example) in the presence of a small amount of water (10-15%) to ensure slow deprotection. If larger proportions of water are required, the photochemical coupling will then be carried out in a very concentrated medium.
  • organic solvent isopropanol or acetonitrile for example
  • polyhydroxylated polymers optionally crosslinked, such as for example Ficoll.
  • the products of formula I can be prepared for example according to "a process characterized in that a compound, unlabeled or labeled using a radioactive isotope, of formula II: H is transformed, according to the usual methods 2 N-Ar-N (R) - (CZ) m - (NR 1 ) p - (E) q -X 2 (II) in which m, p, q, Ar, R, R 1 , E and Z are defined as above, and X 2 represents an electrophilic or nucleophilic reactive group in free or protected form, in corresponding diazonium salt of formula III:
  • R 2 -SO 2 -N N-Ar-N (R) - (CZ) m - (NR 1 ) p (E) q -X 2 (V) and which are optionally transformed, according to known methods into itself, the compound of formula V into a desired compound of formula I.
  • the transformation of compound II into the diazonium salt is carried out for example by the action of nitrous acid (alkali metal nitrite in an acid medium), according to known methods.
  • the reaction of compound III with compound IV is carried out in water, optionally in the presence of an organic solvent immiscible with water.
  • R 2 -SO 2 -N N-Ar-N (R) -C (Z) - (CH 2 ) r -Hal (Va) where Hal represents a halogen, and r is a number equal to 0 or 1, it makes it possible to obtain other compounds of formula I.
  • the product Va is reacted with a compound of formula VI
  • amino acids such as cystine, lysine, ornithine, aspartic acid, glutamic acid, or their derivatives.
  • the compounds of formula II are prepared according to the usual methods of organic chemistry.
  • the group Y 1 is an amino group protected by a usual protective group, for example by a t-butoxycarbonyl, acetyl, trifluoroacetyl, beta-trichloroethyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, phthaloyl group, etc.
  • the deprotection reaction is carried out according to the usual methods .
  • the reduction of the Schiff base can be used to carry out radioactive labeling of the group -CH 2 - of product VIII, using tritiated hydrogen or tritium.
  • the compounds of formula IX can be transformed into products of corresponding formula II by deprotection of the amine.
  • the compounds of formula IX can also be transformed into other compounds of formula II comprising a spacer arm using reactions known per se. For example, compound IX is reacted with a compound of formula VI, as defined above, to obtain a compound of formula X
  • Compound XI can also be obtained by iodination of the compound of formula VII using iodine or ICI.
  • the diiodine derivative can be transformed into a corresponding ditritite derivative by the action of tritiated hydrogen or tritium.
  • a hydrogenation catalyst such as palladium.
  • the subject of the invention is the compounds of formula I, in which Y, Ar, R, Z, R 1 E, X, m, p and q are defined as above, as well as the compounds of formula I labeled with a radioactive isotope, with the exception of the compounds of formula I not labeled with a radioactive isotope for which:
  • the invention also relates to a process for the preparation of new products of formula I, this process being as described above.
  • stage a) (444 mg; 2 mmol) and triethylamine (500 ⁇ l) in anhydrous toluene (18 ml) with stirring.
  • reaction mixture is stirred for 12 hours in a warm water bath and then placed under a slight vacuum (30mm Hg) to remove the residual phosgene.
  • the organic phase is washed three times with water then dried over sodium sulfate and finally evaporated under reduced pressure (20mm Hg).
  • the brownish solid obtained is recrystallized from an ethyl acetate / hexane mixture. 515 mg of white crystals are obtained (yield: 90%) of p-t.-butoxycarbonylamino N-methyl N-chlorocarbonyl aniline.
  • the compound is recrystallized from ethyl acetate: 550 mg (yield 56%).
  • Example 2 The product obtained in Example 2 (34 mg; 0.1 mmol), dissolved in anhydrous THF, is added dropwise to a solution of ethylene diamine (18 mg; 0.3 mmol) in THF (1 ml) cooled in a bath. of ice. After 30 minutes, the mixture is taken up in ethyl acetate (20 ml) and the organic phase is washed several times with water, then dried over sodium sulfate. The organic phase is concentrated under vacuum to a volume of 2ml; then the product of the reaction is precipitated by adding hexane. An amorphous powder is obtained.
  • the starting material is 2,6-diiodo 4-nitroaniline.
  • the nitro group is reduced by sulfurized sodium borohydride
  • stage a) replacing the hydrogen with tritiated hydrogen, the pt-butoxycarbonylamino N-methyl aniline tritiated in position 2 and 6 of the phenyl and on the linked methyl group is obtained with nitrogen.
  • the yellow product is recrystallized from ethyl acetate-hexane. 520mg (yield 60%).
  • the reaction is allowed to evolve for 48 hours.
  • Boc is an abbreviation for: t-butoxycarbonyle.
  • a total of 26.5 xl (1.1 equivalent) of a sodium nitrite solution (10 mg / ml) is added in 30 minutes, in small additions every 10 minutes. We wait 15 minutes after the last addition.
  • EXAMPLE 14 Example of application. Reaction of the product of Example 5 with a hapten (trinitrobenzene).
  • Example 5 To the product of Example 5 (2mmol), dissolved in THF, picryl chloride (2mmol) is added. Then a solution of triethylamine (5 mmol) in THF is added. After reaction, the mixture is taken up in ethyl acetate, washed with water and evaporated under reduced pressure.
  • Example 5 A product similar to that of Example 5 is obtained, but in which X represents the group -NH-C 6 H 2 (NO 2 ) 3 .
  • EXAMPLE 15 Irreversible labeling of the nicotinic acetylcholine receptor of Torpedo marmorata by the compounds prepared in Examples 11 and 12.
  • the receptor is purified according to the method of Saitoh and Changeux; Eur. J. Biochem. 105, 51-52 (1980).
  • the concentration of sites is determined according to the DEAE cellulose filter method described by Fulpius B. et al. ; Febs Letters 24, 323-326, (1972)
  • the ligands are either the compound of Example 11 or the compound of Example 12.
  • the dissociation constants (K d ) of these ligands were evaluated by determining the ligand concentration at which a 50% drop in the initial rate of fixation of alpha-bungarotoxin (alpha-tox) is observed.
  • the irradiations were carried out in a 1 ml UV cell (1 cm of optical path) with a monochromatic light coming from a 500 watt Xenon lamp.
  • the light beam is 10mm high and 2mm wide.
  • the resulting energy is determined by a thermophilic coupled to a microvoltmeter.
  • the irradiations were made at 295nm, at 10 ° C for 30min, the energy being 50 volts; the concentrations were 0.5 ⁇ M at the receptor site and 22 K, in ligand.
  • - Native receptor the ligand is preincubated with the receptor at 10 ° C for 10 min. and we irradiate for 30 min.
  • Receiver desensitized the receiver is preincubated for 30 min. at room temperature with phenylcyclohexylpiperidine (or PCP, non-competitive blocker for binding the ligand at the agonist site). Then the ligand is preincubated at 10 ° C for 10 min., Finally it is irradiated for 30 min.
  • the protection on the native receiver is more than 70%.

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Abstract

Utilisation, comme agents de pontage de ligands biologiques, des composés de formule générale (I), dans laquelle: Y représente -N2O AO ou -N=N-SO2-R2, AO étant un anion et R2 étant un groupement alkyle ou aryle éventuellement substitué, Ar est un groupement p-phénylène éventuellement substitué, R et R1, représentent indépendamment -H, un groupement alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupement arylalkyle dont l'alkyle a 1 à 4 atomes de carbone, Z représente = O ou = S, E est un bras espaceur, X représente un groupement fonctionnel réactif nucléophile ou électrophile sous forme libre ou protégée; m, p et q représentent indépendamment les nombres 0 ou 1, étant entendu que: lorsque m = 0, alors p = 0 et q = 1, lorsque m = p = 1, alors q = 1; ainsi que des produits de formule (I) marqués à l'aide d'isotopes radioactifs; nouveaux composés de formule (I) et leur préparation. Application notamment au marquage de photoaffinité.

Description

Nouveaux réactifs bifonctionnels photoactivables , leur préparation et leur application, notamment au marquage de photoaffinité.
La présente invention a pour objet l'utilisation de réactifs bifonctionnels photoactivables, comme agents de pontage de ligands biologiques, ainsi que de nouveaux réactifs bifonctionnels photoactivables et leur préparation.
Les réactifs bifonctionnels utilisés selon l'invention comportent d'une part un groupement réactif électrophile ou nucléophile classique qui permet le greffage sur un ligand biologique, et d'autre part, un groupement photoactivable qui est un sel de diazonium initialement protégé sous forme d'azosulfone. L'activation photochimique conduit à la formation d'un carbocation extrêmement réactif qui réagira sans discrimination avec toute fonction chimique se trouvant à proximité.
On sait que la technique de marquage de photoaffinité consiste à greffer un ligand biologique sur un réactif photoactivable, de façon à obtenir une sonde qui est reconnue spécifiquement par un récepteur dudit ligand. La réaction photochimique permet alors d'établir une liaison irréversible entre la sonde et le récepteur. Cette technique de marquage de photoaffinité est utilisée notamment comme moyen pour isoler ou caractériser un récepteur inconnu ou comme moyen d'analyse de la structure d'un site récepteur donné. Dans les deux cas, le réactif bifonctionnel doit être lui-même marqué à l'aide d'isotopes radioactifs pour permettre de suivre sa localisation.
Les groupements photoactivables des réactifs de marquage de photoaffinité actuellement utilisés sont essentiellement les groupements azide et les groupements diazo. Toutefois, sous l'action de la lumière, ces composés donnent naissance respectivement à des groupements nitrène et à des groupements carbène. La durée de vie des nitrènes et de certains carbènes est relativement longue, et peut conduire à des réarrangements en des espèces moins réactives, de sorte que la fixation photochimique peut échouer en absence de résidus suffisamment nucléophiles ou s'effectuera en un site relativement éloigné du site récepteur, en particulier lorsque l'affinité lingand-récepteur est relativement faible ; voir par exemple Vinay Chowdry et F.H. Westheimer, ANN. Rev. Biochem. 1979, 48,293-325.
Les réactifs photoactivables de l'invention, qui sont des sels de diazonium, présentent l'avantage de donner naissance, par réaction photochimique, à des carbocations aryle dont la durée de vie est beaucoup plus courte, qui ne sont sujet à aucun réarrangement et qui permettent donc un marquage plus précis du récepteur.
En outre, le groupement diazonium peut être temporairement protégé sous la forme d'azosulfone, ce qui présente plusieurs avantages. Le réactif est stable et il n'est pas nécessaire de le manipuler à l'abri de la lumière. Ce blocage temporaire du groupement diazonium va permettre la synthèse de ligands modifiés qui seraient sensibles aux conditions de la réaction de diazotation (milieu acide ou présence d'autres fonctions chimiques susceptibles de réagir avec l'agent de nitrosation). Finalement la réaction de déprotection, effectuée dans des conditions extrêmement douces (milieu aqueux neutre), est quantitative. Les réactifs bifonctionnels photoactivables peuvent être également utilisés comme agents de pontage entre un ligand biologique et un support polymérique, permettant par exemple de préparer des immunogenes destinés à l'obtention d'anticorps contre des haptènes, ou encore permettant de préparer des supports de chromatographie d'affinité.
La présente invention a donc pour obtjet l'utilisation, comme agents de pontage des ligands biologiques des composés de formule générale I :
(I)
Figure imgf000004_0001
dans laquelle : Y représente -N2 ⊕Aθ ou -N=N-SO2-R2, Aθ étant un anion et R2 étant un groupement alkyle ou aryle éventuellement substitué, Ar est un groupement p-phénylène éventuellement substitué,
R et R1 représentent indépendemment -H, un groupement alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupement arylalkyle dont l'alkyle a 1 à 4 atomes de carbone, Z représente =0 ou =S,
E est un bras espaceur,
X représente un groupement fonctionnel réactif nucléophile ou électrophile, sous forme libre ou protégée ; m, p et q représentent indépendamment les nombres 0 ou 1, étant entendu que :
- lorsque m = 0, alors p = 0 et q = 1
- lorsque m = p = 1, alors q = 1 ; ainsi que des produits de formule I marqués à l'aide d'isotopes radioactifs. Parmi les composés de formule I on citera en particulier les composés suivants (marqués ou non avec un isotope radioactif) :
- Ceux pour lesquels m= 1, p = q = 0, qui répondent à la formule la
Y-Ar-N(R)-C(Z)-X1 (la),
dans laquelle X1représente un halogène ;
- Ceux pour lesquels m = q = 1, et p = 0 c'est-à-dire les composés de formule Ib
Y-Ar-N(R)-C(Z)-E-X (Ib),
et notamment ceux pour lesquels X représente un halogène ou un groupement carboxylique ;
- ceux pour lesquels m = p = q =1, c'est-à-dire les composés de formule le
Y-Ar-N(R)-C(Z)-N(R1)-E-X (lc), et notamment ceux pour lesquels X représente -NH2 (libre ou protégé), un ammonium quaternaire, un halogène ou un groupement diazonium (libre ou protégé) ; - ceux pour lesquels m= p = 0 et q = 1, c'est-à-dire les composés de formule Id
Y-Ar-N(R)-E-X (Id),
et notamment ceux pour lesquels X représente -CHO,-NH2,-OH,-CO2H ou halogène ;
- ceux pour lesquels Aθ est un anion minéral tel qu'un anion halogènure, tétrafluoroborate, etc ... ou un anion organique tel que l'anion trifluoroacétate ;
- ceux pour lesquels R 2 est un groupement alkyle ayant de 1 à 8 atomes de carbone, ou bien R2 est un groupement aryle, en particulier phényle, éventuellement substitué par exemple par un ou plusieurs groupements alkyle (ayant par exemple 1 à 3 atomes de carbone);
- ceux pour lesquels Ar est un groupement p-phénylène, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements électrodonneurs tels que des groupements alkyle ou alkoxy ayant 1 à 3 atomes de carbone ;
- ceux pour lesquels R ou R1 représente -H, un groupement alkyle ayant 1 à 4 atomes de carbone, ou un groupement benzyle ou phénéthyle ;
- ceux pour lesquels, lorsque q = 1, E est un alkylène ayant de 1 à 10 atomes de carbone, ledit alkylène pouvant être substitué par un ou plusieurs groupements amino ou carboxylique libres ou protégés et/ou pouvant être interrompu par un ou plusieurs hétéroatomes ou groupements hétéroatomiques tels que
-NH-,-N(Alk)-, -O-, -S-, -SS-, -O-CO-, -CO-O-, etc ... (Alk étant un groupement alkyle inférieur), et/ou pouvant être interrompu par un ou plusieurs groupements arylène (tels que phénylène éventuellement substitué comme le groupement Ar) ; - ceux pour lesquels X représente un halogène (de préférence chlore ou brome), un groupement -NH2 libre ou protégé, un groupement -CH=O, un groupement carboxylique libre ou protégé, un groupement -CO-Cl, un groupement anhydride mixte tel que -CO-O-CO-O Alk (Alk étant un alkyle inférieur), un groupement diazonium (en particulier un groupement phényldiazonium) libre ou protégé, ou un groupement ammonium quaternaire ; les groupements -NH2 peuvent être protégés, par exemple sous forme d'amide, et les groupements -CO2H sous forme d'esters, avec les groupements protecteurs usuels ; les groupements diazonium peuvent être protégés sous forme d'azosulfone ;
- ceux qui sont marqués au tritium sur le groupement Ar, ainsi que ceux qui sont marqués au tritium sur le carbone, adjacent à l'atome d'azote en position para par rapport au substituant Y, du substituant R (lorsque R est différent de -H). L'utilisation comme agents de pontage des réactifs de formule I englobe aussi bien leur utilisation comme réactifs de marquage de photoaffinité que comme agents de pontage entre un ligand biologique et un support polymérique.
L'utilisation des réactifs de formule I comporte notamment la mise en oeuvre d'un procédé de pontage d'un ligand biologique sur un support polymérique ou sur un récepteur ou un partenaire dudit ligand, ce procédé étant caractérisé par le fait que l'on fait réagir après déprotection éventuelle du groupement X, un composé de formule I, dans lequel le groupement diazonium est protégé sous forme d'azosulfone, avec un ligand biologique contenant un groupement fonctionnel capable de réagir avec le groupement réactif -X pour établir une liaison covalente entre le ligand et le réactif, que l'on déprotège, selon les méthodes connues, le sel de diazonium, que l'on met en contact avec le produit déprotégé obtenu avec un support polymérique ou avec un récepteur ou partenaire dudit ligand, pour obtenir, par réaction photochimique, un couplage irréversible entre ledit support polymérique ou récepteur ou partenaire et ledit ligand.
Pour effectuer la réaction de déprotection du sel de diazonium, il suffit d'opérer en milieu aqueux neutre. Le produit obtenu par fixation sur un support polymérique peut servir d'immunogène, pour préparer des anticorps contre le ligand considéré. Quand le support polymérique est un solide, le produit obtenu peut servir de support de chromatographie d'affinité, pouvant servir à purifier soit le récepteur du ligand, soit des partenaires dudit ligand (par exemple des anticorps dirigés contre ce ligand). Dans le cas de la réaction avec un récepteur ou partenaire du ligand, l'utilisation des composés de formule I est une application de marquage par photoaffinité du récepteur ou partenaire du ligand. Parmi les ligands biologiques, on citera notamment les hormones, les neurotransmetteurs, les drogues synthétiques ou naturelles analogues à ces derniers (agonistes ou antagonistes), les polynucléotides (ARN ou ADN), les antigènes, les anticorps, y compris les anti-anticorps, et les inhibiteurs et substrats enzymatiques.
Le couplage photochimique avec un support polymérique est effectué dans un solvant organique (isopropanol ou acetonitrile par exemple) en présence d'une faible quantité d'eau (10-15%) pour assurer une déprotection lente. Si des proportions plus importantes d'eau sont nécessaires, le couplage photochimique sera alors effectué dans un milieu très concentré.
Parmi les supports polymériques sur lesquels on peut fixer le produit obtenu après réaction avec le ligand, on citera notamment les polymères polyhydroxylés, éventuellement réticulés, tels que par exemple le Ficoll.
Les produits de formule I peuvent être préparés par exemple selon "un procédé caractérisé par le fait que l'on transforme, selon les méthodes usuelles un composé, non marqué ou marqué à l'aide d'un isotope radioactif, de formule II : H2N-Ar-N(R)-(CZ)m-(NR1)p-(E)q-X2 (II) dans laquelle m, p, q, Ar, R, R1 , E et Z sont définis comme précédemment, et X2 représente un groupement réactif electrophile ou nucléophile sous forme libre ou protégée, en sel de diazonium correspondant de formule III :
Aθ⊕N2-Ar-N(R)-(CZ)m-(NR1)p-(E)q-X2 (III) dans laquelle Aθ est défini comme précédemment, que l'on fait réagir le produit III obtenu avec un composé de formule IV : R2-SO2-M (IV) dans laquelle R2 est défini comme précédemment et M est un métal alcalin, pour obtenir un composé correspondant de formule V :
R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-(CZ)m-(NR1)p(E)q-X2 (V) et que l'on transforme éventuellement, selon des méthodes connues en soi, le composé de formule V en un composé de formule I désiré. La transformation du composé II en sel de diazonium est effectuée par exemple par l'action de l'acide nitreux (nitrite de métal alcalin en milieu acide), selon les méthodes connues. La réaction du composé III avec le composé IV est effectuée dans l'eau, éventuellement en présence d'un solvant organique non miscible à l'eau.
On voit que les composés de formules III, IV et V englobent des composés de formule I.
Lorsque, dans la formule V, X représente un groupement réactif protégé, on peut transformer le produit V en produit de formule I correspondant par une réaction de déprotection appropriée.
Lorsque le produit de formule V est un produit de formule Va :
R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-C(Z)-(CH2)r-Hal (Va) où Hal représente un halogène, et r est un nombre égal à 0 ou 1, il permet d'obtenir d'autres composés de formule I. Par exemple, on fait réagir le produit Va avec un composé de formule VI
H-N(R1)-E1-X2 (VI) dans laquelle X2 est défini comme précédemment, et E1 est un bras espaceur, pour obtenir un composé de formule Vb R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-C(Z)-(CH2)r-N(R1)-E1-X2 (Vb) puis on effectue, le cas échéant, une réaction de déprotection pour transformer le groupement X2 en groupement déprotégé. On voit que les produits obtenus sont des produits de formule le, avec Y représentant R2-SO2-N=N-,E=E1 dans le cas où r=0, et des produits Ib, avec E=-CH2-N(R1)-E1-, dans le cas où r=1.
Parmi les composés de formule VI, on peut citer par exemple des acides aminés tels que la cystine, la lysine, l'ornithine, l'acide aspartique, l'acide glutamique, ou leurs dérivés.
Les composés de formule II sont préparés selon les procédés usuels de la chimie organique. Par exemple, les composés de formule II pour lesquels m = p = 1, q = 0 et X2représente Cl, ou pour lesquels m = p = q = 1, E représente -CH2- et X2 représente Cl, peuvent être obtenus au départ des composés de formule VII : Y1-Ar-NH2 (VII) dans laquelle Y1 est un groupement amino protégé.
On soumet le produit VII à l'action d'un aldéhyde de formule R3-CH=0, dans laquelle R3, qui représente - H ou un alkyle, est tel que R3-CH2- est égal à R, tel que défini ci-dessus, puis on réduit la base de Schiff obtenue, pour former un composé correspondant de formule VIII :
Y1-Ar-NH-CH2-R3 (VIII) (c'est-à-dire Y1-Ar-NH-R) puis on fait réagir le phosgene ou le chlorure de chloroacetyle sur le composé VIII pour obtenir un composé correspondant de formule IX:
Y1-Ar-N(R)-CO-X3 (IX) dans laquelle X3 représente -Cl ou -CH2Cl, que l'on transforme selon les méthodes connues en soi en composé de formule II.
Le groupement Y1 est un groupement amino protégé par un groupement protecteur usuel, par exemple par un groupement t-butoxycarbonyle, acétyle, trifluoroacétyle, bêta-trichloroéthyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, phtaloyle, etc ... La réaction de déprotection est effectuée selon les méthodes usuelles.
La réduction de la base de Schiff peut être mise à profit pour effectuer un marquage radioactif du groupement -CH2- du produit VIII, en utilisant de l'hydrogène tritié ou du tritium. Les composés de formule IX peuvent être transformés en produits de formule II correspondant par déprotection de l'aminé. Les composés de formule IX peuvent aussi être transformés en autres composés de formule II comportant un bras espaceur à l'aide de réactions connues en soi. Par exemple, on fait réagir le composé IX avec un composé de formule VI, tel que défini précédemment, pour obtenir un composé de formule X
Y1-Ar-N(R)-CO-X4 (X) dans laquelle X4 représente -N(R1)-E1-X2 quand X3=Cl, et X4 représente -CH2-N(R1)-E1-X2quand X3=CH2cl, et l'on soumet le produit X à une réaction de déprotection pour obtenir un produit correspondant de formule Ile H2N-Ar-N(R)-CO-X4 (Ile).
On voit que les produits Ile sont un cas particulier des produits de formule II.
Pour obtenir un produit marqué radioactivement sur le groupement phénylène Ar, on peut partir par exemple de la 2,6-diodo 4-nitroaniline (qui est un réactif commercial). On réduit le groupement -NO2 par le borohydrure de sodium sulfuré NaBH2S3, et on protège sélectivement le groupement -NH2, obtenu par réduction du groupement nitro, selon les méthodes connues (par exemple à l'aide du groupement t-butoxy carbonyle). On obtient le composé de formule XI
(XI)
Figure imgf000011_0001
dans laquelle Y1 est défini comme précédemment. Le composé XI peut aussi être obtenu par iodation du composé de formule VII à l'aide de l'iode ou de ICI. Dans chaque cas, le dérivé di-iodé peut être transformé en dérivé ditritié correspondant par l'action de l'hydrogène tritié ou du tritium. On peut aussi soumettre le produit XI à une réaction d'alkylation par réaction avec un aldéhyde R3-CH=O, puis réduction de la base de Schiff formée par l'hydrogène tritié ou le tritium en présence d'un catalyseur d'hydrogénation tel que le palladium. On obtient ainsi le composé de formule-XII
(XII)
Figure imgf000011_0002
dans laquelle la totalité ou une partie des H*représente le tritium. Le produit (XII) est identique au produit VIII précédent, mais marque au tritium. le *H lié à l'azote est échangeable dans les solvants protiques et est donc généralement absent dans les produits de formule I finalement obtenus.
Les composés de formule II, pour lesquels R et R1
I représentent -H, m = p = q = 1 et X2 représente -X5-, -X5 étant un groupement réactif electrophile ou nucléophile protégé, peuvent être obtenus par l'action d'un composé de formule XIII :
Z=C=N-E-X5 (XIII) dans laquelle Z et E sont définis comme précédemment.
Sur un composé de formule VII, telle que définie précédemment. On obtient ainsi des composés de formule II'c Y1-Ar-NH-(CZ)-NH-E-X5 (II'c)
Les groupements protégés sous la forme Y1 ou X5 peuvent ensuite être déprotégés.
Pour préparer des composés de formule Id, on fait réagir un composé de formule VII ou VIII avec un dialdehyde de formule XIV O=CH-E2-CH=O (XIV) dans laquelle E2 est un bras espaceur, on réduit la base de Schiff formée pour obtenir un composé de formule XV
Y1-Ar-N(R)-CH2-E2-CH=O (XV) que l'on soumet à une réaction de déprotection pour obtenir un produit de formule XVI
H2N-Ar-N(R)-CH2-E2-CH=O (XVI). On voit que la formule XVI est un cas particulier des produits de formule II, avec m=p=o, q=1, E=-CH2-E2- et X2=-CHO. On peut alors poursuivre la synthèse, comme décrit précédemment, pour obtenir les produits de formule Id correspondants.
Les composés pour lesquels X=-CH=O peuvent être transformés en aminés correspondantes (avec groupement terminal correspondant -CH2N2 , soit X = NH2), par l'action de l'ammoniac et réduction de l'imine formée. Ils peuvent être réduits en alcools correspondants, eux-mêmes transformables en dérivés halogènes correspondants (X=halogène). Ils peuvent aussi être transformés par oxydation en acides carboxyliques correspondants (X=CO2H).
Les composés de formule Ib pour lesquels X représente -CO2H peuvent aussi être préparés selon un procédé analogue à celui qui est décrit dans la demande de brevet français 2201 488.
Parmi les composés de formule I, certains sont nouveaux, et l'invention a pour objet les composés de formule I, dans laquelle Y, Ar, R, Z, R1 E, X, m, p et q sont définis comme précédemment, ainsi que les composés de formule I marqués par un isotope radioactif, à l'exception des composés de formule I non marqués par un isotope radioactif pour lesquels :
-m= q = 1, p = 0 et X représente -CO2H,
-m= p = 0, q = 1 et X représente un groupement aminé libre ou protégé.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des produits nouveaux de formule I, ce procédé étant tel que décrit précédemment.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE 1: Préparation du composé de formule I, avec Y = N2 ⊕, Ar = phénylène, R = méthyle, Z = 0, m = 1, p = q = 0, X = Cl et Aθ=CF3CO2 θ ; et produit correspondant marqué au tritium.
a) A une solution de p-t.-butoxycarbonylamino aniline
(origine : FLUKA) (1,04g ; 5mmoles) dans l'acétate d'éthyle (20ml) on ajoute 100mg de catalyseur Pd/C ainsi qu'une solution aqueuse de formaldéhyde (0,48ml à 37% ; 6,5mmoles). Le mélange est agité fortement et placé sous atmosphère d'hydrogène durant 48 heures. Après filtration du catalyseur le mélange réactionnel est lavé à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, puis évaporée sous vide (i,tig). Le mélange obtenu est chromatographie sur silice (35g) ; éluant : acétate d'éthyle 4/Hexane 6. On obtient 880mg de p-t.-butoxycarbonylamino N-méthyl aniline (79%).
RMN (CDCl3) 1,50ppm (9H) (s) t-butyle
2,81ppm (3H) (s) méthyle
6,56ppm (2H) (d) H aromatiques (alpha NHBoc)
7,17ppm (2H) (d) H aromatiques (alpha NHCH3)
b) A une solution de phosgene dans le toluène (5,25ml à 20% , d=0 , 95) refroidie par un bain de glace et de sel on ajoute goutte à goutte une solution d'un mélange de l'aminé obtenue au stade a) (444mg ; 2mmoles) et de triéthylamine (500μl) dans le toluène anhydre (18ml) en agitant.
Après l'addition, le mélange réactionnel est agité pendant 12 heures dans un bain d'eau tiède puis placé sous léger vide (30mm Hg) pour chasser le phosgene résiduel. La phase organique est lavée à trois reprises à l'eau puis séchée sur sulfate de sodium et finalement évaporée sous pression réduite (20mm Hg).
Le solide brunâtre obtenu est recristallisé dans le mélange acétate d'éthyle/hexane. On obtient 515mg de cristaux blancs (rendement : 90%) de p-t.-butoxycarbonylamino N-méthyl N-chlorocarbonyl aniline.
RMN (CDCl3) 1,52ppm 9H (s) t-butyle 3,34ppm 3H (s) méthyle 6,42-6,65pρm 1H NH 7,1ppm 2H (d) aromatiques 7,37ppm 2H (d)
On rappelle qu'une pression de 1mm Hg correspond à 130 Pa. c) Le chlorocarbamate obtenu au stade b) (57mg ; 0.2mmoles) est traité à 0°C par de l'acide trifluoroacétique (1ml) durant 30 minutes pour éliminer le groupement protecteur t-butoxycarbonyle. La solution est ensuite refroirie à -10°C et l'on ajoute sous forme solide le nitrite de sodium (16mg; 0,23mmoles) durant 30 minutes en agitant vigoureusement. La solution est agitée durant 40 minutes supplémentaires. On obtient le sel de diazonium ayant la formule du titre. Le sel de diazonium obtenu est identifié par spectroscopie
UV.
UV : Dioxane/H2O : 1/9 λmax 367mm ; ε estimé > 18200. De façon analogue, en réduisant la base de Schiff, au stade a), par l'hydrogène tritié ou le tritium (au lieu de l'hydrogène), on obtient là p-t-butoxycarbonylamino N-méthyl aniline marquée au tritium sur le groupement N-méthyl. En poursuivant la synthèse comme aux stades b) et c) ci-dessus, on obtient le produit du titre, marqué au tritium sur le groupement N-méthyle.
EXEMPLE 2: Préparation du produit de formule I, avec
Y=C6H5-SO2-N=N-, Ar=phénylène, R=CH3, Z=0, m=1, p=q=0 et X=Cl.
Une solution du produit de l'exemple 1, stade b) (852mg ; 3mmoles) dans l'acide trifluoroacétique (1ml) est maintenue à 0°C pendant une heure.
Oh refroidit ensuite le mélange réactionnel à -10°C puis on ajoute à l'abri de la lumière, par petites portions, pendant 30 minutes, le nitrite de sodium (225mg). Le mélange est fortement agité et maintenu à cette température durant 30 minutes supplémentaires. L'acide trifluoroacétique est évaporé sous pression réduite et le sel de diazonium repris par l'eau (1ml). On ajoute à cette solution aqueuse placée dans un bain de glace une solution de phényl suifinate de sodium (540mg dans 3ml H2O). Le précipité jaune obtenu est filtré et la phase aqueuse extraite par l'acétate d'éthyle (2 x 5ml). La phase organique est séchée sur sulfate de sodium puis évaporée à sec sous vide.
Le composé du titre, de couleur légèrement jaunâtre, est chromatographié sur silice (80g) et élué par un mélange hexane-acétate d'éthyle ; gradient : hexane 7-acétate d'éthyle 3 jusqu'à acétate d'éthyle pur.
Le composé est recristallisé dans l'acétate d'éthyle : 550mg (rendement 56%).
UV : Dioxane : λmax : 311 nm; ε= 13760 Dioxane /H2O : 1/9 :λmax : 367 nmε= 18140
Microanalyse : Calculé : C % 49,78 Trouvé 49,95
H % 3,58 3,53 N % 12,44 12,25
EXEMPLE 3: Préparation du composé de formule I avec
Y=N2 ⊕, Ar = phénylène, R=H, Z=0, m=q=1,p=0, E=CH2, X=Cl et A-=CF3CO2 θ. a) On utilise le même produit de départ qu'à l'exemple 1, stade a). Ce produit est dissous dans le THF anhydre (5ml). On ajoute de la triéthylamine (1g ; 10mmoles). Le mélange est refroidi à 4°C et agité sous atmosphère d'argon. On ajoute goutte à goutte une solution du chlorure de chloroacetyle (1, 13g ; 10mmoles) dans le THF anhydre (20ml). Après 30 minutes d'agitation à froid le mélange est hydrolyse et extrait par l'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par une solution saturée de NaCl puis séchée sur sulfate de sodium. Après êvaporation du solvant sous vide, on obtient des cristaux blanchâtres de p-t-butoxycarbonylamino N-chlorométhylcarbonyl aniline que l'on recristallise dans un mélange chloroforme-acétate d'éthyle. RMN (CDCl3) 1,5ppm (s) 9H t butyle
4,18ppm (s) 2H méthylène
7,35 - 7 ,50ppm 4H aromatiques 6,3 - 6,6ppm 1H NH amide 8 - 8,3ppm 1H NH uréthane
b) En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple 1, stade c), on obtient le sel de diazonium ayant la formule du titre.
EXEMPLE 4: Préparation du produit de formule I, avec Y=C6H5- SO2-N=N -, Ar=phénylène, R=H, Z=O, m=q=1,p=0, E=CH2 et X=Cl
En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple 2, au départ du produit obtenu à l'exemple 3, stade a), on obtient le produit ayant la formule du titre.
EXEMPLE 5: Préparation d'un composé de formule I avec
Y=C6H5-SO2-N=N-, Ar=phénylène, R=CH3, Z=0, m=p=q=1, R1=H,
E=(CH2)2 et X=NH2
Le produit obtenu à l'exemple 2 (34mg ; 0, 1mmole), dissous dans le THF anhydre, est ajouté goutte à goutte à une solution d'ethylène diamine (18mg ; 0.3mmoles) dans le THF (1ml) refroidie dans un bain de glace. Après 30 minutes, le mélange est repris par de l'acétate d'éthyle (20ml) et la phase organique est lavée plusieurs fois par l'eau, puis séchée sur sulfate de sodium. La phase organique est concentrée sous vide jusqu'à un volume de 2ml ; puis le produit de la réaction est précipité par ajout d'hexane. On obtient une poudre amorphe.
RMN (CDCl3) : 3 - 3,5ppm (7H) : Méthylènes 4H
Méthyle 3H(s) 3.26ppm 7,37ppm 2H (d) Aromatiques p.phénylène, alpha (NCH3) p.phénylène 7,89ppm 2H (d) alpha (N=N) p.phénylène 7,55 - 8pρm 5H (m) aromatiques.
EXEMPLE 6: Préparation du composé de formule I, avec
Y=N2 ⊕,Ar=phénylène, R=méthyle, Z=0, m=1, ρ=q=0, X=Cl et Aθ=CF3CO2 θ, marqué au tritium, et son dérivé azosulfone
(Y=C6H5-SO2-N=N) ; et produits correspondants marqués au tritium.
Le produit de départ est la 2,6-diiodo 4-nitroaniline. On réduit le groupement nitro par le borohydrure de sodium sulfuré
NaBH2S3, selon la méthode décrite par S.N. Lalancette et J.R.
Brindle, Canadian Journal of Chemistry, vol.49, 2990 (1971). On obtient la 2,6-diiodo p-phénylènediamine, sur laquelle on fait réagir l'anhydride mixte t-C4H9-O-CO-O-CO-O-t-C4H9 (commercialisé par Aldrich). On isole deux produits principaux, dont la p-t-butoxycarbonylamino 2,6-diiodo aniline.
En opérant ensuite comme à l'exemple 1, stade a), en remplaçant l'hydrogène par de l'hydrogène tritié, on obtient la p-t-butoxycarbonylamino N-méthyl aniline tritiée en position 2 et 6 du phényle et sur le groupement méthyle lié à l'azote.
En opérant ensuite comme à l'exemple 1, stades b) et c), on obtient le produit du titre marqué par le tritium aux mêmes positions. Ce produit, traité comme décrit à l'exemple 2, donne 1'azosulfone tritiée correspondante.
EXEMPLE 7: Préparation d'un composé de formule I, avec Y=N2 ⊕, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H, E=-(CH2)5-CO-O-(CH2)2-, X=Br et Aθ=CF3CO2 θ. a) A une solution de 3ml de chlorure de méthylène/DMSO (4/1), on ajoute 549mg (2mmoles) du composé de formule
Clθ⊕H3N-(CH2)5-CO-O-(CH2)2-Br et 569mg (2mmoles) du produit obtenu à l'exemple 1, stade b). On additionne goutte à goutte 600μl de triéthylamine (2, 15 équivalent). On laisse sous agitation à température ambiante pendant 2 heures.
On ajoute 15ml de chlorure de méthylène. On fait 3 lavages à l'eau (5ml) et 1 lavage avec une solution saturée en chlorure de sodium (5ml). On sèche sur sulfate de sodium pendant la nuit. On évapore à sec sous pression réduite. On fait une flash colonne avec acétate d'éthyle/hexane
(6/4). On recristallise dans l'acétate d'éthyle. On obtient un compose de formule X, avec Y1=NHBoc, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H, E=-(CH2)5-CO-O-(CH2)2- et X3=Br.
RMN : 1,53ppm CH3-C (NHBoc) (9H) CDCl3 1,31-1,6ppm CH2 aliphatique multiplet (6H)
2,1-2,3ppm CH2-CO2R 3,2ppm NCH3 et NCH2 (5H) 3,37-3,57ppm CH2-Br (2H) 4,25-4,45ppm CH2-ester (2H) 6,6ppm NH
7,05-7,5ppm H aromatiques (4H)
b) On opère de façon analogue à celle décrite à l'exemple
1, stade C, au départ du produit obtenu au stade précédent. On obtient le produit du titre.
EXEMPLE 8: Préparation d'un composé de formule I, avec Y=C6H5-SO2-N=N-, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H, E=-(CH2)5-CO-O-(CH2)2- et X=Br. En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple
2, au départ du produit de l'exemple 7, on obtient le produit du titre.
EXEMPLE 9: Préparation d'un composé de formule I, avec Y=N2 ⊕, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H,
E=-(CH2)7-CO-O-(CH2)2-, X=Br et AΘ=CF3CO2θ ; et de l'azosulfone correspondante (Y=C6H5-N=N-).
On opère comme aux exemples 7 et 8, au départ du composé de formule
Clθ⊕ H3N-(CH2)7-CO-O-(CH2)2-Br
EXEMPLE 10: Préparation d'un composé de formule I, avec X=Y=C6H5-SO2-N=N-, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1 = H , et
E=-CH (CO 2CH3 ) -CH2-S-S-CH2-CH (CO2CH3 ) -NH-CO-N (CH3 ) -C6-H4- . A une solution du produit de l'exemple 2 (506mg ; 1,5mmoles) dans le THF aqueux (6ml ; 5% d'eau) on ajoute à froid (bain de glace) goutte à goutte une solution d'un mélange de chlorydrate de cystine (255mg ; 0.75mmoles) et de triéthylamine (900μl) dans le THF aqueux (6ml).
Après 1 heure le mélange réactionnel est dilué par l'acétate d'hetyle (30ml) et lavé par l'eau (3x5ml). Après séchage de la phase organique sur sulfate de sodium et évaporation sous vide, le produit brut est chromatographié sur silice (plaque préparative, éluant : acétate d'éthyle).
Le produit jaune est recristallisé dans l'acétate d'éthyle-hexane. 520mg (rendement 60%).
UV (Dioxane) : λmax : 375nm (ε=17.000) (H2O) : λmax : 360nm (ε=26.000)
RMN (CDCl3) 3,15ppm CH2(4H) ; 3,42ppm N-CH3 (6H) 3,70ppm CH3esters (6H) ; 4,5 - 4,9ppm CH (2H); 7,25 - 8,05ppm aromatiques (18H)
EXEMPLE 11: Préparation d'un composé de formule I, avec Y=N2 ⊕, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1-H, E=-(CH2)5-CO-O-(CH2)2-,X=⊕ N(CH3)3Brθ et Aθ -CF3CO2 θ ; et de l'azosulfone correspondante. a) A température ambiante, on dissout 4g de triméthylamine gaz dans 25ml de toluène. La réaction se fait dans un bicol dont l'une des sorties est connectée à un réfrigérant suivi d'un fiole de garde et d'un piège contenant une solution de soude.
Dans un ballon on met 20 ml d'acétone contenant 515mg du produit de l'exemple 7, stade a) (Immole). On additionne, à froid et sous azote, 20ml de la solution toluénique ci-dessus (3,2g de triméthylamine ; 54mmoles) goutte à goutte.
On laisse évoluer la réaction pendant 48 heures.
On évapore à sec lentement. On fait 2 lavages avec 10ml d'éther éthylique puis on fait une extraction en continu éther/eau. On récupère le produit voulu dans l'eau. On évapore et sèche sous pression réduite. On obtient le produit de formule X, avec Y1 =NHBoc, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H, E=-(CH2)5-CO-O-(CH2)-N⊕ (CH3)3 Brθ.
Boc est une abréviation pour : t-butoxycarbonyle.
RMN : acétone : 1,53ppm CH3-C (NHBoc) (9H)
1,3-1,6ppm CH2 aliphatique multiplet (6H) 2,3-2,5ppm CH2-CO2R (2H) 3,2ppm N CH3 et NCH2(5H) 3,62ppm N+-CH3 (9H) 4,1-4,35ppm N+-CH2(2H)
4 , 57-4 , 75ppm CH2 ester 5 , 2-5 , 4ppm NH-CONR2 7 , 2-7 , 7ppm H aromatiques ( 4H ) b) On dissout 20mg du produit obtenu au stade a)
(36 , /μ m oles) dans 300 μl d' acide trifluoroacétique à température ambiante. On attend que la dissolution soit totale.
On refroidit à 0°C.
On ajoute au total 26, 5 xl (1, 1 équivalent) d'une solution de nitrite de sodium ( 10 mg/ml) en 30 minutes , par petits aj outs toutes les 10 minutes. On attend 15 minutes après la dernière addition.
On lyophilise.
Toutes les opérations sont réalisées à l' abri de la lumière.
UV : ε = 23400 λ max 362nm
En opérant comme à l' exemple 2, on transforme ce produit en azosulfone correspondante (avec Y=C6H5-SO2-N=N-)
EXEMPLE 12 : Préparation d'un composé de formule I, avec
Y=N2 ⊕, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H,
E=-(CH2)7-CO-O-(CH2)2, X=-⊕N(CH3)3 Brθ et Aθ =CF3CO2 θ; et de l'azosulfone correspondante. En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple
11, au départ du produit de formule X, avec Y1=NHBoc, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0,R1=H, E=-(CH2)7-CO-O-(CH2)2- et X3=Br (ce produit est obtenu intermediairement dans le procédé de l'exemple 9), on obtient le sel de diazonium du titre. UV :ε= 25700 ; λmax : 362nm
En opérant comme à l'exemple 2, on obtient l'azosulfone correspondante (Y=C6H5-SO2-N=N-).
EXEMPLE 13 : Préparation d'un composé de formule I, avec Y=C6H5-N=N-, Ar=phénylène, R=méthyle, m=p=q=1, Z=0, R1=H, et -E-X=-(CH2)4-CH(CO2CH3)-NHBoc.
En opérant de façon analogue à celle décrite à l'exemple 10, en remplaçant la cystine par la NHBoc-lysine (ester méthylique), on obtient le produit du titre.
EXMPLE 14 : Exemple d'application. Réaction du produit de l'exemple 5 avec un haptène (trinitrobenzène).
Au produit de l'exemple 5 (2mmoles), dissous dans le THF, on ajoute le chlorure de picryle (2mmoles). On ajoute ensuite une solution de triéthylamine (5mmoles) dans le THF. Après réaction, le mélange est repris dans l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau et évaporé sous pression réduite.
On obtient un produit analogue à celui de l'exemple 5, mais dans lequel X représente le groupement -NH-C6H2(NO2)3.
Par hydrolyse du groupement azosulfone, on obtient le sel de diazonium correspondant : UV (H2O) :
- λ max : 357nm ; εestimé : 32000
- épaulement : 412nm ; εestimé : 9000
Far greffage photochimique sur le Ficoll, on obtient un immunogène.
EXEMPLE 15: Marquage irréversible du récepteur nicotinique de l'acétylcholine de Torpédo marmorata par les composés préparés dans les exemples 11 et 12. Le récepteur est purifié selon la méthode de Saitoh et Changeux ; Eur. J. Biochem. 105, 51-52 (1980).
On détermine la concentration en sites selon la méthode sur filtre DEAE cellulose décrite par Fulpius B. et al. ; Febs Letters 24, 323-326, (1972)
Les ligands sont soit le composé de l'exemple 11, soit le composé de l'exemple 12.
Les constantes de dissociation (Kd) de ces ligands ont été évaluées en déterminant la concentration de ligand à laquelle on observe une baisse de 50% de la vitesse initiale de fixation d'alpha-bungarotoxine (alpha-tox).
On a trouvé les valeurs suivantes :
Composé de l'exemple 11 - récepteur natif : Kd = 7.10-7M
- récepteur désensibilisé : Kd = 1,2.10-7M
Composé de l'exemple 12
- récepteur natif : Kd = 3,4.10-7M
- récepteur désensibilisé : Kd = 5,5.10-8M
Les irradiations ont été réalisées dans une cuve UV de 1ml (1cm de trajet optique) avec une lumière monochromatique issue d'une lampe Xénon de 500 Watts. Le faisceau lumineux a 10mm de hauteur et 2mm de largeur. L'énergie résultante est déterminée par une thermophile couplée à un microvoltmètre.
Ainsi les irradiations ont été faites à 295nm, à 10°C pendant 30min, l'énergie étant de 50 volt ; les concentrations étaient de 0,5μM en site récepteur et de 22 K, en ligand. Le tampon est 10mM en phosphate de sodium, pH=7,2 et 0,15M en NaCl. Le dosage des sites restants est effectué après irradiation avec l'alpha-tox, ce qui donne accès à la détermination du pourcentage d'inhibition.
Plusieurs types d'expériences ont été réalisés : - Récepteur natif : on préincube le ligand avec le récepteur à 10 °C pendant 10 min. et on irradie pendant 30 min. - Récepteur désensibilisé : on préincube le récepteur pendant 30 min. à température ambiante avec de la phénylcyclohexylpipéridine (ou PCP, bloquant non compétitif pour la fixation du ligand au niveau du site agoniste). Puis on préincube le ligand à 10 ° C pendant 10 min., enfin on irradie pendant 30 min.
- Protection : on incube pendant 10 min. à température ambiante le récepteur avec la carbamylcholine (agoniste compétitif pour le site acétylcholine) puis on incube avec le ligand pendant 10 min. à 10 °C et enfin on irradie pendant 30 min.
Résultats: Pourcentage d'inhibition
Figure imgf000024_0001
La protection sur le récepteur natif est supérieure à 70 %.

Claims

REVENDICATIONS 1. Utilisation, comme agents de pontage de ligands biologiques, de composés de formule générale I
(I)
Figure imgf000025_0001
dans laquelle :
Y représente -N2 ⊕ A θou -N=N-SO2-R2, Aθ étant un anion et R2 étant un groupement alkyle ou aryle éventuellement substitué,
Ar est un groupement p-phénylène éventuellement substitué, R et R1 représentent indépendamment -H, un groupement alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupement arylalkyle dont l'alkyle a 1 à 4 atomes de carbone,
Z représente =0 ou =S,
E est un bras espaceur, X représente un groupement fonctionnel réactif nucléophile ou electrophile sous forme libre ou protégée ; m, p et q représentent indépendamment les nombres 0 ou 1, étant entendu que :
- lorsque m = 0, alors p = 0 et q = 1 - lorsque m = p = 1, alors q = 1 ; ainsi que les produits de formule I marqués à l'aide d'isotopes radioactifs.
2. Procédé de pontage d'un ligand biologique sur un support polymérique ou sur un récepteur ou un partenaire dudit ligand, caractérisé par le fait que l'on fait réagir, après déprotection éventuelle du groupement X, un composé de formule I, dans lequel le groupement diazonium est protégé sous forme d'azosulfone, avec un ligand biologique contenant un groupement fonctionnel capable de réagir avec le groupement réactif -X pour établir une liaison covalente entre le ligand et le réactif, que l'on déprotège, selon les méthodes connues, le sel de diazonium, que l'on met en contact avec le produit déprotégé obtenu avec un support polymérique ou avec un récepteur ou partenaire dudit ligand, pour obtenir, par réaction photochimique, un couplage irréversible entre ledit support polymérique ou récepteur ou partenaire et ledit ligand.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit support polymérique est un polymère polyhydroxyle, éventuellement réticulé.
4. Procédé selon la revendication 2 ou 3, caractérisé par le fait que ledit ligand biologique est choisi parmi les hormones, les neurotransmetteurs, les drogues synthétiques ou naturelles analogues à ces derniers (agonistes ou antagonistes), les polynucléotides (ARN ou ADN), les antigènes, les anticorps, y compris les anti-anticorps, et les inhibiteurs et substrats enzymatiques.
5. Composés de formule générale I
(I)
Figure imgf000026_0001
dans laquelle :
Y représente -N2 ⊕ A θou -N=N-SO2-R2, Aθ étant un anion et R2 étant un groupement alkyle ou aryle éventuellement substitué, Ar est un groupement p-phénylène éventuellement substitué,
R et R1 représentent indépendamment -H, un groupement alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone, ou un groupement arylalkyle dont l'alkyle a 1 à 4 atomes de carbone,
Z représente =O ou =S, E est un bras espaceur,
X représente un groupement fonctionnel réactif nucléophile ou electrophile sous forme libre ou protégée ; m, p et q représentent indépendamment les nombres 0 ou 1, étant entendu que : - lorsque m = 0, alors p = 0 et q = 1
- lorsque m = p = 1, alors q = 1 ; ainsi que les produits de formule I marqués à l'aide d'isotopes radioactifs, à l'exception des composés de formule I non radioactifs pour lesquels :
-m=q=1, p=0 et X représente CO2H ; -m=p=0, q=1 et X représente un groupement aminé libre ou protégé.
6. Composés selon la revendication 5, de formule générale la
Y-Ar-N(R)-C(Z)-X1 (la) dans laquelle X représente un halogène et Y, Ar, R et Z sont définis comme dans la revendication 5.
7. Composés selon la revendication 5, de formule générale Ib
Y-AR-N(R)-C(Z)-E-X (Ib) dans laquelle Y, Ar, R, Z, E et X sont définis comme dans la revendication 5.
8. Composés selon la revendication 5, de formule générale le
Y-Ar-N(R)-C(Z)-N(R1)-E-X (lc) dans laquelle Y, Ar, R, Z, R1, E et X sont définis comme dans la revendication 5.
9. Composés selon la revendication 5, de formule générale Id
Y-Ar-N(R)-E-X (Id) dans laquelle Y, Ar, R, E et X sont définis comme dans la revendication 5.
10. Procédé de préparation des composés de la revendication 5, caractérisé par le fait que l'on transforme, selon les méthodes usuelles un composé de formule II. H2N-Ar-N(R)-(CZ)m-(NR1)p-(E)q-X2 (II) dans laquelle m,p,q,Ar,R,R1, E et Z sont définis comme dans la rev. 5, et X représente un groupement réactif electrophile ou nucléophile sous forme libre ou protégée, en sel de diazonium correspondant de formule III :
Aθ⊕N2-Ar-N(R)-(CZ)-m(NR1)p(E)q-X2 (III) dans laquelle Aθ est défini comme précédemment, que l'on fait réagir le produit III obtenu avec un composé de formule IV :
R2-SO2-M (IV) dans laquelle R2 est défini comme dans la rev. 5 et M est un métal alcalin, pour obtenir un composé correspondant de formule V :
R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-(CZ)m-(NR1)p-(E)q-X2 (V) et que l'on transforme éventuellement, selon des méthodes connues en soi, le composé de formule V en un composé de formule I désiré.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que, lorsque le produit de formule V obtenu est un produit de formule Va,
R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-C(Z)-(CH2)r-Hal (Va) où Hal représente un halogène, on fait réagir le produit Va avec un composé de formule VI
H-N(R1)-E1-X2 (VI) dans laquelle X2 est défini comme précédemment, et E1 est un bras espaceur, pour obtenir un composé de formule Vb R2-SO2-N=N-Ar-N(R)-C(Z)-N(R1)-E-X3 (Vb) puis on effectue, le cas échéant, une réaction de déprotection pour transformer le groupement X2 en groupement déprotégé.
12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que, pour préparer un produit de départ de formule II, pour lequel m=p=1, q=0 et X2 représente Cl, ou pour lequel m=p=q=1, E représente -CH2- et X2 représente Cl, on soumet un composé de formule VII
Y1-Ar-NH2 (VII) dans laquelle Y1 est un groupement amino protégé, à l'action d'un aldéhyde de formule R3-CH=O, dans laquelle R3, qui représente H ou un alkyle, est tel que R3-CH2- est égal à R, tel que défini ci-dessus, puis on réduit la base de Schiff obtenue, pour former un composé correspondant de formule VIII :
Y1-Ar-NH-CH2-R3 (VIII) (c'est-à-dire Y1-Ar-NH-R) puis on fait réagir le phosgene ou le chlorure de chloroacetyle sur le composé VIII pour obtenir un composé correspondant de formule IX: Y1-Ar-N(R)-CO-X3 (IX) dans laquelle X3 représente -Cl ou CH2Cl, que l'on transforme selon les méthodes connues en soi en composé de formule II.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé par le fait que l'on utilise un composé de formule VII marqué au tritium sur le groupement Ar.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13, caractérisé par le fait que l'on réduit la base de Schiff à l'aide d'hydrogène tritié ou de tritium pour obtenir un composé marqué sur le groupement CH2 de la formule VIII.
15. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que, pour préparer un produit de départ de formule II marqué au tritium, pour lequel Ar représente p-phénylène m=p=1, q=0 et
X2 représente Cl, ou pour lequel m=p=q= 1 ,
Figure imgf000029_0003
représente -CH2- et X2 représente Cl, on soumet un composé de formule XI
(XI)
Figure imgf000029_0001
dans laquelle Y1 est un groupement amino protégé, à l'action d'un aldéhyde de formule R3-CH=O, dans laquelle R3, qui représente - H ou un alkyle, est tel que R3-CH2- est égal à R, tel que défini ci-dessus, puis on réduit la base de Schiff obtenue, pour former un composé correspondant de formule XII
(XII)
Figure imgf000029_0002
dans laquelle la totalité ou une partie des H*représente le tritium, puis on fait réagir le phosgene ou le chlorure de chloroacetyle sur le composé XII pour obtenir un composé correspondant de formule IX Y1-Ar-N(R)-CO-X3 (IX) dans laquelle X, représente -Cl ou -CH2Cl, et Ar représente p-phénylène, ledit composé IX étant marqué au tritium en position
2,6 du phénylène et sur le carbone adjacent à l'azote du substituant R, puis l'on transforme le composé IX, selon les méthodes connues en soi, en composé de formule II correspondant marqué au tritium.
16. Procédé selon la revendication 12 ou 15, caractérisé par le fait que l'on fait réagir le composé IX avec un composé de formule VI, tel que défini précédemment, pour obtenir un composé de formule X
Y 1-Ar-N(R)-CO-X4 (X) dans laquelle X4 représente -N(R1)-E1-X2 quand X3=Cl, et X4 représente -CH2-N(R1-)E1-X2 quand X =CH2Cl,
et l'on soumet le produit X à une réaction de déprotection pour obtenir un produit correspondant de formule Ile
H2N-Ar-N(R)-CO-X4 (Ilc)
17. Procédé selon la revendication 10 ou 11, caractérisé par le fait que, pour préparer le produit de départ de formule II, dans laquelle R et R1 représentent -H, m=p=q=1, et X2 représente X5, X5 étant un groupement réactif electrophile ou nucléophile protégé, on fait réagir un composé de formule XIII
Z=C=N-E-X5 (XIII) dans laquelle Z et E sont définis comme dans la revendication 1, avec un composé de formule VII
Y1-Ar-NH2 (VII) dans laquelle Y1 représente un groupement amino protégé, et Ar est défini comme dans la revendication 5, pour obtenir un composé correspondant de formule II'c Y1-Ar-NH-(CZ)-NH-E-X5 (II'c), puis, si désiré, on déprotège les groupements Y1 ou X5.
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