WO1987002245A1 - Antioxidative biophylactic agents - Google Patents

Description

明 細

杭酸化生体防御剤

[技術分野 ]

*発明 は ヒ ト ま た は動物の生体防御機構 に 作用 す る 薬剤 に 関 し 、 特 に 生体 に 対す る 非特異的酸化的侵 襲 に対 し て生体 を 防铒す る 作用 を 有す る 薬剤 に 関す る 。

[発明 の背景 ]

生 体 は 環 境 か ら の 様 々 な 衝撃 の 中 に 曝 さ れ て い る 。 絶え間 な く 降 り かか る.宇宙線、 地上や建物か ら の放射線、 日 光中 の紫外線や 温 の変化 な ど の物理 的刺激 ほ言 う に及 ばず、 空気中 の微量の汚染物質や 食品 中 の異物の吸収 に よ る 化学的刺激 、 目 に 見え な ぃ ゥ ィ ル ス やパ ク テ リ ァ ゃ カ ビ な ど の生物学的侵襲 な ど 、 数 え あ げれ ば切 り が な い ほ どで あ る 。 こ れ ら の 各 種 の侵 襲 に 打 ち 勝 っ て 生物 が生存 し て い る の は 、 生体が非常 に巧妙で強力 な防御機構 を 備 え て い る か ら に 他 な ら な い 。

環境か ら の酸化的侵龔 に よ る 生体の障害機序 と 防 御機構ほ 、 環境要因の差 に よ ら ず基本的 に は共通 の 部分が大 き い 。 す な わ ち 、 放射線障害、 オ ギ シ ダ ン ト 障害、 炎症 、 免疫、 老化、 発癌 、 各種の酵素反応 に は フ リ 一 ラ ジ カ ル の生成や活性酸素がか ら ん で い る こ と が知 られ て い る 。 ま た多 く の薬が人体内 で作 用す る と き 、 そ の代謝作用 の一環 と し て フ リ ー ラ ジ カ ルが生成 さ れ る こ と が知 ら れ て い る 。 フ リ ー ラ ジ カ ル 生 成 は 、 · 0 ₂ ( ス 一 ノ 一 オ ギ サ イ ド ラ ジ カ ル） が、 白血球の殺菌作用 、 あ る 種 の酵素の活性化 等 に生理的 に 関芋 し て い る こ と な ど一部 の有用 な作 用 を 除い て 、 概ね健康 な組織 に と っ て有害 な要素で あ り 、 生体 に は こ れ ら に対す る 非特異的防御系 が備 わ っ て い る の で あ る 。 こ れ を具体的 に説明 する と 、 生体が放射線や オ キ シ ダ ン ト に暴露 さ れた り 薬剤 の 作用 を受け る と 、 こ れ ら は直接 に D N A な ど生物学 的 に重要 な物質 を 障害す る 他 に 、 空気中 の 0 ₂ と 反 応 し て · 0 ₂ を產生 し た り 、 組織 中 の水 ( Η 2 Ο ) と 反応 し 二次的 に · Ο Η ( ヒ ド ロ ギ シ ラ ジ カ ル） な ど反応性の強い ラ ジ カ ル を 生成す る 。 · Ο ₂ は組織 中 に あ る S O D ( ス ー パ 一 オ ギ サ イ ド * デ ィ ム ス タ — ゼ） に よ り 、 H 2 O ₂ に され消去 され る 部分 も あ る 。 H 2 O 2 は 力 タ ラ 一 ゼ に よ り 水 と 酸素 に変換 さ れ る が、 · 0 ₂ と さ ら に反応 し て非常 に 反応性の強 い · Ο Η を生成 し 、 色 々 な生体物質 を 攻撃す る 。 特 に こ れ ら は脂質 ラ ジ カ ル の生成 を介 し て 、 生体膜の 成分で あ る リ ン脂質 の不飽和脂肋酸 の過酸化へ と 発 展 さ せ る 。 こ う し た膜の脂質 に発生す る フ リ ー ラ ジ カ ル の連鎖反応 を 断 ち切 る 役 目 を す る の が 、 ビ タ ミ ン E で あ る 。 脂質の過酸化 を受 けた生体膜は重合反 応 を 起 こ し て生体膜 の機能障害 を来た し 、 色 々 な生 化学的反応の一時的阻害や副腎皮質系 ホ ル モ ン 作用 の異常 を も た ら す。 過酸化脂質生成 に よ る 生体膜損 傷 を 防御す る の が、 グル タ チ オ ン （ G S H ) — ペ ル オ ギ シ ダ ー ゼ系 （ G P 系） に よ る 過酸化物 の 消去作 用 で あ る 。

こ の よ う に 、 生体は 内外か ら 様 々 な酸化的侵襲 を 受 け て い る が 、 同時 に生体 ほ こ れ に対 し 、 ビ タ ミ ン · E の作用 や、 上記 S O D 系 や G P 系 の よ う な ラ ジ カ ルゃ過酸化物の 消去作用 に よ る 防御機構が働い て い る の で あ る 。 こ の 防御機構が充分 に 作用 し な い と 、 こ れ ら の長期的影響が脇や心朦の虔血的障害 、 肺の 損傷や細胞の老化 と い う 一般的現象 を 結果す る 。 こ れ ら 各種の ラ ジ カ ルが直接 に D N A 分子 を損傷 し 、 発癌 に つ なが る こ と も あ る し 、 ま た 多 く の化学発癌 物質 と 中間代謝産物ほ 、 フ リ ー ラ ジ カ ル そ の も の を 舍 む か、 あ る い は フ リ 一 ラ ジ カ ル を活発化す る 働 き が あ り 、 フ リ ー ラ ジ カ ル と それ に 隨伴す る 各種 の 障 害 と そ の 防御 は発癌 の 防御 の 問題 で も あ る 。

[従来 の技衛 ] 斗 フ リ — ラ ジ カ ル を有効 に抑制、 排除す る 医薬 ほ未 だ開発 さ れ て い な い 。 脂質 ラ ジ カ ル の生成 を 阻害す る と 言わ れ て い る ビ タ ミ ン E の作用 は 、 放射線防護 作用 な ど の 全身 的効果でみ る と 未だ安定 し た効果が 得 ら れ て い な い 。 す な わ ち 細胞 レ ベ ル で有効 な作用 を有す る 物質で あ つ て も 動物の全身的バ ラ ン ス を崩 す よ ラ な副作用が大 き い場合 に は医薬 と し て使用す る こ と が で き な い し 、 一般の 医薬 に おい て も そ の 副 作用 が問題 と な る 程度以下 の投与量で使用せざ る を 得 な い

癌治療 に お い ては 、 癌細胞核 の破壊 を 目 的 と し て 放射線照射が汎用 されて い る が 、 隨伴す る 目 的箇所 以外 の放射線照射 に よ る 全身的副作用 に対 し て は 、 殆 ど対策が な さ れ て い な い の が現状 で あ る 。

故射線 を 取扱 う 医療お よ び各種産業 に おい て ほ 、 各従事者の放射線被曝を 防止す る た め に種 々 の手段 が採 られて い る が、 放射線障害 を予防 し た り 、 被曝 を受 け た "ΡΓの 障害 を減弱 し 得 る有劾 な薬剤 は未だ 開発 され て い な い 。 放射線防護物質 と し て は S H 基 を有す る 含硗物質 と し て シ ス テ ア ミ ン 、 S ， 2 — ァ ミ ノ ェ チ ル イ ソ チ ウ ロ ニ ゥ ム 、 s — 2 — （ 3 — ア ミ ノ プ ロ ビル ー ァ ミ ノ ） ェ チ ル ホ ス ホ ロ チ オ イ ッ ク ァ シ ド （ W R — 2 7 2 1 ) 等が知 ら れ て い る が 、 こ れ ら は放射線障害防護効果は大 き いが 、 細胞毒 で あ り 副作用が非常 に大 き く 、 中毒量 と 有効量 と に差が な ，く 、 人体 に は適用 し 難い。 ま た 、 生理的 に 放射線 を 防護す る 作用 の あ る グル タ チ オ ン は外部か ら 投与 し て も 細胞内 に入 リ 難 く 体内残留 時間 も 短い （半減期 2 分） た め 、 大量 に投与 し な い と 効果は期待 で き な い .

上記の 通 り 、 フ リ ー ラ ジ カ ル生成 に伴 な う 生体 の 障害 ま た は損傷 に 対 し て は 、 前述 の S O D 系や G P 系 を主役 と す る 生体内 の 防御機構 に頰 る の み で、 外 部か.ら こ れ を有効 に 作用 さ せ る 有効 な手段は特 に採 られ て 、 な い の が現状 で あ る 。 し か し な が ら 、 特 に 癌 治 療 を 目 的 と し て 放射 線 を 照 射 す る 場合 の よ ラ に 、 体内 で異常 な フ リ ー ラ ジ カ ル生成が詠起 さ れ る 場合 に は生体 自 身 の保有す る 防御機構で ほ ま か な い 切れず、 前述 の通 り の様 々 な機能障害 を も た ら す こ と に な る 。

発明 は かか る 従来技衛の現状 に鑑み て 、 放射線 被曝 な ど各種 の酸化的侵襲 に よ る 生体 の損傷 を 抑制 す る こ と の で き る 薬剤 を提供す る こ と を 目 的 と し て い る 。

[発明 の 開示 ]

本発明者 は上記 目 的 を 達成す る た め 、 銳意研究 し た結果、 金属蛋 白 で あ る メ タ 口 チ ォ ネ イ ン （以下、 M T と い ラ ） が 、 生体膜の過酸化等 に起因す る 生体 の機能障害の抑制 に寄年 し 得 る こ と を見い 出 し 、 生 体内 に M T を 誘起 さ せ る こ と に よ っ て例 え ば放射線 障害 に 対する 防護作用 の よ ラ な抗酸化生体防御作用 を生 じ さ せ る こ と がで き る こ と を 見い 出 し 、 末癸 を 完成 さ せた。

す な わ ち 、 术発明 は新親 な抗酸化生体防御剤 で あ り 、 ヒ ト ま た は動物の生体内 に お け る M T誘起能 を 有 す る 物質 を 合有 す る こ と を 特徼 と す る も の で あ る 。

M T は 、 構成 ア ミ ノ 酸 の 約 3 分 の 1 が シ ス テ ィ ン で 占 め ら れ る 非常 に S H 基 に 富ん だ分子量約 6000〜 7000の低分子蛋 白質 で、 微生物か ら 高等生物 に至 る ま で各種 の生体細胞中 での存在が知 ら れ て い る 。 M T ほ 、 C d や H g な どの重金属 中毒 の緩和 に 害与 し て お り 、 ま た必須元素で あ る Z ii 濃度 の生体内恒常 性 （ホ メ ォ ス タ 一 シ ス ） の維持 に重要 な役割 を 演 じ て い る と 推定 さ れ て い る が 、 そ の生理作用 に つ い て は土だ明確 に は解明 さ れて い な い （ M. Webb et a 1 ： B i ochem . Pharmaco l . 3J , 137 ( 1982 ) , A . Ka r i n ： Cel l ϋ ，9 (1985)) 。 ま た 、 C d ， Z n , C u ， H g , A u , A g の投与 に よ っ て M T が生体組織 内 で誘起 さ れ る こ と は知 られ て い る （不破敬一郎編 著 ： 生体 と 重金属 ， 講談社発行 （ 1381) ) が、 外部 か ら 投与 さ れた 質 に よ っ て誘導 さ れた M T が、 生 体 に おけ る 酸化的侵襲 に対す る 防御作用 を呈す る こ と 、 お よ び下記の物質 の投与 に よ っ て顕著 な効果が 得 られ る こ と は本癸明者が初 め て見い 出 し た こ と で あ る 。

す な わ ち 、 本癸明 に おけ る M T誘起能 を有す る 物 質 と し て は 、 従来 よ り M T誘起能 を 有す る 物質 と し て知 ら れて い る カ ド ミ ウ ム 、 亜鉛 、 銅、 水銀 、 金 、 銀等 の金属 ま た は そ の化合物 を'用 い る こ と がで き る が、 术発明者 は 、 特 に マ ン ガ ン ま た ほ そ の化合物、 ス ト レ ブ ト リ ジ ン S 產生能消失 ¾理 を 旌 し た瑢血性 逢鎖球菌 ( Streptococcus haenol iyt ics ： 以下 、 溶 連菌 と い う ） 、 担子菌類サル ノ コ シ カ ケ科 に属す る 力 ワ ラ タ ケ ( Coriolus versico lor Quel) の油 出物 が顕著 な M T誘起能 を有 し 、 放射線障害 に対す る 防 護作用 の ょ ラ な顕著 な抗酸化生体防御作用 を 呈す る こ と を 見い 出 し た。

人体 に適用 す る 場合 に ほ毒性の 点か ら マ ン ガ ン 、 亜鉛 、 金 ま た は こ れ ら の化合物、 上記溶連菌 お よ び 上記 力 ワ ラ タ ケ ¾出物が好 ま し く 、 特 に効果の 点 で マ ン ガ ン ま た は そ の化合物、 上記溶連菌 お よ び上記 力 ワ ラ タ ケ抽 出物が好 ま し い。 マ ン ガ ン は水溶性マ ン ガ ン塩 を 用 い る こ と が特 に 好 ま し い 。

溶連菌 は 、 ス ト レ プ ト リ ジ ン と ぃ ラ溶血毒素 を 産 生す る 連鎖球菌の一種で、 丹毒、 敗血症、 産 じ ょ く 熱、 扁桃炎 そ の他種 々 の疾病の病原菌で あ る が 、 酸 素 に 安定 な ス ト レ プ ト リ ジ ン S を 産生す る 能力を 消 失 さ せて人体 に適用 し 得 る こ と が知 ら れ て い る （特 開昭 58 - 79822号公報） 。

*発明 に用 い る 溶違菌は 、 ス ト レ ブ ト リ ジ ン S を 産生す る 能力 を 消失 さ せた も の で あ れ ば使用可能で あ り 、 *発明 に お け る 「溶連菌 j な る 語は各種菌体 を適宜処理 し た も の を 含む意味 で あ り 、 例 え ば、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ピ オ ゲ ネ ス S u 株 （ A T C C 2 1 0 6 0 ) 、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ピ オ ゲ ネ ス C 2 0 3 S 株 （ A T C C 2 1 5 4 6 ) 、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ピ オ ゲ ネ ス S — 4 3 株 （ A T C C 2 1 5 4 7 ) 、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ピ オ ゲ ネ ス ブ ラ ッ ク モ ァ株 （ A T C C 2 1 5 4 8 ) 、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス • エ キ シ ミ リ ス 株 （ A T C C 2 1 5 9 7 ) 等 を 各種 処理 し た も の を 用 い る こ と が で き る 。 -，

こ れ ら 菌体の ス ト レ プ ト リ ジ ン S 産生能 を 消失 さ せ る 方法 と し て は 、 生菌体 を比較的高濃度のぺ ニ シ リ ン を 含む塩類溶液例 え ばバ ー ン ハ イ マ 一基礎培地 i

( B B M ) に懸濁 し 、 3 0 〜 3 8 °C に 保持す る 方法 ( Jpn . J . Exp . Med . 38 ： 161 - 171 ( 1966 ) ) が代 表的 で ぁ リ 、 こ れ を さ ら に 4 0 〜 5 0 °C で処理す る 方法 （特公昭 43-8830 号公報） も 用 い る こ と が で き る 。 ま た 、 ペ ニ シ リ ン の代 り に セ フ ァ ロ ス ボ リ ン C お よ び サ イ ク ロ セ リ ン を 用 い て も 同様の結果が得 ら れ る （英国特許第 1153113 号明細書 、 特公昭 45-887 1 号公報、 同 48-2874 号公報） 。 そ の他、 上記工程 に お い て過酸化水素 ま た は 1 価 ア ル コ ー ル で処理す る こ と に よ り 、 生菌数の少 な い製剤 を得 る こ と も で き る （特公昭 55 - 43754号公報、 特開昭 57 - 18821号公 報） 。

溶連菌 の 菌体 を 細胞壁合成が阻害 され る よ う な条 件、 例 え ばペ ニ シ リ ン を 含有す る 高張 な培地 で培養 す る か、 或 い は溶連菌菌体 に溶菌酵素 を 作用 さ せた 後 に ベ ニ シ リ ン等の細胞壁合成阻害剤 を 含 む培地 で 培養 さ せ る こ と に よ っ て得 ら れ る L 型菌が起炎性、 発熱性 お よ び疼痛惹起性等の 欠点が な い こ と が知 ら れて お り 、 こ れ も 好 ま し い菌体 と し て用 レ、 る こ と が で き る （特開昭 56 - 15210号公報） 。

本発钥 に 用 い る 特 に 好 ま し い溶連菌 は 、 ヒ ト 由来 A 群溶連菌 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ビ ォ ゲ ネ ス （ St re ptcoccus pyogenes)弱毒 S u 株 を べ ニ シ リ ン G カ リ I o ゥ ム で処理 し た菌体 で、 こ れ を凍結乾燥 し た菌体製 剤 は O K — 4 3 2 と し て知 ら れて い る 。 O K — 4 3 2 は上記菌体 を ペ ニ シ リ ン G カ リ ウ ム （ 25，000単位 ノ m 1 以上.、 好 ま し く は 27，000〜 80 , 000単位

1 ) 含:言す る バー ンハ イ マ ー基礎培地 に て 3 0 〜 3 8 °(Γ (：好 ま し く は 3 7 で） で 1 0 〜 3 0 分間 （好 ま し く は Ζ Ο 分 間） 培養 し 、 次 い で 3 0 〜 5 0 °C (好 ま し く は 4 5 °C ) で 2 0 〜 4 0 分間 （好 ま し く は 3 0 分間） 培養す る と と も に 、 そ の 間 に過酸化水 素 処 理 を 行 な い 、 培 養処理物 を 凍結乾燥 し た も の で、 安定剤 を合 む 白色 ま た は類 白色で吸湿性の凍結 乾燥粉末で あ る 。 生理食塩水 を 加 え た懸濁液 の P H . は 5.5 〜 7.5 で あ り 、 浸透圧比は生理食塩水 に対 し 1 で あ る 。 O K — 4 3 2 は 、 ス ト レ ブ ト リ ジ ン S の 產生能は認め られず、 原料の S u 株生菌 と 比較す る と 荧膜の消失 な ら び に細胞壁の部分的障害がみ られ る 。 ィ ヌ の L D 50値 は 3 6 K E Z k g ( I K E ほ乾 燥菌体 O. l m g に相当） で あ る 。 こ れ ら O K — 4 3 2 の製法、 性状、 生物学的特徴、 毒性等 の製剤的特 徴、 お よ び生理作用等 に つい て は石 田名香雄お よ び 星野孝著 Γ溶連菌製剤 O K - 4 3 2 」 Excerpta Med ica 発行 （ 1985 )を 参照 さ れた い。

力 ワ ラ タ ケ ¾出物 は 、 例 え ば 力 ワ ラ タ ケ の菌糸体 を熱水抽 出 し 、 上澄液 に礞酸 ア ン モ ニ ゥ ム を飽和 さ せ て生 じ た沈穀 を 分取、 脱塩 し た画分 を 用 い る こ と が で き 、 こ の物は P S — K と し て知 ら れ て い る （塚 越茂 ： 癌 と 化学療法 丄 ， 251-257 ( 1974 ) 、 医学 の あ ゆ み ϋ ,505-510(1974) ) 。 こ の P S — Κ は ァ ス ノ、 · ラ ギ ン酸 ， グル タ ミ ン酸 の ほか 1 9 種類の ァ ミ ノ 酸 よ り な る 約 1 5 % の タ ン バ ク を 含有す る タ ン パ ク 糖 で 、 毒性が き わ め て少 な い こ と が知 ら れ て い る 。

な お、 本発明 の抗酸化生体防御剤 は 、 代表的 に は X線 、 ct 線 、 /^線、 ァ線、 中性子線 、 加速電子線 、 紫外線 な どの放射線 に よ る 障害 を 防護す る 放射線障 害防護剤 と し て有効で あ る が、 上記溶連菌 お よ び 力 ヮ ラ タ ケ油 出物 ほ抗腫瘍活性が あ る こ と が知 ら れ て お り 、 癌 の治療 に おい て： *：剤 を放射線療法 の 際 に使 用 す る 場合 に は 、 そ の抗腫瘍活性 の高い も の を用 い る こ と が好 ま し く 、 こ の場合 は上記処理 に加 え て抗 腫瘍活性 を 增強 さ せ る 各種処理 を 加 え る こ と が で き る 。

未発明 の抗酸化生体防御剤 は 、 M T 誘起能 を 有す る 上記物質 を 、 そ の ま ま あ る い は適宜の薬理的 に 許 容 さ れ る 希釈剤 、 賦形剤 、 担体等 と 混合 し 、 粉末、 顆粒 、 錠剤 、 カ プ セ ル剤 、 注射剤等 の剤型 で、 経 口 的 ま た ほ非経 口 的 に投与す る こ と が で き る 。 投与量 ほ抗酸化生体防御剤 と し て の具体的使用 目 的、 上記 物質の M T 誘起能、 投与対象 、 投与方法等 に よ っ て 大 き く 異 な る の で特 に 限定す る こ と は で き な いが、 概略 1 回 当た リ 0 . l 〜 1 0 0 0 m g Z ¾: g 体重で あ り 、 放射線障害 を予防す る 目 的 で使用す る 場合 に は 、 放射線照射の約 1 日 前 に投与 し て お く こ と が望 ま し い 。 水溶性マ ン ガ ン は放射線障害防護作用 が顕 著 で ぁ リ 、 こ の場合 2 価の M n イ オ ン を 有す る 塩、 例え ば塩化マ ン ガ ン 、 硗酸マ ン ガ ン等 を M n 当た り 1 0 〜 3 0 m g Z k s 体重、 投与す る こ と が望 ま し い。 上記溶連菌お よ び 力 ワ ラ タ ケ ¾出物 も 放射線障 害防護作用が顕著で あ り 、 こ の場合截略 1 回当た り 溶連菌で 0 . l 〜 1 0 m g k g 体重、 力 ワ ラ タ ケ 插 出物で 1 0 〜 1 O O O m g Z k g 体重が適量 で あ る 。

[図面の 箇単 な説明 ]

第 1 図 は X線 830r ad照射後の金属投与群等の マ ウ ス の累積死亡率 を示すグ ラ フ 、 第 2 図ほ同実験例 に け る X線 830rad照射後の M _n 投与群等 の'マ ウ ス の 体重変化率 を示す グ ラ フ 、 第 3 図 は X線 720 rad照射 後の M n 投与量別 のマ ウ ス の生存率 を示す グ ラ フ 、 第 4 A 図 お よ び第 4 B 図 は 、 X線 830 rad照射後の各 /3 群マ ウ ス の生存率 と 、 M ix 投与量 お よ び肝臓中 M T 濃度 の対数値 と の関係 を 単回帰分析 に よ る 相関係数 と と も に 示す グ ラ フ 、 第 5 図 は亜鉑 を 含 む水 を飲用 し て い る マ ウ ス に対 し て ガ ン マ線 を 照射 し た場合 に お け る 照射 後 日 数 に 対 す る 累積 死 亡率 を 示 す グ ラ フ 、 第 6 図 ほ致死量 で あ る X線 720rad照射後の O K - 3 2 投与群等 の マ ウ ス の生存率 を示す グ ラ フ 、 第 7 図 は グ ル タ チ オ ン 一 ペ ル オ ギ シ ダ 一 ゼ （ G P 系） に対す る 銅 - 亜鉛一 チ ォ ネ イ ン の 関与 を 説明 す る 反応図 、 第 8 図 は M T の G P に対す る K m値酒定 のた め の グ ラ フ 、 第 9 図 は M T の G P への作用 点 を 示す グ ラ フ で あ る 。

[作用 お よ び実旌例 ]

以下 に *発明 の抗酸化生体防御剤 の薬理作用 を そ の実施例 と と も に示す。

I . M T 誘起物質 に よ る 杭酸化牛体防御作用

酸 化 的 侵 襲 に よ る 生体 へ の 障 害 機序 と 防御 機 構 は 、 前述の通 リ 障害 を 与え る 要因 に よ ら ず基本的 に は共通 の部分が大 き い の で 、 こ こ で は特 に放射線障 害 を代表 ^ と し て示す。

実験例 1 (各種金属 に よ る 作用）

マ ン ガ ン （ M n ) 、 カ ド ミ ウ ム （ C d ) 、 亜鉛 ( Z n ) を それぞれマ ウ ス に前投年 し 、 全身へ の X Ί斗 線照射 を行い 、 体重変化 と 死亡率 を 記録する と と も に肝瞋中 の M T量 を定量 し た。

(1) 法

動物は ddY系 clea n 雄マ ウ ス （ 7 週今） を用 い 、 M n C 1 2 ( lOm g M n Z k g 体重） 、 C d C l ₂ (3m g C d Z k g 侓重） 、 Ζ ιι ( C H 3 C O O ) ₂ ( 20m g Z n Z k g 体重） いずれ も 半致死量以下 を 0.9%食塩水 に瑢解 し て そ れぞれ皮下注射 し、 2 4 時間後 に ほ ぼ L D 50量の 630 radの： X線 を照射 し 、 そ の 後 3 0 日 間 マ ウ ス の体重変化 と 死亡率 を 記録 し た 。 同時 に 、 こ れ ら の金属投与か ら 2 4 時間後の X 線照射直前 と X線照射か ら 2. 4 時間後のマ ウ ス の肝 臓 を と リ だ し 、 肝ホ モ ジ ネ ー ト の M T畺 を小野坂 ら の じ d 飽和へモ リ ゼ一 ト 処理法 （衛生化学 £1 : 12 8 - 131 ( 1978 )) に よ り 定量 し た 。

(2) 結 果

X線 830rad照射後 の各群マ ウ ス の累積死亡率 を 第 1 図 に示す。 M il ， C d ， Z n い ずれ の金属投与群 に おい て も 対照群 （無投与） に比べ放射線 に よ る 死 亡率 の減少が見 ら れ、 特 に , Μ ιι の投与群で は 対照群の死亡率 0.75に対 し 、 それ ら は い ずれ も 0.08 と 10分の 1 以下 に減少 し て ぉ リ 、 M n , C d を 前投 与す る こ と で放射線障害が著 し く 軽減 され る こ と を 確認 し た。 そ の際、 3 0 日 間マ ウ ス の体重移行 を見 る と 、 対照群 で は 、 放射線障害 に よ る 典型的 な二峰 性の体重減少が見 ら れた の に対 し 、 M n 投与群 に お い て ほ 、 第 2 図 に示す よ う に 体重減少 ほ殆 ど見 ら れ ず 、 逆 に放射線照射後 も 増加 し つづ け 、 毛並 み 、 貧 血 の状態、 身体の動 き か ら みたマ ウ ス の一般状態が 明 ら か に 良好 で あ つ た。 ま た 、 C d 投与群 に おい て も 、 C d 自 身 の毒性 に 由来す る と 思 われ る 典型的 な 体重減少 は見 られず 、 一般状態 ほ M il 投与群同様 に 良好 で あ っ た。 一方、 Z _n 投与群 は第 1 図 に示す よ う に死亡率の減少 は見 ら れ る も の の体重変化 に 関 し て は 固体差が大 き か っ た M II の場合は半致死量の 2 0分 の 1 以下 の棻用量で防護効果が得 ら れ る が、 C d や Z II の場合 は半致死量の 2 分の 1 〜 3 分 の 1 と ぃ ラ 薬用畺 を 必要 と す る こ と も 上記の事実 と 関連が あ ろ ラ 。

各種金属投与 と X線照射前お よ び照射 2 4 時間後 の マ ウ ス の肝臓中 M T量 を 第 1 表 に示す。

第 1表 マウスの肝臓中の MT濃度（ it gノ g肝組織） 平均土標準偏差

前 処 理

照射前 照射後

CdClz 3agCd/kg s.c. 138±41 583±38

Za - acetate 5agZn/kg s.c. 33土 5 88±25

Zn - acetate 20agZn/kg s.c. 120±18 189±24

M11CI2 lOingMn/kg s.c. 128土 18 153±38 生理食塩水 5ng/kg s.c, 25土 1 88± 14

無投与 28土 1 71±22

X線照射直前の マ ウ ス 肝臓中 の M T量 ほ対照群 26 ± 1 /t g Z g 肝組織 に対 し 、 Z n 20 m g / k _g 体 重、 C d 3 m g Z k g 侓重、 M II 10 m g k _g 体重 投与群で は約 5 〜 7 倍 の増加が確認 された。 さ ら に X線照射後で は金属投与の如何 に かかわ ら ず照射前 に比べてマ ウ ス肝矂中 の M T 量が数 10 ^ g ノ g 以上 増加 し て い る こ と がわ か る 。 ま た 、 同様 に じ u の 1. 25 m gr Z k g 体重 を 皮下注射 し た場合 も マ ウ ス の肝 朦中 M T量は 118 ± 21 ;t g Z g 肝組織 に増加 し た。 な お、 こ れ ら の結果 に対 し て M T生成能の な い M g 塩等 は放射線防護作用 を示 さ な か つ た。 実験例 2 ( M il 投与量の作用）

n ¾ 法

M n 投与量 を 5 〜 5 O m g M n Z k g の範囲 で変 え 、 ほ ぼ半致死線量で あ る 830radと 致死線量 で あ る 720 r a dで行 っ た ほ か は 、 実験 ^ 1 と 同様 の方法 で行 つ た 。

(2) 結 果

X線 720rad照射後の各群マ ウ ス の生存率 を第 3 図 に示 し 、 照射後 2 4 時間後の肝朦 中 の M T量 を 第 2 表 に 示 し た。 肝矇 中 の M T量は第 2 表 に示す通 り 、 M _n 投年量 の増加 と と も に増大 し 、 .ま た生存率 も 第 3 図 に示す通 り 、 5 〜 2 0 m g M n Z k g の範 囲 で M n 投与量 の増加 と と も に増大す る こ と が確認 され た。 5 0 m g M n Z k g の場合 の生存率 の低下 は M n 自 身 の毒性 に よ る も の と 考え ら れ る 。

第 2 表 M il 投与量別 の M T生成

線 830 r a d照射後の各群マ ウ ス の生存率 と 、 M n 投与量 お よ び肝臆中 M T濃度の対数値 と の 闋係 を単 回帰分析 に よ る 相閬係数 と と も に第 4 A 図お よ び第

4 B 図 に示 し た。 こ の結杲は 、 マ ウ ス の生存率が、 M n 投与量 よ り も 肝膿中 の M T濃度 に直接相関 し て レゝ る こ と を 示 し て い る 。

実験例 _3 ( Z II の放射線量 に対する 作用）

i¾ 1m度 (lOOOppa) の Z n イ オ ン を合む水 を マ ウ ス に前投与 し 、 全身 への X線照射 を 行い 、 放射線量 に 対す る 生体防铟効果 を検討 し た。

第 5 図は Z II を 含 む水 を飲用 し て い る マ ウ ス に 対 し て半致死 な い し致死線量 の ガ ン マ線 を 照射 し た場 合 に おけ る 照射後 日 数 に対す る 累積死亡率 を 示 し た も の で 、 Z n 飲用群 に お い て対照群 に比 し て致死率 の減少 と 廷命効果が観察 された。 ま た 、 こ の結果か ら 、 致死量以上の大量の放射線照射 に対 し て は照射 効果 を減弱 さ せず、 よ り 低線量 の放射線照射 に対 し て生体防银効果 を 発揮 し て い る こ と がわ か る 。 実験例 4 (溶連菌 、 力 ワ ラ タ ケ抽出物 に よ る M T 誘 起作用）

O K - 4 3 2 ( 中 外製薬製 ： 商 品名 ビ シ バ ニ 一 ル ） 、 P S - K (三共製薬 、 呉羽化学製 ： 製品名 ク レ ス チ ン ） を マ ウ ス に投与 し 、 肝臓中 の M T濃度 を 定 量 し た 。 ま た 、 カ ド ミ ウ ム （ C d ) 、 亜鉛 （ Z n ) 、 マ ン ガ ン （ M n ) な ど の M T 誘起金属 を投与 し て こ れ と 比較 し た。

(Π 方 法

動物は J c 1 ： I C R 雄マ ウ ス （ 7 週今お よ び 9 週令） を 用 い、 飼料 と 水 を 自 由 に 与 え恒温環境で飼 育 し た。 第 1 表 に示す各種薬剤 を 1 回投与 あ る い は 丄 〜 2 日 お き の連続投与で、 表 中 の用量 と 方法 で投 与 し 、 2 0 時間後 に肝瞜の M T を 定量 し た。 M T の 定量 は小野坂 ら の C d - へ モ グ ロ ビ ン吸着法 （衛生 ィ匕学 24 ： 128 - 131 ( 1978 )) お よ び Cheria n ら の A g — ヘ モ グ ロ ビ ン吸着法 （ Toxicol . 23 ： 11-20 (1 982 ) ) に よ っ た。 2) ¾

マ ウ ス の肝臓中 の M T ¾度は 、 4 遇今か ら 2 5 週 今の無処理 の マ ウ ス では通常約 2 〜 3 n olZ g で あ る が、 第 3 表 に示す通 り 、 O K - 4 3 2 ぉ ょ び 1> 3 ー は 1 回投与、 連練投与 と も に対照群 の マ ウ ス よ ^数倍 の値 と な っ て お り 、 金属投与 に匹敏す る 高い M T誘起能 を示 し た 。

第 3表 各種の前処理を行ったマウスの肝朦中の MT生成 肝臓中 MT濃度 (nmol/g tissue) itl ヮス

週令 C d - h e m法 A g - h e m法 -4il 1 i¾ i ·Ρ· i 14 ±：) lo ± 0

1 KE/匹 X10回 i.P. 9 13土 11

PS-K 50mg/kgX 1回 i.P. 7 . 5.7± 1.1

OUfllg/ Kg A. ^H] し Q no

Ρ· 乙 IL Q d · Q ϋ

CdCl₂ 3mgCd/kgX 1回 s.c. 7 25±5.0

Zn-acetate 20mgZn/kgX 1回 s.c. 7 15±2.3

M11CI2 lOngHn/kgX 1回 s.c. 7 18±2.0 生理食塩水 6.7iBl/kgX 1回 i.P. 7 ' 2.8± 1.0 1.7±0.2

8.7nd/kgX10回 i.P. 9 1.5±0.4 すべての成績は、 5匹の平均であり、 標準偏差と共に示した,

審験例 5 (溶連菌 に よ る 放射線防護作用）

0 K - 4 3 2 ( 中 外製薬製 ： 商 品名 ビ シ バ - ― ル ） を マ ウ ス に 前投与 し 、 全身 へ の ： X 線照射 を 行 い'、 照射後の生存率 を記録 し た。 ま た そ の作用 を マ ン ガ ン （ M n ) と 比较 し た。

(1) 方 法

動 物 は J c 1 ： I C R 雄マ ウ ス （ 7 週今） を 用 い 、 0 K - 4 3 2 ( 5 K E Z匹） 、 M n C l ₂ ( 20 m g M II Z k g 体重） を 0.9%食塩水 に溶解 し て 、 O K - 4 3 2 は腹腔内注射、 M n C l 2 は皮下注射 し 、 1 日 後 に'対照群 と と も に致死線量 で あ る 720rad の X線 を照射 し 、 そ の後の 3 0 日 間 の生存率 を記録 し た。

(2) 結 果

X線 720rad照射後の各群マ ウ ス の生存率 を第 6 図 に示 し た。 こ れ に よ る と 、 O K — 4 3 2 投与群、 M ϋ 投与群は対照群 （無投与） に比べ放射線 に よ る 死 亡率の減少が み ら れ、 Ο Κ — 4 3 2 の前投与 に よ つ て Μ _η 前投与 に匹敏す る 放射線障害減弱作用が得 ら れ る こ と が確 ^ された。

Π . Μ Τ の抗酸化 ^体防纈機構に お け る 作用

生体の抗酸化生体防御機構 に おい て 、 グル タ チ ォ ン （ G S H ) — ペル ォ キ シ ダー ゼ系 （ G P 系） が重 要 な役割 を 果た し て い る こ と は前述 の通 り で あ る 。 第 7 図 に示す G P 系 では G S H - ペル オ ギ シ ダ ー ゼ ( G P ) が過酸化物 を還元す る た め に 、 G S H を 電 子供与体 と し て必要 と し 、 そ の結果 G S H を 酸化型 グル タ チ オ ン （ G S S G ) に変 え る 。 酸化 された G S H す な わ ち G S S G は 細跑外 に 流 出 し や す い の で 、 時 に細胞内 の G S H が不足す る 場合が当然考 え られ 、 事実 G S H 低下時 に放射線感受性が増す こ と も 観察 され て い る （ O hara e t al ： Exp. Ce l l . Res . 58 , 182 - 185 ( 1970 )、 Mod i g e t a 1 ： Int . J . Ra diat . Bio l . 22 , 258-268 ( 1971)、 他） 。 G S H レ ペル の低下 は 、 放射線暴露時 の放射線抵抗性の減弱 の他、 胃 潰瘍 の発生や細胞 の癌化 溶血 な ど各種の 病理的現象 に つ なが る こ と も 報告 され て い る （ Boyd e t a 1： Sc ience . 2_ 5 , 1010 - 1012 ( 1979 )、 他：） _β

*発明者 は G S H と 同様 に M T に よ っ て も G P 反 応 が 作 動 す る こ と を 確認 し た 。 以 下 こ れ を 詳 述 す る 。

(1) 方 法

M T が G S H の存在 し な い条件 で、 G P 系 へ の電 子供与体、 す な わ ち G S H の代役た り 得 る か を調べ る た め に 、 第 7 図 に 示す i n V i t r 0の系 を 作成 し た。 す な わ ち 、 第 7 図 に おけ る 基質 t-buty l- O O H の G P に よ る 還元 を 、 N A D P H 酸化系 と 連動 さ せ て 、 キ ュ べ ッ ト 内の 反応液中 の N A D P H の減少 に よ る 3 4 0 n m の吸光度の変化 を 、 ダブル ビ ー ム分光光 度計 で追 し た。 分光光度計 の 2 つ の ギ ュ べ ッ ト 中 に 正 確 に 同 じ 容量 で以下 の 薬液 を 充た す 。 反 応 液 は 、 2 . 5 m M (以下、 濃度はすべ て最終濃度） の N a N 3 を 加 えた 2 5 0 m Mの リ ン酸塩緩衝液 （ p H 7 . 4 ) を 主体 と し 、 こ れ に ， 0 ， 3 単位 Z m l の G F と グル タ チ オ ン 一 リ ダ ク タ ー ゼ （ G R ) 、 5 m Mの t-butyl-O O H お よ び 0 . 5 m Mの N A D P H«を 2 つ の キ ュ べ ッ ト に加 え て お く 。 最後 に片方の ギ ュ べ ッ ト に だけ G S H ま た は M T を添加す る と 反 応が開始 し て 、 両者の吸光度 の差が記録計 に 観卸 さ れ 、 単 位時 間 当 り の N A D P H の 減少畺 （反 応速 度） が観測 され る 。 G S H ま た は M T 濃度 を 段階的 に増やす こ と （ titration)に よ り 、 G 3? の酵素反応 の K m値 （ Michal is定数） を 測定 で き る 。

(2) 結 果

第 8 図 は 、 G P 系 に G S H で な く M T を段階的 に 加 え る こ と に よ っ て G P に対す る M T の K—;a値 を測 定 し た も の で 、 図 に示す L ineweaver-Burl eの プ π ッ ト に よ っ て求め ら れた Μ Τ の K m値 ほ 、 0 . I m M 付近 に あ る こ と が繰 り 返 し 認め ら れた。 一方 、 G S IS

H の K m値 ほ約 4 m Mで あ っ た 。 な お 、 M T は仔牛 の 肝 臓 よ り 精 製 し た 銅 一 亜鉛 一 チ ォ ネ ィ ン を 用 い た。 第 7 図に 示 し た反応 で、 ま ず反応液 中 に G P と

G R と N A D P H を 入れ て お き 、 そ こ に M T を 加え て も反応 は 開始 さ れ な い 。 し か し こ れ に t-butyl-0 O H. を 加 え る と 第 9 図 に 示 す よ う に 反応 が 開 始 す る 。 こ れ は M T が G R で な く G P 系 の電子供与体 と し て働 い て い る こ と を 示す も の で あ る 。

細胞 中 の M T の濃度水準 は 、 7 〜 5 0 0 it _g Z g wet tissueと 広範 囲 に わた っ て い る が、 术発明者 に よ る 測定 で は正常 の マ ウ ス 肝曦 中 の M T は 、 性や遇 今 で大 き な差は示 さ.ず 、 約 2 0 g / g す な わ ち 3

程度で あ り 、 金属投与 な ど の ス ト レ ス 負荷 に よ り 1 2 0 か ら 数 1 0 0 g Z g ( 2 0 〜 ； l O O /t - M ) ま で上昇 し た。 人の肝臓 中 の M T は動物 よ り 高 く 、 小野坂 ら は 2 0 0 〜 5 5 0 g / g を報告 し て い る （小野坂 ら ： 衛生化学 ϋ， 173 - 176 ( 1984 )) 。

本癸明者 の測定 し た銅 - 亜鉛 ー チ ォ ネ ィ ン の G P に 対す る K m値 は約 1 0 0 Mで あ る か ら 、 生体 に お い て M T が充分 に誘起合成 され て い る 場合 は 、 生理 的 に こ の反応が作動 し う る も の と 考 え ら れ る 。

[産業上 の利用可能性 ]

以 上 説 明 し た 通 り 、 * 発 明 の 抗酸化 生体 防 御 剤 は 、 生体内 に おい て メ タ 口 チ ォ ネ イ ン （ M T ) を 誘 起せ し め 、 ダル タ チ オ ン （ G S H ) の代 り に こ の M T に よ っ て生体防御機能 を 発揮 さ せ る も の で あ る 。 し たが つ て本剤は放射線照射等の酸化的侵襲 に対 し て直接的 に フ リ ー ラ ジ カ ル生成 を 抑制 、 拂除す る も の では な く 、 生体膜の損傷 に基づ く 各種の機能障害 を 防御 し 、 細胞 の抵抗力 と 回復力 を高 め る も の で あ る 。 特 に 、 マ ン ガ ン ま た は そ の化合物、 溶連菌 お よ び 力 ワ ラ タ ケ抽出物は そ の効果が顕著で あ り 、 と リ わ け O K — 4 3 2 、 ： P S — K は抗腫瘍剤 と し てすで に人体 に適用 さ れ て い る も の で あ る か ら 、 そ の安全 性 は確認済 で あ り 、 今後増大す る で あ ろ う 原子力産 業従事者、 癌等の疾病の診断 と 治療 を行 な う 医療従 事者、 お よ び望 ま し く な い放射線被曝 を 診断の 目 的 等で受け な けれ ば な ら な い患者等、 放射線被爆の可 能性が あ る ¾合 に 、 起 こ リ 得 る 放射線障害 を 防止す る た め の予防手段 と し て、 本剤 を予 め投与 し て おけ ば 人 体 内 の 生 体防御機能 を 促進 さ せ る こ と が で き る 。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . ヒ ト ま た は動物の生体内 に お け る メ タ 口 チ ォ ネ ィ ン誘起能 を 有す る 物質 を 含有す る こ と を 特徴 と す る 抗酸化生体防御剤。

2 . メ タ 口 チ ォ ネ イ ン 誘起能 を 有す る 物質が、 マ ン ガ ン ま た は そ の化合物 で あ る 請求 の範 囲第 1 項 に記 載の抗酸化生体防街剤。

3 . メ タ 口 チ ォ ネ イ ン 誘起能 を 有 す る 物質 が 、 亜 鉛、 銅 、 カ ド ミ ウ ム 、 銀 、 金、 水銀か ら な る 群か ら 選択 さ れた少 な く と も 1 種 の金属 ま た は そ の化合物 で あ る 請求 の 範 囲 第 1 項 に 記載 の 抗酸 生佳 防 御 剤。

4 . メ タ 口 チ ォ ネ イ ン誘起能 を有す る 物質が、 ス ト レ プ ト リ ジ ン S 產生能消失処理 を 施 し た溶血性連鎖 球菌 で あ る 請求の範囲第 1 項 に記載の抗酸化生体防 御剤。

5 . 前記溶血性連鎖球菌が、 菌体 を ペ ニ シ リ ン G 力 リ ウ ム を 舍有す る 培地 に懸濁 し 、 3 0 〜 3 8 °C に保 持 し 、 次 い で 4 0 〜 5 0 °G で処理 し た も の で あ る 請 求 の範囲第 4 項 に記載 の抗酸化生体防御剤。

6 . 前記溶血性連鎖球菌が、 前記工程中 に おい て過 酸化水素 と 接触 さ せた も の で あ る 請求 の範 囲第 5 項 に記載 の抗酸化生体防御剤。 23

7 . 前記溶血性連鎖球菌が 、 ス ト レ プ ト コ ッ カ ス · ビ ォ ゲ ネ ス Streptococcus pyogenes) S u 珠 で め る 請求 の範 囲第 4 項 に記載の抗酸化生体防御剤。

8 . 前記溶血性連鎖球菌が、 O K — 4 3 2 で あ る 請 求の範 囲第 4 項 に記載の抗酸化生体防御剤。

9S . - タ 口 チ ォ ネ イ ン誘起能 を有す る 物質が 、 担子 菌類サル ノ コ シ カ ケ科 に属す る 力 ワ ラ タ ケ （ Co r i o l us vers i co l o r Que l) 抽出物で あ る 請求の範囲第 1 項 に記載の抗酸化生体防御剤。

1 0 . メ タ 口 チ ォ ネ イ ン誘起能 を 有する 物質が、 担 子菌類サル ノ コ シ カ ケ科 に属す る 力 ワ ラ タ ケ （ Co r i 01 us vers i co l or Que l) の菌糸体 を熱水油 出 し 、 上 澄液 に硗酸ア ン モ ニ ゥ ム を飽和 さ せ て生 じ た枕殺 を 分取、 脱塩 し た画分 で あ る 請求の範囲第 1 項 に記載 の抗酸化生体防御剤。

1 1 . メ タ 口 チ ォ ネ イ ン誘起能 を 有す る 物質が P S - K で あ る 請求の範囲第 1 0 項 に記載の抗酸化生体 防御剤。

1 2 . 放射線障害防護剤 で あ る 請求 の範 囲第 1 項 に 記載 の抗酸化主体防御剤。

1 3 . 放射線が、 X線、 ct線 、 ）8 線 、 y線 、 中性子 線、 加速電子線、 紫外線 の少 な く と も 1 種で あ る 請 求の範 囲第 1 2 項 に記載の抗酸化生体防镩剤。