WO1985004425A1 - Pellicule moleculaire supportee d'un reseau de fibrine permettant la retention selective, a sa surface, de l'activateur du plasminogene tissulaire et applications en decoulant - Google Patents

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WO1985004425A1
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plasminogen
fibrin
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Eduardo Ricardo Angles-Cano
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Institut National De La Sante Et De La Recherche M
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator

Definitions

  • the invention relates to a molecular film supported by a fibrin network in solid phase, fixed to the surface of a support, preferably covacently, to its use for the selective retention of tissue activator of plasminogen. and to the applications arising from this selective retention.
  • the invention also relates to means for obtaining such supported molecular films.
  • the activators of plasminogene are enzymes having for function the conversion of plasminogene, a proenzyme of ubiquitous distribution, into plasmin, the active proteolytic enzyme.
  • Plasmin is a serine protease capable of lysing fibrin, its main substrate, and other proteins.
  • Plasmin is therefore the effector enzyme of the fibrinolytic system which allows the dissolution of the batch.
  • We can schematically summarize the main reactions involved in the fibrinolytic system as follows:
  • PAs are secreted by a variety of cell types under the control of specific stimuli (Cash, 3.D., Progress in chemical fibri ⁇ olysis and thro bolysis, eds. 3.F. Davidson, MM Samama and PC Desnoyers (raven Press, NY ), p. 97, 1975); they are, on the other hand, freely secreted by neoplastic cells and by transformed cells (Christman 3.K. et al, Proteinase in mammalian cells and tissues, ed. Barrett (Elsevier / North Holland, Amsterdam), p. 91 , 1977).
  • PAs can be classified into two different types according to their molecular and functional characteristics and their reactivity vis-à-vis conventional polyclonal antibodies.
  • Activators of the uro inase (u-PA) type with a molecular weight of 54,000 are produced by epithelial cells and are capable of activating plasminog in both the liquid phase (plasma) and the solid phase (clot). These enzymes have almost no affinity for fibrin (Thorsen S. et al, Differences in the binding to fibrin of urokinase and tissue plas inogen activator. Thromb. Diathes. Hae orrh. 28; 65-73, 1972) and their properties with regard to the activation of plasminogen can lead to the production of fibrinolysis and fibrinogenolysis simultaneously.
  • R AP is the AP Original endothé- subsidiary or tissue activator (t-PA); it is a protein of molecular weight 70,000 which is considered to be the physiological AP of plasma fibrinolysis and thrombolysis. Lack of activity in plasma has been linked to the development of thrombosis
  • the detection and the plasma dosage of the endothelial activator are therefore of paramount importance in the study of normal fibrinolysis' and pathological.
  • the endothelial activator has a very high affinity for fibrin allowing it, on the one hand, its specific absorption on a clot and, on the other hand, to develop its enzymatic activity. In fact, this activator is only able to activate plasminogen if it is absorbed on a fibrin clot. T-PA therefore regulates true fibrinolysis without fibrinogenolysis. Under these conditions, the methods currently in common use, allowing the detection of this activator, are methods calling on the lysis of a clot (Kluft C. et al, Screening of fibrinolytic activity in plasma euglobulin fractions in the fibrin plate, Progress in chemical fibrinolysis and thrombolysis, 3.F.
  • anti-t-PA monoclonal antibodies were forced to choose a test for inhibition of the enzymatic activity. These anti-activity tests make it possible to choose only antibodies directed against epitopes located at the level of the active site of the protein or situated very close to it. However, obtaining antibodies directed against other epitopes of the molecule could hardly have been envisaged to date.
  • the invention aims to remedy the diffi ⁇ culties that have been mentioned above and particu ⁇ larly to provide means for both extract and assay quantitatively the tPA ini- tial ent contained in biological samples, in particular plasmas or fractions enriched with plasmas, such as euglobulins, and in addition to making available to specialists a material making it possible to practice in practice the properties, for example enzymatic or immunological of t-PA , even when it is only isolated or isolable in quantities tiny.
  • the main means according to the invention consists of a molecular film supported by a network of fi ⁇ strands in solid phase, preferably fixed in a co-valent manner to the surface - or in certain regions of the surface - of a support.
  • the film of the fibrin network is fixed to at least certain regions of the surface of the support by means of a polyglutaraldehyde network, itself fixed to this support.
  • the support consists of a titration plate comprising one or more wells, the interior surfaces of these wells defining the regions on which mo ⁇ lecular films of the fibrin network according to the invention are formed.
  • the titration plate can be made of any suitable material to which the polyglutaraldehyde can be fixed directly or indirectly, by covalent bonds or not, however stable. Such a result can be obtained more particularly with plastic supports, preferably polyvinyl chloride or polystyrene. It is in fact observed that it is possible to produce films which are fixed in an extremely stable manner to polyvinyl surfaces, for example by incubation of a glutaraldehyde solution in contact with these surfaces.
  • Fibrinogen can then be deposited on these surfaces or surface regions, in particular from a fibrinogen solution, the capacity of which has been found to react with the free functions of glutaraldehyde, in particular the aldehyde functions, without in any way losing its fibrinoformation properties.
  • the conservation of this characteristic is manifested by the ability of fibrinogen to be transformed into fibrin by incubation in the presence of thrombin at the temperature and in the suitable conditions for forming a molecular or even monomolecular film in which structural features of fibrin are nonetheless reconstituted in the form of a polymer constituting a network (as found in cail ⁇ lots).
  • the molecular film supported by the invention takes advantage of the fundamental property of the endothelial activator of plasminogen, of being adsorbed on a fibrin network allowing it to express its enzymatic activity. This allows, under the appropriate conditions to detect only the endothelial activator to the exclusion of other activators not having this physiological property.
  • this molecular film can be used in tests carried out in the solid phase on a molecular fibrin network and not in the liquid phase, which will not detect activators of the urokinase type. It has in fact been observed that the fibrin network of the film or lolecular layer is in all respects comparable to the fibrin generated in the plasma by activation of coagulation. It is, moreover, the ability of this fibrin film to selectively fix t-PA which attests to the network structure typical of fibrin that said film possesses.
  • This "selective fixation" is also quantitative in that it is detectable in its entirety by its ability to be practically entirely involved in the activation of plasminogen which can be brought into contact with it, in particular inside a bucket. of mi ⁇ croplaque, the amount of activated plasminogen being able to be detected in situ, for example using any synthetic substrate transformable by plasmin.
  • the invention completely overcomes the drawback mentioned above which resided in diffusion reverse of t-PA in the thickness of fibrin plaques that have been used to date.
  • the film according to the invention is molecular, even monomolecular.
  • it comprises from about 50 to about 500 ng of fibrin per cm 2 of surface, preferably from 120 to 180, for example from 145 to 150 ng of fi ⁇ strand per cm 2 of surface.
  • proportions of fibrin lower than the lower values of the above-mentioned limits could result in the absence of the formation of a "network", an absence which would manifest itself in the absence of possible adsorption.
  • t-PA under the above-mentioned conditions or under those which will be illustrated below by way of examples.
  • the maximum fibrin levels per unit area will generally be limited by the number of attachment points, in particular by means of functional groups available on the surface of the support and which are involved in the attachment of the fibrinogen molecules brought into contact. of this surface, by means of complementary functional groups carried by fibrinogen.
  • the dandruff fibrin networks of the invention can be used for the assay of t-PA (even unpurified) from the most diverse sources: supernatant of endothelial cells in culture, supernatant of isolated glomeruli, and euglobulin suspensions. It is also possible to use complete human plasma, which until now was hardly possible•
  • the t-PA absorbed on fibrin in the solid phase can, after removal of contaminants and inhibitors by washing, be then detected by activation of plasminogen using a synthetic substrate sensitive to plasmin (indirect method); the use of a synthetic substrate sensitive to t-PA would allow direct assay.
  • Spectrophotometric reading of the reaction release of paranitroanilide from synthetic substrates such as HD-isoleucyl-L-prolyl-L-arginine-p-nitroanilide dihydrochloride (substrate 5-2288) or HD-valyl-L dihydrochloride -leucyl-L-lysine nitro-anilide (substrate 5-2251), both marketed by AB KABI) is carried out at 405 nm of wavelength. These readings can be transformed into fibrino- lytic units by referring to an international standard of t-PA.
  • the dandruff fibrin networks according to the invention allow not only quantitative assays of t-PA, for example under the above-mentioned conditions, but also and conversely the quantitative assay of plasminogen contained in similar biological environments. It is in fact observed that the fibrin film according to the invention can also adsorb plasminogen, in particular by retention on the fi ⁇ strand, at binding sites distinct from those of the t-PA (s). The assay of the adsorbed plasminogen can then intervene by activation of the latter, via one of its activators, whether it is a suitable t-PA or a non-adsorbed activator, such as than urokinase or streptokinase.
  • the dosage of the plasminogen gene thus activated can bring into play the aforementioned substrates.
  • the fibrin network according to the invention not only allows rigorously selective retention of t-PA (or inogenic plas), for their assay, but generally makes the latter accessible to reagents capable of activating them or, more generally still, of reacting with them.
  • the invention therefore also relates to the material obtained as such, namely the film formed by the fibrin network, retaining by selective adsorption a tissue activator of plasminogen (or the film comprising a fibrin-t- complex PA).
  • the level of purity reached is such that the entire material can, for example, be used as a reagent for the specific detection of anti-t-PA antibodies.
  • the invention therefore opens up a whole field of investigation, that of the detection and study of various t-PA epitopes, whether or not they are active sites of the enzyme.
  • the fibrin-t-PA complexes supported by the invention can therefore be used in carrying out specific, very sensitive and rapid tests, for the detection of monoclonal anti-t antibodies.
  • -PA directed against the various epitopes of this molecule and not only against the active site.
  • This as in the physiological fibrin-t-PA interaction, provides a molecular structure which retains its antigenic and functional characteristics.
  • This "im u ⁇ oassay” is based on the ability of the fibrin-t-PA complex to detect anti-t-PA antibodies present either in serum or in culture supernatants of hybriomas.
  • the invention also relates to the process for making a molecular film of fibrin in a network, this process comprising the steps which consist in bringing a fibrinogen solution into contact with glutaraldehyde adsorbed or fixed to the surface of a support, in particular plastic and preferably vinyl chloride, then reacting the retained fibrinogen film with thrombin or the like under conditions conducive to the in situ activation of fibrinogen to insoluble fibrin, for forming the above fibrin film in a network.
  • the quantities of glutaraldehyde initially fixed or adsorbed on the regions or surfaces of the support and the concentrations or quantities of fibrinogen contained in the solutions brought into contact with said regions or surfaces are adjusted so as to ultimately obtain a concentration of 120 to 180, preferably 145 to 150 nanograms of fibrin per cm of surface.
  • the invention also relates to the supported films of fibrinogen themselves, these films preferably comprising doses per cm 2 of fibrinogen equivalent to those which have been indicated for fibrin.
  • the coupling of fibrinogen to a surface carrying polyglutaraldehyde groups is preferably carried out at a temperature between 0 ° C and room temperature, preferably at a temperature below 10 ° C, for example at 4 ° C, contact being maintained during the time required for coupling. It is advantageous, in order to deposit the fibrinogen, to have recourse to solutions which will allow the "saturation" of the surface, for example solutions containing from 50 to 200 micrograms, advantageously 100 micrograms, per milliliter of fibrinogen.
  • the pH has little effect on the level of fibrinogen coupling. However, it has been found that the most effective t-PA adsorptions were obtained when the initial fixation of fibrinogen on said surfaces was carried out with solutions having a slightly basic pH, in particular between 7 and 9.5, preferably of around 8.5.
  • polyglutaraldehyde to achieve bridging between the support surface and the fibrinogen film is particularly advantageous. Any known method can be used to deposit polyglutaraldehyde on the surfaces in question. By way of example, mention will be made of that described by MOZAN et al, 1975, Biochemistry 57, 1281.
  • Glutaraldehyde allows the chemical fixation of fibrinogen, via imine bonds stabilized by resonance with ethylenic bonds.
  • the distribution of the aldehyde groups on the polymer and the flexibility of the latter promote the covalent bonds via the aine groups of fibrinogen, without substantially disturbing the molecular structure of the latter.
  • any surface carrying enough reactive free functions with fibrinogen can be used to retain sufficient quantities to form a molecular film under the conditions which have been described above.
  • - fig. 1 is a curve representative of the variations in absorbance (ordinate axis on the right) and of the corresponding fixed t-PA rates (in mU on the axis of the right or ⁇ data) as a function of the t-PA contents of solutions brought into contact with a film according to the invention formed in the wells of a microplate, as a function of the t-PA content of the solutions used (in IU / ml on the abscissa axis);
  • - fig. 2 schematically represents the different steps involved in the fixation on a fibrin film according to the invention of t-PA, of antibodies formed against t-PA and in the detection of these antibodies;
  • - fig. 3 is representative under similar conditions of a test aimed at distinguishing the nature of the monoclonal antibodies capable of being retained on a film according to the invention.
  • Solid phase microtitration plates in polyvinyl chloride (CPV), 96 U-shaped cups (DYNATECH LABS).
  • the plate is ready and it can be stored at this stage by adding 100 microliters of buffer F containing 0.01% sodium azide in each well, c) Carrying out the test
  • the plate is emptied and three washes are carried out with buffer E. 2.
  • a dilution of the euglobulins or of the source of t-PA to be tested is carried out in buffer E.
  • the source of t-PA is, for example , consisting of venous plasma taken from a patient, after stimulation of endothelial cells, in particular as a result of the placement of a tourniquet (before carrying out the sampling). 100 microliters of this solution are added to the wells and incubated for 1 hour at 37 ° C. This dilution takes into account the possible adsorption capacities of t-PA by the fibrin film used.
  • Reagents for the reaction are added in the following order: a. 50 microliters buffer 50 mM Tris, 12 mM NaCl pH 7.4, b. 25 microliters plasminogen (60 micrograms / milliliter) in Tris-NaCl buffer, c. 25 microliters 2 mM S-2251 or CBS-3308. 5. The plate is protected with an adhesive plastic and kept at 37 ° C for 1 hour.
  • reaction is then "read” at 405 nM using a micro-ELISA reader.
  • results can also be reported in fibrinolytic units compared to a curve performed with an international standard of t-PA.
  • Fig. 1 is representative of the results which can be obtained with a standard fibrin film placed in contact with standard t-PA solutions, under the conditions which have been indicated above. It also follows from this curve that from a certain dose of t-PA, saturation of the fibrin films formed in each of the wells of the microplate can be observed, hence the possible dilution ne ⁇ of the sample to be tested, as indicated above in paragraph c) 2. For example, these dilutions are adjusted so that they can a priori be considered to be between 1 and 10 I.U./ml.
  • t-PA from different origins either unpurified, semi-purified, or in purified form.
  • the plate is ready for 1 * i muno-assay. c) Realization of the immuno-assay (RIA or EL15A).
  • the ; detection of monoclonal antibodies, if any, can be carried out according to any one of the following methods. 3.
  • the bound radioactivity is proportional to the titer of the anti-t-PA antibody present in the serum or in the culture supernatants of the hybridomas.
  • a blank is made with buffer F or eu- supernatant ture of the parental yelomatous line. 4.
  • ELISA a. 50 microliters of an appropriate dilution of a conjugate (usually 1: 800) of Gamig and peroxidase are added. Incubate for 1 hour at 37 ° C. b. The plate is emptied and washed three times with buffer F. c.
  • Fig. 2 shows the main steps in the selection of monoclonal antibodies under the conditions which have been indicated above.
  • the binding of the monoclonal antibody is finally detected by a second mAb antibody carrying a radioactive or enzymatic marker.
  • the result of the attachment of the second antibody is shown diagrammatically in (e) of FIG. 2.
  • the possible fixation of the desired MoAb monoclonal antibody is observed after cutting the bucket and introducing it into the tank of a gamma radiation or a spectrophotometer, depending on the nature of the marker used.
  • the specificity of the MoAb monoclonal antibody can be the subject of various verifications.
  • the films of the fibrin network retaining t-PA allow the study of distinct and specific monoclonal antibodies of also distinct antigenic sites carried by t-PA.
  • the distinction of the specific monoclonal antibodies intervening in the activity of t-PA and of distinct sites can naturally be carried out under the conditions which follow, reference being then made to the schematic diagram of FIG. 3.
  • a hybridoma supernatant containing the monoclonal antibody MoAb isolated according to the above-mentioned procedure is brought into contact with a Gamig antibody, itself fixed on a support, for example on the PVC-GA support (before any fibrinogen fixation on this one).
  • This step is shown diagrammatically in (f) in FIG. 3.
  • the plate retaining the fixed monoclonal antibodies is incubated with a t-PA solution (containing for example 100 units / ml of t-PA) for 1 hour at 37 ° C. .
  • the operation corresponding to this step is shown diagrammatically in (g) in FIG. 3.
  • the result of this operation is sché ⁇ matisé in (h) of fig. 3.
  • the plate retaining the monoclonal antibodies is then incubated with a plasminogen solution. (Pg), fibrin (Fn) and a plasmin substrate (eg S-2251) under the conditions which have been indicated above.
  • a plasminogen solution Pg
  • fibrin Fn
  • a plasmin substrate eg S-2251
  • phase fibrin network "solid as obtained by the manufacturing method described in Example I can also be used for the determination of plasminogen contained in a biological sample, in particular in blood serum. This is particularly likely to be obtained from plasma (blood supernatant after separation of all cells) and after separation of its fibrinogen content, preferably in the form of fibrin (for example after addition of a calcium or thrombin salt This plasma can also be obtained directly from a blood sample, after separation of the clots, once these have occurred spontaneously and, possibly, other cells.
  • the serum sample optionally diluted in buffer E, is incubated for 1 hour, in particular at a temperature of 37 ° C., in contact with the fibrin pellets formed in the cups of the microplate.
  • the absorbed plasminogen is then activated by contacting with a solution of a suitable activator, such as urokinase or streptokinase.
  • a suitable activator such as urokinase or streptokinase.
  • the plasmin produced in situ is then dosed by introduction into the cups of the plate as of a specific substrate for the enzyme, under the conditions which have already been described above. It is also possible to add the activator and the substrate simultaneously and then perform the reading under the conditions that have been indicated.
  • the fibrin network films in accordance with the invention can, as in the previous case, also be used for the selection of antibodies specific to plasminogen, more particularly specific monoclonal antibodies.

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Abstract

Pellicule moléculaire supportée d'un réseau de fibrine en phase solide formée à la surface d'un support, plus particulièrement à la surface des godets d'une microplaque. Cette pellicule se prête à toutes les applications qui mettent en oeuvre la capacité de fixation sélective des activateurs tissulaires du plasminogène, le cas échéant du plasminogène lui-même, notamment à leurs dosages quantitatifs respectifs et à la détection d'anticorps monoclonaux spécifiques de ces activateurs tissulaires et du plasminogène.

Description

Pellicule moléculaire supportée d'un réseau de fibrine permettant la rétention sélective, à sa surface, de l'activateur du plasminogene tissulaire et applications en découlant.
L'invention concerne une pellicule moléculaire supportée d'un réseau de fibrine en phase solide, fixée à la surface d'un support, de préférence de façon cova- lente, à sa mise en oeuvre pour la rétention sélective d'activateur tissulaire du plasminogene et aux applica¬ tions découlant de cette rétention sélective. L'inven¬ tion concerne encore des moyens pour l'obtention de telles pellicules moléculaires supportées.
Il est tout d'abord rappelé que les activateurs du plasminogene (AP) sont des enzymes ayant pour fonc¬ tion la conversion du plasminogene, une proenzyme de distribution ubiquitaire, en plasmine, l'enzyme protéo- lytique active. La plasmine est une sérine-protéase ca¬ pable de lyser la fibrine, son principal substrat, et d'autres protéines.
La plasmine est donc l'enzyme effectrice du sys¬ tème fibrinolytique qui permet la dissolution du cail¬ lot. On peut de façon schématique résumer les princi¬ pales réactions impliquées dans le système fibrinolyti- que comme suit :
Figure imgf000003_0001
Les AP sont sécrétés par une variété de types cellulaires sous le contrôle de stimuli spécifiques (Cash, 3.D., Progress in chemical fibriπolysis and thro bolysis, eds. 3.F. Davidson, M.M. Samama and P.C. Desnoyers (raven Press, N.Y.), p. 97, 1975) ; ils sont, par contre, librement sécrétés par des cellules néopla- siques et par des cellules transformées (Christman 3.K. et al, Proteinase in mammalian cells and tissues, éd. Barrett (Elsevier/North Holland, Amsterdam), p. 91, 1977).
Les AP peuvent être classés en deux types diffé¬ rents suivant leurs caractéristiques moléculaires et fonctionnelles et leur réactivité vis-à-vis des anticorps polyclonaux conventionnels. Les activateurs de type uro inase (u-PA) de poids moléculaire 54.000 sont produits par les cellules épithéliales et sont capables d'activer le plasminog ne aussi bien en phase liquide (plasma) qu'en phase solide (caillot). Ces enzymes ne possèdent presque pas d'af- finité pour la fibrine (Thorsen S. et al, Différences in the binding to fibrin of urokinase and tissue plas i- nogen activator. Thromb. Diathes. Hae orrh. 28;65-73, 1972) et leurs propriétés à l'égard de l'activation du plasminogene peuvent aboutir à la production de fibri- nolyse et fibrinogénolyse simultanées.
L'autre type drAP est l'AP d'origine endothé- liale ou activateur tissulaire (t-PA) ; c'est une pro¬ téine de poids moléculaire 70.000 qui est considérée comme l'AP physiologique de la fibrinolyse plasmatique et de la thrombolyse. L'absence de son activité dans le plasma a été liée au développement de thromboses
Oohansson et al, Acta Med. Scand. 205:477, 1978, et
Angles-Cano E. et al, 3. Lab. Clin. Med. 94..312, 1979).
La détection et le dosage plasmatique de l'acti- vateur endothélial sont donc de primordiale importance dans l'étude de la fibrinolyse normale'et pathologique.
L'activateur endothélial possède une très haute affinité pour la fibrine lui permettant, d'une part, son absorption spécifique sur un caillot et, d'autre part, de développer son activité enzymatique. En effet, cet activateur n'est capable d'activer le plasminogene que s'il est absorbé sur un caillot de fibrine. Le t-PA ré¬ gule par conséquent une véritable fibrinolyse sans fi- brinogénolyse. Dans ces conditions, les méthodes actuel- lement d'utilisation courante, permettant la détection de cet activateur, sont des méthodes faisant appel à la lyse d'un caillot (Kluft C. et al, Screening of fibri- nolytic activity in plasma euglobulin fractions in the fibrin plate, Progress in chemical fibrinolysis and thrombolysis, 3.F. Davidson, M. M. Samama, P.C. Des¬ noyers, Raven Press, New York, 1976, vol. 2_:57) ou ayant pour but la mesure des temps de lyse des euglobulines plasmatiques ou des aires de lyse sur plateau de fi¬ brine. Ces tests sont qualitatifs, non spécifiques (en raison de la diffusion du t-PA et d'autres protéines dans l'épaisseur des plateaux de fibrine utilisés à ce jour). Ils nécessitent en outre un temps de réalisation très prolongé (de 8 à 24 heures). Un test permettant le dosage spécifique et quantitatif de l'activité enzyma- tique de l'activateur du plasminogene d'origine endo- théliale n'est pas encore disponible.
Au cours des quatre dernières années, l'étude de la coagulation et de la fibrinolyse s'est vue considéra¬ blement modifiée par le développement de substrats syn- thétiques (He ker H.C. et al, Handbook of synthetic sub¬ strats. Martinas Nijhoff Publishers, The Hague, 1983). Ces substrats permettent, à l'aide d'un spectrophαto- ètre, le dosage quantitatif de composants de ces systè¬ mes. Des tests utilisant un substrat synthétique pour le dosage des u-PA en phase liquide ont été décrits (Drapier I.C. et al, Régulation of plasminogen activator sécrétion in mouse peritoneal macrophages. Biochimie 61.:463-471, 1979, et Searls D.B., An improved colorime- tric assay for plasminogen activator. Analytical Bio- chem. 107:64-70, 1980) j le principe utilisé n'est pas, cependant, applicable à la détection des t-PA.
D'importants efforts ont été effectués par plu¬ sieurs chercheurs dans le monde pour mettre au point un test permettant la détection enzymatique du t-PA, à l'aide d'un substrat chromogène sensible à la plasmine (Ranby M. et Wallen P., A sensitive parabolic rate assay for the tissue plasminogen activator, Progress in fibri- nolysis, Davidson 3.F. Nilson, I.M., Astedt B. (eds), Churchill Livingstone, Edinburgh, 5_:233-235, 1981, et Wiman B. et al, Plasminogen activator release during venous statis and exercise as determined by a new spé¬ cifie assay. Clin. Chim. Acta. 127:279-288, 1983, Eriksson B. et al, Tissue plasminogen activator activity after total hip replacement and its corrélation to post- operative deep vein thrombosis. Thromb. Haemostas. 5jO_:57, 1983, et Verheijen 3.H. et al, A simple,sensitive spectrophotometric assay for extrinsic ( issue-type) plasminogen activator applicable to measurements in plasma. Thromb. Haemostas. 4>8_:266-269, 1983). Ces tests utilisent comme stimulateur du t-PA des composés proches de la fibrine pouvant mimétiser son action stimulatrice sur le t-PA : monomères de fibrine en solution (articles déjà cités de Ranby et Wallen, 1981, et de Wiman et al, 1983), fragments de fibrinogène en solution (article déjà cité de Verheijen et al, 1983). Dans d'autres cas (article déjà cité de Eriksson et al, 1983), le stimula¬ teur choisi (poly-L-lysine ; Allen R.A., An enhancing effect of polylysine on the activation of plasminogen. Thromb. Haemostas. ^7_:41-45, 1982) n'a aucun lien struc- turel avec la fibrine. La détection du t-PA en absence de stimulateur (Campbell E.E. et al, A colorimetric assay for releasable plasminogen activator. Clin. Chem. ^8.:1125-1128, 1982) a été également rapportée. Mais ces méthodes ne sont pas toujours d'une mise en oeuvre sim¬ ple et ne présentent pas toujours la stricte spécificité requise.
A l'absence de techniques précises pour le do¬ sage quantitatif du t-PA, s'ajoutent les difficultés de l'isoler en quantité suffisante pour l'étudier. L'acqui¬ sition de connaissances sur sa structure moléculaire, sa localisation tissulaire et sur le rapport structure- fonctions serait donc de première importance pour com¬ prendre son rôle physiologique et son rôle dans le déve¬ loppement de thromboses ; ce type d'information peut être obtenu à l'aide des procédés immunochimiques. Mais le caractère polyclonal des anticorps conventionnels ne permet pas cependant la réalisation de type d'études.
Au cours des huit dernières années, le dévelop¬ pement de la technique d'hybridation cellulaire (Kδhler G. et Milstein C, Nature (London), 256:495, 1975) a ouvert des possibilités nouvelles pour la réalisation de ce type de travaux d' i munochimie fine : la production et l'utilisation d'anticorps onoclonaux monospécifi¬ ques. Dans ce type de techniques, le facteur limitant semble être le test de dépistage des hybrides produisant les anticorps de la spécificité désirée. En effet, l'immunisation des souris pouvant être effectuée avec de toutes petites quantités d'antigène semi-purifiés, les tests de détection mettant notamment en jeu des essais radio-im unologiques souvent désignés par l'expression et l'abréviation anglaises "radioimmunoassay" (RIA), demande l'utilisation de quantités beaucoup plus impor¬ tantes de l'antigène purifié ? l'utilisation de produits semi-purifiés pouvant introduire des protéines "para¬ sites", elle peut conduire à la sélection d'anticorps non désirés. Ceci est particulièrement problématique quand on utilise la même préparation antigénique aussi bien pour l'immunisation que pour le test de détection. En raison des difficultés rencontrées (difficultés tech¬ niques et coûts) pour obtenir du t-PA purifié en quan¬ tités suffisantes pour son utilisation dans un RIA, l'u¬ tilisation d'un tel test pour la détection d'anticorps monoclonaux anti-t-PA s'est avérée presque impossible. C'est ainsi que la plupart des auteurs ( alil et al, Prot. Biol. Fluids 2£:587, 1980, Kaltorft K. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 22. : 3720, 1982 ; et NIELSEN L.S. * et al, Embo 3., 2_, 1983) désirant fabriquer des anticorps monoclonaux anti-t-PA ont été obligés de choi¬ sir un test d'inhibition de l'activité enzymatique. ces tests anti-activité permettent de choisir uniquement des anticorps dirigés contre des épitopes localisés au ni- veau du site actif de la protéine ou situés de façon très proche de celui-ci. Mais l'obtention d'anticorps dirigés contre d'autres épitopes de la molécule n'a guère pu être envisagée jusqu'à ce jour. Il n'existe donc guère encore de techniques qui pourraient donner accès à l'étude de la configuration structurelle de la molécule plasmatique ou d'origine endothéliale, à la réalisation d'études cytochimiques, au développement d'un "radioi munoassay" pour l'activateur vasculaire et sondes de détection de l'activateur dans des études de biologie moléculaire et de génie génétique.
L'invention a pour but de remédier aux diffi¬ cultés qui ont été évoquées ci-dessus et plus particu¬ lièrement de fournir des moyens permettant à la fois d'extraire et de doser' quantitativement des t-PA ini- tiale ent contenus dans des échantillons biologiques, notamment des plasmas ou fractions enrichies de plasmas, telles que des euglobulines, et en outre de mettre à la disposition des spécialistes un matériel permettant de mettre en oeuvre de façon pratique les propriétés, par exemple enzymatiques ou immunologiques du t-PA, même lorsque celui-ci n'est isolé ou isolable qu'en quantités infimes.
Le moyen principal selon l'invention consiste en une pellicule moléculaire supportée d'un réseau de fi¬ brine en phase solide, de préférence fixée de façon co- valente à la surface - ou en certaines régions de la surface - d'un support.
Dans une forme avantageuse de l'invention, la pellicule du réseau de fibrine est fixée à au moins cer¬ taines régions de la surface du support par l'interméd- iaire d'un réseau de polyglutaraldéhyde, lui-même fixé à ce support.
Avantageusement, le support consiste en une plaque de titration comprenant un ou plusieurs godets, les surfaces intérieures de ces godets définissant les régions sur lesquelles sont formées des pellicules mo¬ léculaires du réseau de fibrine selon l'invention. La plaque de titration peut être constituée en toute matière appropriée à laquelle le polyglutaraldéhyde peut être fixé directement ou indirectement, par des liaisons covalentes ou non, cependant stables. Un tel résultat peut être obtenu plus particulièrement avec des supports en matière plastique, de préférence le chlorure de poly- vinyle ou le polystyrène. On constate en effet qu'il est possible de réaliser des pellicules fixées de façon extrêmement stable à des surfaces de polyvinyle, par exemple par incubation d'une solution de glutaraldéhyde au contact de ces surfaces. »Du fibrinogène peut alors être déposé sur ces surfaces ou régions de surfaces, notamment à partir d'une solution de fibrinogène dont on a constaté la capacité de réagir avec les fonctions libres du glutaraldéhyde, notamment les fonctions aldéhyde, sans perdre en aucune façon ses propriétés de fibrinoformation. En particulier, la conservation de cette caractéristique se manifeste par la capacité du fibrinogène d'être transformé en fibrine par incubation en présence de thrombine à la température et dans les conditions appropriées pour former une pellicule molécu¬ laire, voire même monomoléculaire, dans lesquelles sont néanmoins reconstituées des caractéristiques structu¬ relles de la fibrine sous la forme d'un polymère cons- tituant un réseau (tel qu'on le trouve dans les cail¬ lots).
La pellicule moléculaire supportée de l'inven¬ tion met à profit la propriété fondamentale de l'acti¬ vateur endothélial du plasminogene, d'être adsorbé sur un réseau de fibrine lui permettant d'exprimer son ac¬ tivité enzymatique. Ceci permet, dans les conditions appropriées de détecter uniquement l'activateur endo¬ thélial à l'exclusion d'autres activateurs n'ayant pas cette propriété physiologique. En outre, cette pellicule moléculaire peut être mise en oeuvre dans des tests effectués- en phase solide sur un réseau moléculaire de fibrine et non en phase liquide, qui ne détecteront pas les activateurs de type urokinase. Il a en effet été constaté que le réseau de fibrine de la pellicule ou couche loléculaire est en tous points comparable à la fibrine générée dans le plasma par activation de la coagulation. C'est d'ailleurs la capacité de cette pellicule de fibrine de fixer le t-PA de façon sélective qui atteste de la structure en réseau typique de la fibrine que possède ladite pellicule.
Cette fixation" sélective est également quantita¬ tive en ce qu'elle est détectable dans sa totalité par sa capacité à être pratiquement entièrement impliquée dans l' activation du plasminogene qui peut être amené à son contact, notamment à l'intérieur d'un godet de mi¬ croplaque, la quantité de plasminogene activé pouvant à son tout être détectée in situ, par exemple à l'aide de tout substrat synthétique transformable par la plasmine. L'invention surmonte complètement l'inconvénient mentionné plus haut qui résidait dans la diffusion in- contrêe de t-PA dans l'épaisseur des plaques de fibrine qui étaient utilisées jusqu'à ce jour. C'est en outre la totalité du t-PA adsorbé aux surfaces intérieures limi¬ tées des godets des plaques de titration qui est mise en jeu dans la réaction ultérieure avec une solution de plasminogene, de sorte que la proportion de plasminogene alors activée (dosable par un substrat synthétique) est directement corrélable à la quantité de t-PA retenue dans le godet concerné.
Comme il résulte déjà de ce qui précède, la pel- licule selon l'invention est moléculaire, voire monomo¬ léculaire. En particulier, elle comprend d'environ 50 à environ 500 ng de fibrine par cm2 de surface, de préfé¬ rence de 120 à 180, par exemple de 145 à 150 ng de fi¬ brine par cm^ de surface. On appréciera que des propor- tions de fibrine plus faibles que les valeurs inférieu¬ res des limites sus-indiquées pourraient résulter en l'absence de la formation d'un "réseau", absence qui se manifesterait par l'absence d'adsorption possible du t-PA, dans les conditions sus-indiquées ou encore dans celles qui seront illustrées plus loin à titre d'exem¬ ples.
Les taux maximum de fibrine par unité de surface seront en général limités par le nombre des points de fixation, notamment par l'intermédiaire de groupes fonctionnels disponibles à la surface du support et qui interviennent dans la fixation des molécules de fibri¬ nogène amenées au contact de cette surface, par l'in¬ termédiaire de groupes fonctionnels complémentaires portés par le fibrinogène. Les réseaux de fibrine pelliculaires de l'in¬ vention peuvent être mis en opeuvre pour le dosage de t-PA (même non purifié) provenant des sources les plus diverses : surnageant de cellules endothéliales en cul¬ ture, surnageant de glomeruli isolés, et suspensions d' euglobulines. On peut également utiliser le plasma humain complet, ce qui jusqu'à présent n'était guère possible•
Le t-PA absorbé sur la fibrine en phase solide peut, après élimination par lavages des contaminants et des inhibiteurs, être ensuite détecté par activation du plasminogene à l'aide d'un substrat synthétique sensible à la plasmine (méthode indirecte) ; l'utilisation d'un substrat synthétique sensible au t-PA permettrait un dosage direct.
La lecture spectrophotométrique de la réaction (libération de paranitroanilide de substrats synthéti¬ ques tels que le dihydrochlorure de H-D-isoleucyl-L- prolyl-L-arginine-p-nitroanilide (substrat 5-2288) ou le dihydrochlorure de H-D-valyl-L-leucyl-L-lysine nitro- anilide (substrat 5-2251), tous deux commercialisés par AB KABI) est effectuée à 405 nm de longueur d'onde. Ces lectures pourront être transformées en unités fibrino- lytiques en faisant référence à un étalon international de t-PA.
Les réseaux de fibrine pelliculaires selon l'in- vention permettent non seulement des dosages quantita¬ tifs de t-PA, par exemple dans les conditions sus-indi¬ quées, mais également et à l'inverse le dosage quanti¬ tatif de plasminogene contenu dans des milieux biolo¬ giques semblables. Il est en effet observé que la pelli- cule de fibrine selon l'invention peut également adsor- ber du plasminogene, notamment par retenue sur la fi¬ brine, en des sites de fixation distincts de ceux du ou des t-PA. Le dosage du plasminogene adsorbé peut alors intervenir par activation de ce dernier, par l'intermé- diaire de l'un de ses activateurs, qu'il s'agisse d'un t-PA approprié ou d'un activateur non adsorbé, tel que l'urokinase ou la streptokinase. Le dosage du plasmino¬ gene ainsi activé peut mettre en jeu les substrats sus- indiqués. Le réseau de fibrine selon l'invention non seu¬ lement permet la rétention rigoureusement sélective des t-PA (ou de plas inogènes) , en vue de leur dosage, mais rend d'une façon générale ces derniers accessibles aux réactifs susceptibles de les activer ou de façon plus générale encore de réagir avec eux. A ce titre, l'invention concerne par conséquent également le matériau obtenu en tant que tel, à savoir la pellicule que forme le réseau de fibrine, retenant par adsorption sélective un activateur tissulaire du plasminogene (ou la pellicule comportant un complexe fibrine-t-PA) . Le niveau de pureté atteint est tel que l'ensemble du matériau est par exemple utilisable en tant que réactif pour la détection spécifique d'anticorps anti-t-PA. C'est une telle propriété qui est à la base de l'une des applications préférées du matériau selon l'invention, savoir la détection d'anticorps monoclonaux rigoureusement spécifiques du t-PA. L'invention ouvre par conséquent tout un champ d'investigation, celui de la détection et de l'étude de divers épitopes du t-PA, qu'il s'agisse de sites actifs ou non de l'enzyme. Les complexes fibrine-t-PA supportés de l'in¬ vention peuvent donc être mis en oeuvre dans la réali¬ sation de tests spécifiques, très sensibles et de réa¬ lisation rapide, pour la détection d'anticorps monoclo¬ naux anti-t-PA dirigés contre les divers épitopes de cette molécule et non seulement contre le site actif. Ces tests peuvent être réalisés sous la forme de "radio- immunoassay" (RIA) utilisant un deuxième anticorps (ha¬ bituellement des immunoglobulines de mouton anti-immuno- globuline de souris : Gamig, de l'anglais "goat-anti- mouse immunoglobulin") marqué à l'iode 125, ou sous la forme d'un essai immunoenzymatique (ELISA : de l'anglais "enzyme-linked i munosorbent assay") en utilisant du Gamig conjugué à une enzyme, par exemple à la péroxydase ou à la phosphatase alcaline. Il va de soi que l'invention n'est pas limitée à la nature du marqueur utilisé. La sensibilité du test est liée à l'absorption sélective et de très haute affinité du t-PA sur un support de fibrine en phase solide. Ceci, comme dans 1* inter-action physiologique fibrine-t-PA, proportionne une structure moléculaire qui conserve ses caractéris¬ tiques antigéniques et fonctionnelles. Cet "im uπoassay" est basé sur la capacité du complexe fibrine-t-PA à dé¬ tecter des anticorps anti-t-PA présents soit dans du sérum, soit dans des surnageants de culture des hybri- dômes.
Il va de soi que l'on s'assurera dans tous les cas de l'absence préalable de tout contaminant possible adsorbé de façon non spécifique, tel que des sérums albumine ou certains facteurs de coagulation, ceux-ci pouvant être éliminés par lavage des surfaces supportant les pellicules du complexe fibrine-t-PA avec les tampons appropriés. Le cas échéant, les surfaces seront égale¬ ment traitées avec une solution de lysine, dont est con¬ nue la capacité de se substituer à d'éventuelles traces de plasminogene ou plasmine, éventuellement adsorbées par l'intermédiaire de groupes lysyne sur lesdites sur¬ faces.
L'invention concerne également le procédé de fa¬ brication d'une pellicule moléculaire de fibrine en ré- seau, ce procédé comprenant les étapes qui consistent à mettre en contact une solution de fibrinogène avec du glutaraldéhyde adsorbé ou fixé à la surface d'un sup¬ port, notamment en matière plastique et, de préférence, en chlorure de vinyle, puis à faire réagir la pellicule retenue de fibrinogène avec de la thrombine ou analogue dans des conditions propices à l'activation in situ du fibrinogène en fibrine insoluble, pour former la susdite pellicule de fibrine en réseau.
Avantageusement, les quantités de glutaraldéhyde initialement fixées ou adsorbées sur les régions ou sur¬ faces du support et les concentrations ou quantités de fibrinogène contenues dans les solutions amenées au con¬ tact desdites régions ou surfaces sont réglées de façon à obtenir en définitive une concentration de 120 à 180, de préférence de 145 à 150 nanogrammes de fibrine par cm de surface. A ce titre, l'invention concerne égale¬ ment les pellicules supportées de fibrinogène elles- mêmes, ces pellicules comportant de préférence des doses par cm2 de fibrinogène équivalentes à celles qui ont été indiquées pour la fibrine. Le couplage du fibrinogène à une surface portant des groupes polyglutaraldéhyde est de préférence réalisé à une température comprise entre 0°C et la température ambiante, de préférence à une température inférieure à 10°C, par exemple à 4°C, le contact étant maintenu pen- dant le temps requis pour le couplage. Il est avanta¬ geux, pour réaliser le dépôt du fibrinogène, d'avoir re¬ cours à des solutions qui permettront la "saturation" de la surface, par exemple des solutions contenant de 50 à 200 microgrammes, avantageusement 100 microgrammes, par millilitre de fibrinogène. Le pH intervient peu au ni¬ veau du couplage du fibrinogène. Il a cependant été constaté que les adsorptions de t-PA les plus efficaces étaient obtenues lorsque la fixation initiale du fibrinogène sur lesdites surfaces avait été réalisée avec des solutions ayant un pH légèrement basique, notamment compris entre 7 et 9,5, de préférence de l'ordre de 8,5.
L'utilisation de polyglutaraldéhyde pour réali¬ ser le pontage entre la surface support et la pellicule de fibrinogène est particulièrement avantageuse. On peut utiliser toute méthode connue pour réaliser des dépôts de polyglutaraldéhyde sur les surfaces en cause. A titre d'exemple, on mentionnera celle décrite par M0NZAN et al, 1975, Biochimie 57, 1281. Le glutaraldéhyde permet la fixation chimique du fibrinogène, par l'intermédiaire de liaisons imine stabilisées par résonance avec des liaisons éthyléniques. La distribution des groupes aldé¬ hyde sur le polymère et la flexibilité de ce dernier favorisent les liaisons covalentes par l'intermédiaire des groupes a iné du fibrinogène, sans sensiblement perturber la structure moléculaire de ce dernier.
Il va de soi que la formation d'un réseau d'abord de fibrinogène, puis de fibrine en une mince pellicule peut être réalisée à l'aide de tout autre agent, lui-même fixé et retenu sur un support, et per- mettant ensuite le couplage ou pontage, direct ou indi¬ rect, avec le fibrinogène, dès lors que ce couplage met en jeu des fonctions chimiques portées par le fibrinogène qui ne modifient pas la propriété majeure que celui-ci possède d'être ultérieurement activé en fi- brine insoluble, sous l'action de la thrombine ou de tout autre agent susceptible de conduire au même résul¬ tat. D'une façon générale, on peut mettre en oeuvre toute surface porteuse de suffisamment de fonctions li¬ bres réactives avec la fibrinogène pour en retenir des quantités suffisantes pour former une pellicule molécu¬ laire dans les conditions qui ont été décrites plus haut. Par exemple, on peut aussi avoir recours aux techniques classiques de fixation covalentes mettant en jeu le bromure de cyanogène. On peut également envisager l'utilisation de surfaces sur lesquelles auront été préadsorbées ou fixées des protéines dans des conditions assurant la présence ainsi formée de groupes carboxyliques , lesquels peuvent alors être combinés chimiquement à tout groupe aminé du fibrinogène, par l'intermédiaire d'agents de couplage du type de ceux qui sont utilisés dans les techniques de synthèse des protéines pour former des liaisons CO-NH. 11 résulte clairement de ce qui précède que l'invention réside essentiellement dans la formation des susdites pellicules de fibrinogène, puis de fibrine présentant les caractéristiques qui ont été définies plus haut. Des caractéristiques supplémentaires de l'inven¬ tion apparaîtront encore à la lumière des exemples qui suivront de la fabrication de pellicules supportées de fibrine en réseau et des conditions dans lesquelles celles-ci sont susceptibles d'être mises en oeuvre. Dans chaque cas, on présentera d'abord les matières et maté¬ riels qui sont mis en oeuvre. Il sera également fait référence dans ce qui suit aux dessins dans lequels :
- la fig. 1 est une courbe représentative des variations d'absorbance (axe des ordonnées à droite) et des taux correspondants de t-PA fixés (en mU sur l'axe des or¬ données de droite) en fonction des teneurs en t-PA de solutions mises en contact avec une pellicule conforme à l'invention formée dans les godets d'une microplaque, en fonction de la teneur en t-PA des solutions utilisées (en I.U./ml sur l'axe des abscisses) ;
- la fig. 2 représente de façon schématique les diffé¬ rentes étapes impliquées dans les fixations sur une pellicule de fibrine conforme à l'invention de t-PA, d'anticorps formés contre le t-PA et dans la détection de ces anticorps ;
- la fig. 3 est représentative dans des conditions sem¬ blables d'un test visant à distinguer la nature des an¬ ticorps monoclonaux susceptibles d'être retenus sur une pellicule conforme à l'invention.
EXEMPLE I : Application au dosage quantitatif du t-PA. a) Matériel
1. Phase solide : plaques de microtitration en chlorure de polyvinyle (CPV), 96 godets en U (DYNATECH LABS).
2. Fibrinogène humain purifié à partir du fibrinogène humain grade L (KABI LABS chez FLOW LABS), par pré¬ cipitation à l'éthanol, et par chromatographie sur lysine-sépharose et gélatine-sépharose. 3. Thro bine bovine (HOFFMANN-LA ROCHE). 4. Glutaraldéhyde (TAAB LABS.). 5. Plasminogene humain (KABI LABS.).
6. Substrats synthétiques S-2251 (KABI LABS) ; CBS. 3308 (Diagnostics stago).
7. tampons : A. Carbonate/bicarbonate 0,1 M pH 9,5
B. Carbonate/bicarbonate 0,1 M pH 8,5
C. Phosphate 5 mM 6,8 contenant 0,5 M NaCl
D. Phosphate 5 M pH 6,8
E. Phosphate 50 mM pH 6,8 F. PBS-BSA (1 mg/ml)-Tween 20 (0,05 35) G. PBS-BSA-Tween 20-EDTA 1 mM.
8. Sources de t-PA a. Surnageants de cultures cellulaires b. Euglobulines plasmatiques c. Plasma d. Autres sources d'activateur tissulaire. b) Fabrication du réseau de fibrine en phase solide
1. 200 microlitres de tampon A sont déposés dans chaque godet de la plaque CPV. On incube pendant 30 minutes à la température de la pièce (22°C). La plaque est vidée.
2. 100 microlitres de glutaraldéhyde 2,5 % dans du tampon A sont déposés dans chaque godet et incubés pendant deux heures à 22°C. La plaque est vidée et rincée trois fois à l'eau distillée.
3. 100 microlitres d'une solution dans le tampon B de 100 microgrammes de fibrinogène par millilitre con¬ tenant 2 M CaC^ sont déposés dans chaque godet. Incubation pendant 18 heures à +4°C. 4. Le fibrinogène non fixé est retiré et la plaque est lavée une fois avec le tampon F. 100 microlitres d'une solution de thrombine 10 N.I.H. unités par millilitre dans du tampon G et contenant 2 mM CaCl. sont déposés dans chaque godet. Incubation 30 mi- nutes à 37°C.
5. On effectue trois lavages avec du tampon C avec un temps de rinçage de 5 minutes entre chaque lavage. 6. On effectue trois lavages avec le tampon D et un der¬ nier lavage avec le tampon F.
La plaque est prête et elle peut être conservée à ce stade en ajoutant 100 microlitres de tampon F con¬ tenant 0,01 % d'azoture de sodium dans chaque godet, c) Réalisation du test
1. La plaque est vidée et on effectue trois lavages avec du tampon E. 2. On effectue une dilution des euglobulines ou de la source de t-PA à tester, dans du tampon E. La source de t-PA est, par exemple, constituée par un plasma veineux prélevé chez un patient, après stimulation des cellules endothéliales, notamment comme suite au placement d'un garrot (préalablement à la réalisation du prélèvement) . On ajoute 100 microlitres de cette solution dans les godets et on incube pendant 1 heure à 37°C. Cette dilution tient compte des capaci- trés d'adsorption éventuelle du t-PA par la pellicule de fibrine mise en oeuvre.
3. La plaque est vidée et lavée trois fois avec du tam¬ pon F.
4. Les réactifs de la réaction sont ajoutés dans l'ordre suivant : a. 50 microlitres tampon 50 mM Tris, 12 mM NaCl pH 7,4, b. 25 microlitres plasminogene (60 microgrammes/ millilitre) dans du tampon Tris-NaCl, c. 25 microlitres 2 mM S-2251 ou CBS-3308. 5. La plaque est protégée avec un plastique adhésif et on la maintient à 37°C pendant 1 heure.
6. On "lit" ensuite la réaction à 405 nM en utilisant un lecteur micro-ELISA.
7. On rapporte les résultats en unités d'absorbance à 405 nm et on les compare à des lectures préalablement obtenues avec des témoins normaux et avec des solutions qui contenaient des quantités connues de t-PA.
Les résultats peuvent également être rapportés en unités fibrinolytiques par rapport à une courbe ef- fectuée avec un standard international de t-PA.
La fig. 1 est représentative des résultats qui peuvent être obtenus avec une pellicule type de fibrine mise en contact avec des solutions types de t-PA, dans les conditions qui ont été indiquées plus haut. Il ré- suite également de cette courbe qu'à partir d'une cer¬ taine dose de t-PA, une saturation des pellicules de fibrine formées dans chacun des godets de la microplaque peut être observée, d'où la dilution éventuellement né¬ cessaire de l'échantillon à tester, comme on l'indiquait plus haut dans le paragraphe c)2. Par exemple ces dilu¬ tions sont ajustées de façon à ce qu'elles puissent a priori être considérées comme étant comprises entre 1 et 10 I.U./ml.
EXEMPLE II : Application à la détection d'anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes du t-PA. a) Matériel
1. Plaques de icrotitration en chlorure de polyvinyle (CPV), 96 godets en U (DYNATECH LABS). 2. Fibrinogène humain purifié. Matériel de départ : fibrinogène humain KABI (FLOW LABS), purifié par précipitation à l'éthanol, chromatographie sur ly¬ sine sépharose et gélatine-sépharose. 3. Thrombine bovine (HOFFMANN-LA ROCHE). 4. Glutaraldéhyde (TAABS LABS). 5. tampons.
A. Carbonate/bicarbonate 0,1 M pH 9,5.
B. Carbonate/bicarbonate 0,1 M pH 8,5.
C. Phosphate 5 M pH 6,8 contenant 0,5 M NaCl. D. Phosphate 5 mM pH 6,8. E. Phosphate 50 mM pH 6,8.
F. PBS-BSA (1 mg/ml)-Tween 20 (0,05 % ) EDTA 1 mM.
6. t-PA de différentes origines, soit non purifié, soit semi-purifié, soit sous forme purifiée. 7. Immunoglobulines de mouton anti-immunoglobuline de souris (Gamig) marquée à l'iode 125 (AMERSHAM)) ou à la péroxydase (AMERSHAM). b) Incorporation du complexe moléculaire t-PA-fibrine sur un support (phase solide). 1. 200 microlitres de tampon A sont déposés dans chacun des godets de la plaque CPV. Après 30 minutes à 22°C, la plaque est vidée.
2. 100 microlitres d'une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % dans du tampon A sont déposés dans chaque godet et incubés à la température de la pièce (22°C) pen¬ dant 2 heures. La plaque est vidée et rincée trois fois à l'eau distillée.
3. 100 microlitres d'une solution de fibrinogène à 100 microgrammes par millilitre (dans le tampon B) conte- nant 2 mM CaC^ sont déposés dans chaque godet. Incu¬ bation 18 heures à +4°C.
4. Le fibrinogène non fixé est retiré, la plaque lavée une fois avec du tampon F et 50 microlitres d'une solution de thrombine 10 N.I.H. unités par millilitre dans du tampon F contenant 2 mM CaCl„ sont déposés dans chaque godet. Incubation 30 minutes à 37°C.
5. On effectue trois lavages avec du tampon C (temps de rinçage de 5 minutes entre chaque lavage) .
6. On effectue trois lavages avec du tampon D et un der- nier lavage avec le tampon F. Ce support de fibrine en phase solide peut être conservé à ce stade en ajoutant 100 microlitres de tampon F contenant 0,013. d'azoture de sodium dans chacun des godets. Il est recommandé de former le complexe fibrine-t-PA juste avant son utilisation pour le RIA.
7. On effectue un lavage avec le tampon E et on ajoute 50 microlitres d'une solution de t-PA dans le tam¬ pon E, contenant 10 U.I. par millilitre d'activateur. De préférence, la solution contient aussi de la ly¬ sine (par exemple à une concentration 20 mM) pour prévenir toute absorption de plasminogene. On incube pendant la nuit (18 heures) à +4°C. 8. On retire le t-PA non fixé et on fait trois lavages avec le tampon F.
La plaque est prête pour 1*i muno-assay. c) Réalisation de l' immuno-assay (RIA ou EL15A) .
On peut opérer, notamment comme suit, sur une plaque t-PA-fibrine-support CPV :
1. Dans chaque godet de la plaque, on ajoute 50 micro- litres d'une dilution choisie de sérum de souris immunisée avec du t-PA ou 50 microlitres d'un sur¬ nageant de culture d'un hybridome obtenu par fusion d'une lignée myélomateuse de souris avec les splé- nocytes d'une souris immunisée avec du t-PA. On in¬ cube pendant 1 heure à 37°C ou 18 heures à +4°C. 2. On effectue trois lavages avec le tampon F.
La ; détection des anticorps monoclonaux éven¬ tuellement fixés peut être réalisée selon l'une quelcon¬ que des méthodes qui suivent. 3. Pour le RIA : a. On ajoute 50 microlitres (50.000 cpm) d'une dilu¬ tion du Gamig marqué à l'iode 125. On incube pen¬ dant 1 heure à 37°C et on retire le Gamig non fixé, b. On effectue six lavages avec du tampon F. c. On vide et on sèche les plaques et, après avoir découpé les godets, on mesure la radioactivité liée au support solide.
La radioactivité liée est proportionnelle au titre de l'anticorps anti-t-PA présent dans le sérum ou dans les surnageants de culture des hybridomes. Un blanc est effectué avec du tampon F ou du surnageant de eu- ture de la lignée yélomateuse parentale. 4. Pour l'ELISA : a. On ajoute 50 microlitres d'une dilution appropriée d'un conjugué (habituellement 1:800) de Gamig et de péroxydase. On incube 1 heure à 37°C b. On vide la plaque et on lave trois fois avec du tampon F. c. On ajoute 200 microlitres d'une solution 1 M ABTS (2,2'-azino-di-3-éthylbenz-thiazoline-6-sulphonate) et on incube pendant 1 heure à 37°C. d. On lit la réaction à 405 mM à l'aide d'un lecteur pour réactions ELISA.
La fig. 2 fait apparaître les principales étapes de la sélection d'anticorps monoclonaux dans les condi- tions qui ont été indiquées ci-dessus.
On a représenté en (a) la surface activée par la glutaraldéhyde d'un godet d'une microplaque (PVC-GA), sur laquelle a au préalable été formée une pellicule de fibrine F. En (b) a été schématisée une molécule de t-PA portant un site antigénique SA. Après mise en contact d'une solution contenant le t-PA avec la pellicule de fibrine, on peut constater la fixation des t-PA sur cette pellicule, comme schématisé en (c) de la fig. 2. Par contact d'un surnageant d'hybridome contenant un anticorps monoclonal MoAb avec le t-PA fixé sur le réseau pelliculaire de fibrine, on obtient la fixation de l'anticorps monoclonal sur le t-PA comme schématisé en (b). La fixation de l'anticorps monoclonal est enfin détectée par un second anticorps AcM portant un marqueur radioactif ou enzymatique. Le résultat de la fixation du second anticorps est schématisé en (e) de la fig. 2. Après élimination des excédents de l'anticorps AcM, on constate la fixation éventuelle de l'anticorps monoclonal MoAb recherché après découpe du godet et introduction de celui-ci dans la cuve d'un détecteur de radiations gamma ou d'un spectrophotomètre, selon la nature du marqueur utilisé. La spécificité de l'anti¬ corps monoclonal MoAb peut faire l'objet de vérifica¬ tions diverses. On peut notamment vérifier qu'il ne se fixe pas sur une pellicule de fibrine formée sur une surface PVC-GA exempt de t-PA ou sur une surface sur laquelle aura été absorbée (de façon spécifique ou non) d'autres protéines telles que le plasminogene, la plasmine, des sérums albumine ou des facteurs de coagulation en lieu et place du t-PA.
Comme indiqué plus haut, les pellicules du ré¬ seau de fibrine retenant du t-PA permettent l'étude d'anticorps monoclonaux distincts et spécifiques de sites antigéniques également distincts portés par le t-PA. La distinction des anticorps monoclonaux spéci¬ fiques intervenant dans l'activité du t-PA et de sites distincts peut naturellement être réalisée dans les conditions qui suivent, référence étant alors faite au schéma de principe de la fig. 3.
Un surnageant d'hybridome contenant l'anticorps monoclonal MoAb isolé selon la procédure sus-indiquée est mis en contact avec un anticorps Gamig, lui-même fixé sur un support, par exemple sur le support PVC- GA (avant toute fixation de fibrinogène sur celui-ci). Cette étape est schématisée en (f) sur la fig. 3. Après saturation de la plaque avec de la sérum-albumine, on incube la plaque retenant les anticorps monoclonaux fixés avec une solution de t-PA (contenant par exemple 100 unités/ml de t-PA) pendant 1 heure à 37°C. L'opéra¬ tion correspondant à cette étape est schématisée en (g) dans la fig. 3. Le résultat de cette opération est sché¬ matisé en (h) de la fig. 3.
On fait ensuite incuber la plaque retenant les anticorps monoclonaux avec une solution de plasminogene (Pg) , de fibrine (Fn) et d'un substrat de la plasmine (par exemple S-2251) dans les conditions qui ont été indiquées plus haut. Ces anticorps monoclonaux obtenus, tous actifs contre le t-PA, sont alors considérés comme spécifiques ou non spécifiques du site actif du t-PA, selon que l'on ob¬ serve une activation ou une absence d'activation du plas¬ minogene amené au contact de la plaque.
EXEMPLE III : Application au dosage quantitatif des plasminoqènes. e réseau de fibrine en phase "solide tel qu'obtenu par le procédé de fabrication décrit dans l'exemple I peut également être utilisé pour le dosage du plasminogene contenu dans un échantillon biologique, notamment dans un sérum sanguin. Celui-ci est notamment susceptible d'être obtenu à partir de plasma (surnageant de sang après séparation de toutes les cellules) et après séparation de sa teneur en fibrinogène, de préfé¬ rence sous forme de fibrine (par exemple après addition d'un sel de calcium ou de thrombine à ce plasma). Le sé- ru peut aussi être obtenu directement à partir d'un prélèvement du sang, après séparation des caillots, une fois que ceux-ci se seront produits de façon spontanée et, éventuellement, d'autres cellules.
L'échantillon de sérum, éventuellement dilué dans du tampon E, est mis à incuber pendant 1 heure, no¬ tamment à une température de 37°C, au contact des pelli¬ cules de fibrine formées dans les godets de la micro- plaque. Le plasminogene absorbé est ensuite activé par mise en contact avec une solution d'un activateur appro- prié, tel que l'urokinase ou la streptokinase. Après lavage de la plaque, la plasmine produite in situ est alors dosée par introduction dans les godets de la pla¬ que d'un substrat spécifique de l'enzyme, dans les con¬ ditions qui ont déjà été décrites plus haut. On peut également ajouter l'activateur et le substrat simulta¬ nément et ensuite effectuer la lecture dans les condi- tions qui ont été indiquées. Il pourra être avantageux d'apprécier les résultats de ces dosages vis-à-vis des résultats obtenus dans des conditions analogues dans les godets d'une plaque distincte dans les mêmes conditions que précédemment, si ce n'est que l'on omet l'étape d'activation par l'activateur extérieur tel que l'uro- kinase ou la streptokinase. Cette dernière mesure permet d'apprécier le bruit de fond éventuel produit par les traces de t-PA qui pouvaient éventuellement être conte¬ nues dans le sérum testé. Les résultats du premier do¬ sage peuvent alors être corrigés à la lumière de ceux obtenus du fait de l'éventuelle activation partielle du plasminogene testé par les traces de t-PA endogène qu'il pouvait contenir initialement.
Les pellicules de réseau de fibrine conformes à l'invention peuvent comme dans le cas précédent égale¬ ment être mises en oeuvre pour la sélection d'anticorps spécifiques du plasminogene, plus particulièrement d'an¬ ticorps monoclonaux spécifiques.
Le spécialiste de ces techniques est naturelle¬ ment à même d'apprécier les modifications qu'il convient d'apporter aux techniques qui ont été décrites dans l'exemple II, afin de les rendre applicables à la détec¬ tion et à l'isolement d'anticorps monoclonaux spécifi¬ ques du plasminogene.
Il va naturellement de soi que les techniques qui ont été décrites s'appliquent tout aussi bien à des enzymes (fibrinogène, fibrine, activateur tissulaire du plasminog ne, plasminogene , plasmine, etc.) d'origine humaine ou animale.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ail¬ leurs déjà de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes d'application et de réa¬ lisation qui ont été plus spécialement envisagés j elle en embrasse au contraire toutes les variantes.

Claims

REVENDICATIONS 1 - Pellicule moléculaire supportée d'un réseau de fibrine en phase solide formée à la surface d'un sup¬ port et apte à retenir à sa surface un activateur tis¬ sulaire du plasminogene. 2 - Pellicule supportée selon la revendication
1, caractérisée en ce qu'elle est également apte à retenir à sa surface du plasminogene.
3 - Pellicule supportée selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce qu'elle com- prend d'environ 50 à environ 500 ng/cm2, de préférence de 120 à 180, et de façon particulièrement avantageuse, de 145 à 150 ng/cm2 de fibrine.
4 - Pellicule supportée selon la revendication 3, caractérisée en ce qu'elle est fixée de façon cova- lente à au moins certaines régions de la surface du support, notamment par l'intermédiaire d'un réseau de polyglutaraldéhyde, lui-même fixé à la surface de ce support.
5 - Pellicule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le support consiste en une plaque de titration en matière plastique, notamment en chlorure de vinyle ou polysty¬ rène, comprenant un ou plusieurs godets et en ce que la pellicule moléculaire du réseau de fibrine est formée sur les surfaces internes des godets.
6 - Pellicule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par la fixation sélective à sa surface de l'activateur tissulaire du plasminogene, notamment sous la forme d'un complexe fibrine-activateur tissulaire.
7 - Pellicule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée par la fixation sélective à sa surface de plasminogene, notamment sous la forme d'un complexe fibrine-plasminogène. 8 - Application de la pellicule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 au dosage spé¬ cifique et quantitatif de l'activité enzymatique d'un activateur tissulaire du plasminogene contenu dans un échantillon biologique, cette application comprenant la mise en contact de ladite pellicule supportée de fibrine avec l'échantillon biologique contenant l'activateur tissulaire à doser et, après lavage du support avec une solution tamponnée appropriée, la mise en contact de lractivateur fixé sur la pellicule avec un plasminogene et le dosage de la plasmine résultant de l'activation du plasminogene activé en plasmine par l'activateur tissu¬ laire alors fixé sur la pellicule, notamment par l'in¬ termédiaire d'un substrat naturel ou synthétique spéci- fique de la plasmine.
9 - Application de la pellicule supportée selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 au dosage spécifique et quantitatif du plasminogene contenu dans un échantillon biologique, notamment un sérum sanguin, cette application contenant la mise en contact de ladite pellicule supportée de fibrine avec l'échantillon biolo¬ gique contenant le plasminogene à doser, après lavage du support avec une solution tamponnée appropriée, la mise en contact du plasminogene fixé sur la pellicule avec un activateur du plasminogene et le dosage de la plasmine libérée résultant de l'activation du plasminogene anté¬ rieurement fixé sur la pellicule, notamment par l'in¬ termédiaire d'un substrat spécifique de la plasmine.
10 - Application de la pellicule supportée selon la revendication 6 à la détection d'anticorps anti-acti- vateurs tissulaires du plasminogene comprenant la mise en contact de ladite pellicule avec une solution conte¬ nant lesdits anticorps et la détection des anticorps fixés à la surface de ladite pellicule. 11 - Application selon la revendication 10, ca¬ ractérisée en ce que la susdite pellicule est appliquée à la détection d'anticorps monoclonaux anti-activateurs du plasminogene, par mise en contact de ladite pellicule avec le surnageant d'une culture d'hybridomes sécréteurs de tels anticorps. 12 - Application de la pellicule supportée selon la revendication 7, à la détection d'anticorps, notam¬ ment d'anticorps monoclonaux anti-plas inogène, la mise en contact de la susdite pellicule avec une solution contenant les anticorps anti-plasminogène, notamment d'un surnageant d'une culture d'hybridome sécréteur de tels anticorps, et la détection des anticorps fixés à la surface de ladite pellicule.
13 - Pellicule moléculaire supportée de fibri¬ nogène pour la fabrication du support conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 7.
14 - Pellicule moléculaire supportée de fibri¬ nogène selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend d'environ 50 à environ 500 ng/cm2. de préférence de 120 à 180, et de façon particulièrement avantageuse de 145 à 150 ng/cm2 de fibrinogène.
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