WO1982002715A1 - Gene d'interferon (beta)humain - Google Patents

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WO1982002715A1
WO1982002715A1 PCT/JP1982/000034 JP8200034W WO8202715A1 WO 1982002715 A1 WO1982002715 A1 WO 1982002715A1 JP 8200034 W JP8200034 W JP 8200034W WO 8202715 A1 WO8202715 A1 WO 8202715A1
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human
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phage
human interferon
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Found Japanese Cancer Res Juridical
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Sugano Haruo
Taniguchi Tadatsugu
Ono Shigeo
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/811—Interferon

Definitions

  • the present invention relates to a human interferon gene derived from human staining ⁇ DNA (DNA corresponding to the entire transcription region of the gene of the interface).
  • plasmid DNA for example, a plasmid DNA derived from Escherichia coli
  • phage DNA a plasmid DNA derived from Escherichia coli
  • phage DNA derived from Escherichia coli with the aim of mass-producing interferon-fluorones by recombinant DNA in which human interferon gene is inserted. went. As a result, it can be propagated and propagated in bacteria, for example, Escherichia coli, and ultimately used to produce human interferon- ⁇ in bacteria, for example, Escherichia coli. It can be further integrated into eukaryotic cells, for example, into the chromosome gene of mouse cells, or incorporated into a virus, and taken up by eukaryotic cells. We have discovered a novel recombinant ⁇ DNA that can be used to cause us cells to produce a material having exactly the same chemical structure as human interferon. The present invention has been completed.
  • the recombinant DNA has at least the entire transcribed region of the human interferon-chromosomal gene, and a portion containing a region considered to be involved in the regulation of transcription. It is a new recombinant DNA.
  • OMFI a human interfering gene and a DNA containing the gene and a DNA involved in its transcriptional regulation are directly extracted from the human staining gene. Indicates success.
  • Honkiaki is a human chromosome-derived human interferon ⁇ transgene, a DNA carrying the gene and the DNA that contributes to the transcriptional section of the gene, and the DNA. And recombinant DNA of vector DMA. Recombinant DNA of Honoki can be produced by leveraging as follows.
  • Human staining Total DNA for example, chromosome DNA extracted from human liver, is renewed to an appropriate length using a control enzyme. Alternatively, only a portion having an appropriate length is taken out and reduced by electrophoresis or the like. This is introduced into vector DNA by recombinant DNA technology to obtain recombinant DNA.
  • recombinant DNAs recombinants that have DNA that complements the human interferon-transfer RNA (human interferon-pi-n cDNA) ⁇
  • a novel recombinant DNA of the present invention containing a human interferon-chromosome gene is searched and collected. I can do it.
  • the human chromosome D MA is extracted from human infant chromosomes, etc. by means of funnel.
  • the extracted DNA is partially digested with a restriction selen, for example, HaeDI and Alul, to obtain an appropriate length.
  • the set of permutations ⁇ thus obtained for the human transgene is called the human gene library.
  • the human library is almost completely human in principle.
  • OMPI It contains transgenic DNA, from which almost all genes can be isolated.
  • the total DNA of human chromosomes is completely erased with Hind! T or the like, and about 10 kilobases (hereinafter abbreviated as Kb) of DNA are electrophoresed in agarose. And assembling it into a phage or the like as described above, a library of about 10 Kb of DNA having Hindn cleavage sites in the rain can be obtained. Obtainable.
  • the human interfacial chromosome transgene is contained in about 10 Kb of DNA generated by Hind. In this case, it is thought that the size is reduced by about 10 times compared to the whole gene library.
  • the phage used as the above-mentioned vector can be replaced with a Charon-based phage, a brassmid such as pBR322, pCl, MB9, pSCl, or the like.
  • a recombinant DNA having a DNA fragment harboring the human interfering gene is searched for as follows. be able to.
  • Recombinant ⁇ plasmid with a structure (cDNA) complementary to human interferon-19-messenger RNA was obtained from E. coli 1776 / TpIF319-13 ATCC31712 And Nester's method CA na 1 yt. Biochem. Vo 1.76, 431-441 (1976)].
  • This two-click preparative lance les over sheet Yo down method [Boop et al, Cell ⁇ , 671 ⁇ 685 (1978 ) ] was labeled with [32 P] according to the probe it.
  • the above-mentioned gene library which used the E. coli phage as a vector, was developed on agar flat hill, and the files corresponding to each clone were developed.
  • This filter is subjected to high-level characterization using the above-mentioned probe, and the radiograph is used to perform the hit-interferon measurement. It discriminates phage clones that have DNA that associates with transgenics that have a structure that is complementary to the sense RNA.
  • the phage thus obtained is spread to extract DNA.
  • the DNA is digested with a restriction enzyme such as EcoRI and screened by agarose gel electrophoresis.
  • the obtained area was determined by the Southern method [J. Mol. Biol. 98, 503-517.
  • the DNA sequence of DNA is determined by the method of Majam and Gilbert et al., Proc. Xatl. Cad. Sci. USA J7, 560-564, (1977)].
  • the base sequence of this DNA was compared with the base sequence of human interferon cDNA C Gene !, 11-15 (1980)]
  • the obtained clone was found to be a human interferon. It can be identified that the gene contains a chromosome gene that corresponds to the messenger RNA, that is, a ⁇ ⁇ gene that stains for human ⁇ .
  • the DNA containing the human interferon gene and the DMA involved in the regulation of the germ and its larvae and its cultivation were obtained from the above-obtained recombinant DNA description by Benton and Davis. Method (Science, 1S6, 180-182
  • FIG. 1a shows a restriction map of a 15 Kb chromosomal DNA section cloned into 'HI FN- ⁇ 1-121.
  • the interruption in the figure shows the arm of the vector DNA from Charon 4A.
  • Figures 1b and d show the restriction map of the 1.8Kb EcoRI fragment from human chromosome DNA. The black band in the figure indicates that the messenger RNA is transferred from there.
  • Figure 1c shows the part of human chromosome DNA corresponding to the interfront cDNA.
  • the white frame indicates the protein coding region.
  • Figure 1e shows the starting point and direction of the sequencing. Arrows in the figure indicate the direction and extent of the sequence of each fraction.
  • Fig. 1 indicate restriction enzymes IB ⁇ in the following literature.
  • FIG. 2 also shows the base sequence of the 1.8 Kb EcoR I fragment.
  • Figure ⁇ 1- ⁇ 561 shows the part that encodes the protein of human interferon-ferron.
  • One arrow indicates the transcription start site, and the underline indicates the TATA box.
  • the human gene library was provided by Tom Maniatis (California Institute of Technology), which was made as follows.
  • the infectious phage-DNA recombination ⁇ is connected to the arm DNA of Escherichia coli phage Charon 4 A via a short synthetic nucleotide having a cut site of the enzyme EcoRI. To work. Next, in order to further increase the infectivity, complete fermentation and diparticulation are performed by a packaging method.
  • the human gene library thus produced is, in principle, a set of 18 to 25 Kb human DNA chains containing almost all human genes. It is considered to be a set of transmutants.
  • a recombinant phage having a DNA fragment that carries a gene from the human gene library to the human interface library is a human interface.
  • the method of Benton and Davis uses a cDNiT fragment, which has a partial translation into a full-length cDNA protein, radiolabeled with (: 32 ?) As a probe, and uses it as a probe. 1977)]. The details are described below.
  • That DNA (0.5 [mu] g) of 50mM Tris-HCl (PH7.8) 5niM MgCl 2.
  • 1 OmM over main Luke flops example data Roh Lumpur, 5 M dGTP, 150 ⁇ dTTP , lng DN ase I (Wor th i ng ton), [ 32 P] 1-dCTP (100 Ci, 2000-3000 Ci / mmol, RCC Amersham), 15 unit DNA polymerase I (Boehringer Mannheim) 30 ⁇ 1 aqueous solution In 15 of them, I did a 4-hour invite. Then add EDTA to a final concentration of 20 mM and incubate at 65 for 10 minutes to inactivate the enzyme.
  • a DNA fragment prepared by radiolabeling a fragment of human interferon-1c DNA is used as a probe to obtain a DNA fragment from the human gene library.
  • a combinatorial phage having a DNA fragment containing the intermediate gene is searched for as follows.
  • the phage particles are formed on the agar plate [Science, 1279-1284 (1978)] by forming the phage break.
  • the density of this plaque should be about 10,000 to 30,000 bottles per plate of 5 cm in straight SI 5 cm.
  • step 4 WIPO one Save the rate in step 4 and air-dry the 2-torocellose at room temperature for about 90 minutes. Put this in an aqueous solution of 0.1 K NaOH, 1.5 M aCl.
  • the toro cell ⁇ thus prepared was compared with the phage DN ⁇ ⁇ on a piece of paper, and the hit-to-feature interface was radiation-marked as described above. -Hybridization was performed as follows using ⁇ cDNA as a probe.
  • the DNA of the radiolabeled probe should be heat-denatured by treating at 95 * C for 10 minutes.
  • the pretreated nitrose cellulose paper and the heat-denatured DNA of the probe were incubated in the upper hybridization solution with 65 ⁇ (:).
  • the recombinant DNA of each clone is excised with the restriction enzyme EcoRI, and the amount of DNA fragments generated by agarose gel electrophoresis is measured.
  • the digests of all clones of DNA have 20 Kb and 11 Kb DNA fragments derived from the arm of the vector, Charon 4A, but not the other. Contains several DMA fragments derived from human intrachromosomal DNA. As a result of this analysis, 11 clones were classified into 5 types.
  • the human interferon-cDNA used in the above-mentioned screening was used as a probe to probe the Southern Hybridization (Southern, J .Mol .Biol, 98, 503-517 (1975)], a new piece of DN'A obtained, for example, by EcoR I digestion, It was identified whether it associates with frontal cDNA.
  • the DNA of each phage clone is digested with EcoRI and then subjected to agar ⁇ -sgel electrophoresis. After the electrophoresis, the gel is cut out and denatured by treating in an aqueous solution containing 0.5 aOH and 1 M NaCl for 30 minutes in a chamber. Then, repeat the same process twice in an aqueous solution containing 0.5 N Tris-HCl (PH 7.0) and 1.5 HaCl to neutralize the gel. Place the gel on a piece of paper impregnated with 20 XSSC. Place nitrose cellulose paper on top of it, further slaughter it on paper and paper towel, and place the denatured DNA in the gel on a two-cell mouth per piece.
  • this 1.8Kb EcoR fragment was used for the brain.
  • the clone was again cloned using the vector pBR322 as a vector. This method is described below.
  • pBR322 was cut with PstI, and in the same manner, a vector was created by extending about 100 deoxysiganin towns in the 3 'rain at the newly cut PstI site. Quasi-qualified.
  • a 0.05 gg piece of EcoRI fragment of human chromosome gene DNA obtained in this way and 0.05 ⁇ g of pBR322 DNA were combined with 0.1 M aCl, 50 mM Tris-HCl (PH 7.5).
  • E. coli 1776 is transformed into form S.
  • DNA was prepared by the above-mentioned Currier and Nester ⁇ method and subjected to the following analysis.
  • a 1.8 Kb EcoRI fragment derived from the human chromosomal DNA is a DNA fragment that is compatible with the human messenger RNA. It is clear from the above that this is the case, but for the purpose of further clarifying this, a cut-out new figure by Restricted Seol was used.
  • the human interferon-messenger RNA (ie, cDNA) was placed on the 1.8 Kb BcoR IDNA fragment obtained from the human pruritus DMAs obtained here.
  • the sequence is completely identical, that is, the 1.8 Kb EcoR I DNA fragment meets the chromosome ⁇ gene of human interferon-1 (black band in Fig. 1b).
  • inter-behavioral sequence that is present in many other eukaryotic genes is absent for the human interferon gene.
  • the absence of the intervening sequence of the interfering gene contained in the obtained 1.8 Kb EcoR I fragment means that the intervening sequence was cut using the DNA of this gene. It shows that it is possible to synthesize the interferon protein in a protozoan such as Escherichia coli, which has no mechanism.

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Description

明 細
発明の名称
ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ン一 B遺伝子
〔技術分野〕
本発明は ヒ ト 染色^由来の ヒ ト イ ン タ ー フ ュ ロ ン一 遗伝子 〔ィ ンタ ー フ ユ 口 ン の遺伝子の全転写領域に対応する D N A (デォ キ シ リ ボ核酸） 〕 ， 該遣伝子および該遺伝子の転写の篛節に関与する D N Aを含む D N A , な らびに該 D N Aとベク タ ー D N A との組換 え体 D M Aに闋する。
〔従来技術〕
ヒ ト イ ン タ ー フ ェ ロ ン一 の c D N Aを m R N Aを誇型と し て取 り 出すこ と は し られている 〔 Gene, 2 , 11〜： 15, ( 1980) 〕 。
〔発明の開示〕 ， 本発明者ら は ， 組換え D N A技術を用い， ブラ ス ミ ド D N A (た とえば大腸菌由来のブラ ス ミ ド D N A) あるいはフ ァ ー ジ D N A
(たとえば大腸菌由来の フ ァ ー ジ D N A ) に ヒ ト イ ンタ 一フ エ 口 ン遗伝子を揷入した組換え体 D N Aによ る ィ ンタ 一 フ - ロ ン の大量 増殖を目的に研究を行っ た。 その結果， 轴菌た とえば大腸菌内で增 殖， 增幅させ ， 最終的に は ヒ ト イ ン タ ー フ Λ ロ ン — ^を細菌た とえ ば大腸菌に生産させる のに利用する こ とができ， さ らに真核細胞内 た とえばマ ウ ス細胞の染色体遣伝子中に組込み， あるい はゥ ィ ルス に組み込んで真核細胞內に取り込ませ， 真核辎胞た とえばマ ウ ス細 胞に ヒ ト イ ン タ 一 フ ュ ロ ン — と全 く 同一の化学構造を有する物資 を生産させる の に利用する こ と の で き る新規な組換え ^ D N Aを見 出 し， 本発明を完¾するに至っ た。
該組換え体 D N Aは ヒ ト イ ンタ ー フ ロ ン — の染色体内遺伝子 の少な く と も全転写領域， さ らに転写の調節に 与している と考え られる領域をも含んだ部分を有する新規な組換え体 D N Aである。
OMFI 本発明では ヒ ト の染色侔遗伝子から直接ヒ ト イ ンタ ーフユ 口 ン— 遣伝子な らびに該遣伝子とその転写調節に関与する D N Aとを舍 んだ D N Aを取り 出すこ と の成功を示している。
以下本発明を詳辎に説明する。
本癸明はヒ ト染色体由来の ヒ ト イ ンタ 一フ - ロ ンー ^透伝子， 該 遺伝子および該遗伝子の転写の篛節に K与する D N Aを舍む D N A , な らびに該 D N Aとベク タ ー D M Aとの組換え体 D N Aに闋する。 本癸明の組換え体 D N Aは， 梃略次のよ う に して製造でき る。
ヒ ト染色 全 D N A, 例えばヒ ト脍児肝藏から抽出 した染色体 D N Aを制跟酵素を用いて適当な县さ に分新する。 それをそのま ま も し く は適当な县さの部分のみを取出 して電気泳動法などによ り籩縮 する。 これを組換え D M A技術によ ってベク タ ー D N Aに揷入する こ と によ っ て組換え D N Aを得る。 こ の組換え D N Aの中から ヒ ト ィ ンタ 一 フ - ロ ン一 ッ セ ン ジ ャ ー R N Aに相補性を示す D N A (ヒ ト イ ンタ ーフ - π ンー の c D N A) を持つ組換え^ D N Aを 放射性同位元素で標篛したも のを探針と して， ヒ ト イ ンタ ー フ - ロ ン一 ^ の染色体遣伝子を含む本発明の新規組換え体 D N Aを探索， 採取する こ とがで き る。
該組換え钵 D N Aの製法についてさ らに具^的に説明する。
ヒ ト染色体 D M Aを， ヒ ト脍児肝蘿などからフ ユノ ールなどで抽 出する。 こ の抽出 D N Aを制限薛素， 例えば HaeDIと Alul などで 部分消化する こ とによ り適当な县さ に分靳する。
こ う して得られる ヒ ト染色体全 D N Aの断片を Ecoi? I リ ンカ 一 な どを介してバク テ リ オ フ ァ ジー T 4 リ ガーゼなどを用いて大腸菌フ ァ ージ ス などの D N Aに揷入し， 組換え体 D M Aを作る。
これをさ らにパ ッ ケ ージ ング法によ り， よ り感染性の高い ス フ ァ ージ粒子にする。 こ の よ う に して得た ヒ ト全遣伝子を舍む ¾換え ^ の集合は， ヒ ト遺伝子ラ イ ブラ リ 一 とよばれる。
ヒ ト還伝子ラ イ ブラ リ 一 は， その構築の原理上ほ とん ど ^て の ヒ
OMPI ト遣伝子 D N Aを含んでおり， ほとんど総ての遗伝子をそ こ から単 離して く る こ とがで き る。
ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ンー の染色体內遣伝子の場合に は， 後逑す るよ う に， 既に遺伝子周辺の制限醇素によ る切新地図が明 らかにな つており， 上述の ヒ ト全遣伝子ラ イ ブラ リ ーを出癸点とする代り に . 次のよ う な ヒ ト イ ン タ 一 フ ュ ロ ンー 遺伝子について， よ り 濩縮さ れた組換え ^の集合を出発点と し て もよ い。
すなわち， ヒ ト染色体全 D N Aを制蹈薛素 Hind!Tなどで完全に消 化し ， 約 1 0 キ ロ ベース （以下 Kbと略記する） 程度の D N Aをァガ ロ ース中の電気泳動法などによ って分画 し， これを上述のよ う に フ ァ ー ジなどに組込むこ とによ って， Hindn切断個所を雨锆に持つ 約 1 0 Kbの D N Aの ラ イ ブラ リ一を得る こ とができ る。
ヒ ト イ ン タ ー フ - 口 ンー の染色体内遣伝子は Hind に よ っ て生じ る約 1 0 Kbの D N A中に含まれている。 こ の場合， 全遺伝子ラ イ ブ ラ リ ーに比べ， 約 1 0倍程度は濩縮される と考え られる。 , 上記ベク タ ー と して用いた フ ァ ージは Charon系のフ ァ ー ジ， ブ ラ ス ミ ド例えば pBR322, pC l , MB9, pSClなどに代える こ と もで き る。
か く して得られた ヒ ト遣伝子ラ イ ブラ リ 一から次のよ う に してヒ ト イ ン タ — フ ユ 口 ンー 遺伝子を舍む D N A断片を持っ た組換え体 D N Aを探し出すこ とができ る。
ヒ ト イ ン タ ー フ ュ ロ ン 一 9メ ッ セ ン ジ ャ ー R N Aに相補的な構造 ( c D N A ) をも っ た組換え ^プラ ス ミ ドを大腸菌 1776/ TpIF319 -13 ATCC31712 から Currier と Nesterの方法 C A na 1 y t . B i ochem . Vo 1. 76, 431-441 ( 1976) 〕 によ って取出す。 これをニ ッ ク ト ラ ンス レ ー シ ヨ ン法 〔 Boopら ， Cell ϋ,671〜 685 ( 1978) 〕 に従って 〔 32 P〕 で標識し ， これを探針とする。
—方， 大腸菌フ ァ 一 ジをべク タ — と して用いた上述の遣伝子ラ イ ブラ リ 一を寒天平坂上に展開し， 各々 の ク ロ ー ン に対応する フ ァ 一
"¾"ϋκ A ジブ-ラ ー ク 中の D N Aを Bentonn t Davis の方法 〔 Science, 196, 180-182 ( 1977) 〕 に従 っ て フ ィ ルタ ー上に固定する。
こ の フ ィ ルタ 一に対して上記探針を用いてハ イ プ リ ダイ ゼー シ ョ ンを行い， ラ ジオォ ー ト グラフ ィ 一によ り， ヒ ト イ ンタ ーフ ェ ロ ン 一 メ ッ セ ン ジ ャ一 R N Aに相補的な構造をも つ た紐換え体に会合 する D N Aを持ったフ ァ一ジの ク ロ ー ンを判別する。
かく して得たフ ァ ージを增巾 し， D N Aを抽出する。 該 D N Aを EcoR I などの制限薛素で消化 し ， ァガロ ー スゲル電気泳動で分面す る。 得られる面分を Southernの方法 〔J. Mol . Biol . 98, 503-517
( 1975) 〕 でフ ィ ルタ -に固定する。 上記の探針を用いてハイ プ リ ダイ ゼー シ ヨ ンを行い， いわゆる Southernブロ ッ テ イ ング分圻 （同 上文献） する。 こ のよ う に して c D N Aにハイ ブリ ダィ ズする， 例 えば 1.8Kbの EcoR I gf片をもつフ ァ ー ジ ク ロ ー ンを得る。
このフ ァ ージク ロ ー ンから， ·Μえば Smi thと Birnstiel らの方法
C Nucleic Acids Res. 3, 2387-2398 ( 1976) 〕 によ り ， よ り詳 な制限酵素地図を作或する β
さ らに ， 伊 Jえば Majamと Gilbert らの方法 Proc. Xatl . cad. Sci. USA J7 , 560-564, ( 1977) 〕 によ り D N Aの埕基配列を決定 する。 こ の D N Aの埕基配列をヒ ト イ ンター フ ェ ロ ン c D N A C Gene ! , 11-15 ( 1980) 〕 の塩基配列と比較する と ， 得られたク ロ ー ンがヒ ト イ ンタ ー フ ェ ロ ン一 ^ メ ッ セ ン ジ ャ ー R N Aに対応す る染色体內遺伝子， すなわち ヒ ト ィ ンタ ーフ ユ π ンー の染色^內 遺伝子を含むこ とが同定でき る。
こ の ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ンー 遺伝子な らびに該遺&子とそれの 耘写の調節に関与する D M Aを舍む D N Aは上記で得 られた組換え 体 D N Aの申から Bentonと Davis の方法 ( Science, 1S6 ,180-182
( 1977) 〕 Grunstein-Hogness の方法 〔 Pro" Natl . Acad. Sci . USA 72. 3961-3965 ( 1975) 〕 に従って採取する。 〔図面の簡単な説明〕
第 1 図 a は， 'HI FN- β 1 - 121 にク ロ ー ン化された 1 5 Kb染色 体 D N A切片の制限酵素地図を示す。 図中断続鎳は Charon 4A か ら の ベ ク タ ー D N Aの腕を示す。
第 1 図 b および d は， ヒ ト染色体 D N Aに由来する 1.8Kbの EcoR I 断片の制限酵素地図を示す。 図中黒い帯はメ ッ セ ン ジ ャ一 R N Aが そこから転写さ れる こ とを示す。
第 1 図 c は， ヒ ト染色体 D N A中の ィ ンタ ー フ ロ ンー c D N A に対応する部分を示す。 図中白枠は蛋白コ —デ ィ ン グ領域を示す。
第 1 図 e は， 配列決定の始点と方向を示す。 図中矢印は分折した各 画分の配列の方向および広がりを しめす。
第 1 図中の記号は， 下記文献に IB载された制限酵素を示す。
EcoR I Methods Mol .Biol .7, 87 ( 1974)
Bgl Π Nucleic Acids Res.. 3, 1747 ( 1976)
Hindi, J.Mol . Biol . , 92, 331 ( 1975)
BamH I J.Mol .Biol . , 97, 123 ( 1975)
Pst I Nucleic Acids Res, 3., 3. 3 ( 1976)
Pvu Π Gene J_， 329-343 ( 1980)
Hinf I J.Mol .Biol . , jj_0. 297 ( 1977)
Alu I J.Mol .Biol . , 102, 157 ( 1976)
Hae IE J.Virol . , 1_0, 42 ( 1972)
Taq I Proc. atl .Acad. Sci .USA, 74, 542 ( 1977)
Ava Π Biochem.J. , 159, 317 ( 1976)
Hin D Gene < 329-343 ( 1980)
EcoRH Nature N'ew Biol . , 244, 7 ( 1973)
第 2 図は， 1.8 Kb EcoR I 断片の埕基配列も示す。 図 ÷ 1 - ÷ 561 はヒ ト イ ン タ 一 フ エ ロ ン 一 の蛋白資をコ 一 ドする部分を示し，
一 7 3 Ί 5 の矢印は転写開始部位を示し， 下線は T A T Aボ ッ ク ス を示す。
C ?I
，ル V IPO , j 〔発明を実施するための最良の形態〕
以下に本発明の態様を実施例によ って説明する。
実施例 1 .
ヒ ト遺伝子ラ イ ブ ラ リ 一 は Tom Maniatis (California Institute of Technology ) から供与を受けたが， これは次のよ う に して作 られた も のであ る。
ヒ ト胎児肝職から染色 全 D N Aをフ ユ ノ ールな どで抽出 し， 制限酵素 Haen と Alu l で部分消化する。 こ う して得 られた DNA 断片の中から鎮县が 1 8 — 2 5 K b程度のフ ラ グメ ン トをシ ョ 糖 密度勾配遠心法によ り濃綰し， 次に制！！酵素 EcoR I の切斷箇所を 持つ短鎮合成ヌ ク レオチ ドを介して大腸菌フ ァ ージ ス Charon 4 A のア ーム D N Aに接続し， 感染性のある フ ァ —ジ D N A組換え ^ を作威する。 次に， さ らに感染性を高め る目的でパ ッ ケ ー ジ ング 法によ り完全なフ ァ ー，ジ 粒子に してある。 このよ う に して作ら れたヒ ト遗伝子ラ イ ブラ リ 一は原理的にはほとんどすべての ヒ ト 遺伝子を含む鎖县 1 8 一 2 5 K b の ヒ ト D N Aを会んだ組換え体 の集合である と考え られる。
ヒ ト遣伝子ラ イ ブラ リ 一から ヒ ト イ ンタ ーフ ヱ ロ ン一 ^ の遣伝 子を舍む D N A浙片を持つ組換え体フ ァ ー ジ はヒ ト イ ンタ ー フ - ロ ンー の c D N Aの蛋白に翻訳される部分すベてを持つ c DNiT 断片を （：32 ?〕 で放射標赣した ものを探針と して Bentonと Davis の方法 〔 Science 196, 180-182 ( 1977) 〕 によ り探索 した。 以下 にそ の詳細を述べる。
先ず， 探針と して用いる ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ン 一 ^ の c D N A の蛋白に翻訳される部分すベてを持つ約 0.57K b の D N A新片は 次の様に して闞製し， 放射標篛した。
ヒ ト イ ンタ ー フ - ロ ン一 の c D N Aを含む組換え体ブ ラ ス ミ ド TpIP 319- 13を持つ大腸菌 χ 1776/ TpIF 319— 13 ATCC 31712 力、ら Currierと Nesterら の方法 Ana 1 v t . B i ochem . 76, 431-441
O PI_
、 ( 1976) ：! 'に よ っ て Tp IF 319— 13ブ ラ ス ミ ド D N Aを精製 し， 制 限薛素 HincH . Bgl Π , Hha I で消化する。 得 られた消化物中 ， 最も鎮县の县ぃ 0.57K b の D N A靳片が目的とする D N A断片で あるが， これを Tabakと Flavel 1 の方法 〔 Nucleic Acids Research 5, 2321 -2332 ( 1978) 〕 によ り ァガロ ー ス電気泳動法で他の靳片 と分離 し精製する。 これをニ ッ ク ト ラ ンス レ ー シ ョ ン法 〔た とえ ば βοορら ， Cel l ϋ, 671 -685 ( 1978) 〕 によ り 〔 32 P〕 で放射標 識する。 すなわち D N A ( 0.5μ g ) を 50mM Tris-HCl ( PH7.8 ) 5niM MgCl 2 . 1 OmM ーメ ルカ プ ト エ タ ノ ール， 5 M dGTP, 150 μ dTTP, lng DN ase I ( Wor th i ng ton 社製） , 〔 32 P〕 一 - dCTP ( lOO Ci , 2000- 3000Ci/ mmol , RCC Amersham社製） , 15 uni t DNA polymerase I ( Boehringer Mannheim 社裂) を会 む 3 0 μ 1 の水溶液中で 1 5 で， 4 時間ィ ン丰 ュ ベー ト した。 つ いで E D T Aを添加し，終濃度 2 0 mMと し， 6 5 で， 1 0 分¾ィ ン キュベー ト し酵素を失活させる。 次にフ ユ ノ 一ルで除蛋白 した後， Sephadex G- 50 ( Pharmacia Fine Chemical 社製） カ ラ ム ク ロ マ ト グラ フ ィ 一で ¾塩し， 探針に供する。 こ のよ う に して得られた 〔32 P〕 で放射標識された c D N A断片は l O S cpm Z g 程度 の放射活性を持つ。
以上述べた方法によ り ， ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ン 一 c D N Aの 断片を放射標篛して調製した D N A断片を探針と して ヒ ト遺伝子 ラ イ ブラ リ ーから ヒ ト イ ンタ ー フ - ロ ン遣伝子を含む D N A新片 を持つ組摸え体フ ァ ー ジを次のよ う に して探索する。
まず. 寒天プ レ — ト 〔Science , 1279-1284 ( 1978) 〕 上に 先のフ ァ ー ジ ス 粒子をま き フ ァ ー ジブラ ー ク を形成させる。. こ の プラ ー ク の密度は直 S I 5 cmのブ レ ー ト 1 抆あた り 1 万〜 3 万瓶 程度にする。 次に こ の寒天ブ レー ト上に二 ト ロ セ ル口 ー ス紙
( Schleicherと Schul l 販壳） を重層 し ， 方向づ けの た め に マ — ク をつけ， 4 でで約 2 0 分間放置 し， フ ァ ー ジを吸着させる。 ブ
OMFI
、 WIPO一 レ ー ト は 4 で に保存しておき， 二 ト ロ セ ル ロ ー ス羝を室温で約 90 分間風乾する。 これを 0.1 K NaOH, 1.5 M aCl の水溶液中に約
2 0教間浸し， フ ァ ージ D N Aを変性させる。 次に 0.2 M Tris - HC1 ( PH 7.4) , 2 X S S C ( S S C とは 0.15 H NaCI . 0.015 M ク ェ ン酸ソ ーダを含む水溶液を言う。 2 X S S C と はそ の 2 倍 の濃度の ものを言う。 ） 中で約 2 0 移間中和し， さ らに 2 X S S . C中で 2 0 移間処理する。 室温で 1 時間風乾後， 8 0 て で 3 時閫 風乾し， 変性したフ ァ ー ジ D N Aをュ ト ロ セ ルロ ー ス 上に固定 する。
こ の よ う に して作成 した - ト ロ セル α — ス紙上のフ ァ ー ジ D N Α に対 し， 先に述べたよ う に して放射標篛さ れた ヒ ト イ ンタ ー フ 口 ン - β c D N Aを探針と してハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ.ンを次の よ う に行っ た。
二 ト ロ セ ル ロ ー ス紙を 3 X S S C中で 6 5 Ό , 3 (3 分閭処理し，
3 X S S Cに 0 .2%ポ リ ビニル ビ 口 リ ド ン （半井化学社製） ，
0 .2%ゥ シ血清ア ルブ ミ ン （岩井化学社製） ， 0 .2%フ イ コ ー ル
( Pharmacia Fine Chemical 社製） を加えた溶液中で 6 5 'C , 60 分間処理する。 さ ら に 1 M NaCl , δΟπιΜ Tris-HCl ( FH 8.0) , 10 mM E D T A, 0.1 % S D S , lOO g Zm ^ の超音 ¾ &理 し， 熱 変性した大腸菌 D N Aを含む溶液 （ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ン溶浚） 中で 6 5 で， 6 0 分藺の ¾理をする こ とによ り ハイ ブ リ ダィ ゼー シ ョ ンめ ため の全 ½理とする。
—方， 放射標識された探針の D N Aを 9 5 *C , 1 0 分間の処理 をする こ と によ り熱変性させてお く 。 次に， 前処理したニ ト ロ セ ル ロ — ス紙と， こ の熱変性した探針の D N A とを上 ハ イ ブ リ ダ ィ ゼー シ ヨ ン溶液中， 6 5 ·(： で イ ンキュ べ一 ト し， ハ イ ブ リ ダィ ゼ― シ ヨ ンを行う。 1 2 — 1 8 時藺後， ニ ト ロ セ ル コ ー ス紙を取 り 出 し， まず 2 X S S Cで 2 面洗い， 0.3 X S S C , 0.1 ¾ S D
Sを含む溶液中で S 5 'c， 6 0 分間の処理を 2 面行い， 最後に 80 •Cで 1 時間風乾させ， X線フ ィ ルムを用いてラ ジオォ ー ト グラ フ ィ 一を行う。
4 'c に保存しておいた寒天板と， ラ ジオォ ー ト グラ ム とを重ね あわせる こ とによ り 探針と会合した部分のフ ァ ー ジをかき取 り， さ らに上記の操作を緣返し行う こ とによ り， ィ ンタ ー フ ュ ロ ン一 β c D N Aに会合する D.N Aを持つ組換え体フ ァ — ジを単一ク 口 一ンに ま で精製する。
こ のよ う に して， 約 1 0 0万個の フ ァ ー ジブラ ー ク をス ク リ 一 ニ ングする こ とによ り 1 1 個のク ロ ー ンを得た。
次に各ク ロ ー ン の組換え体 D Ν Αを Maniatisの方法 〔 Cell, 15, 687-701 ( 1978) 〕 によ り篛製し ， 以下の解折に用いた。
まず， 各ク ロ ー ンの組換え体 D N Aを制限酉 素 EcoR I で切新し ， ァガロ ースゲル電気泳動によ り生じた D N A新片の鎮县を測定す る。 すべての ク ロ ー ンの D N Aの消化物はベク タ ーで あ る フ ァ 一 ジ Charon 4 Aの ア ー ム に由来する 2 0 K b , 1 1 K b の D N A 断片を持つが， それ以外に ヒ ト染色体内 D N Aに由来するい く つ かの D M A断片を持つ。 こ の解折によ り 1 1 個のク ロ ー ンは 5 種 類に分類された。 さ らに上述のスク リ 一ユ ングの と き に用いた ヒ ト イ ンタ ー フ ェ ロ ン 一 c D N Aを探針と してサザ ンハ イ ブ リ ダ ィ ゼ一 ジ ョ ン （ Southern, J.Mol .Biol , 98, 503-517 ( 1975) 〕 を行な う こ とによ り ， た とえば EcoR I 消化によ り得 られたどの县 さ の D N' A新片がヒ ト イ ンタ ー フ ロ ン c D N Aに会合するかと い う こ とが同定された。
すなわち各フ ァ ー ジ ク ロ ー ン の D N Aを EcoR I で消化 し ， ァ ガ π—スゲル鼋気泳動を行う 。 泳動後ゲルを切り 出 し， 0.5 aOH, 1 M NaClを舍む水溶液中 ， 室溘で 3 0 分間処理する こ と に よ り D N Aを変性する。 さ ら に 0.5 N Tris-HCl ( PH 7.0) , 1.5 H aCl を含む水溶液中で同様の処理を 2 面 く り 返 し行い， ゲルを中和す る。 ゲルを 2 0 X S S Cを しみ込ませた 紙上に置き， ゲルの上 にニ ト ロ セ ル ロ ース紙を置き， さ らにその上に玆羝， 紙タ オ ルの 頗に重屠し， ゲル中の変性した D N Aを二 ト ロ セ ル口一ス羝に吸 着させる。 1 2 — 1 8 時間後ニ ト ロ セ ル ロ ー ス羝をゲルから はが し， 8 0 で で 3 時間虱乾する こ と によ り ， D N Aを - ト ロ セ ル口 ース紙上に固定する。 以下は上述したフ ァ ー ジの ス ク リ ーユ ング に際して行ったと全 く 同様に してハイ ブ リ ダィ ゼー シ ヨ ンを行な う
こ の よ う に してク ロ ー ン化された 5 種類の ヒ ト染色体遣伝子断 片のう ち 4種顛が 1.8 Kb の EcoB I によ っ て生ずる D N A蔚片 (以下 EcoR I 新片とい う） を含み， こ の 1.8'K b の EcoiH gf片が ヒ ト イ ンタ ーフ ュ ロ ン c D N Aと相補的な構造を持っている こ と が明らかになっ た。 他の 1 種類のク ロ 一 ンについては， この 1.8 K b の Ecoi? I 断片の途中から始ま る D N A断片を含んでいる こ と が明 らかになっ た。
1 1 個のク ロ ー ンの う ち 1.8 Kb の EcoR I 断片を生ずる も の の 1 つであ る ス HIFN- β ^ - 121 と名づけ られたク ロ ー ンについて は， さ らに HindUI , BamHI, BglH , Pst I などの制 H酵素を用い て同様の実験を行う こ とによ り ， 制限酵素による切断地図を作成 した。 こ れを第 1 図 a に示す。 .
次に ヒ ト イ ンタ ー フ - ロ ン ー c D N Aに相裙性を示す 1.8Kb の EcoJU 靳片について詳¾に検討を加える目的で ， こ の 1.8K b の EcoR ί 断片をブ ラ ス ミ ド p B R 3 2 2 をベク タ ー と して再びク ロ ー ン化 した。 こ の方法を以下に示す。
HIFN- β , - 121 DNA 1 μ g を制跟酵秦 EcoR I で消化した後， 0.1 H リ ン酸カ リ ウ ム緩衝液 （ PH S.9) , 6m« MgCl 2 » 6 mMメ ル カ プ ト エ タ ノ ー ル， I mM A T P, I mH T T Pを舍む 3 0 J2 の水 溶液中で 5 ュニ ッ ト の D N A ポ リ メ ラ ーゼ ク レノ 一 フ ラ グメ ン ト ( Boehringer Mannheim ¾ S ) を用いて ， EcoR I 切斷笸所を修復 する。 フ エ ノ ー ルで除蛋白 した後， タ ー ミ ナ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼを 3 0 £ の反応液 〔 D N A 1 g ： カ コ ジル ¾カ リ （ PH7.6 ) 0.14M ； ト リ ス 0.03M ； ジ チ オ ス レ ィ ト ー ル O. lmM ； CaCI 2 1 mM ； dCTP I raM ; 2 ユ ニ ッ ト の タ ー ミ ナ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ〕 中で 3 7 *c , 1 5分間反応させ， 各 EcoR I 新片の 3 ' 両端に約 1 0 0 個のデォキ シ シチジ ン鎮を延县させる。 一方 p B R 3 2 2 を Ps t I で切断し， 同様に して Ps t I 切新箇所の 3 ' 雨嬈に約 1 0 0 個 のデォキ シグァニ ン鎮を延县して作っ たベク タ ーを準傭してお く 。 こ の よ う に して得られた ヒ ト染色体遣伝子 D N A の EcoR I 切新片 0.05^ g と p B R 3 2 2 D N A 0.05μ g とを 0.1M aCl , 50 mM Tris-HCl ( PH 7.5) , 5 mH E D T Aよ り な る溶液中で 6 5 で， 2 分間， 5 , 1 時間， 3 7 -C , 1 時間， 室温， 1 時間イ ン キュ ベ ー ト して会合させる。 これに Eneaらの方法 CJ.Mol .Biol . 96, 495-509 ( 1975) 〕 に従って大腸菌ズ 1776を形 S転換させる。
得られたテ ト ラ サ イ ク リ ン 性株の中から ， 4 0 0 個の S性株を 選び各々 の D N Aをュ ト 口セ ル口 ー ス紙上に固定する C Gruns tein - Hogness法， Proc. atl .Acad. Sci .USA J72. 3961-3965 ( 1975) , こ の ェ ト ロ セ ル ロ ー ス紙上で上記フ ァ ー ジの ス ク リ 一ユ ン グある いはサザンハイ ブ リ ダイ セ-一シ ヨ ンの と き に行な っ たの と同様の 方法 （ハイ ブリ ダィ ゼー シ ョ ン溶液中に熱ア ル力 リ 処理して靳片 化し， さ らに熱変性した P B R 3 2 2 D N Aを 3 O ^ g Z m ^ の 濃度で加えた。 ） で， 同じ探針 （イ ン タ ー フ ュ ロ ンー c DNA ) を用いてハイ ブリ ダィ ゼー ジ ョ ンを行い， 1.8 Kb の EcoR I 新片 を持つ組換え体プ ラ ス ミ ドを もつ大腸菌株を同定した。
こ の よ う に して得た大腸菌か ら ヒ ト イ ン タ ー フ ェ ロ ン 一 9 cD A に会合する組換え体 D N Aを含む 1.8 Kb の EcoR I 新片を持つ組 換え体ブ ラ ス ミ ド D N Aを前記 Currier と Nes ter©方法で篛製 し ， 以下の駑折に供した。
こ の ヒ ト染色体 D N A に由来する 1.8 Kb の EcoR I 断片がヒ ト ィ ンタ ーフ ュ ン 一 のメ ッ セ ン ジ ャ ー R N Aに相褚的な D N A を含んでいる こ と は， 以上で明 らかであるが， その こ とをさ らに はっ き り させる 目的で， 制限薛素による切新 ¾図を . 組換え ^ブ ラ ス ミ ドの D N Aあるいはその一部を 1 種類あるいは 2種類以上 の制限酵素で切新する方法によ り， ま たは 3 ' 末靖をボ リ ヌ ク レ ォキナーゼを用いて 〔32 P〕 で標識した新片を制 H薛素で部分消 ィ匕する方法 C Smi th と Birnstiel, Nucleic Acids Res. , 3_, 2387 - 2398 ( 1976) 〕 によ り生じた D N A断片の鎮县をァガ n —ス電 気泳動などによ り測定する こ とによ り作成 した。 （第 1 図 b,d) 第 1図 c に ィ ンタ ーフ ヱ ロ ン ー β c D N Aの対応する部分を示し たが （白枠は蛋白コ ーデ ィ ング領域を示す） ， c D Aと全 く 同 一の制限酵素切新地図を示す部分がある こ とが発見された。
以上の事実から， こ こ で得られた ヒ ト染色痒 D M A s来の 1.8Kb BcoR I D N A断片上に， ヒ ト イ ンタ ー フ ュ ロ ン一 メ ツセ ン ジ ャ - R N A (すなわち c D N A) と全 く 同一の配列のある こ と， す なわちこ の 1.8 Kb EcoR I D N A断片がヒ ト イ ンタ ー フ ェ ロ ン一 の染色体內遺伝子 （第 1 図 b の黒い帯） を会んでいる こ とが明 らかになつた。
さ らに他の多 く の真核細胞の遺伝子中に存在する ィ ンタ -ビ一 ユ ング シー ク ェ ンス （介在配列） が ヒ ト イ ンタ ー フ ェ ロ ン 一 の 遗伝子に関して存在しない こ とが明 らかになっ た。 得られた 1.8 Kb EcoR I 断片中に含まれているィ ンタ ーフ ユ π ン一 9遣伝子が 介在配列を持っていない という こ と は， この遺伝子 D N Aを ¾い て， 介在配列を切り 出すメ カ ニズム のな い， 例えば大腸菌などの 原梭生 にィ ンタ ーフ ュ ロ ン蛋白を合成させる こ とが可能であ る こ とを示している。
上記のこ とを決定的に証明する 目的で， こ の 1.8 Kb Eco8 I 断 片の埕基配列を Maxam と Gilbert の方法 C Proc.Katl . Acad.Sci . USA U_, 560-564 ( 1977) 〕 によ り決定した。 そ の s杲を第 2図 に示す。
O PI 1 こ の 1.8 Kb BcoRI 断片は大腸菌に挿入し ' 米国ァメ リ カ ン · タ イ ブ ♦ 力 ノレチ ヤ一 ·' コ レ ク シ ン に Escherichia col i CI 4 ATCC 31905 と して寄託されている。

Claims

- 請 求 の 範 囲
(1) ヒ ト染色体由来の ヒ ト イ ン タ ー フ ユ 口 ンー 遺伝子。
(2) ヒ ト染色体由来の ヒ ト イ ンタ — フ ュ ロ ン一 ?遠伝子および該遣 伝子の転写の調節に関与する D N Aを含む D N A e
(3) ヒ ト 染色体由来の ヒ ト イ ンタ ーフ ユ 口 ンー 遺伝子および該遺 伝子の転写の調節に K与する D N Aを含む D N A とべク タ一 D N A との組換え体 D N A。
(4) 該ベク タ ー D N Aが大腸菌由来の ス フ ァ ージ， Charon系フ ァ ー ジ， プラ ス ミ ド ρΒβ 322, PCR 1 , ρΜΒ 9 および pSC 1 から選ばれ る特許請求の範囲第 3 項記載の組換え体 D N A。
_ O PI
、υ ο ^
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