UA80111C2 - Pharmaceutically acceptable phosphate-glycerol carrying bodies (variants) - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід стосується тривимірних синтетичних і напівсинтетичних композицій, що мають біологічну активність, 2 іх застосування у лікуванні і/або профілактиці різних захворювань у ссавців. Зокрема, винахід стосується препаратів і областей застосування синтетичних і напівсинтетичних тіл, які після введення у тіло пацієнта забезпечують сприятливі протизапальні, органозахисні і імунорегуляторні ефекти. Винахід також стосується способів лікування і композицій для полегшення запальних і аутоїмунних захворювань і їх симптомів.

Професійні антиген-представляючі клітини (АРСз5), включаючи дендритні клітини (ОС) і макрофаги (Мр), 70 активно захоплюють і перетравлюють антигени (Адз), уламки клітин і видаляють інфекційні організми і вмираючі клітини, включаючи залишки вмираючих клітин. Під час цього процесу АРСз можуть стимулювати вироблення домінованих відповідей прозапальних цитокінів ТИ! (11-12, 1-1, ІМЕ-Г, ТМЕ-А і т.д.) або регуляторних цитокінів ТИ2/ТАЗ (таких як 1-10, ТОР-В, 1/-4 і т.д.); у залежності від природи антигена (Ад) або фагоцитозного матеріалу і рівня зрілості/активації АРС. 12 АРС видаляють уламки клітин, частина з яких утворені з клітинних мембран власного організму, частина - з клітин бактеріальних і паразитичних інфекцій і симбіотичних організмів, таких як кишкові бактерії. Тоді як деякі з цих клітинних уламків ініціюють прозапальну відповідь, інші ініціюють захисну і протизапальну відповідь.

Нормально функціонуюча імунна система здатна розрізняти антигени чужорідних впроваджених організмів (не свої), і антигени "своїх тканин або уламків, розвиваючи імунну відповідь тільки проти чужорідних антигенів. Коли імунна система пацієнта перестає розрізняти "свої" і "не свої" антигени, починається аутоїмунне захворювання.

МУО-А-90/11781 описує використання ліпосом як носіїв лікарської речовини для місцевого лікування ран, порізів та садин, наприклад, рогівки або глазної поверхні (реферат).

М/О-А-95/23592 описує використання одношарових ліпосом, що мають середній діаметр у діапазоні від с -400нм до 15Онм та які не зв'язані з діючою речовиною, для переміщення холестеролу з атеросклеротичних Ге) бляшек для лікування атеросклерозу, (стор.б, рядки 6-11).

О5-А-5262405 описує використання фосфоліпідів певного стану для лікування непрохідності дихальних шляхів пацієнта. Звідсі випливає, що принцип дії базується на ефекті взаємодії великого обсягу між фосфоліпідами та слизової для зниження адгезивних властивостей слизової (колонка 4, рядки 47-50). -

Даний винахід визначений в кінці у прикладеній формулі винаходу. «-

Винахід стосується відкриття того факту, що фармацевтично прийнятні тіла, такі як ліпосоми, кульки або подібні частинки, які включають фосфатно-гліцеринові групи, після ведення пацієнту-ссавцю викликають -- протизапальний ефект і тому можуть бути застосовані для лікування ряду захворювань. Ці тіла також можуть Га») включати у якості неосновного компонента неактивну складову і/або складову, що виявляє активність шляхом

Іншого механізму. со

В одному варіанті здійснення винахід стосується композиції, здатної виробляти протизапальну відповідь іп мімо у ссавців, при цьому згадана композиція включає фармацевтично прийнятні тіла розміром від 7520 нанометрів (нм) до 500 мікрометрів (мкм), які містять множину фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть « перетворюватися на такі групи. Переважно, ці тіла по суті не містять неліпідних фармацевтично активних З компонентів. Переважно, фосфатно-гліцеринові групи складають 6095-10095 активних груп цих тіл. За с припущенням, після введення ссавцеві ці тіла через фосфатно-гліцеринові групи взаємодіють з імунною з» системою. В результаті після такого введення виробляється протизапальна відповідь.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується тривимірних синтетичних або напівсинтетичних тіл, що також називаються тут фармацевтично прийнятними тілами, які мають розмір у діапазоні від 2онм до 50Омкм і модифіковані таким чином, що вони містять у якості основного компонента щонайменше один протизапальний бо промоторний ліганд, при цьому згаданий ліганд включає фосфатно-гліцеринові групи. ав | В наступному варіанті здійснення винахід стосується тривимірних синтетичних або напівсинтетичних тіл, що також називаються тут фармацевтично прийнятними тілами, які мають розмір у діапазоні від 2онм до 50Омкм і - містять фосфатно-гліцеринові групи на своїй поверхні. -к 70 Винахід полегшує спосіб лікування захворювання, опосередненого функцією Т-клітин, який включає введення пацієнту-ссавцю ефективної кількості фармацевтично прийнятних тіл, що несуть ефективну кількість та фосфатно-гліцеринових груп, для інгібування і/або вповільнення прогресування захворювання, опосередненого функцією Т-клітин.

Винахід також полегшує спосіб лікування запального захворювання, який включає введення пацієнту 29 ефективної кількості фармацевтично прийнятних тіл, що несуть ефективну кількість фосфатно-гліцеринових

ГФ) груп, для інгібування і/або вповільнення прогресування запального захворювання. юю Винахід також полегшує спосіб лікування розладу ендотеліальної функції який включає введення пацієнту-ссавцю ефективної кількості фармацевтично прийнятних тіл, що несуть ефективну кількість фосфатно-гліцеринових груп, для інгібування і/або вповільнення прогресування розладу ендотеліальної функції. 60 Також винахід полегшує спосіб лікування імунного захворювання, що відрізняється неадекватною екпресією цитокінів, який включає введення пацієнту-ссавцю ефективної кількості фармацевтично прийнятних тіл, що несуть ефективну кількість фосфатно-гліцеринових груп, для інгібування і/або вповільнення прогресування імунного захворювання.

Винахід також полегшує спосіб лікування або профілактики кардіологічного захворювання ссавців, наявність 62 якого або схильність до якого може бути визначена на основі видовженого інтервала ОТ-с на електрокардіограмі пацієнта, при цьому вказаний спосіб включає введення пацієнту-ссавцю, що страждає на таке захворювання або схильний до нього, фармацевтичної композиції, яка включає фармацевтично прийнятні біосумісні синтетичні або напівсинтетичні тіла, що також називаються тут фармацевтично прийнятними тілами, і фармацевтично прийнятний носій, при цьому щонайменше частина згаданих тіл мають розмір у діапазоні від «2Онм до 50Омкм, і при цьому поверхні згаданих тіл модифіковані таким чином, що вони містять у якості основного компонента щонайменше одну протизапальну промоторну груну, причому згадана група являє собою фосфатно-гліцеринову групу.

В іншому варіанті здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції в одиничній дозованій формі для /о введення пацієнту-ссавцю, яка включає фармацевтично прийнятні тіла і фармацевтично прийнятний носій, при цьому щонайменше частина згаданих тіл мають розмір у діапазоні від «20нм до 500мкм і при цьому поверхні згаданих тіл включають фосфатно-гліцеринові групи або групи, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, причому згадана одинична дозована форма містить від 500 до «2,5 х 109 тіл,

В наступному варіанті здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає 75 фармацевтично прийнятні біосумісні синтетичні або напівсинтетичні тіла (які також називаються тут фармацевтично прийнятними тілами) і фармацевтично прийнятний носій, при цьому щонайменше частина згаданих тіл мають розмір у діапазоні від «2Онм до 500мкм і при цьому поверхні згаданих тіл модифіковані таким чином, що вони містять у якості основного компонента щонайменше одну протизапальну промоторну груну, причому згадана група являє собою фосфатно-гліцеринову груну.

В наступному варіанті здійснення винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає фармацевтично прийнятні біосумісні синтетичні або напівсинтетичні тіла (які також називаються тут фармацевтично прийнятними тілами) і фармацевтично прийнятний носій, при цьому щонайменше частина згаданих тіл має розмір від «2Онм до 500мкм і включає кардіоліпін.

Тіла, описані вище, додатково можуть включати неактивну поверхневу груну і/або поверхневу груну, що суч

Виявляє активність шляхом іншого механізму, наприклад, фосфатидилсерин. |Див., наприклад, Радок еї аї.,

Міжнародна публікація УУО 01/667851. і9)

Винахід стосується ліофілізованих або висушених сублімацією фармацевтично прийнятних тіл, що несуть фосфатно-гліцеринові групи або групи, які можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, і комплектів, що включають ліофілізовані або висушені сублімацією фармацевтично прийнятні тіла, що містять «ч- фосфатно-гліцеринові групи або групи, які можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, і фармацевтично прийнятний носій. --

Винахід стосується способу лікування захворювання, опосередненого функцією Т-клітин, який включає «ч- введення пацієнту-ссавцю, що страждає на це захворювання або має підвищений риск захворювання, опосередненого функцією Т-клітин, ефективної кількості композиції, яка включає фармацевтично прийнятні тіла о розміром від «2Онм до «500мкм, які містять на своїй поверхні множину фосфатно-гліцеринових груп абогруп, що об можуть бути перетворені на згадані фосфатно-гліцеринові групи, так що після цього введення прогресування захворювання, опосередненого функцією Т-клітин, інгібується і/або вповільнюється.

Винахід стосується способу лікування розладу ендотеліальної функції який включає введення « пацієнту-ссавцю, що страждає на цей розлад або має підвищений риск розладу ендотеліальної функції, ефективної кількості композиції, що включає фармацевтично прийнятні тіла розміром від «2Онм до У5О0ОмМкм, які -щ-й с містять на своїй поверхні множину фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть бути перетворені на згадані ц фосфатно-гліцеринові групи, так що після цього введення прогресування розладу ендотеліальної функції "» інгібується і/або вповільнюється.

В наступному варіанті здійснення винахід стосується способу лікування імунного захворювання у пацієнта-ссавця, що страждає на це захворювання або має підвищений риск імунного захворювання, який (ее) включає введення згаданому пацієнту-ссавцю ефективної кількості композиції що включає фармацевтично прийнятні тіла розміром від «2Онм до «50Омкм, які містять на своїй поверхні множину фосфатно-гліцеринових о груп або груп, що можуть бути перетворені на згадані фосфатно-гліцеринові групи, так що після введення - прогресування імунного захворювання інгібується і/або вповільнюється.

З іншого боку, цей винахід також може розглядатися як застосування рецептора на клітинах імунної системи - ссавців, наприклад, макрофагах, який специфічно зв'язується з фосфатно-гліцериновою групою. Винахід - М стосується тіл, що включають ліганди і групи, які можуть зв'язуватися з таким рецептором і, в результаті, виробляти протизапальну відповідь. Відповідно, тіла за винаходом можуть бути визначені як тіла, що включають ліганди або їх активні групи, які конкурують зі зв'язуванням або поглинанням тіл, експресуючих фосфатно-гліцеринові групи, описаних тут, антиген-представляючими клітинами. Фахівець у відповідній технології легко може визначити, чи є конкретне тіло таким, що здатне конкурувати описаним чином, шляхом о проведення простих тестових досліджень. Наприклад, тіло може бути досліджене за допомогою легкодоступної ко моноцитарної клітинної лінії, такої як ШО37. У першому досліді клітини 0937 інкубують тільки з міченими флуоресцентною міткою ліпосомами РО, а в решті дослідів клітини 0937 інкубують у присутності мічених бо флуоресцентною міткою ліпосом РО і різних кількостей тестової сполуки. Якщо поглинання мічених флуоресцентною міткою ліпосом РО в решті дослідів знижується порівняно з першим дослідом, тоді тестову сполуку вважають такою, що конкурує за рецептор і входить в область цього винаходу.

Фіг.1 являє собою стовпчасту діаграму, яка представляє результати дослідів наведеного нижче Прикладу 1 з гіперчутливістю мишей (СН, модель гострого запального захворювання, опосередненого Т-клітинами) при 65 використанні ліпосом за переважним варіантом здійснення винаходу, порівняно з іншими ліпосомами і контрольними дослідами.

Фіг2 являє собою подібне графічне представлення, що показує використання ліпосом з різним вмістом фосфатидилгліцерину (РО) у моделі СН5 мишей, Приклад 2.

Фіг.3 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу 3, в якому були використані різні концентрації 7595 РО-ліпосом у моделі СНЗ мишей.

Фіг.А4 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу 4, в якому були використані різні концентрації 10095 РО-ліпосом у моделі СНЗ мишей.

Фіг5 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу 5, в якому були використані ліпосоми різних розмірів у моделі СН5. 70 Фіг.б6 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу б, в якому була використана модель гіперчутливості мишей уповільненого тину (ОН, модель хронічного запального захворювання, опосередненого Т-клітинами).

Фіг.7 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу 7, в якому були використані ліпосоми з кардіоліпіном у моделі ОНЗ мишей.

Фіг.8 являє собою подібне графічне представлення результатів Прикладу 8, в якому були використані ліпосоми з кардіоліпіном у моделі СНЗ мишей.

Фіг.9 показує процентну зміну спаду збуджуючого постсинаптичного потенціалу (ЕРБР) у контрольних і оброблених мишей, що є показником ефекту на довготривале потенціювання (І ТР), Приклад 9.

Фіг.10 представляє дані, показані на Фіг.9, у форматі стовпчастої діаграми, Приклад 9.

Фіг.11 показує різницю у концентрації протизапального цитокіну 1-4 у гіпокампі контрольних і оброблених тварин, Приклад 10.

Фіг.12 показує різницю у концентрації прозапального цитокіну ІЇ-ІВ у суспензії однорідних клітин селезінки контрольних і оброблених тварин, Приклад 11.

Фіг.13 показує різницю у концентрації ТМЕ-А у моноцитарній клітинній лінії 0937, обробленій різними с ов Концентраціями 7595 РО-ліпосом, Приклад 12.

Фіг.14 являє собою графічне представлення результатів Прикладу 13 - вміст ендотеліну-ї у вухах мишей, і) оброблених згідно з переважним варіантом здійснення винаходу, порівняно з контрольним дослідом.

Фіг.15 являє собою графічне представлення результатів Прикладу 14 -ІСАМ-1-позитивні клітини з культур

НОМЕС у присутності і у відсутність композицій за переважним варіантом здійснення винаходу. «- зо За винаходом, пацієнтам вводять фармацевтично прийнятні тіла, що несуть на своїй поверхні фосфатно-гліцеринові групи. Не вдаючись в теорію, можна припустити, що ці тіла взаємодіють з імунною (87 системою пацієнта із супроводжуючими сприятливими ефектами, такими як інгібування прозапальних цитокінівій о пе мімо і/або промотування протизапальних цитокінів. Клітинами, що вступають у реакції, можуть бути імунні клітини, такі як професійні або непрофесійні антиген-представляючі клітини, ендотеліальні клітини, о регуляторні клітини, наприклад, МК-Т-клітини та інші. со

Ці фармацевтично прийнятні тіла включають синтетичні і напівсинтетичні тіла, які мають різні форми, здебільшого, але не виключно, сфероїдальну, циліндричну, еліпсоїдальну форму, включаючи сплющену і довгасту сфероїдальну форму, змієподібну, ниркоподібну форму і т.д., і розміри від 720нм до «500мкм у діаметрі при вимірюванні переважно вздовж найдовшої осі тіла, і містять на своїй поверхні « фосфатно-гліцеринові групи. з с Фармацевтично прийнятні тіла містять на поверхні фосфатно-гліцеринові групи із заздалегідь заданими . характеристиками. Не вдаючись в теорію, можна припустити, що ці групи здатні взаємодіяти з відповідним и?» рецептором (рецепторами) (не тільки з Ре-рецептором) на антиген-представляючих клітинах іп мімо. Структура цих груп може бути змінена синтетичним шляхом і може включати всю, частину або модифікований варіант початкової фосфатно-гліцеринової групи. Наприклад, негативно заряджений кисень фосфатної групи

Го! фосфатно-гліцеринової групи може бути перетворений на фосфатно-ефірну груну (наприклад, І-ОР(ІОХОКХОК"), де Ї являє собою залишок о фосфатно-гліцеринової групи, К' являє собою -СН «СН(ОН)СНООН і К" являє собою алкіл з 1-4 атомів вуглецю - або гідроксизаміщений алкіл з 2-4 атомів вуглецю і 1-3 гідроксильних груп, за умови, що К" легше 5о Підролізується іп мімо, ніж група К; на дифосфатну груну, включаючи дифосфатні ефіри (наприклад, - Г-ОР(ФОХОКЗОР(ОХОК")», де І і К відповідають визначеним вище, а кожний К" незалежно від інших являє як собою водень, алкіл з 1-4 атомів вуглецю або гідроксизаміщений алкіл з 2-4 атомів вуглецю і 1-3 гідроксильних груп, за умови, що друга фосфатна група І-Р(ІОХХОК")2| легше гідролізується іп мімо, ніж група К; або на трифосфатну групу, включаючи трифосфатні ефіри (наприклад, Г-ОРІЮОХОК)ОР(ОХОКОР(ОХОК")», де | і

КЕ відповідають визначеним вище, а кожний К" незалежно від інших являє собою водень, алкіл з 1-4 атомів вуглецю або гідроксизаміщений алкіл з 2-4 атомів вуглецю і 1-3 гідроксильних груп, за умови, що друга і третя

Ф) фосфатні групи легше гідролізуються іп о омімо, ніж група ЕК; і топ. Такі синтетично змінені ка фосфатно-гліцеринові групи здатні експресувати фосфат-гліцерин іп мімо і, відповідно, такі змінені групи являють собою фосфатно-гліцеринові групи, здатні до перетворення. во Фосфатидилгліцерин є відомою сполукою. Він може бути отриманий, наприклад, шляхом обробки природної димерної форми фосфатидилгліцерину, кардіоліпіну, фосфоліпазою Ю. Він також може бути отриманий шляхом ферментативного синтезу з фосфатидилхоліну з використанням фосфоліпази О |див., наприклад, патент США 5,188,951 Тгетріау, еї аїЇ. Його хімічна структура включає фосфатно-гліцеринову групу і пару подібних, але різних ланцюгів жирних кислот С.в8-Сго. 65 Вираз "РО" тут означає фосфоліпіди, що несуть фосфатно-гліцеринову групу, з широким діапазоном ланцюгів щонайменше однієї жирної кислоти, за умови, що утворений РО-компонент може діяти як структурний компонент ліпосоми. Переважно, такі РОо-сполуки можуть бути представлені Формулою І: в і то й де БК і БК" незалежно один від одного вибирають з вуглеводневих ланцюгів С.4-Сод, насичених або ненасичених, прямих або таких, що містять обмежену кількість розгалужень, при цьому щонайменше один ланцюг містить від 10 до 24 атомів вуглецю. По суті, ліпідні ланцюги В і 2" утворюють структурний, а не активний 79 компонент ліпосом. Відповідно, ці ланцюги можуть варіюватися і включати один або два такі ліпідні ланцюги, однакові або різні, за умови, що вони виконують структурну функцію. Переважно, ліпідні ланцюги можуть мати від «10 до «24 атомів вуглецю у довжину, насичених, мононенасичених або поліненасичених, прямих або з обмеженою кількістю розгалужень. Лаурат (С12), мірістат (С14), пальмітат (С16), стеарат (С18), арахідат (С20), бегенат (С22) і лігноцерат (С24) є прикладами придатних насичених ліпідних ланцюгів для РО для застосування у цьому винаході. Пальмітолеат (С16), олеат (С18) є прикладами придатних мононенасичених ліпідних ланцюгів. Лінолеат (С18), ліноленат (С18) і арахідонат (С20) є прикладами придатних поліненасичених ліпідних ланцюгів для застосування у РО в ліпосомах за винаходом. Фосфоліпіди з одним таким ліпідним ланцюгом, також придатні у цьому винаході, відомі як лізофосфоліпіди. Винахід також стосується застосування ліпосом, у яких активним компонентом є димерна форма РО, а саме, кардіоліпін, проте інші димери Формули | с також придатні. Переважно, такі димери не є синтетично зшитими за допомогою синтетичного зшиваючого г) засобу, такого як малеїмід, а є зшитими за рахунок видалення гліцеринової ланки, як описано у Іеппідег,

Віоспетізігу, р. 525 (1970) і показано нижче на реакційній схемі:

Кк я - 7

ЩІ с ЇЙ ьл «в) її

РО г)

І -

Ї. банні кінні ий Санін Я ц А ;» шва і ! «ЕНрят : І ! (ее) («в) й - шу 70 сага йірів

КУ

-ь посьсконинОоН 25 де кожний з В і В незалежно один від одного мають значення, наведені вище.

Ге! Як зазначено вище і, знову-таки, без спроби створення будь-якої теорії, Ро-група і її димер здогадно являють собою ліганд, оскільки, очевидно, вона зв'язується із специфічною ділянкою білка або іншої молекули де (С РО-рецептора"), і, відповідно, ця молекула фосфатидилгліцерину (і її димерна форма) іноді згадується тут як "ліганд" або "зв'язуюча група". Таке зв'язування, очевидно, відбувається через фосфатно-гліцеринову груну бо -О-Р(ХОХХОН)-О-СНО-СН(ОН)-СНО-ОН, яка іноді згадується тут як "головна група", "активна група" або "зв'язуюча група". Згідно з цим, вирази "зв'язування", "зв'язуюча група" або "ліганд" тут не стосуються будь-якого механізму або принцину дії. Тим не менше, є принущення, що описані вище фосфатно-гліцеринові групи розташовані на зовнішніх поверхнях тіл за винаходом для взаємодії з компонентами імунної системи пацієнта. Слід зазначити, що ця взаємодія відрізняється від специфічної взаємодії апоптотичних клітин з б5 фосфатидилсериновим рецептором на антиген-представляючих клітинах.

Приклади "частин тривимірного тіла" або "фармацевтично прийнятних тіл" включають біосумісні синтетичні або напівсинтетичні структури, такі як ліпосоми, тверді кульки, порожнисті кульки, наповнені кульки, крупинки, гранули і мікросфери з біосумісних матеріалів, природних або синтетичних, що звичайно використовуються у фармацевтичній промисловості. Кульки можуть бути твердими або порожнистими, або наповненими біосумісним матеріалом. Вираз "біосумісні" стосується речовин, які у застосовуваних кількостях є або нетоксичними, або мають прийнятні профілі токсичності, так що їх застосування іп мімо є прийнятним.

Подібним чином, вираз "фармацевтично прийнятні" стосовно "фармацевтично прийнятних тіл", тут означає тіла, що включають один або більше матеріалів, що є фармацевтично прийнятними і придатними для доставки іп мімо.

Такі тіла можуть включати ліпосоми, утворені з ліпідів, одним з яких є РО. В альтернативі, фармацевтично 7/0 прийнятні тіла можуть являти собою тверді кульки, порожнисті кульки, наповнені кульки, крупинки, гранули і мікросфери з біосумісних матеріалів, що включають один або більше біосумісних матеріалів, таких як поліетиленгліколь, полі(метилметакрилат), полівінілпіролідон, полістирол і широкий діапазон інших природних, напівсинтетичних і синтетичних матеріалів, з прикріпленими до них фосфатно-гліцериновими групами.

Як зазначено вище, аналоги фосфатидилгліцерину з модифікованими активними групами, які також /5 взаємодіють з РоО-рецепторами на антиген-представляючих клітинах, через той же рецепторний шлях, що й РО, або іншим чином, з виробленням протизапальної реакції в організмі реципієнта, вважаються включеними у межі виразу "фосфатидилгліцерин". Цей вираз включає, без обмежень, сполуки, в яких одна або більше гідроксильних груп і/або фосфатних груп дериватизовані або знаходяться у формі солі. Багато таких сполук утворюють вільні гідроксильні групи іп мімо, відразу після введення або пізніше і, відповідно, включають

РоО-трупи, здатні до перетворення.

Переважними композиціями за винаходом є ліпосоми, що можуть складатися з різноманітних ліпідів. Проте, переважно, ні один з ліпідів не є позитивно зарядженим. У випадку ліпосом, фосфатидилгліцерин РО може складати майже весь або весь шар (шари) або стінку (стінки) ліпосоми, причому його фосфатно-гліцеринова група орієнтована назовні, для того щоб діяти у якості зв'язуючої групи, а ліпідний ланцюг або ланцюги сч утворюють структурну стінку.

Ліпосоми, або ліпідні везікули, являють собою закриті мішки, розміром у мікронному або субмікронному і) діапазоні, стінки (моношари або мультишари) яких включають придатні амфіфільні речовини. Звичайно вони містять водне середовище, хоча для цього винаходу внутрішній вміст не є важливим, і загалом неактивні.

Відповідно, у переважному варіанті здійснення, ліпосоми, а також інші фармацевтично прийнятні тіла, по суті «- зо Не містять неліпідних фармацевтично активних компонентів (наприклад, містять «190) і більш переважно, взагалі не містять неліпідних фармацевтично активних компонентів. Такі ліпосоми отримують і обробляютьтаким (7 чином, що активні групи знаходяться ззовні ліпосомного тіла. Таким чином, РО у ліпосомах переважного варіанту -" де здійснення винаходу служить як лігандом, так і структурним компонентом самої ліпосоми.

Таким чином, переважний варіант здійснення винаходу стосується ліпосомних тіл, які мають на своїх о зв поверхнях, або можуть бути оброблені або індуковані таким чином, щоб мати на своїх поверхнях одну або со більше фосфатно-гліцеринових груп, що діють як зв'язуючі групи. Фосфатидилгліцерин є переважним

РО-лігандом, і такі ліпіди повинні складати від 1095 до 10095 ліпосоми, а решту - неактивний компонент, наприклад, фосфатидилхолін РС, або компонент, що має інший механізм дії, наприклад, фосфатидилсерин Р, або їх суміші. Неактивні складові, такі як РС, є переважними. «

Щонайменше 109595 ваг. такої ліпосоми складається з РО, переважно щонайменше 5095, більш переважно від шщ с 60 до 10095 і найбільш переважно від 70 до 9095, при цьому в одному з найбільш переважних варіантів здійснення ліпосома містить 7595 ваг. РО. ;» Також можуть бути використані суміші РО-ліпосом з неактивними ліпосомами і/або з ліпосомами з фосфоліпідів, що мають інший механізм дії, за умови, що загальна кількість РО у суміші залишається вище Мінімуму 71095 і переважно вище 60905. о Що стосується неліпосомних тіл для застосування у винаході, то, як зазначено вище, вони включають біосумісні тверді або порожнисті кульки придатного розміру. Біосумісні неліпосомні синтетичні або о напівсинтетичні тіла можуть бути вибрані з поліетиленгліколю, полі(метилметакрилату), полівінілпіролідону, - полістиролу і широкого діапазону інших природних, напівсинтетичних і синтетичних матеріалів, з прикріпленими 5о до них фосфатно-гліцериновими групами. Такі матеріали включають полімери, що біорозкладаються, такі як - описані у |(Оипп, еї аіІ., патент США 4,938,763), що включений у цю заявку у вигляді посилання у всій його повноті. як Полімери, що біорозкладаються, описані в літературі і включають, наприклад, полімери з прямими ланцюгами, такі як полілактиди, полігліколіди, полікапролактони, поліангідриди, поліаміди, поліуретани, поліефіраміди, поліортоефіри, полідіоксанони, поліацеталі, полікеталі, полікарбонати, поліортокарбонати, дв Пполіфосфазени, полігідроксибутирати, полігідроксивалерати, поліалкіленоксалати, поліалкіленсукцинати, полі(яблучна кислота), полі(амінокислоти), полівінілпіролідон, поліетиленгліколь, полігідроксицелюлоза,

Ф) хітин, хітозан і їх сополімери, терполімери і комбінації. Інші полімери, що біорозкладаються, включають, ка наприклад, желатин, колаген і т.д.

Придатні речовини для дериватизації з метою прикріплення фосфоліпіду (фосфоліпідів) або його частин з бо групами або зв'язуючими групами, до тривимірних тіл, серійно винускаються, наприклад, компанією |Роїузсіепсез

Іпс., 400 Маїеу Коайд, УМагіпдіоп, РА 18976, або Зідта АЇагіспй Ріпе СНетісаІ5). Способи їх дериватизації відомі у хімічній технології. Окремі переважні приклади таких способів описані у Міжнародній патентній заявці

РСТ/САО2/01398 Мазодетп Ігеїіапа І ітпіед, що включена в цю заявку у вигляді посилання.

Винахід передбачає, що пацієнт може бути ссавцем, включаючи, але не тільки, людей і свійських тварин, б5 таких як корови, коні, свині, собаки, кішки і т.п.

Фосфоліпіди являють собою амфіфільні молекули (тобто, амфіфіли), що означає, що сполука включає молекули, які містять полярну водорозчинну груну, прикріплену до водонерозчинного вуглеводневого ланцюга.

Амфіфіли, що служать у якості шарів матриці, мають визначені полярні і аполярні області. Амфіфіли можуть включати, на додаток до РО за винаходом, інші природні ліпіди, що використовуються разом з фосфоліпідом, що несе активну груну, окремо або у суміші з іншим ліпідом. Амфіфіли що служать у якості шару (шарів) ліпосоми, можуть являти собою інертні, структуроутворюючі синтетичні сполуки, такі як поліоксиетилен-алкілефіри (прості), поліоксиетилен-алкілефіри (складні) і сахароза-діефіри.

Способи отримання ліпосом відповідного розміру відомі у науці і не утворюють частини цього винаходу.

Можна навести посилання на різні посібники і літературні статті з цього предмету, наприклад, оглядову статтю 7/0 ГМірозотез аз РНагтасеціїсаї Оозаде ГРогтз", Бу УеспегКе! Вагеппої2 і Овап 9. А. Спготтеїп, і літературні джерела, наведені тут, наприклад Мем, К.С. "Ірозотев: А Ргасіїса! Арргоасі", ІК. Ргезз аї Охіога Опімегейу

Ргезз (1990)|.

Діаметр ліпосоми, а також інших фармацевтично прийнятних тіл у переважному варіанті здійснення винаходу становить від «20нм до 7500мкм, більш переважно від 72О0нм до «100Онм, ще більш переважно від 75О0нм до 7/5. 790ОНМ, Ї найбільш переважно від у"8Онм до «120нм (переважно при вимірюванні вздовж найдовшої осі тіла). В одному з варіантів здійснення діаметр ліпосоми становить від бонм до 500мкм.

Фармацевтично прийнятні тіла можуть бути суспендовані у фармацевтично прийнятному носії, такому як стерильний фізіологічний розчин, стерильна вода, апірогенна вода, ізотонічний сольовий розчин і розчини, буферизовані фосфатом (наприклад, стерильні водні розчини, що містять фосфатний буфер), разом з іншими 2о нетоксичними біосумісними речовинами, що використовуються у фармацевтичних складах, такими як допоміжні фармацевтичні засоби, буфери, консерванти і т.п. Переважно, фармацевтично прийнятні тіла виготовляють у вигляді рідкої суспензії у стерильній біосумісній рідині, такій як буферизований сольовий розчин, і вводять пацієнту будь-яким придатним шляхом, який дає можливість їх взаємодії з одним або більше компонентами імунної системи, наприклад, внутрішньоартеріальним, внутрішньовенним або, найбільш переважно, сч ов ВНнутрішньом'язовим або підшкірним введенням.

Винахід передбачає, що фармацевтично прийнятні тіла можуть бути висушені сублімацією або ліофілізовані і) таким чином, щоб пізніше вони могли бути пересуспендовані для введення. Винахід також стосується комплекту частини, що включає ліофілізовані або висушені сублімацією тіла, що несуть зв'язуючі групи, і фармацевтично прийнятного носія, такого як стерильний фізіологічний розчин, стерильна вода, апірогенна вода, ізотонічний «- зо сольовий розчин і розчини, буферизовані фосфатом (наприклад, стерильні водні розчини, що містять фосфатний буфер), а також інших нетоксичних біосумісних речовин, що використовуються у фармацевтичних складах, таких 77 як допоміжні фармацевтичні засоби, буфери, консерванти і т.п. Також у склад можуть бути включені захисні «- засоби для сублімаційної сушки, відомі у фармацевтичній технології, наприклад, лактоза або сахароза.

Переважним способом введення фармацевтично прийнятних тіл пацієнту є ін'єкція, яку вводять щоденно, о декілька разів на тиждень, раз на тиждень або раз на місяць, протягом періоду від тижня до декількох місяців. со

Частота і тривалість лікувального курсу будуть змінюватися у залежності від особливостей конкретного пацієнта і конкретного стану, що лікується, його тяжкості і того, чи лікування є профілактичним, оздоровчим або цілющим. Планування і оптимізація лікування знайомі досвідченим лікарям. Внутрішньом'язова ін'єкція, особливо у сідничний м'яз, найбільш переважна. Один з окремих ін'єкційних курсів, щонайменше для деяких показань за « винаходом, являє собою ін'єкцію у сідничний м'яз відповідної кількості тіл у день 1, наступну ін'єкцію у день з с 2, наступну ін'єкцію у день 14, і потім "бустерні" ін'єкції через місячні інтервали, якщо це доречно. . За принущенням, у багатьох варіантах здійснення винаходу фармацевтично прийнятні тіла, що містять на и?» своїй поверхні РО-групи у якості зв'язуючих груп, діють як модифікатори імунної системи пацієнта, на зразок дії вакцини. Відповідно, їх застосовують у таких кількостях і такими способами введення, щоб забезпечити достатню локалізовану концентрацію тіл на ділянці введення. Кількості таких тіл, придатні для модифікації

Го! імунної системи, можуть безпосередньо не корелювати з розміром тіла реципієнта і тому можуть помітно відрізнятися від доз лікарських засобів, що розроблені для забезпечення терапевтичних рівнів активних речовин о у кровообігу і тканинах пацієнта. Відповідно, дози лікарських засобів повинні бути набагато більші, ніж дози - модифікаторів імунної системи.

Кореляцію між вагою ліпосом і кількостями ліпосом досвідчений фахівець у ліпосомних композиціях може - визначити на основі тієї інформації, що двошарова везікула діаметром 10Онм містить 81230 ліпідних молекул на як 1 везікулу, розподілених приблизно 50:50 між шарами |див. Кіспага Наїтідап - 1992 Опімегейу ої ВпйізА

СоІштріа РИО Тпезіз "Ттапвтетбргапе рН агадіепів іп ІПрозотевз (птісгоїогт): агид-мевісіе іпіегасіопе і ргоїоп

Пих", рибіїзней ру Майопа! (ібгагу ої Сапада, ОНЧаужша, Сапада (1993); МОпімегейу Місгоїйтв огдег по.

ОМІО0406756; Сападіапа по. 942042220, ІБВМ 0315796936). Звідси можна розрахувати, наприклад, що доза

ЗХ108 везікул (порядок дози, що використовується іп мімо в окремих прикладах, наведених нижче) еквівалентна о 4,06х1073 ліпідних молекул. Використовуючи число Авогадро для кількості молекул ліпідів у грам-молекулі о (моль), 6,023х1023, можна визначити, що це становить 6,74хХ1077! моль, що при молекулярній масі РО 729 складає приблизно 3,83х10 8 г, або 38,Знг РО для такої дози. 60 Кількості фармацевтично прийнятних тіл, що мають бути введені, будуть варіюватися у залежності від природи захворювання ссавця, що підлягає лікуванню, і від природи і особливостей пацієнта. Переважно, ефективна кількість фармацевтично прийнятних тіл є нетоксичною для пацієнта, і не настільки велика, щоб зашкодити імунній системі. При використанні внутрішньоартеріального, внутрішньовенного, підшкірного або внутрішньом'язового введення стерильної водної суспензії фармацевтично прийнятних тіл переважним є бо введення, на кожну дозу, від 70,1 до 50мл рідини, яка містить кількість тіл, загалом еквівалентну 1095-100090 кількості лейкоцитів, що звичайно міститься в еквівалентному об'ємі суцільної крові. Переважно, кількість тіл, що вводиться за одну доставку пацієнтові-людині, становить від 500 до -2,5Х10 9 («25Онг тіл у випадку ліпосоми і пропорціонально різниці у щільності для інших варіантів тіл), більш переважно від 1000 до 71500000000, ще більш переважно від 10000 до "50000000 і найбільш переважно від 7200000 до «2000000.

Оскільки фармацевтично прийнятні тіла у способі за винаходом діють як модифікатори імунної системи, подібно до вакцини, кількість таких тіл, що вводиться на ділянці ін'єкції за кожне введення, може являти собою більш значуще кількісне визначення, ніж кількість або вага тіл на одиницю ваги тіла пацієнта. З тієї ж причини, можна принустити, що ефективні кількості або числа тіл, використані для малої тварини, можуть не 70 переводитися безпосередньо за ваговим співвідношенням у ефективні кількості для більших ссавців (тобто, більше 5кг).

Цей винахід придатний для застосування у профілактиці і/або лікуванні широкого діапазону захворювань ссавців, у яких задіяні функція Т-клітин, запалення, ендотеліальна дисфункція і невідповідна експресія цитокінів. Для лікування може бути вибраний пацієнт, що страждає на таке захворювання або схильний до нього. 75 Вираз "лікування" означає зниження симптомів, наприклад, але не тільки, зниження тяжкості або кількості симптомів конкретного захворювання або обмеження подальшого прогресування симптомів.

Що стосується розладів функції Т-клітин (захворювань, опосереднених Т-клітинами), ці розлади включають усі і будь-які захворювання, опосереднені щонайменше частково Т-клітинами, і включають, наприклад, виразки, рани і аутоімунні захворювання, в тому числі, але не тільки, діабет, склеродермію, псоріаз і ревматоїдний артрит.

Винахід придатний для застосування при запальних алергічних реакціях, реакціях при трансплантаціях органів і клітин і мікробних інфекціях, що викликають запальні реакції. Винахід також придатний для застосування у профілактиці проти окислювального стресу і/або ішемічного реперфузійного ураження, прийняття отрут, дії токсичних хімікатів, радіаційного пошкодження і дії подразнюючих речовин, що передаються повітрям або водою, наприклад, таких, що викликають запалення. Винахід також придатний для застосування при с запальних, алергічних і опосереднених Т-клітинами захворюваннях внутрішніх органів, таких як нирки, печінка, серце і т.д. і9)

Що стосується захворювань, які включають невідповідну експресію цитокінів, для яких цей винахід є придатним, вони включають усі і будь-які захворювання, в яких задіяна невідповідна експресія цитокінів, наприклад, нейродегенеративні захворювання. Нейродегенеративні захворювання, включаючи синдром Дауна, «- хворобу Альцгеймера і хворобу Паркінсона, пов'язані з підвищеними рівнями певних цитокінів, включаючи інтерлейкін-1В (1-18) (див. Сгійіп МУЗТ еї аїЇ. (1989); Моді М. еї аї. (1996)). Також було показано, що 1-18 -- інгібує довготривале потенціювання у гіпокампі |Мигтгау, С. А. еї аї. (1998)). Довготривале потенціювання у «ч- гіпокампі являє собою певну форму синаптичної пластичності і звичайно розглядається як придатна модель пам'яті і навчання |Віїв5, Т. М. Р. еї аї. (1993)). Таким чином, невідповідна експресія цитокінів у мозку на о цей час вважається задіяною у розвитку і прогресуванні нейродегенеративних захворювань і нейрозапальних с захворювань.

Таким чином, винахід є придатним для лікування і профілактики широкого діапазону нейродегенеративних та інших неврологічних захворювань ссавців, включаючи синдром Дауна, хворобу Альцгеймера, хворобу «

Паркінсона, сенільну деменцію, депресію, хворобу Хантінггона, периферичні невропатії, синдром

Джуліана-Барра, хвороби спинного мозку, невропатичні захворювання суглобів, хронічне запальне демієлінуюче с захворювання, невропатії, включаючи мононевропатію, поліневропатію, симетричну дистальну сенсорну ц невропатію, захворювання нервово-м'язових синапсів, міастенії і аміотрофічний латеральний склероз (АЛЛО). "» Лікування і профілактика цих нейродегенеративних захворювань являє собою особливо переважний варіант здійснення винаходу, при цьому лікування хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона і АЛС є найбільш переважним. (ее) Що стосується захворювань, що включають ендотеліальну дисфункцію, винахід є придатним для лікування і профілактики широкого діапазону таких захворювань ссавців, включаючи усі і будь-які захворювання, о опосереднені щонайменше частково ендотеліальною дисфункцією, наприклад, кардіоваскулярні захворювання, - такі як атеросклероз, периферичне артеріальне захворювання або оклюзійне ураження артерій, застійна серцева недостатність, цереброваскулярне захворювання (інсульт), інфаркт міокарда, стенокардія, гіпертонія і - т.д., вазоспастичні захворювання, такі як хвороба Рейно, серцевий синдром Х, мігрень і т.д., а також - М пошкодження в результаті ішемії (ішемічне ураження або ішемічне реперфузійне ураження). Загалом, це може бути по суті будь-яке захворювання, патологія якого включає невідповідно функціонуючий ендотелій.

Інші показання для композицій і способів за винаходом включають введення пацієнтам з метою прискорення загоєння ран і виразок, а також введення пацієнтам перед хірургічними операціями для прискорення швидкості їх відновлення після операцій, включаючи швидкість загоєння хірургічних ран і швів.

Ф, Що стосується "сердечних захворювань", цей винахід є придатним для лікування і профілактики широкого ко діапазону таких захворювань ссавців, включаючи усі і будь-які захворювання, пов'язані із серцем, наприклад, аритмії шлуночків (тахікардія або фібриляція шлуночків) і раптова смерть від серцевого захворювання. бо Схильність пацієнтів до серцевих захворювань, таких як аритмії і раптова смерть від серцевого захворювання, часто може бути визначена за подовженими інтервалами ОТ-с у ритмі серцебиття. Введення композицій за переважними варіантами здійснення винаходу повинно зменшити інтервали ОТ-с у пацієнтів-ссавців, що буде показником зниження схильності до аритмії і раптової смерті від серцевого захворювання.

Далі винахід описаний, з ілюстративною метою, за допомогою необмежуючих прикладів. 65 Приклади

У наведених далі прикладах скорочення мають значення, визначені нижче. Якщо скорочення не визначене, то воно має загальноприйняте значення. мкг - мікрограм мкл - мікролітр

МКМ - мікромолярний

СНнЗ - контактна гіперчутливість см - сантиметр

ОМ5О - диметилсульфоксид

ОМЕВ - 2,4-динітрофторбензол 70 рнз - гіперчутливість уповільненого тину

ЕЮН - етанол ге грам год. - година

НІ - Герц в.м. - внутрішньом'язово і.п. - інтраперитонеально кг - кілограм

І РЗ - ліпополісахарид

Г ТР - довготривале потенціювання мг - міліграм хв. - хвилина мл - мілілітр

ММ - мілімолярний мес - мілісекунда сч нг - нанограм щі нм - нанометр і)

НМ - наномолярний

РВ5 - сольовий розчин, буферизований фосфатом

ПЛР - полімеразна ланцюгова реакція «- зо РОРЗ - 1-пальмітоїл-2-олеоїл-зп-гліцеро-3-І(фосфо-1| -серині, тут має назву Р5

РОРО - 1-пальмітоїл-2-олеоїл-зп-гліцеро-3-Іфосфо-рац-(І -гліцерин)|), тут має назву РО --

РОРСО - 1-пальмітоїл-2-олеоїл-зп-гліцеро-3-фосфохолін, тут має назву РС об/хв.- обертів на хвилину «- с - секунда

Якщо не вказане інше, точна форма ліпідів, використовуваних у дослідах, являла собою РОРБ5, РОРО і о

РОРС, що визначені вище. со

Приклад 1

Ліпосоми середнього діаметру 100--20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і мали такий склад:

Група А-100965 Р5 «

Група В-10095 РО 8 с Група С - контрольна, без ліпосом. ц Загальну суспензію кожної ліпосомної композиції, що містила 4,8 х 1077 ліпосом/мл, розбавили РВЗ з -» отриманням ін'єкційної суспензії, що містила б х 10 9 часток/мл. Ліпосомні суспензії використовували для ін'єкцій самицям мишей ВАЇ В/с (даскгоп І арогайюгіез) віком 6-8 тижнів і вагою 19-23г, для визначення ефекту на розпухання вух в моделі контактної гіперчутливості (СН5) мишей. Модель СНО тестували на (ее) Тп1-опосереднені запальні реакції. о Тварин розподіляли на три групи, по 5 тварин у кожній групі. Групи А і В отримували близько З х 105 вищеописаних ліпосом (тобто, 10095 РС і 10095 РО, відповідно), в об'ємі близько 5Омкл. Група С була -й контрольною групою, що не отримувала ліпосом. -л 20 Протокол

Виконували такі експерименти: -

Ф) іме) 60 б5 птн тестя йо ето дент їй ї н- х т є сет ; - пету ЖЕ ; - МЕбина ГЯйшоє (деки! дено |Денеа лденей ден ІДеНКЄ Гдеву, з | І се ! | | ово |. Е - тк | зай з ст сла п 7 сплю : ее ву фс їн гео т те я пита Перлкняа сет ; й й З одрденся У І 2 г, І СУ Й І. : : зеееноМВі» : чуровое: |, ; пдв. ; . | Кенія -Ш й .

Я сш Ді шо ЕЕ, М Ин КОМА ДАО КА у тя Зо ди и стю совет вими т отв тт УллюТИТНКАТ пяче поки я я - пон анкотиг я

У дні 1-6 мишам Груп А і В вводили ін'єкцію відповідного препарату ліпосом. Близько 300000 ліпосом вводили у 50-мкл об'ємі шляхом внутрішньом'язової (ІМ) ін'єкції, до загальної кількості за весь тестовий період близько 1800000 ліпосом. Мишам контрольної групи (Група С) не вводили ліпосом, але сенсибілізували, провокували і тестували таким же чином, що й Групи А і В, як описано нижче. ера ай ко- хі р шк сій я ке сів соня пиніні іній прі стіні опититтуннтрнй и Ддсі існнтт 4 бін нні бін птн обідній - їні інт ііі: таня Янь пе На пре р са ее й р овиичевде я ве нен ах СЕ ЕВ р ДЕ, Що Шк жі вай г

І - г Ц фан кон - й т : ти 7 й и опнйкряають У |! й з ! " : намзннянн | й 7 ввесь ЇЇ, Я ч- : Ж "-НІЗаЦі ; . ; ЩІ ацЦЕ Її : і - ШІ Я й вич в | ЕТ Б М сон к Ех ШУ щ Меч 1 Я ав) лав До и Клеван | Тейсеокеє | Теибсшннянн | Тебе Бен 7 рення | Бреектть ен зя КВТ 0б56 | бек; | ТСЕКЦі | Тек | ЛИ'Овіь: | Я | ПРЕКЩЯ, ВИМРЕУЄЇ с : Щ Її док І Е Ч ча т : : . Мізаця ! ї Ч жая: 1 ; ше ДІ т0 Сенсибілізація 8 с У день 1, після ліпосомної ін'єкції у цей день, мишей анестезували 0,2мл розчину Б5мг/мл натрію "з пентобарбіталу шляхом і.п. ін'єкції. Абдомінальну шкіру миші обприскали 7095 ЕН і застосували лезо " . . - . . скальпеля для видалення ділянки волосся діаметром близько 1 дюйма з абдомену. Тоді на виголену ділянку нанесли 25мкл 0,595 2,4-динітрофторбензолу (ОМЕВ) у суміші 4:1 ацетонуюливкової олії з використанням піпетки.

Провокація бо Після ліпосомної ін'єкції у день б мишам робили провокаційну пробу ОМЕВ шляхом нанесення 1Омкл 0,290 ав | ОМЕВ на дорсальну поверхню правого вуха піпеткою і нанесення 1Омкл носія на ліве вухо піпеткою. з Результати

У день 7, через 24 години після провокації, кожну тварину анестезували галотаном і виміряли товщину вуха - о з використанням підпружиненого мікрометра Реасоск. Результати представили як різницю між товщиною щ обробленого ОМЕВ правого вуха і товщиною обробленого носієм лівого вуха. Експерименти повторювали тричі "7 на подібних тваринах. Збільшення розпухання вуха використовували як міру СНоЗ-відповіді. Значущість результатів визначали на основі подвійної вибірки Ї-тесту Ст'юдента. Величину Р «0,05 вважали значущою.

Результати представлені на Фіг.1, у вигляді стовпчастої діаграми, що показує середні величини розпухання 25 вух з трьох експериментів, у мкм.

ГФ) Фіг.1 показує, що за допомогою ін'єкції ліпосом за винаходом було досягнуто значне зниження розпухання кю вух. Зниження, досягнуте за допомогою 100906 Ро-ліпосом суттєво вище, ніж для 10095 Ре-ліпосом.

Приклад 2

Ліпосоми середнього діаметру 100-20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і 60 мали такий склад:

Група А-10095 РО

Група В - 7595 РО, 2595 РОС

Група С - 5095 РО, 5095 РС

Група О - 2595 РО, 75965 РС бо Група Е - тільки РВ5

Група Е - без ін'єкцій

Загальну суспензію кожної ліпосомної композиції, що містила 4,8 х 1077 ліпосом/мл, розбавили РВ5 з отриманням ін'єкційної суспензії, що містила 12 х 106 ліпосом /мл. Ліпосомні суспензії використовували для ін'єкцій мишам для визначення ефекту на розпухання вух у моделі СНЗ мишей, біологічній системі, корисній для дослідження ТП1-опосереднених запальних реакцій. Для цих експериментів використовували самиць мишей

ВАЇ В/с (дасКвгоп І арогайгіез) віком 6-8 тижнів і вагою 19-23Гг.

Тварин розподілили на 6 груп (Групи А-Е, описані вище) по 10 тварин у кожній групі. Також у дослідження включили контрольні групи, що не отримували ін'єкцій (Група Е) або отримували ін'єкції РВ5 без ліпосом (Група 70. Е). Тваринам Груп А-О вводили ін'єкції ХОмкл вищеописаних ліпосомних суспензій, кожна з яких містила близько 6 х 105 ліпосом.

Протокол

Тест включав сенсибілізацію (Зепв) речовиною, що потенційно викликає запалення, ін'єкції ліпосом (Іпі) тестовим тваринам або РВ5 контрольним тваринам і провокацію (Спа!) речовиною, що потенційно викликає 75 запалення, з наступним вимірюванням вух (Меавз) для визначення того, чи є ін'єкція ліпосом ефективною проти розвитку запалення, викликаного провокацією.

Виконували такі експерименти:

Груна |Ліпосоме | Деме 7 | Дене-?. День Я День; | Денв5 | Деввб | День? ( 201 Тк Ч. І І і ! | її;

І! у йеРО барви і |) ої 1 ба) Ме 1/9

Ї щі | ! | І Щі | ! , ЦИ ТО, : ке Ї і

Ї вот ее уст НЕО Я Кс НН етики неви ен як на ЕК ет ств скиту зсуви: ПИЙ

ОВ рр бенн | Зб | Ж о) о у ба; Ме о

І Ж І : Й ї Ід) Ї і ! Ка | | 7 Шо з | | Ки шк І Що Що. й. 1. Й | З со

Ера евддвнс нквстасн НН: НЕ УТ Ж кн ств СВ як пеніс. пит Та ШЕ ТИВНЕ пис НЕ с УНН тової Ар, ЇЇ | І | Її « ! т більки: з З і; |!

Ки В. Е ; ; г, ! : Ї т ш ! Б МносВи. ! Її ; Ї Ї і 45. МК Її і ї п ша Мч РН ИН Да т -жк лик х клини лих тиви пи то спос т Зв, рт. со вв з нВс ев рій Зно ПО ресокні м пи п вл ЕЕ В яоістатя я я кт Й т со У дні 1-6 мишам вводили відповідні ліпосоми, як вказано вище. Ліпосоми вводили шляхом в.м. ін'єкції в

І ав | об'ємі 5Омкл, тобто, 600000 ліпосом на ін'єкцію, до загальної кількості за весь тестовий період близько з 3600000 ліпосом. Мишам контрольної групи не вводили ліпосом, але сенсибілізували, провокували і тестували таким же чином, що й інші групи мишей, як описано нижче. - 70 Сенсибілізація (Зепв) га У день 1, після ліпосомної ін'єкції у цей день, мишей анестезували 0,2мл розчину Б5мг/мл натрію фенобарбіталу шляхом і.п. ін'єкції. Абдомінальну шкіру миші обприскали 7095 ЕЮН і застосували скальпель для видалення ділянки волосся діаметром близько 1 дюйма з абдомену. Тоді на виголену ділянку нанесли 25мМкл 0,595 2,4-динітрофторбензолу (ОМЕВ) у суміші 41 ацетону:оливкової олії з використанням піпетки. 99 Провокація (Спаї)

ГФ) У день 6, після ліпосомної ін'єкції у цей день, мишам робили провокаційну пробу (Спа!) ОМЕВ таким чином: з 10мкл 0,296 ОМЕВ наносили піпеткою на дорсальну поверхню правого вуха, а 1Омкл носія наносили піпеткою на ліве вухо.

Результати 60 У день 7, через 24 години після провокації, кожну тварину анестезували галотаном і виміряли товщину вуха (Меаз) з використанням підпружиненого мікрометра Реасоск. Збільшення розпухання вуха використовували як міру СН5З-відповіді. Результати представили як різницю між товщиною обробленого правого вуха і товщиною обробленого носієм лівого вуха. Значущість результатів між двома групами визначали на основі подвійної вибірки і-тесту Стюдента. Величину Р «0,05 вважали значущою. бо Результати представлені графічно на Фіг.2, у вигляді стовпчастої діаграми, що показує розпухання вух у мкм. При побудові діаграми використовували середню величину з відповідних експериментів.

Фіг.2 показує, що за допомогою 100 і 7595 РО було досягнуте значне зниження розпухання вух, що свідчить про те, що обидві ці концентрації забезпенують захист проти розвитку запалення від контакту з алергенною

Вечовиною, ОМЕВ. 5095 ії 2595 РО-ліпосоми також показали зниження порівняно з обома контрольними дослідами, але різниця в цьому експерименті не досягла статистичної значущості.

Приклад З

Ліпосоми середнього діаметру 100-20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і мали склад 75956 РО, 25956 РОС. Загальну суспензію, що містила 4,8 х 1014. ліпосом/мл, використовували, як 70 описано вище, і розбавляли у РВ5 з отриманням ін'єкційної суспензії, що містила такі концентрації ліпосом:

Група й й ; о це тера і ція «ІН тя о со М на; роя и ко Її гру "Й. І : | І їн'єкцію і І

Ж | во. 4 ! : :

ЧО | 7596 РО, гою Да и а! в 250 ііннвтентвінаятіннх ї- ання нн ти винна: нс тт а ПН пи т нн

Кедр інв я НЕ те тин ПЕ ення 5 пе Ро ве т ВИ ЕЕ Є їв шля т Ре Е і

І Бай : ша

Е знатні ян Ко о Е зл яння лівих ЗК ї вия дповжвнях нт --2 т --- у че:

ТЕ "Беаліпосом. | | І 16; ес

Мишей ВАїІВ-С розподілили на шість груп (Групи А-Р), включаючи контрольну груну, яка не отримувала ліпосом, але отримувала ін'єкції бОмкл РВЗ (Група Р). Мишей сенсибілізували на боку, вводили вибрану дозу ліпосом, внутрішньом'язово у м'яз правого стегна, у той самий день, але після сенсибілізації (день 1) і у дні « 2, 3, 4, і 5. У день б мишам робили ін'єкцію і провокацію на вусі, як описано у Прикладі 1. Товщину вуха -о с вимірювали, як описано, через 24 години після провокації. й Результати (Фіг.3) показують значну різницю між контрольною групою (Група Е) і Групою С (12 х 108 "» ліпосом/мл), між контрольною групою і Групою О (12 х 107 ліпосом/мл), а також між контрольною групою і

Групою Е (12 х 109 ліпосом/мл). Між контрольною групою і Групами А або В (12 х 1071 і 12 х 109 ліпосом/мл,

Відповідно) була дуже мала різниця, що наводить на думку про існування оптимального діапазону концентрацій (ее) ліпосом, вище якого сприятливий ефект може знижуватися. В інших експериментах зниження ефекту також о спостерігалося при зменшенні концентрації ліпосом нижче 12 х 107 ліпосом/мл.

Приклад 4 - Ліпосоми складу 10095 РО із середнім розміром 100-20нм отримували за стандартними методиками. Чотири -л 20 групи з 10 мишей (Групи А-0) сенсибілізували, робили ін'єкції і провокації за методикою і графіком, описаними у Прикладі 3, з такими кількостями 10095 РО-ліпосом у 50мкл суспензії: ть Групад -6 х 107

Група В - 6 х 109

Група С - 6 х 109 52 Група О - 6 х 107

ГФ! Результати, разом з контрольним дослідом із РВЗ5 з Прикладу 4, представлені у формі стовпчастої діаграми на Фіг.4. Суттєве зниження розпухання вух, порівняно з контрольною групою, можна помітити для кожної тестової о групи, але різниця між різними групами дуже мала.

Приклад 5 бо Ліпосоми композиції 7590 РО, 25906 РОС із середнім розміром 50,100, 200 і 400нм отримували за стандартними методиками. Їх тестували у моделі СНЗ мишей, як описано у Прикладах З і 4, з використанням 6 х 10? ліпосом у

БОмкл суспензій на кожну ін'єкцію і з використанням методики і графіка "сенсибілізація-ін'єкція-провокація", описаних у Прикладі 3. Групи утворювали таким чином:

Група А - 50-нм ліпосоми бо Група В - 100-нм ліпосоми

Група С - 200-нм ліпосоми

Група 0 - 400-нм ліпосоми

Група Е - без ліпосом

Результати представлені на Фіг.5. Результати для Групи 0, з використанням ліпосом діаметром 40Онм, мало відрізнялися від контрольної групи (Групи Е), що показує можливість існування критичного діапазону розміру в цій моделі.

Приклад 6

Загальну суспензію 75956 РО-ліпосоми із середнім діаметром 100-2Онм, що містила 4,8 х 10 ліпосом/мл, 70 розбавили з отриманням ін'єкційної суспензії що містила 6 х 10 5 ліпосом/мл. Ліпосомну суспензію використовували для введення мишам для визначення ефекту на розпухання вух у моделі ОН5 мишей. Як і у

Прикладі 1, використовували самиць мишей ВАЇ В/с (даскзгоп І арогайогієв) віком 6-8 тижнів і вагою 19-23Гг.

Тварин розподілили на З групи по 10 тварин у кожній групі. Контрольна група (Група С) отримувала тільки ін'єкції РВ5. Тварини Груп А і В отримували ін'єкції ХОмкл суспензії, що містила 6 х 109 ліпосом.

Протокол

У дні 13-18 мишам вводили 7595 РО-ліпосоми, як вказано нижче. Ліпосоми вводили у 50-мкл об'ємі шляхом в.м. ін'єкції, тобто, 600000 ліпосом на ін'єкцію, до загальної кількості за весь тестовий період близько 3600000 ліпосом. Сенсибілізацію і провокацію проводили, як описано у Прикладі 2. в (Прововця сч о - зо - «-

Результати о

Результати графічно представлені на Фіг.б і показують, що 7595 РО ефективна у моделі ОНЗ на день 16,

Через 24 години після третьої ін'єкції, зробленої після другої провокації. (ее)

Приклад 7

Ліпосоми складу 10095 кардіоліпін (СІ) і з середнім діаметром 100-2О0нм отримували за стандартними методиками. їх використовували при дозі 6 х 107 ліпосом на 50-мкл ін'єкцію в моделі ОНЗ мишей, описаній у «

Прикладі 6. Дані, отримані для тварин, яким вводили ін'єкції Сі -ліпосом (Група А; 10 тварин) порівнювали з даними, отриманими для тварин, яким вводили тільки РВ5 (Група В; 10 тварин). Методики сенсибілізації, З с ін'єкцій і провокації відповідали описаним у Прикладі 2. Результати вимірювання товщини вух на день 19, через "» 24 год. після шостої ін'єкції, представлені на Фіг.7. Результати показали значне зниження розпухання вух в " тестовій групі з ін'єкціями СІ. (Група А).

Приклад 8

Ліпосоми середнього діаметру 100нм, що включали 10095 кардіоліпіну або 7595 кардіоліпіну і 2595 РОС, со отримували за стандартними методиками. Три групи (Групи А-С) з 10 мишей сенсибілізували у день 1. о Контрольна група отримувала ін'єкції РВЗ у дні 1, 2 і 6 (Група С). Інші дві групи отримували ін'єкції ліпосом: б х з 105 10095 кардіоліпіну (Група А) або 6 х 105 7595 кардіоліпіну (Група В), в об'ємі БОмкл, згідно з тим же графіком. Мишам робили провокацію у день 7 і вимірювали товщину вух, як описано у попередніх прикладах. - 70 Фіг.8 показує середні виміри у кожній групі. Обидві групи, що отримували Сі -ліпосоми, показали щк статистично знануще пригнічення СН5 порівняно з контрольною групою.

Приклад 9

Для дослідження клітинного і молекулярного механізмів когнитивної функції використовували тваринну модель довготривалого потенціювання (ІТР). ТР являє собою певну форму синаптичної пластичності, що 25 відбувається у гіпокампальному утворенні, яке вважають біологічним субстратом навчання і пам'яті |Віїв5 еї

ГФ) аі. Майте 361: 31-39 (1990)). Проводять електрофізіологічне дослідження ТР у щурів способами, добре юю відомими фахівцям. Тоді тварин вмертвляють для дослідження біохімічних змін у гіпокампальних тканинах.

Порівняння електрофізіологічних даних з біохімічними гіпокампальними змінами корисно для визначення того, як клітинні події, що лежать в основі ТР, можуть бути змінені у тварин, що страждають на захворювання або 60 розлади, пов'язані з нейрозапаленням, такі як старіння, стрес, хвороба Альцгеймера і бактеріальна інфекція.

Системне введення ліпополісахариду (І Р5), компонента клітинної стінки грам-негативних бактерій, провокує активацію імунної системи шляхом індукування збільшення прозапальних цитокінів, таких як ІІ -18. Як зазначено вище, одним з прикладів нейронного дефіциту, індукованого ГРЗ і 1/-18, є погіршення І ТР у гіпокампі.

Показником ТР є середній нахил понуляційного збуджуючого пост-синаптичного потенціалу (ерзр). Після бо тетанічної стимуляції нахил ерзр (95) різко підвищується, що показує підвищену синаптичну активність.

І Р5-індуковане інгібування І ТР знижує підвищення нахилу і/або викликає швидше повернення нахилу ерзр до базової лінії, що означає, що підвищена синаптична активність є короткочасною. Відповідні виміри нахилу ерзр (95) через певні часові інтервали після тетанічної стимуляції можуть бути використані для відображення пам'яті і її втрати після запального стимулу, а також запалення у гіпокампі мозку.

Ліпосоми середнього діаметру 100--20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і мали склад 7595 РО і 2595 РОС. Загальну суспензію ліпосом, що містила ч2,9 х 1074 ліпосом/мл, розбавили РВ5 з отриманням ін'єкційної суспензії, що містила «1,2 х 107 ліпосом/мл. її використовували для введення щурам з метою визначення ефекту на І Р5-індуковане погіршення І ТР. Для цих експериментів використовували самців 70 щурів М/ізіаг (Віокезоигсез Опії, Тгіпку СоПеде, Юибіїп) вагою близько ЗООг.

Тварин розподілили на чотири групи по 8 тварин у кожній групі для такої обробки:

Група А - сольовий розчин т контрольний дослід

Група В - сольовий розчин ї- РО

Група С - ІГРБ ж контрольний дослід

Група С-ІРБ - РО 150мкл кожного з вищеописаних препаратів вводили шляхом в.м. ін'єкції у дні 1, 13 і 14. ГрупиВіоЇ отримали загальну кількість 5400000 ліпосом (1800000 ліпосом в одній ін'єкції). Процедуру ІТР і процедуру препарування тканини проводили у день 0.

Процедура І ТР

Щурів анестезували шляхом і.п. ін'єкції уретану (1,5г/к). Щури отримували або І РБ5 (10Омкг/кг), або сольовий розчин інтраперитонеально. Через три години біполярний стимулюючий електрод і однополярний записуючий електрод розмістили у перфорантному путі і в клітинному тілі дорсальної області зубчатої звивини, відповідно. Завдавали тестових розрядів частотою 0,033 Н?і і відповіді записували за 1Охв. до і через 45Ххв. після високочастотної стимуляції (З серії стимулів проводили з З0-секундними інтервалами, 250 Н2 за 200Омс). Ге

Щурів вмертвили шляхом обезголовлювання. Гіпокамп, тетанізовані і нететанізовані зубчаті звивини, кору і о енторинальну кору препарували на льоду, розрізали на зразки і заморозили в мл розчину Кребса (композиція

Кребса в мМ: Масі 136, КСІ 2,54, КНоРО, 1,18, Ма5О,-7Н.О 1,18, МансСо» 16, глюкоза 10, СаСі» 1,13), що містив 1095 ЮМ5О.

Результати -

Результати представлені на Фіг.9. Діаграма показує різницю у збуджуючому постсинаптичному потенціалі «- (ерзр), записаному у клітинних тілах лаброцитів. Дані являють собою середні величини 7-8 спостережень у кожній групі обробки і представлені у вигляді середньої процентної зміни нахилу ерзр кожні Збс, - нормалізованої по відношенню до середньої величини за 5 хвилин до тетанічної стимуляції. о

Фіг.9 показує, що І РоЗ-індуковане інгібування І ТР у синапсах перфорантного путі-лаброцитів було пригнічене шляхом передобробки РОз-ліпосомами. Чорні трикутники представляють Групу А (сольовий розчин ж (ее) контрольний дослід), білі трикутники представляють Групу В (сольовий розчин ж- РО), чорні квадратики представляють Груну С (І РБ5 ж контрольний дослід) і білі квадратики представляють Груну О(ІРЗ Ро).

Фіг.10 представляє аналіз середніх величин через 40-45 хвилин після тетанічної стимуляції, який показує, « що популяційний ерзр-нахил знизився у контрольній-І Р5 групі (білі стовпці) Її що РО ліпосоми (заштриховані стовпці) суттєво змінили цей ефект у зворотному напрямку ("р«0,01). Як показник функціональності пам'яті і - с навчання, покращення в уповільненні ТР, продемонстроване у цьому Прикладі, означає придатність такого ч лікування у випадку деменцій, наприклад, хвороби Альцгеймера і погіршення пам'яті. є» Приклад 10

І -4 є одним з декількох цитокінів, що виробляються підкласом Тй2 лімфоцитів і відомі своїми протизапальними ефектами. Фіг.11 показує, що концентрація ІІ -4 в гіпокампі суттєво підвищилася у І Ро-групі, (ее) передобробленій РО-ліпосомами ("р«0,05). Білі стовпці представляють контрольну груну (Група Е), а о заштриховані стовпці представляють Ро-оброблену груну (Група Р). ІІ -4 вимірювали шляхом ЕГ ІЗА і результати представили у пг (пікаграмах) ІІ-4/мг загального білка. Така апрегуляція протизапального цитокіну 1-4 у -й мозку є показником можливості застосування способу і композиції за переважним варіантом здійснення винаходу щу 90 у лікуванні широкого діапазону нейрозапальних захворювань, включаючи хворобу Паркінсона, АЛС, хронічне запальне демієлінуюче захворювання СІРО і синдром Джуліана-Барра. - Приклад 11

І-18 є одним з декількох цитокінів, що виробляються підкласом ТИ1 лімфоцитів і відомі своїми прозапальними ефектами. Селезінки тварин, оброблених як описано у Прикладі 9, групи С і 0, витягли і зібрали клітини селезінки. їх препарували таким чином: о Фіг.12 показує, що концентрація І./-1В8 у клітинах селезінки була суттєво знижена у І Р5-групі, що була передоброблена РО-ліпосомами ("р«0,05). І -18 вимірювали шляхом ЕГІЗА і представили у пг 1І/-18/МГ іме) загального білка. Це показує системний протизапальний ефект способу і композицій за переважним варіантом здійснення винаходу. бо Приклад 12

ШЦ937 являє собою лейкозну моноцитарну клітинну лінію, що може бути диференційована у макрофаги шляхом застосування форболових ефірів. Обробка ліпополісахаридом (І Р5), компонентом клітинної стінки грам-негативних бактерій, стимулює запальну відповідь у клітинах ШО937, з апрегуляцією експресії ряду запальних молекул, включаючи ТМЕо. Ця модель являє собою експериментальну систему для оцінки 65 протизапальних терапій. Макрофаги можна вирощувати у середовищі культури у присутності протизапальної композиції, що досліджується, при цьому може бути виміряна експресія ТМЕсо.

Ліпосоми середнього діаметру 100--20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і мали склад 7595 фосфатидилгліцерину (РО) і 2595 фосфатидилхоліну (РОС). Загальна концентрація ліпосом складала «40мММ ліпідів і була розбавлена до таких кінцевих концентрацій для аналізу: 100мкМ фосфатидилгліцерину (РО) 40мМкМ РО 10мМкМ РО 4,0МкМ РО 1мМмкМ РО 70 Клітини ШУО37 культивували шляхом вирощування у середовищі КРМІ (С5ІВСО ВК), доповненому 1090 ембріональної бичачої сироватки (ЕВ) і 195 пеніциліну/стрептоміцину, і вирощували при 372С у атмосфері, що містила 595 СО». 5 х 10 клітин засіяли у чарунки б-ч-арункових пластин і викликали диференціацію у макрофаги шляхом обробки 150нм форболу міристату ацетату (РМА) протягом 2-3 днів. Клітинне середовище замінили повним середовищем, після того як клітини ШОЗ7 диференціювали у макрофаги. Тоді клітини інкубували ще 75 24год. для мінімізації плеотропних ефектів внаслідок обробки РМА.

Потім клітини інкубували з такими сполуками:

Група А Сольовий розчин, буферизований фосфатом (РВ5) - негативний контрольний дослід,

Група В 1Онг/мл І Р - позитивний контрольний дослід,

Група С 1Онг/мл ГР - 100мкМ РО,

Група О 1Онг/мл ГРБ5 - 40мкМ РО,

Група Е ТІОнг/мл РБ - 10мкМ РО,

Група Е 1Онг/мл І Р я 4,0мкМ РО, або

Група ОС 1Онг/мл І Р ї- 1МмкМ РО.

Клітини інкубували, як описано вище, при 372 у 590 СО». Через 18год. супернатанти з кожної групи обробки су зібрали і проаналізували на ТМЕ-5 з використанням стандартного аналітичного комплекту ОпапіїКіпе о

Епгуте-і іпкей Іттипозогрепі Аззау (ЕГІЗА) (КО зувіетв, Міппеароїїв, ОБА).

Результати

Фіг.13 показує кількість виробленого ТМЕ-А у РО на мл. Ці результати демонструють, що и937-диференційовані макрофаги експресують дуже низькі рівні ТМЕ-5 у нормальних умовах. Проте після - обробки /Р5 вони секретують великі кількості ТМЕ-5 в оточуюче середовище, що є показником клітинного «- стресу. Інкубація клітин РО-ліпосомами інгібує секрецію ТМЕ- 5 дозозалежним чином, при цьому найвища концентрація 100мкМ забезпенує 98905 зниження, і навіть найнижча концентрація їмкМ викликає 5895 зниження - експресії ТМЕ-о. о

Приклад 13 3о Для визначення ефекту РО-ліпосом за переважним варіантом винаходу на ендотеліальну функцію, со визначали вміст ендотеліну-ї (ЕТ-1) у вухах мишей, що приймали участь у СНЗ-дослідженнях, описаних у

Прикладі 3. Ендотелій-ї являє собою потужний судинозвужуючий засіб, виявляє інотропну і мітогенну дію, модулює сольовий і водний гомеостаз і відіграє важливу роль у підтриманні тонусу судин і кров'яного тиску. «

Різноманітні свідчення підтверджують, що ендогенний ЕТ-1 може приймати участь у патофізіології станів, З пов'язаних з уповільненим звуженням судин, таким як серцева недостатність. При серцевій недостатності с спостерігаються підвищені рівні циркулюючих ЕТ-1 і рБід-ЕТ-1 |Сіаппеззі Ю, Оє! Ку 5, Міаіе КІ. "Тпе гоЇе ої

Із» епдоїпеїїпз апа (Неїг гесеріоге іп Неагі Тайиге" РПаптасо! Кез 2001 Ре 43: 2 111-26)ї. Таким чином, ЕТ-1 є маркером ендотеліальної функції, а підвищене вироблення ЕТ-1 у тканині є показником погіршення ендотеліальної функції.

Для визначення експресії ЕТ-1 вуха мишей (праве провоковане вухо) збирали через 24год. після провокації у бо СНз-експериментах. Вуха брали у мишей, що отримували в.м. ін'єкції РВ5 протягом 6 днів (Група А) і мишей, що ав! отримували в.м. ін'єкції ліпосом 75956 РО/2595 РОС (600000 ліпосом/ін'єкцію; Група В). Вуха зберігали у КМАЇаїег з при -202С до екстракції РНК. РНК екстрагували і генерували кДНК з використанням зворотної транскриптази (КТ) разом з ЕТ-1-специфічними праймерами, у якості внутрішнього контрольного досліду, а також провели ПЛР з - 70 використанням щрактин-специфічних праймерів. Продукти ПЛР відокремили на 1,595 гелі агарози і смуги ДНК - М підрахували шляхом денситометричного аналізу. Розрахували співвідношення ЕТ-1/В-актину.

Склад ПЛР:

ПЛР-суміш (ЕТ-1) ПЛР-суміш (В-актин) бмкл ПЛР-буфера (10х) бмкл ПЛР-буфера (10х) (Ф. 1,Бмкл. Масіг(БОММ) 1,5мкл. Масіг(5ОММ) ко їмкл аМТР (10ММ) їмкл аМТР (10ММ)

О,Бмкл праймера 1 (25мкМ) їмкл праймера 1 (10мкМ) во О,Бмкл праймера 2 (25мкМ) мкл праймера 2 (10мкМ)

О,2Бмкл ТАЙ О,2Бмкл ТАЙ 2,5мкл кКДдНК 2,5мкл кКДдНК

ЗВмкл води 37,75мкл води

Усього 5мкл Усього 5Омкл б5

Праймери: |Як описано вище - див., наприклад, Мапо, !; Низаїп, М; і Зіемжмат. 0. у. "Сопайопаї! сагаіас омегехргезвіоп ої епдоїпеїїп-1 іп (гапздепіс тісе", ЕАБЕВ У 15(53:А1138-А1138 Рагі 2, МАКВ 20011.

ЕТ-1 () 5-САС САС ТТС ТО Тест т Тоо-3

ЕТ-1 (ФД) 5-ССА ДОС АОС ТСС АСА дДАС дО-3!

Р-актин (Р) 5-СТО БОС СОС ТСТ АСО САС САА-3

Р-актин (г) 5-СТС ТТТ САТ ТС АСО САС САТ ТТО-3

Параметри ПЛР: 9420-5 хвилин 9490-30 с 602С-30с ЗО циклів 729060 -60с 7220-10 хвилин 420 - витримка

Після шести щоденних ін'єкцій 7595 РО-ліпосом рівень ЕТ-1 знизився на 3695 порівняно з контрольною групою 75 мишей, що отримували РВ5 у тому ж режимі ін'єкцій. Результати графічно представлені на Фіг.14. Це зниження означає сприятливий ефект ін'єкцій ліпосом за переважним варіантом здійснення винаходу на ендотеліальну функцію пацієнта-ссавця, за рахунок зниження Тп1-опосередненого запалення.

Приклад 14

Молекула міжклітинної адгезії-ї (ІСАМ-1) являє собою молекулу клітинної поверхні, яку експресують декілька типів клітин, включаючи лейкоцити і ендотеліальні клітини. Вона приймає участь в адгезії моноцитів до ендотеліальних клітин і виконує певну роль у запальних процесах і у системі імунного захисту, опосередненого Т-клітинами. Експресія ІСАМ-1, здогадно, приймає участь у клінічних виявах різноманітних захворювань, здебільшого шляхом перешкоджання нормальній імунній функції. Серед цих захворювань - злоякісні утворення (наприклад, меланома і лімфоми), багато запальних захворювань (наприклад, астма і с аутоіїмунні захворювання), атеросклероз, ішемія, деякі неврологічні захворювання і аллогенні трансплантації Ге) органів (Мап де БіоіІре А, мап дег 5ааод РТ, "ІпіегсеїІшаг адпевіоп тоіесціе-1" у). Мої. Мед. (1996) 74:1 13-33).

Людські ендотеліальні клітини пупкової вени (НОМЕСзв) є основною клітинною лінією ендотеліальних клітин, яку виділяють з нуповин таким чином.

Колби 775 підготували шляхом нанесення покриття 0,296 желатину (5-7 мл/колбу) протягом мінімум 15/20 - хвилин або протягом ночі. Залишок видалили. Пуповину обприскали перед процедурою 7095 етанолом і зрізали «- залишки плаценти, що були на нуповині. Тоді пуповину відрізали до приблизної довжини 5-6 дюймів. Пуповина містить дві артерії, що мають товсті стінки, і одну вену, що є більшою і має тонкі стінки. Знайшли вену і (57 вмістили в неї рифлений край пробки. Тоді використали близько 20см мотузки, щоб прив'язати пуповину до о пробки.

Зо Потім пуповину промили сольовим розчином, буферизованим фосфатом (РВ5), декілька разів, доки со промивальний РВ5 не став виглядати чистим. Після цього на пуповину вмістили 15-20мл розчину колагенази, завернули її в олов'яну фольгу і інкубували 15 хвилин при 372С. Після інкубації зав'язаний кінець пуповини відрізали і злили колагеназу в 50-мл пробірку. Тоді колагеназу знову пронустили через пуповину, нуповину « масажували для вивільнення ендотеліальних клітин і тоді через нуповину пронустили РВ5 і зібрали в ту саму пробірку, що містила розчин колагенази. її центрифугували при 16б00об/хв., супернатант видалили і краплю З с осадку пересуспендували у 10-12мл повного середовища М199. Потім середовище, що містило клітини, додали "з у желатинізовані колби. " Ліпосоми середнього діаметру 100-20нм були отримані за стандартними методиками, відомими у науці, і мали склад 7595 фосфатидилгліцерину (РО) і 2595 фосфатидилхоліну (РОС). Загальна концентрація ліпосом складала 40мМ і була розбавлена до 100мМкМ для проведення аналізу. бо Клітини НОМЕС розподілили по колбах для тканинної культури, дали прикріпитися до поверхні колб і тоді ав! обробили таким чином: з Група А - РВ5 - негативний контрольний дослід,

Група В - 50Онг/мл І Р - позитивний контрольний дослід, -к 70 Група С - 50Онг/мл І РЗ ї- 100МКМ РО щ Група 0 - 5О0Онг/мл І РБ5 ї- 100мкМ РОС 7" Клітини інкубували при 372С, 5956 СО». Через 18год. супернатанти кожної групи обробки зібрали і проаналізували на ЕТ-1 з використанням стандартного комплекту ЕГІЗА (від Аззау Оезідпв), а клітини зібрали для аналізу на ІСАМ-1 таким чином: 99 Клітини спочатку промили РВЗ і тоді інкубували з буфером клітинної дисоціації при 372С протягом 25-3О0хв.

ГФ) Клітини промили шляхом центрифугування і інкубували з анти-СО54 (ІСАМ-1) антитілом протягом ЗО хвилин. 7 Тоді додали вторинне РІТС-антитіло і інкубували з клітинами, як перед цим. Потім їх пересуспендували в їмл

РВЗ і проаналізували на флуоресценцію на проточному цитометрі.

Результати 60 Результати наведені на Фіг.15, що являє собою графічне представлення процентної кількості клітин, позитивно забарвлених у аналізі на ІСАМ-1 у відповідних культурах. Слід зазначити, що кількості клітин, позитивно забарвлених у культурі, яка містить РО-ліпосоми, знижені до рівня негативного контрольного досліду, і є набагато нижчими за рівень позитивного контрольного досліду.

Приклад 15 бо Мікрогліальні клітини (макрофаги мозку) культивували і вимірювали вироблення ними ТМЕ-о, запального цитокіну. Клітини стимулювали імуноглобуліном (Ід) пацієнтів, що страждають на АЛС, в результаті чого вироблення ТМЕ-о, збільшилося у «800 разів. Коли такі ж клітини вирощували у присутності АЛС-ІдО і ліпосом

РО, вироблення ТМЕ-о, знизилося на «75905, що показує потенціал переважних варіантів здійснення винаходу для лікування АЛС. Результати представлені на Фіг.16.

Claims (59)

1. Формула винаходу 70 1. Фармацевтична композиція, в одиничній дозованій формі, для введення пацієнту-ссавцю, яка містить фармацевтично прийнятні тіла і фармацевтично прийнятний носій, яка відрізняється тим, що принаймні частина згаданих тіл має розмір у діапазоні від 20 нм до 500 мкм, і при цьому поверхні згаданих тіл включають фосфатно-гліцеринові групи або групи, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, причому згадана одинична дозована форма містить від 500 до 2,5 х 109 тіл,
2. 2. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що тіла являють собою ліпосоми.
3. З. Фармацевтична композиція за п. 1 або 2, яка відрізняється тим, що по суті не містить неліпідних фармацевтично активних компонентів.
4. 4. Фармацевтична композиція за п. З, яка відрізняється тим, що не містить неліпідних фармацевтично активних компонентів.
5. 5. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 2-4, яка відрізняється тим, що ліпосоми включають від 60 до 100 96 фосфатидилгліцерину, при цьому їх фосфатно-гліцеринові кінцеві групи розташовані на зовнішніх поверхнях ліпосом.
6. б. Фармацевтична композиція за п. 5, яка відрізняється тим, що ліпосоми включають 70-90 90 фосфатидилгліцерину. с
7. 7. Фармацевтична композиція за п. 5 або б, яка відрізняється тим, що решту ліпосом складає фосфатидилхолін. о
8. 8. Фармацевтична композиція за п. 1, яка відрізняється тим, що згадані тіла включають поверхневі групи, що специфічно зв'язуються з рецепторами на клітинах імунної системи ссавця, специфічних для зв'язування з фосфатно-гліцериновими групами. «-
9. 9. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-8, яка відрізняється тим, що одинична дозована форма містить від 10000 до 50000000 тіл. -
10. 10. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 1-9, яка відрізняється тим, що використовується як «- медикамент.
11. 11. Композиція, яка містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром від 20 нм до 500 мкм, що о Містять множину експресованих на поверхні або таких, що можуть бути експресовані на поверхні, ее) фосфатно-гліцеринових активних груп, при цьому згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних неліпідних компонентів, для виробництва лікарського засобу для лікування або профілактики захворювання, вибраного з захворювання, опосередкованого функцією Т-клітин, запального захворювання і імунного « захворювання, пов'язаного з невідповідною експресією цитокінів.
12. 12. Композиція за п. 10, де фосфатно-гліцеринові групи є експресованими на поверхні тіл. - с
13. 13. Композиція за п. 11 або 12, де фосфатно-гліцеринові активні групи складають від 60 до 100 95 активних ц груп на поверхні тіл. "»
14. 14. Композиція за будь-яким з пп. 11-13, де фосфатно-гліцеринові групи являють собою кінцеві групи фосфатидилгліцеринових (Ро) лігандів.
15. 15. Композиція за будь-яким з пп. 11-14, де тіла являють собою ліпосоми. (ее)
16. 16. Композиція за п. 15, де ліпосоми складаються з 50-100 95 ваг. фосфатидилгліцерину.
17. 17. Композиція за п. 15 або 16, де ліпосоми складаються з 65-90 95 ваг. фосфатидилгліцерину. о
18. 18. Композиція за будь-яким з пп. 15-17, де ліпосоми мають діаметр від 20 нм до 1000 нм. -
19. 19. Композиція за будь-яким з пп. 11-18, де одинична дозована форма згаданої композиції містить від 500 шу 20 до25х 109 тіл.
20. 20. Композиція за п. 19, де одинична дозована форма згаданої композиції містить від 10000 до 50 млн. тіл.
21. -. й 21. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання являє собою захворювання, опосередковане функцією Т-клітин, вибране з виразок і аутоїмунних захворювань.
22. 22. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання являє собою аутоїмунне захворювання, вибране з склеродерми, псоріазу і ревматоїдного артриту. о
23. 23. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання являє собою запальну алергічну реакцію.
24. 24. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання являє собою контактну гіперчутливість. їмо)
25. 25. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання являє собою уповільнену гіперчутливість.
26. 26. Композиція, що містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром у діапазоні від 20 нм до 500 бо мкм, які містять на поверхні активні групи, які складаються по суті з фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, де згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних неліпідних компонентів, для виробництва лікарського засобу для лікування або профілактики захворювання, пов'язаного з ендотеліальною дисфункцією, вибраного з периферичного артеріального оклюзійного захворювання, застійної серцевої недостатності, аритмії шлуночків, раптової смерті б5 від серцевої хвороби, інсульту, інфаркту міокарда, стенокардії, гіпертонії, вазоспастичного захворювання, ішемічного ураження і ішемічного реперфузійного ураження.
27. 27. Композиція за п. 26, де лікування або профілактика здійснюється завдяки лікувальній взаємодії згаданих тіл з імунною системою пацієнта для пригнічення прозапальних цитокінів та/або сприяння протизапальним цитокінам.
28. 28. Композиція за п. 26 або 27, де одинична дозована форма згаданої композиції містить від 500 до 2,5 х 109 тіл.
29. 29. Композиція за будь-яким з пп. 26-28, де тіла являють собою ліпосоми.
30. 30. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 26-29, де композиція не містить неліпідних фармацевтично активних компонентів. 76
31. 31. Композиція за п. 29 або 30, де ліпосоми містять від 60 до 100 956 фосфатидилгліцерину, при цьому їх фосфатно-гліцеринові кінцеві групи розташовані на зовнішніх поверхнях ліпосом.
32. 32. Композиція за п. ЗО, де ліпосоми містять від 70 до 90 96 фосфатидилгліцерину.
33. 33. Композиція за п. 31 або 32, де решту ліпосом складає фосфатидилхолін.
34. 34. Композиція за будь-яким з пп. 26-33, де згадані тіла включають поверхневі групи, що специфічно /5 Зв'язуються з рецепторами на клітинах імунної системи ссавця, специфічних для зв'язування з фосфатно-гліцериновими групами.
35. 35. Композиція за будь-яким з пп. 28-34, де одинична дозована форма згаданої композиції містить від 10000 до 50 млн. тіл.
36. 36. Композиція за будь-яким з пп. 11-20, де захворювання пов'язане з невідповідною експресією цитокінів.
37. 37. Композиція за п. 36, де захворювання являє собою нейродегенеративне захворювання.
38. 38. Композиція за п. 37, де нейродегенеративне захворювання вибирають з синдрому Дауна, хвороби Альцгеймера, хвороби Паркінсона, сенільної деменції, депресії, хвороби Хантінгтона, периферичних невропатій, синдрому Джуліана-Барра, хвороб спинного мозку, невропатичних захворювань суглобів, хронічного запального демієлінуючого захворювання, мононевропатії, поліневропатії, симетричної дистальної сенсорної невропатії, сч ов Захворювання нервово-м'язових синапсів, міастеній і аміотрофічного латерального склерозу (АЛС).
39. 39. Композиція за п. 38, де нейродегенеративне захворювання являє собою хворобу Альцгеймера, хворобу і) Паркінсона або АЛС.
40. 40. Одинична доза композиції, що містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром від 20 нм до 500 мкм у кількості від 500 до 2,5 х 109 тіл, згадані тіла містять на поверхні активні групи, які складаються «-- по суті з фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, а згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних неліпідних компонентів, для лікування або -- профілактики атеросклерозу. «ч-
41. 41. Композиція за п. 40, яка відрізняється тим, що тіла являють собою ліпосоми, що містять фосфатидилгліцерин. о
42. 42. Композиція за п. 41, яка відрізняється тим, що ліпосоми складаються з 60-100 96 фосфатидилгліцерину. ее)
43. 43. Композиція за п. 42, яка відрізняється тим, що ліпосоми складаються з 50-90 96 фосфатидилгліцерину.
44. 44. Композиція речовини, здатної здійснювати протизапальний ефект іп мімо у ссавця, де згадана композиція містить фармацевтично прийнятні ліпосоми розміром від 20 нм до 500 мкм, ліпосоми містять 60-100 95 ваг. « фосфатидилгліцерину з фосфатно-гліцериновими групами, орієнтованими назовні, і ліпосоми по суті не містять неліпідних фармацевтично активних компонентів. - с
45. 45. Композиція за п. 44, яка відрізняється тим, що ліпосоми містять принаймні бО 90 ваг. ц фосфатидилгліцерину. "»
46. 46. Композиція за п. 44 або 45, яка відрізняється тим, що решту ліпосоми складає неактивний компонент.
47. 47. Композиція за п. 46, яка відрізняється тим, що неактивний компонент являє собою фосфатидилхолін.
48. 48. Композиція за будь-яким з пп. 44-47, яка відрізняється тим, що згадана композиція по суті не містить (ее) неліпідних фармацевтично активних компонентів.
49. 49. Композиція за будь-яким з пп. 44-48, яка відрізняється тим, що ліпосоми мають розмір від 50 до 500 нм. о
50. 50. Композиція за п. 49, яка відрізняється тим, що ліпосоми мають розмір від 80 до 20 нм. -
51. 51. Композиція за будь-яким з пп. 44-50, яка відрізняється тим, що містить суміш згаданих ліпосом, що Містять фосфатидилгліцерин, з неактивними ліпосомами і/або ліпосомами з фосфоліпідів, які діють шляхом - іншого механізму, при цьому РО-ліпосоми складають принаймні 10 95 загальної суміші. - М
52. 52. Застосування композиції, що містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром від 20 нм до 500 мкм, що містять множину експресованих на поверхні або таких, що можуть бути експресовані на поверхні, фосфатно-гліцеринових активних груп, при цьому згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних Неліпідних компонентів, у виробництві лікарського засобу для лікування або профілактики захворювання, вибраного з захворювання, опосередкованого функцією Т-клітин, запального захворювання і імунного іФ) захворювання, пов'язаного з невідповідною експресією цитокінів. ко
53. 53. Застосування за п. 52, де композиція є композицією за будь-яким з пп. 12-25 та 36-39.
54. 54. Застосування композиції, що містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром у діапазоні від бо 20 нм до 500 мкм, які містять на поверхні активні групи, які складаються по суті з фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, де згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних неліпідних компонентів, у виробництві лікарського засобу для лікування або профілактики захворювання, пов'язаного з ендотеліальною дисфункцією, вибраного з периферичного артеріального оклюзійного захворювання, застійної серцевої недостатності, аритмії шлуночків, раптової смерті 65 Від серцевої хвороби, інсульту, інфаркту міокарда, стенокардії, гіпертонії, вазоспастичного захворювання, ішемічного ураження і ішемічного реперфузійного ураження.
55. 55. Застосування за п. 54, де композиція є композицією за будь-яким з пп. 27-35.
56. 56. Застосування композиції, що містить фармацевтично прийнятні біосумісні тіла розміром у діапазоні від 20 нм до 500 мкм, які містять на поверхні активні групи, які складаються по суті з фосфатно-гліцеринових груп або груп, що можуть бути перетворені на фосфатно-гліцеринові групи, де згадана композиція по суті не містить фармацевтично активних неліпідних компонентів, у виробництві лікарського засобу для лікування або профілактики атеросклерозу.
57. 57. Застосування за п. 56, де композиція є композицією за будь-яким з пп. 41-43.
58. 58. Застосування композиції, що містить фармацевтично прийнятні ліпосоми розміром від 20 нм до 500 мкм, 7/0 Лліпосоми містять 60-100 9о ваг. фосфатидилгліцерину з фосфатно-гліцериновими групами, орієнтованими назовні, і ліпосоми по суті не містять неліпідних фармацевтично активних компонентів, для приготування лікарського засобу, здатного здійснювати протизапальний ефект іп мімо у ссавця.
59. 59. Застосування за п. 58, де композиція є композицією за будь-яким з пп. 45-51. с щі 6) «- «- «- «в) г)

    - . и? (ее) («в) - - 70 - іме) 60 б5