UA78774C2 - Dipyridodiazepinones as inhibitors of reverse transcriptase - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід стосується нових сполук й їх фармацевтично прийнятних солей, їх застосування індивідуально або в 2 сполученні з іншими терапевтичними агентами для лікування або профілактики ВІЛ-інфекції й фармацевтичних композицій, які містять такі сполуки.

Захворювання, відоме як синдром набутого імунодефіциту (СНІД) викликається вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), насамперед штамом, відомим як ВІЛ-1. Для реплікації ВІЛ у клітині-хазяїні інформація, яка міститься у вірусному геномі, повинна бути інтегрована в ДНК клітини-хазяїна. Однак ВІЛ являє собою 70 ретровірус, тобто вірус, у якого генетична інформація зчитується із РНК. Таким чином, цикл реплікації ВІЛ включає стадію транскрипції вірусного геному (РНК) з утворенням ДНК, цей процес є зворотним по відношенню до нормального ходу подій. Транскрипція вірусної РНК із утворенням ДНК відбувається за допомогою ферменту, який тому називається зворотною транскриптазою (ЗТ). Віріон ВІЛ містить копію ЗТ разом з вірусною РНК.

Відомо, що зворотна транскриптаза має три ферментативні функції: вона діє як РНК-залежна 12 ДНК-полімераза, як рибонуклеаза й ДНК-залежна ДНК-полімераза. Як РНК-залежна ДНК-полімераза, ЗТ здійснює транскрипцію копії одноланюгової ДНК вірусної РНК. Як рибонуклеаза ЗТ розщеплює вихідну вірусну

РНК ї вивільняє ДНК отриману безпосередньо на матриці вихідної РНК. Нарешті, як ДНК-залежна

ДНК-полімераза ЗТ створює другий комплементарний ланцюг ДНК, використовуючи перший ланцюг ДНК як матрицю. Два ланцюги утворюють дволанцюгову ДНК, яка інтегрується в геном клітин-хазяїв за допомогою іншого ферменту, який називається інтегразою.

Сполуки, які мають здатність інгібувати ферментативні функції зворотної транскриптази ВІЛ-1, можуть інгібувати реплікацію ВІЛ-1 в інфікованих клітинах. Такі сполуки можна застосовувати для запобігання або лікування інфекції, викликаної ВІЛ-1, у хворих людей, як це встановлено при використанні відомих інгібіторів

ЗТ, таких як 3-азидо-3-дезокситимідин (А2Т), 2',3'і-дидезоксінозин (аа), 2'3-дидезоксицитидин (ас), с 29 а4т, ЗТС, невірапін, делавірдин, ефавіренц й абакавір, які є основними лікарськими засобами, дозволеними для Ге) застосування при лікуванні СНІДу.

Як і при будь-якій антивірусній терапії застосування інгібіторів ЗТ для лікування СНІДу в остаточному підсумку може приводити до зниження чутливості вірусу до конкретного лікарського засобу. Стійкість (знижена чутливість) до таких лікарських засобів є результатом мутацій, які відбуваються в сегменті зворотної З транскриптази гена рої. Дотепер визначені характеристики декількох мутантних штамів ВІЛ і встановлено, що стійкість до відомих терапевтичних агентів зумовлена мутаціями в гені ЗТ. Одними з мутантів, які найбільш часто зустрічаються в клінічних умовах, є: мутант У181С, у якому залишок тирозину (У) у кодоні 181 замінений в на залишок цистеїну (С), і КТОЗМ, у якому залишок лізину (К) у положенні 103 замінений на залишок аспарагіну о (М). Інші мутанти, які виникають із зростаючою частотою, при лікуванні з використанням відомих антивірусних 325 лікарських засобів, являють собою мутанти з однією мутацією М1О6А, з190А, У188С й Р2З6І ; і мутанти із двома - мутаціями КТОЗМ/У181С, КТОЗМ/Р225Н, КТОЗМЛ/108І й КТОЗМЛ 1001.

Триваюче застосування антивірусних сполук для запобігання ВІЛ-інфекції безперечно буде приводити до збільшення випадків виникнення нових стійких штамів ВІЛ. Таким чином, існує необхідність в створенні нових « інгібіторів ЗТ, які мають різні параметри ефективності відносно різних мутантів. З

Сполуки, які мають трициклічні структури, які є інгібіторами ВІЛ-1, описані в (0.5. Мо. 53669721. Інші с інгібітори зворотної транскриптази ВІЛ-1 описані в (Нагогаме й ін., У. Мед. Спет., 34, (1991), стор. 22311. : » в ІО.5. Мо. 5705499) описані 8-арилалкіл- і 8-арилгетероалкіл-5,11-дигідро-6Н-дипіридої|3,2-8:2,3-Е)(1,4)діазепіни як інгібітори ЗТ. Встановлено, що вказані як приклади сполуки мають певну активність у відношенні ЗТ дикого типу й мутантного ВІЛ-1, насамперед 49 У181С, але при цьому вони менш ефективні відносно інших мутантів, які несуть одну мутацію, таких як КТОЗМ. і В МО 01/96338А1 й 05 6420359) описані діазепінові структури, які містять хінолінові й хінолін-1чЧ-оксидні

Ге | замісники, як інгібітори ЗТ. Наведені як приклади сполуки мають активність відносно штамів ВІЛ дикого типу (МУТ), мутантів з однією й двома мутаціями. і У винаході запропоновані заміщені похідні бензойної кислоти, які є ефективними інгібіторами ЗТ ВІЛ-1 -і 20 дикого типу (М/Т) і мутантних штамів із двома мутаціями, насамперед мутантного штаму із двома мутаціями кт1ОоЗзМ/У1816.

Т» Першим об'єктом винаходу є сполука формули І: іо ШЕ - ще - оди танні 1 (Ф) що ет Я я ка ев 4: сій;

М коні м В: НИ Й Я бо сей в ПОМ Дос тя

Ж б5 де

В? означає Н, галоген, Сі-Сдалкіл, О С.4-Су алкіл, М Сі-Слалкіл або М(С--Суалкіл)»;

В" означає Н або СНУ; Е? означає Н або СНУ;

В"? означає Н, галоген, Сі-Сдалкіл, СЕз або МО»;

ВЗ означає Н, С.-Сулалкіл, галоген, ОН або МН», за умови, що К "2 й В З обидва не означають Н; і

В" означає СООВ "9, де 772 означає Н або С,Свалкіл; або К"" означає Со-С.алкеніл-СООК 9, де Ба. має вказані вище значення; або К "7 означає С.-Слалкіл- СООК "72, де К 72 має вказані вище значення; або її сіль або проліки.

Другим об'єктом винаходу є фармацевтична композиція, призначена для лікування або запобігання

ВІЛ-інфекції, яка містить представлену вище в даному описі сполуку формули І, або її фармацевтично прийнятну 70 сіль,і фармацевтично прийнятний носій.

Третім об'єктом винаходу є спосіб лікування або запобігання ВІЛ-інфекції, який полягає в тому, що пацієнтові вводять інгібуючу ВІЛ кількість сполуки формули | або її фармацевтично прийнятної солі, або фармацевтичної композиції, які вказані в даному описі.

Четвертим об'єктом винаходу є спосіб лікування або запобігання ВІЛ-інфекції, який полягає в тому, що 19 вводять фармацевтичну композицію, яка містить описану вище сполуку формули | у сполученні з антиретровірусним лікарським засобом.

П'ятим об'єктом винаходу є спосіб лікування або запобігання перинатальної передачі ВІЛ від матері до дитини, який полягає в тому, що матері перед пологами вводять вказану в даному описі сполуку формули І або фармацевтичну композицію, як вони описані вище.

Докладний опис винаходу

Визначення

Якщо не вказане інше, то в описі використовуються наступні визначення:

У контексті даного опису поняття " С 4-Со галкіл", " С.і-С, алкіл" й " С.і-Св алкіл" індивідуально або в сполученні з іншим радикалом означають ациклічні алкільні радикали, які містять аж до двох, чотирьох або с

Щести атомів вуглецю відповідно. Прикладами таких радикалів є метил, етил, пропіл, бутил, 1-метилетил, Ге) 1-метилпропіл, 2-метилпропіл й 1,1-диметилетил.

У контексті даного опису поняття "Со-С,алкеніл" індивідуально або в сполученні з іншим радикалом означає ненасичений ациклічний радикал, який містить від двох до чотирьох атомів вуглецю.

У контексті даного опису поняття "галоген" означає атом галогену й включає фтор, хлор, бром і йод. З

У контексті даного опису поняття "фармацевтично прийнятна сіль" означає солі, які отримані з рч- фармацевтично прийнятних основ й є нетоксичними. Прикладами придатних основ можуть служити холін, етаноламін й етилендіамін. Мається на увазі, що під обсяг винаходу підпадають також Ма 7-, К"- і Са""-солі - див. також Вігде 5.М. і ін., Рпагтасеціїса! заїї5, 9). РНагт. Зсі., 66, (1977), стор. 1-19, включено в даний (ее) опис як посилання).

У контексті даного опису поняття "проліки" означає фармакологічно прийнятні похідні, з яких у результаті - біотрансформації утворюється діючий лікарський засіб, який стосується сполук формули І. Прикладами таких похідних є (але не обмежуючись ними) складні ефіри й аміди див. боодтап й Сіїтап, Те РНагтасоіодіса! Вазіз ої ТПпегареціїсв, 9У-е вид., МеОгам/-НІЇЇ, Іпйї. Еа., "Віоїгапеїогтайоп ої ЮОгидв, 1995, стор. 11-16, включене в « дю даний опис як посилання). -о

Докладний опис переважних варіантів здійснення винаходу с Переважно КЗ? означає Н, галоген, Сі-Су алкіл, О-С.С, алкіл або М(С4-С4)». Переважно К? означає Н, СІ, Е, ;» С.-Слалкіл, О-С4-С; алкіл або М-(С4-Слалкіл)». Більш переважно ВК? означає Н, СІ, Е, СН, ОМе або ОБ.

Найбільш переважно КЗ? означає Н.

Переважно В й КЗ обидва мають однакове значення. ш- Більш переважно В" означає Н. (ее) Більш переважно КЕ? означає СН». - Переважно К"2 означає галоген, С41-Са алкіл, СЕз або МО». Більш переважно, ВК"? означає Вг, СІ, СНз або 80. СНаСН». Найбільш переважно В"? означає СНуз або СНУСН».

Ше Переважно К"З означає Н, СН, галоген, ОН або МН». Більш переважно К' означає Н, СНз або ОН. Найбільш

Я» переважно К "З означає Н.

Переважно КВК"? означає СООН, СООМЕе, Со-СлалкенілСООН або С.-СлалкілСООН. Більш переважно В" означає СООН, СНАСН-СООН, СНоСООН або СНоСНОСООН. Найбільш переважно К"" означає СООН. 59 Сполуки формули | є ефективними інгібіторами ВІЛ дикого типу, а також мають здатність інгібувати

ГФ) мутантний фермент, який несе дві мутації КТОЗМ/У181С.

Сполуки формули І! мають інгібуючу активність у відношенні зворотної транскриптази ВІЛ-1. При введенні у де вигляді придатних лікарських засобів їх можна застосовувати для лікування СНІД, стану, який передує синдрому набутого імунодефіциту (АКС) і споріднених захворювань, зв'язаних з ВІЛ-1-інфекцією. Таким чином, наступним 60 об'єктом винаходу є спосіб лікування інфекції, яка викликається ВІЛ-1, який полягає в тому, що людині, інфікованій ВІЛ-1, вводять терапевтично ефективну кількість описаної вище нової сполуки формули І. Як для лікування, так і для профілактики, сполуку можна застосовувати також для запобігання перинатальної передачі

ВІЛ-1 від матері до дитини шляхом введення сполуки матері перед пологами.

Сполуки формули І можна вводити у вигляді однократної дози або у вигляді розділених доз оральним або бо парентеральним шляхом. Придатна оральна доза сполуки формули І може становити від приблизно 0,5 мг до З г на день. Переважно оральна доза сполуки формули | становить від приблизно 100 до 800 мг на день для пацієнта вагою 70 кг. У випадку композицій для парентерального введення придатна стандартна доза може становити від 0,1 до 250 мг сполуки, переважно від 1 до 200 мг. Однак слід мати на увазі, введена доза може змінюватися для різних пацієнтів й доза для кожного конкретного пацієнта залежить від рішення лікаря, який як критерій при призначенні відповідної дози повинен враховувати вагу і стан пацієнта, а також реакцію пацієнта на лікарський засіб.

Якщо сполуки, запропоновані в даному винаході, вводять оральним шляхом, то їх можна вводити у формі фармацевтичних композицій, які містять лікарський засіб у сполученні із сумісним фармацевтичним носієм. 7/0 Такий носій може являти собою інертний органічний або неорганічний носій, придатний для орального введення.

Прикладами таких носіїв є вода, желатин, тальк, крохмаль, стеарат магнію, аравійська камедь, рослинні олії, поліалкіленгліколі, вазелін і т.п.

Сполуки формули | можна застосовувати в сполученні з антиретровірусним лікарським засобом, відомим фахівцеві в даній галузі, як комбінований лікарський засіб для одночасного, окремого або послідовного /5 введення для лікування або запобігання ВІЛ-інфекції в індивідуума. Приклади антиретровірусних лікарських засобів, які можна застосовувати при комбінованому лікуванні з використанням сполук формули І, включають (але не обмежуючись ними) нуклеозидні/нуклеотидні інгібітори зворотної транскриптази (такі як АЗТ і тенофовір), ненуклеозидні інгібітори зворотної транскриптази (такі як невірапін), інгібітори протеази (такі як ритановір), інгібітори вірусного злиття (такі як Т-20), антагоністи ССК5 (такі як ЗСН-351125), антагоністи

СХСКА (такі як АМО-З100), інгібітори інтегрази (такі як І-870,810), інгібітори тирозинамінотрансферази (ТАТ), інші лікарські засоби, які знаходяться на стадії дослідження, (такі як РКО-542, ВМ5-806, ТМСО-114 або А!-183), протигрибкові або антибактеріальні агенти (такі як флуконазол), і імуномодулятори (такі як левамізол). Крім того, сполуку формули І можна застосовувати в сполученні з іншою сполукою формули І.

Фармацевтичні композиції можна готувати стандартним способом і кінцеві лікарські форми можуть являти сч собою тверді лікарські форми, наприклад, таблетки, драже, капсули й т.п., або рідкі лікарські форми, наприклад, розчини, суспензії, емульсії й т.п. Фармацевтичні композиції можна піддавати стандартній і) фармацевтичній обробці, такій як стерилізація. Крім того, фармацевтичні композиції можуть містити стандартні допоміжні речовини, такі як консерванти, стабілізатори, емульгатори, коригенти, змочувальні агенти, буфери, солі для зміни осмотичного тиску й т.п. Тверді носії, які можна застосовувати, включають, наприклад, «г зо крохмаль, лактозу, маніт, метилцелюлозу, мікрокристалічну целюлозу, тальк, вторинний кислий фосфат кальцію й високомолекулярні полімери (такі як поліетиленгліколь). -

Для парентерального застосування сполуку формули | можна вводити у вигляді водного або неводного ї- розчину, суспензії або емульсії у фармацевтично прийнятному маслі або суміші рідин, які можуть містити бактеріостатичні агенти, антиоксиданти, консерванти, буфери або інші розчинені речовини, які надають розчину со ізотонічність із кров'ю, загусники, суспендувальні агенти або інші фармацевтично прийнятні добавки. Такі ї- добавки включають, наприклад, тартратний, цитратний й ацетатний буфери, етанол, пропіленгліколь, поліетиленгліколь, комплексоутворюючі агенти (такі як ЕДТК), антиоксиданти (такі як бісульфіт натрію, метабісульфіт натрію й аскорбінова кислота), високомолекулярні полімери (такі як рідкі поліетиленоксиди) для регулювання в'язкості й поліетиленові похідні ангідридів сорбіту. За необхідності можна додавати також «

Консерванти, такі як бензойна кислота, метил- або пропілпарабен, бензалконійхлорид й інші похідні в с четвертинного амонію.

Й Сполуки, запропоновані у винаході, можна вводити також у вигляді розчинів для назального введення й вони а можуть містити крім сполук, запропонованих у даному винаході, придатні буфери, агенти для регулювання тонічності, протимикробні консерванти, антиоксиданти й агенти, які підвищують в'язкість, у водному носії.

Прикладами агентів, які підвищують в'язкість, є полівініловий спирт, похідні целюлози, полівінілпіролідон, -І полісорбати або гліцерин. Протимікробні консерванти, які можна додавати, включають бензалконійхлорид, тимерозал, хлорбутанол або фенілетиловий спирт. со Крім того, сполуки, запропоновані у винаході, можна вводити у вигляді супозиторію. -І Метод і синтез

Фахівець в галузі синтетичної органічної хімії на основі своїх знань може одержувати сполуки,

Ше запропоновані у винаході. Приклади реакційних схем наведені нижче на схемах 1-4. Замісники 2, В, в, їз» КТ2 ВЗ ВЗ й ря мають значення, вказані в описі.

Ф) іме) 60 б5 йо. й да З В То

СЯ. ВУ. о шжіх ТЕ

ЛО ДЕ нин нн о ай жи й Отит сна он аа:

Ян те ; З ці же Ж ; "ХХ 1 - ої фу З ; 70 юс Не: Ре ШІ скрбйачва: Га ша Й КК зов МНН я в --ь ями пен «ВИ НИ ПІВНЯ й З й Вояон отв. ж ві

ЦО їй

Загалом метод полягає в тому, що шляхом ароматичного заміщення (5 уАК) сполуки 1(ї) ЕЕМН». одержують проміжну сполуку (ії Потім шляхом галогенування положення 5 за допомогою бромувального агента (наприклад, МВ5 або брому) одержують (ії). У результаті замикання кільця сполуки (ії) за допомогою проведеної в присутності основи реакції 5ЗААК утворюється трициклічний проміжний продукт Кім). Шляхом введення замісника К2 за допомогою ароматичного заміщення хлору в положенні С-2 сполуки (ім) одержують проміжну сполуку ММ). (о шо дк - АК, ідол «ди деии ВН й «КД тк покннн кб,

Ша 2 20) зо заяв «Ж Ду шк, у ні п нн ан и ; з за 5 - їн: з ; в | у з я со ж її питод ржсттююта 2 св Н вс з у нн,

Ін са ий ім ч

Послідовність реакцій на схемі 2 аналогічна до послідовності, описаної в .).М. Кіппдег й ін.; у. Мей. ЩО с Спет. 41, 1998, стор. 2960-2971 й в С.І. Суміп й ін.; У. Мед. Спет., 41, 1998, стор. 2972-2984. Загалом, ц метод полягає в тому, що шляхом ароматичного заміщення (5 уАК) сполуки 2(ї) ЕЕМН»о одержують проміжний "» продукт 4(ії). Шляхом відновлення нітрогрупи (наприклад, за допомогою каталітичного гідрування) одержують сполуку З4(іїї). У результаті реакції конденсації, проведеної в присутності основи, сполуки (ії), наприклад,

З 5-бром-2-хлор-3-піридинкарбонілхлоридом, одержують сполуку 2(ім). Після замикання кільця сполуки 2(ім), яке -І здійснюють шляхом реакції 5 АК у присутності основи, одержують трициклічний проміжний продукт 2(хм). бо Метальну групу КО у сполуці 2(мі) можна вводити за допомогою відомого в даній галузі алкілування з використанням, наприклад, метилиодиду. -і Схема 3: Одержання проміжних продуктів, де 2 означає С.-Су алкіл -.70 Е й б сх Ст от ій пенсій дж ал х дит т пів

Бай чі. "зи т реикрвня її й м вн г ни " зай Коні: Не Моб. Сісти ім шу бо 1 ніг сь ке в з: ж

Загалом метод полягає в тому, що шляхом реакції конденсації сполук З(ї) та З(і), яку проводять у присутності основи, одержують проміжний продукт З(ії). Шляхом ароматичного заміщення (5 МАК) сполуки 65 З(її) ЄЕ2ЕМНо одержують проміжний продукт З(ім). Замикання кільця сполуки З(ім) проводять за допомогою

ЗпАК-реакції в присутності основи, одержуючи трициклічний проміжний продукт, з якого шляхом алкілування одержують проміжний продукт З(х). Й

Схема: -Альтерративний: нерівну: одержання сполуки, лев однячає Ме: ; Я 1 оф й нн Я, ВЕ 0 о Н- І

Ду нн ти визна а вина ях ші) Зі) 4 ва Е на г.

Же СД НА

НЯ, 7 ВІ и, "ЩА: ---к ІЗ , Ж ща 7 Її 4 СИ кеВ в й й нн пк жіє ви де ле ЕЕ і їз 4 (. 15

Загалом метод полягає в тому, що за допомогою реакції конденсації сполук 4(ї) і З(ії) у присутності основи одержують проміжний продукт 4(ії). Шляхом ароматичного заміщення (З МАК) сполуки 4(ії) ЕМН» одержують проміжний продукт 4(ії). Шляхом замикання кільця 4(ії) за допомогою реакції 5 ДАК у присутності основи одержують трициклічний проміжний продукт, який представляє собою сполуку Ім). мама вважай пох ние ЕРНІ і ЕМСПОТИ, бр нн В нор нові. лійпування: ОД ехо Зіреж сч ее; зд веотую ДЯ ян я я ії ря 5 й. що жа «г то сещья вне дір, Най Щ ї-

Загалом метод полягає в тому, що бром-вмісне похідне 5(ї), синтезоване відповідно до методу, - представленому в описі, піддають реакції сполучення з реагентом, що представляє собою алілолово, в апротонному розчиннику (наприклад, ДМФ) у присутності каталізатора, у результаті чого утворюються

С-8-замісники 5(ії). Після окислення подвійного зв'язку (наприклад, шляхом озонолізу з одержанням озоніду), і « наступного відновлення одержують С-8-гідроксиетильний замісник 5(ії). За допомогою реакції типу реакції Міцунобу, нафтильні похідні 5(ім), 5(м) або 5(мі), де М має значення, вказані для БК "7, за винятком СООН, т с конденсують зі сполукою «щ(ії), одержуючи сполуку формули І. В альтернативному варіанті, якщо М означає "» попередник групи К"", наприклад, СООСНі, можна застосовувати реакцію типу реакції Міцунобу для " конденсації сполуки 5(ім) або 5(у) зі сполукою «5і(іїї), і після цього М можна хімічним шляхом перетворювати в замісники К"", наприклад, шляхом омилення СООСН з, з утворенням СООН, у результаті чого одержують сполуку формули І. і Як вказано вище, сполука, запропонована у винаході, інгібує ферментативну активність ЗТ ВІЛ-1. Шляхом (ее) тестування цих сполук відповідно до описаного нижче методу встановлено, що вони інгібують РНК-залежну

ДНК-полімеразну активність ЗТ ВІЛ-1. Встановлено (дані не представлені), що вони інгібують також ДНК-залежну 7 ДНЕК-полімеразну активність ЗТ ВІЛ-1. За допомогою описаного нижче аналізу на основі зворотної транскриптази -І 20 (ЗТ) сполуки можна тестувати відносно їх здатності інгібувати РНК-залежну ДНК-полімеразну активність ЗТ

ВІЛ-1. Таким шляхом було проведене тестування деяких конкретних сполук, які описані в наведені нижче

Т» прикладах. Результати тестування наведені в таблиці 1 у вигляді значень ІСво й ЕС»о.

Приклади

Нижче винахід більш докладно проілюстрований на прикладах, які не обмежують його обсяг. Всі реакції проводили в атмосфері азоту або аргону, якщо не вказане інше. Температури представлені в градусах Цельсію.

ГФ) Відсотки або співвідношення для розчинів являють собою об./об.-співвідношення, якщо не вказане інше.

Скорочення або символи, які використовуються в описі, мають наступні значення: о ДЕАД: діетилазодикарбоксилат;

ДІАД: діїзопропілазодикарбоксилат; бо ДІЕА: діізопропіл етил амін; ДМАП: 4-(диметиламіно)піридин;

ДМСО: диметилсульфоксид;

ДМФ: диметилформамід;

ДЦК: дициклогексилкарбодіїмід;

Е5 МС: мас-спектрометрія з використанням електронного пучка; бо ЕЄ етил;

ЕЮН: етанол;

ЕЮОАс: етилацетат;

ЕСБО: діетиловий ефір;

ВЕРХ: рідинна хроматографія високого розділення;

Рг: ізопропіл;

Ме: метил; меон: метанол;

Ммескм: ацетонітрил; 70 манмов5: гексаметилдисилазид натрію;

МЕС: М-бромсукцинімід;

РІ: феніл;

ТБЕ: Трис-борат-ЕДТК;

ТБТУ: тетрафторборат 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-М,М,М'М' -тетраметилуронію;

ТФК: трифторогггова кислота;

ТГФ: тетрагідрофуран;

БУО: бляшкоутворюючі одиниці;

ДЕПК: діетилпірокарбонат;

ДТТ: дитіотреїтол;

ЕДТА: етилендіамінотетраацетат;

УМФ: уридин-5'і-монофосфат;

УТФ: уридин-5--трифосфат;

МЕС: 2-(н-морфоліно)етансульфонова кислота;

ДСН-ПААГ: гель-електрофорез у поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію; сч

ММСО: граничне значення пропускної молекулярної маси;

Біс-трис-пропан: 1,3-біс(трис(гідроксиметил)метиламіно)пропан; і)

ОЗН: відновлений глутатіон;

ОБГ: н-октил-р-О-глюкозид.

Синтез «г зо У наступних прикладах проілюстровані способи одержання сполук, запропонованих у винаході.

Приклад 1 -

Стадія а: М оте Кі С, с ШИН й: не "У СЯ Ши їй " кін ча най їв де « пл І. й Я «Й о

Її Ж. й з у, ря ей як я 8

І» і: ШИ й фо ж їв; це

Не ! я: (ее) ше -Й З й 2-х. у ЩО й ко, й ше т те чо з» Ж; т й -ї ї й

Щ нттив - й ШК ай нон о не ю ін

До розчину 2-хлор-3-нітропіридину Та (51г, 325ммолів) у ТГФ (6б50мл) додавали 2М розчин етиламіну в ТГФ 60 (Зв5мл, 731ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ночі. Реакційну суміш зливали у воду (71,5 л) і утворений твердий продукт фільтрували й сушили при зниженому тиску, одержуючи сполуку ТЬ (52Гг).

Стадія б:

Розчин 2-(етиламіно)-З-нітропіридину ЛЬ (52 г) в Меон (600 мл) перемішували протягом ночі при кімнатній бо температурі в атмосфері водню (1 атм.) у присутності 2096-ного РІ(ОН)2/С (10,4 г). Каталізатор видаляли шляхом фільтрації через діатомову землю. Фільтрат концентрували при зниженому тиску, одержуючи сполуку 1с у вигляді твердої речовини чорного кольору (39 г, вихід 8895 після стадій а й б).

Стадія в:

До охолодженого розчину З3-аміно-2--етиламіно)піридину 1с (30,6 г, 223 ммоля) в МесмМ (740 мл) додавали твердий Мансо» (56,3 г, 669 ммолів). Через 5 хв додавали неочищений 5-бром-2-хлор-3-піридинкарбонілхлорид (отриманий з 5-бром-2-гідрокси-З-піридинкарбонової кислоти й 5ОСІ»Ь (Текв., 22З3ммоля) (як описано в Т. МУ.

Сего й ін. в Зупій. Соттип. 19, 1989, стор. 553-559 (документ включений у даний опис як посилання) за винятком водної обробки). Через 2 год реакційну суміш зливали на лід/Ною (1,5л) і утворений твердий продукт 7/0 Ффільтрували, промивали НоО і потім гексаном. Після сушіння при зниженому тиску протягом ночі одержували сполуку Ід у вигляді твердої речовини чорного кольору (54,9г, вихід 6995).

Стадія г:

До розчину 2-хлор-М-/2-(етиламіно)-3-піридиніл)-5-бром-3- піридинкарбоксаміду 14 (54,9г, 154,4ммоля) у піридині (ЗО8мл) при 509 додавали по краплях ТМ розчин МАНМО5 у ТГФ (З55мл, З55ммолів). Через 1Охв 7/5 реакційної суміші давали охолонути до кімнатної температури й потім зливали на льодяну воду (2л). Утворений твердий продукт фільтрували, промивали водою й потім гексаном. Після сушіння при зниженому тиску протягом ночі одержували сполуку Те (Збг, вихід 75905) у вигляді твердої речовини темно-зеленого кольору.

Стадія д:

До розчину 8-бром-5,11-дигідро-11-етил-6Н-дипіридоїЗ,2-6:2,3-е| П1,4Ідіазепін-б-ону 1е (36, 7г, 15ммолів) у ДМФ (З8Омл) додавали Ман (3,5г, 13в8ммолів) і суміш нагрівали до 5023 протягом ЗО хв. Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури й обробляли Ме! (14,Змл, 230ммолів). Через 1,5 год реакційну суміш зливали на льодяну воду. Твердий продукт фільтрували, промивали водою й потім гексаном, одержуючи після сушіння сполуку 11 (37,9г, вихід 9995) у вигляді твердої речовини темно-сірого кольору.

Стадія є: Га

Алілтрибутилолово (30,7мл, 99,Оммолів) і РЯ(РАзЗР)4 (5,20г, 4,50ммоля) додавали до дегазованого (шляхом пропускання М 2 через розчин протягом ЗОхв) розчину і) 8-бром-5,11-дигідро-11-етил-5-метил-6Н-дипіридоїЇЗ,2-6:2,3'-е|(1,)діазепін-б-ону 17 0 (30,Ог, 90, Оммолів). у

ДМФ (45О0мл) при кімнатній температурі. Суміш перемішували при 902С протягом 1,5 год, потім охолоджували до кімнатної температури й концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою «Ж експрес-хроматографії (гексан:Е(ОАс, від 8:2 до 7:3), одержуючи сполуку 19 (22,19г, вихід 8496).

Стадія є: -

Струменем озонованого кисню барботували холодний (-7825) розчин 0/0 че 5,11-дигідро-11-етил-5-метил-8-(2-пропеніл)-6Н-дипіридої|З,2-6:2,3-е)1 Я|діазепін-б-ону 19 (22,19г, со 754ммоля) в СН 5СІ» (150мл) і Меон (15Омл) протягом 2,5год. Потім розчин барботували струменем М» протягом 15хв і після цього до розчину додавали твердий Мавн , (4,99г, 132ммоля). Реакційної суміші давали - нагрітися до кімнатної температури. Через їгод додавали водний насичений МН СІ (200мл) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2год. Органічні розчинники видаляли при зниженому тиску. До залишку додавали воду (ЗО0Омл) і СНСІз (ЗООмл). Фази розділяли й водний шар екстрагували СНСІз(З3 х ЗО0Омл). «

Об'єднані органічні шари сушили (М9504), фільтрували й концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали експрес-хроматографією (ЕФАс:ІСНеСЇІЗ, 4:11) одержуючи сполуку Іп (16,1 г, вихід 72905) у вигляді - с твердої речовини білого кольору. хз» Приклад 2 -І (ее) -І - 50 с»

Ф) іме) 60 б5 ф -й щі -Щ с-яе

Гете са ян "НН. - В "ЗН.- з зву - В. й «о рак тя Ж ж. Вк шій -е що

БИ ся, ді я шк, й ак з ок ТИНИ

Щі Хе Бе -- Ж, (ЦИ з г Хдння и В Шк в и А е як Й щ що, ут, пк и -ОЕ см ся. Ше! ш- о

В

Стадія а: «г зо Охолоджений на льоді розчин ЕМН» (49,8г, 1,1Омоля) у толуолі (200мл) додавали протягом 15хв до охолодженого на льоді розчину 2,6б-дихлор-З-нітропіридину 2а (100,0г, О,52моля) у толуолі (225мл). Суміш - перемішували при 02С протягом 45хв. Додавали воду (500мл) і ЕЮАс (500 мл) і розділяли фази. Органічний шар М послідовно промивали водою (200 мл) і соляним розчином (200 мл), сушили (Мао5О 4), фільтрували й концентрували при зниженому тиску. Твердий продукт, що залишився, перекристалізовували з МмМеон, со

Зз5 одержуючи сполуку 25 (83,7г, вихід 8095) у вигляді голок жовтого кольору. ча

Стадія б:

Сполуку 2с одержували методом, аналогічним до методу, описаному в прикладі І, стадія б.

Стадія в:

Розчин 5-бром-2-хлор-3-піридинкарбонілхлориду (30,0г, 97,О0ммолів) в МесмМ (100мл) додавали через канюлю « при кімнатній температурі до розчину З-аміно-б-хлор-2-(етиламіно)піридину 2с (16,6г, 97,0ммолів) в МесМм щу с (180мл), який містить твердий Мансо »з (14,2г, 169ммоля). Суміш перемішували при кімнатній температурі й протягом год. Додавали воду (200мл) і суміш перемішували протягом 1Охв. Утворену суспензію фільтрували. «» Твердий продукт промивали водою, потім гексаном і сушили при зниженому тиску, одержуючи сполуку 2а (28,4г, вихід 7590).

Стадія г: -і 1М розчин МмМанмоз у ТГФ (167,5мл, 167,5ммоля) повільно додавали до розчину 5-бром-2-хлор-М-12-(етиламіно)-6-хлор-3-піридиніл)-З-піридинкарбоксаміду 24 (28,4г, 72,8ммоля) у піридині бо (146мл), нагрітому до 502С. Реакційну суміш перемішували при 502С протягом 1,5 год. Потім суміш зливали на -І суміш води й льоду (1 л) і через 1 год фільтрували утворену суспензію. Твердий продукт промивали водою й - 50 сушили при зниженому тиску, одержуючи сполуку 2е (23,4г, вихід 91905).

Стадія д: «г» Твердий Ман (6б095-на масляна дисперсія, 3,4бг, 86,їммоля) додавали протягом ЗОхв до розчину 8-бром-2-хлор-5,11-дигідро-11-етил-6Н-дипіридоїЇЗ,2-6:2,3-е|. (1,)діазепін-б-ону 2е (23,4г, 66б,Зммоля) у ДМФ (220мл) при 502С. Суміш перемішували при 5092 протягом 1 год, потім давали нагрітися до кімнатної температури. Суміш зливали на воду (1 л) і утворену суспензію фільтрували. Твердий продукт послідовно промивали водою й гексаном, потім сушили при зниженому тиску, одержуючи сполуку 21 (23,0 г, вихід 94905). і) Стадія є: ко Алілтрибутилолово (21,З3мл, 68,7ммоля) і РЯ(РИ ЗР). (3,61г, З3,12ммоля) додавали до дегазованого (шляхом пропускання М 2 через розчин протягом ЗОхв) розчину 60 8-бром-2-хлор-5,11-дигідро-11-етил-5-метил-6Н-дипіридоїЇЗ,2-6:2",3'-е| П1,4Ідіазепін-б-ону 2 (23,Ог, 62,5ммоля) у ДМФ (312мл). Суміш нагрівали до 902С протягом 2 год. Суміш концентрували при зниженому тиску.

Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: ЕІЮАс, 7:3) одержуючи сполуку 29 (13,4 г, вихід 6596).

Стадія є: 65 Озонований кисень вводили в холодний (-7820) розчин 2-хлор-5,11-дигідро-11-етил-5-метил-8-(2-пропеніл)-6ЄН-дипіридоїЗ,2-р:2,3-е| П1,4Ідіазепін-б-ону 24 (13,4г,

40,7ммоля) в Меон (102мл) і СН-СІ» (102мл) до повного поглинання алкену. Розчин барботували азотом для видалення надлишку О з. Потім невеликими порціями додавали твердий МАВН у (2,69г, 71,1ммоля) і суміші давали повільно нагрітися до кімнатній температурі. Через Тгод додавали водний насичений МН СІ (15Омл) і суміш перемішували протягом 20хв. Органічні розчинники видаляли при зниженому тиску. До водного розчину додавали воду (100мл). Розчин екстрагували СНСІз (3 х 200мл). Об'єднані органічні шари сушили (Мо5зО)), фільтрували й концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (ЕоОАс:СНОЇ з, 41), одержуючи сполуку 2П (10 ,4г, вихід 7790).

Приклад 3: сій б зд ВК. пені і Й 7: . й. -н я і я. ! | я зу. чан вої

Н: 5 ві і ; о НК Й те я чи йх : ' ' секту, й нання й ж Мет ц. Чен І не я ; г «А. Ка т : Но ниж не - й Й Н | й чи н с шк й в й

Щ - ДЕЙ - ЕЙ ї- ше нин о со й «Вр М.

Стадія а:

До суміші концентрованої сірчаної кислоти (бООмл) і димлячої азотної кислоти (90905, 400мл) у льодяній бані « (внутрішню температуру підтримували на рівні 5-1095) додавали по краплях 2,6-дифторпіридин За (20О0Гг, 1,74моля). Утворену суміш перемішували протягом ночі при кімнатній температурі. Суміш повільно зливали на З не) с кг льоду й екстрагували ЕБО (2 х 2л). Об'єднані органічні шари промивали водним 1,5н. Маон (2х1л), потім "» водним насиченим Мансо)» (400Омл) або до досягнення значення рН приблизно 8-9. Органічні шари сушили над " Мао), фільтрували й концентрували при зниженому тиску до постійної маси (для видалення 2,6-дифторпіридину, який не прореагував: 10-1295). У результаті одержували сполуку ЗБ у вигляді рідини жовтого кольору (207,3г, вихід 7490). - Стадія б: о До розчину 2,6-дифтор-З-нітропіридину ЗБ (45,7г, 285ммолів) у ТГФ (500мл) при -409С додавали по краплях розчин етиламіну (25,7г, 570ммолів) у ТГФ (250мл). Через ЗОхв, реакційну суміш концентрували при зниженому і тиску й залишок розчиняли в ЕОАс. Органічну фазу промивали соляним розчином, сушили (Мо5О /), -І 20 фільтрували й концентрували. Утворений твердий продукт очищали за допомогою експрес-хроматографії (15965

І» ЕЮАс у гексані), одержуючи сполуку Зс (43, 2г, вихід 82905) у вигляді твердої речовини жовтого кольору.

Стадія в:

Розчин 2-етиламіно-б-фтор-3-нітропіридину Зс (43,2г, 230ммолів) у ТГФ (1л) перемішували протягом ночі при кімнатній температурі в атмосфері водню (Татм.) у присутності 2095-ного РЯ(ОН)/С (4,35г). Каталізатор 99 видаляли фільтрацією через діатомову землю. Фільтрат концентрували при зниженому тиску, одержуючи

ГФ) сполуку За (36,3г, вихід 95905) у вигляді твердої речовини чорного кольору. юю Стадія г:

До охолодженого розчину (42С) З-аміно-2-етиламіно-6-фторпіридину За(31,0г, 200ммолів) у МесмМ (16бОмл) додавали твердий Ммансо»з (50,4г, бООммолів). Через 15хв додавали розчин бо 5-бром-2-хлор-3-піридинкарбонілхлориду (Текв., 200ммолів) у МеСМ (155мл). Після витримування протягом бохв при кімнатній температурі реакційну суміш зливали на воду (1,2л) і перемішували протягом 30 хв. Утворений твердий продукт фільтрували, сушили протягом ночі при зниженому тиску при 5020. У результаті одержували сполуку Зе (73,7г, вихід 99905) у вигляді твердої речовини чорного кольору. б Стадія д:

До розчину 2-хлор-М-(2-(етиламіно)-6-фтор-3-піридиніл)-5-бром-3-піридинкарбоксаміду Зе (73,5г, 216бммолів)

у піридині (435мл) при 502 додавали по краплях 1М розчин МаНнНМО5 у ТГФ (520мл, 520ммолів). Через 1Охв реакційної суміші давали нагрітися до кімнатної температури, після чого зливали на льодяну воду (2л).

Утворений твердий продукт фільтрували, промивали водою і потім гексаном. Твердий продукт сушили при Зниженому тиску, одержуючи сполуку ЗІ (50,6г, вихід 6990) у вигляді твердої речовини темно-зеленого кольору.

Стадія є:

До розчину / 8-бром-5,11-дигідро-11-етил-2-фтор-6Н-дипіридої|З,2-5:2,3-е)(1,4)діазепін-б-ону ЗЕ С (44г, 130,5ммоля) у ДМФ (520мл) додавали Ман (4,28г, 178ммолів) і суміш нагрівали до 5029 протягом ЗОхв.

Реакційну суміш охолоджували до кімнатної температури й обробляли Меї (24,4мл, 522ммоля). Через 1,5год 70 реакційну суміш зливали на льодяну воду. Твердий продукт фільтрували, промивали водою і потім гексаном, сушили при зниженому тиску, одержуючи сполуку За (43,2г, вихід 9495) у вигляді твердої речовини темно-сірого кольору.

Стадія є:

Алілтрибутилолово (32,Омл, 103,4ммоля) і РЯ(РПИзР)А (5,43г, 4,70ммоля) додавали до дегазованого (шляхом 75 пропускання М 2 через розчин протягом 45хв) розчину 8-бром-5,11-дигідро-11-етил-2-фтор-5-метил-6Н-дипіридоїЗ,2-6:2,3-е| П1,4Ідіазепін-б-ону За (33,Ог, 94,Оммоля) у ДМФ (47Омл). Через 1, 2, 3, 4 і 5 год додавали додаткові кількості РЯ(РНз)4 (1,09г, О,94ммоля) для завершення реакції. Суміш нагрівали до 909С протягом б год. Суміш концентрували при зниженому тиску.

Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан"Е(Ас, від 8:2 до 7:3), одержуючи сполуку Зп (22,4г, вихід 76905).

Стадія є:

Струменем озонованого кисню барботували холодний (-7825) розчин 5,11-дигідро-11-етил-2-фтор-5-метил-8-(2-пропешл)-6Н-дипіридоїЇЗ,2-6:2,3-е|(1,4)діазепін-б6-ону Зп (22,38Г, 71,бммоля) у СНьЬСІ» (100мл) і Меон (10Омл) протягом Згод. Після цього розчин барботували протягом 15хХв Ге струменем Мо і потім до розчину додавали твердий Мавн., (5,05г, 13Зммоля). Реакційній суміші давали (5) нагрітися до кімнатної температури. Через 1 год до реакційної суміші додавали додаткову порцію Мавн у (1,627, 43,0ммоля). Ще через 1 год додавали водний насичений МН СІ (15О0мл) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом ЗОхв. Органічні розчинники видаляли при зниженому тиску. Додавали воду (200мл) і суміш екстрагували СНСІЗ (3 х Зб0Омл). Об'єднані органічні шари сушили (М95О)), фільтрували і «Ж концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (ЕФАс:СНе», м 4:1), одержуючи сполуку ЗІ (19,7г, вихід 7290) у вигляді твердої речовини білого кольору.

Приклад 4 (сполуки 1003 і 1031) - :

ЗБ. я че шо «й ї-

Ф Щ | - іа з і Ов; « мий - с й . я в Ин. "що 1 ен ш- Стадія а:

Го) Розчин 1,6М А-Ви і у гексані (6,22 мл, 9,95 ммоля) швидко додавали до холодного (-782С) розчину сполуки 4а (0,87г, 4,3З3ммоля) у ТГФ (20мл). Суміш перемішували при -782С протягом 10хв, давали нагрітися до 0 ес, ї витримували при 09С протягом 71 год. У реакційну суміш вводили струмінь СО 5 протягом 1Охв і розчин -і 20 підкисляли шляхом додавання водного 1,0н. розчину НСд. Суміш екстрагували ЕЮАс. Органічний шар сушили

ГТ» (Мао50,), фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок розчиняли в ЕГ2О (20мл) і обробляли надлишковою кількістю розчину СНОМ» у ЕБО (приблизно 0,6М, 10мл) протягом 1Охв. Суміш концентрували при зниженому тиску і залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: Е(Ас, від 4:11 до 7:3), одержуючи 465 (0,13г, вихід 1790). й

Стадія б:

ГФ) Розчин ДІАД (8бмкл, О0,44ммоля) у ТГФ (2,0мл) додавали протягом ЗОхв до розчину, який містить сполуку ТА

ГФ (100мг, О,3Зммоля), сполуку 45 (60,Омг, О,3Зммоля) і РР з (114мг, О0,44ммоля) у ТГФ (1Омл), при 2520. Суміш перемішували протягом їгод і потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою во експрес-хроматографії (гексан:Е(ОАс, від 7:З до 1:1), одержуючи сполуку 1031 (128 мг, вихід 8395).

Стадія в:

Водний 1,Он. розчин ГІОН (1,52мл, 1,52ммоля) додавали до розчину сполуки 1031 (10Омг, 0,22ммоля) у ТГФ (бмл) і МеонН (2мл). Реакційну суміш перемішували при 2593 протягом 24год, потім нагрівали до температури дефлегмації протягом 1год. Розчин підкисляли шляхом додавання водного 1,Он. розчину НС, потім екстрагували 65 ЕЮАс. Органічний шар промивали водою (2 Х) ї соляним розчином, сушили (Мо5О )), фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок розтирали з ЕбО/гексаном, одержуючи сполуку 1003 (8Омг, вихід

8390) у вигляді твердої речовини білого кольору. Суміш сполуки 1003 (38,0 мг, 0,085 ммоля) і водного 0,02н. розчину Маон (4,3 мл, 0,085ммоля) у МесМ (Змл) опромінювали ультразвуком. Утворений розчин заморожували і ліофілізували, одержуючи відповідну натрієву сіль (З37мг, вихід 9890) у вигляді твердої речовини білого кольору.

Приклад 5 (сполуки 1019, 1020 і 1028) ця -и сх сь і, 5 ай. - т; ій х я в : й М; ня що А . подала й бачка а «біли Пбня:

Стадія а:

Розчин ДІАД (8бмкл, 0,44ммоля) у ТГФ (2,0мл) додавали протягом 2год до розчину, який містить сполуку Зі (106бмг, О0,З4ммоля), сполуку ба (56,0мг, О,З4ммоля) і РР з (114мг, О,44ммоля) у ТГФ (7мл), при 2520. Суміш перемішували протягом їгод і потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: Е(Ас, від 7:33 до 1:1), одержуючи сполуку 55 (115мг, вихід 7395) у вигляді твердої речовини білого кольору.

Стадія б: с

Водний 1,Он. розчин ГІОН (1,Омл, 1,0ммоль) додавали до розчину сполуки 56 (100мг, 0,21ммоля) у МеОоН о (бмл). Реакційну суміш перемішували при 252 протягом 24год. Розчин підкисляли шляхом додавання водного 1,Он. розчину НСЇІ і потім екстрагували ЕЮАс. Органічний шар промивали водою і соляним розчином, сушили (М95О)), фільтрували і концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: ЕОАсС:АСОН, 50:50:1), одержуючи спочатку сполуку 1019 (25мг, вихід 25950) у. Ж вигляді твердої речовини білого кольору, а потім сполуку 1020 (48мг, вихід 5095) у вигляді твердої речовини їм білого кольору. Відповідні натрієві солі одержували шляхом обробки водним 0,02н. розчином Ммаон.

Стадія в: і - 1,0М розчин диметиламіну в ТГФ (5,Омл, 5,Оммолів) і водний 1,Он. розчин ІОН (1,Омл, 1,0ммоль) додавали со до розчину сполуки 55 (50,О0мг, 0,11ммоля) у ізо-РГОН (Змл). Реакційну суміш нагрівали до температури дефлегмації протягом 48год. Додавали водний 1,Он. розчин НСЇ (2мл) і суміш екстрагували Е(Ас. Органічний в. шар промивали водою і соляним розчином, сушили (Ма5О4), фільтрували і концентрували при зниженому тиску.

Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: ЕОАс:АсоОнН, 50:50:1), одержуючи сполуку 1028 (18мг, вихід 3595) у вигляді твердої речовини білого кольору. Відповідну натрієву сіль одержували шляхом « обробки водним 0,02н. розчином Маон.

Приклад 6 (сполука 1014) т с зва ду: ет!

ГУ СЮДО; Шо З сидекнкиг ди що ДИ зни де ИН кА, че ота те шо - Хнда тися Мр СОСНУ

ООН БОБА як щ о ж-Й -5 ще ду ї» й ж тк 5 пев й зд о В ен їй хв ее Я й; 60 й ваше з Що й з Сушити тво

Ко . , З й Ди й и. пи ч сія з і с 0 т (В. В : ЧЕ увркцї 65 кввуваютя ке

Стадія а:

До розчину кислоти ба (1,00г, 5,55ммоля) у СНоСІ» (5Омл) додавали оксалілхлорид (0,7Змл, 8,Зммоля) і ДМФ (100мкл). Реакційну суміш перемішували протягом ООхв, потім додавали ЕТОН (15мл) і реакційну суміш перемішували ще протягом год. Реакційну суміш концентрували при зниженому тиску, залишок розбавляли

ЕЮАс і промивали послідовно водою, соляним розчином, сушили (Мао /), фільтрували і концентрували, одержуючи складний ефір бБ, який використовували без додаткового очищення.

Стадія б:

До розчину складного ефіру 665 у СНьЬСІ» (5бмл) додавали 1М розчин ВВгз у СНоСЇІ» (7,2мл, 7,20ммоля).

Після витримування протягом Згод при кімнатній температурі реакційну суміш охолоджували до 02С і додавали 7/0. ЕН (5мл). Реакційну суміш перемішували протягом ЗОхв при кімнатній температурі, потім концентрували при зниженому тиску. Залишок розбавляли Е(Ас і послідовно промивали насиченим водним розчином Мансо з, водою і соляним розчином, сушили (Мао 4), фільтрували і концентрували досуха. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан: Е(Ас; 70:30), одержуючи фенол бс (802мг, вихід 7490 після двох стадій) у вигляді прозорої смоли.

Стадія в:

Розчин ДІАД (87 мкл, 0,44 ммоля) у ТГФ (2,0 мл) додавали протягом 2 год до розчину, який містить сполуку

Іпй (100 мг, 0,33 ммоля), РИ ЗР (104 мг, 0,44 ммоля) і фенол бс (65 мг, 0,34 ммоля) у ТГФ (7,0 мл), при кімнатній температурі. Суміш перемішували протягом 4 год і потім концентрували при зниженому тиску. Залишок очищали за допомогою експрес-хроматографії (гексан:'ЕЮАс; від 30:70 до 50:50), одержуючи сполуку ба (46 мг, вихід 29905) у вигляді піни білого кольору.

Стадія г:

До розчину складного ефіру ба (44мг, О0,09ммоля) у суміші ТГФ (Змл) і Меон (мл) додавали водний Ін. розчин ГІОН (1,Омл, 1,О0ммоль). Після витримування протягом 4год при кімнатній температурі додавали Ін. НСІ (2мл). Суміш екстрагували Е(Ас. Органічний шар промивали водою і соляним розчином, сушили (М4о50о )/), с Ффільтрували і концентрували досуха, одержуючи сполуку 1014 (ЗОмг, вихід 9395) у вигляді твердої речовини білого кольору. Відповідну натрієву сіль одержували шляхом обробки Текв. водного гідроксиду натрію і о утворений розчин ліофілізували, одержуючи пухнасту тверду речовину білого кольору. « їч- ча с м. ші с ;» -І (ее) -І - 50 с»

Ф) іме) 60 б5

Щ як

ЇСпокоРе ТЕ ТВ НН Кі МОВ) тій рек с ук ржрнк | (юю ю ЦБД зно з рю ж 1 сере кю си зи зярмеунє ск реюрею є феоуисре)ме фо фямеюи ре сч з аб є рен ін бю Ме о як я свое о бенеюю я се ря зерен фо зеювох ред ю Гр оре|е о увеснвювю й поря ов ре|е оо сяажно рев й пе ук со ржрво я аю пев й сов |в іно рере ме осо о їй з реє р вору о сен де й лає ре но рерж фею Не) є я укр ново рене « я рег ов орер ее р з с ле ук ну ням :» бе же он реле | вже те рр лере ровер щ 45 со -І - 50 їз» 52 іФ) іме) 60 б5

Тс ій г Гб я |В ТЕ МЕЧЕНІ;

Ге уяв в фббан р р за рмере зн фс р я їн фа фер реко уен зе кох ржрю ре ре ря я инеюря мери | реко р

Щй Її : - . В реж є рук | бер

Мекотябоеружо фо гееми р 4 1 реє ія фезне фе аюме о аннв х зору р фноумеев |ж ме о пвх ря рр кб іме ЗО

Аналіз зворотної транскриптази (ЗТ) -

Теоретичні основи аналізу М

До переліку ферментів, які кодуються вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ-1), входить зворотна транскриптаза (1), яка одержала таку назву тому, що вона транскрибує копію ДНК на матриці РНК. Цю активність можна со з5 Кількісно вимірювати за допомогою безклітинного ферментативного аналізу, який заснований на встановленому М факті, що зворотна транскриптаза має здатність використовувати синтетичну матричну роїу (С), примовану біотинільованим олігонуклеотидом 4(с), для транскрипції радіоактивноміченого ланцюга ДНК із використанням як субстрату ЗН-ДГТФ. В описаному нижче методі аналізу використовується фермент дикого типу (який є домінуючою формою ферменту, виявленою в пацієнтів, інфікованих ВІЛ-1), однак у методі можна застосовувати « також мутантні ЗТ-ферменти (наприклад, У181С, отриманий шляхом сайтнаправленого мутагенезу, у якому з с залишок тирозину в кодоні 181 замінений на залишок цистеїну) з використанням аналогічних умов проведення . аналізу. Цей аналіз дозволяє оцінювати ефективність сполук відносно їх здатності інгібувати мутантні ферменти. и?» Матеріали: а) Одержання ферменту

Деякі мутанти ЗТ ВІЛ-1 клону ВНІО ПІВ були отримані від Ог. С.-К. Зпіпй (фірма Воепгіпдег ІпдеІНеїт -І РпагтасеціїсаІз Іпс., США) у векторі рКК233-2 (фірма Рнагтасіа). Зокрема, клон ЗТ ВІЛ рККТт2, що несе тільки ген рбб ЗТ, яка знаходиться під контролем оперону Іас/промотору їгс, одержували від Ог. МУ. Зиттегв (Єльський со університет) (2). Шляхом сайтнаправленого мутагенезу в ген ЗТ дикого типу інтродукували різні амінокислотні -І заміни. Клони ЗТ субклонували в бактеріальному експресійному векторі рКК233-2. Отримані клони включали 5р Клон дикого типу, МаїПОбАїа, Тупв1Суз, ТупЗвСув, Тупі88іІ ем, СІУЗОАа й Рго236і еи. Інші клони були отримані

Ш- заявниками шляхом сайтнаправленого мутагенезу ЗТ рКК233-2 і включали ІУузіІОЗАзп, ІУузІОЗАзп/Тутв1Сув, ї» ГувІОЗАзгп/л еціООІе, І узвІОЗзАвзп/Рго225Нів Я уУВІОЗАзп//анюве. б) Очищення ферменту

Очищення рекомбінантної зворотної транскриптази здійснювали за допомогою комбінації описаних раніше ов Методів (3). Для ініціації росту попередньої культури, яку вирощували при 372С, використовували індивідуальну колонію із планшета, який містить свіжі трансформовані клітини лінії УМ109. Цією попередньою культурою іФ) інокулювали два літри середовища для росту. Після досягнення ОГ вод 71,5 (5-6 год при 372С), експресію гена ко ЗТ індукували за допомогою ІПТГ (кінцева концентрація імМ) і ферментацію здійснювали ще протягом декількох годин при 372С. Після центрифугування відкидали супернатанти, пелетовані клітини пулювали й поміщали на 60 Зберігання при -80 С до здійснення очищення. Клітинам давали розмерзтися при 4 С протягом ночі й суспендували в буфері для лізису (МЕ5 50мММ рН 6, ЕДТА імм, 10 об.9о гліцерину, 0,0295 мас/об. ОБГ, 0,0290 мас./об. азиду натрію). Додавали лізоцим і суміш інкубували на льоді протягом 40 хв. Після гомогенізації з використанням Юошпсе у присутності лізоциму й опромінення ультразвуком клітини центрифугували протягом 30 хв. Збирали супернатант (51) і поміщали на зберігання при 4 С. Отриманий центрифугуванням пелет б5 ресуспендували в буфері для екстракції (МЕЗ 50мММ рН 6, КРО, 50мМ рН 6, КС1 100мМ, 10 об.9о гліцерину, 0,0295 мас/об. ОБГ, 0,0295 мас/об, азиду натрію) і перемішували протягом ЗОхв при 42С. Цю другу суміш знову центрифугували й збирали супернатант (52). Описану вище процедуру повторювали ще два рази, одержуючи супернатанти 53 й 54, і протягом ночі проводили останню екстракцію (55). До об'єднаних супернатантів додавали полімін (кінцева концентрація 0,00595) для видалення нуклеїнових кислот. Цей розчин перемішували протягом 75хв при 42С і центрифугували протягом год. Супернатант (551) осаджували на льоді за допомогою 2090 мас/об, сульфату амонію й перемішували протягом 1год при 42С. Потім суміш центрифугували й утворений супернатант (552) осаджували шляхом додавання 4095 мас/об, сульфату амонію (усього 6095), перемішували протягом ігод і знову центрифугували. Кінцевий дебрис (Р1) зберігали протягом ночі при 4 оС перед проведенням очищення наступного дня. Всі стадії очищення здійснювали при 42С, якщо не вказане інше.

Дебрис (Р) ресуспендували в буфері МЕ5, який містить 50мМ рН 6, КРО, 10мМ рн 6, КСІ 100мМ, 10 об. гліцерину, 0,0295 мас/об. ОБГ, 0,0295 мас/об, азид натрію. Суспензію протягом ночі піддавали діалізу в протитечії того ж самого буфера з використанням діалізних трубок із ММСО 12-14кДа. Діалізат центрифугували й супернатант фільтрували через фільтри типу Мійех-РЕ з розміром отворів 0,8 мкм. Профільтрований зразок завантажували в гідроксіапатитну колонку (об'єм шару 3З0-мл) і промивали тим же самим буфером. Зв'язаний 75 фермент елюювали з використанням лінійного градієнта від 10 до З0О0 мМ КРО, (-200 мл) у вказаному вище буфері. Фракції, які містять гетеродимер рбб/р51 (за даними аналізу за допомогою ДСН-ПААГ 8595 і вестерн-блотингу) об'єднували для внесення в наступну колонку. Фракції, які містять ЗТ, розбавляли у два рази біс-Трис-буфером, який містить пропан 50 мМ рН 7,0, 0,02 Фомас./об. ОБГ, 10 об.95 гліцерину, 0,0295 мас/об, азиду натрію й завантажували в Ні-Тгар гепарин-сефарозну колонку (об'єм шару Б5мл) і промивали тим же самим буфером. Потім зв'язану ЗТ елюювали з використанням лінійного градієнта від 0 до ЇМ сульфату амонію (75мл) у тому ж самому буфері. Фракції, які містять ЗТ, об'єднували на основі даних аналізу, отриманих за допомогою

ДСН-ПААГ і вестерн-блотингу. Концентрацію протеїну в такому пулі визначали за допомогою методу

Брадфорда, використовуючи як стандарт БСА. Кінцевий ферментний препарат піддавали діалізу в протитечії буфера, який містить МЕ5 50мМ рн 6, КРО, 300 мм рН 6, КСІ 175мМ, 10 об.9о гліцерину, 0,0295 мас/об, азиду СМ натрію, розділяли на аліквоти і зберігали при -8026. (5)

Процедура аналізу:

Радіометричний ферментативний аналіз був адаптований до формату 9б-лункового титраційного мікропланшета й заснований на використанні завантажених стрептавідином сцинтиляційних гранул. Метод аналізу коротко описаний нижче. Фермент ЗТ ВІЛ-1 піддавали розморожуванню й розбавляли відповіднимчином (Ж Трис/НСіІ-буфером, 50 мМ рн 7,8, який містить Масі 60 мМ, гексагідрат МоСІ» 2 мМ, ДТТ 6 мм, с5Н 2 мМ й їм 0,0295 мас/об. Спарз, одержуючи ях З НМ фермент. До ЗОмкл розчину цього ферменту додавали 10мкл розчину інгібітора (від 5ОмМкМ до 2,5НМ інгібітора в цьому ж самому буфері для аналізу, доповненому 15 об.96 ДМСО). -

Перед здійсненням наступної стадії планшет піддавали попередній інкубації протягом 15хв при кімнатній со температурі. На цій стадії попередньої інкубації найбільша й найменша концентрації інгібітора становили

Зо 12,5мМкМ й 0,62нМ відповідно, а концентрація ДМСО становила 3,75о06.95. Потім ініцювали ферментативну - реакцію шляхом додавання 1Омкл розчину субстрату. Кінцева реакційна суміш містила Трис/НСІ 50 мМ рн 7,8, масі 60 мм, МосСі»ебнНоО 2 мМ, ДТТ 6 мм, с5нН 2 мМ, Спарз 0,0295 мас/об. ДМСО Зоб.оо, Роїу го 179 НМ, біотин

ДГ45 18 НМ, ДГТФ 288 НМ, ЗН-дгТФ 71 нМ й 1-2 НМ фермент. «

На цієї стадії інкубації найбільша й найменша концентрації інгібітора становили 10 мкМ й 0,5 нм З7З 70 відповідно. Після додавання субстратів планшет заклеювали пластиковим покриттям й інкубували протягом 1 с год при 372С у сухій камері. Потім реакцію припиняли шляхом додавання 75 мкл 0,5М розчину ЕДТК, який :з» містить 5 мг/мл завантажених стрептавідином сцинтиляційних гранул.

Планшет струшували протягом 2 хв при середній швидкості й інкубували протягом 1 год при кімнатній температурі. Потім додавали 75 мкл 7М розчину хлориду цезію, планшет струшували протягом 2 хв при середній - 15 швидкості й знову інкубували протягом 1 год при кімнатній температурі. Потім планшет заклеювали пластиковим покриттям і здійснювали кількісну оцінку з використанням сцинтиляційного й люмінісцентного лічильника для (ее) мікропланшетів типу ТорСошпі-МХ "м (фірма РаскКага). Радіоактивність у кожній лунці оцінювали протягом 60 -1 с. У кожній серії для одержання екстремальних значень використали порожні й контрольні лунки.

Відсоток інгібування розраховували в такий спосіб: -і срт у лунці -срт у чист. лунці

Т» двінгібування «(1-|--------------нсястнттттттттттттттт | (100 срт у контр.лунці - срт у чист. лунці

За допомогою описаного вище аналізу тестували сполуку, запропоновану у винаході, у відношенні інгібування ЗТ дикого типу (МТ) і мутантних ферментів. Результати наведені в таблиці 4 у вигляді значень ІС Бо (НМ).

ГФ) Для підтвердження здатності сполуки інгібувати реплікацію ВІЛ її тестували відповідно до описаного нижче г методу аналізу людської Т-клітинної культури (фірма Зупсуйіа).

Твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІ5А) для оцінки активності в клітинній культурі во Здатність сполуки, запропонованої у винаході, інгібувати реплікацію ВІЛ у клітинній культурі тестували у форматі 9б-лункового планшета. Для розведення сполуки, а також середовища для росту клітин використовували повне середовище КРМІ 1640, яке містить КРМІ 1640 ж- 1095 фетальної телячої сироватки, 10 мкг/мл гентаміцину й ЮмкМ (р-меркаптоетанолу.

Клітинну лінію Т-лімфоцитів С8166б інфікували із множинністю зараження 0,001 вірусами, які кодують б5 зворотну транскриптазу дикого типу й мутантну транскриптазу. Потім клітини інкубували протягом трьох днів у присутності серійних розведень сполуки, запропонованої у винаході. Об'єднували супернатант із восьми лунок-копій і визначали концентрацію позаклітинного р24 з використанням набору для аналізу антигену р24

ВІЛ-1, який надходить в продаж (фірма Весктап-Соц(егое). Рівень інгібування (95 інгібування) розраховували на основі наступного рівняння: р24 пг/мл інгібітора увінгібування (1-|--------------нтняяятт о (100 324 пг/мл контролю

Результати наведені в таблиці 2 у вигляді ЕСво (НМ).

Процитована література (включена в опис як посилання) 70 1. Вепп, 5. І ін., Зсіепсе 230:, 1985, стор. 949. 2. Б'Адиїйа К. Т. і Зиттегв МУ. С. 9., Аса. Ітт. Оеї. уп. 2: 1989, стор. 579.

З. а) МУатеп Т. С і ін., Ргоївіп Ехргезвіоп 5 Ригіїісайоп З:, 1992, стор. 479; 6) КопПівіаеді І. А. Зсіепсе 256 (5065):, 1992, стор. 1783.

Таблиця 2 й (МУ) (нм) У181С (нм) 2 1601 в0106001108 см щі о з м щі яву в61в 1060106 со зв м ч 4 пів А1 в З с пів 8011К . » паж вне 18100008 ож. вне | не 10011081 1 пея і в1А1яв10001нв - со - 4» т» оз лв |в 1 нене 5Б Позначення для таблиці:

ІСво й ЕСво: А - 2100 нМ; В - 100-50 нм; С - «50 НМ; о Н.в. - не визначали. іме) во

Claims (18)

Формула винаходу

1. Сполука формули: б5 ві в о що) чо; я 12 / ут чи Мов м о ЕЇ Е! 4 де В? означає Н, галоген, Сі-Слалкіл, ОС.4-Слалкіл, МНО.-Суалкіл або М(С.-Су алкіл)»; В" означає Н або СНУ»; ВЕ? означає Н або СНУ», за умови, що й В й В? не мають однакового значення; В"? означає Н, галоген, Сі-Сдалкіл, СЕз або МО»; В "З означає Н, С.-Сдалкіл, галоген, ОН або МН», за умови, що В? й ВЗ обидва не означають Н; і В" означає СООВ "2, де Ка означає Н або С.-Свалкіл; або КЕ"! означає Со-С.алкеніл-СООВ а, де д/а має вказані вище значення; або К"" означає С.4-С.алкіл-СООК 2, де К 72 має вказані вище значення; сч або її сіль або проліки.

2. Сполука за п. 1, де КЕ? означає Н, галоген, С--Слалкіл, ОС4-Слалкіл або М(С.-Слалкіл)» й ВК" й КЕ? не мають о однакових значень.

3. Сполука за п. 2, де В? означає Н, СІ, Е, С4-Слалкіл, ОС.4-Слалкіл або М(С.-Слалкіл) ».

4. Сполука за п. З, де 2 означає Н, СІ, Е, СН», ОМе або ОК. «І

5. Сполука за п. 4, де 22 означає Н. м

6. Сполука за п. 1, де ЕВ" означає Н.

7. Сполука за п. 1, де о означає СН». в.

8. Сполука за п. 1, де 22 означає галоген, С.-С.алкіл, СЕз або МО». с зв

9. Сполука за п. 8, де В"? означає Вг, СІ, СнНз або СНаЗСН». ча

10. Сполука за п. 9, де ВК"? означає СНз або СНаСН».

11. Сполука за п. 1, де Е"З означає Н, СН» галоген, ОН або МН».

12. Сполука за п. 11, де К"З означає Н, СНа або ОН. «

13. Сполука за п. 12, де КЗ означає Н.

14. Сполука за п. 1, де 2"? означає СООН, СООМЕе, Со-С.алкеніл-СООН або С.-С.алкіл-СООН. - с

15. Сполука за п. 14, де В" означає СООН, СНАСН-СООН, СНЬСООН або СН.СНЬСООН. »

16. Сполука за п. 15, де В" означає СООН.

17. Сполука формули (І) за п. 1: ер Кк о 0 і: / М со 12 - Ше хх -1 20 | р / о ї» М М М Ще г ЕЇ Ф) я ко де В? означає Н, СІ, Е, СНз3, ОМе або ОБ В" означає Н; В? означає СНа; ВК/2 означає ВГ, СІ, СНз або 60 СН.СНаУ; В З означає Н, СНз або ОН; і В"? означає СООН, СН-СН-СООН, СНоСООН або СНоСНоСООН; або її сіль або проліки.

18. Сполука за п. 17, де ВК? означає Н; В" означає Н; ЕК? означає СНу; В? означає СНз або СНУСНо; ВЗ означає Н; і В"" означає СООН; або її сіль або проліки. 65 19. Фармацевтична композиція, призначена для лікування або запобігання ВІЛ-інфекції, яка містить сполуку формули І за п. 1 або її фармацевтично прийнятну сіль і фармацевтично прийнятний носій.

Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2007, М 5 25.04.2007. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с о « їч- ча с м. ші с ;» -І (ее) -І - 50 с» Ф) іме) 60 б5