UA75562C2 - Methods and compositions for modification of the level of secondary metabolic compounds in plants - Google Patents

Description

Опис винаходу

Ця заявка є частковим продовженням заявки США, порядковий номер 09/012, 453, та заявляє пріоритет з попередньої заявки 60/072, 156.

У даному винаході пропонуються способи та композиції для зміни рівня сполук, що утворюються внаслідок процесів вторинних метаболічних шляхів у рослин. Також у винаході пропонуються рослинні клітини зі зміненим рівнем вторинних метаболітів та насіння рослин зі зміненим рівнем вторинних метаболітів. В одному втіленні у рослинах, рослинних клітинах та насінні рослин згідно з винаходом змінено рівень нехарчових вторинних 70 метаболічних речовин. В іншому втіленні у рослинах, рослинних клітинах та насінні рослин згідно з винаходом змінено рівень продуктів вторинних метаболічних шляхів, таких як фенілпропаноїди та цукрові спирти. Також у винаході пропонуються генетичні конструкти та вектори, що застосовуються для модифікації рівня вторинних метаболітів у рослинних клітинах та насінні. Винахід також стосується борошна з модифікованого зерна, корму для тварин, що містить борошно з модифікованого зерна, і зокрема борошно з зерна, у якому рівень вторинних 12 метаболітів зменшено або змінено.

Рослини утворюють велику кількість різних сполук шляхом вторинного метаболізму. Внаслідок вторинних метаболічних шляхів, що не вважаються суттєвими для метаболізму рослин, часто утворюються унікальні біохімічні речовини, причому деякі з них вважаються нехарчовими або навіть токсичними. Вторинні метаболічні шляхи та сполуки, що утворюються внаслідок цих шляхів, часто є специфічними для окремого виду або роду.

Тому обробка вториних метаболічних шляхів може привести до виникнення нових композицій біохімічних речовин або рослинних тканин зі зміненим рівнем вторинних метаболітів. Зокрема, обробка вторинних метаболічних шляхів з метою зміни рівня вторинних метаболічних сполук, що є нехарчовими або токсичними за своєю природою, може привести до унікальних застосувань у галузі харчів та корму.

Обробку вторинного метаболізму бажано проводити, не змінюючи біохімічних процесів, що вважаються с життєво необхідними для росту та життєздатності рослинної клітини. Сукупність біохімічних процесів та сполук, (У що є важливими для росту та життєздатності рослини, які беруть у них участь, вважаються процесами основного метаболізму та їхніми продуктами. Основний метаболізм взагалі розглядається як такий, що включає в себе ті біохімічні процеси, що приводять до утворення основних цукрів (наприклад, глюкози), амінокислот, звичайних жирних кислот, нуклеотидів та їх полімерів (полісахаридів, таких як крохмаль, білки, ліпіди, рибонуклеїнові с та дезоксирибонуклеїнові кислоти тощо) |(Уеотап апа Меотап, Тапзієу Кеміеєм/ Мо.90, Мапіршанйпуо Зесопдагу «о

Меїабоїїзт іп Сийигеа Ріапі СеїЇв, Мем Рпуюіодіві, 134:553-569, 1996).

Таким чином, прийнято розрізняти основний метаболізм як процес обміну речовин, що є важливими для о життєздатності та росту усіх клітин рослини, та вторинний метаболізм як біохімічні процеси, що не є життєво ою необхідними для усіх клітин рослини. Наприклад, вторинні метаболічні шляхи обумовлюють такі ознаки рослини, 39 як колір, смак, морфологію тощо. Також внаслідок процесів вторинних метаболічних шляхів утворюються в різноманітні сполуки, що сприймаються комахами або беруть участь у реакції на патогени. Деякі з цих сполук можуть бути корисними для деяких видів рослин у диких умовах, але у культивованому стані ці сполуки можуть погіршувати якість вирощуваного продукту або обмежувати використання врожаю при певних застосуваннях. «

Деякі вторинні метаболіти є унікальними сполуками, що виникли внаслідок еволюції у видів як результат З 50 спеціалізованих біохімічних процесів. Вторинний метаболізм не відзначається надмірністю біохімічних с механізмів, що є типовим для основного метаболізму, тому, як правило, продукти вторинного метаболізму не

Із» утворюються в рослині багатьма шляхами. Вторинні метаболіти типово є більш специфічними для окремих рослин, ніж розповсюджені біохімічні речовини, що беруть участь у основних шляхах.

Численні спроби модифікації процесів основного метаболізму призвели до появи рослинних клітин зі зміненим рівнем крохмалю або олії (ліпідів). Проте грубий вплив на основний метаболізм може призвести до це. шкідливих наслідків. Наприклад, можна змінити склад ліпідів, проте видалення ліпідів було б негативним 4! наслідком для життєздатності клітини. Обробка основного метаболізму не завжди є цілюом успішною, тому що велика кількість біохімічних механізмів може подолати будь-які спроби обробки. Таким чином, процеси основного і-й метаболізму в рослин часто важко змінити так, щоб можна було б повністю передбачити та одержати б 20 застосовувані та помітні результати в умовах культивування.

У деяких випадках основний метаболізм було успішно модифіковано для створення нового фенотипу, у із якому було досягнуто зміни складу, а не зменшення чи виключення окремої речовини. Типово, такі маніпуляції здійснювалися шляхом ектопічної експресії гена рослини, наприклад, надекспресією гена у деяких тканинах або у конститутивній формі частіше, ніж у регульованій формі, або інгібуванням активності певного гена за 29 допомогою антизмістовної РНК, рибосомних ферментів або косупресії. Проте, дуже важко було передбачити а

ГФ) ргіогі наслідки таких маніпуляцій.

Експресію рослинного ферменту можна змінити на багатьох рівнях. До них відноситься контроль на рівні о експресії гена, трансляції, процесингу білка та алостеричний контроль за функцією білка. Таким чином, ектопічна експресія гена рослини, що бере участь в основному метаболізмі, може не подолати комплексного 60 біохімічного контролю основного метаболізму. Окрім того, проблему великої кількості шляхів основного метаболізму також важко подолати, оскільки процеси основного метаболізму важливі для росту та життєздатності рослини. Таким чином, спроби змінити основний метаболізм часто не призводять до створення бажаного фенотипу. Більше того, випробування таких модифікованих рослин у польових умовах або в екстремальних умовах навколишнього середовища часто виявляють, що передбачуваний ефект не бо спостерігається або життєдіяльність рослини ставиться під загрозу. Таким чином, модифікація основного метаболізму вимагає ретельного розгляду процесу основного метаболізму або обачливого впровадження етапу в межах шляху, щоб досягти потрібного фенотипу.

Маніпулювання процесами вторинних метаболічних шляхів утруднювалася недостатнім розумінням їх біохімії, недостатньою інформацією про гени, задіяні у вторинних метаболічних шляхах, та складною взаємодією між біохімічними процесами взагалі.

Проте, способи зміни вторинного метаболізму можуть надати корисні засоби для створення нових фенотипів, включаючи фенотипи зі зміненою кількістю сполук вторинного метаболізму, наприклад, таких, що вважаються нехарчовими за своєю природою. Отже, вторинні метаболічні шляхи речовин є важливим завданням для 7/0 генетичної модифікації рослин.

Були здійснені спроби щодо перенесення шляху біосинтезу бетаїну в рослини, що є нездатними синтезувати осмопротектор -- бетаїн. (ІНоітвігот, К.О. сеї аїЇ., Ргодисіоп ої (Ше ЕзсПпегіспіа соїї Бейаіпе-аідепуде депудгодепазе? Ап еплуте гедицігед їог зупіпевіз ої озторгоїесіапі діусіпе Бреїаіпе, іп (гапздепіс ріапів, Те

Ріапі доцгпа!ї, (1994) 6(5):749-58| описує використання гена, що кодує бетаїн-альдегіддегідрогеназу для 7/5 бинтезу осмопротектора -- гліцинбетаїну.

У роботі |ОСегмепі арзігасі АМ 96-512578, Тоуоїа дідозпа КК, 15 жовтня, 1996) описується використання гена холіндегідрогенази та гена бетаїн-альдегіддегідрогенази для синтезу осмопротектора бетаїну.

Два біохімічних шляхи в рослинах, що розглядаються як шляхи вторинного метаболізму, були предметом досліджень, метою яких є зміна рівня кінцевого продукту. Способи, що використовувались для маніпулювання цими шляхами, не призвели до бажаного результату. Наприклад, фенілпропаноїдний шлях бере участь в утворенні лігніну та може вважатися вторинним метаболічним шляхом. Біосинтез лігніну є частиною загального шляху біосинтезу фенілпропаноїдів, у якому утворюються принаймні три основні фенольні попередники: кумарова, ферулова та синапінова кислоти, продукти яких полімеризуються у лігнін та інші фенольні сполуки (див. Фіг.2). сч

У спробах змінити вторинний метаболічний шлях фенілпрвланоїдів гени багатьох ферментів, що беруть о участь в утворенні мономерів лігніну, тепер розглядаються як мішені для зменшення рівня лігніну шляхом використання антизмістовних послідовностей або косупресії (наприклад, патент США Мо5451514, патент США

Мо5633439, МО 93/05160, МУО 94/08036). До цих генів-мішеней відносяться ті, що кодують дегідрогеназу цинамілового спирту, О-метил-трансферазу кофеїнової кислоти та фенілаланінамонійліазу. Ці способи с зо спрямовані на зменшення рівня лігніну, оскільки вважається, що це матиме загальний корисний вплив на переробку або засвоєння рослин. ісе)

Проте зменшення рівня лігніну шляхом використання антизмістовної послідовності або косупресії одного з ю генів фенілпропаноїдного шляху може мати велику кількість небажаних наслідків. До них відносяться: підвищена схильність до захворювань, змінені темпи росту або зменшення фізичної міцності рослинних волокон та, як о наслідок, зменшення агрономічної ефективності. Було показано, що інгібування ферменту ї- фенілаланінамонійліази призводить до виникнення численних шкідливих фенотипів (ЕїКіпа еї. аіІ., Абпогтаї Ріапі

Оемеюортепі апа ОЮомп-Кедшайоп ої РВПепуІргорапоіїйй Віозупійевів іп Тгтапздепіс Торассо Сопіаіпіпд а

Нейегоїсдоиз РНепуїаїапіпе Аттопіа Іуазе Сепе, Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 87:9057-9061, 1990). Фермент фенілаланінамонійліаза діє на основний метаболіт фенілаланін, що є амінокислотою. Результати цих « експериментів показують, що зміна вторинного метаболізму шляхом модифікації одного з основних метаболітів, ств) с що бере участь в окремому вторинному метаболічному шляху, може створити небажані та шкідливі фенотипи.

Отже, вибір біохімічного етапу або етапів у межах вторинного метаболічного шляху є вирішальним для ;» створення рослин, які є фенотипічно нормальними, але виявляють зменшення рівня певного вторинного метаболіту.

Окрім того, застосування антизмістовної РНК або косупресії може не призвести до зниження рівня або -І специфічності певного вторинного метаболіту, що є економічно прийнятним. На додаток, інгібування генів, що кодують головні ферменти, може вплинути на експресію пов'язаних з ними генів. Таким чином, було досягнуто о невеликого прогресу у зменшенні рівня фенольних сполук, що вважаються нехарчовими, або у зменшенні рівня с лігніну шляхом застосування антизмістовної РНК або косупресії без шкідливих побічних ефектів.

Другим прикладом спроб змінити метаболічний шлях, що зазнали невдачі, є модифікація біосинтезу

Ме, глюкозинолату в насінні рапсу. Повідомлялося про спроби змінити рівень глюкозинолату в борошні з рапсу

Із шляхом обробки -- глюкозинолатного шляху. Пропонувався спосіб зміни біосинтезу глюкозинолату, що полягав у створенні нового шляху, конкурентного для сірки, що використовується при утворенні глюкозинолатів, або в зменшенні рівня триптофану, що використовується при утворенні глюкозинолатів шляхом перетворення ов триптофану на триптамін ГЕпдіпеегіпу АкКегей Сійсозіпоіаїе Віозупіпезіз ру Гмо АКегпайме Зіга(едіев", ру

Іогапіт, Спамаде| 5 ЮОе І иса, рибіїзпей іп: Сепегіс епдіпеегіпд ої ріапі зесопдагу теїйароїїзт 1994, Ріепит

Ф) Ривіїзпіпд Согрогайоп; Мем ЖМогк; ОА. ка Однак цей спосіб не був успішним для зниження рівня глюкозинолату в борошні з рапсу. Виявилося, що цим способом неможливо зменшити рівень нехарчових глюкозинолатів у борошні з рапсу. Глюкозинолати бо утворюються в листі рослин і потім переносяться до насіння. Тому цей спосіб був оснований на припущенні, що проста зміна доступності одного з основних метаболітів (сірки, амінокислоти триптофану), що беруть участь в утворенні глюкозинолатів, зменшить утворення глюкозинолатів. Однак основними глюкозинолатами в насінні є аліфатичні глюкозинолати, що не використовують амінокислоту триптофан для створення бокових ланцюгів.

Більше того, результати цих експериментів (наприклад, (Спамаде| еї. аїЇ., Ргос. Май. Асай. Зсі. О5А, 65 91:2166-2170, 19941 показали, що трансгенні рослини, у складі яких є фермент, здатний змінювати кількість основної амінокислоти триптофану, не містять зменшеної кількості глюкозинолатів у насінні; рівень аліфатичного глюкозинолату в насінні дорівнює або є навіть більшим, ніж у нетрансгенних рослин. Таким чином, загальне утворення глюкозинолатів у насінні не зменшилося, навіть коли виявилось зменшення рівня мінорного компоненту (індолглюкозинолатів). З генетичних досліджень видно, що рослини з низьким рівнем глюкозинолату

Можна одержати шляхом звичайного розведення. Та існує велика кількість локусів, що контролюють низький рівень глюкозинолатів у хрестоцвітих. Існують чисельні біохімічні перетворення, що відбуваються при біосинтезі глюкозинолатів, та ці перетворення, подібно до усіх або більшості процесів синтезу глюкозинолатів, мають бути об'єктом у способі зменшення загального рівня глюкозинолатів. Таким чином, при розробці загального способу зміни утворення глюкозинолатів у хрестоцвітих треба враховувати різні ферменти та 7/о субстрати, що беруть участь у біосинтезі глюкозинолатів.

Проте виявляється, що ферменти, які використовуються для одержання цієї модифікації, також впливають на основні метаболіти (амінокислоту триптофан та мінеральну сірку) і, отже, будь-яка значна зміна рівня цих сполук в рослинній клітині може викликати шкідливі наслідки. Таким чином, запропонованим способом не можна специфічно впливати на вторинний метаболізм. Дійсно, зміна рівня триптофану може призвести до багатьох шкідливих наслідків. Таким чином, зміна рівня основного метаболіту не дає бажаного ефекту зниження глюкозинолатів у борошні з рапсу, що підкреслює складність зміни основного метаболізму.

У МО 97 23599 А Меїййпоа тог Кедшаїйоп ої Ріапі Сотрозійоп, (Е.І. ОиРопі апа Ригаце Кезеагсп Рошпаайоп,

З липня, 1997 року| описується використання ферулат-5-гідроксилази (ФГ), одержаної з хрестоцвітої рослини, для регулювання рівня лігніну в рослинних клітинах. Фермент ФГ, описаний у УМО 97 23599, являє собою фермент, що зазвичай розглядається як частина фенілпропаноїдного шляху в рослинних клітинах, наприклад, у хрестоцвітій рослині, з якої він був одержаний. Фермент ФГ, описаний у УУО 97 23599, не виявляє активності у трансформованій клітині, проте виявляє активність у клітині, з якої він був одержаний.

Таким чином, загальний спосіб зміни вторинного метаболізму буде корисним для зміни біохімічного складу рослинних тканин. Він може включати, наприклад, зменшення рівня нехарчових сполук, зміну профілю сч ов вторинного метаболізму, одержання рослинної тканини зі зміненим процесингом, зміну рівня сполук, що знаходять застосування у промисловості або у фармацевтиці, створення рослин зі зміненим смаком, будовою і) або виглядом, створення рослин зі зміненими вторинними метаболітами, що приваблюють комах, пов'язані з чутливістю до захворювань або іншими біологічними процесами, на які впливають вторинні метаболіти, або рослин з позитивно зміненими характеристиками росту внаслідок зміни рівня вторинних метаболітів. с зо У даному винаході пропонується спосіб спрямованого впливу на утворення вторинних метаболітів. Спосіб включає зміну доступності субстрату, що є специфічним до вторинного метаболічного шляху та важливим для ікс, утворення кінцевих продуктів вторинного метаболізму, зокрема сполук, що беруть участь на 1--5 біохімічних ю етапах утворення кінцевого продукту. Спрямування впливу на субстрати на етапах, близьких до утворення кінцевого продукту, дозволяє уникнути проблем, пов'язаних зі зміною рівня метаболітів, які також причетні до о з5 основних шляхів, оскільки воно відбувається після моменту потрапляння субстрату до основного метаболічного ча шляху. Таким чином, цей спосіб пропонує нові засоби специфічного спрямування впливу зменшення або зміни рівня вторинних метаболітів за допомогою виявлення попередників, що беруть участь у вторинному метаболічному шляху, що не являються субстратами основних метаболічних шляхів.

Спосіб може також включати зміну доступності субстрату тканинно-специфічним способом так, що « Змінюватимуться тільки окремі тканини, наприклад, тканини насіння. в с Таким чином, у даному способі пропонуються нові засоби специфічного спрямовування впливу на зменшення

Й або зміну рівня вторинних метаболітів завдяки виявленню попередників, що беруть участь у вторинному а метаболічному шляху, які не являються сполуками основного метаболізму.

У першому втіленні цей винахід пропонує спосіб створення генетично трансформованої рослини, що складається з: -І А) введення в клітину, яка може бути трансформована та регенерована у цілу рослину, касети для експресії

ДНК, що містить окрім послідовності ДНК, потрібної для трансформації та селекції в рослинних клітинах, також 1 послідовність ДНК, яка під контролем промотору, активного в рослинних клітинах, кодує білок, здатний змінити с використання субстрату у вторинному метаболічному шляху за умови, що субстрат не є основним метаболітом, таким як глюкоза, амінокислоти, звичайні жирні кислоти та нуклеотиди;

Ме, Б) вирощування рослини зі зміненим рівнем принаймні одного з продуктів вторинного метаболічного шляху.

Ге В іншому втіленні цей винахід пропонує спосіб створення генетично трансформованого насіння, що складається з вирощування рослини, одержаної на етапах А та Б описаного вище способу за умов утворення насіння.

Рекомбінантна ДНК -- це послідовність ДНК, інтегрована у хромосому та геном родючої рослини таким чином, що вона успадковується наступними поколіннями.

Ф) В іншому втіленні цей винахід пропонує вектори для трансформації рослин, рослини та насіння, ка трансформовані згідно з вищеописаним методом, та харчові продукти, що містять насіння або борошно, одержане з насіння. во Короткий опис малюнків:

Фіг.1: Схематичне зображення загальної схеми способу зміни будь-якого вторинного метаболічного шляху.

Фіг2: Схематичне зображення загального фенілпропаноїдного метаболізму та утворення синапіну у хрестоцвітих.

Фіг.3: Початок та розвиток синтезу синапіну в насінні, що проростає. Аналіз насіння Вгазвзіса парив сорту 65 УУевіаг методом тонкошарової хроматографії.

Фіг.4: Кількісний аналіз накопичення синапіну в насінні, що проростає, методом НІ РО.

Фіг.5: Визначення здатності проростаючого насіння синтезувати синапін шляхом уведення радіоактивного холіну через ніжку вирізаних стручків та включення мітки у синапін з 7-го по 43-тій день після запилення.

Фіг.6: Визначення здатності проростаючого насіння синтезувати синапін за поглинанням розчину, що містить радіоактивний холін, виділеним насінням та включення мітки у синапін з 43-го по 64-тий день після запилення.

Фіг.7: Накопичення новосинтезованого синапіну в сім'ядолі, осях зародка та насінній шкірці проростаючого насіння як частини загальної кількості міченого синапіну в насінні.

Фіг.8: Рівень синапіну в сім'ядолі та осях зародка проростаючого насіння на одиницю маси зразка тканини.

Фіг.9 : Визначення рівня синапіну в сім'ядолі та осі зародка проростаю чого насіння на одну насінину, 7/0 тобто на вісь або пару сім'ядоль.

Фіг.10А та 10Б: Послідовність нуклеотидів відкритої рамки зчитування холіноксидази (ЗЕО). ІЮ. Мо3).

Фіг.11 : Передбачувана послідовність амінокислот відкритої рамки зчитування холіноксидази (ЗЕО). ІЮ. Мод).

Фіг.12: Діаграма вектора рН 731, що містить ген ХО під контролем тканино-селективного промотору, для трансформації рослини.

Фіг.13: Зменшення рівня синапіну у насінні Вгазвзіса зр. завдяки експресії гена ХО.

Фіг.14: Діаграма вектора рН5 981, що містить ген БАДГ під контролем тканино-селективного промотору, для трансформації рослини.

Фіг.15: Зменшення рівня синапіну у насінні Вгазвіса зр. завдяки експресії генів ХО та БАДГ.

Фіг.16 : Зміна рівня фенольних сполук в насінні Вгаззіса зр. завдяки експресії генів ХО та БАДГ.

Фіг.17: Послідовність нуклеотидів синтетичного гена декарбоксилази Федулової кислоти В. ритиїв, оптимізованого для експресії у рослинних клітинах (ЗЕО). 1І0.Мо1).

Фіг.18: Передбачувана послідовність амінокислот білка, закодованого синтетичною відкритою рамкою зчитування декарбоксилази ферулової кислоти В.ритиїйв5 (ЗЕО. ІЮ. Мо2).

Фіг.19: Рестрикційна мапа вектора, що містить ген декарбоксилази Федулової кислоти під контролем сч ов Конститутивного промотору 355, для трансформації рослини.

Фіг.20: Рестрикційна мапа вектора, що містить ген декарбоксилази Федулової кислоти під контролем і) насіння-селективного напінового промотору, для трансформації рослини.

Фіг.21: Накопичення фітинової кислоти під час проростання насіння.

Фіг.22: Особливості накопичення фітинової кислоти в різних тканинах насіння, що проростає. с зо Фіг.23: Рівень засвоєного міченого міоінозиту у фітиновій кислоті, ліпідах, ТРА-розчинній фракції стінки клітини та уламках клітини. ікс,

Фіг.24: Послідовність ампліфікованого фрагмента ДНК гена О-метилтрансферази міоінозиту (ЗЕО). ІЮ. Моб). ю

Фіг.25: Рестрикційна мапа вектора рЗІМТ, що містить касету: промотор 355 - ІМТ-5И5-Моз термінатор, в рЕО400. о

Фіг26: Рестрикційна мапа вектора рМІМТ, що містить насіння-селективний промотор 355 -ІМТ-Моз ї- термінатор, у рКО400.

Фіг.27: РСК-аналіз трансгенних рослин, що містять ген ІМТ.

Фіг.28: Нозерн-блот аналіз рослин, що містять ген ІМТ.

Фіг.29: Діаграма спостережуваного зменшення рівня фітинової кислоти в трансгенних рослинах. «

Фіг.30: Зменшення рівня фітинової кислоти в рослинах НЕ1, Е2 та ЕЗ, що містять вектор рЗІМТ. з с Фіг.31: Зменшення рівня фітинової кислоти у рослинах Е1 та Е2, що містять вектор РМІМТ.

Цей винахід стосується специфічного зменшення або зміни співвідношення рівня попередників та продуктів ;» вторинного метаболізму, відмінних від основних метаболітів. У такий спосіб можна уникнути потенціальних шкідливих ефектів зміни основних метаболічних шляхів, щоб досягти подібного результату. Таким чином, цей

Винахід не стосується сполук, які могли б вважатися основними метаболітами. -І У кращому втіленні змінюється доступність субстрату завдяки використанню ферменту, наприклад, стороннього для цієї рослинної клітини, придатного для дії на цей субстрат та такого, що видаляє згаданий о субстрат або змінює його доступність у наявній сукупності субстратів. Узагальнений огляд способу та взаємодії с між основним та вторинним метаболізмом показані на Фіг.1. Використання стороннього ферменту для зміни 5р потоку продуктів вторинного метаболічного шляху призводить до модифікації бажаного кінцевого вторинного

Ме, метаболіту. Це змінює потік продуктів у вторинному метаболічному шляху, призводячи до модифікації бажаного

Із кінцевого вторинного метаболіту. Таким чином, рівень кінцевого продукту на окремих ферментативних етапах вторинного метаболічного шляху зменшується, у той час як на інших етапах, навпаки, продукт накопичується, інгібуючи ферменти, що відповідають за утворення цього продукту. Це інгібування за принципом зворотнього в Зв'язку, у свою чергу, впливає на утворення кінцевого продукту всього вторинного метаболічного шляху. Отже, зміна рівня продуктів певного вторинного метаболічного шляху та пов'язаних з ними процесів досягається

Ф) завдяки застосуванню нових ферментів, що змінюють потік біохімічних речовин (тобто субстратів та їхніх ка продуктів) через цей шлях. Сторонні ферменти були експресовані в рослинних тканинах, спричиняючи метаболічний перерозподіл попередників в межах цих шляхів до речовин, які накопичуються без шкідливих 6о ефектів у рослинній клітині.

У деяких втіленнях у результаті застосування цього способу утворюються корисні продукти або продукти, що корисно діють на рослинну клітину.

В одному втіленні попередник-мішень змінюється завдяки додаванню нового ферменту. В одному кращому аспекті винаходу вибирається такий фермент, що має активність, сторонню для рослинної клітини, в якій він 65 експресується. Наприклад, такий фермент у звичайному стані не пов'язаний з вторинним метаболічним шляхом, що розглядається у рослинній клітині. Використовуваний фермент може мати рослинне, тваринне або мікробіологічне походження та може бути модифікований для належної експресії в рослинних клітинах.

Вибраний сторонній фермент здатний модифікувати попередник таким чином, щоб змінити його доступність при утворенні вторинного метаболіту. Використовуючи фермент, сторонній для клітини, в якій він експресується,

Можна обійти звичайні біохімічні механізми контролю та змінити вторинний метаболізм у передбачуваному напрямі. Особливий інтерес у межах цього винаходу викликає модифікація продуктів вторинного метаболічного шляху, що має відношення до вторинного метаболічного шляху цукрових спиртів та фенілпропаноїдів.

Додаткові приклади використання цього способу - зміна рівня модифікованих цукрових сполук, таких як галактоза та нехарчові цукрові глікозиди, такі як стахіоза та рафіноза. Галактоза перетворюється на /о гапактинол, який є одним з попередників утворення цих нехарчових цукрових глікозидів. Попередником галактози є кон'югована форма -- УДФ-галактоза. Як спосіб, у об'ємі цього винаходу можна розглянути запобігання утворенню та накопиченню УДф-галактози (та її наступному перетворенню у галактинол) завдяки використанню активності ферменту, стороннього для рослинних клітин, причому цей фермент здатен змінювати рівень УДФ-галактози. Фермент 4-епімераза УДФ-галактози (УГЕ) використовується на одному з головних етапів метаболізму галактози в живих системах. Він спричиняє перетворення УДФ-галактози на УДФ-глюкозу. Ген цього ферменту можна отримати з людини, дріжджів та бактерій. У цьому винаході передбачається використання ферменту, кодованого геном бактерій.

Внаслідок експресії цього стороннього ферменту в рослинній клітині може бути зменшена доступність

УДФ-галактози та утворена корисна речовина -- УДФ-глюкоза. Можна з упевненістю припустити, що експресія 4-епімерази УДФ-галактози призведе до зниження біосинтезу галактинолу, який є одним з попередників нехарчових цукрових глікозидів. Окрім зменшення швидкості накопичення небажаних цукрових глікозидів, активність уведеного ферменту може спричинити підвищену доступність УДФ-глюкози та внаслідок цього утворення цукрози. Остання, як очікується, буде брати участь та збільшувати активність інших метаболічних шляхів, для яких необхідна цукроза, або для джерела вуглецю для збільшення продуктивності рослини (тобто с ов Для білків, ліпідів, загального врожаю тощо) або безпосередньо для накопичення цукрози.

Проте у об'ємі цього винаходу можна розглянути також інші застосування даного способу. Існує можливість і) змінити рівень різних похідних цукрів, таких як глюкозо-1-фосфату та глюкозо-6-фосфату, використовуючи фермент фосфоглюкомутазу (ФГМ). Цей фермент викликає взаємоперетворення глюкозо-1- та глюкозо-6-фосфату (Глюкозо-1-Ф, Глюкозо-6-Ф) у синтезі та поглинанні цукрози. Він відіграє головну рольу су

Зо бинтезі та використанні цукрози, крохмалю та глікогену й присутній у всіх організмах. Ген цього ферменту можна отримати з великої кількості еукаріот, а також бактеріальних джерел (наприклад, Адгобасіегіит). ісе)

Глюкозо-6-Ф є головним вихідним матеріалом для великої кількості взаємоперетворень цукрів, одне зяких-- му синтез міосінозиту-1-Ф. Останній є головним субстратом та кофактором у синтезі фітинової кислоти та, відповідно, нехарчових цукрових глікозидів. Експресія ферменту, як можна очікувати, знизила б рівень о

Глюкозо-6-Ф, що знизило б рівень вищезгаданих нехарчових факторів. У такий спосіб у об'ємі цього винаходу ї- можна розглянути різноманітні метаболічні зміни.

Цей спосіб не обмежується будь-яким окремим вторинним метаболічним шляхом. Також він не обмежується будь-яким окремим видом рослини. Навпаки, цей спосіб може застосовуватися для зміни вторинних метаболічних шляхів, звичайних у багатьох економічно корисних видів сільськогосподарських культур, «

Включаючи одно- та дводольні, чи бути спрямованим на вторинний метаболіт, який має унікальне значення для в с окремої культури.

Біохімічна основа способу цього винаходу полягає в регулюванні активності ферментів за рахунок ;» доступності субстратів. Загалом, на швидкість ферментативних перетворень впливає доступність субстратів.

Інакше кажучи, фермент синтезує продукт у кількості, пропорційній кількості доступного субстрату. Зменшення

Концентрації субстрату викликає зменшення утворення продукту. Крім того, багато ферментів інгібуються -І кінцевим продуктом, тобто швидкість ферментативних перетворень зменшується у присутності великого надлишку кінцевого продукту. Отже, змінюючи рівень доступних субстратів чи ферментативних продуктів, можна о керувати загальним утворенням сполук, що утворилися біохімічним шляхом. с Прикладами вторинних метаболічних шляхів, що можуть бути змінені згідно з представленим винаходом, є біосинтез ізопреноїдів, біосинтез алкалоїдів, біосинтез терпеноїдів, біосинтез фенолів, біосинтез цукрових

Ме, спиртів або будь-який інший вторинний метаболічних шлях, в якому утворюються сполуки з нехарчовими або

Ге економічно корисними властивостями. До окремих вторинних метаболітів, що можуть бути змінені згідно з цим винаходом, відносяться нехарчові фенольні сполуки, такі як синапін або глюкозинолати у хрестоцвітих, продукти цукрових спиртів, такі як фітинова кислота або стахіоза та рафіноза, госипол у бавовнику, нікотин, в Хпорогенова кислота, конденсовані таніни або будь-який інший нехарчовий вторинний метаболіт. Хлорогенова кислота звичайно зустрічається в сої, бавовні, соняшнику та утворюється з кофеїнової кислоти -- сполуки, що

Ф) утворюється в межах фенілпропаноїдного шляху. Проте, до інших нехарчових сполук належать сапоніни -- ка нехарчові сполуки, що зустрічаються в багатьох рослинах, включаючи люцерну. Сапоніни -- це високомолекулярні глікозиди, що складаються з цукрової складової, приєднаної до тритерпену чи стероїду бо аглікону. Існують принаймні три класи відомих сапонінів: тритерпенові глікозиди, стероїдні глікозиди та стероїдні алкалоїдні глікозиди. Біосинтез сапонінів у рослинах засновується на вихідному матеріалі -- сквалені. Інші важливі класи вторинних метаболітів, такі як фітостерини, карденоліди, кукурбітацини, квасиноїди та лимоніди, також утворюються зі сквалену. Надлишок сапоніну у раціоні тварин пов'язаний зі станом, відомим як здуття. 65 У даному винаході показано застосування способу у великій кількості незалежних вторинних метаболічних шляхів. Однак застосовуваність способу модифікації будь-якого вторинного метаболічного шляху в рослин буде очевидною для кваліфікованого фахівця, та пропонується загальний спосіб втілення винаходу.

В одному втіленні цей винахід пропонує способи та композиції ДНК для зміни рівня синапіну та пов'язаних з ним фенольних сполук в рослинах. В іншому втіленні винахід пропонує рослинні клітини зі зміненим рівнем фенольних речовин та насіння рослин зі зменшеним рівнем фенольних речовин, зокрема хрестоцвіті рослини зі зменшеним рівнем синапіну. В іншому втіленні цей винахід пропонує способи та композиції ДНК для зміни рівня фітинової кислоти в рослинних клітинах (продукту вторинного метаболічного шляху цукрових спиртів). В іншому втіленні винахід пропонує рослинні клітини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти та насіння рослин зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. В іншому втіленні винахід пропонує насіння рослин зі зменшеним рівнем 7/0 Фітинової кислоти, придатне для харчового використання, насіння рослин зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для модифікованого борошна, та рослинні клітини зі зміненим метаболізмом цукрового спирту (інозит).

Кожен вторинний метаболічний шлях в рослинах має обмежену кількість пов'язаних з ним ферментів та субстратів для них, які самі є унікальними або використовуються в унікальний спосіб. Вторинний метаболічний /5 шлях може утворювати різні сполуки, що використовуються або присутні в усій рослині. Тобто, як засіб для зміни вторинного обміну речовин використовуються унікальні ферменти для специфічної зміни потоку сполук через певний шлях. Для ілюстрації використання способу було змінено два різні вторинні метаболічні шляхи.

Нижче представлено інформацію щодо цих процесів, яка допоможе повністю усвідомити природу цього способу. (А) Вторинний метаболічний шлях фенілпропаноїідів

Рослини синтезують велику кількість фенольних сполук через фенілпропаноїдний шлях, який є вторинним метаболічним шляхом. Фенілпропаноїдний метаболізм бере участь у багатьох фізіологічних процесах рослин, включаючи резистентність до захворювань, захист від ультрафіолетового випромінювання та регулювання росту рослини. Продукти цього процесу використовуються у біосинтезі лігніну та суберіну, які є компонентами рослинних тканин та беруть участь у формуванні рослинних волокон -- загальний термін, що стосується с об слабозасвоюваних вуглеводів зерна або борошна. Лігнін, як вважається, бере участь у формуванні нерозчинних волокон, отже, високий рівень лігніну зерна чи борошна пов'язаний з неефективним використанням зерна чи і) борошна одношлунковими тваринами. Отже, рослинні феноли, особливо фенольні попередники лігніну, можуть розглядатися як нехарчові фактори для корму тварин. Скорочення або належна зміна рівня рослинних фенолів, зокрема фенолів, що використовуються у формуванні лігніну, може створити корм вищого гатунку. с зо Рослинні феноли також причетні до формування різноманітних сполук, деякі з яких є також нехарчовими за своєю природою. ікс,

Винахід пропонує засіб зменшення рівня окремих фенольних сполук, які вважаються нехарчовими, в ю рослинних клітинах, насінні або борошні, що використовується для корму. Зокрема, у цьому винаході передбачається зменшення рівня гіркої нехарчової сполуки синапіну (або синапоїлхоліну) у рослинних клітинах, о які її синтезують. Також синапін, як вважається, об'єднується з білком у кормі, зменшуючи придатність білка ї- для засвоєння й використання твариною. Гіркий смак може також впливати на рівень споживання. Крім того, при годуванні деяких порід курей, що несуть яйця з коричневою шкаралупою, синапін викликає неприпустимий рибний запах у яєць. Кількість синапіну в кормі у цих випадках повинно утримуватись нижче 1095 і це обмежує використання корму, що містить синапін. Отже, скорочення синапіну у зерні або борошні з нього у хрестоцвітих « є важливою економічною задачею. в с Утворення синапіну відбувається як збільшення фенілпропаноїдного шляху. Шлях, визначений у цьому винаході, містить біохімічні шляхи, що приводять до утворення синапінової кислоти, а також біохімічні ;» процеси, що відгалужуються від різних етапів, такі як бічні шляхи, що приводять до формування мономерів лігніну та інших біохімічних речовин, похідних від продуктів фенілпропаноїдного шляху.

У фенілпропаноїдному шляху І-фенілаланін -- ароматична амінокислота, є субстратом ферменту -І фенілаланінамонійліази (ФАЛ). Ферментативна активність ФАЛ приводить до утворення коричної кислоти, яка є субстратом цинамат-4-гідроксилази (Ц4Г). Продукт ЦАГ -- це п-кумарова кислота, що є попередником багатьох о флаваноїдних сполук, причому деякі з них також можуть утворюватися з І-тирозину завдяки дії ферменту с тирозинамонійліази (ТАЛ). Кумарова кислота може також бути попередником біосинтезу лігніну. Фермент 5ор п-кумарат-З-гідроксилаза (КЗГ) діє на п-кумарову кислоту та утворює кофеїнову кислоту. Кофеїнова кислота

Ме, перетворюється кофеат/5-гідроксиферулат-О-метилтрансферазою (ОМТ) на ферулову кислоту. Ферулова

Ге кислота -- це один з трьох відомих основних фенольних мономерів, що беруть участь у біосинтезі лігніну.

Ферулова кислота також може бути субстратом ферменту ферулат-5-гідроксилази (Ф5Г), що утворює 5-гідроксиферулову кислоту, яка, у свою чергу, може бути перетворена ферментом ОМТ на синапінову кислоту. дв Сбинапінова кислота -- це другий головний фенольний мономер лігніну. Синапінова кислота також може бути кон'югована у формі синапоїлглюкози завдяки дії ферменту УДфФ-глюкози-синапоїлтрансферази (УГСТ).

Ф) Синапоїлглюкоза є субстратом для синапоїлглюкози : синапоїлхолінтрансферази (СХТ), що призводить до ка утворення синапоїлхолину або синапіну. Останні два етапи розповсюджені у хрестоцвітих; у Вгаззісаз синапін, накопичений у насінні, представляє головну неполімерну фенольну сполуку, знайдену в стиглому насінні. во Узагальнений процес фенілпропаноїдного метаболізму показано на Фіг.2. Слід зазначити, що у деяких видів рослин додаткові ферменти можуть бути частиною фенілпропаноїдного шляху.

Синапін або синапоїлхолін -- це найбільш поширена фенольна сполука в насінні хрестоцвітих; у В. париз він може складати до 495 борошна |Віайїг апа Кеїіспегі, 1984., 9. Зсі. Роод Адгіс. 35:29). Синтез синапіну відбувається у недостиглому насінні, яке зовні виглядає ще світло-зеленим, і, як вважається, не зазнає 65 деградації під час вистигання |Моодї еї. аі., 1993., Агсп. Віоспет. Віорпувз. 300: 622.

Проростання насіння (тобто, схожість насіння) зменшує рівень синапіну за рахунок дії естерази, яка розкладає його на синапінову кислоту та холін. Було припущено, але не доведено, що розкладення синапіну може надавати холін для синтезу фосфоліпіду протягом проростання насіння |Зігаск ейаїЇ., 1981., 7.

Маїипогеси. Збс: 215). Проте, оскільки більшість нехрестоцвітих рослин не містить синапіну в своєму насінні,

Малоймовірно, що синапін є основною сполукою для проростання насіння чи схожості насіння взагалі.

У Агарідорзіз ІНаіапа були виділені мутанти з дефектним загальним фенілпропаноїдним шляхом |СПарріеє еї. аІ,, 1992., Те Ріапі СеїЇ 4: 1413-1424). Ці мутанти являють собою чудовий матеріал для фізіологічних, біохімічних і генетичних досліджень, хоча не мають ніякої агрономічної цінності Через негативні наслідки мутації, що включають підвищену чутливість до ультрафіолетового випромінювання через прояв мутантного 7/0 фенотипу у всій рослині, особливо в листі. Ці мутанти, що позначаються 5ІМ1 (мутанти біосинтезу синапоїлмалату), блокують синтез ефірів синапінової кислоти, зменшуючи рівень синапіну (складного ефіру синапоїлхоліну) та змінюючи склад мономерів лігніну рослини. Зміна рівня лігніну може призвести до появи рослини з унікальним складом лігніну і, отже, зміненим волокном.

Спарріе еї аіІ. розглядають можливість використання мутантів типу ЗІМ1 для зменшення рівня лігніну або 7/5 Зміни рівня лігніну у важливих видах насіння хрестоцвітих, таких як насіння рапсу, але не визначають напрямку, у якому це можна здійснити. Також вказується, що скорочення синапіну в насінні рапсу є важливою метою, але не визначається спосіб, як це можна зробити, використовуючи мутацію 5ІМ1. З огляду на очевидну чутливість мутанта ЗІМІ1 до ультрафіолету, мутація не має великого значення для застосування у сільськогосподарських умовах. Однак хоча способи зниження вмісту синапінового компоненту у насінні не описані у існуючому рівні техніки, мутація ЗІМІ дає важливий науковий доказ того, що синапін не є основним компонентом росту та розвитку рослини, і що насіння зі зменшеним рівнем синапіну здатне до проростання й розвитку. Проте, мутація ЗІМІ не забезпечує способу зменшення рівня синапіну у сільськогосподарському виробництві зерна хрестоцвітих без супроводжуючої шкідливої чутливості до ультрафіолету.

На додаток до нехарчових фенольних сполук, таких як синапін, у формуванні лігніну приймають участь сч багато продуктів фенілпропаноїдного шляху. Біосинтез лігніну є складовою частиною загального фенілпропаноїдного шляху, у якому утворюється принаймні три основ ні фенольні попередники -- кумарова, і) ферулова та синапінова кислоти, продукти яких полімеризуються в лігнін та інші фенольні сполуки.

Біохімія формування лігнінів з цих попередників є складною; існує безліч інших ферментів, що беруть участь у цьому процесі, наприклад, О-метилтрансфераза кофеїнової кислоти/5-гідроксиферулової кислоти су зо «КОМТ), кофеоїл-КоА-редуктаза (ККОЛОМТ), дегідрогеназа цинамілового спирту (ДНЦ), цинамоїл-КоА-редуктаза (ЦКР), пероксидаза, 4-кумарат:КоА-лігаза (4АКЛ) та специфічна до коніферину р-глюкуронідаза (КБГ). Можуть ісе) бути задіяні інші ферменти, та біохімія формування лігніну у повному обсязі ще не є цілком зрозумілою. ю

Лігнін -- це складний полімер, головним чином складений з елементів мономерних фенольних сполук у різних пропорціях і з різними типами зв'язків у різних типах клітин та у різних видів рослин. Лігніни є о необхідними компонентами стінки рослинної клітини, у якій тканини зазнають механічного навантаження або ї- беруть участь у переносі води. Крім того, лігніни, як вважається, причетні до механізмів опору патогенам. У дводольних звичайно зустрічається гваяцил-сирингіллігнін, складений як з елементів гваяцилу, похідних ферулової кислоти, так і з залишків сирингілу, похідних синапінової кислоти. Таким чином, для формування лігніну довільного типу потрібні як синапінова, так і ферулова кислоти. Здатність до розкладу або переробки « деревини, наприклад при варінні целюлози, як вважається, у значній мірі залежить від складу мономерів шщ с лігніну, який базується насамперед на доступності окремих мономерів лігніну. Припускається, що присутність й групи 5-О-метилу в синапоїлпохідних сирингіллігнінах зменшує перехресне зшивання, що робить лігнін, "» складений насамперед з сирингілових елементів, більш легким для переробки, ніж лігнін, складений головним чином з гваяцилових елементів, похідних від ферулової кислоти. Таким чином, способи збільшення рівня сирингіллігніну можуть призвести до створення більш легко перетравлюваного корму внаслідок зменшення -і перехресного зшивання лігніну.

На перетравлення зернових фуражних культур впливає кількість волокна, тому що перехресно зшиті лігніни о стійкі до розкладення та фізично з'єднують між собою компоненти клітинної стінки. «сл З вищесказаного очевидно випливає, що будь-які спроби поліпшити зерновий корм за рахунок зменшення рівня або виключення синапіну та зміни загального рівня фенолів повинні бути спрямовані на насіння, що

Фо проростає. Щоб змінити біохімічний процес синтезу синапіну саме у насінні, найбільш придатним є молекулярний

ГЯ6) генетичний підхід, беручи до уваги нестачу ендосперму, що природно забезпечує низький рівень синапіну.

В одному втіленні у представленому винаході описується спосіб, що змінює рівень фенольних сполук у насінні і, також, змінює рівень синапінової кислоти і пов'язаних з нею фенольних сполук. Спосіб базується на введенні нових ферментів, що впливають на доступність сполук, які використовуються як попередники, і субстратів для ферментів у феніллпропаноїдному шляху. Вичерпання або зміна достатньої кількості цих сполук іФ) викликає біохімічну зміну нормального процесу та утворення іншої кількості різних фенілпропаноїдних продуктів. ко Прикладом застосування способу є новий фермент, холіноксидаза (ХО), що використовується для зменшення кількості холіну в рослинній клітині, особливо в насінні. Холін використовується, зокрема, для бо одержання синапіну з синапоїлглюкози. Зменшення кількості холіну спричиняє зміну рівня попередників синапіну (холіну й синапоїлглюкози) і тому змінює склад попередників, утворених на попередніх ферментативних етапах фенілпропаноїдного шляху, включаючи синапінову кислоту. Результат -- насіння з дуже зменшеним рівнем синапіну й зміненим фенольним вмістом. Відомо, що при окиснюванні холіну холіноксидазою утворюється перекис водню. Утворення перекису водню в рослинних клітинах вважається корисним, і тому виникає додаткова б5 перевага дії холіноксидаз на рослини. Як ілюстрація додаткового аспекту способу, другий фермент, бетаїн-альдегіддегідрогеназа (БАДГ), використовується для збільшення перетворення продукту холіноксидази,

бетаїнальдегіду, на гліцинбетаїн, який використовується як засіб захисту від стресу. Складний бетаїн є корисним як сполука для різного застосування у харчовій промисловості і як добавка для посилення росту рослин.

Таким чином, корисний ефект зміни фенольного рівня в рослинних клітинах і, зокрема, зменшення рівня синапіну є очевидним, завдяки зменшенню єдиного попередника у фенілпропаноїдному шляху. Фахівцеві ясно, що у межах способу для зміни різноманітних інших кінцевих продуктів у фенілпропаноїдному шляху можуть бути використані інші ферменти.

Інший приклад у межах представленого винаходу -- використання нового ферменту для розкладення 7/0 ферулової кислоти, що також утворюється у фенілпропаноїдному шляху. Серед трьох головних мономерів лігніну ферулова кислота, як вважається, забезпечує механічну твердість та міцність стінок клітини завдяки перехресно зшитим ланцюгам пентози, арабіноксиланам та геміцелюлозам, роблячи клітинні стінки більш твердими та менш чутливими до ферментативного розщеплення. Таким чином, як компонент лігніну, ферулова кислота відіграє важливу роль у механічній міцності тканин рослини. Зменшення рівня ферулової кислоти у відповідний спосіб може призвести до багатьох корисних наслідків.

Ферулова кислота синтезується у межах загального фенілпропаноїдного шляху, як описано вище, і служить попередником для різних продуктів процесу |див. УРМ Козаглга еї. аїЇ., доигпа! ої Іпаивігіаї Місгтобіооду 15: 457-471, 1995); (К. МУпейеп апа К. Зедегоїї, Ріапі Се 7: 1001-1013, 1995); (КА Оіхоп апа Мі. Раїма, 1995,

Ріапі Сеї! 7: 1085-1097, 1995).

Представлений спосіб забезпечує засіб зміни рівня ферулової кислоти і за рахунок цієї зміни вироблення різних інших сполук у фенілпропаноїдному шляху, зокрема синапіну. У одному аспекті представленого винаходу описується спосіб, завдяки якому змінюється рівень ферулової кислоти в рослинних клітинах. Спосіб базується на сторонніх ферментах, що розкладають ферулову кислоту. Деякі ферменти також можуть виробляти сполуки, що застосовуються економічно. Наприклад, використовується фермент декарбоксилаза ферулової кислоти, що с г Виробляє сполуку вінілтваякол, яка може використовуватися як промислова сировина та може накопичуватися в рослинних клітинах без шкідливого ефекту. Вичерпання або зміна достатньої кількості ферулової кислоти і) викликає біохімічну зміну нормального фенілпропаноїдного шляху та утворення іншої кількості різних фенілпропаноїдних продуктів.

Спосіб згідно з винаходом не обмежується фенілпропаноїдним процесом. Як приклад застосування цього с зо винаходу наводиться модифікація вторинного метаболічного шляху, в якому утворюються цукрові спирти. (Б) Вторинний метаболічний шлях цукрових спиртів ісе)

Цей винахід також пропонує способи та композиції ДНК для зміни рівня цукрових спиртів в рослинних ю клітинах. В результаті застосування способу згідно з цим винаходом у рослинних клітинах змінюється рівень сполук, похідних від цукрових спиртів, наприклад фітинової кислоти, стахіози, рафінози, цукрозилглікозидів, о уронідів та пентоз, фосфоїнозитидів та глікофосфокерамідів. У результаті, в деяких реалізаціях винаходу ї- одержують насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. У винаході також пропонується насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для застосування у кормі, насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для виготовлення модифікованого борошна та рослинні клітини зі зміненим механізмом інозитового метаболізму. Також цим способом змінюється рівень інших сполук, похідних від метаболізму цукрових спиртів, « 470 таких як стахіоза та рафіноза. Особливо корисним для застосування у кормі є насіння зі зміненим рівнем фітату. з с Фітат є важливим компонентом багатьох видів насіння, типово складає 2--495 маси насіння, але може у деяких видів сягати рівня 1095. Високий рівень фітату в кормовому раціоні пов'язаний з втратою апетиту, ;» зменшеним розміром приплоду та іншими негативними факторами. Ці ефекти, можливо, виникають через здатність фітату зв'язувати цинк. Комплекси фітинової кислоти з іншими компонентами насіння взагалі позначаються як фітин. Високий рівень фітину також пов'язаний з негативними ефектами. -І Окрім шкідливого впливу на ефективність корму, присутність фітинової кислоти в кормовому раціоні також викликає велику кількість небажаних наслідків у довкіллі У моношлункових тварин фосфор, зв'язаний з о фітиновою кислотою, взагалі недоступний, тому до раціону треба додавати фосфор, що спричиняє додаткові с витрати. Фосфор, зв'язаний з фітиновою кислотою, виділяється моношлунковими тваринами, та наступне розкладення фекалій мікроорганізмами призводить до потрапляння в навколишнє середовище фосфору, що

Ме, міститься в фітиновій кислоті. Високий рівень фітинової кислоти в багатьох зернових кормах спричиняє значну

Ге кількість фосфору, що виділяється. Тривале збільшення поголів'я худоби часто викликало заростання водойм та інші проблеми навколишнього середовища, пов'язані з фосфорним забрудненням. Як очікується, ці проблеми будуть ставати значнішими й можуть стати головним обмеженням для збільшення поголів'я худоби в майбутньому. Таким чином, способи зменшення рівня виділення фітинової кислоти суттєво вплинуть на вирішення проблем навколишнього середовища.

Ф) Хоча фактичні витрати, пов'язані з додаванням фосфору до раціону, не складають істотної частини витрат на ка корми, наслідки для довкілля внаслідок забруднення фосфором, що виділяється, викликають значні додаткові витрати, яких можна було б уникнути завдяки виробництву борошна з низьким рівнем фітату. во У жуйних тварин присутність мікробної фауни в рубці може викликати вивільнення фосфору, що міститься у фітиновій кислоті, і тому фосфор стає більш доступним. У результаті кількість доданого фосфору в раціоні значно зменшується в порівнянні з моношлунковими тваринами. Проте, кількість фітинової кислоти в більшості насіння рослин перевищує фактично необхідну, тому навіть у жуйних тварин фосфорне забруднення є головною проблемою. 65 Досі основні способи зменшення фітату були в значній мірі спрямовані на розкладення фітату дією ферментів фітаз, які входять до складу корму. Хоча цей спосіб приводить до більшої доступності фосфору, він непридатний для виробництва зерна чи корму зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, а тільки для корму, в якому фосфор, що міститься в фітиновій кислоті, взагалі є більш доступним. Таким чином, спосіб з використанням ферменту фітази знаходить застосування тільки для надання фосфору у фітиновій кислоті більшої доступності.

Діяльність фітази звичайно спостерігається у таких мікроорганізмів, як плісень (Азрегаїїйв), бактерії (Васійив5, Рзепдотопаз) та дріжджі (Засспаготусев). Видалення фітатів цими рослинними матеріалами за допомогою сумішей ферментів, що містять мікробну фітазу, описується наприклад, в патенті США Мо5554399,

Більшість мікроорганізмів синтезує велику кількість різновидів фітази, що можуть включати саму фітазу разом з усілякими фосфатазами, що далі розкладають фітинову кислоту. Повне вивільнення доступного фосфору з 7/0 фітинової кислоти може залежати від ряду різних дій ферментів.

Також описується альтернативний варіант перетворення рослин для вироблення мікробної фітази. У патенті

США Мо5593963 описується дія фітази у трансгенних рослинах під контролем регулюючих послідовностей, які здатні спрямовувати експресію ферменту або постійно, або специфічно до етапу процесу чи тканино-специфічно. Можуть бути створені рослинні клітини або, конкретніше, клітини насіння рослин, які /5 Містять фермент фітазу, що може вивільнити частину фосфору, який міститься в фітиновій кислоті.

Однак, просте вивільнення фосфору з фітинової кислоти не повністю вирішує проблему скорочення відходів фосфору й потенційних нехарчових ефектів фітинової кислоти. Більш важлива присутність комплексної фітинової кислоти або фітату не зменшується. У літературі відомі засоби вивільнення фосфору з фітинової кислоти, але не існує засобу керування рівнем фітинової кислоти, що виробляється.

Будь-який засіб, за допомогою якого можна було б зручно керувати рівнем фітинової кислоти, був би дуже корисним при виробництві кормів. Наприклад, насіння рослин із зменшеним рівнем фітинової кислоти дало б можливість створити корм з більшою засвоюваністю мінералів. Насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти також дало б зерновий корм зі зменшеним рівнем фітину, що завдяки цьому був би більш поживним та легкотравним через зниження рівня комплексів фітинової кислоти. сч

Окрім борошна з підвищеною цінністю, борошно зі зменшеним рівнем фітинової кислоти спричинили б зменшення потрапляння фосфору у навколишнє середовище й менше забруднення. Хоча засоби вивільнення і) фосфору з фітинової кислоти можуть знизити рівень доданого й виділеного фосфору, фактичний рівень фітинової кислоти та, отже, потенційно доступного фосфору перевищують потреби фосфору в їжі для більшості тварин. с зо Таким чином, способи керування рівнем фітинової кислоти знайдуть використання у застосуванні кормів і, крім того, дозволять створити нове та корисне борошно і харчові композиції. ісе)

З урахуванням цих обставин очевидно, що засіб, який дозволив би керувати виробленням фітату протягом ю проростання насіння, міг би бути корисним та дозволив вирішити проблеми, пов'язані з фосфорним забрудненням та нехарчовими ефектами фітинової кислоти. Крім того, був би особливо корисним генетичний о з5 Механізм, який можна було б застосовувати у широкому діапазоні видів рослин. Представлений винахід надає (М такі рішення.

Для оцінки можливостей представленого винаходу потрібне розуміння біохімічного механізму, відповідального за формування фітинової кислоти. Хоча біосинтез фітинової кислоти цілком не з'ясований, відома велика кількість ключових етапів. Фітинова кислота є гексафосфатною похідною міоінозиту; біохімічний « процес, що синтезує фітинову кислоту, використовує міоїнозит - цукровий спирт, винятково як початковий в с субстрат. Ця сполука (міоїнозит, що також звичайно позначається як інозит) є також ключовою у виробленні . інших похідних та епімерів міоінозиту. Деякі з цих похідних, наприклад глікозиди сахарози, також є а нехарчовими сполуками, тому зменшення їхнього рівня також є бажаним.

Міоінозит являє собою цукровий спирт, що зустрічається скрізь у рослинних клітинах. Однак простий захист

Кожної з гідроксильних груп міоінозиту робить його непридатним для біосинтезу фітинової кислоти та інших -І процесів. Захист міоіїнозиту можна здійснити іп мімо шляхом метилування окремих місць різними метил-трансферазами. Наприклад, міоінозит перетворюється на ононітол шляхом монометилування у положенні о б. Метилування у положенні 5 утворює секвоїтол, що епимеризується у пінітол. Пінітол не може с використовуватися для біосинтезу фітинової кислоти. Метильовані похідні міоїнозиту, як відомо, надають рослині корисних властивостей, як наприклад, стійкість до стресів, та беруть участь у перенесенні розчинів та

Ме, стабілізації білків мембрани. Таким чином, модифікація інозиту за допомогою неспецифічних ферментативних

Із дій, звичайно не пов'язаних з метаболізмом цукрових спиртів, розглядається в межах цього винаходу.

Біохімія формування фітату ще не цілком зрозуміла, але відомі принаймні два потенційних процеси формування, та, скоріш за все, існує велика кількість різних ферментів, що беруть участь у біосинтезі дв Ффітинової кислоти. Фітат знайдено у більшості рослинних тканин, однак він особливо поширений в насінні й пилку, що грає передбачену роль у збереженні фосфору. Тому важко винайти засіб для зміни біосинтезу фітату

Ф) звичайним шляхом, зокрема з тої причини, що біохімія його формування ще не з'ясована. ка Для мінімізації вироблення фітинової кислоти у цьому винаході описуються способи й композиції ДНК, що кодують ферменті(и), які модифікують міоінозит, запобігаючи його використанню у біосинтезі фітинової кислоти. бо У цьому винаході передбачається використання стороннього гена метилтрансферази для вибіркового метилування міоінозиту в насінні, зокрема в тканинах насіння, відповідальних за біосинтез фітинової кислоти (під стороннім розуміється фермент, звичайно не пов'язаний з біосинтезом фітату в цій рослинній клітині). У винаході використовують сторонній фермент, отриманий від галофітної рослини, який не знайдено в звичайних сільськогосподарських рослинах, таких як зернові, соя, бавовник, люцерна, пшениця, ячмінь, жито, сорго, 65 Соняшник, олійні культури Вгаззіса та інші традиційно вирощувані культури.

Вироблення метилового інозиту з місінозиту також становить додаткову вигоду утворення нешкідливої сполуки без шкідливого ефекту для рослинної клітини. Таким чином, завдяки зменшенню кількості доступного міоїнозиту зменшується вироблення фітинової кислоти.

Фітат - один з головних нехарчових факторів у зерновому кормі. До нехарчових ефектів фітинової кислоти відносяться зв'язування мінералів, утворення комплексних сполук з білком та інші негативні ефекти, зокрема пов'язані з викидом надлишку фосфору у формі фітинової кислоти, яка перетворюється у навколишньому середовищі, викликаючи фосфорне забруднення. Таким чином, способи зменшення рівня фітинової кислоти в рослинних клітинах знаходять застосування для кормів. В аквакультурі високий рівень фітинової кислоти також становить головну проблему при використанні білка рослинного походження як заміни борошна для риб. Тому 70 способи зменшення рівня фітинової кислоти у рослинних клітинах, особливо в клітинах тканин, що використовуються для корму, є корисними та можуть знайти широке застосування. Способи зменшення рівня фітинової кислоти у насінні у широкому діапазоні видів рослини, що використовуються для корму, особливо корисні для кормової промисловості.

Рослинний ген, що кодує міоінозит-О-метил-трансферазу (ІМТ), був виділений з Мезетргуапіпетит 7/5 бгузіайпит (кришталевої трави) і було показано, що цей фермент перетворює міоіїнозит на пінітол у гетерологічних трансгенних рослинах |Патент США Мо 5 563 324). Цей рослинний ген був підданий контролю конститутивного промотору з метою підвищення стійкості до стресів у рослин шляхом надмірного вироблення метильованої похідної міоїнозиту, ононітолу, що згодом може епімеризуватися у пінітол. У цьому винаході рослинний ген піддається контролю селективного до насіння промотору для зміни метаболізму інозиту в насінні.

Вироблення пінітолу, описане в патенті США Мо5563324, як було показано, збільшувало стійкість до солі при конститутивній дії на трансгенний тютюн. Подібно до цього, конститутивна дія бактеріальної 1-Р. дегідрази манітолу на рослинну клітину викликає утворення манітолу, цукрового спирту, або поліолу, та надає клітині стійкості до солі. Отже, в патенті США Мо5563324 описується вироблення цукрових спиртів за допомогою ферменту, здатного до утворення цукрових спиртів з цукрів, притаманних рослинним клітинам, як засіб надання с об рослинним клітинам стійкості до солі.

Проте патент США Мо5563324 не містить ніяких пропозицій щодо використання гена, здатного до модифікації і) міоїнозиту, щоб запобігти його використанню як попередника для інших сполук, що включають його власні похідні. Однак патент США Мо5563324 ясно показує, що модифікація міоїнозиту не призводить до будь-яких негативних ефектів для рослини, і тому маніпуляції з рівнем міоінозиту, як очікується, не призведуть до с зо шкідливих ефектів.

Відповідно, можливість модифікації міоїнозиту геном метил-трансферази, ймовірно, не буде шкідливою для со рослинних клітин та метильований продукт цієї ферментативної реакції, як відомо, не є шкідливим для ю рослинних клітин.

Проте міоіїнозит є ключовим у багатьох різних аспектах росту та розвитку рослини. На додаток до його ролі о зв попередника для біосинтезу фітинової кислоти, міоїнозит також використовується для біосинтезу пентози та ї- уронідів, він також присутній у фосфоїнозитидах мембран рослинних клітин, а також в інших складних ліпідах рослин, включаючи глікофосфокераміди. Крім того, він також є попередником інших природних ізомерів інозиту, причому багато з них, а також міоінозит, розповсюджені як метилові ефіри специфічним для виду способом в усьому рослинному світі. «

Роль міоінозиту в загальному обміні речовин у рослин є значною, та модифікація рівня міоїнозиту може мати пт») с непередбачені наслідки, особливо в агрономічних умовах. Хоча в патенті США Мо5563324 описується . конститутивна дія гена метил-трансферази, він не дає ніяких доказів, що отримані в результаті рослини будуть и?» корисними. У патенті США Мо5563324 зазначено: "Навіть якщо нововставлені гени не спричинять більшої ефективності рослини в сільськогосподарських умовах, трансгенні рослини, що містять такі гени, будуть застосовуватися для дослідження того, як зміни внутрішніх процесів у рослині (наприклад, осморегуляція) -І впливатимуть на врожайність рослин." (стовпець 2, рядки 60-65). Отже, в патенті США Мо5563324 не передбачається керування рівнем міоінозиту для зменшення рівня фітинової кислоти та не очікується безумовно, о що результатом описаних в ньому досліджень будуть рослини з корисними агрономічними характеристиками. с Також в патенті США Мо5563324 описується дія гена, модифікуючого міоіїнозит у всій рослині, з метою підвищення стійкості до стресів або для подальших наукових досліджень.

Ме. Таким чином, можна з впевненістю зазначити, що в представленому винаході пропонується зовсім новий

Ге підхід до зменшення рівня фітинової кислоти. Використання гена метил-трансферази є специфічним для зменшення рівня фітинової кислоти. Представлений винахід не стосується вже відомих способів, таких як дія ферментів фітази, які не вирішують проблему надлишку фітинової кислоти в насінні та/або зерновому борошні. У в Ході виконаної роботи було встановлено, що рівнем фітинової кислоти можна керувати, змінюючи рівень міоїнозиту, доступного для біосинтезу фітинової кислоти. Було виявлено, що дія гена метил-трансферази на

Ф) тканину насіння призводить до зменшення рівня фітинової кислоти в насінні без будь-яких помітних змін в інших ка характеристиках рослини. Очевидно, що обмеження вираження дії гена метил-трансферази на тканини насіння, відповідальні за біосинтез фітату, значно зменшує рівень фітинової кислоти в стиглому насінні без будь-яких бор додаткових впливів на рослину, навіть вирощену в екстремальних польових умовах. Використання селективного до тканини промотору пропонує багато переваг щодо відомих способів, включаючи обмеження дії ферменту на тканину насіння при збереженні метаболізму міоінозиту в інших тканинах.

Мета представленого винаходу полягає в тому, щоб запобігти використанню міоінозиту як вихідного матеріалу для біосинтезу фітинової кислоти шляхом переведення його до метаболічного процесу, у якому він 65 перстворюється на нешкідливі для рослини сполуки. Цей спосіб базується на нових діях ферментів, включаючи, в одному втіленні, ген метил-трансферази, який вичерпує чи змінює кількість міоїнозиту, що використовується для вироблення фітинової кислоти. Вичерпання або зміна рівня цього попередника викликає біохімічну зміну нормального процесу біосинтезу фітинової кислоти та зменшення кількості фітинової кислоти, що утворюється.

Біохімічна основа цього винаходу виходить з концепції регулювання активності ферменту завдяки доступності субстратів. Взагалі, на ефективність ферментів впливає доступність субстратів. Інакше кажучи, фермент виробляє продукт у кількості, пропорційній до кількості доступного субстрату. Зменшення концентрації субстрату викликає менший темп утворення продукту.

Таким чином, в представленому винаході використовується перевага цього підходу шляхом застосування нового ферменту, метил-трансферази, який вичерпує доступність інозиту - субстрату, що використовується для 7/0 Формування фітинової кислоти. Будь-які ферменти, здатні впливати на кількість міоінозиту в насінні рослин, можуть використовуватися в рамках представленого винаходу. Спосіб базується на дії ферменту, що в будь-якій кількості випадків змінює рівень міоінозиту, використовуваного для біосинтезу фітинової кислоти.

На відміну від патенту США Мо5563324, представлений винахід передбачає модифікацію вироблення фітату у насінно-селективний спосіб шляхом дії гена, здатного до модифікації міоїнозиту, роблячи його непридатним /5 для вироблення фітинової кислоти. Дивно, але навіть некерована дія гена, що змінює міоінозит, викликає зменшення рівня фітату в насінні. Проте в найбільш прийнятній реалізації представленого винаходу використовується селективний до насіння промотор, щоб гарантувати, що агрономічна ефективність рослини не ставиться під загрозу та отримана в результаті рослина буде нормальною з будь-якого погляду, за винятком зменшеного рівня фітату в насінні. Тому, на відміну від патенту США Мо5563324, представлений винахід не передбачає отримання ані рослин з підвищеною стійкістю до стресів, ані рослин для дослідних цілей.

Описаний спосіб пропонує багато переваг над відомими способами, пов'язаними зі зменшенням рівня фітинової кислоти завдяки дії ферментів фітази. До цього відносяться рослини зі зміненим рівнем фітинової кислоти в окремих тканинах, рослина з насінням зі зменшеним рівнем фітинової кислоти та зерновий корм зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. Переваги таких рослин, насіння та борошна включають краще сч об Використання корму та харчову ефективність, виготовлення борошна та корму зі зниженим рівнем фосфору і, отже, кращі екологічними показниками, та здатність до використання в кормовій промисловості, що раніше було і) обмежено кількістю нехарчової фітинової кислоти в борошні чи кормі.

Описаний спосіб є корисним для багатьох видів рослин, включаючи однодольні та дводольні рослини, а також як зернові, так і олійні культури. Особливу застосовуваність він являє для олійного насіння та с зо хрестоцвітих рослин.

Результатом цієї генетичної модифікації є рослинні клітини зі зміненим метаболізмом цукрових спиртів, ісе) зокрема метаболізмом інозиту, та рослинні клітини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, зокрема насіння зі ю зменшеним рівнем фітату. Таким чином, спосіб згідно з даним винаходом пропонує корисний засіб зміни вторинного метаболізму стосовно цукрових спиртів. о

Хоча втілення цього винаходу, що заподіює зміну метаболізму цукрових спиртів, наприклад, рослинні клітини ї- зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, продемонстровано на рослинних клітинах рапсу, зернові рослини також мають високу концентрацію фітинової кислоти і зменшення рівня фітинової кислоти в клітинах зерна може бути досягнуто подібним шляхом.

У представленому винаході пропонуються способи, генетичні конструкції та вектори, що застосовуються для «

Модифікації рівня фітату в рослинних клітинах та насінні, особливо для зменшення рівня фітату в рослинних з с клітинах. Винахід також пропонує способи і композиції ДНК, що застосовуються для зменшення рівня фітату в . насінні рослини. Крім того, винахід стосується модифікованого борошна з насіння та корму для тварин, що и?» містить модифіковане борошно, особливо борошно зі зменшеним рівнем фітату.

Зменшення рівня фітинової кислоти здійснюється з використанням недавно описаних методів і сумішей ДНК.

Спосіб включає розробку "метаболічного обхідного шляху" або нового біохімічного процесу, здатного до -І відведення попередника в процесі біосинтезу фітинової кислоти до нового та нововведеного "тупикового шляху", який зменшує вироблення фітинової кислоти. У результаті однієї реалізації цього способу "тупиковий шлях" 1 виробляє сполуки, які, як відомо, нешкідливі для цієї рослинної клітини. Таким чином, можна з впевненістю с зазначити, що обхідний процес перетворення сполук-попередників міоїнозиту в ці сполуки не є загрозою

Життєдіяльності рослини.

Ме, Згідно з іншою реалізацією винаходу пропонуються вектори та конструкції рекомбінантних ДНК для створення

Ге рослинного насіння зі зміненим рівнем фітинової кислоти, зокрема рослинного насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. Крім того, в іншому втіленні винаходу пропонується рослинне насіння, корисне для виробництва зернового борошна зі зменшеним рівнем фітату. Це борошно містить зменшений рівень фітату і, ов отже, є корисним для застосування для тварин, особливо для тих галузей, де рівень фітинової кислоти пов'язаний з забрудненням довкілля або визначений як нехарчовий фактор. У винаході також пропонується (Ф, модифіковане борошно, отримане з генетично зміненого насіння, що може використовуватися в різних тваринних ка раціонах, у тому числі для свійської птиці, свиней, рогатої худоби та риби.

Спосіб включає додання нового ферменту, який може змінювати рівень міоіїнозиту в насінні і може во безпосередньо застосовуватися для всіх видів та різновидів рослин. Один і той самий ген може використовуватися для будь-якого виду рослини, тому що зміна міоінозиту відбуватиметься в однаковий спосіб у будь-якій рослині. Спосіб не базується на використанні технологій супресії гена, які залежать від послідовності ДНК і тому вимагають конкретно пристосованих генів для кожного окремого гена чи виду рослини.

Таким чином застосування представленого винаходу для всіх культур є очевидним. У рамках способу можуть 65 Використовуватися численні придатні ферменти мікробного, рослинного чи тваринного походження. В різноманітних видах рослин можуть використовуватися одні і ті самі генетичні конструкції.

Таким чином, беручи до уваги широкий аспект представленого винаходу, в ньому пропонується спосіб зменшення рівня фітату в насінні рослин, що складається з побудови вектора перетворення рослини, який, на додаток до маркера з можливістю перемикання, що дозволяє ідентифікувати рослинні клітини, перетворені цим вектором, містить фермент, здатний до метаболізації міоінозиту, що робить його непридатним для утворення фітинової кислоти.

У контексті представленого винаходу, метаболізація інозиту включає гідроксилювання, ізомеризацію, метилування, розщеплення або будь-яку іншу біохімічну модифікацію, яка робить міоїнозит нечутливим до впливу відповідних ферментів, які звичайно діють на міоїнозит з метою одержання фітинової кислоти. Отже, до 70 метаболізації відноситься будь-яка модифікація, що ефективно зменшує доступність міоінозиту з сукупності доступних субстратів для біосинтезу фітинової кислоти.

Як приклад представленого винаходу застосовується ген, що кодує метил-трансферазу міоінозиту. Цей фермент, під контролем промотору, селективного до дії в клітинах насіння рослини, здатен до вичерпання кількості міоїнозиту, доступного для вироблення фітату в цьому насінні. В іншому аспекті представленого /5 винаходу, ця метил-трансфераза здатна до перетворення міоінозиту на нешкідливу речовину.

Отже, взагалі рослинні клітини, створені способом згідно з представленим винаходом, зберігають незмінний основний метаболізм та мають фенотипи, що не відрізняються від немодифікованих рослин, за винятком зміни продукту чи продуктів в окремому процесі вторинного метаболізму.

Щоб гарантувати, що основний метаболізм залишається незмінним, у цьому винаході описується спосіб, го специфічно для тканини спрямований на формування вторинного метаболіту шляхом зміни доступності субстрату, специфічного для вторинного метаболічного процесу та важливого для утворення кінцевого продукту цього процесу, зокрема субстратів у одному-п'яти біохімічних етапах формування кінцевого продукту. Завдяки цьому досягається зменшення кількості окремих продуктів у процесі вторинного метаболізму.

В контексті представленого винаходу до сполук, що використовуються як попередники продуктів вторинного с ов процесу фенілпропаноїдного метаболізму, відносяться, але не обмежені ними, корична кислота, п-кумарова кислота, кофеїнова кислота, ферулова кислота, 5-гідроксиферулова кислота, синапінова кислота, холін, різні і) сполуки синапоїлу, що включають, але не обмежені ними, синапоїл-глюкозу та синапоїл-малат, а також холін синапоїлу. У контексті представленого винаходу до продуктів фенілпропаноїдного шляху відносяться, але не обмежені ними, флавоноїди, лігніни, різні мономерні та полімеризовані фенольні сполуки і синапін. Шляхом с зо вибору специфічного ферменту можна досягти будь-якої кількості змін рівня продуктів в фенілпропаноїдному шляху. Ферменти, що використовуються для модифікації сполук-попередників, можуть мати мікробне, тваринне ісе) або рослинне походження. Ферменти можуть бути природними або отриманими за допомогою мутації відомих му ферментів, щоб змінити їхню специфічну дію на субстрат, а отже, створити новий фермент.

Ферменти, що використовують в представленому винаході, можуть бути здатні до модифікації сполук, що о з5 Використовуються як попередники продуктів, які утворюються в фенілпропаноїдному шляху, шляхом ча ізомеризації, сполучення, фосфорилування, гідроксилювання, окиснення, дегідрогенізації, метилування або будь-якої іншої подібної біохімічної операції (включаючи зв'язування або секвестрацію), або можуть включати ферменти, здатні до руйнування сполук, що використовуються як попередники у фенілпропаноїдному шляху, наприклад, гідролази, декарбоксилази, оксидази, естерази або будь-які інші ферменти, здатні до розкладання « Коричної кислоти, п-кумарової кислоти, кофеїнової кислоти, ферулової кислоти, 5-гідроксиферулової кислоти, Ше) с синапінової кислоти, синапоїл-глюкози, синапоїл-малату або холіну (що використовується для утворення . синапіну з синапоїл-глюкози). В одному аспекті способу використовуються ферменти, що виробляють речовини, а що захищають від стресу, зі сполук, що використовуються як попередники звичайних продуктів фенілпропаноїдного шляху. Подібно цьому, фермент для специфічного зменшення кількості додаткового субстрату, що не виробляється як частина фенілпропаноїдного шляху, але потрібен для утворення продукту -І фенілпропаноїдного шляху, може використовуватися для зменшення рівня цього продукту. Відповідно, як сполуки, що використовуються як попередники у фенілпропаноїдному шляху, так і будь-яка інша сполука, о потрібна у фенілпропаноїдному шляху для утворення продуктів, може розглядатися в рамках представленого с способу.

В контексті представленого винаходу до сполук, що використовуються як попередники продуктів вторинного

Ме, процесу метаболізму цукрових спиртів, відносяться, але не обмежені ними, міоінозит, галактинол та УДФ-похідні

Ге цукрів. До продуктів метаболізму цукрових спиртів, відносяться, але не обмежені ними, фітинова кислота, стахіоза, рафіноза, цукрозил-глікозиди, уроніди та пентози, фосфоїнозитиди та глікофосфокераміди. У контексті представленого винаходу ферменти, що використовуються для зміни сполук метаболізму цукрових спиртів, дв Можуть бути здатні до гідроксилювання, ізомеризації, метилування, розщеплення або будь-якої іншої біохімічної модифікації (такої як зв'язування або секвестрація), яка робить цукровий спирт нечутливим до впливу (Ф) відповідних ферментів, які звичайно діють на нього. У прикладі представленого винаходу в рамках вторинного ка процесу метаболізму цукрових спиртів показано метилування інозиту, який є попередником фітинової кислоти, з метою зменшення доступності інозиту для біосинтезу фітинової кислоти. во Таким чином, фахівцеві очевидно, що попередники кінцевого продукту в процесі вторинного метаболізму є тими біохімічними речовинами, що використовуються безпосередньо для формування вторинного метаболіту, або тими біохімічними речовинами, що використовуються в біохімічній реакції, яка веде до формування окремого вторинного метаболіту, та що ці біохімічні речовини не є основним и метаболітами.

Ферменти, що діють на сполуки, які функціонують як попередники продуктів у вторинному метаболічному 65 процесі, переважно утворюють з вищезгаданих сполук речовини, що є безпечними для рослинної клітини і тому можуть накопичуватися до високого рівня без зміни властивостей рослинної клітини. Ферменти можуть також утворювати речовини, що корисно впливають на рослинну клітину, наприклад, виробляють з цих сполук-попередників продуктів вторинного метаболізму речовини, що захищають від стресів. Використовувані ферменти можуть також утворювати речовини, що застосовуються, наприклад, як промислова сировина, фармацевтичні чи лікувально-харчові речовини. У рамках представленого винаходу можуть застосовуватися один або кілька ферментів та кілька різних властивостей може використовуватися для зменшення рівня окремих сполук-попередників продукту у процесі вторинного метаболізму.

Ферменти, що використовуються в контексті представленого винаходу, можуть бути отримані з багатьох джерел або багатьма методами. Наприклад, можна ідентифікувати сполуку-попередник продукту у процесі 7/0 вторинного метаболізму, на яку повинен бути спрямований представлений винахід. Хімічна структура цих сполук добре відома або може бути визначена, отже, можна проаналізувати літературу щодо ферментів, щоб визначити фермент з відомою дією на хімічно подібних субстратах. Відповідно, можна ідентифікувати придатний фермент та виділити ген і використати його в контексті представленого винаходу. Додатково для отримання синтетичного гену може використовуватися комбінаторна хімія або подібні схеми, що відшукують штучні білки з бажаною /5 властивістю. Ферменти, що використовуються в рамках представленого винаходу, можна змінити за допомогою загальноприйнятних в даній галузі методів.

Як приклад модифікації ферменту, ген, що кодує фермент, здатний до дії на хімічно подібні сполуки, які використовуються як попередники у процесі вторинного метаболізму, можна модифікувати та/або вибрати для підвищеної активності, використовуючи такі способи, як сайт-специфічна модифікація, мутація та селекція Змінених особливостей у неспецифічних системах, наприклад бактеріальних чи грибних клітинах. Це може включати експресію гена, що кодує цей змінений фермент у бактеріальних клітинах, щоб зробити його нездатним перетворювати вищезазначені речовини, селекцію бактерій, що виробляють цей фермент та здатні рости на вищезазначених сполуках, використовуючи їх як єдине живильне середовище або джерело вуглецю, та відновлення активності ферменту, здатного до дії на окрему сполуку-попередник у процесі вторинного сч метаболізму. Таким чином, можливо створити фермент зі специфічною дією на окрему сполуку, що використовується як попередник у конкретному процесі вторинного метаболізму. Також можна вивести бактерії, і) які будуть рости на різних сполуках, що використовуються як попередники у процесі вторинного метаболізму.

Фахівець може легко здійснити селекцію мутованих бактерій або інших клітин на окремих сполуках, що використовуються як попередники у процесі вторинного метаболізму, та засіб визначення специфічних с зо ферментів, здатних до перетворення цих сполук у нешкідливі речовини. Цей підхід може включати прямий відбір специфічних ферментів або поетапну модифікацію та відбір ферментів з бажаною дією. Подібно цьому, ісе) використання відомих ферментів, що находять зараз комерційне застосування, наприклад, ферментативних ю препаратів з екстрактів грибків Тгісподегта, здатних до розкладення лігніну при операціях варення целюлози, може дати джерело придатного ферменту, наприклад, для виділення ферментів, задіяних в розкладенні Щео, фенольних сполук. Для фахівців очевидно, що гени, які кодують ферменти, використовувані в целюлозній ї- промисловості для обробки лігніну, можуть використовуватися в рамках способу, або безпосередньо, або після модифікації для специфічної дії на одну зі сполук- попередників у фенілпропаноїдному шляху. Також передбачається, що в рамках представленого винаходу може використовуватися велика кількість різних ферментів. Таким чином, спосіб не обмежується джерелом або специфікою використовуваного ферменту. «

Наприклад, в одному аспекті способу фермент, який експресується в клітині рослини, діє на з с сполуку-попередник або субстрат продукту в фенілпропаноїдному шляху та утворює речовину, на яку вже не впливає фермент, що звичайно використовує цю сполуку як попередник у фенілпропаноїдному шляху. ;» Відповідно, рівень окремого продукту цього процесу зменшується завдяки зменшенню попередників, необхідних для його формування. Отримана в результаті рослинна клітина може використовуватися безпосередньо або для регенерації цілої рослини зі зміненим рівнем продуктів фенілпропаноїдного шляху, яка буде корисною в -І будь-яких промислових процесах, не тільки для виробництва кормів, целюлози або створення рослин з новими складами фенольних сполук, включаючи надмірне вироблення окремих продуктів у фенілпропаноїдному шляху. о Дерева зі зміненим рівнем фенілпропаноїдних продуктів будуть корисними в целюлозно-паперовій с промисловості. Рослини зі зміненим рівнем фенілпропаноїдних продуктів будуть корисними в кормовій промисловості.

Ме, Спосіб також базується на відновленні та використанні рослинних клітин або тканини зі зміненими

Із властивостями, зокрема рослинної тканини, що використовується для виготовлення кормів або в інших промислових процесах. Можливо, що зміни фенілпропаноїдного шляху, передбачені в рамках представленого винаходу, можуть також спричинити позитивні зміни агрономічної ефективності рослин, отриманих цими

Методами, особливо тими аспектами винаходу, в яких дія доданих ферментів призводить до утворення речовин, що захищають від стресів. Можна очікувати інших ефектів, що застосовуються, наприклад, підвищену стійкість

Ф) до захворювань та ультрафіолетового випромінювання, механічну міцність і т.п. ка В іншому втіленні винаходу спосіб включає етап вирощування вищезазначеної рослинної клітини та регенерації рослини зі зміненими продуктами фенілпропаноїдного шляху. 60 Ще в одному втіленні винахід включає використання вищезгаданої рослини для промислового процесу, такого як виробництво корисних сполук, корму для тварин чи целюлози.

Гени, що кодують ферменти, здатні до дії на сполуки-попередники продуктів у феніллропаноїдному шляху, можуть бути природними, синтетичними чи їхньою комбінацією. Фахівець може легко усвідомити, що кодуючу послідовність гена можна змінити для більш ефективної дії в рослинних клітинах. Це можна здійснити, змінивши 65 послідовності кодонів, щоб вони були більш схожими на використання кодонів при звичайній дії гена в рослинній клітині. Крім того, очевидно, що можна визначити окремі ділянки рестрикцій для зручної маніпуляції кодуючою послідовністю. Також передбачається, що для забезпечення відповідної дії кодуючої послідовності може використовуватися додання різних послідовностей, наприклад енхансерів трансляції, інтронів тощо. Ферменти можуть також бути модифіковані шляхом зміни ділянок зв'язування субстратів або іншої модифікації початкової послідовності амінокислот, що підвищує активність ферменту. Усі ці маніпуляції відомі в цій галузі і легко будуть усвідомлені фахівцем.

В іншому аспекті представленого винаходу фермент знаходиться під контролем селективного до тканини промотору, зокрема селективного до насіння промотору. Селективний до насіння промотор - це промотор, що обмежує дію послідовностей виключно або переважно тканинами насіння рослини. Тому рівень окремого 7/0 продукту фенілпропаноїдного шляху змінюється у вибірковий до тканини спосіб, а інші рослинні тканини зберігають нормальний рівень продуктів феніллпропаноїдного шляху. Тканина, в якій вибірково діє фермент, використовується в приготуванні кормів або в будь-якому іншому промисловому процесі.

Фахівцеві очевидно, що у межах представленого винаходу може бути використана будь-яка кількість селективних до тканини промоторів. Зокрема, селективний до насіння промотор використовується для зміни 7/5 рівня продуктів фенілпропаноїдного шляху в культурах, зерно або борошно яких використовуються для кормів. В інших культурах можуть використовуватися різні селективні до тканин промотори в залежності від частини рослини, в якій бажана зміна фенольного вмісту. Наприклад, селективний до коріння або до бульби промотор може використовуватися для зміни рівня фенолів або лігніну в корінні або в коренеплодах, таких як картопля, турнепс, касава тощо. У тих випадках, де листя чи стебла використовуються як корм, може застосовуватися 2о промотор, селективний до листя або стеблин, щоб обмежити дію ферментів на сполуки-попередники. у фенілпропаноїдному шляху. Інші селективні до тканини промотори можуть використовуватися, наприклад, у деревах, що вирощуються для целюлози. Отже, промотор, який обмежує дію ферменту на деревину, буде корисним в рамках представленого способу.

В одному специфічному аспекті представленого винаходу передбачається дія кодуючої послідовності сч ов ферменту, що перетворює холін в рослинних клітинах. Дія цього холін-метаболізуючого ферменту вичерпує кількість доступного холіну, що використовується при утворенні синапіну з синапоїл-глюкози. Деякі види і) рослин, особливо родини Сгисіїегае, виробляють нехарчову сполуку синапін. Синапін, як вважається, синтезується шляхом зміни складової глюкози в синапоїл-глюкозі (віп-дІш) на холін. Зменшення рівня нехарчової сполуки синапіну збільшує цінність насіння і отриманого з нього корму. Використання ферменту, що змінює с зо Холін, наприклад, холіноксидази, є корисним в представленому винаході.

Відомо, що холін окиснюється до бетаїну в таких харчових рослинах, як пшениця, шпинат, цукровий буряк та ікс, ячмінь (Кподез апа Напзоп, 1993, Аппиа! Кеміемжм ої Ріапі Рпузіоїоду апа Ріапі Моїіесшіаг Віоіоду, 44: 357-384). ю

Цей окиснювальний процес каталізується двома ферментами (в термінах генетики відомими як "система окиснювання холіну "); продукти цього процесу показані нижче: о

Холін - альдегід бетаїну - гліцинбетаїн (бетаїн) ча

Реакція на першому етапі каталізується дегідрогеназою холіну (СОН) або холіноксидазою (ХО) у бактеріях та тваринах (КогмжадомувКкі, Кпаспайигіапе апа беїмага), 1991, оцгпа! ої Васіегіоїюду, 173: 472-478) і монооксигеназою холіну (СМО) в рослинах (Кподез апа Напзоп, 1993). Реакція на другому етапі каталізується дегідрогеназою альдегіду бетаїну (БАДГ) (КПодез апа Напзоп, 1993). Відповідно, використання ферменту, що « перетворює холін, може призвести до зменшення кількості доступного холіну в загальний чи специфічний спосіб пт) с за допомогою конститутивних, адаптованих чи специфічних до тканини промоторів. Зменшення доступності холіну скорочує вироблення синапіну. Додатково, зменшення рівня синапіну може викликати зміни кількості ;» інших продуктів феніллропаноїдного шляху, що призводить до утворення рослинної тканини зі зміненим фенольним змістом.

В іншій специфічній реалізації представленого винаходу мікробний ген холіноксидаз (ХО) |Когмадомузкі, -І Кпаспайигіапе апа Зеїмага), 1991, Шоцгпа! ої Васіегіоїоду, 173: 472-478| розміщався під контролем селективного до насіння промотору. Дія холіноксидаз в насінні переводить холін, один з попередників у о біосинтезі синапіну в насінні рапсу, у нешкідливу речовину бетаїн, шляхом формування альдегіду бетаїну, що с повільно перетворюється на бетаїн під дією ферменту ХО. У насінні з рекомбінантною ДНК зменшився рівень 5р бинапіну та змінився рівень інших продуктів фенілпропаноїдного шляху. Борошно, отримане з такого насіння, є

Ме. корисним для застосування у кормі.

Ге В іншій специфічній реалізації представленого винаходу ген ХО використовувався під контролем селективного до насіння промотору, та використовувався другий фермент, БАДГ, для збільшення утворення бетаїну з альдегіду бетаїну. У цій реалізації |Воуд, Г.А. Її. Адат, Г.Е. Реїспег, А. МесНидпеп, К. Нігі, апа ов З. Зеїмага)., 1990, бепе 103:45-52.| БАДГ діяв під контролем селективного до насіння промотору.

Бетаїн - це сполука, знайдена в їстівних частинах багатьох харчових та кормових рослин; вона також (Ф, використовується в деяких випадках як харчова та кормова добавка. Бетаїн також має стресозахисну функцію. ка В іншій специфічній реалізації представленого винаходу ген ХО використовується в клітині хрестоцвітої рослини (виду Вгаззіса) під контролем селективного до насіння промотору, та використовувався другий фермент бо БАДГ, також під контролем селективного до насіння промотору, для забезпечення утворення бетаїну з альдегіду бетаїну.

Зміна рівня холіну в насінні хрестоцвітих передбачає зменшення рівня синапіну і подальшу зміну кількості різних продуктів феніллпропаноїдного шляху. Можна з впевненістю зазначити, що зміна рівня холіну в насінні призводить до збільшення рівня синапоїлглюкози або інших синапоїлових сполук, наприклад малату синапоїлу, б5 що у свою чергу змінює рівень синапінової кислоти, попередника лігніну. Отже, активізується механізм біохімічної регуляції, що звичайно позначається як стримування кінцевого продукту, спричинюючи зміну рівня різних продуктів у фенілпропаноїдному шляху. Відповідно, запобігання утворенню синапіну призводить до зміни рівня великої кількості різних продуктів, що утворюються на етапах фенілпропаноїдного шляху перед заключним етапом формування синапіну.

На вторинний процес фенілпропаноїдного метаболізму також може впливати фермент, який діє на ферулову кислоту. Ферулова кислота є іншим попередником у фенілпропаноїдному шляху. Відповідно, рівень ферулової кислоти зменшується. Зменшення доступності ферулової кислоти викликає зміну кількості фенольних сполук, включаючи зменшення рівня синапіну у хрестоцвітих рослинах.

Гени, що кодують ферменти, здатні впливати на ферулову кислоту, можуть бути природними, синтетичними 70 або їхньою комбінацією. Фахівець може легко усвідомити, що кодуючу послідовність гена можна змінити для більш ефективної дії в рослинних клітинах.

Згідно з іншим аспектом винаходу, ген, що кодує фермент, здатний впливати на ферулову кислоту, розміщується під контролем селективного до тканини промотору. Тому рівень ферулової кислоти змінюється у вибірковий до тканини спосіб, зберігаючи нормальний рівень ферулової кислоти в інших тканинах рослини. /5 Тканина, в якій вибірково діє фермент, використовується в приготуванні кормів, їжі або в будь-якому іншому промисловому процесі.

До ферментів, що передбачаються для використання в цих втіленнях представленого винаходу, відносяться ферменти, здатні модифікувати ферулову кислоту й особливо ті, що, як відомо, виробляють з ферулової кислоти сполуки, що застосовуються. Фахівцеві ясно, що в рамках способу метаболізації ферулової кислоти можна 2о Використовувати інші ферменти. Відомі джерела ферментів, що метаболізують ферулову кислоту, знайдені в таких мікроорганізмах, як (Аегорасіег зр, Васіїй5 теда(егішт, В. зиБійв5, Согуперасіегішт дішатісит,

Епіегорасіег зр., Резцедотопаз зр., Зігеріотусевз зр., АвзрегаоїЇйїв взр., Сапаїда зр., Ривагішт вр., Напзепша зр., Репісіїйшт вр., Кподоїогціа зр., Засспаготусез зр)|. Цей список не вичерпний, але показує багато відомих джерел ферментів метаболізму ферулатів. Таким чином, цей спосіб не обмежується джерелами ферментів, сч г використовуваних для метаболізму ферулової кислоти. У рамках представленого винаходу передбачено зміну гена, що кодується мікробами, для забезпечення оптимальної дії в рослинних клітинах. Такі способи добре (8) відомі в цій галузі.

Як приклад таких ферментів, використовується декарбоксилаза ферулової кислоти від В. ритиїйй85. Ген для цього ферменту був виділений та вивчена його послідовність. (Ладо еї. аї., Арріе4й апа Епмігоптепіаї! с

Зо Місгторіоюду 61:4484-4486, 1995). Послідовність гена можна змінити, щоб він був більш схожим на рослинний ген, зберігаючи при цьому передбачувану послідовність амінокислот. Цей фермент здатний до створення ікс, вініллгваяколу з ферулової кислоти шляхом декарбоксилювання. Відповідно, в одному прикладі способу ю утворюється корисна сполука (вінілтваякол, МО) шляхом діяльності введеного гена, що може впливати на ферулову кислоту. Фермент не вимагає додаткових факторів і має ймовірну молекулярну масу приблизно 22 о зво ТлН. ї-

В іншій специфічній реалізації представленого винаходу фермент декарбоксилаза ферулату розміщується під контролем селективного до тканини промотору, призводячи до створення рослини, що містить тканини зі специфічно зміненим метаболізмом ферулової кислоти.

Зміна рівня ферулової кислоти передбачає зменшення рівня ферулової кислоти та наступну зміну кількості « різних продуктів фенілпропаноїдного шляху. з с У цьому винаході також передбачається створення рослинної тканини, зокрема зерна, корисного для застосування у харчових продуктах та кормах. Як безпосереднє вживання зерна, так і використання ;» модифікованої муки з отриманого зерна входять у об'єм представленого винаходу. Зменшення рівня фенолів у зерні є бажаним у кормах та генетично змінене насіння зі зміненим фенольним вмістом, зокрема з меншою

Кількістю нехарчових фенолів, є дуже корисним у виробництві кормів. -І На додаток до безпосередньої годівлі цілим або частково розмеленим зерном, існує багато способів приготування зернового борошна. Особливе значення для насіння хрестоцвітих має спосіб виготовлення о борошна шляхом екстракції олії з насіння олійних хрестоцвітих культур. Взагалі кажучи, олію одержують з с насіння олійних культур за допомогою розчинника або без нього. Макуха або віджаті тверді залишки, отримані 5о протягом цього процесу, використовуються для приготування корму та звичайно містять більшу частину

Ме, фенольних сполук з насіння хрестоцвітих. Способом виробництва борошна з меншим фенольним рівнем

Із створюють новий склад, на цей час не виявлений у борошні з насіння хрестоцвітих.

Представлений винахід передбачає використання генетично зміненого насіння, створеного згідно зі способом отримання кормового продукту зі зміненим рівнем фенолів.

Описаний спосіб надає багато переваг щодо зміни фенотипу рослини. Додатково спосіб дозволяє виробництвво різних сполук з відомим промисловим використанням. Описаний спосіб знаходить застосування у (Ф, будь-яких видах рослин або рослинних тканин. ка Описаний спосіб надає багато переваг у порівнянні з відомими методами керування фенілпропаноїдним процесом. Цей спосіб не базується на мутаціях, таких як мутація 5ІМІ, що виявляється в усій рослині та бо пов'язана з чутливістю до ультрафіолету. Спосіб не використовує генетичні механізми, розроблені для блокування експресії гена, наприклад, антизмістовну РНК або косупресію, які вимагають клонування генів рослини з фенілпропаноїдного шляху. Спосіб не змінює жодного гена, притаманного рослині. Відповідно, різні функції процесу, такі як вироблення флавоноїдів, речовин, що захищають від ультрафіолету, участь у реакції на захворювання та інші біохімічні функції процесу не зазнають шкідливої зміни. За допомогою селективних до бе тканини промоторів можна змінити фенольний рівень у будь-якій тканині, зберігаючи інші тканини рослини без змін.

Описаний спосіб знаходить застосування для багатьох видів рослин, але найбільш корисним він є для хрестоцвітих. У результаті застосування способу виникає додаткова перевага завдяки виробленню стресозахисної або промислово корисної сполуки, як результату дії доданого ферменту. Очевидно, що спосіб

Може бути спрямований на будь-яку кількість етапів у фенілпропаноїдному шляху, та інші біохімічні процеси також можуть бути змінені подібним підходом.

Представлений винахід також знаходить застосування для зміни інших процесів вторинного метаболізму.

Наприклад, в одному втіленні представленого винаходу пропонуються способи і конструкції ДНК для створення рослин зі зміненим метаболізмом цукрових спиртів, зокрема шляхом зміни рівня фітату в клітинах насіння. Фітат 7/0 утворюється з цукрового спирту міоінозиту, який також є попередником або проміжною ланкою для формування інших сполук, таких як стахіоза, рафіноза, цукрозил-глікозиди, уроніди та пентози, фосфоїнозитиди та глікофосфокераміди. Крім того, винахід пропонує способи і композиції ДНК для зменшення рівня фітату в насінні хрестоцвітих. У винаході також пропонується насіння рослини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для застосувань у кормах, насіння рослини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для виготовлення 7/5 Модифікованого корму, та рослинні клітини з модифікованим метаболізмом інозиту.

У цьому винаході пропонуються способи та конструкції ДНК для створення рослин зі зміненим рівнем фітату в клітинах насіння. Також у винаході пропонуються способи та композиції ДНК для зменшення рівня фітату в насінні однодольних, дводольних, олійних культур та у насінні хрестоцвітих. У винаході також пропонується насіння рослини зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, придатне для виготовлення модифікованого борошна, го та рослинні клітини з модифікованим метаболізмом інозиту.

У цьому винаході розглядається експресія генів, що кодують ферменти, які діють на цукровий спирт -- попередник у біосинтезі фітинової кислоти, міоїнозит, викликаючи метаболічне переведення цього попередника у "тупик", або погано перетворювані сполуки, що можуть безпечно накопичуватися в рослинній клітині. У такий спосіб досягається скорочення біосинтезу фітинової кислоти. Способи, описані в представленому винаході, сч ов Можуть бути спрямовані на інші цукрові спирти. Фермент, що використовується для дії на міоіїнозит, може мати мікробне, тваринне або рослинне походження. Цей фермент може бути природним або отриманим за допомогою і) мутації відомого ферменту, щоб змінити його специфічну дію на субстрат, отже, створити новий фермент.

Фермент, що використовується для дії на міоїнозит, переважно утворює сполуки, що є безпечними для рослинної клітини і тому можуть накопичуватися до високого рівня без шкідливого впливу на рослинну клітину. В с зо об'ємі представленого винаходу можуть застосовуватися один або кілька ферментів, та кілька різних властивостей може використовуватися для зменшення рівня міоінозиту. ікс,

В об'ємі представленого винаходу використовуються ферменти, здатні до модифікації міоїнозиту шляхом ю ізомеризації, сполучення, фосфорилування, гідроксилювання, метилування або будь-якої іншої подібної біохімічної операції, або ферменти, здатні до видалення міоінозиту чи інших цукрових спиртів. о

Ферменти, що використовуються в контексті представленого винаходу, можуть бути отримані з багатьох ча джерел або багатьма методами. Наприклад, можна ідентифікувати фермент з відомою дією на хімічно подібні субстрати. Відповідно, можна визначити фермент, виділити ген і використати його в контексті представленого винаходу. Ферменти, що використовуються в рамках представленого винаходу, можна змінити звичайними методами, відомими в цій галузі. «

Спосіб також базується на використанні трансформації для введення в рослинні клітини гена, що кодує з с фермент. Трансформацію рослинної клітини можна здійснити за допомогою багатьох засобів. До способів загального застосування відносяться системи на основі Адгобрасіегійт, з використанням бінарних і ;» коїнтегрованих плазмід А. (Шшптіїасіепе та А. гпулодепез (напр. (патенти США 4940838 та 5464763), біолістичного підходу (напр., (патенти США 4945050, 5 015580 та 51496551), мікроін'єкції (напр., патент США 4143548), прямого поглинання ДНК протопластами (напр., |патенти США Ме5231019 та 54533671) чи введення -І ін'єкцією (напр., (патент США 53025231). У контексті представленого винаходу може застосовуватися будь-який спосіб генетичної трансформації рослинної клітини. о Спосіб також базується на регенерації та використанні рослинних клітин або тканини зі зміненими с властивостями, зокрема тканини насіння, що використовується для корму.

Таким чином, одержують рослинні клітини зі зміненим метаболізмом цукрових спиртів. З цукрових спиртів

Ме, утворюються численні сполуки, але найбільш важливою є фітинова кислота або фітат. Способи зменшення

Ге кількості фітату в окремих рослинних клітинах активно застосовуються при використанні кормів.

Гени, що кодують ферменти, здатні діяти на міоінозит, можуть бути природними, синтетичними або їхньою комбінацією. Фахівець може легко усвідомити, що кодуючу послідовність гена можна змінити для більш ефективної дії в рослинних клітинах. Це можна здійснити, змінивши послідовності кодонів, щоб вони були більш схожими на використання кодонів при звичайній дії гена в рослинній клітині. Крім того, очевидно, що можна

Ф) визначити окремі ділянки рестрикцій для зручної маніпуляції кодуючою послідовністю. Також передбачається, ка що для забезпечення відповідної дії кодуючої послідовності може використовуватися додання різних послідовностей, наприклад енхансерів трансляції, інтронів тощо. Усі ці маніпуляції відомі в цій галузі і бо легко будуть усвідомлені фахівцем.

Також очевидно, що можна застосовувати селективний до тканини промотор, щоб обмежити дію ферменту, здатного до модифікації міоінозиту, тими тканинами, в яких виробляється фітинова кислота, наприклад, тканиною насіння. До придатних селективних до насіння промоторів відносяться промотор напіну з Вгавзвіса парив, промотор фазеоліну з Ріазеоїї5, або будь-який інший селективний до насіння промотор. 65 Зокрема, в рамках представленого винаходу передбачається використання О-метил-трансферази міоінозиту з Мезетьгуапіпетит сгузіаІІ пит.

У цьому винаході передбачається використання генетично зміненого насіння, отриманого шляхом дії ферментів, що впливають на міоіїнозит, під контролем селективного до насіння промотору. Відповідно зменшується рівень фітинової кислоти. Після обробки насіння отримують кормовий продукт зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. Таким чином, виготовлення борошна зі зменшеним рівнем фітинової кислоти також розгляддається як результат застосування способу.

У представленому винаході пропонують засоби створення насіння хрестоцвітих зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. Зокрема, в об'ємі винаходу передбачається використання О-метил-трансферази міоінозиту, наприклад, з Мезетрбгуапійетит сгувіайпит, для зменшення кількості фітинової кислоти в хрестоцвітих 7/о Культурах. Фахівець може легко усвідомити, що виробництво борошна зі зменшеним рівнем фітинової кислоти з насіння хрестоцвітих також може бути здійснене в результаті застосування представленого винаходу.

Відомо, що присутність фітинової кислоти в зерновому борошні є шкідливим для риби, вирощуваної в аквакультурі. Однак деякі зернові борошна, наприклад, борошно з насіння рапсу, мають білковий склад, корисний для годівлі риб. Висока концентрація фітинової кислоти в борошні з рапсу обмежує кількість корму, що /5 Може використовуватися в раціоні риби. Тому борошно зі зменшеним рівнем фітинової кислоти, отримане з насіння хрестоцвітих, є дуже корисним в аквакультурі.

Відповідно, представлений винахід знаходить застосування у виробництві насіння зі зміненим рівнем фітинової кислоти та зернового корму зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. Модифіковані насіння та корм знаходять широке застосування, наприклад, для свійських птахів, свиней, риби, жуйних та нежуйних тварин. З го попереднього опису також ясно, що в рамках представленого винаходу для модифікації міоїнозиту можна використовувати будь-яку кількість різних ферментів. Також очевидно, що для специфічного зменшення рівня фітинової кислоти можна використовувати різноманітні комбінації цих ферментів під контролем селективних до насіння промоторів.

Використання винаходу у процесі вторинного метаболізму цукрових спиртів не обмежується наведеними с г видами рослин. Фактично будь-який вид рослини, що виробляє фітинову кислоту, можна модифікувати способом представленого винаходу. Спосіб є корисним для будь-якої сільськогосподарської культури, оскільки фермент, і) що використовується, О-метил-трансфераза, є неспецифічним до усіх головних економічно важливих культур.

Таким чином, будь-яка культура, що використовується для фуражу або виробництва зерна, яке повністю або частково використовується для фуражу, може бути змінена представленим способом для створення рослин зі с зо Зменшеним рівнем фітату.

Відповідно, спосіб може застосовуватися для будь-яких сільськогосподарських культур, включаючи ікс, однодольні (наприклад, зернові, рис, пшеницю, ячмінь, жито) та дводольні (наприклад, сою, бавовну, люцерну, ю

Вгазвіса, льон, соняшник тощо.).

За допомогою представленого способу досягається модифікація як фенілпропаноїдного метаболізму, так і о з5 Метаболізму цукрових спиртів, з наведенням окремих прикладів щодо того, як надійно та передбачувано, згідно ча зі способом представленого винаходу досягається зменшення рівня окремих метаболічних сполук, зокрема нехарчових сполук.

Для фахівця очевидно, що в рамках представленого винаходу можна змінити будь-який вторинний метаболічний процес. Винахід було продемонстровано на двох незалежних вторинних метаболічних процесах та « отримано передбачені та реальні результати. При детальних дослідженнях винаходу досягнуто зменшення рівня 7-3) с нехарчових факторів, наприклад, в клітинах насіння рапсу, клітинах зернових, рису та бавовни.

Й Наприклад, увага фахівця спрямовується на оцінку вироблення окремого вторинного метаболіту як частину а способу представленого винаходу. Отже, фахівець може легко усвідомити, що потрібно базове вивчення тканин, в яких синтезується вторинний метаболіт або сполука, яка застосовується як його попередник, на додаток до експериментально визначеного часового інтервалу, в якому це відбувається. Така інформація надасть напрямок -І для вибору промотору, який буде контролювати дію ферменту на вторинний метаболіт або його попередник. У такий спосіб фахівець легко усвідомить, що спрямування на вторинний метаболіт потребує ферменту, здатного о до дії на попередник цього вторинного метаболіту в тканині, де вторинний метаболіт утворюється, та в той с часовий інтервал, в якому він утворюється. Таким чином, фермент, що діє на попередник вищезазначеного Вторинного метаболіту, повинен бути введений у момент або під час синтезу цього попередника. ме) Далі, фахівець повинен виконати біохімічний аналіз тканини, в якій буде здійснюватися спосіб. Цей аналіз

Ге може включати визначення рівня різних сполук у тканині протягом процесу, будь-якої компартменталізації або субклітинної локалізації біосинтезу, часового періоду, в який сполука починає або закінчує синтезуватися, та будь-якої іншої доречної біохімічної інформації.

При виконанні цього аналізу фахівець спроможний вибрати промотор, який забезпечує інтенсивність дії, придатну для здійснення бажаних змін вмісту вторинного метаболіту в рослинній тканині. Передбачається, що (Ф, навіть маленька зміна рівня сполуки, що використовується як попередник, може дати бажаний ефект. ка Наприклад, при частковій реалізації представленого винаходу щодо фітинової кислоти, фахівець легко усвідомить, що базове вивчення тканин, в яких синтезується фітинова кислота, на додаток до експериментально бо визначеного часового інтервалу, в якому це відбувається, дасть напрямок для вибору промотору, який буде контролювати дію ферменту на міоінозит. У такий спосіб фахівець легко усвідомить, що спрямування на міоїнозит потребує ферменту, здатного діяти на міоінозит у тканині, де утворюється фітинова кислота, та в той часовий інтервал, в якому вона утворюється. Таким чином, фермент, що діє на міоінозит, повинен бути введений у момент або під час синтезу фітинової кислоти. Інтенсивність дії ферменту можна змінити, щоб досягти 65 визначеного скорочення вироблення фітинової кислоти. Це скорочення може сягати від кількох відсотків до майже повного видалення фітинової кислоти. Фахівець може легко усвідомити, що зменшення рівня фітинової кислоти, особливо в деяких культурах з високим рівнем фітинової кислоти, може потребувати більш інтенсивної дії гена, що змінює міоінозит, ніж у тій культурі, де фітинова кислота присутня в меншій кількості. Керування інтенсивністю дії різними засобами добре відоме. Воно може включати додання послідовностей ДНК, що посилюють трансляцію, сильні промотори, що забезпечують високий рівень транскрипції, або додання послідовностей ДНК, таких як області додатку матриксу або додатку клітинного каркасу, що, як вважається, забезпечує надійні рівні транскрипції трансгенам.

Ця реалізація представленого винаходу також передбачає створення рослинної тканини, зокрема насіння рослини, що знаходить застосування для кормів. Як безпосереднє вживання насіння, так і використання 7/0 Модифікованого корму з отриманого насіння входять у об'єм, представленого винаходу. Зменшення рівня фітинової кислоти в насінні є бажаним для застосування у Нормах, і генетично змінене насіння зі зміненим рівнем фітинової кислоти буде дуже корисним для виробництва кормів.

У деяких застосуваннях тварин годують цілим зерном або зерно піддається мінімальній обробці, але не подрібнюється. Наприклад, зерно зернових культур часто використовується для корму з мінімальною обробкою. 7/5 Однак, деякі зернові культури піддаються обробці та тварин годують отриманими в результаті продуктами, наприклад зерновою клейковиною. Для обох типів зернового корму може бути корисним зменшення рівня фітинової кислоти, особливо якщо Це стосується руйнування навколишнього середовища через надлишок фосфору, що його виділяють тварини. Для інших видів зерна, наприклад пшениці, ячменя і вівса, представлений винахід також може бути корисним. Таким чином, представлений винахід знаходить застосування для широкого діапазону економічно важливих зернових культур. Ген, представлений у даному винаході для зміни рівня міоїнозиту, може виявитися здатним до дії в будь-якій зерновій культурі, оскільки міоінозит міститься в усіх зернових культурах та є єдиним відомим попередником у біосинтезі фітинової кислоти. Таким чином, продемонстровано безсумнівне застосування гена метил-трансферази для зміни рівня міоінозиту. Фахівець може легко усвідомити, що кодуюча послідовність кодуючої ділянки, або окрема послідовність ДНК промотора, сч або нетрансльована послідовність ділянки, термінатор тощо, може бути змінена для забезпечення оптимальної дії в клітині конкретного виду рослини. Все це знаходиться в межах можливостей кваліфікованого фахівця. Таким і) чином, можна з упевненістю передбачити, що цей винахід може бути здійснений для будь-якого виду рослин, здатних до генетичної трансформації, включаючи ті рослини, зерно яких використовується безпосередньо для одержання корму, або ті рослини, зерно яких спочатку піддають обробці перед використанням як корм. с зо Таким чином, у результаті застосування цього способу одержують кормове насіння зі зменшеним рівнем фітинової кислоти. ісе)

Окрім прямого згодовування цілого або частково пошкодженого насіння існують багато способів одержання ю насіннєвого борошна. Серед інших продуктів -- мокрий помел зерна використовують для одержання борошна з клейковини зерна. Окрім продуктів обробленого зерна, може бути одержане ціле зерно зі зменшеним рівнем о фітинової кислоти згідно зі способом цього винаходу. Цей винахід також пропонує одержання борошна з ї- клейковини зерна зі зменшеним рівнем фітинової кислоти.

Окрім основних сільськогосподарських культур, таких як кукурудза, олійне насіння забезпечує велику кількість рослинного борошна, що використовується як корм. Особливо важливим у переробці олійного насіння є одержання борошна під час екстрагування олії. Загалом, олію екстрагують з олійного насіння за допомогою « розчинника або без нього. Макуху або віджату тверду речовину, що утворюється внаслідок цього процесу, в с використовують для кормових композицій, де вони зазвичай містять головну частину рівня фітинової кислоти насіння. ;» Найбільш широко використовувана обробка олійного насіння включає екстрагування олії та виділення макухи або остаточних компонентів насіння після екстрагування олії. Цей винахід пропонує використання цього процесу

Й кормові складові, що утворилися, можуть бути більш цінними, ніж загальновизнаний одержаний корм, завдяки -І зменшеному рівня фітинової кислоти.

Таким чином, спосіб одержання корму з низьким рівнем фітинової кислоти пропонує нову композицію, що не о міститься в кормі, одержаному після переробки олійного насіння. До основних олійних культур, що будуть с корисними у цьому винаході, належать хрестоцвіті олійні зернові культури, такі як Вгаззіса париз, Вгазвіса 5о "тара, Вгазвіса дипсеа, Вгаззіса підга, Зіпаріз аіра, Статре, Егиса займа та інше насіння хрестоцвітих

Ме. олійних культур, що можуть бути комерційно важливими й використовуватися як корм. До олійного насіння

Із нехрестоцвітих, що часто використовують при одержанні корму, належить соя, бавовна, кукурудза, сафлор, соняшник та арахіс.

У даному винаході розглядається використання генетично модифікованого олійного насіння, одержаного внаслідок експресії ферментів, здатних діяти на міосінозит, де вищезгаданий фермент знаходиться під контролем насіння-селективного промотору. Таким чином, кількість фітинової кислоти є зменшеною. Під час обробки

Ф) олійного насіння кормовий продукт має знижений рівень фітинової кислоти. ка Наступні приклади надані з метою ілюстрації способу й жодним чином не обмежують об'єму винаходу.

Приклад 1: Загальні способи визначення продуктів фенілпропаноїдного шляху: Визначення рівня синапіну -- бо кінцевого продукту фенілпропаноїдного шляху, у насінні хрестоцвітих.

Є очевидним той факт, що фахівець у галузі може виконати усі способи визначення продуктів фенілпропаноїдного шляху, звернувшись до багатьох публікацій з аналітичної хімії. Згідно з першим описаним методом був виконаний простий тест на визначення синапіну в тканині рослин, а саме тканині насіння з хрестоцвітих рослин, згідно з опублікованими способами |СПпарріе, С.С.5., Т. Моді, В.Е. Еїїв і СК. 65 бЗотегміе, 1992, Ріапі СеїІ 4:1413-1424). Протокол тонкошарової хроматографії (ТІ С) був стандартизований для визначення синапіну -- продукту фенілпропаноїдного шляху. Цей спосіб складався з відокремлення рослинних екстрактів, і відому кількість синапіну наносили на пластинки з силікагелю (наприклад, У/пайтап бОА б5іїїсаб).

Синапін може бути очищений за допомогою опублікованих способів (наприклад, |О. БЗігаск, 1977, 7.

РІПапгепрпузіо!. 84: 139-1451). Відокремлення проводили за рахунок композиції розчинників н-бутанолу, оцтової

КИСЛОТИ й води у співвідношенні 10:2:3, відповідно, до приблизно 7Осм від початку. Насіннєві екстракти одержували із застосуванням просочування протягом ночі попередньо зваженого зразка у щільно зачиненій пробірці, що містить 100-Б00мкл розчину метанолу (9895 метанол, 2906 оцтова кислота), після чого додавали такий самий об'єм метанолу й розтирали. Супернатант одержували після центрифугування при 12000 ха.

Супернатант екстрагували сумішшю хлороформ: вода (40О0мкл:10Омкл), центрифугували, як описано вище, 7/0 видаляли ліпідну фазу й водну фазу висушували на повітрі або висушували у вакуумі. Зразки розчиняли у воді й переносили на пластинки для ТІ С. Певну кількість зразка, що визначали емпірично, переносили на пластинки для ТС перед піддаванням дії розчинника, що піднімається угору. У тих випадках, де використовували вимірювання сухої ваги, ці вимірювання здійснювали шляхом висушування і потім зважування відомої кількості свіжих зразків.

Пластинку для ТС потім роздивлялись під УФ-світлом, і синапін візуалізували як блискучу пляму.

Попередньо очищений зразок синапіну використовували як стандарт один, а також як штучну суміш з насіннєвим екстрактом для того, щоб переконатися, що очищений синапін мігрував з синапіном в насіннєвому екстракті, якщо він присутній разом з компонентами насіннєвих екстрактів. При спостереженні радіоактивно міченого синапіну пластини ТС сканували за допомогою сканера Атріз4000 (Зсапаїуїйсв), що кількісно зображує радіоактивне випромінювання.

Потім використовували рідинну хроматографію під високим тиском (НРІ С) для підтвердження рівня синапіну.

Метанолові екстракти рослинного матеріалу, як описано вище, але без екстрагування хлороформ-вода, піддавали дії НРІ С, використовуючи Магіап НРІ С, оснащену колонкою Мисіеовії! СІ8АВ. Об'єм ін'єкції типово складав 1Омкл і рухомою фазою була суміш Розчинника А (295 оцтова кислота у воді) і Розчинника В (295 оцтова с

Кислота в ацетонітрилі). Типові умови промивання включають у рухомій фазі: Розчинник А, що змінюється від 9096 до 8095 протягом 17 хвилин, після чого ще падає до 1095 протягом 1 хвилини. Колонку утримували 1090 о

Розчинником А протягом чотирьох хвилин, потім промивали й врівноважували 9095 Розчинником А. Ці умови можуть бути змінені для підвищення відокремлення речовин, що елюювали. Наприклад, Розчинник А може бути змінений від 9095 від початку елюювання до 8095 протягом 15 хвилин до 7095 протягом 15 хвилин і потім до 1095 с

Зо протягом 2 хвилин, після чого витриманий ще 2 хвилини при 1095 і врівноважений на 9095. Діодний детектор використовували для виявлення УФ-поглинання. УФ-поглинання при ЗЗОнм використовували для аналізу зразків. о

Будували стандартну криву очищеного синапіну й використовували для підрахування синапіну у рослинних ю екстрактах. Для фахівця у галузі є очевидним той факт, що умови НРІ С (наприклад, співвідношення й градієнт розчинників, різні типи розчинників) можуть змінюватись. Бажано визначати відповідні умови для обладнання, і юю

З5 складність зразка, що наносять. В опублікованих даних описують багато способів НРІ С для аналізу фенольних ї- сполук, включаючи синапін.

Радіоактивні дослідження використовували для того, щоб одержати більш точне виявлення початку синтезу синапіну й визначення співвідношення заново синтезованого синапіну у різних частинах насіння. Спосіб радіоактивного визначення може також використовуватися для визначення здатності окремих компонентів « 70 насіння (наприклад, сім'ядолей, ембріона, насінної шкірки) синтезувати синапін з екзогенного надходження шщ с холіну. Радіомічені продукти можна потім перевіряти на синапін, наприклад, використовуючи протокол ТІ С, після й чого сканування Атбріз4000. «» Протокол НРІ С використовували для кількісного аналізу загального рівня синапіну в насіннях і компонентах насіння. ТС використовували для кількісного аналізу рівня синапіну на різних етапах розвитку насіння, а радіоактивне визначення разом з ТС та наступне підрахування радіоактивних плям використовували для -і визначення початку й розповсюдження синапіну в насіннях і тканині насіння, такій як сім'ядолі, осі зародків і насінної шкірки. іні При радіоактивному визначенні синтезу синапіну де помо з холіну використовували цілі стручки, аніж с виділене насіння, для того, щоб експериментальні умови якомога більше наближались до умов іп мімо. Стручки з 5о різних етапів розвитку одержували з рослин, що були вирощені в контрольних умовах -- типово 209 б температура вдень, 1593 температура вночі при 16/8-годинному циклі день/ніч. Квітконіжкову частину стручка

Із занурювали у розчин, що містив ""С-мічений холін, придбаний у Мем Епдіапа Мисієаг (активність маточного розчину 2,0ГБк/ммоль; концентрація, 7,4МБк/мл, яка є такою самою, як і 0,2мКі/мл; холін, З,/7МмкМ/мл). Стручки з їх ніжкою, зануреною у пробірку, що містила 1,8мл водного середовища, такого як О0,5-сильне середовище

Мигазпіде-5Кос9д, і мМ нерадіоактивного холіну й від 1,8 до Умкл радіоактивного маточного розчину холіну, о інкубували у камері для зростання рослини протягом від 24 до 72 години з циклом день/ніч 16 годин світло/8 годин темрява за температури 202С. Світлові умови становили 51мк Ейнштейнів/м2 за секунду, й насіння, що о видаляли з цих стручків, використовували при аналізі ТІ С. Ці зразки екстрагували в розчині метанолу, після чого виконували екстрагування розчином хлороформ-вода (СУМУ), як описано вище. 60 У тих випадках, коли аналізували більш старе насіння, окрім вищезгаданого способу проводили інфільтрацію насіння, відокремленого від стручків. Двадцять насінин просочували 50О0мкл середовища з радіоактивним холіном, описаного вище, в умовах легкого вакууму протягом 15 хвилин за кімнатної температури 23 260.

Радіоактивне середовище потім видаляли й заміщали 50Омкл нерадіоактивного середовища вищезгаданої композиції, менше 14С-холіну й інкубували при 232С протягом 24 годин. Насіння потім екстрагували, як описано бо вище.

Рослинний матеріал можна також екстрагувати сумішшю хлороформ : метанол : мурашина кислота (СМЕ) у співвідношенні 5:12:3, відповідно. Типово додавали 2мкл СМЕ на мг зразка, потім зразок перетирали й залишали при кімнатній температурі (21-232С) протягом ночі (16 годин), після чого центрифугували при 12000х9 протягом

З хвилин. Супернатант збирали й осад ретельно змішували з іншим об'ємом СМЕ, що додавали раніше, залишали протягом 20 хвилин і центрифугували, як описано вище. Збирали супернатанти й виконували екстрагування хлороформ-вода (СМУ), як було описано вище, і водну фракцію перевіряли, як було описано вище.

Приклад 2: Визначення розташування синтезу продукту фенілпропаноїдного шляху в певній тканині.

У цьому прикладі визначали час синтезу продукту фенілпропаноїдного шляху під час вистигання. Цей 7/0 приклад ілюструє синтез синапіну й накопичення всередині тканин насіння хрестоцвітих. У цьому прикладі використовували насіння, що вистигає, рослини Вгаззіеві париз. Виконували Ті С-аналіз екстрактів стручків, одержаних зі штучно запилених квіток, для визначення часу початку накопичення синапіну. Зразки збирали на 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 32 і 34 день після запилення (ДПЗ) і після достигання насіння. Насіннєві екстракти одержували згідно зі способами, описаними у Прикладі 1, і рівень синапіну візуалізували за 75 допомогою ТІ С-аналізу. Синапін спостерігався з 18 ДПЗ до моменту достигання насіння й насіння, що вистигало, містило найбільшу кількість синапіну, що дозволяє припустити, що має місце загальне накопичення в насінні, що вистигає.

Фракція стінки стручків, з яких видаляли насіння, не містила синапіну, синапін також був відсутній у більш молодому насінні зі зразків на 7-14- і 16-ДПЗ. Цей аналіз показав, що початок накопичення синапіну становив приблизно 18 ДПЗ, проте, оскільки у цьому способі використовувалось визначення УФ-флуоресценції, то за присутності дуже малої кількості, якщо таке трапляється у більш молодому насінні, визначення стає неможливим. Фіг.3 показує приклад ТІ С-аналізу зразків до 28 ДПЗ і наступна пластинка показує приклад аж до моменту достигання насіння. Оскільки вищезгадані результати не були кількісними, виконували НРІ С-аналіз екстрактів з цілого насіння, одержаних при використанні розчину метанолу, як описано у Прикладі 1. с

Результати, наведені у Фіг.4, підтверджують початок синтезу синапіну з 20 ДПЗ, зі швидким підвищенням і тривалістю до моменту достигання. Кількість синапіну у стиглому насінні становила 0,890 на основі сухої маси о насіння і, оскільки рівень олії становить приблизно 4595 насіння, цей покажчик наближатиметься до 1,595 знежиреного насіннєвого корму.

Приклад 3: Визначення часових і просторових аспектів синтезу продукту у фенілпропаноїдному шляху -- Га синтез синапіну стосовно стиглості насіння.

Виходячи з одержаного вище у Прикладі 2, надалі було показано, що синапін синтезується насінням, що о вистигає. Є також очевидним той факт, що руйнування синапіну є мінімальним протягом вистигання насіння. Для ю того, щоб підтвердити цей аналіз, насіння, що вистигає, інкубували з ""С-холіном, а попередник використовували для синтезу синапіну з синапоїл-глюкози, кінцевого етапу фенілпропаноїдного шляху у рослин. Присутність о радіоактивного попередника дала змогу одержати мічений синапін. Таким чином, можливо у цей спосіб кількісно /-|ч« описати біосинтез синапіну. Як показано на Фіг.5, синтез синапіну (включення ""С-холіну в синапін) було неможливо визначити на 10 ДПЗ, а стає можливим лише на 14 ДПЗ. Таким чином, синтез синапіну (тобто одержання кінцевого продукту синапіну з попередників синапоїл-глюкози та холіну) має місце з 14 ДПЗ до « приблизно моменту достигання насіння. Таким чином, початок накопичення синапіну у насінні відбувається після 14 ДПЗ і насіння, що вистигає, продовжує синтезувати й накопичувати синапін до моменту достигання. - с Хоча 18 ДПЗ і є моментом часу, у який накопичення синапіну можна виявити при нерадіоактивному аналізі, ч радіоактивний аналіз є більш чутливим і дозволяє виявити навіть малу присутність біосинтезу. Таким чином, як я показано за допомогою радіоактивного аналізу, синтез синапіну спочатку починається за малої швидкості на 14

ДПЗ. Дослідження інфільтрації показують, що здатність синтезувати синапін властива також і більш дорослому насінню (Фіг.б). -і Окрім визначення рамки часу накопичення продуктів феніллропаноїдного шляху протягом вистигання, сл фахівець у галузі надалі має спрямувати свої зусилля на визначення тканинної специфічності біосинтезу продукту фенілпропаноїдного шляху. У цій частині прикладу вимірювали накопичення синапіну у сім'ядолях, осях 1 зародка і насінній шкірці. Радіоактивний аналіз виконували з цілими стручками від 18 до 42 ДПЗ. Ніжку б 50 вирізаних стручків занурювали у розчин, що містив "С-холін, на час від 24 до 72 годин, і три компоненти насіння вирізали й перевіряли на синапін. Результати, наведені на Фіг.7, показали, що сім'ядолі містили г» максимальну кількість синапіну (стосовно кожного насіння), після чого йшли осі зародків і насінна шкірка.

Екстракти синапіну з сім'ядолей та осей зародка насіння з 25 ДПЗ до моменту достигання показали, що осі зародка містили приблизно 5095 синапіну сім'ядолей відносно сухої маси (Фіг.8). Проте, оскільки сім'ядолі є го відносно більшими по масі порівняно з осями зародка (у шість разів більші за масу осей для зародку при

Ф! дозріванні), їх рівень синапіну становить аж до 9095 загального синапіну, що зустрічається в насінні (Фіг.9).

Приклад 4: Генетична трансформація рослин, що містять ген, який кодує фермент, здатний діяти як о попередник фенілпропаноїдного шляху.

У цьому прикладі фермент -- холіноксидаза (ХО), який діє на попередник, що використовується для синтезу 60 синапіну, експресується у клітині рослини. Фермент холіноксидазу вставляли у вектор для трансформування рослин під контролем насіння селективного промотору. Холін є попередником для одержання синапіну з синапоїл-глюкози, таким чином, зменшення пулу холіну зменшує одержання синапіну.

Генетичне трансформування Вгаззіса париз, виду хрестоцвітих рослин, з конструктом, що містить насіння-селективну холіноксидазу (ХО). ДНК-послідовність гена холіноксидази наведена на Фіг.10, тоді як бо передбачувана послідовність амінокислот наведена на Фіг.11. Для того, щоб забезпечити насіння-специфічну експресію, використовували послідовність паріп-промотору |(Коппо-Нигазе, .)., М. Мигазе, Н. Іспікамжа і ..

Ітатига, 1994, Ріапі МоіІесшіаг Віоіоду, 26:1115-1124). Цю кінцеву плазміду рН57З31 будували за допомогою серій клонування та субклонування згідно зі стандартними протоколами, описаними у таких посібниках, як (Мапіаїйз,

Т., Епйвсй, Е. Р. ії ЗатрбгоокК, У. (1982; Моіесшіаг Сіоппіпд:. А І арогаїогу Мапиа!: Соїд Зргіпд Нагрог, Мем

Могк))!. Векторна побудова походить від КО400 |Оайа, К.5.5., Наттегіїпа!, 9. К., Рапспик, В., РеІснег І. В. і

КейПег, МУ, 1992, «зепе 211:383-384Ї), що був модифікований таким чином, що замість Мо5Р-МріІ рослина-селективного маркера КО400, став складеним геном між диз і прі (бив: пр). Сбив-прі вже був описаний

ІОаМЦа, К.5.5., Натітегіїпа!ї, 9У.К., Реїспег, .Е., Стозру, МУ. і б. Зеїмага), 1991, Сепе 101; 239-245). Він був клонований як 2,6 т.п.н. фрагмент, що містив Мов-термінатор (поліА сигнал) наприкінці послідовності прі, /о з роОкКкКт4 |Оацйа еї аї., 1991) у проміжну плазміду, що втратила повністю Т-ДНК КО400. Частково подвоєний промотор Самуз55 разом з лідерною послідовністю вірусу мозаїки люцерни з рВІ525 |ОСаца, К.5.5., РЕ. Веккаоці,

У.К., НатіпегіїпаІ, с., Ріїаїє, О.І. Оцпвіап і МУЛ. Стозру, 1993, Ріапі Зсіепсе 94; 139-149| клонували як

Ніпа!п-Ватні фрагмент до 5-кінця послідовності (зив:прі. Видаляли сайти Ніпаїй, Ватні і прилеглий Хбаї заповненням кінців фрагментом Кіепом/ полімерази І з утворенням рНн5З722. Функціональну Іас-аІрна ділянку, що містила численні сайти клонування з рГ719К |Меай, О.А., Е. 52сгезпа-ЗКогира, і В. Кетрег, 1986, Ргоїеіп

Епдіпеегіпод 1:67-74), одержували як 0,26 т.п.н. фрагмент за допомогою ланцюгової полімеразної реакції. Цей фрагмент розщеплювали МипХ і ЕсокіІ і уводили в ЕсоКіІ сайт або рНн5б722 з утворенням рНн5723. Визначали нуклеотидну послідовність частини т-ДНК-вектора й унікальні сайти в численних сайтах клонування визначали рестрикційним аналізом. рНнЗ725 -- це похідна, що походить від рН5О723 і містить відкриту рамку зчитування Холіноксидази, що бере свій початок з рКК11 (див. Когмадому»кі еї а!., 1991), через серії проміжних векторів, щоб забезпечили зручні сайти або такі властивості як полі А сигнал вірусу мозаїки кольорової капусти. рне725 вектор забезпечує в рНЗ723 СОХ відкриту рамку зчитування разом з поліА сигналом Самм на 3З-кінці. 5-частину відкритої рамки зчитування, що містить промотор Самуз355, заміщали на паріп-промотор з проміжної плазміди з утворенням рН5З7З1. Проміжна плазміда містила руОС19 похідну, що містила 1,1 т.п.н. паріп-промотору як сч дв Ніпап-МаріпР-Ватні касета, що одержували з у. Коппо-Мигазе |Коппо-Мигазе еї аї!., 1994), яку лігували як

Ніпаї!й-Ватні вставку в Ніпаїй-ЗатнНі вікно плазміди КО400 |Оайа еї аїЇ., 1992). Плазміда, що утворилась, і) була рн5З9о74. ВатнНі-БАДГ відкриту рамку зчитування-ПоліА-Крп!І касети виділяли як 2,1 т.п.н. фрагмент з рРЕКУОбА (рККбА |описана детально в К.К. даїп, 1995, Сепеїйіс Епдіпеегіпд ої Озтоїуїе Віозупіпевів іп Ріапів:

Мапіршаноп ої АїІдепуде Вейаіпе Оепудгодепазе (Сепе Ехргезвіоп Торассо, Р.О. Тпезів, ОпімегзПйу ої су зо Зазкаїспежмап, ЗазКаїоп, Сапада)) і лігували у ВатнНі-КРп І вікно плазміди рНнз974, що приводило до утворення рнЗеО81. рНОЗВІ використовували для створення похідної рНО7З1. Фіг.12 показує плазміду рН5З7З1, що ісе) утворилась, яка містить відкриту рамку зчитування-СамМ полі А-сигналу разом з лівим і правим ю паріп-промотором-ХО. З компонентів визначали нуклеотидну послідовність сегменту паріп-промотора-ХО відкритої рамки зчитування-СамМ полі А сигналу. Додаткове підтвердження послідовності також можливе, Щео, оскільки попередник рНЗ7/23 включав усі компоненти рВІМ19 |Вемап, М., 1984, Мисіеїс Асідв Кезеагси 12: ї- 8711-8721), включаючи праві та ліві кінці й усю іншу ділянку. Була опублікована повна нуклеотидна послідовність рВІМ19. Таким чином, конструкт гена ХО, описаного вище, може бути легко використано для клонування в інші вектори. Плазмідний вектор рН5731 в Е. сої ОН5 був депонований 22 січня 1997 року в

Американське зібрання типових культур (АТСС), 12301 Рагкіамл Югіме і КоскКмШе МО, ОБА 20852, під « реєстраційним номером АТСС 98300. з с Виходячи з опублікованого матеріалу (Оеє! івІіе А.)., і Стос, М.Ї., 1989, Ріапі РНузіоіоду 11:617-623); . ІНодіюпа, А.-5., Т. Кодіп, Е. ІГагезоп, і Її КавК, 1992, Ріапі РПпузіоіїоду, 98:509-515) і даних результатів щодо а паріп-промотору, було знайдено, що активність триває протягом середньої частини терміну вистигання насіння

В. париз.

Вектор рН5З731 вставляли в штам Адгорасіегішт МРОО стандартним потрійним сполученням, після чого -І виконували опосередковану Адгорасіегічт трансформацію Вгазвіса. Трансформацію виконували в основному, як (описано Моіопеу еї а!., 1989, Ріапі Сеї! Керогів 8:238-2421). 1 Штам Адгорасіегішт ішптіїасіепе МЗ3101/рМРОО (Копс2 Со б БспеїЇ; 39).,, 1986, Мої. еп. Сепеї. с 204:383-396), що несе бінарний вектор рН5З7З31, використовували для трансформації. Культуру бактерій у стаціонарній фазі у ІВ-бульйоні (Діфко, США) (100 мл) збирали за допомогою центрифугування й

Ме. ресуспендували у 1Омл свіжого І В-бульйону з 19060 ОМ5О (диметилсульфоксид) (Сігма, США) як кріопротектор.

Ге Аліквоти по 200мкл зберігали при -202С, доки не використовували для трансформації, де бактеріальну аліквоту додавали до 2 мл бульйону Вгаїп Неаг Іпгивіоп (Діфко, США), що містив 2905 цукрозу, 50 мкМ ацетосирингону, рН 5,6 й інкубували протягом ночі при 282С. Густина бактеріальних клітин становила приблизно 1 х 109 клітин на мл.

Експлантати сім'ядолей експонували до Адгобрасіегішт, що містив вектор для трансформації рослин згідно зі способом |МоіІопеу еї аїЇ., 1989, Ріапі Се Кер. 8:238-242). Поверхню з боку зрізу черешка експлантатів на о короткий термін занурювали в культуру бактерій. Експлантати переносили у ко-культиваційне середовище так, ко що поверхня з боку зрізу торкалася середовища. Десять експлантатів поміщали в кожну 100 Х15мм чашку Петрі.

Ко-культиваційні чашки герметично закривали пластиковою плівкою Зіге(сп'п Зеаітм. Чашки інкубували протягом бо трьох днів у камері для зростання з умовами температури й фотоперіоду, як описано вище, стосовно етапу пророщування насіння. Експлантати потім переносили на селективне середовище.

Після 3-4 тижнів у селективному середовищі регенеровані зелені паростки (вихідні трансформанти) вирізали й переносили на свіже селективне середовище для тривалого росту. Коли паростки досягали довжини 1,5-2,0см, їх переносили на середовище для проростання коренів. Вихідні трансгенні паростки піддавали 65 скринінгу на експресію гена диз в основному, як (описано у ОеПегвгоп, К.А., 1987, Ріапі Мої. Віої. Кер.5; 387-405). Присутність блакитного забарвлення вважали за явище трансформації.

Підтвердження трансформації встановлювали за допомогою селекції на канаміцині, Саузерн-блотингу, РСК (ланцюгової полімеразної реакції) і аналізу нащадків. Трансгенне насіння Вгаззіса паривз, сорту УУевіаг, що містив вектор рН5З7З31, одержало номер 202622 і було депоновано 22 січня 1997 року в Американському зібранні

Типових культур (АТСС), 12301 РагКіамжмп Огіме, Коскмійе МО, О5А. 20852, під реєстраційним номером АТОС

Мо978541.

Потім визначали експресію гена холіноксидази у насінні Вгаззіса париз. Регенерували кілька незалежних трансгенних ліній. Активність ХО виявляли, використовуючи подвійну ферментативну реакцію. ХО утворює альдегід бетаїну з холіну і цей альдегід бетаїну може бути легко виявлений за допомогою НАД-залежного 7/0 окиснення його за допомогою БАДГ. НАД відновлення спостерігали за допомогою зміни у поглинанні при З4Онм.

Для того, щоб стандартизувати аналіз, використовували різну кількість комерційно доступного ХО (наприклад,

Сігма) і постійну кількість БАДГ штаму Е. соїї (50 одиниць; 1 одиниця-1нмоль НАД, відновленого за хвилину на мг білка) з БАДГ-надекспресуючого бактеріального штаму для стандартизації умов реакції і для побудови стандартної кривої, що ХО, але не БАДГ, є обмежуючим. Потім виконували аналіз з екстрактами рослин з /5 трансгенних ліній та контролю. БАДГ може бути насиченим або очищеним за допомогою опублікованих способів (наприклад, (РаіКкепбега. Р. і Зсгот, А.К., 1990, Віоспетіса Віорпузіса Асіа 1034:253-2591).

Екстракти рослин одержували наступним чином. Листя рослин масою приблизно 100 мг заморожували у рідкому азоті, занурювали у льодяний буфер для екстрагування по два об'єми на масу зразка. Зразки центрифугували при 100009 і супернатант знову піддавали центрифугуванню. Центрифугування повторювали,

ДОКИ жодної часточки не можна було спостерігати. Стосовно насіння, відбирали по 20 насінин на зразок і після першого центрифугування додавали 20мг активованого вугілля й продовжували процедуру. Буфер для екстрагування, що мав рНе,О0, яке створювали додаванням КОН, містив на 100мл 1,92г НЕРЕ5, 0,2мл 0,5ММ

ЕОТА, 1Омл гліцерину й деіонізованої води, щоб довести об'єм до 100мл. Перед проведенням аналізу додавали

ОТТ з 1М маточного розчину до кінцевої концентрації 25ММ і додавали повний набір інгібіторів протеаз сч дв ІВоепгіпдег-Маппйеїйт, Каталог Мо1697-498| з Л1ОмММ маточного розчину буфера НЕРЕ5. Буфер для ферментативного аналізу (буфер БАДГ) містив ХОММ НЕРЕЗ-КОН, рНа,0, 1мМ ЕОТА і свіжедоданий ОТТ до 1мММ і) кінцевої концентрації. Подвійний аналіз виконували в реакційній композиції, що містила 5Омкл буфера БАДГ,

БОмкл 10ММ маточного розчину НАД, 5Омкл зразку рослини, ЗОмкл або еквівалент з утворенням 50 Одиниць

БАДІ і деіонізовану воду для створення об'єму 450мкл. Поглинання спостерігали при 34Онм протягом 20 хвилин, с зо потім додавали 50мкл хлориду холіну й спектрофотометричне дослідження тривало від 10 до 20 хвилин.

З метою побудови стандартної кривої зразок рослини не використовували й замість цього додавали різну ісе) кількість очищеного ХО. Підраховували одиниці, використовуючи спектрофотометр з програмним управлінням ю типу Весктап БИб65. Фахівець у галузі може модифікувати протоколи під наявне обладнання, використовуючи біохімічні дані, що існують в літературі стосовно коефіцієнта екстинкції НАД. Відновлення НАД саме по собі є о з5 стандартним аналізом, виконується для дегідрогеназ. ча

Приклад 5: Дослідження трансгеного насіння на зменшений рівень фенольних сполук

У цьому прикладі насіння досліджували на рівень синапіну. Насіння з трансгенних рослин, одержаних в

Прикладі 4, вирощували для того, щоб одержати самозапилених нащадків, і лінії цих нащадків досліджували на сегрегацію або відсутність трансгенного кодування активності Др-глюкуронідази (305). Цей ген |див. Оайа, « 0 Б.5.5., Наттепіпа!, У.К., Реїснег, Г.Е., Стозру, МУ.Г., і б. зеїмага), 1991, Сепе 101:239-246) присутній в ше) с межах правого й лівого кінця т-ДНК-вектора рН5З7З31 і, таким чином, є зручним маркером при генетичному й аналізові сегрегації. Відсутність генетичної сегрегації свідчило про гомозиготну природу рослини, з якої «» походять нащадки. Ті ліній, що виявили сегрегацію, були гемізиготами, й сегреганти, що не мали активності ви, залишали як контроль, що не містив гена ХО. Таким чином, були відібрані гомозиготні лінії, що містили

ХО, та лінії, що не містили трансгена. Ці лінії досліджували на рівень синапіну за допомогою протоколу НРІ С. -і Результати, представлені на Фіг.13, показують, що трансгенні сегреганти мають значно зменшену кількість синапіну в порівнянні з їх нетрансгенними аналогами. Нетрансгенні сегреганти краще піддаються контролю, іні оскільки вони походять від однієї вихідної трансгенної рослини. Ці результати показують використання с описаного способу. Для фахівця у галузі є очевидним той факт, що різна кількість зменшення може супроводжуватись зміною кількості, часу й розташування експресії гена, а також пошуком корисних різновидів б серед окремих трансгенних ліній, що виявляють бажані результати завдяки різноманітним причинам, до яких з належать розташування та кількість копій.

Приклад 6. Створення захищеного від стресу продукту за допомогою зміни попередника всередині фенілпропаноїдного шляху.

У цьому прикладі синтезували бетаїн як захист від стресу за допомогою сполучної активності ХО і БАДГ, обидва під контролем насіння-селективного промотору. Як і у першій частині цього прикладу, були створені іФ) трансгенні Вгаззіса париз, що несуть ген БАДГ під контролем-насіння селективного промотору. Виконували ко аналіз цих рослин на експресію БАДГ.

Експресія гена бетаїн альдегіддегідрогенази в насінні Вгаззіса париз. Виділяли ген БАДГ Е. сої (реїВ) і бо готували для насіння-специфічної експресії за допомогою сполучення з паріп-промотором В. париз |Воуа еї аї.,

Сепе 103:45-52 (1990). Плазміду КО400 |ОСайца, кК.5.5., Наттегіймва!, 9У.К.. РапспикК, В., Реїснег, І.Е., і

Кеїег, МУ., 1992, Сепе 211:383-384| використовували як вектор, з якого одержували кінцеву похідну рРН5ЗО74, що містила в межах правих і лівих кінців Т-ДНК відкриту рамку зчитування бБеїВ - з його АТО-сайту під контролем експресії паріп-промотору й поліА сигналу вірусу мозаїки цвітної капусти. Маріп-бе(В-ПоліА касета (3,3 бе т.п.н.р) містила у вказаній послідовності: сайт Ніпаїїї, Маріп-промотор, ВатНі сайт, ре(В ОКР, Есокі сайт-ПоліА сигнал вірусу мозаїки цвітної капусти ДНК, сайт Крпі і сайт ЕсокКіІ. Маріп-промотор був від

Коппо-Мигазе еї аї. (Ріапі МоїІесшаг Віоіоду, 26:115-1124, 1994) і ПоліА сигнал був спочатку з плазміди ру!/Т1117 ІСцегіпеаи, Р., МУсоівіоп, 5., ВгооКк5, |. і Миїйпеаих, 1988, Мисіеіс Асідв Кезеагсп 16:11380).

Кінцева плазміда рН5Зо81 15 т.п.н. наведена на Фіг.14. Цю плазміду уводили в Адгорасіегіит (Шшптегасіепе СМЗ3101

ІРМРООЇ ІКопсг, С, і ЗсНпеїЇ, 9У., 1986, МоіІесціаг і Сепега! Сепеїйісв 204: 383-396| і штам, що утворився, використовували для генетичної трансформації Вгазвіса парив.

Одержували кілька трансгенних ліній і насіння на різних стадіях розвитку досліджували на активність БАДГ.

Активність БАДГ була максимальною десь на 35 ДПЗ, і стигле насіння залишало остаточну активність.

Специфічна активність як функція стадії вистигання показала, що початок активності БАДГ співпадає з синтезом 7/о бинапіну.

Лінії, що експресують ген БАДГ, схрещували з лініями, що несли ген ХО, що описано у Прикладі 4. Рослини, що містили ген ХО, і рослини, що містили гени БАДІГ і ХО, досліджували на рівень синапіну і загальний рівень фенольних сполук. Ці результати показані на Фіг.15 (рівень синапіну) і Фіг.1б6 (загальний рівень фенольних сполук). Досліджене насіння збирали з рослин та культивували у польових умовах влітку 1999. Як показано на

Фіг.15, сполучена активність ХО і БАДГ призводила до подальшого зменшення накопичення синапіну під час активності лише одного ХО. Як показано на Фіг.1б6, відбувається зменшення у загальному вмісті фенольних сполук в трансгенних рослинах відносно контролю.

Приклад 7:Нуклеотидна послідовність синтетичного гена декарбоксилази ферулової кислоти.

У цьому прикладі опубліковану послідовність декарбоксилази ферулової кислоти з Васійй5 ритішз (7адо еї 2о а. Арріє4й і ЄЕпмігоптепіа! Місгоріоюду 61:4484-4486, 1995| використовували для створення гена, оптимізованого для експресії в клітинах рослин. Відкриту рамку зчитування декарбоксилази ферулової кислоти синтезували за допомогою сполучення синтетичних олігонуклеотидів, що базуються на опублікованій послідовності. Олігонуклеотиди синтезували, базуючись, головним чином, на переважних кодонах надекспресованих генів Вгазвзіса парив. сч

Синтетичні олігонуклеотиди мали довжину приблизно 60 нуклеотидів. Будова олігонуклеотидних дуплексів включала на 5-кінці ВатНі-липкий кінець (5 (зЗАТС-) і ЕдоК! липкий кінець (3-ТТАА-5) на 3'-кінці. Збирали і) окремі дуплекси і утворювалась відкрита рамка зчитування на повну довжину з 5' Ватні і Зі ЕсокКіІ сайтами.

Реакції зв'язування проводили згідно зі стандартними протоколами. Продукти зв'язування, у свою чергу, зв'язували у вектор для клонування. с зо При приєднанні вищезгаданого синтетичного гена у ВатНі-ЕсокКіІ розщеплювану рВішпевзстгірі 5К- (Зіа(адепе), клони з 0,5 т.п.н. вставкою визначали за допомогою скринінгу плазміди ДНК з клонів Е. соїї. Потенційних со кандидатів піддавали скринінгу й визначали нуклеотидну послідовність двох з клонів. Було знайдено, що кожний ю з клонів мав точкову мутацію, і ці дві точкові мутації були різними за розташуванням в двох вибраних клонах.

Відстань між цими мутаціями дозволяла реконструювати інтактний ген, сполучаючи дві немутовані частини гена о зв З ЦИХ клонів. Цей клон одержав назву рОоз97р1. Нуклеотидна послідовність цього синтетичного гена наведена на ї-

Фіг.17. Передбачувана послідовність амінокислот наведена на Фіг.18.

Функціональність синтетичного гена була перевірена за допомогою простого тесту. Декарбоксилаза ферулової кислоти перетворює ферулову кислоту на 4-вінілтваякол (4-МО). 4-МО має певний запах гвоздик і вважається за єдину найважливішу сполуку, що передає натуральний аромат гвоздик. Штам Езспегісніа сої з « рОЗУ9ТЬ1 при вирощуванні у присутності ТММ ферулової кислоти у середовищі для зростання дає чіткий запах ще) с гвоздики, тоді як культура без ферулової кислоти або культура штаму лише з вектором не мала запаху. НРІС аналіз культур, що поглинали ферулову кислоту, підтвердив зникнення ферулової кислоти. Виходячи з ;» вищезгаданих результатів, можна зробити висновок, що функціональний ген клонований в роз97р1.

Приклад 8: Генетична трансформація рослини, що несе ген, який кодує декарбоксилазу ферулової кислоти

Під контролем конститутивного промотору -І У цьому прикладі фермент -- декарбоксилазу ферулової кислоти, клоновану в ро597р1, вставляли у вектор для трансформації рослин КО400О |ОаЦа, К.5.5., Наттегіїйпаї, У.К., Рапспик, В., Реїіспег, І.Е., апа Кеїег, МУ., о 1992, Сепе 211:383-384)|, який був модифікований таким чином, щоб замість МозР-Мрі рослина-селективний с маркер КО400 містився злитий ген між див і прі (бив:пр). бив-прі був описаний попередньо |Оайа, МК.5.5.,

Наттегійпаї, 9У.К., Реїіспег, Г.Е., Стозру, МУ.Ї. і б. БЗеїмага), 1991, Сепе 211: 239-246)Ї. Ген декарбоксилази

Ме, ферулової кислоти розміщували під контролем 355 опромотору й плазміду використовували для

Із трансформування рослин тютюну згідно з стандартними протоколами.

Рестрикційна мапа вектора наведена на Фіг.19. Вектор роз97р3, як показано на Фіг.19, такий самий, як і рНОЗ'З1, за винятком наступного. На такій ж самій векторній основі рНб7З1 НіпапП-паріп Р-Ватні касету ов Заміщали на касету: 355 промотор вірусу мозаїки цвітної капусти-лідерна послідовність вірусу мозаїки люцерни описана в К.5.5. Юайа, ЕР. ВекККаоці, У. К. Наттегіїпа!, с. Ріїаїе, О.І. Юипеіап апа МУЛ. Стовру. Ітргомей

Ф) підп-Іеме! сопвійшіме Тогедп депе ехргезвіоп іп ріапів извіпд ап АММ КМА4 ипігапзіаїе(й Іесадег зедпепсе, ка Ріапі Зсіепсе 94: 139-149, 1993). Ця частина промотора одержала скорочену назву 355 на Фіг.19. Після 355 знаходиться відкрита рамка зчитування декарбоксилази ферулової кислоти, з'єднана за допомогою ВатнНі на бо З-кінці ї Есокі на З'-кінці замість відкритої рамки зчитування ХО рНнз7з31.

Були відкриті трансгенні рослини, що експресували ген декарбоксилази ферулової кислоти. Рослини досліджували на рівень фенольних сполук і вивільнення вінілгваяколу.

Використовуючи Вестерн-блот аналіз з використанням поліклональних антитіл проти декарбоксилази ферулової кислоти, було знайдено, що незалежні трансгенні рослини тютюну, що несуть ген декарбоксилази 65 ферулової кислоти, містять імунореактивний поліпептид передбачуваного розміру. Нетрансформовані рослини не мали імунореактивного пептиду. Це підтверджує факт трансгенної експресії білка декарбоксилази ферулової кислоти в цих трансгенних рослинах.

Приклад 9: Генетична трансформація рослини, що містить ген, який кодує декарбоксилазу ферулової кислоти під контролем тканино-селективного промотору.

У цьому прикладі фермент -- декарбоксилазу ферулової кислоти, клоновану в ро597р1, вставляли у вектор

КО400 для трансформації рослин. Ген декарбоксилази ферулової кислоти розміщували під контролем насіння-специфічного паріп-промотору з В. париз і потім плазміду використовували для трансформування рослин тютюну згідно зі стандартними протоколами. Рестрикційна мала вектора наведена на Фіг.20. Вектор роз97р2, як показано на Фіг.20, такий самий як і р597р3, за винятком того, що на тому ж самому векторі 7/0. Ніпап-355-Ватні касета була заміщена на НіпаїІ-паріп промотор-ВатнНі касету, показану на Фіг.12 для рНн5е731.

Були відкриті трансгенні рослини, що експресували ген декарбоксилази ферулової кислоти. Рослини досліджували на рівень фенольних сполук і вивільнення вінілгваяколу.

Приклад 10. Визначення тканинної специфічності й накопичення в насінні фітинової кислоти під час вистигання насіння хрестоцвітої рослини, Вгазвіса парив.

Біосинтез фітинової кислоти.

У цьому прикладі дані стосовно біосинтетичного шляху фітинової кислоти визначали у насінні Вгазвіса.

Оскільки фітинова кислота є гексафосфатною похідною міоінозиту (фітинова кислота позначається як ІР б), визначали співвідношення окремих фосфорилованих похідних міоінозиту (наприклад ІР 4, ІР», ІРз, ІР,. і ІРв) із загальних похідних фосфорилованого інозиту. Чисту фітинову кислоту, частково зруйновану за допомогою 2о аутоклавування для одержання різних фосфорилованих похідних, використовували як стандарт для аналізу

НРГІС, проведеного згідно з Мегоп і Воппегі (1992. Тпе ЕМВО доигпа! 11:2077-2085) і Мегпоп ОМ, Тагсгупекі МС і Удепзеп КО і Воппегі Ну), (1993. Тне Ріапі доигпаї 4: 199-205.

Різні форми фосфорилованого інозиту (наприклад ІР., ІРо, ІРз, ІР; і ІРб5) і фітинової кислоти легко розрізнялися за допомогою цього аналізу. Лише один пік був знайдений, і відповідав ІР б (тобто, фітиновій сч ов Кислоті), коли аналізували зразки інозитфосфату, екстрагованого з насіння Вгазвіса, що вистигало. Цей результат показав, що ІРе є головною формою інозитфосфату в насінні, що вистигає, і що інші проміжні і) фосфориловані форми інозиту не можна було виявити за допомогою НРІ С описаними способами. Таким чином, вважається, що біосинтез фітинової кислоти з міоінозиту відбувається швидко й головним чином кількісно.

Біосинтез фітинової кислоти під час вистигання. с зо У цій частині прикладу визначали накопичення фітинової кислоти протягом вистигання насіння. Способи визначення рівня фітинової кислоти в насінні були наступними: ісе)

Насіння перетирали у ступці в присутності рідкого азоту і порошок переносили у 15-мл стерильну пробірку, ю що містила 5мл 0,5М НОЇ. Після видалення ліпідів за допомогою екстрагування гексаном фазу, що залишилась (водну фазу із залишками тканини) обробляли ультразвуком протягом 90 секунд на рівні З ультразвуковим о рідинним процесором |Моде! ХІ/2020, Неаї Зувієтв, Іпс., Фармінгдаль, штат Нью-Йорк, СШАЇ. Після ї- центрифугування рідину переносили у свіжу пробірку для аналізу фітинової кислоти за допомогою НРІ С. Цей спосіб застосовували до насіння на різних стадіях стиглості.

Накопичення фітинової кислоти протягом вистигання насіння наведено на Фіг.21. Хоча фітинову кислоту спочатку можна спостерігати в насінні на дуже ранніх стадіях (тобто 12 днів після запилення), рівень її « значно не підвищується до 22 днів після запилення. Протягом 10-добового періоду після її першої появи з с фітинова кислота досягає максимального рівня приблизно 24Омкг/насіння. Рівень фітинової кислоти відносно сухої маси стиглого насіння становив приблизно 3,295. Ці результати вказують, що зменшення кількості фітинової ;» кислоти через взаємодію з біосинтезом фітинової кислоти потребує промотору, що здатний експресувати ген приблизно з 12 ДПЗ до достигання насіння.

Подальшій аналіз показав, що фітинова кислота головним чином накопичується в ембріональній тканині -І більш ніж в насінній шкірці (Фіг.22). Сім'ядолі містять майже 9095 фітинової кислоти насіння і 1095 присутні в осі зародків. Ці дослідження дозволяють припустити, що різні ембріональні тканини є найбільш переважними о тканинами-мішенями для зменшення рівня фітинової кислоти за допомогою генетичної модифікації біосинтезу с фітинової кислоти.

Приклад 11. Визначення метаболізму міоінозиту в тканинах насіння, що вистигає.

Ме, Цей приклад ілюструє частину пулу міоінозиту, що використовується для біосинтезу фітинової кислоти. Хоча

Ге міоїнозит є попередником синтезу фітинової кислоти у рослин, він також використовується в інших анаболічних шляхах для одержання фосфатидилінозиту й компонентів клітинної стінки. Цей приклад ілюструє частину загального пулу міоїнозиту, що використовується для біосинтезу фітинової кислоти в насінні, що вистигає. Мічення насіння Вгазвіса іп мімо, використовуючи ЗН-міоїнозит, застосовували для спостерігання розповсюдження інозиту в різних фракціях, що екстрагували різними розчинниками. Спосіб, що використовували

ІФ) для імпульсного мічення насіння іп мімо, що вистигає, ЗН-міоіїнозитом, описаний наступним чином. Видаляли іме) стручки на різних стадіях розвитку, і кінець із розрізом відразу ж переносили у 10 мл стерильного культурального середовища, що містило 5мкКі ЗН-міоінозиту у 50-мл пробірці, і культивували за стандартних 60 умов для росту (202 протягом 16 годин у світлі, 1593 протягом 8 годин без світла) протягом двох днів. Насіння збирали для екстрагування ліпідів, фітинових кислот, компонентів трифтороцтової кислоти (ТРА)-розчинної клітинної стінки й уламків клітинної стінки. Радіоактивність визначали в кожній фракції за допомогою рідинного сцинтиляційного лічильника.

Виконували чотири типи екстракцій з насіння з імпульсним міченням для відокремлення водорозчинних бо клітинних компонентів (для аналізу фітинової кислоти), гексанрозчинних (аналізу ліпідів), трифтороцтова кислота (ТЕРА)-розчинних компонентів клітинної стінки й уламків клітин. На Фіг.23 представлено середню радіоактивність в кожній фракції на різних стадіях розвитку насіння. Дані свідчать, що більш ніж 2090 загального рівня мітки в насінні знаходиться в ліпідній фракції на 25-30 днях після запилення (ДПЗ).

Радіоактивність у фракціях клітинної стінки (ТЕРА-розчинної клітинної стінки й уламків клітин) становить приблизно 595 загального рівня мітки, включеної протягом розвитку насіння. Радіоактивність у водорозчинній фракції надалі аналізували за допомогою НРІ С для визначення частини фітинової кислоти. Було знайдено, що приблизно 1095 мітки у водорозчинному екстракті знаходиться у піці фітинової кислоти й приблизно 3090 мітки знаходилось у піці ін'єкції зразка, який є вільним міоінозитом. Інший мічений матеріал, присутній у водорозчинному екстракті, виділяли у пре- і пост-піках фітинової кислоти, що представляють невизначені 7/0 сполуки.

Відсоток метаболізованої мітки, знайденої у фракціях фітинової кислоти, ліпідів, ТРА-розчинної клітинної стінки й уламків клітин, наведений на Фіг.3. Приблизно 3095 мітки з ЗН-міоінозит-похідних метаболітів знаходиться в фітиновій кислоті на 20-30 ДПЗ. Одночасно, приблизно 6095 мітки були присутні в ліпідах (інозитвмісних фосфоліпідах) і менш, ніж 1095 у фракції клітинної стінки.

Таким чином, частина загального пулу міоіїнозиту, що використовується для біосинтезу фітинової кислоти, становить приблизно 3095 у період розвитку насіння, коли біосинтез фітинової кислоти є максимальним.

Приклад 12. Клонування гену, що кодує фермент, здатний діяти на міоінозит.

У цьому прикладі виділяли ген, здатний діяти на міоінозит. Геном був ген інозит О-метил-трансферази із звичайних рослин родини Аі2гоасеае. Клонування з використанням зворотної транскриптази використовували для виділення гена, як описано нижче. Стандартні процедури з ДНК виконували згідно з |Мапіаїйіз еї.аї.,

Моїіесшіаг Сіопіпо, А І арогаїюгу Мапиаї, Соїа Зргіпд Нагброг І арогаюгу, Соїй Зргіпд Нагброг, ММ.

Загальну РНК екстрагували з оброблених 500ММ Масі тканин листя Аігоасеае і очищали полі (АХАРНК. Цю

МРНК використовували для зворотної транскрипції за допомогою Зирегзстгірі ІІ Кемегзе Тгапсгіріазе (Рготеда,

Мадізоп, УМІ.) за наступних умов: три мкг мРНК, розчинені в 20мкл води, використовували як матрицю. РНК Га денатурували за допомогою нагрівання при 652 протягом 5 хвилин, потім охолоджували на льоді. До композиції додавали Змкл оліго-д! (50Омкг/мл), вмкл 5Х буфера зворотної транскриптази, 4мкл 01М ОТ, 2мкл 10ММ о дНтТФатів. Суміш нагрівали до 422С, потім додавали Змкл (60 одиниць) зворотної транскриптази Зирегігапзсгірі

ІЇ. Реакцію виконували протягом однієї години при 4220. Після цього періоду часу, додавали їмкл РНКази Н (1,5О/мкл) і реакцію виконували протягом ЗО хвилин при 3720. КДНК, що утворилася, використовували як с матрицю для РСК за допомогою Мепі полімерази за наступних умов: реакцію РОК виконували у 100Омкл об'єму з «о циклами, що складаються з 949 протягом хвилини, 5529 протягом хвилини, 729С протягом хвилини з 2-секундними подовженнями протягом кожного циклу в загальних 30 циклах. Праймери, що використовували в о цій реакції, були основані на опублікованій послідовності ІМТ ДНК (СепВапк реєстраційний номер М87340). У

Переднім праймером, що використовували, була послідовність І.О. Мо.6:

УТТТТТОбАТССАТОАСТАСТТАСАСААТООССААСТАСА З - яка містить сайт Ватні на б5'-кінці (підкреслено) Заднім праймером, що використовували, була послідовність І.О. Мо.7:

УТТТТТТТТОСООССОСАТААДАСОСААДАТСАТАСАСТО « дю яка містить сайт Мої! на 5'-кінці (підкреслено). з

Ампліфікований фрагмент ДНК розщеплювали Ватн І і Мої І і потім субклонували в РЗРОКТ 1 (ВК, ВеїНегзаа, с МО). Розщеплений Ват НІ, Мої І фрагмент РОК клонували у відповідні сайти вектора рЗРОКТ з утворенням :з» рарогіМтТ. На Фіг.24 (Послідовність І.О. Мо.5) показано послідовність ампліфікованого фрагменту ДНК, який є ідентичним опублікованій послідовності ІМТ ДНК за винятком двох основ у 3'-нетрансльованій ділянці.

Передбачувана послідовність білка є ідентичною опублікованим даним від СепеВапк. - 15 Приклад 13: Створення векторів для трансформації рослин, що містить ген, який кодує фермент, здатний діяти на міоінозит: використання гена міоїнозит О-метилтрансФерази Аігоасеае. 1 Цей приклад ілюструє створення вектора для трансформації рослин, що містить ген, здатний діяти на сл міоіїнозит під контролем промотору, активного в клітинах рослин. Наведений вектор для трансформації рослин містить ген місіїнозит О-метилтрансферази під контролем промотору, активного у клітин насіння, тобто 355 (о) 50 промотор. Вектор створювали наступним чином: реропіМТ розщеплювали Ваїп НІ і Есо КІ для вивільнення гена "з ІМТ. Фрагмент гена ІМТ клонували в відповідні сайти рВішезсгірі 5ЗК(-), ІЗігаїедепе, їа оїа, СА. і плазміда, що утворилася, одержала назву рВіше!МТ. рВіиеМТ розщеплювали зЗре І і клонували у вектор рВІ 221 (СіопТесі), попередньо розрізаний Хра І. Вибирали плазміду, що містила ген ІМТ у правильній орієнтації відносно 355 промотору в рВІ 221, і розщеплювали Ніпа ПШ ії Есо КІ. Фрагмент 355-ІМТ - Моз термінатор переносили у рКО 400, що привело до створення вектора для трансформації рослин рЗ55ІМТ.

ГФ) Конструкт, що утворився, рЗ355ІМТ, містить касету: 355 промотор-ІМТ-505-Моз термінатор у рКОраоб0О і 7 показаний на Фіг.25.

Приклад 14: Створення векторів для трансформації рослин, що містять ген, який кодує фермент, здатний діяти на міоінозит під контролем насіння селективного промотору. 60 У цьому прикладі створювали ген, що кодує фермент, здатний діяти на міоінозит під контролем насіння-селективного промотора, у векторі для трансформації рослин. Геном, що використовували, був ген міоїнозит О-метилтрансферази й промотором був насіння-селективний паріп-промотор. Вектор одержав назву

РМІМТ.

Вектор рМІМТ будували наступним чином: Зре І-розщеплений фрагмент ІМГДНК (Приклад 4) лігували у рОНІ бо Іпаріп-промотор, як (описано Коппо-Мигазе еї аіЇ., 1994, Ріапі МоїІесшіаг Віоіоду, 26:1115-1124)) у Хбеї сайт, що привело до утворення касети паріп-промотор-ІМТ-Моз термінатор. Цю експресійну касету далі переносили у РКО400. Вектор, що утворився, наведений на Фіг.26.

Приклад 15: Трансформація Вгазвіса париз (У/евіаг) за допомогою РЗ5БІМТ.

Вектор рЗ355ІМТ вставляли в штам Адгобрасіегішт МРОО за допомогою стандартного потрійного сполучення, після чого виконували опосередковану Адгорасіегішт трансформацію Вгаззіса. Трансформацію виконували, як описано у Прикладі 4. Одержували рослини, трансформовані рЗ3551ІМТ, й перевіряли на рівень фітату.

Приклад 16: Молекулярний аналіз трансгенних рослин

Трансгенні рослини ЕР, що містили Самм 355-ІМТ експресійну касету, аналізували за допомогою РСК, 7/0 Саузерн та Нозерн-блотів, а також аналізу на фермент ІМТ. Попередній аналіз РСК показав, що усі трансгенні рослини містили ген ІМТ (Фіг.27). Саузерн - гібридизація показала, що ген ІМТ інтегрувався у геном Вгазвіса з різною кількістю копій. Загальну РНК екстрагували з насіння, що вистигає, для нозерн - гібридизації, як показано на Фіг.28.

Приклад 17: Аналіз Фітинової кислоти в трансгенних рослинах.

Рівень фітинової кислоти визначали у стиглому насінні, що збирали з ЕР, трансгенних рослин. Екстрагування насіння виконували, як описано у Прикладі 10. Зібрані дані показують, що в середньому зменшення більш ніж на 1595 фітинової кислоти знаходиться в трансгенних рослинах. На Фіг.29 і 30 показано ці дані. Зібрані дані показують, що в середньому зменшення більш ніж на 1595 фітинової кислоти знаходиться в трансгенних рослинах, що містять реІМТ вектор. Енасіння -- це композиції трансгенного й нетрансгенного насіння завдяки 2о сегрегації таким чином, справжнє зменшення рівня фітинової кислоти є значно вищим на кожне трансформоване насіння. РЕ» і Ез насіння -- це гомозиготні лінії, що містять вектор рзІМТ. Очевидним є те, що в польових умовах гомозиготні лінії що несуть рзІМТ вектор, виявили в середньому 3096 зменшення рівня фітинової кислоти в насінні. Окрім визначення рівня фітинової кислоти, виконували Саузерн-блот аналіз для визначення кількості копій вставлених генів. Навіть у рослин з однією вставкою гена спостерігається значне сч ов Зменшення (3470) фітинової кислоти (наприклад, рослина МеТРІ1). Таким чином, експресія ферменту здатна модифікувати міоіїнозит в тканинах, які відповідають за біосинтез фітинової кислоти, що призводить до (8) зменшення кількості фітинової кислоти в насінні. Також зрозуміло, що ознака меншого рівня фітинової кислоти може бути передана статево, оскільки вона успадковується, таким чином, спосіб використання може також включати передачу ознаки за допомогою загальноприйнятих способів розведення, як тільки ознаку низького с зо рівня фітинової кислоти буде закріплено.

Приклад 18: Трансформація рМІМТ Вгазвіса пасив. ісе)

Вектор рЗ5ЗМІМТ вставляли в Адгорасіегішт штам МРОО за допомогою стандартного потрійного сполучення, ю після чого виконували Адгорасіегіцт-опосередковану трансформацію Вгаззіса. Трансформацію виконували, як описано у Прикладі 4. о

Рослини, трансформовані рЗ5МІМТ, одержували й перевіряли на зменшений рівень фітинової кислоти, як ї- зазначено у Прикладі 17. На Фіг.31 показано таблицю даних, зібраних з Е; і Р» трансгенного насіння, що несе

РМІМТ вектор, вирощеного у польових умовах. У Е- рослин вставка рМІМТ піддалася сегрегації, таким чином насіння, що перевіряли, було сумішшю трансгенних і нетрансгенних сегрегантів. У Е 5 поколінні, більшість з ліній були гомозиготними або майже гомозиготними. При аналізі 2 майже 4095 зменшення рівня фітинової «

Кислоти спостерігали у насінні з рослин, вирощених у польових умовах. Таким чином, експресія ферменту, в с здатного зменшувати доступність місінозиту для біосинтезу фітинової кислоти насіння-селективним чином, призводить до значного зменшення кількості фітинової кислоти. ;» Приклад 19: Утворення та накопичення УДФ-галактози не допускається шляхом використання ферменту, що є чужорідним клітинам рослини.

Фермент УДФ-галактоза 4-епімераза (даіЕ) бере участь в основних етапах метаболізму галактози в живих -І системах. Вона каталізує перетворення УДФ-галактози на УДФ-глюкозу. Ген ферменту доступний з людини, дріжджів і бактерій. о Мета цього прикладу - надекспресувати цей фермент у певних тканинах рослини-мішені з метою збільшення с пулу УДФ-глюкози за рахунок УДФ-галактози. Передбачуваним результатом є зменшений біосинтез галактинолу, який є попередником нехарчових цукрозних глікозидів (КЕО-глікозиди (родина рафінози олігосахаридів),

Ме, наприклад, рафіноза, стахіоза тощо). Для того, щоб досягти цієї мети, потрібно зменшити швидкість накопичення

Ге небажаних КЕО-глікозидів, що призвело б до підвищеної доступності УДФ-глюкози й цукрози одночасно. Остання мала би брати участь і підсилювати інші метаболічні шляхи, де необхідна цукроза, або для утворення інших метаболітів, що є необхідними для рослини, або як джерело вуглецю для підвищеної продуктивності рослин (наприклад білки, ліпіди, загальний вихід тощо).

Цей приклад ілюструє використання бактеріального ферменту у вищих рослин для викликання метаболічного

Ф) перетворення одного з необхідних субстратів на інший, тоді як новий субстрат, що утворився, буде легко ка використовуватися рослиною у багатьох важливих метаболічних перетвореннях.

Приклад 20: Зміна кількості похідних цукру з використанням ферменту фосфоглюкомутази (ФГМ). во Фермент фосфоглюкомутаза (ФГМ) каталізує перетворення глюкози ((зІс)-1- і (Іс-б6 -фосфату в синтезі й поглинанні цукрози. Фермент відіграє основну роль в синтезі й використанні цукрози, крохмалю й глікогену, і присутній в усіх організмах. Ген цього ферменту доступний з багатьох еукаріотичних, а також бактеріальних джерел (наприклад, Адгорасіегіит).

Глюкозо-1-Ф і Глюкозо-6-Ф є необхідними субстратами у кількох головних метаболічних шляхах вуглеводів в 65 усіх живих організмах. Зокрема, Глюкозо-1-Ф є головним субстратом для одержання УДФф-глюкози, яка є основним субстратом біосинтезу цукрози. Глюкозо-6-Ф, з іншого боку, є основним початковим матеріалом для кількох взаємоперетворень цукрів, один з яких є синтез міоінозит-1-Р. Останній є основним субстратом і кофактором в синтезі фітинової кислоти і КЕО-цукрів відповідно.

Мета цього прикладу полягає в тому, що за допомогою надекспресії бактеріального гена РОМ у рослині-мішені відносне співвідношення Глюкозо-1-Ф до Глюкозо-6-Ф може бути змінено на користь однієї або другої з двох фосфорильованих форм глюкози (тканинозалежно). За допомогою правильного спрямування цієї активності, наприклад, в насінні, що вистигає (накопичуючі тканини), можна передбачити збільшення кількості

Глюкозо-1-Ф, яка буде потрібна для одержання УДФ- або АДФф-глюкози і, згодом цукрози та інших запасних речовин, таких як білки, ліпіди або крохмаль. З іншого боку, зменшення кількості Глюкозо-6-Ф призведе до 7/0 Зменшення кількості нехарчових факторів, згаданих вище.

Приклад 21: Створення та регенерація трансгенних клітин кукурудзи.

Культури калюсу типу І! ініцювали з нестиглих зиготних ембріонів генотипу Ні-І КАгтвігопд еї аї., (1991) Маїге Сепеї. Соор. Мемувіей, 65; 92-93)Ї. Нестиглі ембріони виділяли приблизно на 14 день після запилення з качанів, що вирощували у теплицях, з кросів між Ні-ІЇ батьківською рослиною А і НіІ-ЇЇ /5 батьківською рослиною В або Го ембріонів з само- або запилення серед сибсів Ні-ІЇ рослин. Нестиглі ембріони (1,5--3,5мм) культивували у середовищі для ініціювання, що містило Мб солі й вітаміни (Спи еї аї., (1978) Тпе

Мб тедіит апа йв арріїсайоп (о апоїйег сийиге ої сегеаІ! сгорв. Ргос. Зутр. Ріапі Тізвие Сийшге, Рекіпд

Егеез, 43-56), 1,0мг/Л 2,4-О0, 25мММ І-проліну, 10Омг/л казеїнового гідролізату, ТОмг/л Ао9МОз, 2,5г/л СЕ КІТЕ

Ізспмеїігегпа!ї, Зоцій Ріаїпйей, МЛ, і 20Ог/л цукрози з рН5.8. Після 4-6 тижнів калюс субкультивували на середовище для зростання (середовище для ініціювання, в якому АОМО з відсутній та І-пролін зменшений до бмМ). Селекцію для калюсу типу ІЇ виконували через 12-16 тижнів.

Для бомбардування або введення чужорідної ДНК в клітини рослини (трансформація через бомбардування мікрочастками), 14Омкг плазмідної ДНК (наприклад, вектор, що містить 355-РАТ/промотор глобуліну кукурудзи//МТ), осаджували на 60 мг сферичні золоті частки, промиті спиртом (1,5--3,О0мкм у діаметрі, Аїагісн сч

Спетіса! Со., Іпс., Мім"ацКее, МІ), за допомогою додавання 74мкл 2,5М СасСі» НьО і ЗОмкл 0,1М спермідину (вільна основа) до З0Омкл плазмідної ДНК і Н2О. Розчин відразу ж збовтували, і золоті частки, вкриті ДНК, (8) осаджувались. Видаляли чистий супернатант, що утворився, і золоті частки ресуспендували в їмл абсолютного етанолу. Цю суспензію розводили абсолютним етанолом для того, щоб одержати 15 мг ДНК-вкритих золота/мл.

Краще, якщо використовувана плазмідна ДНК містить селективний маркер, такий як ген Баг або раї, що с зо надає резистентності до фосфінотрицину або гербіциду глюфозинату амонію, і генетичний конструкт, здатний змінювати вторинний метаболізм, такий як кодуюча ділянка гена ІМТ, описаного на Фіг.24 або кодуюча ділянка со гена декарбоксилази ферулової кислоти, описана на Фіг.17, під контролем придатного насіння-селективного ю промотору, такого як промотор глобуліну 1 кукурудзи, або промотор зеїну кукурудзи. Як альтернатива, може бути використаний конститутивний промотор, такий як убіквітиновий промотор кукурудзи або промотор актину рису о

Зв ДЛЯ експресії ІМТ або декарбоксилази ферулової кислоти. ї-

Приблизно бООмг ембріоногенного калюсу тканини розподіляли вздовж поверхні середовища для зростання калюсу типу ІЇ без казеїнового гідролізату і І-проліну, але з 0,2М сорбітом і 0,2М манітом, як осмотичними агентами. Калюс витримували протягом 4 годин як попередньо оброблений і потім переносили на посудини для культивування, що містили середовище для бомбардування (осмотичне середовище, що загущували 20г/л ТС « агару (РпуютТесппоїоду Гарогаїюогіез, ГІС, Зпамупеє Міввіоп, КЗ) замість 7 г/л. ЗЕКІТЕ. Гелієвий газ (як з с активна сила) використовували для прискорення суспендованих ДНК-вкритих золотих часток в напрямку та в одержані тканини-мішені. Використовуваний пристрій описаний у патенті США Мо5141131, який включений сюди ;» шляхом посилання. Тканини вкривали пластинкою з нержавіючої сталі (104мкм отвори) і переносили у частковий вакуум 62,5мм ртутного стовпчика в камері пристрою. ДНК-вкриті золоті частки розводили 1:11 абсолютним етанолом перед бомбардуванням і бомбардували калюс чотири рази, використовуючи тиск гелію в 10,342МПа, -І кожний раз бомбардуючи 2Омкл суспензії ДНК/золото. Відразу ж після бомбардування тканини переносили на осмотичне середовище для відновлення протягом 16-24 годин. Після цього тканини розрізали на маленькі о шматки й переносили на селективне середовище (середовище для зростання без казеїнового гідролізату і с Ї-проліну, але з ЗОмг/л ВАБТАФ (АагЕмо, Вегіїп, Септапу). Кожні чотири тижні протягом З місяців шматочки 5р тканин неселективно переносили на свіже селективне середовище. Після / тижнів і аж до 22 тижнів сектори

Ме, калюса, що виявили проліферацію, видаляли і відокремлювали. ВАВТАФ -резистентні тканині, що утворилися,

Ге субкультивували кожні два тижні на свіже селективне середовище. Після відповідного аналізу ідентифікували позитивні трансгенні лінії та переносили на середовище для регенерації.

Регенерацію ініцювали за допомогою перенесення тканин калюсу до середовищ для індукування з дв Цитокінами, яке складається з солей Мигазпіде і ЗКосд--далі М5-солей, і вітамінів Мигазпіде апа ЗКосо, (1962)

Ріузіо!ї. Ріапі. 15:473-497| ЗОг/л цукрози, 1О0Омг/л міоінозиту, ЗОг/л манітолу, 5 мг/л б-бензиламінопурину, --

Ф) далі ВАР, 0,025мг/л 2,4-О0, ЗОмг/л ВА5ТА і 2,5г/л СЕЇ КІТЕ при рнН5.7. Культури розміщували під слабким світлом ка (125Кд) протягом тижня, після чого один тиждень витримували під блискучим світлом (325Кд). Після двотижневого періоду індукції тканини неселективно переносили на середовище для регенерації, що не містило бо гормонів, яке є ідентичним середовищу для індукування, за винятком того, що йому бракувало 2,4-О0 і ВАР, і утримували під блискучим світлом. Видаляли малі (1,5-З3см) кільчики й переносили в 150Х525мм посудини для культивування, що містили ЗН-середовище (ЗН-солі та вітаміни (ЗспепкК апа Ніїідебгапаї, (1972) Сап. 9. Вої. 50:199-204)), 10г/л цукрози, 10Омг/л міоінозиту, 5мл/л ГеєОТА і 2,5г/л СЕЇ КІТЕ, рН5,8).

Більші кільчики переносили у 12см горщики, що містили приблизно 0.25кКг МЕТКО-МІХ 360 (Те Зсойнв Со. 65 МагузмуШе, ОН), в теплицю, як тільки вони почали рости й розвили достатню кореневу систему. Кільчики вирощували при фотоперіоді протягом 16 годин, що створювався за допомогою комбінації натрієвих та металевих галідних ламп з високим тиском, і поливали при потребі комбінацією трьох незалежних добривних композицій Рейеге Ехсе! (Сгасе-Зіета Нопісийига! Ргодисів Сотрапу, Міїрйаз, СА). При появі 6-8 листків рослини пересаджували у 18,9л горщики, що містили приблизно 4кг МЕТКО-МІХ 360, і вирощували до зрілих

Вослин трансгенної кукурудзи. Насіння з цих рослин містило гени, вставлені у нестиглі ембріони, і при вирощуванні у рослини експресували білки, що кодувались за допомогою вставленої ДНК.

Приклад 22 : Створення трансгенного рису.

Для ініціювання ембріогенного калюсу стигле насіння японського сорту Таіреі 309 очищували і піддавали поверхневій стерилізації 7095 етанолом протягом 2-5 хвилин, після чого 30-45 хвилин просочували у 5090 76 комерційному відбілювачі (2,695 гіпохлориті натрію) з кількома краплинами мила "ІГідціпох". Насіння потім промивали тричі стерильною дистильованою водою й переносили на фільтрувальний папір перед перенесенням на середовище для індукції калюсу (тобто, МВ). МВ-середовище складається з Мб макроелементів (Спи, 1978,

Мб середовище і його застосування на культуру пиляків зернових культур. (Ргос. Зугпр. Ріапі Тіззцие Сипиге,

РекКіпд Ргезз, р. 43-56Ї), В5 мікроелементи та вітаміни |(Сатрогуд еї аїЇ. 1968, Мийгіепі гедцігетепів ої 7/5 Визрепвіоп сиМигез ої воуреап гоої сеїв. Ехр. Сей Кев. 50: 151-158), З0Омг/л казеїнового гідролізату, 500 мг/л І-проліну, 500 мг/л І-глутаміну, ЗО г/л цукрози, 2мг/л 2,4-дихлор-фенокиоцтова кислота (2,4-Ю3) і 2,5г/л деїшще (ЗспуеігегнаїЇї, МО) з рН-5,8. Стигле насіння, що культивували на середовищі калюса для індукції, інкубували в темряві при 232С. Після З тижнів культивування основний калюс, що утворився зі щиткової ділянки стиглого зародка, переносили на свіже МВ-середовище для наступного вирощування.

Використовували трансформацію Віоїївііс тканин рослин для введення чужорідної ДНК. Приблизно 14Омкг плазмідної ДНК осаджували на бОмг 1,0мкм (Віс-Кай) золотих часток, як описано у Прикладі 21.

Використовували плазміду, яка містила промотор убіквітину кукурудзи, що керує пре (гігроміцин-фосфотрансферазу), і убіквітин 1 кукурудзи, глобулін 1 кукурудзи або зеїновий промотор, що керує геном ІМТ. Приблизно 14Омкг плазмідної ДНК осаджували на бомг 1,Омкм (Віо-Кад) золотих часток, як описано у с цьому винаході.

Для бомбардування гелієм активно зростаючі ембріогенні культури калюсу 2-4мм в розмірі піддавали великій о осмотичній обробці. Ця обробка включала розміщення калюсу на МВ-середовище з 0,2М манітолом і 02М сорбітом Маїп еї а!., 1993, Озтоїїсут ігеаійтепі епспапсез рагісіє ротрагатепі-теаіа(ей (гапзіепі апа зіабіе ігапзіогтаїйоп ої гісе. Ріапі СеїЇ Кер. 12:84-88| протягом 4 годин перед гелієвим бомбардуванням. Після Га зо осмотичної обробки культури калюсу переносили на середовище для бомбардування (МВ4-290 агару) і накривали пластиною з нержавіючої сталі (230мкм). Культури калюсу бомбардували під тиском 13,789МПа двічі о на мішень. Після бомбардування калюс переносили назад на середовище з великою осмотичною силою ю протягом ночі перед перенесенням на селективне середовище, що містило МВ-середовище з ЗОмг/л гігроміцину.

Після 2 тижнів культури переносили на свіже селективне середовище з вищою концентрацією селекційного о

Зз5 агента, тобто МВжб5Омг/л гігроміцину МКС ек а. 1993) Ап ітргомей гісе (гапвіогта(йоп звувіет ивіпд (Ше Кк

Бріоїївііс теїпса. Ріапі Сеї! Кер. 12: 250-255).

Невеличкі, біло-жовті ембріогенні культури калюсу, вирощені на МВя50О мг/л гігроміцину, регенерували за допомогою перенесення на прорегенераційне (РК) середовище ї-50 мг/л гігроміцину. РЕ-середовище складається з МВ-середовища з 2мг/л бензиламінопурину (ВАР), і Імг/л нафталіноцтової кислоти (МАА), і 5мг/л « абсцизової кислоти (АВА). Після 2 тижнів культивування в темряві калюс переносили на регенераційне шщ с середовище (КМ). Склад КМ-середовища -- це МВ-середовище з Змг/л ВАР і 0О,5мг/л МАА. Культури калюсу на й КМ-середовищі інкубували протягом 2 тижнів при 282С під сильним флуоресцентним світлом (325Кд). Після того, "» як у кільчиків з'являлися 2см корінці, їх переносили у магентові ящики, що містили 1/2 М5-середовища

ІМигазпіде апа 5Коод, 1962, А гемівей тедішт їог гарій дгоули апа Біоаззауз м/йй (орасоо (ізвце сийигев.

РНузіоІї. Ріапі 15:473-497)| з 1/2 Вб-вітамінами, 1Ог/л цукрози, О,О5мг/л МАА, 5Омг/л гігроміцину і 2,5г/л -І деїпййе з рН 5,8. Великі рослини 8-15см з добре розвинутою кореневою системою переносили на грунт (1

МЕТКО-МІХ: 1 верхній шар грунту) і вирощували в теплиці (29/24 день/ніч цикл, 50-60905 вологість, 12 й годинний фотоперіодизм). Рослини рису вирощували у стиглі трансгенні рослини. Насіння з цих рослин містило (9) гени, вставлені в клітини рису, і при виростанні в рослини експресували білки, що були кодовані вставленою бу 20 днк.

Ко) Ф ормула винаходу 1. Спосіб покращення харчового профілю рослини, що складається з: - забезпечення ДНК послідовності, що кодує фермент, здатний модифікувати використання проміжного о субстрату у вторинному метаболічному шляху, зв'язаний з харчовим профілем рослини, причому зазначений ко фермент не зустрічається в природі у вказаному вторинному метаболічному шляху; - трансформування рослинної клітини вказаної рослини експресійною касетою, що містить вказану діючу ДНК бо послідовність, операбельноз'єднану з насіннєселективним промотором, та - регенерація генетично зміненої рослини з вказаної рослинної клітини, причому вказана генетично змінена рослина характеризується покращеним харчовим профілем по відношенню до дикого типу вказаної рослини. 2. Спосіб за п. 1 який відрізняється тим, що вказаним вторинним метаболічним шляхом є фенілпропаноїдний шлях. 65 3. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний фермент є холіновим метаболізуючим ферментом. 4. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що вказаним холіновим метаболізуючим ферментом є

Claims (1)

1. холіноксидаза.

   5. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що вказана експресійна касета, додатково містить ДНК послідовність, що кодує бетаїн-альдегіддегідрогеназу, здатну перетворювати альдегід бетаїну на бетаїн.

   6. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний фермент впливає на ферулову кислоту.

   7. Спосіб за п. 6, який відрізняється тим, що вказаним ферментом є декарбоксилаза ферулової кислоти.

   8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вказаним вторинним метаболічним шляхом є вторинний метаболічний шлях цукрового спирту.

   9. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що вказаний субстрат вибрано із групи, що складається з 7/0 Міоінозиту, галактинолу та УДФ-похідних цукрів.

   10. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що вказаним субстратом є міоінозит, а вказаним ферментом є фермент, що діє на міоінозит.

   11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що вказаним ферментом є міоінозит-О-метилтрансфераза.

   12. Спосіб за п. 11, який відрізняється тим, що вказана міоінозит-О-метилтрансфераза має ДНК 7/5 послідовність міоїнозит-О-метилтрансферази Мезетбгуапілетит стувіайпит.

   13. Спосіб за п. 8, який відрізняється тим, що вказаний покращений харчовий профіль включає зменшений склад фітинової кислоти в порівнянні з диким типом вказаної рослини.

   14. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний покращений харчовий профіль включає зменшений склад синапіну в порівнянні з диким типом вказаної рослини.

   15. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вказаний покращений харчовий профіль включає змінений склад лігніну в порівнянні з диким типом вказаної рослини.

   16. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що вказаним субстратом не є первинний метаболіт з групи, що складається з глюкози, амінокислот, простих жирних кислот та нуклеотидів.

   17. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що вказаним насінним промотором є сч фазеоліновий промотор або лар/п-промотор.

   18. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який додатково містить наступну стадію: (8) вирощування вищевказаної генетично зміненої рослини за умов, які дозволяють утворення насіння та регенерацію цього насіння.

   19. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що рослина вибрана з дводольних / с зо ОДНОДОлЬьнИХ.

   20. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що вищезгадана рослина вибрана з ісе) родини бБ/аз5з5/сасеае, краще з роду В/азз/са, краще В/авв/са гара або Вгазв/іса парив. ю

   21. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-15, який відрізняється тим, що вищезгадана рослина вибрана із групи, що складається з кукурудзи, каноли, пшениці, ячменю, люцерни, сої та сорго. о

   22. Генетично змінена рослина або її нащадок, що містить рекомбіновану молекулу ДНК, стабільно вбудовану ї- в ген згаданої рослини, причому вказана рекомбінантна молекула ДНК містить: насіннєселективний промотор; ДНК послідовність, операбельно з'єднану з зазначеним насіннєселективним промотором, яка кодує фермент, здатний модифікувати використання проміжного субстрату у вторинному метаболічному шляху, зв'язаному з « харчовим профілем рослини, причому фермент не зустрічається в природі у вказаному вторинному в с метаболічному шляху; причому згадана генетично змінена рослина, її клітина, насіння або складова вказаної генетично зміненої ;» рослини, або її нащадка, характеризується покращеним харчовим профілем рослини по відношенню до дикого типу вказаної рослини.

   23. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним вторинним -І метаболічним шляхом є фенілпропаноїдний шлях.

   24. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 23, яка відрізняється тим, що вказаним ферментом є о холіновий метаболізуючий фермент. с 25. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 24, яка відрізняється тим, що вказаним холіновим метаболізуючим ферментом є холіноксидаза. ме) 26. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 25, яка відрізняється тим, що вона додатково містить Ге ДНК послідовність, що кодує бетаїн-альдегіддегідрогеназу, здатну перетворювати альдегід бетаїну на бетаїн.

   27. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 23, яка відрізняється тим, що вказаний фермент впливає на ферулову кислоту.

   28. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 27, яка відрізняється тим, що вказаним ферментом є декарбоксилаза ферулової кислоти. Ф) 29. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним вторинним ка метаболічним шляхом є вторинний метаболічний шлях цукрового спирту.

   30. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаний субстрат во вибрано із групи, що складається з міоінозиту, галактинолу та УДФ-похідних цукрів.

   31. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаним субстратом є міоінозит, а вказаним ферментом є фермент, що діє на міоінозит.

   32. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 31, яка відрізняється тим, що вказаним ферментом є міоінозит-О-метилтрансфераза. 65 33. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 32, яка відрізняється тим, що вказана міоїінозит-О-метилтрансфераза має ДНК послідовність міоінозит-О-метилтрансферази /езетегуапілпетит стувіашпит.

   34. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-33, яка відрізняється тим, що вказаним субстратом не є первинний метаболіт з групи, що складається з глюкози, амінокислот, простих жирних Кислот та нуклеотидів.

   35. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-33, яка відрізняється тим, що вказаним насіннєселективним промотором є фазеоліновий промотор або лар/п-промотор.

   36. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вказаний покращений харчовий профіль включає зменшений склад фітинової кислоти в порівнянні з диким типом вказаної рослини. 70 37. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що включає зменшений склад синапіну, в порівнянні з диким типом вказаної рослини.

   38. Генетично змінена рослина або її нащадок за п. 22, яка відрізняється тим, що вона має змінений склад лігніну, в порівнянні з диким типом вказаної рослини.

   39. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, що /5 рослина вибрана з дводольних / однодольних.

   40. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, що вищезгадана рослина вибрана з родини В/азз/сасезе, краще з роду В/азвз/са, краще В/авв/са гара або Вгазвіса парив.

   41. Генетично змінена рослина або її нащадок за будь-яким з пунктів 22-38, яка відрізняється тим, що 2о вищезгадана рослина вибрана з групи, що складається з кукурудзи, каноли, пшениці, ячменю, люцерни, сої та сорго.

   42. Корм для тварин, який хоча б частково отримують з генетично зміненої рослини або її нащадка за будь-яким з пунктів 22-41, або з її клітини, насіння, або будь-якої іншої її складової. с щі 6) с (Се) ІФ) ІФ) і -

   - . и? -і 1 1 (о) Ко) іме) 60 б5