UA46357A - KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS - Google Patents
KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS Download PDFInfo
- Publication number
- UA46357A UA46357A UA2001074537A UA200174537A UA46357A UA 46357 A UA46357 A UA 46357A UA 2001074537 A UA2001074537 A UA 2001074537A UA 200174537 A UA200174537 A UA 200174537A UA 46357 A UA46357 A UA 46357A
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- activity
- tablet
- kit
- preparation
- proteinases
- Prior art date
Links
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 42
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims abstract description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 14
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims abstract description 5
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims abstract description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 20
- 229940071106 ethylenediaminetetraacetate Drugs 0.000 claims description 18
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 11
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 9
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 9
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 5
- 102100032491 Serine protease 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 101710151387 Serine protease 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101710119665 Trypsin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 abstract description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 abstract description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 abstract 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 abstract 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 abstract 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 6
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 4
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 description 3
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 description 3
- 102100024539 Chymase Human genes 0.000 description 3
- 108090000227 Chymases Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 101150010457 SAS5 gene Proteins 0.000 description 2
- -1 azo compound Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002849 elastaseinhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- GTTYPHLDORACJW-UHFFFAOYSA-N nitric acid;sodium Chemical compound [Na].O[N+]([O-])=O GTTYPHLDORACJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 2
- GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfamate Chemical compound [NH4+].NS([O-])(=O)=O GEHMBYLTCISYNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910004709 CaSi Inorganic materials 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000017274 Diospyros sandwicensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000282838 Lama Species 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 102100033174 Neutrophil elastase Human genes 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 101710132772 Peroxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 101000693530 Staphylococcus aureus Staphylokinase Proteins 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 108090000155 pancreatic elastase II Proteins 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003142 primary aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Винахід відноситься до біохімії і може бути використано у біології та медицині для наукових досліджень 2 для визначення активності кальцій-залежних протеїназ в біологічних рідинах, а також - в клінічній практиці.The invention relates to biochemistry and can be used in biology and medicine for scientific research 2 to determine the activity of calcium-dependent proteinases in biological fluids, as well as in clinical practice.
Відомий "Набір реактивів для визначення первинних ароматичних амінів у розчинах і біологічних рідинах" (див. Пат. РФ М 2097762, з 01 М 33/48, А 61 В 19/02), який містить у відповідних упаковках: - наважку трихлороцтової кислоти. При розчиненні у ЗХОмл дистильованої води дає розчин, що приводить до осаду білків; - смужки паперу із натрієм азотнокислим, які призначені для утворення діазотуючого розчину безпосередньо перед аналізом (ех (етроге); - наважку амонію сульфамінокислого, котра при розчиненні у 25мл дистильованої води дає розчин для зв'язування залишку натрію азотнокислого; - розчин М-(1)-нафтилетилендіамінодигідрохлориду для утворення забарвленої азосполуки, смужки паперу, 12 що містять 0,018мкмоль стандартного аміну, який аналізують. Використання набору дозволяє спростити проведення аналізу і підвищити його точність.The well-known "Set of reagents for the determination of primary aromatic amines in solutions and biological fluids" (see Pat. RF M 2097762, with 01 M 33/48, A 61 B 19/02), which contains in the appropriate packages: - a weight of trichloroacetic acid. When dissolved in ZHOml of distilled water, it gives a solution that leads to the precipitation of proteins; - strips of paper with sodium nitric acid, which are intended for the formation of a diazotizing solution immediately before the analysis (ex (etroge); - a weight of ammonium sulfamic acid, which, when dissolved in 25 ml of distilled water, gives a solution for binding the remaining sodium nitric acid; - solution M-(1 )-naphthylethylenediaminodihydrochloride to form a colored azo compound, paper strips, 12 containing 0.018 μmol of the standard amine being analyzed.Using the kit allows you to simplify the analysis and increase its accuracy.
Недоліком відомого рішення є призначення набору тільки для визначення ароматичних амінів.The disadvantage of the known solution is the appointment of the kit only for the determination of aromatic amines.
Відомий також "Набір для визначення активності нетрипсиноподібних протеїназ (НП), хімази, еластазоінгібіторної активності о-1-інгібітора протеїназ (о-1-І7) та рівня о-2-макроглобуліну (о0-2-МГ) в біологічних рідинах" (див. деклараційний патент України Мо 34208 А, МПК (301М33/48, Аб1819/02) - прототип, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із субстратом протеолітичної реакції, препарат протеїнази, фосфатний буфер для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, цитратний буфер, ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту. У 29 наборі для визначення хімази планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із « субстратом білкової природи, що містить послідовність Рго-Рпе. У наборі для визначення 0-2-МГ планшет іммобілізований маркерним ферментом, який комплексно пов'язаний із протамінсульфатом. Набір для визначення НП, хімази містить мг інгібітору трипсину із сої (СІТ) для пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ. Набір для визначення о-2-МГ містить Змг СІТ для пригнічення залишкової - активності трипсину. У наборі для визначення еластазоінгібіторної активності о-1-І препаратом протеїнази є М) еластаза. Усі компоненти надані у окремих упаковках при наступному складі компонентів: препарат протеїнази со (трипсин - 1мг, еластаза - 2 - бмкл), детергент - 0,75мл, фосфатний буфер - 12,5мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамін - 2мг або 1 таблетка, гідроперит -1 таблетка, СІТ -1 або Змг, відповідно. (Се)It is also known as "The kit for determining the activity of non-trypsin-like proteinases (NP), chymase, elastase inhibitory activity of o-1-inhibitor of proteinases (o-1-I7) and the level of o-2-macroglobulin (o0-2-MG) in biological fluids" (see . declaratory patent of Ukraine Mo 34208 A, IPC (301М33/48, Аб1819/02) - a prototype containing a polystyrene tablet with an immobilized marker enzyme that is complexly connected to the substrate of the proteolytic reaction, a proteinase preparation, a phosphate buffer for preparing a working proteinase solution , control material and experimental samples for analysis, detergent for preparation of washing liquid, citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite for detection of residual activity of the marker enzyme. In the 29 set for the determination of chymase, the tablet is immobilized with a marker enzyme that is complexly associated with "substrate of protein nature, containing the sequence Pgo-Rpe In the kit for the determination of 0-2-MG, the tablet is immobilized with a marker enzyme that is complexly linked with protamine sulfate. The kit for determining NP, chymase contains mg of soybean trypsin inhibitor (SIT) to inhibit the activity of trypsin-like proteinases. The kit for determination of o-2-MG contains Zmg SIT for inhibition of residual trypsin activity. In the kit for determining the elastase inhibitory activity o-1-I, the proteinase preparation is M) elastase. All components are provided in separate packages with the following composition of components: proteinase preparation (trypsin - 1 mg, elastase - 2 - bml), detergent - 0.75 ml, phosphate buffer - 12.5 ml, citrate buffer - bml, orthophenylenediamine - 2 mg or 1 tablet , hydroperit -1 tablet, SIT -1 or Zmg, respectively. (Se)
Недоліком відомого набору є неспецифічність щодо визначення кальпаїнів. «тThe disadvantage of the known kit is its non-specificity regarding the determination of calpains. "t
В основу винаходу поставлена задача розробки набору, за допомогою якого можна специфічно визначати активність кальпаїнів у біологічних рідинах.The invention is based on the task of developing a kit that can be used to specifically determine the activity of calpains in biological fluids.
Ця задача вирішується тим, що у наборі для визначення активності кальпаїнів в біологічних рідинах, який містить полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом, що комплексно пов'язаний із « 20 субстратом білкової природи, а саме альбуміном сироватки бика (БСА), препарат протеїнази, фосфатний буфер 73 с для приготування робочого розчину протеїнази, контрольного матеріалу і дослідних проб для аналізу, детергент для приготування миючої рідини, інгібітор для пригнічення активності окремих протеїназ, цитратний буфер, :з» ортофенілендіамін і гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту, усі компоненти подані в окремій упаковці при наступному складі: препарат протеїнази - трипсин - їмг, фосфатний буфер - 12,5мл, детергент - 0,75мл, цитратний буфер - бмл, ортофенілендіамін (ОФД) - 2мг або 1 таблетка, гідроперит - їз 1 таблетка.This task is solved by the fact that in the kit for determining the activity of calpains in biological fluids, which contains a polystyrene tablet with an immobilized marker enzyme, which is complexly associated with a protein substrate, namely bovine serum albumin (BSA), a proteinase preparation, phosphate buffer 73 s for the preparation of the working proteinase solution, control material and test samples for analysis, detergent for the preparation of washing liquid, inhibitor for inhibiting the activity of individual proteinases, citrate buffer, orthophenylenediamine and hydroperite for detecting the residual activity of the marker enzyme, all components are provided in separate packaging with the following composition: proteinase preparation - trypsin - 1 mg, phosphate buffer - 12.5 ml, detergent - 0.75 ml, citrate buffer - 1 ml, orthophenylenediamine (OFD) - 2 mg or 1 tablet, hydroperit - 1 tablet.
Згідно винаходу набір додатково містить хлорид кальцію (СаСі») у кількості не більш 18,Змг, цистеїн у (22) кількості не більш 25,98мг, а у якості інгібітору для пригнічення активності окремих протеїназ використовують с етилендіамінтетраацетат (ЕДТА) у кількості 96,Змг і менш.According to the invention, the set additionally contains calcium chloride (CaSi") in an amount of no more than 18.Zmg, cysteine in (22) an amount of no more than 25.98 mg, and as an inhibitor to inhibit the activity of individual proteinases, ethylenediaminetetraacetate (EDTA) is used in an amount of 96, Zmg and less.
Додаткова наявність у наборі Сасі 5 і цистеїну сприяє активації Са 2"-залежних нейтральних протеїназ, а о використання в якості інгібітору ЕДТА забезпечує пригнічення металопротеїназ. Це обумовлено тим, що "І активність кальпаїнів визначають як різницю протеолітичної активності зразків біологічної рідини з добавленням Сасі 5 і цистеїну до кінцевих концентрацій 5тМ і дублікатів зразків з добавленням ЕДТА до кінцевої концентрації т10тМ.The additional presence of Sasi 5 and cysteine in the set contributes to the activation of Sasi 2-dependent neutral proteinases, and the use of EDTA as an inhibitor provides inhibition of metalloproteinases. This is due to the fact that the activity of calpains is defined as the difference in the proteolytic activity of samples of biological fluid with the addition of Sasi 5 and cysteine to final concentrations of 5tM and duplicate samples with the addition of EDTA to a final concentration of 10tM.
Вміст і певна кількість компонентів у наборі забезпечує оптимальні умови для здійснення високочутливого ферментативного способу оцінки активності кальпаїнів одночасно 18 проб у дублікаті.The content and a certain number of components in the set provide optimal conditions for the implementation of a highly sensitive enzymatic method for evaluating the activity of calpains at the same time of 18 samples in duplicate.
Р» Дослідження по запропонованому наборові були проведені в Інституті терапії АМН України. Розрахунки комплектування наборів перевірено лабораторними іспитами.Research on the proposed set was conducted at the Institute of Therapy of the Medical Academy of Ukraine. Calculations for the completion of sets have been verified by laboratory tests.
Набір складається із наступних компонентів: 60 - Полістироловий планшет з іммобілізованим маркерним ферментом (наприклад, пероксидаза), який комплексно пов'язаний із субстратом білкової природи (альбумін сироватки бика) крім лунки АЇ - для контролю насичення забарвлення. - Препарат протеїнази (трипсин) - мг. - Фосфатний буфер для приготування вихідних розчинів трипсину, ЕДТА, Сасі 5» і цистеїну, контрольного 65 матеріалу і дослідних проб для аналізу - 12,5мл. - Детергент для приготування миючої рідини, твін-20 - 0,75мл.The kit consists of the following components: 60 - Polystyrene tablet with an immobilized marker enzyme (for example, peroxidase), which is complexly connected to a protein substrate (bull serum albumin) except for the AI well - to control the color saturation. - Proteinase drug (trypsin) - mg. - Phosphate buffer for preparing initial solutions of trypsin, EDTA, Sasi 5" and cysteine, control 65 material and experimental samples for analysis - 12.5 ml. - Detergent for preparation of washing liquid, twin-20 - 0.75 ml.
- Інгібітор ЕДТА - 96,Змг і менш. - Сасі » - не більш 18,Змг. - Цистеїн - не більш 25,98мг. - Цитратний буфер - бмл. - ОФД - 2мг або 1 таблетка. - Гідроперит для виявлення залишкової активності маркерного ферменту пероксидази -1 таблетка.- EDTA inhibitor - 96, Zmg and less. - Sasi » - no more than 18, Zmg. - Cysteine - no more than 25.98 mg. - Citrate buffer - bml. - OFD - 2 mg or 1 tablet. - Hydroperite to detect the residual activity of the marker enzyme peroxidase - 1 tablet.
Аналіз здійснюють за інструкцією, яка надається до набору.The analysis is carried out according to the instructions provided with the kit.
Приготування реагентів і матеріалів здійснюють таким чином: 70 1. Готують рідину для відмивання: 0,5мл детергенту додають до 1л дистильованої води. 2. Готують фосфатний буфер: рідину доводять до 250мл дистильованою водою і додають 0,25мМкл детергенту.Preparation of reagents and materials is carried out as follows: 70 1. Prepare liquid for washing: 0.5 ml of detergent is added to 1 liter of distilled water. 2. Prepare a phosphate buffer: bring the liquid to 250 ml with distilled water and add 0.25 ml of detergent.
З. Відмивають планшет 2 - З рази дистильованою водою, яка містить детергент. 4. Готують вихідний розчин трипсину додаванням 2мл 0,0025 М НОЇ, потім 160мкл отриманого розчину 7/5 додають до 25мл фосфатного буферу, що приготовлено згідно п.2. 5. Готують контрольний матеріал шляхом послідовного розведення за схемою згідно таблиці. ю 8 21овов тема, ові оима 30001110 лемв 098, ик 40060111 зм 06001100 ом 25 50040000 лем009 им 57777702 лама ов оовма « 81111111 ар вихідногорозчигу 0505 вихідного розчину) ча зо 6. Згідно винаходу готують розчин, який містить СасСі 5 і цистеїн, додаванням фосфатного буферу, що приготовлено згідно п.2. Для цього додають у флакони з Сасі » і цистеїном по 1,5мл буферу та змішують їх. іт) 7. Згідно винаходу готують розчин ЕДТА додаванням Змл фосфатного буферу, який приготовлено згідно п.2. со 8. Готують суміш для виявлення активності маркерного ферменту: цитратний буфер розводять у 2 рази дистильованою водою, додають ОФД, гідроперит (готується суміш перед використанням). |се) 35 Можливість проведення аналізу з використанням запропонованого набору наводиться у прикладах. «тQ. Wash the tablet 2-Z times with distilled water containing a detergent. 4. Prepare the initial trypsin solution by adding 2 ml of 0.0025 M NOI, then add 160 μl of the resulting 7/5 solution to 25 ml of the phosphate buffer prepared according to item 2. 5. Prepare the control material by serial dilution according to the scheme according to the table. yu 8 21ovov theme, ovi oima 30001110 lemv 098, ik 40060111 zm 06001100 om 25 50040000 lem009 im 57777702 lama ov oovma « 81111111 ar of the initial solution 0505 of the initial solution) cha zo 6. According to the invention, a solution containing 5 cysteine phosphates is prepared buffer, prepared according to p.2. To do this, add 1.5 ml of buffer each to vials with Sasi » and cysteine and mix them. and) 7. According to the invention, the EDTA solution is prepared by adding 3 ml of phosphate buffer, which is prepared according to item 2. so 8. Prepare a mixture for detecting the activity of the marker enzyme: dilute the citrate buffer 2 times with distilled water, add OFD, hydroperite (the mixture is prepared before use). |se) 35 The possibility of conducting an analysis using the proposed set is given in the examples. "t
Приклад 1. Визначення активності кальпаїнів у біологічних рідинах у щурів. 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (п - 18 - 38) сироватки крові та екстрактів тканин щурів. 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно вищенаведеної таблиці. « 3. Перед проведенням протеолітичної реакції розщеплення іммобілізованого комплексу добавляють в лунки - с відмитого планшета (ряди З - 12) по 1їОмкл Сасі 5 «цистеїн (наприклад, ряди 3, 5, 7, 11) і паралельно ЕДТА (наприклад, ряди 4, 6, 8, 12). :з» 4. Вносять контрольний матеріал (ряди 1-й і 2-й) і дослідні зразки (крім лунок АЗ, А4, ВЗ, В4), які приготовлені згідно пп. 1, 2, у лунки планшета, який містить Сасі окцистеїн або ЕДТА, інкубують при 377С 15хв (реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату маркерного ферменту пероксидази з БСА). їх Лунки АЗ, ВЗ, А4, В4 планшету використовують як додатковий контроль для оцінки впливу Сасі. окцистеїн або ЕДТА на активність іммобілізованого маркерного ферменту, в ці лунки додають по 1Омкл Сасі 5 «цистеїнExample 1. Determination of calpain activity in biological fluids in rats. 1. Test samples (n - 18 - 38) of blood serum and rat tissue extracts are prepared separately on a titration board. 2. Put the control material prepared according to the above table into the wells of the titration board. 3. Before carrying out the proteolytic cleavage reaction of the immobilized complex, add 1 μl of Sasi 5 "cysteine (for example, rows 3, 5, 7, 11) to the wells of the washed tablet (rows C - 12) and in parallel EDTA (for example, rows 4, 6, 8, 12). :з" 4. Introduce the control material (rows 1 and 2) and test samples (except for wells AZ, A4, VZ, B4), which are prepared according to paragraph 1, 2, in the wells of the tablet containing Sasi oxycysteine or EDTA, incubate at 377C for 15 minutes (cleavage reaction of the immobilized conjugate of the marker enzyme peroxidase with BSA). their Wells AZ, VZ, A4, B4 of the tablet are used as an additional control to assess the influence of Sasi. oxycysteine or EDTA on the activity of the immobilized marker enzyme, add 1 μl of Sas 5 "cysteine to these wells
Ме, або ЕДТА та робочий буфер замість дослідних проб. с 4. Відмивають плашку як вказано раніше. 5. Готують 5095 сірчану кислоту (у набір не входить). о 6. Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що містить ОФД та гідроперит у "м цитратному буфері. Інкубують до появи диференційного забарвлення. 7. Зупиняють реакцію додаванням по 5Омкл у лунку 5095 сірчаної кислоти. 8. Визначають оптичну густину розчинів при 49Онм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра. 9. Будують калібровочний графік за результатами вимірювань контрольних зразків розраховують активність кальпаїнів у дослідних пробах за формулою: » (АГ- АТО 4 ях --ьро-- сіа/е ага, во А. - протеолітична активність зразку з добавленням Сасі онцистеїна, яка визначена за калібровочним графіком залежності оптичної густини (з урахуванням впливу на активність іммобілізованого маркерного ферменту) від концентрації трипсину у контрольних зразках, мкг/мл,Me, or EDTA and working buffer instead of test samples. c 4. Wash the die as indicated earlier. 5. Prepare 5095 sulfuric acid (not included in the kit). o 6. Determine the activity of the marker enzyme by adding a mixture containing OFD and hydroperite in 1 m citrate buffer. Incubate until the differential color appears. 7. Stop the reaction by adding 5 μl of sulfuric acid to well 5095. 8. Determine the optical density of the solutions at 49 Ohm using multichannel microspectrophotometer. 9. Build a calibration graph based on the results of measurements of control samples, calculate the activity of calpains in experimental samples according to the formula: » (АГ-АТО 4 ях --йро-- sia/e aga, vo A. - proteolytic activity of the sample with the addition of Sasi oncysteine , which is determined according to the calibration graph of the dependence of the optical density (taking into account the effect on the activity of the immobilized marker enzyme) on the concentration of trypsin in the control samples, μg/ml,
А» - протеолітична активність зразку з добавленням ЕДТА, яка визначена за калібровочним графіком залежності оптичної густини (з урахуванням впливу на активність іммобілізованого маркерного ферменту) від в5 концентрації трипсину у контрольних зразках, мкг/мл, 4 - коефіцієнт перерахунку на 1 год.,A" is the proteolytic activity of the sample with the addition of EDTA, which is determined according to the calibration graph of the dependence of the optical density (taking into account the effect on the activity of the immobilized marker enzyme) on the concentration of trypsin in the control samples, μg/ml, 4 - the conversion factor for 1 hour,
1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000 - коефіцієнт перерахунку в мг.1000 is the conversion factor for 1 liter, 1000 is the conversion factor in mg.
Приклад 2. Визначення активності кальпаїнів у сироватці крові людини. 1. Окремо на титрувальній дошці готують дослідні зразки (п - 40): зразки сироватки крові людини розводять у 250 разів фосфатним буфером, наприклад, шляхом послідовного розведення у 25 та 10 разів (до 9бОмкл буферу додають 4Омкл сироватки, потім до 180мкл буферу - 20мкл 1-го розведення сироватки). 2. Вносять у лунки титрувальної дошки контрольний матеріал, приготовлений згідно таблиці на стор.3. 3. Перед проведенням протеолітичної реакції розщеплення іммобілізованого комплексу добавляють в лунки 7/0 Відмитого планшета (ряди З - 12) по 1Омкл Сасі 2 «цистеїн (наприклад, ряди З, 5, 7, 11) і паралельно ЕДТА (наприклад, ряди 4, 6, 8, 12). 4. Вносять контрольний матеріал (ряди 1-й і 2-й) і дослідні зразки (крім лунок АЗ, А4, ВЗ, В4), які приготовлені згідно пп. 1, 2, у лунки планшета, який містить Сасі окцистеїн або ЕДТА, інкубують при 377С 15хв (реакція розщеплення іммобілізованого кон'югату маркерного ферменту пероксидази з БСА).Example 2. Determination of calpain activity in human blood serum. 1. Test samples (n - 40) are prepared separately on a titration board: samples of human blood serum are diluted 250 times with phosphate buffer, for example, by successive dilutions of 25 and 10 times (to 9 bOmcl of buffer add 4Omcl of serum, then to 180mL of buffer - 20mL 1st serum dilution). 2. Put the control material prepared according to the table on page 3 into the wells of the titration board. 3. Before carrying out the proteolytic cleavage reaction of the immobilized complex, add 1 μl of Sas 2 "cysteine (for example, rows 3, 5, 7, 11) to wells 7/0 of the Washed tablet (rows C - 12) and in parallel EDTA (for example, rows 4, 6, 8, 12). 4. Introduce control material (rows 1 and 2) and test samples (except for wells AZ, A4, VZ, B4), which are prepared according to paragraphs 1, 2, in the wells of the tablet containing Sasi oxycysteine or EDTA, incubate at 377C for 15 minutes (cleavage reaction of the immobilized conjugate of the marker enzyme peroxidase with BSA).
Лунки АЗ, ВЗ, А4, В4 планшету використовують як додатковий контроль для оцінки впливу Сасі. окцистеїн або ЕДТА на активність іммобілізованого маркерного ферменту, в ці лунки додають по 1Омкл Сасі 5 «цистеїн або ЕДТА та робочий буфер замість дослідних проб. 5. Відмивають плашку як вказано раніше. 6. Готують 5095 сірчану кислоту (в набір не входить). 7. Визначають активність маркерного ферменту додаванням суміші, що приготовлена з цитратного буферу,Wells АЗ, ВЗ, А4, В4 of the tablet are used as an additional control to assess the effect of Sasi. oxycysteine or EDTA on the activity of the immobilized marker enzyme, add 1 μl of Sas 5 "cysteine or EDTA and working buffer instead of test samples to these wells. 5. Wash the die as indicated earlier. 6. Prepare 5095 sulfuric acid (not included in the set). 7. Determine the activity of the marker enzyme by adding a mixture prepared from a citrate buffer,
ОФД та гідропериту. Інкубують до появи диференційного забарвлення. 8. Зупиняють реакцію додаванням по 5Омкл у лунку 5095 сірчаної кислоти. 9. Визначають оптичну щільність розчинів при 49О0нм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра. 10. Будують калібровочний графік за результатами вимірювань контрольних зразків та розраховують активність кальпаїнів за формулою: « (Аг-Аг2)ОЮЮ 4 250 еру топ Щ Кк зо А. - протеолітична активність зразку з добавленням Сасі онцистеїна, яка визначена за калібровочним графіком залежності оптичної густини (з урахуванням впливу на активність іммобілізованого маркерного о ферменту) від концентрації трипсину у контрольних зразках, мкг/мл, сOFD and hydroperite. Incubate until differential color appears. 8. The reaction is stopped by adding 5 µl of sulfuric acid to well 5095. 9. Determine the optical density of solutions at 49O0nm using a multichannel microspectrophotometer. 10. Build a calibration graph based on the results of measurements of control samples and calculate the activity of calpains according to the formula: "(Ag-Ag2)ОЮЯ 4 250 er top ShЩ Kk zo A. - proteolytic activity of the sample with the addition of Sasi oncysteine, which is determined according to the calibration graph of the dependence of the optical density (taking into account the effect on the activity of the immobilized marker enzyme) from the concentration of trypsin in the control samples, μg/ml, s
А» - протеолітична активність зразку з добавленням ЕДТА, яка визначена за калібровочним графіком залежності оптичної густини (з урахуванням впливу на активність іммобілізованого маркерного ферменту) від ісе) концентрації трипсину у контрольних зразках, мкг/мл, «Е 4 - коефіцієнт перерахунку на 1 год., 1000 - коефіцієнт перерахунку на 1л, 1000000 - коефіцієнт перерахунку в г. 250 - розведення зразків сироватки крові людини. «A" is the proteolytic activity of the sample with the addition of EDTA, which is determined according to the calibration graph of the dependence of the optical density (taking into account the effect on the activity of the immobilized marker enzyme) from the concentration of trypsin in the control samples, μg/ml, "E 4 - the conversion factor for 1 h ., 1000 - conversion factor for 1 liter, 1000000 - conversion factor in g. 250 - dilution of human blood serum samples. "
Висновок: Вказані приклади підтверджують можливість здійснення специфічного і високочутливого - с (1079Од//мл) способу визначення активності кальпаїнів у біологічних рідинах (у щурів і людей), спрощення й постановки аналізу за рахунок використання наборів. "» Технічний результат 1. Можливість специфічного визначення активності кальпаїнів мікрометодом. 2. Висока чутливість аналізу: 1079 - 10719Од /мл. т» З. Спрощення проведення аналізу. (22) сюConclusion: These examples confirm the possibility of carrying out a specific and highly sensitive - s (1079 U/ml) method of determining the activity of calpains in biological fluids (in rats and humans), simplifying and setting up the analysis due to the use of kits. "» Technical result 1. The possibility of specific determination of calpain activity by micromethod. 2. High sensitivity of the analysis: 1079 - 10719U/ml. t» Z. Simplification of the analysis. (22)
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2001074537A UA46357A (en) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UA2001074537A UA46357A (en) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA46357A true UA46357A (en) | 2002-05-15 |
Family
ID=74207600
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA2001074537A UA46357A (en) | 2001-07-02 | 2001-07-02 | KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA46357A (en) |
-
2001
- 2001-07-02 UA UA2001074537A patent/UA46357A/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105785043B (en) | For quantitatively detecting AFP L3% kit | |
| CN104977400A (en) | Infertility joint detection kit and detection method thereof | |
| Jimenez-Porras | Differentiation between Bothrops nummifer and Bothrops picadoi by means of the biochemical properties of their venoms | |
| CN109061175A (en) | A kind of kit and application method detecting osteocalcin | |
| CN102798726B (en) | Cobalamin chemiluminescence immunoassay immue quantitative detection reagent box and preparation method thereof | |
| JPWO2006123789A1 (en) | Enzyme analysis method | |
| CN101548019A (en) | Method for measuring the concentration of transient proteolytic activity in composite biological media containing cells | |
| CN101424602A (en) | Specimen pretreatment liquid, kit for measuring virus, and method for detecting virus | |
| Plantner | A microassay for proteolytic activity | |
| JP4197393B2 (en) | Test method for IgA nephropathy | |
| CN105974117B (en) | CK MB calibration objects dilutions and its application in clinical CK detections | |
| CN102749456B (en) | Kit for chemilumineseent quantitative immunoassay of angiotensin I and preparation method thereof | |
| UA46357A (en) | KIT FOR DETERMINATION OF CALPAINE ACTIVITY IN BIOLOGICAL LIQUIDS | |
| US5320945A (en) | Method and reagent for the determination of antithrombin III | |
| Santarius et al. | Radial diffusion as a sensitive method for screening endopeptidase activity in plant extracts | |
| CN106198959A (en) | Serum hyaluronic acid chemiluminescence immune detection reagent kit and preparation method thereof | |
| CN101368965A (en) | Chemical luminescence method immune analysis diagnostic reagent kit for detecting cytomegalovirus IgM antibody | |
| EP1031035B1 (en) | Haptoglobin assay | |
| AU622339B2 (en) | Method and reagent for the determination of antithrombin iii | |
| Sato et al. | Identification of human urinary stains by the quotient uric acid/urea nitrogen | |
| UA44066C2 (en) | Set for determining activity or concentration of cathepsin "g" in biological liquids | |
| UA34208C2 (en) | Complete set of agents for determining the activity of non-tripsine-like proteinase and chymase, elastoinhibiting activity of proteinase 1-inhibitor, and content of 2-macroglobulin in biological liquids | |
| UA66517A (en) | Set for determining the activity of metalloelostase in biological liquids | |
| UA72656C2 (en) | Set for determining the activity of no-tripsin-like proteinases in biological liquids | |
| UA72345C2 (en) | Complete set for determining the activity of -2-macroglobulin in biological liquids |