UA120089U

UA120089U - METHOD OF OBTAINING CYTOCHROME-C

Info

Publication number: UA120089U
Application number: UAU201703386U
Authority: UA
Inventors: Валентина Анатоліївна Кузіна; Олена Валеріївна Жлудько
Original assignee: Публічне Акціонерне Товариство "Фармстандарт-Біолік"
Priority date: 2017-04-07
Filing date: 2017-04-07
Publication date: 2017-10-25

Abstract

Спосіб отримання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’язу ВРХ розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням. При цьому здійснюють додаткове очищення отриманого розчину цитохрому-С шляхом видалення іонів сульфату амонію заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі.Method of producing cytochrome-C by extraction of crushed cardiac muscle with cattle with ammonium sulfate solution followed by acidification with sulfuric acid and alkali with barium hydroxide to pH 8.5 ± 0.05, deposition of ballast proteins and barium sulfate and subsequent recovery of cytochrome c and its purification. They further purify the obtained cytochrome-C solution by removing ammonium sulfate ions by freezing and lyophilization in vacuo.

Description

Корисна модель відноситься до біотехнології отримання біологічно активних з'єднань, саме цитохрому-С, що може бути використаний в фармацевтичній промисловості та медицині для виготовлення антигіпоксичних лікарських засобів для нормалізації тканинного дихання, а також у науково-дослідницькій роботі.The useful model refers to the biotechnology of obtaining biologically active compounds, namely cytochrome-C, which can be used in the pharmaceutical industry and medicine for the production of antihypoxic drugs for the normalization of tissue respiration, as well as in scientific research.

Відомий спосіб отримання цитохрому-С, що включає екстрагування подрібненого серцевого м'яза ссавців водним розчином сульфатів, підлужування, очищення на іонообмінних смолах з наступним виділенням цільового продукту, що відрізняється тим, що, з метою поліпшення якості цільового продукту, екстракцію проводять 0,25-0,75 96 розчином сульфату амонію, потім підкислюють сірчаною кислотою при рн 4-5 і підлужують гідроокисом барію до рН 8-9 (ПатентThere is a known method of obtaining cytochrome-C, which includes extraction of crushed mammalian heart muscle with an aqueous solution of sulfates, alkalization, purification on ion exchange resins, followed by isolation of the target product, which is distinguished by the fact that, in order to improve the quality of the target product, the extraction is carried out at 0.25 -0.75 96 ammonium sulfate solution, then acidified with sulfuric acid at pH 4-5 and alkalized with barium hydroxide to pH 8-9 (Patent

України Мо 1110).of Ukraine Mo 1110).

Недоліками відомого способу є невисокий ступінь очищення цільового продукту, так як заявлені в свідоцтві етапи очищення цитохрому-С є недостатніми для очищення продукту від іонів сульфату амонію, яким проводять осадження, це викликає необхідність в додаткових способах очищення продукту.The disadvantages of the known method are the low degree of purification of the target product, since the stages of purification of cytochrome-C stated in the certificate are insufficient to purify the product from ammonium sulfate ions, which are used for precipitation, this causes the need for additional methods of purification of the product.

Також відомий спосіб отримання цитохрому-С, що включає знежирення сердець свиней, великої рогатої худоби або коней. Підготовлену сировину подрібнюють з отриманням фаршу, потім екстрагують 2,595 розчином трихлороцтової кислоти при температурі 10-157С і рН 3,9-4 2.Also known is the method of obtaining cytochrome-C, which includes defatting the hearts of pigs, cattle or horses. The prepared raw materials are crushed to obtain minced meat, then extracted with a 2.595 trichloroacetic acid solution at a temperature of 10-157C and a pH of 3.9-4 2.

Відокремлюють екстракт і здійснюють його сорбцію на катіоніті, урівноваженому дистильованою водою. Після завершення сорбції катіонів промивають дистильованою водою і аміачно- амонійний буферним розчином. Потім проводять елюцію цитохрому С з катіоніту розчином сульфату амонію з наступним очищенням його діафільтрацією до повного видалення іонів сульфату амонію і концентрування цитохрому С ультрафільтрацією (Патент РФ Мо 2528061).The extract is separated and its sorption is carried out on a cationite balanced with distilled water. After the sorption of cations is completed, they are washed with distilled water and an ammonia-ammonium buffer solution. Then elution of cytochrome C from the cationite with an ammonium sulfate solution is carried out, followed by its purification by diafiltration until complete removal of ammonium sulfate ions and concentration of cytochrome C by ultrafiltration (RF Patent Mo 2528061).

Даний спосіб обраний в якості прототипу.This method is chosen as a prototype.

За відомим способом очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію здійснюють шляхом діафільтрації та ультрафільтрації розчину цитохрому-С із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа.According to a known method, the target product is purified from ammonium sulfate ions by diafiltration and ultrafiltration of a cytochrome-C solution using membranes or cassettes with a cut-off threshold of 5 kDa.

Недоліком відомого способу є значні втрати цільового продукту при проведенні очищення цитохрому-С від іонів сульфату амонію шляхом ультрафільтрації із застосуванням мембран чи касет з порогом відсікання 5 кДа.The disadvantage of the known method is the significant loss of the target product during purification of cytochrome-C from ammonium sulfate ions by ultrafiltration using membranes or cassettes with a cut-off threshold of 5 kDa.

Зо В основу корисної моделі поставлено задачу: за рахунок зміни процесу очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію отримати продукт з вищим ступенем чистоти та збільшити вихід цитохрому-С.The basis of the useful model is the task: by changing the process of purifying the target product from ammonium sulfate ions, obtain a product with a higher degree of purity and increase the yield of cytochrome-C.

Поставлена задача вирішується тим, що у способі отримання цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м'язу великої рогатої худоби (ВРХ) розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідроокисом барію до рН 8,5:40,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, відповідно до корисної моделі здійснюють додаткове очищення отриманого розчину цитохрому-С шляхом видалення іонів сульфату амонію заморожуванням та ліофілізацією у вакуумі.The problem is solved by the fact that in the method of obtaining cytochrome-C by extracting the crushed cardiac muscle of cattle (cattle) with an ammonium sulfate solution followed by acidification with sulfuric acid and alkalizing with barium hydroxide to pH 8.5:40.05, precipitation of ballast proteins and barium sulfate and subsequent recovery from the resulting cytochrome-C solution and its purification, according to a useful model, additional purification of the obtained cytochrome-C solution is carried out by removing ammonium sulfate ions by freezing and lyophilization in a vacuum.

Заморожування розчину здійснюють до температури -657"С протягом 12 годин з наступною ліофілізацією при величині вакууму 48-12 тт при температурі 35:543"С не менше 4 годин.The solution is frozen to a temperature of -657"C for 12 hours followed by lyophilization at a vacuum of 48-12 tt at a temperature of 35:543"C for at least 4 hours.

Спосіб отримання цитохрому-С, що заявляється, виконують наступним чином. Перероблені на фарш серця КРОС вносять у реактор з підготовленим розчином амонію сульфату 2 95, вимішують та охолоджують до температури від 27"С до 8"С. Встановлюють рН 5 95 розчином сірчаної кислоти (4,3:0,05), проводять екстракцію цитохрому при постійному перемішуванні у реакторі при температурі від 2"7"С до 8"С. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. В отриманому екстракті проводять осадження баластних білків розчином гідроокису барію при рН (8,5:20,05) та температурі від 2"С до 8"С. Після осадження розчин декантують, проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізносинеродистого або 0,01 М калію феррицианіду. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіоннообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Після отримання елюату цитохрому проводять очищення, що включає в себе осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2"7С до 8"С. Відділення баластних білків фільтрацією на воронці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,220,05) бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 27"С до 8"С. Отриманий осад відділяють центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а бо потім десорбцію розчину. Відповідно до технології що заявляється, отриманий розчин цитохрому-С заморожують та ліофілізують у вакуумі. Отриманий ліофілізат цитохрому-С розчиняють в розчині натрію хлориду 9 96 та очищують шляхом проведення діафільтрації та ультрафільтрації розчину крізь касетні мембрани з порогом відсікання 100 КДа та проведенням стерилізуючої фільтрації крізь фільтруючу мембрану 0,22 мкм.The claimed method of obtaining cytochrome-C is carried out as follows. KROS hearts processed into minced meat are introduced into the reactor with a prepared solution of ammonium sulfate 2 95, mixed and cooled to a temperature from 27"C to 8"C. Set pH 5 to 95 with a solution of sulfuric acid (4.3:0.05), carry out cytochrome extraction with constant stirring in the reactor at a temperature from 2"7"C to 8"C. After the extraction, the extract is separated from the cake by centrifugation. In the obtained ballast proteins are precipitated in the extract with a solution of barium hydroxide at pH (8.5:20.05) and a temperature from 2"C to 8"C. After precipitation, the solution is decanted, cytochrome-C is recovered by adding ferric iron potassium or 0.01 M potassium ferricyanide. Purification of cytochrome is carried out using cation-exchange columns, where Amberlite resins with a particle size of 0.45-0.5 mm are used as a sorbent. Adsorption is carried out first, and then desorption of the solution. After obtaining the cytochrome eluate, purification is carried out, which includes precipitation ammonium sulfate solution for 12 hours at a temperature from 2"7C to 8"C. Separation of ballast proteins by filtration on a Buchner funnel, precipitation of cytochrome at pH (4,220,05) binarn with a solution of cadmium chloride and a solution of potassium iodide at a temperature from 27"C to 8"C. The resulting precipitate is separated by centrifugation. The sedimentation process is repeated and the resulting solution is sent to purification using cation exchange columns, where Amberlite resins with a granule size of 0.45-0.5 mm are used as a sorbent. Adsorption is carried out first, and then desorption of the solution. According to the claimed technology, the obtained solution of cytochrome-C is frozen and lyophilized in a vacuum. The obtained lyophilisate of cytochrome-C is dissolved in sodium chloride solution 9 96 and purified by diafiltration and ultrafiltration of the solution through cassette membranes with a cut-off threshold of 100 KDa and sterilization filtration through a filter membrane of 0.22 μm.

Таким чином якість цільового продукту зростає та підвищується вихід продукту, що є особливо суттєвим при промисловому виробництві цитохрому-С та має вищий ступінь чистоти за рахунок проведення ліофілізації у вакуумі та кінцевої стерилізуючої фільтрації.In this way, the quality of the target product increases and the product yield increases, which is especially important in the industrial production of cytochrome-C and has a higher degree of purity due to vacuum lyophilization and final sterilizing filtration.

При проведенні ліофілізації у вакуумі відбувається видалення іонів сульфату амонію з розчину цитохрому-С, про що свідчать показники якісного визначення наявності сульфатів (при додаванні до розчину цитохрому-С барію хлориду розчин залишається прозорим, що свідчить про відсутність сульфатів) та показник кількісного визначення цитохрому-С, який склав 103,10 90 (при критерії прийнятності 90965).During lyophilization in a vacuum, ammonium sulfate ions are removed from the cytochrome-C solution, as evidenced by the indicators of the qualitative determination of the presence of sulfates (when barium chloride is added to the cytochrome-C solution, the solution remains transparent, which indicates the absence of sulfates) and the indicator of the quantitative determination of cytochrome-C C, which was 103.10 90 (at the acceptance criterion of 90965).

Ефективність способу підтверджується наступним прикладом:The effectiveness of the method is confirmed by the following example:

Приклад 1. 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м'язу ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-87"С розчином 2 95 сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв. при температурі 2-8"С та обертах мішалки 25242 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3-40,05 595 розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8"С протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації екстракту гідроокисом барію, в кількості З кг, при рН 8,5:0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізосинеродистого, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатномуExample 1. 200 kg of blood-free fat and connective tissue of the cardiac muscle of cattle are ground and processed into minced meat and, with constant stirring, are loaded into a reactor with a prepared solution of 2 95 ammonium sulfate cooled to a temperature of 2-87"С in the amount of 50 liters . The mixture in the reactor is stirred for 10-15 min. at a temperature of 2-8"C and the revolutions of the stirrer are 25242 rpm. The pH of the mixture is set to 4.3-40.05 with 595 sulfuric acid solution and cytochrome-C is extracted at a temperature of 2-8"C for 1.5 hours. After the extraction, the extract is separated from the cake by centrifugation. The resulting extract is collected in the second reactor and precipitation of ballast proteins is carried out by neutralizing the extract with barium hydroxide, in the amount of 3 kg, at a pH of 8.5:0.05 for 12-18 hours. When barium hydroxide is added, barium sulfate and ballast proteins, whose isoelectric point is below 8.5, precipitate Cytochrome-C is recovered in the resulting solution by adding potassium ferric oxide, in the amount of 0.001 kg. Cytochrome is purified using cation exchange columns, where Amberlite resins with a granule size of 0.45-0.5 mm are used as a sorbent. Cytochrome adsorption is carried out first -С at pH 8-9, and then desorption of the solution by adding 15 l of a solution of 1 M sodium chloride in 0.02 M sodium phosphate

Зо буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8"С. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8"С. Відділяють осад фільтруванням на воронці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 7 л розчину) при рН (4,220,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2250,05 5 95 розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять ще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рн 7,5-0,05 3 95 розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію залізосинеродистого, перемішують та фільтрують розчин на воронці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смолиFrom the buffer. To achieve complete desorption, the solution is kept on columns for 12-18 hours at a temperature of 2-8"C. The resulting eluate is collected in glass containers and an additional stage of purification is carried out, which consists in the repeated precipitation and purification of cytochrome-C. The precipitation of ballast proteins is carried out by adding 5 .6 kg of ammonium sulfate with stirring and keep the solution for 12-18 hours at a temperature of 2-8"C. The sediment is separated by filtering on a Buchner funnel, the solution is collected in glass containers and cytochrome-C is precipitated in it with a binary complex of cadmium chloride and potassium iodide (in the amount of 0.25 l per 7 l of solution) at pH (4.220.05). It is kept for 302 minutes and the precipitate formed is separated by centrifugation at 2500 rpm. The obtained precipitate is dissolved in purified water and the pH is set to 4.2250.05 5 95 with a solution of sulfuric acid. The binary complex precipitation process is carried out again. After that, the precipitate is dissolved in 8 liters of purified water, the pH is set to 7.5-0.05 with 3 95 ammonia solution, 1 g of potassium ferric oxide is added to restore cytochrome, the solution is mixed and filtered on a Buchner funnel. The solution is purified using cation exchange columns, where resins are used as a sorbent

Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С З 905 розчином аміаку. Відповідно до технології, що заявляється, отриманий розчин цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та поміщують в камеру ліофільної установки. Набирають розрядження (900-100) тВаг та проводять заморожування розчину до температури (-657"С) протягом 12 годин. Після цього починають вакуумування і, при досягненні величини вакууму (48:12) тт, протягом 15-20 годин підвищують температуру у камері до (35:23)"С та витримують при цій температурі не менше 4 годин.Amberlite with a granule size of 0.45-0.5 mm. Adsorption is carried out first, and then desorption of the cytochrome-C solution with 905 ammonia solution. According to the claimed technology, the resulting solution of cytochrome-C is poured into 50 ml vials and placed in the chamber of the freeze-drying unit. A discharge of (900-100) tWag is obtained and the solution is frozen to a temperature of (-657"C) for 12 hours. After that, vacuuming is started and, when the vacuum value is reached (48:12) tt, the temperature in the chamber is increased for 15-20 hours to (35:23)"C and kept at this temperature for at least 4 hours.

Отриманий ліофілізат збирають в єдину серію та розчиняють в 15 л 995 розчину натрію хлориду, встановлюють рН 6,5-7,0. Розчин піддають діафільтрації та ультрафільтрації крізь мембрани з порогом відсікання 100 КДа та наступній стерилізуючій фільтрації крізь мембрану з розміром пор 0,22 мкм.The obtained lyophilisate is collected in a single series and dissolved in 15 l of 995 sodium chloride solution, pH is set to 6.5-7.0. The solution is subjected to diafiltration and ultrafiltration through membranes with a cut-off threshold of 100 KDa and subsequent sterilizing filtration through a membrane with a pore size of 0.22 μm.

Таким чином, при проведенні ліофілізації у вакуумі відбувається видалення іонів сульфату амонію з розчину цитохрому-С, про що свідчать показники якісного визначення наявності сульфатів (при додаванні до розчину цитохрому-С барію хлориду розчин залишається прозорим, що свідчить про відсутність сульфатів) та показник кількісного визначення цитохрому-С, який склав 103,10 95 (при критерії прийнятності 9090). бо Відповідно до технології, що заявляється, ліофілізація розчину полягає в тому, що розчин цитохрому-С розливають у флакони по 50 мл та розміщують в камеру ліофільної установки.Thus, during lyophilization in a vacuum, ammonium sulfate ions are removed from the cytochrome-C solution, which is evidenced by the qualitative determination of the presence of sulfates (when barium chloride is added to the cytochrome-C solution, the solution remains transparent, which indicates the absence of sulfates) and the quantitative indicator determination of cytochrome-C, which was 103.10 95 (at the acceptance criterion of 9090). because according to the claimed technology, lyophilization of the solution consists in the fact that the cytochrome-C solution is poured into vials of 50 ml and placed in the chamber of the lyophilization unit.

Набирають розрідження (9002100) тВаг та проводять заморожування розчину до температури (-65"С) протягом 12 годин. Після цього починають вакуумування і, при досягненні величини вакууму (48:12) тт, протягом 15-20 годин підвищують температуру у камері до (35:23)"С та витримують при цій температурі не менше 4 годин.A dilution of (900-2100) tWag is obtained and the solution is frozen to a temperature of (-65"С) for 12 hours. After that, vacuuming is started and, when the vacuum value is reached (48:12) tt, the temperature in the chamber is increased for 15-20 hours to ( 35:23)"C and kept at this temperature for at least 4 hours.

Протягом 12 годин відбувається повне заморожування усього об'єму розчину до температури (-65"С). Температура заморожування вибрана з розрахунку максимального видалення вологи з препарату, а тривалість витримки при заданій температурі вибрана з розрахунку об'єму серії виробництва цитохрому. При проведенні ліофілізації: задане значення температури (35243)"С - температура, що є допустимою для нагрівання препаратів білкової природи не допускаючи порушення білкової структури та водночас дозволяє в повній мірі провести висушування препарату та видалити при іони сульфату амонію, величина вакууму (48412) тТ, в свою чергу, не дозволяє утворюватись волозі при висушуванні, що забезпечує рівномірне та повне висушування. Тривалість витримки при температурі (35:53)"С також обумовлена об'ємом серії виробництва.Within 12 hours, the entire volume of the solution is completely frozen to a temperature of (-65"C). The freezing temperature is selected based on the maximum removal of moisture from the drug, and the duration of exposure at a given temperature is selected based on the volume of the cytochrome production series. When lyophilization is carried out : set temperature value (35243)"С - the temperature that is permissible for heating preparations of a protein nature without allowing a violation of the protein structure and at the same time allows to completely dry the preparation and remove ammonium sulfate ions, the vacuum value (48412) tT, in its in turn, does not allow the formation of moisture during drying, which ensures uniform and complete drying. The duration of exposure at a temperature of (35:53)"С is also determined by the volume of the production series.

Відсутність іонів сульфату амонію визначають контролем за якісним показником, що доводить відсутність сульфатів.The absence of ammonium sulfate ions is determined by quality control, which proves the absence of sulfates.

Показник, що підтверджує зменшення втрат продукту при виробництві, є показник втрати маси при висушуванні, що склав 0,02 95 (при критерії прийнятності 0,5 90).The indicator that confirms the reduction of product losses during production is the indicator of mass loss during drying, which was 0.02 95 (at the acceptance criterion of 0.5 90).

Claims

USEFUL MODEL FORMULA

1. The method of obtaining cytochrome-C by extracting the crushed cardiac muscle of cattle with an ammonium sulfate solution, followed by acidification with sulfuric acid and barium hydroxide alkalization to pH 8.5:20.05, precipitation of ballast proteins and barium sulfate, and subsequent recovery from the resulting cytochrome solution -C and its purification, which is characterized by additional purification of the obtained cytochrome-C solution by removing ammonium sulfate ions by freezing and lyophilization in a vacuum.

2. The method according to claim 1, which differs in that the freezing of the solution is carried out to a temperature of -657"C for 12 hours followed by lyophilization at a vacuum of 48:12 tt at a temperature of 35:543"C for at least 4 hours.