RU2128512C1

RU2128512C1 - Cytochrome c isolation method

Info

Publication number: RU2128512C1
Application number: RU96112735A
Authority: RU
Inventors: О.В. Софронова; С.Л. Люблинский; Е.Д. Ермолаев
Original assignee: Софронова Ольга Владимировна; Люблинский Станислав Людвигович; Ермолаев Евгений Дмитриевич
Priority date: 1996-07-08
Filing date: 1996-07-08
Publication date: 1999-04-10

Abstract

FIELD: biochemistry and pharmacology. SUBSTANCE: invention relates to cytochrome c used in medicine as antihypoxic drug to normalize tissue respiration in patients with viral hepatitis, asphyxia, pneumonia, asthmatic conditions, ischemic heart disease, intoxications, senile retina degeneration, and bodily overloading. Method involves extracting preparation from homogenized farm animal hearts with 0.2-0.5% of sulfuric acid solution at pH 4.0-4.5 followed by neutralizing extract with calcium or barium hydroxide solution. Filtered extract solution is chromatographed on macroporous cationite column at pH 8-9 allowing cytochrome c and myoglobin to be separated, the latter being unable to be sorbed on column charge under conditions employed. Myoglobin is collected separately to be used as valuable iron-containing additive. Ballast proteins are precipitated by adding 90-120 g/l of sodium chloride. EFFECT: reduced cytochrome c isolation time and increased its yield. 2 ex

Description

Изобретение относится к технологии выделения биологически активных соединений, а именно цитохрома C, используемого в медицине в качестве антигипоксического средства для нормализации тканевого дыхания при вирусном гепатите, асфикции, пневмонии, астматических состояниях, ишемической болезни сердца, интоксикациях, старческой дегенерации сетчатки глаза, физических перегрузах и т.д. The invention relates to a technology for isolating biologically active compounds, namely cytochrome C, used in medicine as an antihypoxic agent to normalize tissue respiration in case of viral hepatitis, asphyxiation, pneumonia, asthmatic conditions, coronary heart disease, intoxications, senile degeneration of the retina, physical overloads, and etc.

Известны способы выделения цитохрома C из сердец различных с.-х. животных: лошадей, свиней и других:
1. Патент США 3342796 (Кл. 260-115), сентябрь 1967;
2. Патент ПНР 126445 (Кл. A 61 К 37/02), сентябрь 1984.Known methods for the isolation of cytochrome C from hearts of various agricultural animals: horses, pigs and others:
1. US patent 3342796 (CL. 260-115), September 1967;
2. Patent Poland 126445 (Cl. A 61 K 37/02), September 1984.

Известные способы выделения включают стадии: экстракцию из измельченных сердец, адсорбционную хроматографию на слабом катионите, осаждение балластных белков сульфатом аммония, диализ, повторную хроматографию, повторный диализ. Known isolation methods include the steps of: extraction from crushed hearts, adsorption chromatography on weak cation exchange resin, precipitation of ballast proteins with ammonium sulfate, dialysis, rechromatography, re-dialysis.

В частности, согласно способу (2) из 150 кг гомогенизированных свиных сердец препарат экстрагируется 300 л холодной воды pH 4,0 при 4-8^oC в течение 4 часов, затем после нейтрализации и фильтрации экстракта цитохром C адсорбируют на катионите Амберлит ИРС-50 в объеме, расходуя 10 л сорбента на 100 л раствора. Экстрагируют цитохром C 2 M раствором аммиака, pH нейтрализуют до 7,0 соляной кислотой, к раствору добавляют сульфат аммония: 100 г на 1 л раствора, осадок балластных белков отфильтровывают, раствор цитохрома C диализуют 48 часов и повторяют хроматографию и диализ.In particular, according to method (2), from 150 kg of homogenized pig hearts, the preparation is extracted with 300 L of cold water, pH 4.0 at 4-8 ^° C for 4 hours, then after neutralization and filtration of the extract, cytochrome C is adsorbed on Amberlite IRS-50 cation exchanger in volume, spending 10 liters of sorbent per 100 liters of solution. It is extracted with cytochrome C 2 M ammonia solution, the pH is neutralized to 7.0 with hydrochloric acid, ammonium sulfate is added to the solution: 100 g per 1 liter of solution, the ballast protein precipitate is filtered off, the cytochrome C solution is dialyzed for 48 hours and chromatography and dialysis are repeated.

Выход цитохрома C 4,9-6,87 г из 100 кг сердца, чистота препарата удовлетворительная. The output of cytochrome C 4.9-6.87 g from 100 kg of heart, the purity of the drug is satisfactory.

Указанный способ позволяет в одном цикле переработать большое количество сырья, однако имеет недостатки:
- однократная хроматография на Амберлите ИРС-50 не позволяет сразу получить достаточной степени чистоты и большой концентрации цитохрома C в растворе,
- длительный по времени диализ приводит к потерям препарата, т.к. цитохром C относительно небольшая по размерам молекула, ММ которой всего лишь 12700 Д,
- применение сульфата аммония для осаждения балластных белков и аммиака водного для десорбции цитохрома C требует последующего тщательного обессоливания от нежелательных ионов NH₄ и SO₄, если цитохром C применяется как лекарственный препарат. Кроме того, указанный способ не предусматривает выделения других биологически активных соединений из сердца.This method allows you to process a large amount of raw materials in one cycle, however, it has disadvantages:
- single chromatography on Amberlite IRS-50 does not immediately allow to obtain a sufficient degree of purity and a high concentration of cytochrome C in solution,
- long-term dialysis leads to drug losses, because cytochrome C is a relatively small molecule, the molecular mass of which is only 12700 D,
- the use of ammonium sulfate to precipitate ballast proteins and aqueous ammonia for desorption of cytochrome C requires subsequent thorough desalination from undesired NH ₄ and SO ₄ ions, if cytochrome C is used as a medicine. In addition, this method does not provide for the isolation of other biologically active compounds from the heart.

Предлагается способ выделения цитохрома C из сердца сельскохозяйственных животных, включающий экстракцию, хроматографию, осаждение балластных белков нейтральными солями, отличающийся тем, что с целью увеличения выхода целевого продукта и комплексного использования сырья
1. экстракцию препарата из гомогенизированных сердец осуществляют 0,2-0,5%-ным раствором серной кислоты при pH 4,0-4,5 с последующей нейтрализацией экстракта раствором гидроокиси Ca или Ba, образующиеся в экстракте осадки сульфата Ca или Ba облегчают фильтрацию суспензии из животного сырья, кроме того, из-за низкой растворимости солей ионная сила экстракта сравнительно низка, что позволяет с наименьшими потерями осуществлять сорбцию цихохрома C,
2. хроматографию отфильтрованного экстракта проводят на колонке с макропористым катионитом при pH 8-9, что позволяет разделить цитохром C и миоглобин, который при указанных условиях не сорбируется на колонке, миоглобин собирается отдельно и используется в качестве ценной железосодержащей добавки, концентрирование раствора цитохрома C после хроматографии методом ультрафильтрации позволяет уменьшить потери препарата в последующей стадии осаждения балластных белков,
3. использование хлористого натрия для осаждения балластных белков позволяет исключить в конечном препарате ионы NH₄ и SO₄. Таким образом, предлагаемый способ позволяет сократить технологическое время выделения цитохрома C, увеличить его выход и комплексно использовать ценное сырье - сердце с.-х. животных.A method for isolating cytochrome C from the heart of farm animals is proposed, including extraction, chromatography, precipitation of ballast proteins with neutral salts, characterized in that in order to increase the yield of the target product and the integrated use of raw materials
1. extraction of the drug from homogenized hearts is carried out with a 0.2-0.5% solution of sulfuric acid at a pH of 4.0-4.5, followed by neutralization of the extract with a solution of Ca or Ba hydroxide, the precipitates formed in the extract of Ca or Ba sulfate facilitate filtration suspensions from animal raw materials, in addition, due to the low solubility of salts, the ionic strength of the extract is relatively low, which allows sorption of cychochrome C with minimal losses,
2. chromatography of the filtered extract is carried out on a column of macroporous cation exchange resin at pH 8-9, which allows to separate cytochrome C and myoglobin, which under these conditions is not adsorbed on the column, myoglobin is collected separately and used as a valuable iron-containing additive, concentration of the cytochrome C solution after chromatography by ultrafiltration allows to reduce the loss of the drug in the subsequent stage of deposition of ballast proteins,
3. The use of sodium chloride to precipitate ballast proteins allows the elimination of NH ₄ and SO ₄ ions in the final preparation. Thus, the proposed method allows to reduce the technological time for the isolation of cytochrome C, to increase its yield and to make complex use of valuable raw materials - the heart of agricultural animals.

Пример 1. Example 1

10 кг гомогенизированных сердец крупного рогатого скота суспендируют в 20 л 0,25% раствора серной кислоты при pH 4,5. Экстрагируют 2 ч при постоянном перемешивании. Фарш отделяют центрифугированием при 3500 об/мин. К полученному экстракту при перемешивании добавляют 60 г гидроокиси бария до достижения pH 8,5. Суспензию оставляют на 3 часа. Выпавший осадок отделяют фильтрацией. Фильтрат пропускают через колонку с макропористым катионитом и промывают 25% раствором сульфата аммония. Прошедший через колонку раствор (проскок) собирают для выделения миоглобина. Элюцию цитохрома C осуществляют 5% раствором сульфата аммония pH 8,5. Объем элюата 1 л. Раствор цитохрома C подвергают концентрированию и диафильтрации с использованием мембран в виде полых волокон марки ВПУ-50-ПА. Объем концентрата 200 мл. Осаждение балластных белков из концентрата осуществляют добавлением 20 г NaCl. Осадок отфильтровывают. Супернатант обессоливают и лиофилизируют. Выход цитохрома C 0,85 г. Чистота препарата соответствует ФС 42-2533-78. 10 kg of homogenized cattle hearts are suspended in 20 l of a 0.25% sulfuric acid solution at pH 4.5. Extract for 2 hours with constant stirring. Stuffing is separated by centrifugation at 3500 rpm. To the resulting extract, 60 g of barium hydroxide are added with stirring until a pH of 8.5 is reached. The suspension is left for 3 hours. The precipitate formed is filtered off. The filtrate is passed through a column of macroporous cation exchange resin and washed with a 25% solution of ammonium sulfate. The solution passing through the column (slip) is collected to isolate myoglobin. Elution of cytochrome C is carried out with a 5% solution of ammonium sulfate pH 8.5. The volume of the eluate is 1 liter. The cytochrome C solution is subjected to concentration and diafiltration using membranes in the form of hollow fibers of the VPU-50-PA grade. The volume of the concentrate is 200 ml. Precipitation of ballast proteins from the concentrate is carried out by adding 20 g of NaCl. The precipitate is filtered off. The supernatant is desalted and lyophilized. The yield of cytochrome C is 0.85 g. The purity of the drug corresponds to FS 42-2533-78.

Пример 2. Example 2

10 кг гомогенизированных сердец крупного рогатого скота суспендируют в 20 л 0,4% раствора соляной кислоты при pH 4,0. Экстрагируют 1 час при перемешивании. Фарш отделяют центрифугированием. К полученному супернатанту добавляют 50 г гидроокиси кальция до pH 8,5. Суспензию оставляют на 3 ч. Выпавший осадок отделяют фильтрацией. Фильтрат пропускают через колонку с макропористым катионитом. Проскок собирают для выделения миоглобина. Эволюцию цитохрома C осуществляют 10% раствором сульфата аммония pH 8,5. Элюат концентрируют и обессоливают методом ультрафильтрации на мембранах в виде полых волокон. Осаждение балластных белков из концентрата осуществляют добавлением 120 г/л NaCl. Супернатант обессоливают и лиофилизируют. Выход цитохрома C 0,8 г. Чистота препарата соответствует ФС 42-2533-78. 10 kg of homogenized cattle hearts are suspended in 20 L of a 0.4% hydrochloric acid solution at pH 4.0. Extract for 1 hour with stirring. Stuffing is separated by centrifugation. To the resulting supernatant was added 50 g of calcium hydroxide to a pH of 8.5. The suspension is left for 3 hours. The precipitate formed is filtered off. The filtrate is passed through a column of macroporous cation exchanger. A slip is collected to isolate myoglobin. The evolution of cytochrome C is carried out with a 10% solution of ammonium sulfate pH 8.5. The eluate is concentrated and desalted by ultrafiltration on a hollow fiber membrane. Precipitation of ballast proteins from the concentrate is carried out by adding 120 g / l NaCl. The supernatant is desalted and lyophilized. The yield of cytochrome C is 0.8 g. The purity of the drug corresponds to FS 42-2533-78.

Claims

The method of isolation of cytochrome C from the heart of farm animals, including extraction, chromatography, precipitation of ballast proteins with neutral salts, characterized in that, in order to increase the yield of the target product and the integrated use of raw materials, the preparation is extracted with a 0.2 - 0.5% sulfuric acid solution at pH 4.0 - 4.5, followed by neutralization of the extract with Ca or Ba hydroxide, chromatography of the filtered extract is carried out on macroporous cation exchange resin at pH 8.0 - 9.0, followed by concentration of the eluate by ultrafiltration, precipitation of the ballast proteins from the concentrated eluate containing cytochrome C, is carried out by adding sodium chloride in an amount of 90 - 120 g of salt to 1 liter of solution.