UA113761U - METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR - Google Patents
METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR Download PDFInfo
- Publication number
- UA113761U UA113761U UAU201608896U UAU201608896U UA113761U UA 113761 U UA113761 U UA 113761U UA U201608896 U UAU201608896 U UA U201608896U UA U201608896 U UAU201608896 U UA U201608896U UA 113761 U UA113761 U UA 113761U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- hybridization
- sensor
- dna
- response
- temperature
- Prior art date
Links
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 12
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 5
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 abstract 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 5
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241001227559 Airapus Species 0.000 description 1
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000009878 intermolecular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000002824 redox indicator Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
В способі покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора додатково використовують систему термостабілізації, контролю та регулювання температури в два етапи. На першому етапі вимірюють величину сенсорного відгуку у відповідь на гібридизацію одного виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ при початковій температурі (Т0), проводять післягібридизаційну обробку, під час якої нагрівають буферний розчин, що надходить до вимірювальної комірки приладу, до вибраної температури (Т1), впродовж 5 хв. обробляють сенсорну поверхню буферним розчином, нагрітим до Т1, після чого охолоджують вимірювальну комірку буферним розчином початкової температури (Т0), потім після такої обробки знову вимірюють величину сенсорного відгуку. Після регенерації біоселективного елемента на другому етапі повторюють процедуру гібридизації другого виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ, а саме вимірюють величину сенсорного відгуку при То, проводять післягібридизаційну обробку при Т1 і після охолодження знову вимірюють величину сенсорного відгуку при Т0. За результатами двох етапів визначають величини співвідношення сенсорного відгуку на один вид ДНК-мішеней до сенсорного відгуку на другий вид ДНК-мішеней і порівнюють величини такого співвідношення, отримані при Т0 та після післягібридизаційної обробки при Т1 - суттєва зміна величини такого співвідношення буде показником покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора.The method of improving the selectivity of the hybridization DNA sensor additionally uses a system of thermal stabilization, temperature control and regulation in two stages. In the first stage, the magnitude of the sensory response in response to hybridization of one type of target DNA with oligonucleotide samples immobilized on the sensory surface of the instrument for analysis of biochemical media at initial temperature (T0) is carried out. to the measuring cell of the device, to the selected temperature (T1), for 5 minutes treat the sensor surface with a buffer solution heated to T1, then cool the measuring cell with a buffer solution of the initial temperature (T0), then after such treatment again measure the value of the sensory response. After regeneration of the bioselective element in the second stage repeat the procedure of hybridization of the second type of target DNA with oligonucleotides-samples immobilized on the sensory surface of the device for analysis of biochemical media, namely measure the magnitude of sensory response at sensory response at T0. The results of two stages determine the ratio of sensory response to one type of target DNA to sensory response to another type of DNA target and compare the values of this ratio obtained at T0 and after post-hybridization treatment at T1 - a significant change in such a ratio will be DNA sensor.
Description
Пропонована корисна модель належить до галузі біотехнології, біофізики, аналітичної біохімії та медицини, а більш конкретно до способу покращення селективності гібридизаційногоThe proposed useful model belongs to the field of biotechnology, biophysics, analytical biochemistry and medicine, and more specifically to the method of improving the selectivity of hybridization
ДНК-сенсора та може бути використана як для вивчення міжмолекулярних взаємодій, так і для розробки методів селективного розпізнавання послідовностей нуклеїнових кислот в діагностичних цілях.DNA sensor and can be used both for the study of intermolecular interactions and for the development of methods for selective recognition of nucleic acid sequences for diagnostic purposes.
Досягнення сучасної молекулярної біології особливо в області розшифровки геномів різних організмів (від вірусів і бактерій до ссавців і людини) відкривають великі можливості для розробки ефективних засобів діагностики, моніторингу і профілактики багатьох інфекційних та генетичних захворювань. Для цих цілей в багатьох випадках можуть бути корисні такі засоби сучасної аналітичної біотехнології як біосенсори. Гібридизаційний ДНК-сенсор складається з фізичного перетворювача та іммобілізованих на його поверхні одноланцюгових олігонуклеотидів певної нуклеотидної послідовності, довжина яких, зазвичай, варіюється від 18 до 50 основ |1Ї, і які можуть селективно взаємодіяти з комплементарними послідовностями нуклеїнових кислот в досліджуваних зразках. Визначення наявності тих чи інших мутацій, можна здійснити за допомогою ДНК-сенсора шляхом гібридизаційної дискримінації частково та повністю комплементарних послідовностей нуклеїнових кислот (2-4). Це може бути досягнуто за рахунок використання різних факторів, що впливають на ефективність гібридизації, в тому числі, довжини ДНК-мішені, концентрації, температури, складу буферного розчину для гібридизації, умов післягібридизаційної обробки, а також комбінації таких факторів (5, 6). Серед перерахованих факторів впливу на жорсткість умов гібридизації - зміна температури є найбільш гнучкою і технологічною. Вона є простим однофакторним, інтуїтивно зрозумілим рішенням. Крім цього існує багато програм і сервісів (наприклад ВІМАМей Г71), що дозволяють розрахувати (для гомогенних умов) такі параметри, як зміна вільної енергії Гіббса та температура плавлення дволанцюгової ДНК в залежності від її нуклеотидної послідовності. Знання цих параметрів дозволяє прогнозувати результат взаємодії тих чи інших послідовностей нуклеїнових кислот з певними олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні.The achievements of modern molecular biology, especially in the field of deciphering the genomes of various organisms (from viruses and bacteria to mammals and humans), open up great opportunities for the development of effective means of diagnosis, monitoring and prevention of many infectious and genetic diseases. For these purposes, such means of modern analytical biotechnology as biosensors can be useful in many cases. The hybridization DNA sensor consists of a physical transducer and single-stranded oligonucleotides of a certain nucleotide sequence immobilized on its surface, the length of which usually varies from 18 to 50 bases, and which can selectively interact with the complementary sequences of nucleic acids in the studied samples. Determination of the presence of certain mutations can be carried out with the help of a DNA sensor by hybridization discrimination of partially and completely complementary sequences of nucleic acids (2-4). This can be achieved through the use of various factors that affect the efficiency of hybridization, including the length of the DNA target, concentration, temperature, composition of the buffer solution for hybridization, conditions of post-hybridization processing, as well as a combination of these factors (5, 6). Among the listed factors affecting the rigidity of the hybridization conditions, temperature change is the most flexible and technological. It is a simple one-factor, intuitive solution. In addition, there are many programs and services (for example, VIMAMey G71) that allow you to calculate (for homogeneous conditions) such parameters as the change in Gibbs free energy and the melting temperature of double-stranded DNA depending on its nucleotide sequence. Knowledge of these parameters allows predicting the result of the interaction of certain nucleic acid sequences with certain oligonucleotide samples immobilized on the sensor surface.
До найбільш класичного і широко відомого класу методів, що дозволяють встановити комплементарність одноланцюгових ДНК, визначити енергію їх взаємодії, належать спектрофотометричні та спектрофлуориметричні методи аналізу плавлення ДНК |І81І.Spectrophotometric and spectrofluorimetric methods of DNA melting analysis belong to the most classic and widely known class of methods, which allow to establish the complementarity of single-stranded DNA, to determine the energy of their interaction.
Відомий метод дослідження гібридизації ДНК за допомогою використання електрохімічноїA well-known method of studying DNA hybridization using electrochemical
ДНК (Е-ДНК) сенсорної платформи |9| при підвищеній температурі для розрізнення повністю та частково комплементарних одноланцюгових олігонуклеотидів (10). Біоселективним елементом згаданої Е-ДНК сенсорної платформи є ковалентно приєднані до робочого електрода одноланцюгові олігонуклеотиди-проби, які обов'язково мають бути мічені окислювально- відновними індикаторами (редокс-мітками). Тільки в такому випадку спостерігається сенсорний сигнал завдяки перенесенню електронів між редокс-мітками олігонуклеотидів-проб і поверхнею електрода (за відсутності олігонуклеотидів-мішеней). В присутності необхідної концентрації олігонуклеотидів-мішеней починається їх гібридизація з іммобілізованими на робочому електроді олігонуклеотидами-пробами, що просторово відділяє редокс-мітки від поверхні електрода, перешкоджає перенесенню електронів і, таким чином, викликає зменшення окислювально-відновного струму, тобто зміну сенсорного сигналу. Для експериментів при підвищеній температурі (47-21 "С) застосовували алюмінієвий нагрівальний блок "ТПпептоКоо!" як тримач для скляної електрохімічної комірки. Однак, щоб забезпечити рівномірний розподіл температури, перед кожним вимірюванням електрохімічну комірку витримували при відповідній температурі протягом, не менше 30 хв.DNA (E-DNA) of the sensor platform |9| at elevated temperature to distinguish fully and partially complementary single-stranded oligonucleotides (10). The bioselective element of the mentioned E-DNA sensor platform is single-chain oligonucleotide probes covalently attached to the working electrode, which must necessarily be labeled with redox indicators (redox labels). Only in this case, a sensor signal is observed due to the transfer of electrons between the redox labels of the probe oligonucleotides and the electrode surface (in the absence of target oligonucleotides). In the presence of the required concentration of target oligonucleotides, their hybridization with probe oligonucleotides immobilized on the working electrode begins, which spatially separates the redox labels from the electrode surface, prevents the transfer of electrons and, thus, causes a decrease in the redox current, i.e., a change in the sensor signal. For experiments at elevated temperature (47-21 "С), an aluminum heating block "TPpeptoKoo!" was used as a holder for a glass electrochemical cell. However, to ensure uniform temperature distribution, before each measurement, the electrochemical cell was kept at the appropriate temperature for at least 30 min .
В основу запропонованої корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора, який був би більш зручним у користуванні, який точніше і в достатньо широкому діапазоні контролював би температуру процесу гібридизаціїThe proposed useful model is based on the task of developing a way to improve the selectivity of the hybridization DNA sensor, which would be more convenient to use, which would control the temperature of the hybridization process more accurately and in a sufficiently wide range
ДНК, і який би не потребував ніякої молекулярної мітки.DNA, and which would not require any molecular label.
Поставлена задача вирішується тим, що у запропонованому способі покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора, відповідно до корисної моделі, додатково використовують систему термостабілізації, контролю та регулювання температури в два етапи, а саме на першому етапі вимірюють величину сенсорного відгуку у відповідь на гібридизацію одного виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами-пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ при початковій температурі (То), проводять післягібридизаційну обробку, під час якої нагрівають буферний розчин, що надходить до вимірювальної комірки приладу, до вибраної температури (Т1), впродовж 5 хв. обробляють сенсорну поверхню буферним розчином, нагрітим до Ті, після чого охолоджують вимірювальну комірку буферним розчином початкової температури (То), потім після такої обробки знову бо вимірюють величину сенсорного відгуку, після регенерації біоселективного елемента на другому етапі повторюють процедуру гібридизації другого виду ДНК-мішеней з олігонуклеотидами- пробами, іммобілізованими на сенсорній поверхні приладу для аналізу біохімічних середовищ, а саме вимірюють величину сенсорного відгуку при То, проводять післягібридизаційну обробку при Ті ії після охолодження знову вимірюють величину сенсорного відгуку при То, за результатами двох етапів визначають величини співвідношення сенсорного відгуку на один видThe task is solved by the fact that in the proposed method of improving the selectivity of the hybridization DNA sensor, according to the useful model, a system of thermostabilization, control and temperature regulation is additionally used in two stages, namely, in the first stage, the value of the sensor response is measured in response to the hybridization of one type of DNA -targets with oligonucleotides-samples immobilized on the sensor surface of the device for the analysis of biochemical environments at the initial temperature (To), post-hybridization treatment is carried out, during which the buffer solution entering the measuring cell of the device is heated to the selected temperature (Т1) for 5 min. the sensor surface is treated with a buffer solution heated to Ti, after which the measuring cell is cooled with a buffer solution of the initial temperature (To), then after such treatment the value of the sensor response is measured again, after the regeneration of the bioselective element in the second stage, the procedure of hybridization of the second type of DNA targets with with oligonucleotides-samples immobilized on the sensor surface of the device for the analysis of biochemical environments, namely, the value of the sensor response is measured at T, post-hybridization treatment is carried out at T and after cooling, the value of the sensor response is again measured at T, based on the results of two stages, the value of the ratio of the sensor response to one is determined kind
ДНК-мішеней до сенсорного відгуку на другий вид ДНК-мішеней і порівнюють величини такого співвідношення, отримані при То та після після-гібридизаційної обробки при Ті - суттєва зміна величини такого співвідношення буде показником покращення селективності гібридизаційногоof DNA targets to the sensory response to the second type of DNA targets and compare the values of this ratio obtained at To and after post-hybridization treatment at Ti - a significant change in the value of this ratio will be an indicator of improvement in the selectivity of the hybridization
ДНК-сенсора.DNA sensor.
Прилад для аналізу біохімічних середовищ, що включає систему термостабілізації, контролю та регулювання температури розроблений колективом авторів (заявка на корисну модель Мо (0201603382, подана 01.04.2016 р. МПК (2015.01) С01М 21/55; Заявники:The device for the analysis of biochemical environments, which includes a system of thermostabilization, control and temperature regulation, was developed by a team of authors (application for utility model Mo (0201603382, submitted on April 1, 2016, IPC (2015.01) С01М 21/55; Applicants:
Дорожинський Г.В., Ушенін Ю.В., Самойлов А.В., Мацишин М.Й., Рачков О.Е.).Dorozhynskyi G.V., Ushenin Yu.V., Samoilov A.V., Matsyshin M.Y., Rachkov O.E.).
Спосіб покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора полягає в тому, що додатково використовують розроблену для цього систему термостабілізації, контролю та регулювання температури, за допомогою якої при гібридизації повністю або частково комплементарних олігонуклеотидів-мішеней з іммобілізованими на сенсорній поверхні олігонуклеотидами-пробами досягають значно кращого співвідношення сенсорних відгуків на користь повністю комплементарних олігонуклеотидів-мішеней за рахунок вибору температури післягібридизаційної обробки, близької до температури плавлення (Тт) дволанцюгового комплекса з частково комплементарними олігонуклеотидами-мішенями.The way to improve the selectivity of the hybridization DNA sensor is to additionally use a thermostabilization, control, and temperature regulation system developed for this purpose, with the help of which, upon hybridization of fully or partially complementary target oligonucleotides with probe oligonucleotides immobilized on the sensor surface, a significantly better ratio of sensor feedback in favor of fully complementary target oligonucleotides due to the choice of post-hybridization treatment temperature close to the melting temperature (Tt) of the double-stranded complex with partially complementary target oligonucleotides.
Використання згаданого вище веб-сервера ОІМАМей значно спростило пошук такої температури Ті, під дією якої дволанцюговий комплекс одного виду ДНК-мішеней майже не зазнає змін, тоді як дволанцюговий комплекс другого виду ДНК-мішеней повністю (або в значній мірі) руйнується. Можливість регулювати температуру вимірювальної комірки с точністю 0,1 7 в діапазоні від 20 "С до 70 "С дозволяє швидко, зручно і без застосування молекулярних міток підібрати таку температуру, тобто добитися суттєвого покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора для будь-якої пари різних ДНК-мішеней. Приклад використання способу.The use of the OIMAMey web server mentioned above greatly simplified the search for a temperature Ti at which the double-stranded complex of one type of target DNA undergoes almost no changes, while the double-stranded complex of the second type of DNA-targets is completely (or largely) destroyed. The ability to adjust the temperature of the measuring cell with an accuracy of 0.17 in the range from 20 "C to 70 "C allows you to quickly, conveniently and without the use of molecular labels to choose such a temperature, that is, to achieve a significant improvement in the selectivity of the hybridization DNA sensor for any pair of different DNA - target An example of using the method.
Зо При реалізації запропонованого способу були використані короткі послідовності нуклеїнових кислот (олігонуклеотиди), які є фрагментами гібридного гену Бег-арі, що пов'язаний з розвитком такого захворювання як хронічна мієлогенна лейкемія. На сенсорну поверхню приладу для аналізу біохімічних середовищ з системою термостабілізації контролю та регулювання температури іммобілізували олігонуклеотиди-проби тод-РА (5Н-(СНег). СТ САА СсОО СТ ТОDuring the implementation of the proposed method, short sequences of nucleic acids (oligonucleotides) were used, which are fragments of the Beg-ari hybrid gene, which is associated with the development of such a disease as chronic myelogenous leukemia. On the sensor surface of the device for the analysis of biochemical environments with a thermostabilization system of control and temperature regulation, oligonucleotide probes tod-RA (5H-(СНег). СТ САА СсОО СТ ТО were immobilized
ААС ТСТ ОСТ). Для дослідження селективності процесу гібридизації використовували два різних вида ДНК-мішеней: 1) повністю комплементарні (до іммобілізованих олігонуклеотидів тоа-Ри) олігонуклеотиди РІ (АС АПА СТІ САА ДА ССС ТС Ас); та 2) частково комплементарні (до іммобілізованих олігонуклеотидів тоа-Ри) олігонуклеотиди Встех14 (ССАAAS TST OST). To study the selectivity of the hybridization process, two different types of DNA targets were used: 1) completely complementary (to the immobilized toa-Ry oligonucleotides) RI oligonucleotides (AS APA STI SAA DA SSS TC As); and 2) partially complementary (to immobilized toa-Ry oligonucleotides) Vstekh14 oligonucleotides (ССА
Ста САТ ТТА АОС АСА СТ САА).Sta SAT TTA AOS ASA ST SAA).
Веб-сервер ОІМАМеїї дозволяє визначати температуру плавлення подвійної спіралі будь- якої відомої нуклеотидної послідовності, що знаходиться у гомогенній системі (у розчині). Таким чином, були отримані термодинамічні параметри гібридизації двох пар досліджуваних олігонуклеотидів: зміна енергії Гіббса та температура плавлення (Табл.).The OIMAME web server allows you to determine the melting point of the double helix of any known nucleotide sequence in a homogeneous system (in solution). Thus, the thermodynamic parameters of the hybridization of two pairs of oligonucleotides under study were obtained: change in Gibbs energy and melting temperature (Table).
ТаблицяTable
Оцінка за допомогою веб-сервера СІМАМеїї термодинамічних параметрів гібридизації досліджуваних олігонуклеотидів для Сднк - 200 нМ, (Ма"1-0,4 М, (Ма-41--0 М.Estimation using the SIMAM web server of the thermodynamic parameters of the hybridization of the studied oligonucleotides for Sdnk - 200 nM, (Ma"1-0.4 M, (Ma-41--0 M.
Табличні дані свідчать про те, що в розчині при кімнатній температурі обидві пари досліджуваних олігонуклеотидів утворюють стійкі дволанцюгові структури, а при підвищенні температури до -40 "С значна частина дуплексів тоа-Рн/Встех14 плавиться, тоді як дуплекси тода-РП/РІ залишаються стабільними. Гібридизація в гетерогенній системі (при наявності твердої сенсорної поверхні, на якій іммобілізують олігонуклеотиди-проби) створює менш сприятливі умови для гібридизації і абсолютні значення АС та Тт мають дещо відрізнятися від зазначених в Табл. Якісна поведінка цих двох пар олігонуклеотидів буде такою ж: при поступовому підвищенні температури спочатку будуть руйнуватися тільки дуплекси тоа-The tabular data indicate that in the solution at room temperature, both pairs of the studied oligonucleotides form stable double-stranded structures, and when the temperature is increased to -40 "С, a significant part of the toa-Pn/Vstech14 duplexes melts, while the toda-RP/RI duplexes remain stable . Hybridization in a heterogeneous system (in the presence of a solid sensor surface on which probe oligonucleotides are immobilized) creates less favorable conditions for hybridization, and the absolute values of AC and Tt should differ slightly from those indicated in Table. The qualitative behavior of these two pairs of oligonucleotides will be the same: at with a gradual increase in temperature, initially only duplexes will be destroyed
Рі/Встех14. Для досягнення покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора для пари досліджуваних ДНК-мішеней як температуру Т: було вибрано 40 "С, що є значно нижчою, ніж Тт дуплексів тода-РИ/РІ, але дещо вище Тт дуплексів для дуплексів тоа-Рп/Встех14, розрахованих для гомогенних умов.Ri/Vsteh14. In order to achieve an improvement in the selectivity of the hybridization DNA sensor for a pair of DNA targets under investigation, the temperature T: was chosen to be 40 "C, which is significantly lower than the Tt of duplexes toda-RI/RI, but slightly higher than the Tt of duplexes for duplexes toa-Pp/Vstech14 , calculated for homogeneous conditions.
Відповідно до концепції методу, дослідження здійснювали в два етапи: спочатку вивчали гібридизацію повністю комплементарних олігонуклеотидів Рі, а потім - частково комплементарних олігонуклеотидів Встех14. Кожен етап складався з трьох кроків. Спочатку, при початковій температурі То-30 "С в робочий канал вимірювальної комірки було введено 200 нм розчин комплементарної ДНК-мішені Р1 (в контрольний канал продовжували вводити буферний розчин), було проведено гібридизацію впродовж 10 хв. і промивання буферним розчином і вимірювання початкового відгуку біосенсора на гібридизацію цієї мішені.According to the concept of the method, the research was carried out in two stages: first, the hybridization of completely complementary Ri oligonucleotides was studied, and then - partially complementary oligonucleotides Vstekh14. Each stage consisted of three steps. First, at an initial temperature of To-30 "С, a 200 nm solution of the complementary DNA target P1 was introduced into the working channel of the measuring cell (buffer solution continued to be introduced into the control channel), hybridization was carried out for 10 min. and washing with buffer solution and measurement of the initial response biosensor for hybridization of this target.
Потім, за допомогою терморегулюючої комірки було забезпечено нагрівання буферного розчину до вибраної температури 40 "С і здійснено обробку комірки цим розчином впродовж 5 хв. При цьому, дегібридизовані послідовності нуклеїнових кислот видалялися з вимірювальної комірки. Після цього температуру в комірці знов знижували до 30 "С.Then, with the help of a thermoregulating cell, the buffer solution was heated to the selected temperature of 40 "C and the cell was treated with this solution for 5 minutes. At the same time, dehybridized sequences of nucleic acids were removed from the measuring cell. After that, the temperature in the cell was again reduced to 30 "C .
Третім кроком було визначення величини сенсорного відгуку після повернення температури до початкового значення. Порівнявши отриману величину з початковим сенсорним відгуком, визначали частку дволанцюгових комплексів, що залишились на сенсорній поверхні після зазначеної процедури.The third step was to determine the value of the sensory response after the temperature returned to the initial value. After comparing the obtained value with the initial sensor response, the proportion of double-chain complexes remaining on the sensor surface after the specified procedure was determined.
Суть запропонованої корисної моделі пояснюється наступними графічними матеріалами, де на:The essence of the proposed useful model is explained by the following graphic materials, where on:
Фі. 1 - схематично наведено сенсограму ППР, що відображає взаємодію Рі з іммобілізованими на сенсорній поверхні тод-Ри та вплив на рівень такої взаємодії спочатку підвищення температури до 40 "С, а потім охолодження до початкової температури.Fi. 1 - schematically shows the PPR sensorgram, which reflects the interaction of Ri with immobilized tod-Ri on the sensor surface and the effect on the level of such interaction at first by raising the temperature to 40 "С, and then cooling to the initial temperature.
Фіг. 2. схематично наведено сенсограму ППР, що відображає взаємодію Всгех14 з іммобілізованими на сенсорній поверхні тод-Ри та вплив на рівень такої взаємодії спочатку підвищення температури до 40 "С, а потім охолодження до початкової температури.Fig. 2. schematically shows the sensorgram of the PPR, which reflects the interaction of Vsgekh14 with immobilized tod-Ry on the sensor surface and the effect on the level of such interaction of first raising the temperature to 40 "С, and then cooling it to the initial temperature.
Як видно з Фіг. 1, підвищення температури до 40 "С майже не впливає на рівень взаємодіїAs can be seen from Fig. 1, increasing the temperature to 40 "C has almost no effect on the level of interaction
Зо тоа-Ри ї РІ: при охолодженні до початкової температури сенсорний відгук складав 81 905 від початкового.Zo toa-Ri and RI: when cooled to the initial temperature, the sensory response was 81,905 from the initial one.
У випадку, коли замість повністю комплементарних олігонуклеотидів РІ у вимірювальну комірку вводили частково комплементарні олігонуклеотиди Всгех14 (Фіг. 2), після процедури нагрівання до 40 "С і охолодження до початкової температури спостерігали практично повну відсутність сенсорного відгуку. Це свідчить, що практично всі дуплекси тоа-Рп/Встех14 не витримали зазначеної процедури.In the case when, instead of fully complementary RI oligonucleotides, partially complementary Vsgekh14 oligonucleotides were introduced into the measuring cell (Fig. 2), after the procedure of heating to 40 "C and cooling to the initial temperature, an almost complete absence of sensory response was observed. This indicates that almost all duplexes of -Rp/Vstekh14 did not pass the specified procedure.
Таким чином, за допомогою запропонованого способу покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора на основі приладу для аналізу біохімічних середовищ з системою термостабілізації, контролю та регулювання температури при застосуванні нагрівання до 40 "С, що є значно нижчою температурою, ніж Тт дуплексів тоа-РА/РІ, але дещо вище Тт дуплексів для дуплексів тоа-Ри/ Встех14, розрахованих для гомогенних умов, вдалося показати не тільки різну стабільність двох видів дуплексів нуклеїнових кислот, але й досягнути цілковитої температурної дискримінації вказаних послідовностей нуклеїнових кислот, тобто було досягнуто покращення селективності гібридизаційного ДНК-сенсора. Це було зроблено швидко, зручним способом і без застосування будь-яких молекулярних міток.Thus, using the proposed method of improving the selectivity of the hybridization DNA sensor based on a device for the analysis of biochemical environments with a system of thermostabilization, control and regulation of temperature when applying heating to 40 "C, which is a much lower temperature than the Tt of duplexes toa-RA/RI , but slightly higher Tt duplexes for toa-Ry/Vstech14 duplexes calculated for homogeneous conditions, it was possible to show not only the different stability of the two types of nucleic acid duplexes, but also to achieve complete temperature discrimination of the specified nucleic acid sequences, i.e., an improvement in the selectivity of hybridization DNA- sensor.This was done in a fast, convenient way and without the use of any molecular labels.
Джерела інформації: 1. Соодіпу 9.9. Еіесітоспетіса! ОМА НуБгіаігайоп Віозепзог5 // Еіесітоапа|увів. - 2002. - Мої. 14, Мо 17. - Р. 1149-1156. 2. Гисагей Р. еї аі. Сагтоп апа дод еїІесігодез5 ав еєІесігоспетіса! їапзаисегв Тог ОМАSources of information: 1. Soodipu 9.9. Eiesitospetisa! OMA NuBgiaigayop Viozepzog5 // Eiesitoapa|uviv. - 2002. - Mine. 14, Mo. 17. - R. 1149-1156. 2. Hysagei R. ei ai. Sagtop apa dod eiIesigodez5 av eiIesigospetisa! iapzaisegv Tog OMA
Нубгіаізаноп зепзогз // Віозепв. ВіоєЇІесігоп. - 2004. - Мої. 19, Ме 6. - Р. 515-530.Nubgiaizanop zepzogz // Viozepv. VioyeYiIesigop. - 2004. - Mine. 19, Me 6. - R. 515-530.
З. Мапд 9. ЕІестптоспетіса! ріозепзогв: Томжагав роїіпі-ої-саге сапсег адіадповіїс5. // Віозепв.Z. Mapd 9. EIestptospetisa! riozepsogv: Tomzhagav roiipi-oi-sage sapseg adiadpoviis5. // Viozepv.
ВіоєЇІесігоп. - 2006. - Мої. 21, Мо 10. - Р. 1887-1892. 4. ТеІез Р., Еопзеса Г.. Ттепаз іп ОМА Біозепзогз // Таіапіа. - 2008. - Мої. 77, Мо 2. - Р. 606-623. 5. Реїегзеп у. еї аіІ. Обе ої а типі-ШТептаї! мавзнег ог ОМА тістоаітаув 5ітрійев ргобе девідп апа діме5 гобиві депоїуріпу аззаув. //Мисівєїс Асід5 Нев. - 2008. - Мої. 36, Мо 2. - Р. е10. б. Рошпівеп Ї. еї аі. Мийі-зїпіпдепсу жав ої рапіау Ппубгіаігед 60-тег ргобез гемеаїв5 ШТаї Ше 5ігіпдепсу апа Ше ргобе дестеабзе5 мій аівтапсе пот Ше тістоатау 5ипасе. // Мисівіс Асід5VioyeYiIesigop. - 2006. - Mine. 21, Mo. 10. - R. 1887-1892. 4. Teiz R., Eopsesa G.. Ttepaz ip OMA Biozepsogz // Taiapia. - 2008. - Mine. 77, Mo. 2. - R. 606-623. 5. Reiegzep u. her aiI. Both oh and tipi-SHTPtai! mauzneg og OMA testoaitauv 5itriyev rgobe devidp apa dime5 gobivy depoiuripu azzauv. //Mysiveis Asid5 Nev. - 2008. - Mine. 36, Mo 2. - R. e10. b. Roshpivep Y. ei ai. Miyi-zipipdepsu zhav oi rapiau Ppubgiaiged 60-teg rgobez gemeaiv5 ShTai She 5igipdepsu apa She rgobe desteabze5 my aivtapse pot She testoatau 5ipase. // Mysivis Acid5
Вез. - 2008. - Мої. 36, Мо 20. - Р. е132.Transportation - 2008. - Mine. 36, Mo 20. - R. e132.
7. йиКег М. ТнеОМАРоіЯУУев бЗегуег (Електронний ресурс| /М. 7иКег, М. МажЖнат, //7. yiKeg M. TneOMARoiYAUUev bZegueg (Electronic resource | /M. 7yKeg, M. Mazzhnat, //
Вепззеїаєг Роїуїеснпіс Інзійше. - 1995. пер/ипагоа.гпа.аірапу.еди/?д-діпатеїї. 8. М/йметг С. Т. Нідн-тезоїшіоп ОМА тейіпд апаїувзіб: адмапсетепів апа Ітйайоп5 /НитапVepzeiaeg Roiuiesnpis Inziyshe. - 1995. per/ipagoa.gpa.airapu.edi/?d-dipateii. 8. M/ymetg S.T.
Миаїйоп. - 2009. - Мо 30. - Р. 857-859. 9. Віссі Е., Гаї В.У., Ріахсо КМУ. І Іпеаг, тедох тоайва ОМА ргобрез5 аз веіесігоспетіса! ОМА зепвогв /Спет. Соттип. - 2007. - Р. 3768-3770. 10. Мапа МУ., Гаї Н.У. ЕНесі ої айнепі спаїіп Іепдій оп Ше репогтапсе ої Ше еІесіоспетісаїMiayop. - 2009. - Mo 30. - R. 857-859. 9. Vissi E., Gai V.U., Riahso of KMU. And Ipeag, tedoh toaiva OMA rgobrez5 az veiesigospetisa! OMA zepvogv /Spet. Sottype - 2007. - R. 3768-3770. 10. Map MU., Gai N.U. Enesi oi ainepi spaiip Iepdiy op She repogtapse oi She eIesiospetisai
ОМА 5епзог аї єЇІемаїей їетрегаїшге//Апаїуві. - 2011. - Мої. 136. - Р. 134-139.ОМА 5епзог аи еІІемаіей јетрегаішге//Апаіуви. - 2011. - Mine. 136. - R. 134-139.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201608896U UA113761U (en) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU201608896U UA113761U (en) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA113761U true UA113761U (en) | 2017-02-10 |
Family
ID=58049076
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU201608896U UA113761U (en) | 2016-08-18 | 2016-08-18 | METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA113761U (en) |
-
2016
- 2016-08-18 UA UAU201608896U patent/UA113761U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ma et al. | Sensitive quantification of microRNAs by isothermal helicase-dependent amplification | |
| Xi et al. | Nanopore-based selective discrimination of microRNAs with single-nucleotide difference using locked nucleic acid-modified probes | |
| Redshaw et al. | A comparison of miRNA isolation and RT-qPCR technologies and their effects on quantification accuracy and repeatability | |
| Yin et al. | Sensitive detection of microRNA in complex biological samples via enzymatic signal amplification using DNA polymerase coupled with nicking endonuclease | |
| Mi et al. | Circular RNA detection methods: A minireview | |
| Walter et al. | Fluorescence correlation analysis of probe diffusion simplifies quantitative pathogen detection by PCR | |
| Ou et al. | Rapid and ultrasensitive detection of microRNA based on strand displacement amplification-mediated entropy-driven circuit reaction | |
| TWI527905B (en) | Method of snp detection by using gene detection technique in bead-based microfluidics | |
| JP6126381B2 (en) | Target nucleic acid detection method and kit | |
| Hashimoto et al. | Multiplex real-time loop-mediated isothermal amplification using an electrochemical DNA chip consisting of a single liquid-flow channel | |
| CN105765583B (en) | Quantum method for removing fluorescence background in DNA melting analysis | |
| Wang et al. | Integration of multiplex PCR and CRISPR-Cas allows highly specific detection of multidrug-resistant Acinetobacter Baumannii | |
| Wang et al. | Sensitive detection of cancer gene based on a nicking-mediated RCA of circular DNA nanomachine | |
| Zhang et al. | Development of oxidation damage base-based fluorescent probe for direct detection of DNA methylation | |
| US20190169682A1 (en) | Molecular Constructs for Differentiating a Target Molecule from an Off-Target Molecule | |
| CN102112632A (en) | Detection algorithm for PCR assay | |
| Song et al. | A novel assay strategy based on isothermal amplification and cascade signal amplified electrochemical DNA sensor for sensitive detection of Helicobacter pylori | |
| Na et al. | Multiplex quantitative analysis of microRNA expression via exponential isothermal amplification and conformation-sensitive DNA separation | |
| Zahra et al. | The SHERLOCK platform: an insight into advances in viral disease diagnosis | |
| Dong et al. | Rolling circle amplification-coupled glass nanopore counting of mild traumatic brain injury-related salivary miRNAs | |
| Ye et al. | Sequence-specific probe-mediated isothermal amplification for the single-copy sensitive detection of nucleic acid | |
| JP5403573B2 (en) | Primer set for detecting pneumonia | |
| Liao et al. | Simultaneous detection of two hepatocellar carcinoma-related microRNAs using a clever single-labeled fluorescent probe | |
| Liu et al. | Enhanced fluorescent detection of nucleic acid based on hairpin DNA-assisted toehold-mediated strand displacement reaction | |
| UA113761U (en) | METHOD OF IMPROVING SELECTIVITY OF HYBRIDIZATION DNA SENSOR |