UA113493C2 - Спосіб видалення ділянки днк в рослині - Google Patents

Спосіб видалення ділянки днк в рослині Download PDF

Info

Publication number
UA113493C2
UA113493C2 UAA201210056A UAA201210056A UA113493C2 UA 113493 C2 UA113493 C2 UA 113493C2 UA A201210056 A UAA201210056 A UA A201210056A UA A201210056 A UAA201210056 A UA A201210056A UA 113493 C2 UA113493 C2 UA 113493C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
plant
dna
nucleic acid
plants
zinc finger
Prior art date
Application number
UAA201210056A
Other languages
English (en)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44307617&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=UA113493(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed filed Critical
Publication of UA113493C2 publication Critical patent/UA113493C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/8265—Transgene containment, e.g. gene dispersal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses

Abstract

Винахід стосується способу видалення ділянки ДНК в рослині згідно з яким:надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні;вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза "цинкові пальці" функціонально зв′язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку;схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина Fпродукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини F; івирощують одержувану рослину F, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини F.

Description

(54) СПОСІБ ВИДАЛЕННЯ ДІЛЯНКИ ДНК В РОСЛИНІ (57) Реферат:
Винахід стосується способу видалення ділянки ДНК в рослині згідно з яким: надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК їі першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'--кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні; вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза "цинкові пальці" функціонально зв'язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку; схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина Е: продукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини Н.; і вирощують одержувану рослину Рі, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини Ні.
СС ІННО БЕ МЕ МАНКУ
Авюреєх Ш Уа кої / ЛОНА Ножівк В ши ну - вв й яке Й. Огнййе 4 та
ДОЛ ро -Й7 рОАВН279 ї і
СС ВІНГІНЕ БЕ ее -»
ВІДІ рити чо - | -55 4
ДІА реоннкегіпгов сії тТайо СЕР я? рай Й ов нер
АБОНЕгУ ЗИ Зеох о «у
ЛИВІ рустовиг ч2 и х ТОНА ВаміагА й рат тона ВаціегА
І ТОВЩА Багіег
Ав З ІНК Уа
Бате Тепоі па
Фіг. і
ДОМАГАННЯ НА ПРІОРИТЕТ
Дана заявка заявляє пріоритет за попередньою патентною заявкою США, Мо 61/297628, зареєстрованою 22 січня 2010 року, що має назву «Вирізання трансгенів в генетично модифікованих організмах».
ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД
Винахід загалом стосується композицій і способів створення трансгенних рослин. У певних варіантах здійснення трансгенні рослини містять один або більше трансгенів, що представляють інтерес. У певних варіантах здійснення управляють вирізанням трансгену (трансгенів) в пилку і/або насінні, так що пилок і/або насіння, вироблене трансгенною рослиною винаходу, в основному не містить трансгену (трансгенів). У деяких варіантах здійснення трансгенні рослини винаходу корисні, наприклад, для досягнення біоутримання трансгену (трансгенів), що представляють інтерес, в трансгенній рослині. В інших варіантах здійснення вирізання трансгену направлене на специфічну касету експресії, наприклад, на селектований маркер, так що тільки вказана касета експресії видаляється з трансгенної рослини і/або потомства трансгенної рослини.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
Багато які рослини генетично трансформують за допомогою генів інших видів для надання їм бажаних властивостей, а саме, щоб збільшити сільськогосподарську цінність завдяки, наприклад, поліпшенню якості харчової цінності, збільшенню врожайності, наданню стійкості до шкідників або захворювань, збільшенню стійкості до засухи і стресу, поліпшення плодових якостей, таких як пігментація і ріст, і/або наданню стійкості до гербіцидів; забезпеченню можливості продукції промислово застосовних сполук і/або матеріалів з рослин и; і/або забезпеченню можливості продукції лікарських засобів. Введення клонованих генів в рослинні клітини і відновлення стабільно плодоносних трансгенних рослин може бути використане д ля отримання таких модифікацій рослини, і забезпечує бажані ознаки або якості, які представляють інтерес, які повинні бути включені в рослини за допомогою генної інженерії (наприклад, поліпшення культури). У вказаних способах чужорідну ДНК звичайно вводять в ядерну або пластидну ДНК еукаріотичної рослинної клітини з подальшим виділенням клітин, що містять чужорідну ДНК, інтегровану в клітинну ДНК, для отримання стабільно трансформованих
Зо рослинних клітин.
Один недолік, який виникає в зв'язку із застосуванням трансгенних рослин, полягає в можливості витоку трансгенів до диких видів і нетрансформованих видів. Вказані ознаки можуть збільшувати ризик ауткросингу, персистенції і інтрогресії трансгенів в сусідній популяції. Витік трансгенів з генетично модифікованих (ЗМ) сільськогосподарських культур звичайно відбувається завдяки потоку генів, головним чином за допомогою перехресного запилення (І и (2003) Емігоп. Віозаїеїу Нез. 2:3-8), але також може відбуватися в результаті інтрогресії. іЇемаг г. ег а. (2003) Маї. Веміємв Сівп. 4:806-17. Потік генів від культури до культури буде приводити до контамінації не-ЗМ сортів, впливаючи на стратегічне розставляння трансгенних і нетрансгенних сортів сільськогосподарських культур в даній сільськогосподарській системі.
Значна контамінація не-ОМ культур трансгенним матеріалом викликає складності в міжнародній торгівлі в зв'язку з юридичними обмеженнями на імпорт трансгенних продуктів багатьма країнами. Потік генів від культури до культури може спричинити накопичення трансгенів в гібридах, які потенційно можуть стати самозасівними бур'янами, якщо трансгени надають множинну стійкість (наприклад, до гербіцидів, шкідників і/або захворювань). Крім того, потік генів від культури до культури може привести до витоку трансгенів в популяції бур'янів або споріднених диких видів, що може являти собою серйозні проблеми з бур'янами і інші екологічні ризики, якщо трансгени зберігаються і фіксуються в бур'янових/диких популяціях внаслідок статевого розмноження і/або вегетативного розмноження. Це має особливо велике значення, якщо «гени, що вислизнули» посилюють екологічну пристосованість бур'янових/дикий видів.
Інтрогресія трансгену сільськогосподарської культури відбувається під час стадій, що залучають декілька послідовних гібридних поколінь. Інтрогресія є динамічним процесом, який відбувається протягом багато років і поколінь, перш ніж трансген закріпиться в спадковості отримуваних видів і, таким чином, викликає складності у визначенні і моніторингу. Однак якщо відбір є суворим і/або розмір популяції є невеликим, закріплення інтрогресивного гену може відбуватися стрімко.
Обмеження специфічної касети експресії в межах генетично модифікованих рослин, особливо касети експресії селектованого маркера є важкодосяжною метою. Гени селектованого маркера звичайно являють собою гени стійкості до антибіотиків або до гербіцидів, але можуть включати репортерні гени (тобто Д-глюкуронідаза (Сгтгапат еї аї. (1989) Ріапі Сеї! Тіб5.. ОГО. 20():35-39). Селектовані маркери, які спільно переносять в геном рослини, забезпечують бо селективну перевагу і дозволяють провести ідентифікацію стабільно трансформованих трансгенних рослин. Доступність функціональних генів селектованих маркерів, які можуть бути використані для трансформації рослин, до деякої міри обмежена. Огляд опублікованої наукової літератури по трансгенних сільськогосподарських культурах показує, що селективні агенти стійкості до антибіотиків, що найбільш широко застосовуються, являють собою агент стійкості до канаміцину (що кодується геном неоміцин-фосфотрансферази типу І! (Вемап еї аї. (1983)
Маїште 304: 184-187)) або до гігроміцину (що кодується геном гігроміцин-фосфотрансферази (Уаїдюг еї аї, Ріапі Мої. Віо!. 5: 103-108), і стійкість до гербіцидів є стійкістю до фосфінотрицину (що кодується генами раї (УмопІереп еї аї. (1988) Сепе 70:25-37) або Баг (ОевВіоск еї аї. (1987),
ЕМВО У. 6 (9):2513-2518)). Див. Зипааг еї аї. (2008) 9. Ріапі РНувзіої. 165: 1698-1716. Беручи до уваги обмежене число генів селектованих маркерів, і практичне використання ряду параметрів цих ознак, рішення, яке дозволяє вирізання і повторне застосування селектованих маркерів, в трансгенній рослині усувало б потребу в додаткових селектованих маркерах в послідовних раундах перенесення генів або стекінгу генів в тій же самій рослині. Крім того, можливість вирізати селектований маркер може подолати непередбачені зміни транскриптому рослини, які викликаються експресією маркера (Абваееп еї а. (2009) Ріапі Віоїесппої. 9. 7(3):211-218).
Сучасні стратегії запобігання або мінімізації потоку генів між зМ-культурами і іншими видами і сортами включають: (1) фізичну ізоляцію трансгенної культури; (2) хлоропластний інжиніринг трансгенів; (3) до-інжиніринг гену ослаблення разом з трансгеном; (4) генетичне використання рестрикційних технологій (ЗИОКТ); (55 СКЕЛОохХР і РІР/РКТ рекомбіназа- опосередковану делецію гену. Див., наприклад, І ее апа Маїезап (2006) ТКЕМО5 Віоїесн. 24(3): 109-147; Си (2003), вище; і Го еї аїЇ. (2007), Ріапі Віоїесп. 9. 5:263-74; і (6) мегануклеаза- опосередковану делецію генів. Див., наприклад, патентну заявку США Мо 11/910515; і патентну заявку США Мо 12/600902.
Рекомбінази СКЕ, РІР ії К використовували для видалення небажаного генетичного матеріалу з рослин. Наге і Спа (2002) Маї. Віотесп. 20:575-80. І цо еї аї. (2007), вище описали специфічну до пилка і насіння систему "ЗМ-депе-деїейг", в якій застосування гібридних послідовностей охР-ЕКТ як сайтів розпізнавання для видалення трансгенів рекомбіназою СКЕ або РІ Р. приводило до делеції трансгенів з пилка, або пилка і з насіння трансгенних рослин тютюну. Всі ці сайт-специфічні рекомбіназні системи, що виявили функціональність в рослинах,
Зо є членами сімейства інтеграз. Вказані системи вибрані для застосування, щонайменше частково, внаслідок того, що інші рекомбінази можуть мати потребу у допоміжних білках і більш складних сайтах розпізнавання, що може накласти топологічні обмеження на ефективність рекомбінації. (4. Вказані системи мають декілька істотних недоліків: рекомбінази типу інтеграз також можуть розпізнавати "псевдопослідовності", які можуть сильно відрізнятися від специфічної послідовності-мішені і в наслідок цього викликати небажані неспецифічні делеції
ДНК; і при вирізанні послідовності-мішені залишається залишкова послідовність розпізнавання, яка може являти собою сайти хромосомних реаранжирувань після послідовної обробки рекомбіназою, або активувати механізми сайленсингу генів. Іа. Крім того, вказані системи додатково обмежені, оскільки функціональна рекомбіназа повинна бути представлена і експресована в одній з батьківських рослин, присутність якої вимагає додаткових стратегій делеції при наявності в пилку і/або насіння. Незважаючи на вказані обмеження, система
СКЕЛОХР вважається найбільш прийнятною стратегією оптимізації делеції генів в рослинах. Ід.
Сконструйовані на замовлення нуклеази «цинкові пальці» (2ЕМ) являють собою білки, розроблені для внесення направленого сайт-специфічного дволанцюжкового розриву в ДНК, з подальшою рекомбінацією розщеплених кінців. 2ЕМ об'єднують в собі домен неспецифічного розщеплення ендонуклеази рестрикції БоКкІ з ДНК-зв'язувальними білками "цинкові пальці".
Див., наприклад, Ниапо еї аї. (1996) 9. Ргоїєвіп Спет. 15:481-9; Кіт еї аї. (1997) Ргос. Маї). Асад.
Зсі. ОБА 94:3616-20; Кіт еї аї. (1996) Ргос. Май. Асад. 5сі. ОБА 93: 1156-60; Кіт еї аї. (1994)
Ргос, Маї!. Асай. сі. ОБА 91:883-7; Кіт еї аї!. (19975) Ргос. Маї). Асад. осі. ОБА 94: 12875-9; Кіт еї аІ. (1997с) Сепе 203:43-9; Кіт еї аї. (1998) ВіоЇ. Снет. 379:489-95; Манйоп апа Ваменй (1998)
Мисієїс Асідб5 Нев. 26: 1233-95 Зтій еї аї. (1999) Мисієїс Асід5 Вевз. 27:674-81. Індивідуальні мотиви «цинкові пальці» можуть бути розроблені для виявлення і зв'язування з великим набором сайтів ДНК. Білки «цинкові пальці» Субз2Нівг2 зв'язують ДНК шляхом введення с-спіралі у велику борозенку подвійної спіралі. Розпізнавання ДНК «цинковими пальцями» є модулярним: кожний палець спочатку контактує з трьома парами основ в мішені, що йдуть підряд, і декілька ключових остатків в білку опосередковують розпізнавання. Показано, що ендонуклеаза рестрикції БоКІ повинна димеризуватися через нуклеазний домен для розщеплення ДНК, викликаючи дволанцюжковий розрив. Аналогічним чином, 2ЕМ також мають потребу в димеризації нуклеазного домену для розрізання ДНК. Мапі еї аї. (2005) Віоспет. Віорпу5. Кезв. 60 боттип. 334: 1191-7; Зтійй еї а). (2000) Мисієїс Асідб5 ВНе5. 28:3361-9. Димеризації 2ЕМ сприяють два прилеглих, протилежно орієнтованих сайти зв'язування. Крім того, дволанцюжкові розриви, викликані нуклеазами «цинкові пальці» усуваються репараційним апаратом ДНК рослин за допомогою з'єднання негомологічних кінців (МНЕ.)) або за допомогою гомологічної рекомбінації (НО), приводячи, таким чином, до утворення рослин, які не містять залишкових послідовностей розпізнавання.
ОПИС ВИНАХОДУ
Згідно з варіантом здійснення винаходу, надається спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, в якій жива рослина містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК; і нуклеаза «цинкові пальці», сконструйована для розщеплення геномної ДНК в послідовності розпізнавання, експресується або вводиться в живу рослину, що містить геномну ДНК; приводячи тим самим до розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання, що приводить до вирізання геномної ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК.
В іншому варіанті здійснення спосіб видалення ділянки ДНК в рослині включає надання першої життєздатної рослини, що містить геномну ДНК, що містить ділянку ДНК, і першу послідовність розпізнавання, що фланкує 3'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК. Надають другу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ДНК, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», сконструйовану для розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання. Схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що нащадок Еї виробляється на першій або на другій життєздатній рослині. Вирощують отриману рослину Е1, що містить геномну ДНК, в якій відсутня ділянка ДНК з геномної ДНК. У певних варіантах здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання можуть бути однаковими.
У конкретному варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти включає: першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці»; ген, що представляє інтерес; і другу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці», де ген, що представляє інтерес, фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, розпізнавані нуклеазою «цинкові пальці». В іншому варіанті здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання можуть бути фланковані гомологічними послідовностями. У ще одному варіанті здійснення
Зо спосіб отримання трансгенної рослини включає трансформування рослинної клітини або рослинної тканини виділеною молекулою нуклеїнової кислоти і регенерацію цілої рослини. У додатковому варіанті здійснення спосіб зменшення передачі гену, що представляє інтерес, іншим рослинам включає схрещування цілої рослини з рослиною, регенерованою з рослинної клітини або тканини, трансформованої виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить специфічний для пилка промотор, функціонально зв'язаний з нуклеазою «цинкові пальці», де ген, що представляє інтерес, специфічно вирізають в пилку потомства, отриманого в результаті схрещування. Потомство, отримане в результаті схрещування, культивують. У такому варіанті здійснення виділена молекула нуклеїнової кислоти містить промотор і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», де промотор функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці», і спосіб отримання трансгенної рослини, який включає трансформацію рослинної клітини або рослинної тканини виділеною молекулою нуклеїнової кислоти і регенерацію цілої рослини.
У варіанті здійснення спосіб видалення ділянки ДНК в рослині містить молекулу нуклеїнової кислоти, що включає: першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці»; касету експресії гену селектованого маркера; і другу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнавану нуклеазою «цинкові пальці», де селектований маркер фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, розпізнаваними нуклеазою «цинкові пальці». В іншому варіанті здійснення перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання фланковані гомологічними послідовностями. Крім того, нуклеаза «цинкові пальці», сконструйована для розщеплення геномної ДНК в послідовності розпізнавання, експресується або вводиться в життєздатну рослинну клітину; приводячи тим самим до розщеплення геномної ДНК в послідовностях розпізнавання, що приводить до вирізання геномної ДНК, де селектований маркер відсутній в геномній ДНК.
В іншому варіанті здійснення кожна половина мономеру нуклеази «цинкові пальці» експресується окремо і при з'єднанні разом одна з одною вони утворюють функціональний комплекс. Наприклад, одиниця транскрипції рослини, яка експресує один мономер нуклеази «цинкові пальці» (що складається із зв'язувального мотиву «цинкові пальці», функціонально зв'язаного з нуклеазою РОКІ) стабільно інтегрується в одного батька, РІ, і одиниця транскрипції рослини, яка експресує другий мономер, стабільно інтегрується в другого батька, Р2. Статеве бо схрещування Рі х Р? дає в результаті рослини-нащадки, які містять обидва мономери
«цинкових пальців». Отримуваний димер нуклеази «цинкові пальці» здатний до зв'язування з сайтом зв'язування «цинкових пальців» і до формування комплексу, який має розщеплювальну активність. Враховуючи, що ендонуклеаза ЕоКі активна як димер (Віпаїйе еї аї. (1998) Ргос. Май.
Асад. Осі. ОБА 95: 10,570-10,575), розщеплювальна активність здатна виявитися тільки у потомства, яке містить обидва функціонально експресуючих мономери.
В іншому варіанті здійснення вирізання нуклеазою «цинкові пальці» в послідовності розпізнавання приводить до утворення сполуки на місці розщеплення, яка не містить залишкової послідовності розпізнавання. Сполука розриву не може зв'язуватися (« розщеплюватися вихідною нуклеазою (нуклеазами) «цинкові пальці». Крім того, сполука розриву може бути результатом негомологічного з'єднання кінців (МНЕ) або результатом гомологічної рекомбінації між двома гомологічними областями ДНК, які розташовані вище за 5'- послідовність розпізнавання і нижче за 3'-послідовність розпізнавання, або результатом іншого неописаного механізму репарації ДНК. Гомологічна послідовність може розташовуватися за межами сайтів зв'язування, так що після розщеплення може відбуватися гомологічна рекомбінація. Це є удосконаленням в порівнянні з рекомбіназними системами, які завжди залишають після себе залишок сайту, використаного для проведення ексцизії.
У ще одному варіанті здійснення спосіб вирізання нативного гену, що представляє інтерес, в рослині включає трансформацію рослинної клітини або тканини, що містить ген, що представляє інтерес, виділеною молекулою нуклеїнової кислоти, що містить послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу «цинкові пальці» або послідовність ізольованого білка, яка кодує нуклеазу «цинкові пальці», де нуклеаза «цинкові пальці» розпізнає послідовність нуклеїнової кислоти, яка фланкує нативний ген, що представляє інтерес, і нативний ген, що представляє інтерес, специфічно вирізається. Потім регенерують цілу рослину. В альтернативному варіанті здійснення вирізування ендогенного гену може здійснюватися схрещуванням рослини, що експресує нуклеазу «цинкові пальці», з рослиною-мішенню.
КОРОТКИЙ ОПИС ФІГУР
Фіг. 1 включає карту плазміди ррАБЗ5380.
Фіг. 2 включає карту плазміди ррА55381.
Фіг. За являє собою схематичну діаграму і рестрикційну карту вставки Т-ДНК. Фіг. ЗБ
Зо включає декілька панелей, що зображають аналіз Саузерн-блотинг То, використаний для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні РТО з плазміди ррАБ5380 згідно з варіантом здійснення винаходу. Саузерн-блотинг То зображає ферменти рестрикції М'еї ї Мвії, що використовуються для розщеплення «подій ррА55380», що показують інтактні вставки Т-
ДНК при спільній гібридизації 5И5 і РАТ.
Фіг. 4А являє собою схематичну діаграму і рестрикційну карту вставки Т-ДНК. Фіг. 4р включає декілька панелей, що зображають Саузерн-блотинг То, використаний для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні РТО з плазміди рОрА5Б5381 згідно з варіантом здійснення винаходу. Саузерн-блотинг ТО зображає ферменти рестрикції М'єЇ і МБ5іЇ, що використовуються для розщеплення «подій» ррАБ5ЬЗ381, що показують інтактні вставки Т-ДНК при гібридизації НрінІ.
Фіг. 5 включає Саузерн-блотинг вибраної групи «подій», які відповідають більш великому зразку згідно з варіантом здійснення винаходу. Вказані зразки вибирали для ілюстрації вирізаного фрагмента (тобто більш короткого молекулярного фрагмента), невирізаного фрагмента (тобто фрагмента з більш високою молекулярною вагою), і химерних «подій», які містили вирізані і невирізані фрагменти. Крім того, включали контролі геномної ДНК дикого типу і 100 пг плазміди ррА55Ь380. Результати корелювали з результатами експресії 505. «Події», які не давали позитивної реакції при гістохімічному фарбуванні на 55, не містили повнорозмірної, інтактної касети експресії РТО 505.
Фі. б включає зображення агарозного гелю, що містить зразки РеОЄ-ампліфікованих фрагментів геномної ДНК, використаних в експериментах Саузерн-блотингу згідно з варіантом здійснення винаходу. Вказані амплікони ПЛР ілюструють вирізаний фрагмент (тобто фрагмент з меншою молекулярною вагою), невирізаний фрагмент (тобто фрагмент з великою молекулярною вагою), і химерні «події», які містили вирізаний і невирізаний фрагменти. Крім того, включені контролі диких рослин То; більш велику касету експресії інтактного РТО 505 ампліфікували у вказаних реакціях. Негативні контролі також включені в тих випадках, коли для реакцій ПЛР використовували геномну ДНК дикого типу і не використовували ДНК (Нго).
Результати корелювали з результатами експресії (305 і з результатами Саузерн-блотингу.
Фіг. 7а і 765 включають аналіз вирівнювання послідовності смуги 2,4 т.н., що свідчить про делеції касети експресії ЗОЗ згідно з варіантом здійснення винаходу. Послідовність, виділена бо напівжирним шрифтом, показує промотор актину АїЇ і елементи гену МАК. Сайти зв'язування
ССР виділені підкресленням і курсивом. Хоч декілька ампліконів отримували і секвенували на подію, тільки один амплікон вирівнювали в фігурах.
Фіг. 8 включає аналіз ПЛР нащадків Р» «інтактних» гібридів Р: згідно з варіантом здійснення винаходу.
Фіг. 9 включає Саузерн-блотинг нащадків Е2 «інтактних» гібридів ЕР: згідно з варіантом здійснення винаходу.
Фіг. 10 включає аналіз ПЛР нащадків Ро «вирізаних» гібридів Рі згідно з варіантом здійснення винаходу.
Фіг. 11 включає аналіз Саузерн-блотинг нащадків ЕР «вирізаних» гібридів Еі згідно з варіантом здійснення винаходу.
Фіг. 12 включає аналіз ПЛР нащадків ЕР «химерних» гібридів Рі згідно з варіантом здійснення винаходу.
Фіг. 13 включає аналіз Саузерн-блотинг нащадків Е2 «химерних» гібридів РЕ згідно з варіантом здійснення винаходу.
СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
Послідовності нуклеїнової кислоти, перераховані в прикладеному списку послідовностей, представлені з використанням стандартних буквених скорочень нуклеотидних основ. Показаний тільки один ланцюг кожної послідовності нуклеїнової кислоти, але комплементарний ланцюг зрозумілий, оскільки він включений за допомогою посилання на представлений ланцюг. У прикладеному списку послідовностей:
ЗЕО ІЮО МО: 1 показує сайт зв'язування ЕМ СС.
ЗЕО ІЮО МО: 2 показує послідовність гену нуклеази «цинкові пальці» ССК5.
ЗЕО ІЮ МО: З показує праймер ТОРАТЗ5.
ЗЕО ІЮ МО: 4 показує праймер ТОРАТА.
ЗЕО ІЮ МО: 5 показує праймер ТОРАТЕО.
ЗЕО ІО МО: 6 показує праймер ТОРАЇ 5.
ЗЕО ІЮ МО: 7 показує праймер ТОРАГА.
ЗЕО ІЮ МО: 8 показує праймер ТОРАГ ГЕО.
ЗЕО ІЮ МО: 9 показує праймер НРТ25.
Зо ЗЕО ІЮ МО: 10 показує праймер НР ТА.
ЗЕО ІЮО МО: 11 показує праймер НРТЕО.
ЗЕО ІЮ МО: 12 показує праймер бок! ОРІ Р.
ЗЕО ІЮ МО: 13 показує праймер бок! ОРІ К.
ЗЕО ІЮО МО: 14 показує праймер ВУ2АСТ895.
ЗЕО ІЮ МО: 15 показує праймер ВУ2АСТВ9А.
ЗЕО ІЮ МО: 16 показує прямий праймер ПЛР для аналізу ПЛР РТИ.
ЗЕО ІЮ МО: 17 показує зворотний праймер ПЛР для аналізу ПЛР РТО.
ЗЕО ІЮ МО: 18 показує праймер ВХАСТЕО.
СПОСІБ(И) ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ
Розкривається спосіб вирізання генів зі специфічної рослинної тканини в генетично модифікованих організмах. У деяких варіантах здійснення використовують одну або більше ЕМ (нуклеаза «цинкові пальці») для видалення трансгенів зі специфічної рослинної тканини як засіб зменшення потоку генів в не-ЗМ культури. У деяких варіантах здійснення трансген, що видаляється, являє собою касету гену селектованого маркера. У певних варіантах здійснення специфічна рослинна тканина являє собою пилок.
У деяких варіантах здійснення одна або більше 2ЕМ можуть бути функціонально зв'язані з різними тканиноспецифічними промоторами. У вказаних і в інших варіантах здійснення одна 2ЕМ з однієї або більше 2ЕМ, функціонально зв'язана з тканиноспецифічним промотором, може бути трансформована в одну лінію батьківської рослини, і іншої 2ЕМ з однієї або більше ЕМ, функціонально зв'язану з іншим тканиноспецифічним промотором, може бути трансформована у другу лінію батьківської рослини. Схрещування батьківських ліній, що містять кожну з однієї або більше 2ЕМ, може дати лінію Е:, яка містить функціональну 2ЕМ, яка розщеплює ДНК в послідовності розпізнавання. Послідовності розпізнавання можуть фланкувати трансгени в ДНК рослини.
Вирізання тканиноспецифічного гену може бути досягнуте шляхом функціонального зв'язування промоторів, специфічних для тканин рослини, з 2ЕМ. У деяких варіантах здійснення функціональне зв'язування тканиноспецифічного промотору з однією або більше 2ЕМ приводить до тканиноспецифічної експресії однієї або більше 2ЕМ, і в зв'язку з цим до вирізання 2ЕМ, селектованих маркерів, і/або будь-яких генів або послідовностей нуклеїнової кислоти, бо розташованих між послідовностями розпізнавання в специфічній тканині.
У конкретних варіантах здійснення одна або більше 2ЕМ експресуються в одній і тій же рослині. ЕМ можуть бути функціонально зв'язані з промоторами, які запускають експресію ЕМ під час більш пізніх стадій розвитку рослини. У вказаних і в інших варіантах здійснення одна або більше функціональних 2ЕМ можуть розщеплювати специфічні послідовності розпізнавання, які фланкують один або більше трансген(и), видаляючи тим самим один або більше трансгенів з тканини рослини під час більш пізніх стадій розвитку рослини.
СКОРОЧЕННЯ
СМ - генетично модифікований
РТ - одиниця транскрипції рослини 4 - цинковий палець
ЕМ - нуклеаза «цинкові пальці»
ЕР - білок «цинкові пальці»
ТЕРМІНИ
Експресія гену. Процес, за допомогою якого кодована інформація одиниці транскрипції нуклеїнової кислоти (включаючи, наприклад, геномну ДНК або кДНК) перетворюється в функціональну, нефункціональну або структурну частину клітини, часто включає в себе синтез білка. Експресія гену може знаходитись під впливом зовнішніх сигналів; наприклад, вплив на клітину, тканину або організм агента, який збільшує або зменшує експресію гену. Експресія гену також може регулюватися всюди в каскаді реакцій від ДНК до РНК і до білка. Регуляція експресії гену відбувається, наприклад, за допомогою контролів, що впливають на транскрипцію, трансляцію, транспорт і процесинг РНК, деградацію допоміжних молекул, таких як мРНК, або за допомогою активації, інактивації, компартменталізації або деградації специфічних білкових молекул, після того, як вони були зроблені, або за допомогою їх комбінацій. Експресію гену можна розрахувати з розрахунку рівня РНК або рівня білка будь-яким методом, відомим в даній галузі техніки, включаючи, але без обмеження, нозерн-блотинг, ЗТ-ПЛР, вестерн-блотинг, або тест(и) визначення активності білка іп міїго, іп 5йи або іп мімо.
Гібридизація. Олігонуклеотиди і їх аналоги гібридизуються шляхом утворення водневих зв'язків, які можуть бути водневими зв'язками по моделі Уотсона-Крика, хугстинівськими або зворотними хугстинівськими, між комплементарними основами. Загалом, молекули нуклеїнової
Зо кислоти складаються з азотистих основ, які являють собою піримідини (цитозин (С), урацил (М), і тимін «Т)) або пурини (аденін (А) і гуанін (С)). Вказані азотисті основи утворюють водневі зв'язки між піримідином і пурином, і зв'язування піримідину з пурином позначається як «спаровування основ». Більш детально, А буде утворювати водневий зв'язок з Т або у, і з буде зв'язуватися з С. «Комплементарний» стосується спаровування основ, яке відбувається між двома окремими послідовностями нуклеїнової кислоти або двома окремими областями тієї ж самої послідовності нуклеїнової кислоти. «Той, що специфічно гібридизується» і «комплементарний» є термінами, які вказують достатній ступінь комплементарності, таким чином, що відбувається стабільне і специфічне зв'язування між олігомерною сполукою і ДНК- або РНК-мішенню.
Олігонуклеотид не повинен бути на 10095 комплементарний своїй послідовності-мішені для специфічної гібридизації. Олігонуклеотид специфічно гібридизиується, якщо зв'язування олігонуклеотиду з молекулою-мішенню ДНК або РНК перешкоджає нормальному функціонуванню мішені ДНК або РНК, і є достатній ступінь комплементарності, щоб уникнути неспецифічного зв'язування олігонуклеотиду з нецільовими послідовностями в умовах, коли бажане специфічне зв'язування, наприклад, в фізіологічних умовах у разі тестів або систем іп мімо. Таке зв'язування називають специфічною гібридизацєю.
Умови гібридизації, що дають в результаті різні ступені жорсткості, будуть варіювати в залежності від природи вибраного методу гібридизації і складу і довжини послідовностей нуклеїнової кислоти, що гібридизуються. Загалом, температура гібридизації і іонна сила (особливо концентрація Ма" і/або Ма) буфера гібридизації будуть забезпечувати суворість гібридизації, хоч час відмивання також впливає на суворість. Розрахунки, що стосуються умов гібридизації, необхідних для досягнення певних ступенів суворості, обговорюються в Затргоок еї а. (ед.), МоіІесшаг Сіопіпд: А І абогаїгу Мапаиаї, 2па ед., мої. 1-3, Соїд 5ргіпд Нагбог І арогайогу
Рге55, Соїа 5ргіпуд Нагрог, Мем/ МогК, 1989, сп5. 9 і 11.
У контексті даного розкриття «Суворі умови» охоплюють умови, в яких гібридизація буде відбуватися, якщо є менше, ніж 2595 невідповідності між молекулою гібридизації і послідовністю- мішенню. «Суворі умови» можна додатково описати в певних рівнях суворості. Таким чином, умови «помірної суворості», що використовуються в описі, являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 2595 невідповідності не будуть гібридизуватися; умови «середньої бо суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 1595 невідповідності не будуть гібридизуватися, і умови «високої суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 1095 невідповідності не будуть гібридизуватися. Умови «дуже високої суворості» являють собою умови, в яких молекули з більш ніж 695 невідповідності не будуть гібридизуватися. У конкретних варіантах здійснення, суворі умови являють собою гібридизацію при 652С, з подальшим послідовним відмиванням при 652 0,1х55С/0,195 505 протягом 40 хвилин.
Ізольований. «Ізольований» біологічний компонент (такий як нуклеїнова кислота або білок) по суті відділений, зроблений окремо від або очищений від інших біологічних компонентів клітини організму, в якій компонент присутній природним чином, тобто від інших хромосомних і екстра-хромосомних ДНК і РНК і білків. Молекули нуклеїнової кислоти і білки, які «ізолювали», включають молекули нуклеїнової кислоти і білки, очищені стандартними методами очищення.
Термін також охоплює нуклеїнові кислоти і білки, отримані за допомогою рекомбінантної експресії в клітині-хазяїни, а також хімічно синтезовані молекули нуклеїнової кислоти, білки і пептиди.
Молекула нуклеїнової кислоти. Полімерна форма нуклеотидів, яка може включати смисловий і антисмисловий ланцюг РНК, кДНК ії геномної ДНК, і їх синтетичні форми і змішані полімери. Термін «нуклеотид» означає рибонуклеотид, дезоксинуклеотид або модифіковану форму нуклеотидів будь-якого типу. Термін «молекула нуклеїнової кислоти», що використовується в даному винаході, є синонімом термінів «нуклеїнова кислота» і «полінуклеотид». Термін також включає одноланцюжкову і дволанцюжкову форми ДНК.
Молекула нуклеїнової кислоти може включати природні або модифіковані нуклеотиди або ті й інші нуклеотиди, зв'язані один з одним природними і/або неприродними нуклеотидними зв'язками.
Молекули нуклеїнової кислоти можуть бути модифіковані хімічно або біохімічно, або вони можуть містити неприродні або дериватизовані нуклеотидні основи, як може бути легко визначено фахівцем. Такі модифікації включають, наприклад, мітки, метилування, заміну одного або декількох природних нуклеотидів їх аналогами, міжнуклеотидні модифікації, такі як введення незаряджених зв'язків (наприклад, метилфосфонатів, фосфотриефірів, фосфорамідитів, карбаматів і т.п.), заряджених зв'язків (наприклад, фосфортіоатів, фосфордитіоатів і т.п.), бокових груп (наприклад, поліпептидів), інтеркалюючих агентів
Зо (наприклад, акридину, псоралену і т.п.), хелатоутворювальних агентів, алкілуючих агентів і модифікованих зв'язків (наприклад, «-аномерних нуклеїнових кислот і т.п.). Термін «молекула нуклеїнової кислоти» також охоплює будь-які топологічні конформації, включаючи одноланцюжкову, дволанцюжкову, частково дуплексні і триплексні конформації, а також конформації типу «шпильки», кільцеві конформації і конформації типу «висячий замок».
Функціонально зв'язаний. Перша послідовність нуклеїнової кислоти функціонально зв'язана з другою послідовністю нуклеїнової кислоти, якщо перша послідовність нуклеїнової кислоти знаходиться в функціональній залежності з другою послідовністю нуклеїнової кислоти.
Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. При рекомбінантному отриманні функціонально зв'язані послідовності нуклеїнової кислоти звичайно межують одна з одною і, при необхідності з'єднують дві області, що кодують білок, в одній і тій же рамці зчитування. Однак елементи не обов'язково повинні межувати, щоб бути функціонально зв'язаними.
Промотор. Область ДНК, яка звичайно розташовується в 3'-5' напрямі (відносно 5'-області гену), яка необхідна для транскрипції. Промотори забезпечують відповідну активацію або репресію гену, який вони контролюють. Промотор містить специфічні послідовності, які розпізнаються факторами транскрипції. Вказані фактори зв'язуються з промоторними послідовностями ДНК і приводять до рекрутування РНК-полімерази, ферменту, який синтезує
РНК з кодуючої області гену. У деяких варіантах здійснення тканиноспецифічні промотори використовують в способах винаходу, наприклад, промотор, специфічний для пилка.
Тканиноспецифічний промотор являє собою послідовність ДНК, яка забезпечує більш високий рівень транскрипції асоційованого гену в тканині, для якої промотор є специфічним, в порівнянні з іншими тканинами організму. Приклади тканиноспецифічних промоторів включають тапетум- специфічні промотори; промотори, специфічні для пильника; промотори, специфічні для пилка (див., наприклад, патент США Мо 7141424, і міжнародну публікацію РСТ Мо МО 99/042587); промотори, специфічні для сім'язародка; (див., наприклад, патентну заявку США Мо 2001/047525
АЇ); промотори, специфічні для плодів (див., наприклад, патенти США Мо 4943674 і Мо 5753475); і промотори, специфічні для насіння (див., наприклад, патенти США Мо 5420034, і Мо 5608152). У деяких варіантах здійснення промотори, специфічні для стадії розвитку, використовують в 60 способах винаходу, наприклад, промотор, активний на пізній стадії розвитку.
Трансформований. Вірус або вектор «трансформує» або «трансдукує» клітину, якщо він переносить молекули нуклеїнової кислоти в клітину. Клітина «трансформується» молекулою нуклеїнової кислоти, трансдукованою в клітину, якщо молекула нуклеїнової кислоти стабільно реплікується клітиною, за допомогою включення молекули нуклеїнової кислоти в клітинний геном або за допомогою епісомальної реплікації. Застосовуваний в описі термін «трансформація» охоплює всі технології, за допомогою яких молекула нуклеїнової кислоти може бути введена в таку клітину. Приклади включають, але без обмеження трансфекцію вірусними векторами, трансформацію плазмідними векторами, електропорацію (Еготт еї аї. (1986) Маїшге 319:791-3), ліпофекцію (ЕРеідпег еї а. (1987) Ргос. Маї!. Асад. з5сі. ОБА 84:7413-7), мікроін'єкцію (Миеїег еї аїІ. (1978) СеїІ 15:579-85), Адгорасієгіит-теадіаїва ігапвтег (Егаїєу еї аї. (1983) Ргос. Май). Асад. бсі ОБА 80:4803-7) пряме захоплення ДНК і бомбардування мікрочастинками (Кіеїп еї аї. (1987) Майшге 327:70).
Трансген. Екзогенна послідовність нуклеїнової кислоти. В одному прикладі трансген являє собою нуклеотидну послідовність гену (наприклад, гену стійкості до гербіциду), гену, що кодує промислово або фармацевтично застосовну сполуку, або гену, що кодує бажану сільськогосподарську ознаку. У ще одному прикладі трансген являє собою антисмислову послідовність нуклеїнової кислоти, де експресія антисмислової послідовності нуклеїнової кислоти інгібує експресію послідовності-мішені нуклеїнової кислоти. Трансген може містити регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з трансгеном (наприклад, промотор).
Вектор. Молекула нуклеїнової кислоти, яку вводять в клітину, отримуючи таким чином трансформовану клітину. Вектор може включати в себе послідовності нуклеїнової кислоти, які дозволяють йому реплікуватися в клітині-хазяїні, наприклад, точка початку реплікації. Приклади включають, але без обмеження? плазміду, косміду, бактеріофаг або вірус, який переносить екзогенну ДНК в клітину. Вектор також може включати один або більше генів, антисмислові молекули і/або гени селектованого маркера, і інші генетичні елементи, відомі в даній галузі техніки. Вектор може трансдукувати, трансформувати або інфікувати клітину, при цьому примушуючи клітину експресувати молекули нуклеїнової кислоти і/або білки, що кодуються вектором. Вектор необов'язково включає матеріали, що сприяють досягненню проникнення молекули нуклеїнової кислоти в клітину (наприклад, ліпосома, кодування білка і т.д.).
Зо Опосередковуване 2п-пальцевою нуклеазою вирізання трансгенів з рослин
Розкриваються способи отримання рослини, що має знижений витік трансгенів, а також рослини, отримані такими способами, і рослинні матеріали, зроблені з них, наприклад, насіння.
В одному варіанті здійснення спосіб включає взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше нуклеазу (нуклеази) «цинкові пальці» (2ЕМ) функціонально зв'язану з одним або більше тканиноспецифічним промотором (промоторами) (наприклад, промотор, специфічний для пилка). Експресія вказаного вектора приводить до продукції 2ЕМ в певній тканині, в якій її функціонально зв'язаний промотор є активним. 2ЕМ може бути розроблена або сконструйована для розпізнавання послідовності, що розщеплюється, яка Ффланкує послідовність нуклеїнової кислоти, вирізання якої є бажаним. Продукція 2ЕМ, в такому випадку, в певній тканині, в якій промотор є активним, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними 2ЕМ, утворюючи при цьому послідовність нуклеїнової кислоти, яка містить сполуку розщеплення, яка не містить залишкової послідовності розпізнавання.
В іншому варіанті здійснення спосіб включає: взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше 2ЕМ функціонально зв'язану з тканиноспецифічним промотором; ген, що представляє інтерес; необов'язково один або більше регуляторний елемент(и), який може бути функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес; і одну або більше послідовностей, що розщеплюються, розпізнаваних 2ЕМ, що фланкують ген, що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и). Експресія вказаного вектора приводить до продукції 2ЕМ в певній тканині, де її функціонально зв'язаний промотор є активним.
Продукція 2ЕМ, в такому випадку, в певній тканині, де промотор є активним, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними 2ЕМ, яка включає в себе ген, що представляє інтерес і, необов'язково, один або більше регуляторний елемент(и).
В інших варіантах здійснення спосіб включає взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше нуклеаз цинкові пальці (2ЕМ), функціонально зв'язаних з одним або більше промотором (промоторами), активну в певний період розвитку рослини (наприклад, промотор, який запускає експресію на відносно пізній стадії розвитку). Експресія вказаного вектора приводить до продукції 2ЕМ в певний період розвитку, під час якого її функціонально 60 зв'язаний промотор є активним. 2ЕМ можуть бути розроблені або сконструйовані для розпізнавання послідовності, що розщеплюється, яка фланкує послідовність нуклеїнової кислоти, вирізання якої бажане. Продукція 2ЕМ на стадії розвитку, під час якої промотор активний, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними 2ЕМ.
В інших варіантах здійснення спосіб включає: взаємодію рослини з вектором, де вектор містить одну або більше 2ЕМ, функціонально зв'язану з промотором, активним в певний період розвитку рослини; ген, що представляє інтерес; необов'язково один або більше регуляторний елемент(и), який може бути функціонально зв'язаний з геном, що представляє інтерес; і одну або більше послідовностей, що розщеплюються, розпізнаваних ЕМ, що фланкують ген, що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и). Експресія вказаного вектора приводить до продукції 2ЕМ в певний період розвитку, під час якого її функціонально зв'язаний промотор активний. Продукція ЕМ в певний період розвитку, під час якого активний його функціонально зв'язаний промотор, приводить до вирізання послідовності нуклеїнової кислоти між послідовностями, що розщеплюються, розпізнаваними 2ЕМ, яка включає в себе ген, що представляє інтерес, і один або більше регуляторний елемент(и).
Нуклеази 2ЕМ
У конкретних варіантах здійснення 2ЕМ експресуються з молекул нуклеїнової кислоти в трансформованих рослинах, щоб управляти вирізанням послідовностей нуклеїнової кислоти в трансформованих рослинах. Можуть бути використані 2ЕМ, які впливають на послідовність розпізнавання, сконструйовану для фланкування певної послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, трансген, ген, що представляє інтерес, або ген селектованого маркера) або можуть бути розроблені 2ЕМ, які впливають на послідовність нуклеїнової кислоти, що зустрічається в природі, яка фланкує певну послідовність нуклеїнової кислоти, яку треба вирізати. Виняткова гнучкість і специфічність 2ЕМ-системи забезпечує рівень контролю, недосяжний раніше за допомогою відомих раніше стратегій вирізання гену, опосередковуваних рекомбіназами.
Специфічності розпізнавання 2ЕМ можна легко регулювати експериментальним шляхом. УМи еї а. (2007) СеїЇ. Мої. І бе 5сі. 64:2933-44. Рандомізація кодонів залишків, що відповідають за розпізнавання цинкових пальців, забезпечує відбір нових пальців, які мають високу афінність до довільно вибраних послідовностей ДНК. Крім того, цинкові пальці є природними ДНК-
Зо зв'язувальними молекулами, і показано, що сконструйовані цинкові пальці діють на задані мішені в живих клітинах. Таким чином, нуклеази на основі «цинкових пальців» можна направити на специфічні, але довільні сайти розпізнавання.
Потреба в димеризації доменів розщеплення химерних нуклеаз «цинкові пальці» забезпечує високий рівень специфічності до послідовності. Оскільки кожний набір з трьох пальців зв'язується з дев'ятьма послідовними парами основ, дві химерні нуклеази фактично вимагають мішені з 18 п.н., якщо кожний домен цинковий палець має ідеальну специфічність.
Передбачається, що встановлена послідовність такої довжини є унікальною в межах одного геному (приймаючи приблизно 109 п.о.). Вірікома еї а. (2001) Мої. Сеїї. ВіоІ. 21(1):289-97; Ми єї а!. (2007), вище. Крім того, додаткові пальці забезпечують підвищену специфічність, Веегії єї аї. (1998) Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА 95: 14628-33; Кіт апа Рабро (1998) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 95:2812-7; Пи єї аї. (1997) Ргос, Маї!. Асай, сі. ОБА 94:5525-30, так що число цинкових пальців в кожному ДНК-зв'язувальному домені може бути збільшене для забезпечення додаткової специфічності. Наприклад, специфічність може бути додатково збільшена при використанні пари 4-пальцевих 2ЕМ, які розпізнають послідовність з 24 п.о. Огпом еї а. (2005) Майшге 435:646- 51.
Ключові амінокислоти 2ЕМ, в положеннях -1, 2, З і 6 відносно початку а-спіралі, роблять найбільший внесок в специфічні взаємодії мотивів «цинкових пальців». Раміеїспй апа Рабо (1991) Зсівєпсе 252:809-17; ЗПпі апа Вегу (1995) Спет. Віої. 2:83-9. Вказані амінокислоти можуть бути змінені, при збереженні амінокислот, що залишилися, як консенсусний основний ланцюг, для утворення 2ЕР»: з різною і/або новою специфічністю до послідовностей. Див., наприклад,
Споо апа Кішд (1994) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 91: 11163-7; Оевіапаїіз апа Вегу (1992) Ргос. Маї!
Асад. сі. ОБА 89:7345-9; Юевзіапаійє апа Вега (1993) Ргос. Май. Асай. сі. ОБА 90:2256-60;
Стеізвтап апа Рабро (1997) Зсієпсе 275:657-61; Ізаіап еї аі. (1998) Віоспетівігу 37: 12026-33;
Уатієезоп еї а)ї. (1994) Віоспетівігу 33:5689-95; Вебаг апа Рабо (1994) бсіепсе 263: 671-3; Зедаї еїаї. (1999) Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА 96:2758-63; УМоїге еї а. (1999) 9. Мої. Віої!. 285: 1917-34; Ми еї а). (1995) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 92:344-8. Крім того, можуть бути сконструйовані щонайменше дві З-пальцеві 2ЕМ з різною специфічністю послідовностей, так що вони діють спільно при проведенні розщеплення. Зтіїй еї а. (2000), вище.
Підходи до дизайну і відбору при створенні ЕМ винаходу можуть починатися з визначення бо одного або більше прийнятних мотивів 2Е для розпізнавання специфічної послідовності нуклеїнової кислоти. Альтернативно 2ЕМ, яка розпізнає специфічну послідовність нуклеїнової кислоти, може бути використана для побудови молекули нуклеїнової кислоти, що містить специфічну послідовність нуклеїнової кислоти (наприклад, в якій специфічна послідовність нуклеїнової кислоти фланкує ген, що представляє інтерес) і інші елементи з потреби.
Розглядалися дизайн і різні підходи при відборі ЕР, включаючи метод фагового дисплею. Мапі еї аІ. (2005), вище; Юигаї еї аІ. (2005) Мисівїс Асід5 Ке5. 33:5978-90; Іваіап еї аї. (2001) Маї.
Віотесппої. 19:656-60; Капаамеїои еї аї. (2005) Маї. Віотесппої. 23:686-87; Рабо вї а). (2001) Аппи.
АВем. Віоспет. 70:313-40; Зедаї! єї аї. (2003) Віоспетівігу 42:2137-48. Будь-який дизайн і/або метод відбору, відомий в даній галузі може бути використаний для отримання 2ЕМ для застосування у варіантах здійснення даного винаходу. Наприклад, клітинні стратегії відбору з використанням бактерійних одногібридних і двогібридних систем можуть бути використані для отримання високоспецифічних 2ЕР. Юигаї еї аІ. (2006) Сотр. Спет. Нідпй ТПгоцдприї Зсгееп. 9:301-11; Ний еї аї. (2003) гос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА 100: 12271-6; дото еї аї. (2000) Ргос. Маї!).
Асад. осі. ОБА 97:7382-7. Високоспецифічні 2ЕР також можуть бути отримані прямим перетасовуванням доменів і клітинною селекцією, яка пропонує загальний підхід до оптимізації багатопальцевих 2ЕР. Нитгі еї аї. (2003), вище.
Множина даних, основаних на дизайні і методологіях фагового дисплею, доступні відносно модулів 2Е, які специфічно розпізнають триплети 5'(ЗММ З3'ї 5 АММ 3", ії в меншій мірі, відомі переваги мотиву 2Е відносно триплетів 5' СММ 3'ї 5' ТММ 3". Див., наприклад, Юигаї єї аї. (2005), вище; Огеїег еї аїЇ. (2001) 9. Віої. Спет. 276:29466-78; Огеієг (2005) у Віої. Спет. 280:35588-97;
Огеїег єї а). (2000) 9. Мої. Віої. 303:489-502; Пи еї а. (2002) 9. Вісі. Спет. 277:3850-6. В даний час доступні два пакети програм по дизайну 2Е на основі Умер-технології (наприклад, на 7іпсіїпдепоо!5.ог9у). Вищевикладене представляє практично всі гени, що кодуються в геномі, сприйнятливі до 2ЕМ-опосередкованого таргетування генів. Каїажда апа Коптіуата (2009) СПпетбріоспет. 10(8): 1279-88.
У конкретних варіантах здійснення використовують 2ЕМ, яка зв'язується з корецептором НІМ
ССР. Реге еї аї. (2008) Маї. Віоїесппо!ї. 26:808-16. Вказану 7ЕМ називають "ССК5 2ЕМ". У конкретних варіантах здійснення кодуюча область ССК5 7ЕМ включає: послідовність орадие-2 з внутрішньоядерною локалізацією (Масдааюпі еї а. (1989) Мисівеїс Асій5 Кев5. 17(18):7532); 1
Зо домен зв'язування цинкових пальців гіб2уЇ, домен нуклеази РОКІ (І оопеу еї аї. (1989) Сепе 80: 193-208); статтерну послідовність Т2А (Майшіоп еї а. (1996) 9. Міго!. 70:8124-7), отриману з вірусу
Тпезоа аззідпа; другу послідовність орадие-2 з внутрішньоядерною локалізацією, домен зв'язування цинкових пальців 168ЕА мЕ; і другий домен нуклеази ЕокКІ.
Молекули нуклеїнової кислоти
У деяких варіантах здійснення спосіб включає схрещування першої рослини, що містить один або більше генів, що представляють інтерес (які можуть надавати бажану властивість або фенотип), а саме два або більш генів, що представляють інтерес, з другою рослиною. Друга рослина також може мати один або більше генів, що представляють інтерес. Перша рослина може містити вектор, де вектор включає промотор, функціонально зв'язаний з одним або більш геном (генами), що представляє інтерес. Промотор може бути конститутивним або індуцибельним промотором. Послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує ген(и), що представляє інтерес, може бути фланкована сайтами розпізнавання 2ЕМ. Необов'язково, промотор, функціонально зв'язаних генів (генами), що представляє інтерес, і будь-які додаткові послідовності нуклеїнової кислоти (наприклад, регуляторні послідовності), також можуть бути фланковані сайтами розпізнавання 2ЕМ. Друга рослина може містити інший вектор, який може включати в себе тканиноспецифічний промотор або специфічний для стадії розвитку промотор, функціонально зв'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує 2ЕМ. Вектори можуть бути стабільно інтегровані в геноми обох рослин. Після схрещування першої і другої рослин, тканиноспецифічний промотор або специфічний для стадії розвитку промотор специфічно запускає експресію 2ЕМ в потомстві такого схрещування, що отримується. Експресія 2ЕМ в цьому потомстві приводить до вирізання послідовностей нуклеїнової кислоти, фланкованих сайтами розпізнавання ЕМ, тим самим ослабляючи або виключаючи ген, що представляє інтерес, і необов'язково додаткові послідовності (такі як гени селектованого маркера) в специфічних тканинах і/або стадіях розвитку потомства. У деяких варіантах здійснення сайти розпізнавання 2ЕМ можуть бути додатково фланковані гомологічними послідовностями нуклеїнової кислоти, щоб надалі сприяти гомологічній рекомбінації ДНК.
Ген, що представляє інтерес, звичайно буде функціонально зв'язаний з одним або більше промоторами рослини, що запускають експресію гену в кількості, достатній, щоб забезпечити бажану властивість або фенотип. Промотори, що підходять для цього і для інших застосувань, бо добре відомі в даній галузі техніки. Необмежувальні приклади, що описують такі промотори,
включають патенти США Ме 6437217 (промотор кукурудзи К581); Мо 5641876 (промотор актину рису); Мо 6426446 (промотор кукурудзи К5324); 6429362 (промотор кукурудзи РЕ-1); 6232526 (промотор кукурудзи АЗ); 6177611 (конститутивні промотори кукурудзи); 5322938, 5352605, 5359142 і 5530196 (промотор 355); 6433252 (промотор олеозину ІЗ кукурудзи); 6429357 (промотор актину 2 рису, і інтрон актину 2 рису); 5837848 (промотор, специфічний для коріння); 6294714 (промотори, що індукуються світлом); 6140078 (промотори, що індукуються солями); 6252138 (промотори, що індукуються патогеном); 6175060 (промотори, що індукуються дефіцитом фосфору); 6388170 (двонаправлені промотори); 6635806 (промотор гамма-коїксину); і патентну заявку США, серійну Мо 09/757089 (промотор альдолази хлоропластів кукурудзи).
Додаткові промотори включають промотор нопалінсинтази (МОБ) (Ебегї еї а. (1987) Ргос. Май.
Асад. Зсі. ОБА 84(16):5745-93; промотор октопінсинтази (ОС5) (які містяться в пухлин- індукуючих плазмідах Адгобасіегішт Ішптегтасіеп5); промотори колімовірусу, такі як промотор вірусу мозаїки цвітної капусти (Саму) 195 (Гаумоп еї аї. (1987) Ріапі Мої. Віої. 9:315-24); промотор Саму 355 (Оаеї! еї аї. (1985) Маїшиге 313:810-2; промотор вірусу мозаїки ранника 355 (У/аКег єї аї. (1987) Ргос. Маї). Асад. 5сі, ОБА 84(19):6624-8); промотор сахарозосинтази (уапд апа Виззеї! (1990) Ргос. Маї!. Асад. сі. ОБА 87:4144-8); промотор комплексу гену К (Спапайег еї а!. (1989) Ріапі Сеї! 1: 1175-83); промотор гену, що кодує білок, що зв'язується з хлорофілом а/р;
Самм355 (патенти США Ме 5322938, Мо 5352605, Мо 5359142 і Мо 5530196); ЕММУ355 (патенти
США Мо 6051753 і Мо 5378619); промотор РС15М (патент США Мо 5850019); промотор 5СРІ1 (патент США Мо 6677503); і промотори АОКИШИ.по5 (номер доступу СепВапк М00087; ОерісКег еї а!. (1982) У. Мої. Аррі. Сепеї. 1: 561-73; Вемап єї аї. (1983) Маїштге 304: 184-7) і т.п.
Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, включають послідовності, що кодують транзитні пептиди.
Наприклад, показано, що включення прийнятного транзитного пептиду хлоропласта, такого як
А. ІШаійапа ЕРБРБ СТР (Ківєе еї аї. (1987) Мої. Сеп. Сепеї. 210:437-42), і Решпіа пубгіча ЕРБРБ
СТР (аепПа-Сіорра еї аї. (1986) Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 83:6873-7) направляє гетерологічні послідовності білків ЕРБРЗ в хлоропласти в трансгенних рослинах. Дикамба-монооксигеназа (ОМО) також може бути націлена на хлоропласти, як описано в міжнародній РСТ публікації Мо
МО 2008/105890.
Зо Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, також включають 5-ШТК, розташовану між промоторною послідовністю і кодуючою послідовністю, яка працює як лідерна послідовність при трансляції.
Лідерна послідовність трансляції в повністю процесованій мРНК в 3-5 напрямку від стартової послідовності трансляції. Лідерна послідовність трансляції може впливати на процесинг первинного транскрипту мРНК, на стабільність мРНК, і/або ефективність трансляції. Приклади лідерних послідовностей трансляції включають лідерів білків теплового шоку кукурудзи і петунії (патент США Мо 5362865), лідери білків оболонки рослинних вірусів, лідери рослинного ферменту гибрівсо, і інші. Див., наприклад, Тигпег апа Ровіег (1995) МоїІесшіаг Віоїтесп. 3(3):225-36.
Необмежувальні приклади 5 ТЕ включають отН5р (патент США Мо 5659122); РпОпак (патент США Мо 5362865); ААпії; ТЕМ (Сагтіпдаїоп апа Егеєй (1990) 9. МігоІ. 64: 1590-7); і
АсКШшпоз (номер доступу СепВапк м00087; і Вемап еї а. (1983) Маїиге 304:184-7).
Додаткові генетичні елементи, які необов'язково можуть бути функціонально зв'язані з геном, що представляє інтерес, також включають 3'-нетрансльовані послідовності, 3'-області термінації транскрипції або області поліаденілювання. Вони являють собою генетичні елементи, розташовані в 5-3 напрямі полінуклеотидної молекули, і включають полінуклеотиди, які забезпечують сигнал поліаденілювання, і/або інші регуляторні сигнали, здатні впливати на транскрипцію, процесинг мРНК або експресію генів. Сигнал поліаденілювання функціонує в рослинах для надання аденілатнуклеотидів до 3'-кінця попередника мРНК. Послідовність поліаденілювання може бути отримана з природного гену, з безлічі рослинних генів з генів Т-
ДНК. Необмежувальним прикладом 3'-області термінації транскрипції є 3'-область нопалінсинтази (по5 3" ЕгаІеу еї аіІ. (1983) Ргос. Маї). Асад. Зсі. ОБА 80:4803-7). Приклад застосування різних 3'-нсетрансльованих областей наводиться в Іпдеїбгестйї еї аї., (1989) Ріапі
Сеї! 1:671-80. Необмежувальні приклади сигналів полі«аденілювання включають сигнал з гену аРівит заїймит ВЬев5а2 (Ре.Аре52-Е9У; Согиг7і єї а). (1984) ЕМВО 3. 3:1671-9) і АОмш.поз (Номер доступу СепВапк ЕО1312).
Трансформація рослин
Будь-який з методів, відомих в даній галузі, для введення трансгенів в рослини може бути використаний для отримання трансформованої рослини згідно з винаходом. Передбачається, що прийнятні методи трансформації рослин включають практично будь-який метод, з 60 допомогою якого ДНК може бути введена в клітину, наприклад: з допомогою електропорації, як проілюстровано в патенті США Мо 5384253; за допомогою бомбардування мікрочастинками, як проілюстровано в патентах США МоМо 5015580, 5550318, 5538880, 6160208, 6399861, і 6403865; опосередковану Адгобрасіегішт трансформацію, як проілюстровано в патентах США МоМо 5635055, 5824877, 5591616; 5981840 і 6384301; і трансформацію протопластів, як описано в патенті США Мо 5508184 і т.д. Завдяки застосуванню технологій, таким як вказані, клітини практично будь-яких видів рослин можуть бути стабільно трансформовані, і вказані клітини можуть розвиватися в трансгенні рослини за допомогою технологій, відомих фахівцям в даній галузі. Технології, які можуть бути особливо корисні в контексті трансформації бавовни, розкриваються в патенті США МоМо 5846797, 5159135, 5004863 і 6624344; технології трансформації рослин роду Вгаззіса зокрема розкриваються, наприклад, в патенті США Мо 5750871; технології трансформації зоубеап розкриваються, наприклад, в патенті США Мо 6384301; і технології трансформації кукурудзи розкриваються, наприклад, в патенті США Мо 7060876, патенті США Мо 5591616, і в міжнародній публікації РСТ УМО 95/06722.
Після здійснення доставки екзогенної ДНК реципієнтним клітинам, наступні стадії звичайно стосуються ідентифікації трансформованих клітин для подальшого культивування і регенерації рослин. З метою збільшення здатності ідентифікувати трансформанти, може бути бажане застосування гену селектованого або скринованого маркера з вектором трансформації, що використовується для створення трансформанту. У такому випадку потенційно трансформована клітинна популяція може бути перевірена шляхом впливу на клітини селективного агента або агентів, або може бути проведений скринінг клітин відносно бажаної ознаки маркерного гену.
Клітини, які пережили вплив селективного агента, або клітини, які вважали позитивними в скринінговому тесті, можуть бути культивовані в середовищі, яке підтримує регенерацію рослин.
У деяких варіантах здійснення, будь-яке культуральне середовище, що підходить для рослинної тканини (наприклад, середовища М5 і Мб) може бути модифікована включенням інших речовин, таких як регулятори росту. Тканину можна підтримувати на основному середовищі з регуляторами росту доти, поки доступна достатня кількість тканини для початку спроб по регенерації рослини, або для подальших повторних раундів ручної селекції, доти, поки морфологія тканини підходить для регенерації (наприклад, щонайменше 2 тижні), потім
Зо переносять на середовище, що сприяє утворенню паростка. Культури переносять періодично, доти, поки не станеться достатнього формування паростків. Після того, як паростки сформуються, їх переносять на середовище, сприятливе для утворення коріння. Після формування достатньої кореневої системи рослини можуть бути пересаджені в грунт для подальшого росту і розвитку.
Для підтвердження присутності гену, що представляє інтерес (наприклад, трансгену), в регенерованих рослинах можуть бути проведені різні тести. Такі тести включають, наприклад: молекулярно-біологічні тести, такі як саузерн-блотинг і нозерн-блотинг і ПЛР; біохімічні тести, такі як визначення присутності білкового продукту, наприклад, імунологічними методами (ЕГІЗА іабо вестерн-блотинги) або за допомогою ферментативної функції; аналізи частин рослин, такі як аналізи листя і коріння; і аналіз фенотипу цілої регенерованої рослини.
Культивування і застосування трансгенних рослин
Рослина, в якій виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з даним винаходом, може мати одну або більше бажаних властивостей, наприклад, дві або більше бажаних властивостей.
Такі властивості можуть включати, наприклад: стійкість до комах і інших шкідників і хвороботворних агентів; стійкість до гербіцидів; підвищена стійкість, врожайність, або здатність до зберігання; стійкість до впливів зовнішнього середовища; фармацевтичну продукцію; виробництво промислового продукту; і поліпшені харчові якості. Бажані властивості можуть забезпечуватися генами, фланкованими послідовністю нуклеїнової кислоти, розпізнаваною 2ЕМ, експресованої в рослині, що виявляє бажані властивості, так що експресія 2ЕМ в рослині знижує або усуває передачу властивості, за допомогою обмеження гену, що лежить в його основі, іншим рослинам або подальшим поколінням рослини. Таким чином, в одному варіанті здійснення бажана властивість може бути присутньою завдяки наявності трансгену (трансгенів) в рослині, який може бути фланкований послідовностями розпізнавання 2ЕМ. У додатковому варіанті здійснення бажану властивість можна отримати за допомогою відповідної селекції, будь-яка властивість може забезпечуватися одним або більше генами, фланкованими послідовностями розпізнавання 2ЕМ.
Рослина, в якій виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, може бути будь-якою рослиною, здатною до трансформації молекулою нуклеїнової кислоти винаходу.
Відповідно, рослина може бути дводольною рослиною або однодольною рослиною. 60 Необмежувальні приклади дводольних рослин, застосовних в даних способах, включають люцерну, квасолю, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовну, огірок, баклажан, салат, диню, горох, перець, арахіс, картоплю, гарбуз, редиску, рапс, шпинат, сою, кабачок, цукровий буряк, соняшник, тютюн, томат і кавун.
Необмежувальні приклади однодольних рослин застосовних в даних способах, включають кукурудзу, цибулю, рис, сорго, пшеницю, жито, пшоно, цукрову тростину, овес, тритикалє, просо лозиноподібне і газонну траву.
Рослини, в яких виявляється вирізання нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, можна використати або культивувати будь-яким чином, там, де передача вирізаної послідовності нуклеїнової кислоти іншим рослинам є небажаною. Відповідно, ЗМ рослини, які були розроблені, іпіег аа, таким чином, що вони мають одну або більше бажаних властивостей, можуть бути трансформовані молекулами нуклеїнової кислоти згідно з винаходом, і посаджені і культивовані будь-яким методом, відомим фахівцям в даній галузі.
ПРИКЛАДИ
Нижченаведені приклади включені для ілюстрації варіантів здійснення винаходу. Фахівцям в даній галузі ясно, що методики, розкриті в Прикладах, являють собою методики, розкриті авторами винаходу для правильного функціонування винаходу на практиці. Однак фахівцям в даній галузі в світлі даного розкриття буде зрозуміло, що в конкретні варіанти здійснення, які розкриваються, можуть бути внесені численні зміни, і з отриманням такого ж або схожого результату без порушення об'єму винаходу. Більш детально, очевидно, що певні агенти, які зв'язані хімічно і фізіологічно, можуть використовуватися замість агентів, описаних тут, в той же час будуть отримані аналогічні або схожі результати. Всі такі схожі замісники і модифікації, очевидні для фахівців в даній галузі техніки, вважають, що входять в об'єм винаходу, як визначено прикладеною формулою винаходу.
Приклад !: Розробка і створення плазмід
Розробляли і створювали цільову конструкцію, що містить касету експресії цільового репортерного гену, фланковану ділянками зв'язування цинкових пальців (ррА55380), і ексцизійну конструкцію, що містить касету експресії гену нуклеази «цинкові пальці» (ррд55381).
Розробляли конструкції, якими трансформували по окремості рослини тютюну. Вирізання цільового репортерного гену здійснювали шляхом схрещування двох ліній тютюну, де
Зо функціональна нуклеаза «цинкові пальці» розпізнавала сайти зв'язування цинкових пальців, що фланкують касету цільового репортерного гену, і розщеплювала геномну ДНК. Схрещування ліній рослин, що містять конструкцію цільового репортерного гену, з лінією рослини, що містить ексцизійну конструкцію, приводило до видалення/делеції репортерного гену геному рослини.
Розробка і створення цільової конструкції ррА55380 ррАБЗ5380 (Фіг. 1) створювали у вигляді бінарного плазмідного вектора. Дана конструкція містила наступні касети експресії одиниці транскрипції рослини (РТ) і генетичні елементи: КВ7
МАК ((ділянка прикріплення до ядерного матриксу (Тпотрзхоп еї а. (1991) УМО9727207)): ССНК5Б- зв'язувальна ділянка, що повторюється 4х (Реге еї аїЇ. (2008) Маї. Віоїесппої. 26:808-16):
АїШОКРІ 3 ТК (відкрита рамка зчитування-! Адгобасієгішт іШтеїасієпв, З3'-чсетрансльована область (Ниапа еї аї. (1990) 9. Васіегіо!. 172: 1814-22)у/505 (8-О-глюкуронідаза (дейегзоп (1989)
Маїшге 342:837-83)/АШБІ10 (промотор Агабідорзі5 (пайапа убіквітин-10 (Саїйййв єї аї. (1990) У. Віо!.
Спет. 265:12486-93)): ССА5-зв'язувальна ділянка, що повторюється 4х: : АгАсі2 (промотор актину-2 А. ІПаїйапа (Ап еї аї. (1996) Ріапі 9. 10: 107-21))/Тигро СЕР (зелений флуоресцентний білок турбо-грин (ЕмаокКітом еї аї. (2006) ЕМВО Кер. 7(10):1006-12)/Аїш ОВЕ23 3 ОТВ (відкрита рамка зчитування -23 А ішптегасіеп5, 3' нетрансльована область (Се/Мміп еї а! (1987) ЕР222493)): :
АШБІ10/РАТ (фосфінотрицинацетилтрансфераза (М/опІереп еї аїЇ. (1988) Сепе 70:25-37))/Аш
ОКЕЇ1 3 ТК. Касету експресії РТО 505 вміщували в ігапх-положення по відношенню до касет експресії СЕР і РТ РАТ. Крім того, касету експресії РТО 505 фланкували сайтами зв'язування нуклеази «цинкові пальці» ССК5. Цю послідовність (5ЕБО ІЮ МО: 1) повторювали 4х безпосередньо зліва і справа від касети експресії РТО 505. Локалізації сайтів зв'язування цинкових пальців позначені на Фіг. 1 як "САЙТ ЗВ'ЯЗУВАННЯ ССР5". Вказані сайти розпізнаються і зв'язуються білком нуклеази «цинкові пальці», кодованим ексцизійною конструкцією ррАЗ5381. Збирання вказаного бінарного вектора виконували із застосуванням стандартних технологій молекулярної біології. Структуру плазміди, що отримується, підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції і секвенуванням ДНК.
Розробка і створення ексцизійної конструкції РОА5З5381
Бінарну плазміду, що містить ген нуклеази «цинкові пальці», яка призначена спеціально для зв'язування з сайтом зв'язування ССК5 (5ЕО ІЮО МО:2), розробляли і створювали, як описано
Реге? сеї аї, (2008) Майте Віоїесппої!. 26:808-16. Конструкція ррА55381 (Фіг. 2) містить наступні бо касети експресії РТО: С5МММ (промотор вірусу мозаїки касаві (Мегдадиег еї аї. (1996) Ріапі Мо).
Вісі. 31: 1129-39)у/кодуюча область нуклеази «цинкові пальці» ССК5 (що містить: послідовність орадие-2 внутрішньоядерної локалізації (Маада|опі еї аї. (1989) Мисієїс Асіа5 Нев. 17(18):7532); 1 домен зв'язування цинкових пальців гіб2уїЇ; домен нуклеази РОКІ (І оопеу еї аї. (1989) Сепе 80: 193-208); статерна послідовність Т2А (Майіоп еї аї. (1996) 9. Міго!Ї. 70:8124-7) отримана з вірусу
Тпезоа аззідпа; друга послідовність орадие-2 внутрішньоядерної локалізації; домен зв'язування цинкових пальців 1680А мЕ; і другий домен нуклеази ЕоКІ)/Аїи ОКЕ23 3 ТК: : промотор АЮБІЗ (промотор убіквінтину-3 А. ІПпаїапа (Саїїй5 еї аІ. (1995) Сепеїїс5 139(2):921-39))/НРТІЇ (гігроміцин фосфотрансфераза ІІ (Сг; єї аІ. (1983) Сепе 25(2-3): 179-88))/АШш ОКЕ24 3 ТК (відкрита рамка зчитування-24 А. Шшптегасіеп5, 3' не трансльована область (СеМміп еї аї. (1987) ЕР222493)).
Збирання вказаного бінарного вектора виконували із застосуванням стандартних технологій молекулярної біології. Структуру плазміди, що отримується, підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції і секвенуванням ДНК.
Приклад ІІ: Адгобасіегічт-опосередкована трансформація рослин
Трансформація Адгобасіегійт з допомогою ррАБ5380 і рОА5З5381
Електрокомпетентні клітини А. Іїштеїасієп5 (штам І ВА4404) отримували з Іпмігодеп (Сапзбрайд, СА) і трансформували з використанням методу електропорації по матеріалах У/еїдеї апа Сіагебгоок (2002) "Ном ю Тгапвіопт Агарідорвів" іп Агарідор5іб5: А І абогаїгу Мапиаї, Соїд зргіпд Нагрог ІГарогаїогу Рге55, Соїй Зргіпд Нагрог, Мем/ МогкК, ШО.5.А. Трансформовані колонії отримували на пептонному середовищі з дріжджовим екстрактом (ЖЕР), що містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл), і підтверджували їх структуру шляхом розщеплення ферментами рестрикції. Клони, які виявляли картини розподілу смуг, що відповідають дії ферментів рестрикції, зберігали у вигляді вихідних культур в гліцерині при - 8026.
Адгорасіегйт-опосередкована трансформація Місойапа їарасит
Листові диски тютюну (су. Реїй Намапа) трансформували із застосуванням А. їшптеїасівеп5 (штам І ВА4404), що містить ррдА55381 і ррд55380. Окремі колонії Адгобасієгійт, що містять вказані плазміди, інокулювали в 4 мл середовища УЕР, що містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл) і інкубували протягом ночі при 282С на шейкері при 190 об./хв. Потім 4 мл культури для посіву використовували для інокуляції 25 мл культури середовища ХЕР, що
Зо містить спектиноміцин (50 мкг/мл) і стрептоміцин (125 мкг/мл), що вирощується в 125 мл колбі
Ерленмейєра з відведенням. Культуру інкубували при 282С з перемішуванням при 190 об./хв. до досягнення значення ОЮвоо «1,2. Десять мл суспензії Адгобасіегішт вміщували в стерильні чашки Петрі.
Двадцять п'ять свіжозрізаних листових дисків (0,5 см"), зрізаних з рослин, вирощених в асептичних умовах на середовищі М5 (РпуюїесппоЇоду Гарз, 5пампее Міззіоп, К5, ЖМ524) з 30 г/л сахарози в РПуїаТгаує "М (Зідта, 5. Гоціх5, МО) вимочували в 10 мл добової культури
Адгорасіегішт протягом декількох хвилин, промокали досуха стерильним фільтрувальним папером і потім вміщували на те ж саме середовище з додаванням 1 мг/л індолілоцтової кислоти і 1 мг/л бензиламінопурину. Через 48 годин спільного культивування листові диски, культивовані спільно з Адгобасіегйт, що містить ррАБ5380, переносили на те ж саме середовище з 5 мг/л ВавзіаФ і 250 мг/л цефотаксиму. Листові диски, культивовані спільно з
Адгорасіегішт, що містить рраА55381, переносили на те ж саме середовище з 10 мг/л гігроміцину і 250 мг/л цефотаксиму. Через З тижні окремі паростки То переносили на середовище М5 з 10 мг/л ВазіФ і 250 мг/л цефотаксиму у випадку ррАБЗ5380 або на середовище М5 з 10 мг/л гігроміцину і 250 мг/л цефотаксиму у випадку ррА5З5381, на наступні З тижні перед пересадкою в грунт і перенесенням в теплицю.
Число піків, повнорозмірна РТИ і аналіз експресії рослин То
Перевірка числа піків
Тести ІпмадегФ і тести із застосуванням гідролізних зондів здійснювали для відбору зразків
Вавіаф-стійких рослин, щоб ідентифікувати рослини, які містили в собі однокопійну інтеграцію Т-
ДНК в ррад55380 і ррА5З5ЬЗ81. Проводили докладний аналіз із застосуванням праймерів і зондів, специфічних до касет експресії генів. Однокопійні «події» ідентифікували для додаткового аналізу.
Зразки тканин збирали в 96-ямкові планшети і ліофілізували протягом 2 днів. Мацерацію тканин виконували за допомогою подрібнювача тканин Кіесо" і вольфрамових гранул (Мізаїіа,
СА). Після мацерації тканин геномну ДНК виділяли у високопродуктивному форматі із застосуванням набору ОМеазу 96 Ріапі КИ" (Оіадеп, Сегптапіомп, МО) відповідно до протоколу виробника. Визначали кількість геномної ДНК за допомогою набору реагентів Оцапі-Ії Рісо
Сгееп ОМА аззау Кім (МоїІесшаг Ргобев5, Іпмігодеп, Сагізрай, СА). Кількість геномної ДНК 60 доводили до значення 9 нг/мкл, для тесту Іпмадего або до значення 5 нг/мкл для тесту із застосуванням гідролізних зондів з використанням автоматичного пробовідбірника
Віогороїз000 "м (Сіадеп, Сегптапіом/п, МО).
Тести Сивіот Іплмадегобули розроблені для аналізу гену РАТ в тютюні компанією Ноіодіс (Мадізхоп, УМІ). Зразки геномної ДНК (7,5 мкл при 9 нг/мкл) спочатку денатурували в форматі 96- ямкового планшета інкубацією при 952С протягом 10 хвилин і потім охолоджували на льоду.
Потім 7,5 мкл реакційної суміші (З мкл суміші зондів для раї і внутрішнього референсного гену (фенілаланін-амоній-ліаза (раіА); СепВапк І: АВОО8199), 3,5 мкл суміші СівамазхеФф ХІ ЕКЕТ і 1 мкл розчину СіІеамазеФ ХХІ Еплуте/МоСіг) додавали в кожну ямку і зразки покривали мінеральним маслом. Планшети щільно закривали і інкубували при 632С протягом 1 години в термоциклері ВіоКай ТеїгаайФ. Планшети охолоджували до кімнатної температури перед зчитуванням з допомогою флуоресцентного планшетного рідера. Всі планшети містили 1- копійні, 2-копійні і 4-копійні стандарти, а також контрольні зразки дикого типу і контрольну ямку, що не містять зразка. Зчитування показників проводили для каналів РАМ (А 485-528 нм) і КЕО (А 560-620 нм) і з цих показників визначали перегин вище за нуль (тобто фон) кожного каналу для кожного зразка шляхом розподілу необробленого сигналу зразка на необроблений сигнал без матриці. На основі цих даних будували калібрувальну криву і визначали максимальну відповідність за допомогою лінійного регресивного аналізу. Використовуючи параметри, встановлені з вказаної відповідності, потім визначали очевидне відповідне число піків для кожного зразка.
Визначення числа піків трансгену в тесті із застосуванням гідролізних зондів, аналогічному тесту ТадМапФ, здійснювали з допомогою ПЛР в режимі реального часу із застосуванням системи ГідпіСусіего480 (Коспе Арріїей зЗсіепсе, Іпаіапароїї5, ІМ). Тести здійснювали для НРТІЇ,
РАТ і внутрішнього референсного гену фенілаланін-амоній-ліази (раїА) із застосуванням програмного забезпечення Ргоре ЮРезідп Зоймаге 2.0 І ідпіСусіегФ. Для проведення ампліфікації готували майстер-мікс зондів Гідп(Сусієг9480 (Коспе Арріїєй Зсіепсе, Іпдіапароїїб5, ІМ) в їх кінцевій концентрації в об'ємі 10 мкл мультиплексної реакційної суміші, що містить 0,4 мкм кожного праймера і 0,2 мкМ кожного зонду (таблиця 1). Здійснювали двостадійну реакцію ампліфікації з подовженням при 582С протягом 38 секунд з отриманням флуоресценції. Всі зразки досліджували в триплетах і середні значення порогових циклів (СЮ) використовували для
Зо аналізу кожного зразка. Аналіз результатів, отриманих з допомогою ПЛР в реальному режимі часу, виконували із застосуванням програмного забезпечення І ідпіСусіегю версія 1.5 із застосуванням модуля квантування відносних значень і основаного на методі ЛАСЯ. З цією метою зразок геномної ДНК однокопійного калібратора і відомий двокопійний контроль включали в кожну серію вимірювань (ідентичні калібратору і контролю, які застосовували в тестах ІпладегФ вище).
Таблиця 1
Інформація про праймери і зонди для проведення тесту із застосуванням гідролізних зондів для РАТ, РАТ, НРТІЇ ї внутрішнього референсного гену (раїіА)
РЕ. ПП в Послідовність Виявлення праймера
ТОРАТ5 /(5ЗЕОІО МОЗ: 5БАСААСАСТОСАТТСАТСАТСТАСАсСАСОТУ /:/:/:/0 ФГ
ТОРАТА /(5ЗЕОІО ЗМО: 5 СТТТСАТОССТАТОТСАСАССТАААСАСТУЇ 1777
ТОРАГ5 /5ЗЕОІО МО: 5 ТАСТАТСАСТІСАТОТТСТОТОСТоАСТоАЗУ /:/:///:ГО
ТОРАГА /5ЗЕОІО ЗМО: 5 САССОСТСТАААТТССсАСССтТТАТТТСЯ3 -::///ї7777/::Г
ЗЕО ІЮ МО:8;
НРТ25 (5ЗЕОІО ЗМО БАСАСТАСАТОССОТСАТТТУ -/-::///////: г ї//:у/;:::
НРТ2А (5ЗЕОІЮ МОЛО УАОСАТСАОСТСАТССАСАУ 77777771
Аналіз повнорозмірної РТ з використанням Саузерн-блотингу
Саузерн-блотинг використовували для визначення патерну інтеграції фрагмента ДНК, що вставляється, і ідентифікації «подій» ррА55380 і ррдА55381, які містили повнорозмірну РТИ.
Отримували результати, щоб показати інтеграцію і цілісність трансгенів, вставлених в геном тютюну. Результати Саузерн-блотингу використовували, щоб ідентифікувати просту інтеграцію інтактної копії Т-ДНК з ррад55380 і рра55381. Докладний Саузерн-блотинг здійснювали із застосуванням зондів, специфічних до касет експресії генів. За допомогою гібридизації вказаних зондів з геномної ДНК, яка була розщепленням специфічними ферментами рестрикції, ідентифікували фрагменти геномної ДНК з молекулярною масою, характер розподілу яких можна аналізувати з метою виявлення «подій» для просування в Ті. Вказані аналізи також показали, що фрагмент плазміди був вставлений в геномну ДНК тютюну без реаранжувань
РТИ.
Зразки тканин збирали в 50 мл конічні пробірки (Рієпег Зсіепійіс, Рійбригой, РА) і ліофілізували протягом 2 днів. Мацерацію тканин здійснювали з допомогою млина для подрібнення тканин і вольфрамових кульок. Після мацерації тканини геномну ДНК виділяли з використанням набору ОМеазу" Ріапі Махі Кії (Оіадеп, Септапіомп, МО) згідно з протоколом виробника. Очищену геномну ДНК осаджували і ресуспендували в 500 мкл буфера ТЕ. Геномну
ДНК потім очищали із застосуванням набору Оіадеп Сепотіс Тір5"м. Кількість геномної ДНК визначали за допомогою набору реактивів Оцапі-ІТ Рісо Сгееп'"м (МоїІесшаг Ргоревз, Іпмйгодеп,
Сагівзрайд, СА). Кількість геномної ДНК доводили до 8 мкг у відповідному об'ємі.
Для кожного зразка 8 мкг геномної ДНК ретельно розщеплювали ферментами рестрикції
М'ЄЇ ї М5іЇ (Мем/ Еподіапа Віоїар5, Вемепеу, МА). Зразки інкубували при 372С протягом ночі.
Розщеплену ДНК концентрували осадженням розчином ОпціскК Ргесірйайцйоп Зоїішіоп'м (Едде
Віозузіетв5, сайпегериго, МО) відповідно до протоколу, що пропонується виробником. Геномну
ДНК потім ресуспендували в 25 мкл води при 652С протягом 1 години. Ресуспендовані зразки вміщували в 0,895 агарозний гель, приготований в 1х ТАЕ, і проводили електрофорез протягом ночі при 1,1 В/см в їх ТАЕ буфері. Гель послідовно піддавали денатурації (0,2 М МаОн/О,6 М масі) протягом 30 хвилин і нейтралізації (0,5 М Ттгібз-НСІ (рН 7,53/1,5 М Масі) протягом 30 хвилин. Перенесення фрагментів ДНК здійснювали шляхом пасивного протікання 20х розчинів
ЗЗС протягом ночі через гель на оброблену Іттобріоп" МУ блотинг-мембрану (Мійіроге,
ВШегіса, МА) з використанням гньоту з хроматографічного паперу і паперових рушників. Після перенесення мембрани швидко промивали 2х 55С, зшивали з 5ігайаійпКег"м 1800 (5ігаг(адепе,
Гадоїа, СА), і висушували у вакуумі при 802С протягом З годин.
Блоти інкубували з розчином для попередньої гібридизації (Регесї Нуб ріи5"М, Зідта, 51.
Зо Гоціз5, МО) протягом 1 години при 652С в скляних ролерних флаконах із застосуванням інкубатора для гібридизації, модель 400 (Корбріп5 5сіепійіс, 5иппумаІе, СА). Зонди готували з
ПЛР-фрагменту, що містить повну кодуючу послідовність. Амплікон ПЛР очищали із застосуванням набору для екстракції з гелю ОІАЕХ Їм і мітили З2рР-ЯСТР за допомогою набору для мічення Капдот ЕТ Рігіїте ІТ" (Зігаїадепе, Іа доПа, СА). Блоти гібридизували протягом ночі при 652С з денатурованим зондом, доданим безпосередньо в гібридизаційний буфер приблизно до 2 мільйонів імпульсів на блот на мл. Після проведення гібридизації блоти послідовно відмивали при 652С 0,1 х 55С/0,195 505 протягом 40 хвилин. На закінчення блоти експонували на хемілюмінесцентну плівку, (Коспе Оіадповіїсв5, Іпаіапароїї5, ІМ) і отримували зображення із застосуванням системи візуалізації Моіїесшаг Супатісв 5іопт 8607".
Очікувані і розміри фрагментів, що спостерігаються при використанні певного розщеплення і зонда, виходячи з відомих сайтів рестрикції ферментами фрагментів ррда55380 або ррад55381, подані на Фіг. З і 4. Аналізи Саузерн-блотингу, виконані в даному дослідженні, використовували для ідентифікації «подій», які містили повнорозмірні інтактні РТО з плазмід ррА55380 або ррАБ5381, які вставляли в геном тютюну (Фіг. З і 4 відповідно).
Перевірка експресії 505
Щоб перевірити, чи містили трансгенні рослини ррА55380 функціональну касету експресії
РТИ 05, зразки листя збирали і проводили гістохімічне фарбування для визначення експресії вИ5. Листові диски (- 0,25 см") різали і вміщували в 24-ямковий планшет (1 листовий диск на ямку), що містить 250 мкл реакційного розчину 505 (ЧеПегзоп (1989) Маїшге 342:837-8). 24- ямковий планшет обгортали плівкою МезсоїйтФе (Різпег Зсіепійіс, Рій5Ббигой, РА) і інкубували при 372С протягом 24 годин. Через 24 години реакційний розчин ОЗ видаляли з кожної ямки і замінювали 250 мкл 10095 етанолу. Планшет обгортали плівкою МезсойтФ і інкубували при кімнатній температурі протягом 2-3 годин. Етанол видаляли і замінювали свіжим етанолом.
Листові диски потім оглядали під препарувальною лупою. Листові диски, які були забарвлені в блакитний колір, оцінювали, як такі, що містять функціональну касету експресії ОЗ РТ.
Кількісний аналіз експресії ОПЕР
Аналізували експресію СЕР в зразках листя тютюну з використанням ЕГІЗА. Наносили на планшети очищене кроляче антитіло проти СЕР на ніч при 42С. У день проведення аналізу планшети блокували 0,595 ВБА в РВ5ЗТ. Дубльовані зразки листя екстрагували кульовим бо подрібненням частин замороженого листя з 2 намистинами з нержавіючої сталі в гомогенізаторі
Кієсо" протягом З хвилин при максимальній швидкості. Зразки центрифугували при 3000 д протягом 10 хвилин і збирали супернатанти. Виділені зразки наносили на планшети для проведення тесту ЕГІЗА в розведенні 1:5 і 1:50. На кожному планшеті будували калібрувальну криву для рекомбінантного СЕР Е. соїї з концентраціями від 12,5 нг/мл до 0,195 нг/мл.
Стандарти і зразки інкубували на планшетах для проведення тесту ЕГІ5А протягом 1 години.
Планшети відмивали і додавали пероксидазу хрону, кон'юговану з кролячим антитілом проти
СЕР. Після 1 часу інкубації планшети відмивали і додавали субстрат. Після розвитку фарбування зупиняли реакцію додаванням На5О:. Оптичну густину визначали з допомогою планшетного рідера при 450 нм з фільтром порівняння 650 нм. Квадратичну стандартну криву будували шляхом нанесення по точках концентрації стандарту Е. соїї в залежності від ОО.
Концентрації в зразках, що досліджуються, визначали за допомогою лінійної регресії.
Селекція рослин То для продукції Ті-мішеней
Усього регенерували 68 ВазіаФ-стійких, зИО5-/3ЕР. рослин і виявили, що 38 рослин містили 1-2 трансгенні копії, виходячи з результатів тесту РАТ ІпуадегФ).
Саузерн-блотинг виявив 14 однокопійних «подій», з яких 8 показали смуги, які відповідали інтактним РТ: РАТ, 505 ії СЕР. Три «події» ррА5Б5380, що демонструють однокопійну, повнорозмірну РТ, і що експресують 55 і СЕР, ррад55380-3, ррда55380-18 і ррд55380-46, самозапилювали для отримання насіння 11.
Кількісний аналіз експресії ЕоКі
Використовували кількісну ПЛР в реальному часі (ПЛП-РУ) для кількісного визначення рівня експресії МРНК нуклеази «цинкові пальці» в рослинах тютюну То, трансформованих рра55381.
Аналіз здійснювали для кількісного визначення відносного рівня експресії мРНК РОКІ в зразках листя тютюну, при нормалізації вказаних рівнів відносно рівня експресії МРНК, отриманого для вхідної МРНК. Нормалізація значення мРНК РОКІ відносно загальної мРНК дозволяє порівняти рівень експресії БоКІ в різних зразках і може бути використана для виявлення «подій», які, ймовірно, є такими, що високо експресуються. Відносна експресія ЕМ наводиться в Таблиці 11.
Таблиця 1.1
Кількісне визначення рівня експресії мРНК нуклеази «цинкові пальці» в рослинах тютюну То, трансформованих ррда55381. "дДКТ-РСК для мРНК РокІ, нормалізованої по загальній РНК.
Середнє значення 4 повторних проб.
Зо Матеріал листя рослин тютюну То, яке було трансформоване рраАБ55381, збирали і вміщували на лід. Загальну РНК виділяли із застосуванням набору Оіадеп'є КМеазуФф Ріапі Міпі
КИ (Оіадеп, Сегтапіожмп, МО). Загальну мРНК обробляли ДНКазою, що не містить РНКазу, згідно з рекомендацією виробника, щоб видалити будь-яке забруднення ДНК, яка може ампліфікуватися під час проведення кількісної ПЛР-РЧ. Синтез першого ланцюга проводили згідно з інструкціями виробника ферменту зворотної транскриптази Зирегвзогірі ШІ" (Іпийодеп,
Сагі5райд, СА) і подавали із застосуванням випадкових гексамерів. Синтезовані ланцюги КкДНК розводили у воді у відношеннях 1:10 і 1:50. Кожну аліквоту зберігали при -202С.
Реакцію ПЛР-РЧ здійснювали таким чином: прямий праймер БоКкІ ОРІ Е (ЗЕО ІЮ МО: 12), зворотний праймер БоКкІ ОРІ К (ЗЕО ІЮ МО: 13), зонд ОРІ 4130 (каталожний 2Ж04693663001,
Коспе, Іпаіапароїїв, ІМ), їх Ї С480 буфер для зондів (Восне Оіадпозіїйс, Іпаіапароїїв, ІМ), і 1,5 мкл синтезованої кКДНК в 15 мкл реакційній суміші. Робили серійне розведення синтезованої кДНК, проводили аналіз в повторах. Коктельну суміш ампліфікували із застосуванням набору зондів
ПойіСусієтгФ 480 Ргобех5 Мавіег Кії 204707494001 (Коспе Оіадповіісв5, Іпаіапароїїв5, ІМ). Розмічали і підписували 96-ямковий мікропланшет, додавали по 13,5 мкл реакційної суміші в ямку. Плівку, що сама клеїться, обережно приклеювали до мікропланшету. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Плівку, що сама клеїться, видаляли і додавали 1,5 мкл розчину розморожених, розведених синтезованих ланцюгів кКДНК. Плівку, що сама клеїться, міцно прикріпляли до планшета і центрифугували як описано раніше. Програму ПС запускали таким чином: ї) активація, 9523 протягом 5 хвилин; ії) денатурація, 952С протягом 10 сек. (Ф 4,82С/сек.); ії) відпал/подовження, 602С протягом 25 сек. (Ф 2,52С/сек.); ім) отримання, 722С протягом 1 сек. (Ф4,82С/сек.); стадії ії-їм повторювали 45 разів; мі) охолоджування 382С протягом 5 сек.)
Аналіз ПЛР-РЧ для кількісного визначення експресії мРНК внутрішнього референсного гену виконували як інший метод для нормалізації експресії мРНК нуклеази «цинкові пальці». Реакцію
ПЛР-РЧ для актину здійснювали таким чином: прямий праймер ВУ2АСТ895 (5ЕБЕО ІЮО МО: 14), зворотний праймер ВУ2АСТВ89А (5ЕО ІО МО: 15), зонд ВУАСТРО (5ЕО ІО МО: 18), 1х І С480 буфер для зондів, і 2,0 мкл синтезованої кКДНК, в 10 мкл реакційної суміші. Робили серійне розведення синтезованої КкДНК, проводили аналіз в повторах. Крім того, додавали 2 мкл стандартів плазмідної ДНК з відомою кількістю піків, щоб розділити ямки в серіях розведення від найбільш низької до найбільш високої концентрацій, і ці стандарти порівнювали з кКДНК актину (синтезованої із загальної мРНК), щоб визначити кількість числа піків. Серії стандартів числа піків ДНК актину створювали клонуванням цільового амплікону в плазміду РСК2.1 (Іпмігодеп,
Сагізрай, СА), і отриманням серій розведення, приготованих в буфері для розведення (10 мМ
Тиів-НСЇІ |рН 8,01, 100 мкг/мл тРНК дріжджів), для визначення кількості числа піків. Коктельну суміш ампліфікували із застосуванням набору зондів ГідпіСусіеєгю 480 Ргоре5 Мавієг Кії яо4707494001 (Коспе Оіадповійс5, ОБА). Розмічали і підписували 96-ямковий мікропланшет, і додавали і по 8,0 мкл реакційної суміші в ямці. Плівку, що сама клеїться, обережно приклеювали до мікропланшету. Планшет центрифугували протягом 1 хвилини при 3000 об./хв. в центрифузі для мікропланшетів Оіадеп. Плівку, що сама клеїться, видаляли і додавали 2,0 мкл розчину розморожених, розведених синтезованих ланцюгів КДНК або плазмідної ДНК.
Плівку, що сама клеїться, міцно прикріпляли до планшету і центрифугували, як описано раніше.
Програму ПС запускали таким чином: ії) активація, 9523 протягом 10 хвилин; ії) денатурація, 952С протягом 10 сек. ((Ф 4,82С/сек.); ії) відпали/уподовження, 562"С протягом 40 сек. (Ф 2,52Су/сек.); ім) отримання, 722С протягом 1 сек. (Ф 4,82С/сек.); стадії ії-їм повторювали 45 разів; мі) охолоджування до 382С протягом 5 сек.
Зо Селекція рослин То для продукції ексцизійних Т
Всього регенерували 54 гігроміцин-стійких рослин і виявили, що 34 рослини містили 1-2 копії трансгену, на основі методу гідролізних зондів. Саузерн-блотинг ідентифікував 12 однокопійних «подій», з яких 7 демонстрували смуги, що відповідають інтактним РТО НРТ і 2ЕМ. «Події» То ррАБ5Ь381, що демонструють одну копію трансгену, повнорозмірну РТИ, ії що експресують ЕоКІ, рорАБ5З381-18, ррад55381-49 і ррді55381-56, піддавали самозапиленню для отримання насіння
ТІ.
Приклад І. Відтворення і відбір рослин Т
Самозапилення рослин То для отримання гомозиготних рослин
Наступні рослинні «події» То: рра55380-3; рраіБ5380-18; ррАБ5380-46; ррАБ5З381-18; рОАБ5З381-49; і ррда55381-56 вирощували до дозрівання і самозапилювали для отримання насіння Ті. Після проростання рослини Т', які були гомозиготними по конструкціях ррАЗ5380 і ррАБ5Ь3З81, використовували для делеції трансгену. Відповідно до менделевського успадкування, схрещування гомозиготних однокопійних рослин Ті ррА55381 з гомозиготними однокопійними рослинами Ті ррді55380 дає популяцію Е:, що містить гетерозиготну унікальну копію обох конструкцій рраАБ5381 і рраАБз5380. Передбачалося, що потомство даного схрещування містить одну копію репортерного гену (3И5. По суті, рослина Е:, що не експресує
СИ, показує, що касета експресії РТО 55 була вирізана.
Рослини То вирощували при довжині світлового дня 16:18 годин, з денними і нічними температурами в діапазоні 22-242Сб. Коли первинне квіткове стебло починало довшати і утворювати бутони, рослину цілюом накривали мішечком для самозапилення, щоб запобігти випадковому схрещуванню. Насіння, отримане в результаті самозапилення, збирали приблизно через вісім тижнів після висаджування рослин. Насіння самозапилених рослин збирали і вміщували в грунт. Отримувані популяції Ті вирощували в теплиці в умовах, описаних вище.
Молекулярний скринінг рослин ТТ
Аналіз зиготності
Аналіз кількісного визначення зиготності рослин Ті виконували із застосуванням методу гідролізних зондів, описаного вище (аналіз числа піків). Проводили аналіз результатів ПЛР в режимі реального часу і число піків трансгену, що містяться в рослинах Ті, визначали шляхом порівняння з числом піків контролю. Для цього в аналіз включали зразок геномної ДНК з батьківської рослини То, який, як було показано раніше, містить однокопійний калібратор.
Ідентифікували гомозиготні рослини Ті ррд55380 і рОА5З5381.
Перевірка експресії (3305
Для просування експериментів по схрещуванню важливо було ідентифікувати експресуючі «події». Рослини Ті рОрАБ5ЬЗ8О перевіряли з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії 505). Тестували рослини ррАБЗ5380, які були відібрані як гомозиготні по конструкції РОАЗ5380, за результатами тесту на гомозиготність, описаного вище. Всі рослини давали блакитне фарбування.
Кількісний аналіз експресії ОПЕР
Рослини Ті ррА55380 тестували з використанням протоколу, описаного вище (кількісний аналіз експресії СЕР). Тестували рослини ррА55380, які були відібрані як гомозиготні по конструкції РОАЗ5380, внаслідок перевірки гомозиготності, як описано вище. Всі рослини, що тестуються, були позитивними по експресії СЕР.
Кількісний аналіз експресії ЕоКі
Використовували кількісний метод ПЛР в реальному масштабі часу РСК (ПЛР-РЧ) для кількісного визначення мРНК нуклеази «цинкові пальці» в гомозиготних рослинах тютюну ТТ ррАБ5Ь381, трансформованих рра55381. Протоколи, описані вище, (Кількісний аналіз експресії
ЕоКІ), використовували для скринінгу рослин Ті для підтвердження, що нуклеаза «цинкові пальці» була експресуючою, і для ідентифікації «подій», які могли б продукувати стійкі кількості нуклеази «цинкові пальці» для вирізання касети експресії РТО 50И5.
Селекція рослин Ті
Проводили скринінг «подій» Ті ррА55380 на зиготність і експресію 55 і СЕР. Проводили скринінг «подій» Т1 ррдА55381 на зиготність і експресію РОКІ. Виходячи з вказаних результатів, «події» Т: відбирали для схрещування. Вказані «події» були визначені як оптимальні, оскільки вони являли собою гомозиготні, однокопійні, повнорозмірні «події», що експресують трансген.
Крім того, рослини сибс-нуль ррд55381 зберігали для застосування як контролі. Вказані «події» не містили касету експресії РТО нуклеази «цинкові пальці». Трансген не успадковувався вказаними рослинами Т: в результаті сегрегації трансгену. Відібрані «події» вирощували до зрілого стану і схрещували для отримання рослин Е:;, щоб тестувати вирізання трансгену з
Зо допомогою нуклеази «цинкові пальці». Стратегія схрещування викладена нижче.
Схрещування гомозиготних рослин Ті: для отримання Рі
Відібрані рослини ррА55380 схрещували з відібраними рослинами ррА55381. Крім того, проводили зворотні схрещування, так що батьками були чоловіча і жіноча форми (Таблиця 2).
Рослини схрещували вручну; пилок з пильовиків зрілої чоловічої батьківської форми вводили в рильце зрілої жіночої батьківської форми. Рослини, готові до схрещування, прибирали від інших рослин, щоб зменшити імовірність того, що жіночі форми рослин тютюну будуть запилені непередбаченим пилком. Жіночі форми рослин кастрували (пильовики видаляли перед розкриттям) використовуючи пінцет, за 15-30 хвилин до запилення чоловічою формою квітки.
Квітки відбирали для кастрування, беручи до уваги пильовики і забарвлення квіток. Знову відкриті квітки мали яскраво-рожеву облямівку, і пильовики були всі ще закриті. Квітки, що містили пильовики, які були відкриті або частково відкриті, не використовували. Рясні квітки, на стеблі рослини тютюну, кастрували і запилювали. Додаткові квітки на стеблі (наприклад, вже запилені коробочки, старі квітки, дуже молоді бутони і т.д.) видаляли пінцетом, щоб гарантувати, що коробочки, що утворилися на гілці, були отримані в результаті схрещування, що контролюється. На гілку прикріпляли етикетку, в якій указано зроблене схрещування, скільки скрещувань зробили і дата запилення. Пильовики у чоловічої форми рослини повністю видаляли пінцетом, і використовували для запилення вихолощеної жіночої форми.
Пильовиками чоловічої форми, що розтріскуються, торкалися клейкої рецептивної поверхні рильця жіночого особня доти, поки рильце не покривалося пилком. Рильце покривали пилком декілька разів, щоб знизити імовірність непередбаченого запилення яким-небудь пилком, що має доступ до рильця жіночої форми рослини. Насіння запліднених рослин збирали і вміщували в грунт. Отримувані рослини-нащадки Ег вирощували в теплиці в умовах, описаних вище.
Таблиця 2
Матриця експериментального схрещування 5381-18-17 5381-49-16 5381-56-5 5380-03 Х Хх Хх 5380-3-6 5380-3-12 5380-3-21 5381-18-22 5381-49-16 5381-56-37 5380-18 Хх Хх Хх 5380-18-17 5380-18-22 5380-18-22 5381-18-17 5381-49-10 5381-56-5 5380-46 Хх Хх Хх 5380-46-15 5380-46-15 5380-46-15 5381-56-12 5381-56-12 5381-56-12
Ми! Емепів Хх Хх Хх 5380-3-10 и 5380-25-10 5380-3-10 и 5380-25-10 І5380-3-10 и 5380-25-10
Приклад ІМ: Аналіз рослин НЕ; у відношенні 2ЕМ-опосередкованої делеції трансгену
Тестування 55
Рослини Е: тестували у відношенні експресії ЗО5 за допомогою гістохімічного фарбування матеріалу листя. Скринінг 35 являв собою попередній тест для ідентифікації «подій», які перенесли делецію трансгену, опосередковану 2ЕМ. Результати скринінгу 5И5 не передбачалися як заключні, але, швидше, були індикатором для визначення рослин для подальшого молекулярного аналізу. Рослини ЕЕ: тестували з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії 305). Результати представлені в Таблиці 3.
Таблиця З
Експресія 5И5 в гібридах РЕ:
Ексцизійні Зворотне події схрещування Тестовані с/ | Гестовані со/ |Гестовані о овзвтлв - 9 5 л6 о Р о Я и
З 1 1459 144196 480 | 2. 441 - | - овзві49 1 | «о т лат аа ет ва
З 7.171465 | 67 |144| 467 | 17 | 36 485 | 69 |142 овавівв - 2 Р о « Я 5 6 1 Я о 81117117 - 117-17-11 470 | 7 1151 450 | з | 07 маш 12 | - 1-1 | и | 8118 453 | п 87771171 - 117-11-11 446 | 4 1091 490 | п | 22
Саузерн-блотинг
Саузерн-блотинг використовували для отримання молекулярної характеристики вирізання касети експресії РТО 05 нуклеазою «цинкові пальці». Результати виявили вирізані касети експресії РТО (05 у різновиду «подій», невирізані касети експресії РТО (05 у іншого різновиду «подій», і різновид химерних «подій», які містили вирізані і невирізані касети експресії РТО 50И5.
Детальний Саузерн-блотинг проводили із застосуванням зонду, специфічного до касети експресії РТО СЕР. Гібридизація зонда з геномної ДНК, яка була фрагментована специфічними фрагментами рестрикції, ідентифікувала фрагменти ДНК з певною молекулярною вагою.
Вказані типи можуть бути аналізовані для ідентифікації «подій», які містили вирізану касету експресії РТО 50И5, містили інтактну касету експресії РТО 5015, або були химерними і містили вирізану і інтактну касету експресії РТО 505.
Рестрикційне розщеплення виконували з 10 мкг кожного зразка в їх буфері 4 їі 100 одиницями Маеї (Мем Епдіапа Віої! арх, Ірхм/ісп, МА) в кінцевому об'ємі 350 мкл, при 10-кратному надлишку ферментів розщеплення. Зразки інкубували при 372С протягом ночі. Розщеплену ДНК концентрували повторним осадженням розчином ОпціскК Ргесірйайцоп Зоішіоп "м (Едде Віозузієетв5,
Сайпегериго, МО) відповідно до протоколу, що пропонується виробником. Отримувана суміш ресуспендували в 30 мкл їх буфера для внесення і інкубували при 652С протягом 30 хвилин.
Ресуспендовані зразки наносили на 0,895 агарозний гель, приготований в буфері їх ТАЕ (0,8 М
Трис-ацетат ІрН 8,9/0,04 мм ЕОТА) і проводили електрофрез протягом ночі при 1,1 В/см в їх
ТАЕ буфері. Гель послідовно піддавали денатурації (0,2 М МаОін/0,6б М масі) протягом 30 хвилин, і нейтралізації (0,5 М Ттгі5-НСІ ІрН 7,5)/1,5 М Масі) протягом 30 хвилин. Перенесення фрагментів ДНК здійснювали шляхом пасивного протікання 20х розчинів 55С протягом ночі через гель на оброблену Іттобіоп" МУ блотинг-мембрану (Міййроге, ВШегіса, МА) з використанням гньоту з хроматографічного паперу і паперових рушників. Після перенесення мембрану швидко промивали 2х З5С, зшивали з 5ігайзаійпКег" 1800 (Зігагадепе, Іа Чдоїа, СА) і висушували у вакуумі при 802С протягом З годин. Блоти інкубували з розчином для попередньої гібридизації протягом 1 години при 652С в скляних ролерних флаконах із застосуванням інкубатора для гібридизації Зонд виготовляли з ПЛР-фрагмента, що містить кодуючу послідовність дір, яку очищали із застосуванням набору для екстракції з гелю Оіадеп і мітили 50 мкКі (З32Р-ЯСТР з використанням набору для мічення. Блоти гібридизували протягом ночі при 652С з денатурованим зондом, доданим безпосередньо в буфер гібридизації приблизно до 2 мільйонів імпульсів блот на мл. Після проведення гібридизації блоти послідовно відмивали при 652С 0,1 х 5502/0190 505 протягом 40 хвилин. Блоти експонували касети з екраном
Ріпозріогітадетг зстееп і отримували зображення із застосуванням системи візуалізації Моїесшіаг
Бупатісв пт 860". Результати блотів подані на фіг. 5.
Аналіз ПЛР одиниці транскрипції рослини
Реакції ПЛР здійснювали, щоб охарактеризувати вирізання касети експресії РТ (5.
Розробляли праймери, які зв'язувалися з послідовністю МАК і з послідовністю ОКЕ 23 3 ТЕ (3
ТК для касети експресії РТО СЕР). Вказаний амплікон ПЛР охоплює ділянку касети експресії
РТИ ИБ5, яка, як очікується, повинна бути вирізана. По суті, застосування вказаних праймерів
ПЛР може виявити «події», в яких касета експресії РТО 505 вирізана, «події», в яких вирізання не сталося і химерні об'єкти, в яких касета експресії РТО 55 нерівномірно видалена в «події».
Ампліфікація фрагмента 6,7 т.н. показує, що немає вирізання, тоді як ампліфікація фрагмента
Зо 2,4 т.н. дозволяє передбачити, що касета експресії РТО 505 була вирізана. Амплікони, що містять фрагменти обох розмірів, служать ознакою того, що касета експресії 5СО5 РТ була видалена не повністю.
Геномну ДНК виділяли з тканини тютюнового листя з використанням набору Ріапі Махі Кії
ОМеаву ", і визначали кількісно з використанням набору реактивів Рісо Сгееп ОМА Опцапі-ІТ", як описано вище. ПЛР для одиниці транскрипції рослини (РСК РТ) виконували з використанням термоциклера Теїгад2 " (ВіоКкай, Негсціез5, СА). Олігонуклеотидньіе праймерь! розробляли для ампліфікації РТО з використанням програмного забезпечення МесіогМТІ". Для ампліфікації Ех
Тад Роїутегазе " (ТаКага, Ої5и, Зпіда, дарап) готували в 1х кінцевій концентрації в 25 мкл об'ємі реакційної суміші Зіпдіеріех, що містить 1,2 мкМ кожного праймера (ЗЕО ІЮО МоМо: 16 і 17), 02 мМ амтР, 296 О0М5О, 1,25 одиниць ТАС з використанням 4 нг матриці геномної ДНК.
Тристадійну реакцію ампліфікації здійснювали в наступному вигляді; З хвилини початкова денатурація при 942С і 33 цикли по 30 секунд при 942С, 6 хвилин при 65,52С, 30 секунд при 722С, із заключною реакцією подовження при 722С протягом 10 хвилин. Аліквоту продукту ПЛР пропускали на 195 гелі з бромідом етидію із застосуванням маркера 1Кр-- (Іпмігодеп, Сагівбай,
СА) для визначення розміру продукту. Результати реакцій ПЛР РТИШ подані на Фіг. 6.
Секвенування продуктів ПЛР РТО
Смуги 2,4 т.н., отримані внаслідок реакцій ПЛР РТИ, вирізали з гелю і очищали ДНК із застосуванням набору для екстракції з гелю Оіадеп Оіаєх І!" (Оіадеп, Септапіомлл, МО).
Очищені фрагменти лігували у вектор клонування реК2.1 ТОРО-ТА" (Іпмігодеп, Сарай, СА).
Присутність клонованого амплікону ПЛР всередині вектора рСК2.1 підтверджували шляхом розщеплення ферментами рестрикції. Клони, що містять смуги, що відповідають продуктам ампліфікації, секвенували. Послідовності місця з'єднання, що отримується внаслідок видалення касети експресії РТ ЗИ5, подані на Фіг. 7а і 70. Повну касету експресії РТ видаляли.
Послідовності, що залишаються, являють собою тільки реаранжовані сайти зв'язування «цинкових пальців», які фланкували касету експресії РТО 505. Крім того, деякі амплікони ПЛР містили делеції, які розповсюджувалися на промотор актину 2 касети експресії РТО СЕР.
Аналіз із застосуванням ферментів рестрикції смуги 6,7 т.н.
Амплікони ПЛР більш великої смуги 6,7 т.н. аналізували за допомогою розщеплення ферментами рестрикції. Вказані фрагменти розщеплювали рестрикційними ферментами Есоркі і 60 Меоі/Засі (Мем Епдіапа Віоіабзв, Ірзулісп, МА). Розміри смуг, що отримуються, аналізували, щоб підтвердити, що ампліфіковані фрагменти включали невирізану геномну вставку трансгену рорАБЗ5З80.
Самозапліднення рослин Е; для отримання нащадків Е2
Показову групу рослин Е;, описаних вище, самозапилювали для отримання нащадків ЕР». У
Б Таблиці 5 перераховані рослини, які відбирали, і фенотип і генотип Е:. Відібрані рослини РЕ: вирощували в теплиці при довжині світлового дня 16:88 годин, з денними і нічними температурами в діапазоні 22-242Сб. Коли первинне квіткове стебло починало довшати і утворювати бутони, рослину цілюом накривали мішечком для самозапилення, щоб запобігти випадковому схрещуванню. Насіння, отримане в результаті самозапилення, збирали приблизно через вісім тижнів після висаджування рослин. Насіння самозапилених рослин збирали і вміщували в грунт. Отримувані популяції Рг вирощували в теплиці в умовах, описаних вище.
Рослини Ег: аналізували на подальшу делецію трансгену і успадковуваність делеції, яка була охарактеризована в рослинах Н..
Приклад М. Отримання і відбір рослин Т
Аналіз нащадків ЕР» на трансген і успадковуваність делеції
Аналіз О5
Рослини г перевіряли на експресію ОЗ за допомогою гістохімічного фарбування матеріалу листя. Рослини тестували з використанням протоколу, описаного вище (Перевірка експресії 505). Результати представлені в Таблиці 5. Результати експресії 505, отримані в рослинах Е»г, відповідали очікуваним результатам. Рослини Ні, які ідентифікували, як такі, що містять вирізану касету експресії РТ 505, виробляли рослини Ег, які були 10095 5И5- негативними, що підтверджували гістохімічним фарбуванням. Відсутність експресії 505 у вказаних рослинах Ро підтверджує результати, отримані з Еї, що дозволяє передбачити, що касета експресії РТО СИ5 вирізана з допомогою делеції трансгену, опосередковуваної нуклеазою «цинкові пальці». Крім того, отримані результати є прикладом успадковуваності трансгену, що видаляється в подальшій генерації.
Сибс-нуль контрольні рослини експресували ЗИ приблизно у 7595 потомства РЕ». Інші рослини (приблизно 2595), в яких ЗИ на виявляли за допомогою гістохімічного фарбування, були очікуваними. Передбачається, що касета експресії РТО 505 сегрегує в популяції Е2 в
Зо очікуваному відношенні 3:1. Химерні «події», які містили вирізані і невирізані касети експресії
РТИ БИ» в Ні, сегрегували в межах Р». Більшість рослин експресували 55.
Таблиця 5
Експресія ЗИ5 в нащадках Ег2
Схрещування Позначення Молекулярний/фенотипічний й НН т аОБІЖ СО я схрещування опис РІ щ ня - тестуються 5380-46-1-15 . . 5381-49-1-10-003 | Вирізаний 55 яв | о |в 5381-49-1-10 . . 5380-3-1-6 . . 5380-46-1-15 . . 5380-46-1-15 . . 5381-49-1-10-021 | Вирізаний ув ат | о рят 5381-49-1-10 . . 5381-49-1-16 . . 5380-46-1-15 . . 5380-18-1-22(5381-49- . 5381-56-1-6(нуль) 214 (5380-46-1-23.010 | Інтактний/5И5 (нуль) 480 377 | 102
Таблиця 5
Експресія ЗИ5 в нащадках Ег2
Схрещування Позначення Молекулярний/фенотипічний й НН я вОБІЖХ 105 я схрещування опис РІ щ ня - тестуються 5381-49-1-14(нуль) . 292 5З80-18-1-22.013 Інтактний/5О5-- (нуль) 481 370 111 5380-46-1-15 . 5381-18-1-17 . 5381-18-1-17 .
БЗ8О-18-1-22.020 | Химерний ЗОВ 5381-18-1-17 . 5380-46-1-15 .
Аналіз ЕГІ5ЗА з використанням зеленого флуоресцентного білка
Відібрані рослини Е2 тестували на експресію СЕР методом ЕЇІЗА з використанням протоколу, описаного вище (Кількісний аналіз експресії СЕР). Результати експресії СЕР в рослинах Р»: відповідали очікуваним результатам. Рослини Еї експресували СЕР приблизно в 75 95 потомства РЕ». Інші рослини (приблизно 25 95), в яких не виявляли СЕР з допомогою ЕГІ5А, були очікуваними. Передбачається, що касета експресії РТО СЕР сегрегує в популяції Е2 в очікуваному відношенні 3:1. Химерні "події", які містили вирізані і невирізані касети експресії
РТ ОБР в ЕТ, сегрегували в Р». Більшість рослин експресувало СЕР.
ПЛР, Саузерн-блотинг, і аналіз СЕР в потомстві Е2
Шістнадцять рослин, отриманих в результаті трьох схрещувань, перерахованих в Таблиці 5 (що являють собою нащадків з вирізаним геном, інтактних нащадків і химерних нащадків) зберігали для подальшого молекулярного аналізу. Вказані шістнадцять рослин включали вісім рослин, які були (зИ5-позитивними, і вісім рослин, які були (05-негативними по відношенню до контролю сибс-нуль і химерних рослин. Протоколи, описані вище (Саузерн-блотинг; і аналіз
ПЛР одиниці транскрипції рослини), повторювали з геномною ДНК рослин РЕ». Відібрані рослини
Ег тестували на експресію СЕР з допомогою ЕГІ5ЗА з використанням протоколу, описаного вище (Кількісний аналіз експресії СЕР). Молекулярні дані підтверджують, що рослини, які не експресували СИ5, не містять інтактної касети експресії РТО (305. Експресія СЕР сегрегувалась, як очікувалося. Результати подані на Фіг. 8-13.
Незважаючи на те, що ряд ілюстративних аспектів і варіантів здійснення обговорювався вище, фахівцям в даній галузі будуть зрозумілі їх певні модифікації, перетворення, доповнення і субкомбінації. Таким чином, потрібно розуміти, що нижченаведена формула винаходу і пункти формули винаходу, привнесені надалі, тлумачаться як такі, що включають в себе всі такі модифікації, перетворення, доповнення і субкомбінації, оскільки вони відповідають суті і об'єму винаходу.
Посилання, що обговорюються в описі, надаються виключно для їх розкриття до дати реєстрації даної заявки. В описі немає нічого, що потрібно розглядати як визнання, що автори не мають права датувати заднім числом таке розкриття внаслідок попереднього винаходу.
БЕБЕЛІК: ПОСЛІДОВНОСТЕИ «1102 БПом ддтобсіевсев
Вивавеії1, Веап
Рехоїїпо, доверц Е. «1250 ВИРІЗАННЯ ТРАБССВНІВ В КЕКЕНИТИчНЦО ЗМІНЕНИХ ОРГАНІЗМАХ ка ше ВВЯ З 1РО «1605: 15 ті70м Патент о в'взорсїх 35 «їй» 1 «жі» 3 «219 ДНЕ «132 Штучна поспідовність «ах» «ка3» діпника зв'язування КМ СС «4005 1 з5опдтвагробЕ сасосруата авесгусавза де 33 ка я «її ЯЗ «кіз ДНК «--ах Штучна песлідовніств сах «2235 послідовність гена нуклеази "цинкові пальці" ССМ5 ча» г асодзстссав здовазвочав ззазсстазс адуЗачссазч ссаузазУуєс аассбасаосу - заччсууста босасодаує зсосяссусї абздоссозоа сусоссосса Ясчксааоє 125 кчсасасоба асосоварца ссчссссаас содссоодос взсасососао сбасасачто 180 чачаачесЕк СІЗО аз сагсбцсоду асцаачессоа ссасогескс гавосоувяє йо ссссакасов асасзсаєсвс здодаєсстсво авдссстсес адсосеЗаве стлпсаєасуїє З аастссваєс детессдасаа сссоадсосЯс сасабссосав соовзсасаця сувчавосое зо тесЧдесеЧЕТГ асзтЕсоасЯад ЯвоаЧчавуво оссавосособ дозасссдає сепосавучєє 42 сгачсуссасоа ссусосвдеЯ зепвтссога ОсСтуєячаває садааєсоуза зуааагазау тва посадаусста Засасаазьс чевуесОо сеасасазає абаєсоаасо Євбодадаєє 545 чевазцавої савсасводца сачуаессесо завовосавод касове сіссаєствай що псаїасолає зразчсачавве совостсуу: сакпстадув евоссочесооа босвавсево або зсіЧечсааяЕ свзосіавєцча сстасочечск асссучавка савачоесвса сеосасечов Зо
Бгасазсс бус сазесазаса зассовсуаа апочЧазчасає асчсузвасе зазвсовавсх тво ачазасазває асгсзаєссс авасдазсчу сузчавчосис вісссрсасс сабкасваа 549 тжсавастсс бтсесабасо содасаєссекс аадодссаеноє збазасаба спсбяссвоу 00
Еругассаса сстасваатєо сеасчоксою псоссобсвао ссувачаось сксуассада 960 азкчФазаєча ссавуусася аасавстстаск сСтасвочаво сСсаЗаачава зсксваасває 12720 ччсдаавсса взсуттатасєс Судсдссеза чадучсадад час аасаєбсаде 1080 часчссчадчу асаавсссосод ссостасчасо зсбссавоса зосасдазвуча дсставсаде 114 чзачесваста чазадксава засада дедотаєос асоачадевосс спассускаєу 1200 щесзасачнє сосббссачсо ссопасессас всоссодавеє бсвзодсадова соавоваєссто: 1250 пчсогасаса сссасаєсса сасадосчас вадсстеєба ссоцісчвсатї БсЧсачовоо 17259 взасстоссс вадзадастсав себосатасс басассавоа ссобсасвсссо асавчавоєсо 1559 сіЕссвусоса Чаавососас чЧазавастсо бссосасосоа всабоссава Соадоасасх 1450 авччасросвсв сслчоасаав всостксоес Сзсавсарсс чсосдесасва ВЕС ссВ 1520 саседссвсоо ддасзасаєв ссдосовасояс басоувядес сусудаовсо сезасесасу їЇ5КО вавксачазс: сочавоаауаз задусссчво сосбсаздасвса азосочввцва соссссвосвЕ 1621 чвасгасаксо васттаєсза чаксодосауд аасссавсає ауддаєвуває єЕкоЧасзака 1650 заспоссасов аогессогсває чазачсосас дуахасваЗЧ овазусаєссе сбодеЕЧаЕсЕ їі ацдозаасстоа абостасав сбасасєоба поуабсвоста сосастякозу боббатсоеа ї80а чагсасвавоає салаєссстча СЗзЧпаєсасаає єБоссветсу пасавассов сдаваєсоасву 1853 зазбарусуз васзоадсся авскацазас азасаєзтка зкссазаєоча зсочспоаза то чЧчевгассстт сасотасіває адаусксава сСссскесккЯа саЯсесоацаса составуЗУє 13850 австасааза сзсачессас стачастовас сасвазасав агкзсвакоб Кассукаїки 2040 гсадссоває здстсссовЕ сочачогсаав аксозесваду садуавсасву Касктобозад -100 пазвпссацдаа даавастова свасудєсав ахевавксе Аза «2105 З «її» 29 «йІйВ дцк «РІ» Штучна послідеовеаафсвь «вх «йез» Праймев ТОБАТЕ «а З асалцвчеЯа аседзЕдасс БгадападЧеє 2 «і» 4 «ввіз ай «рій ДНК «213». Штучна поспіДдОВвнастЬ «ша «235 Праймер ТОРАТА.
«а» а стЕсдаєуесє тата дасво чтавасаці 25
«ш1Ож 5 чиї 29 жі2» ДЕК
«13» Штучна спослідовність
«ВаИхМ
«ее» праймер ТОРАТКО
«час о часов атач ссзусасхус сво З
«Тйх 6
«ЕТї1з Зо
«2125 дик
«213» Штучна Ммосдавнисть
«шо
«веж праймер ТОРАБЕ
«002 6 жассасчась сузвеетеоа сачбовсеса 8.
«10 7
«кві ВВ.
«ті2» ДНК
«Ша» ЩЧтучзна послідовність
«20
«Бо3» праймаеюв ТОРАТА
«005 7 чачсачїсса вактссуасс ска В
«ах» В
-821ї5: (33
«192 ДНК
«гій Штучва посліІДОВНАСТЬ
«Войх
«223» праймер ТОРАБТО
«0» 8 звассасас взпааоусссос СеЕхжЕсівис авЕ 33
«вії 19
«ва» ДНК к«е13з Штучна послідовність
«й
«ша» праймер БРЕД
«поз 8 асзаєтасас дЧостдасгє 18
«й 1 «ії» 18 «тій» НК «213» Штучна послідовність «920 «иа» праймею ПРТОА «(м 10 аукаєсвосі свесуала ІВ «Ох ЛІ «тіїж 19 «рт» ДНК
Че Штуєна послІДОВНа СТЬ «г «иа» праймер ЯРТКО сей 1 висчЕчЗасач асзасарося ІЗ «10 19. «117» 21 «рія ДИКЕ сеї3» Штучна послідовність «вах «гаЗ» праймер Бокі ПРЕ КЕ «оз те стазгачеЕЧа заччспсасе с 254 «атох 13 ки» 23 «10» дик «13 екучна постідовністе же» каРаз праймер КОКІ ПРЕ К кад» 13 задстсосасі стаз сяас сестра ве «а СК «2117 81 «вїй» днк «13» Штучна посліудовнаісті: «еко «вва» прайщмев» ВІАСТЯЗЕ «ОР» 14 шссачассає зссбовабасю Є ах «210з 158 «2115 7 «2122 ДНК «213 Штучна послідовність
«гг «СЕЗ» праймер ВХгАСТЯЗА «00» 15 павазчсоЯсас абссотсаса 4 21 «210ж 16 «2115 74 «кі2» ДНК «213» Штучна послідовнасть «ай «еи3» Прямий праймер ПИВ о для аналіву ПЛ ВТО «айй» 15 сазустовяс Едаздасаси сксео Я «ріпй» 17 «811 2 «оі2» ДНК «їх Штучна Зосльдовнасть ких «ве3» Зворосвий праймер ЛЛР для аналізу ПЛР ОКтТО «Ох 17 стсуцававсга чЧеЕучссвова се ще «2105 ТВ «ії» 28 «213 ШЩевучна послідовність «ве «гра» праймер ВУАСТКО «00» 18 севссоаЯЧссо гастаєсоос аЕсобусе 28

Claims (5)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, згідно з яким: надають першу життєздатну рослину, що містить геномну ДНК, де геномна ДНК містить ділянку ДНК ії першу послідовність розпізнавання, що фланкує З'-кінець, і другу послідовність розпізнавання, що фланкує 5'-кінець ділянки ДНК, де перша послідовність розпізнавання і друга послідовність розпізнавання ідентичні; вводять ДНК, яка кодує нуклеазу "цинкові пальці" у другу життєздатну рослину, в якій нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована таким чином, щоби розщепити геномну ДНК в послідовності розпізнавання, і де нуклеаза "цинкові пальці" функціонально зв'язана з тканиноспецифічним промотором, специфічним для стадії розвитку; схрещують першу і другу життєздатні рослини, так що насінина КЕ: продукується або на першій, або на другій життєздатній рослині, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК насінини Н.; і вирощують одержувану рослину Е:ї, що містить геномну ДНК, де ділянка ДНК відсутня в геномній ДНК пилку і/або насінини рослини Н..
2. Трансгенна рослина, отримана способом за п. 1, де трансгенна рослина містить ділянку ДНК в тканині, відмінній від пилку і/або насінини.
3. Виділена молекула нуклеїнової кислоти, що містить: промотор; і послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу "цинкові пальці», де промотор функціонально пов'язаний з послідовністю нуклеїнової кислоти, що кодує нуклеазу "цинкові пальці", де промотор вибраний з групи, яка складається з: промотору, специфічного для пилку, промотору, специфічного для насіння, і промотору, специфічного для стадії розвитку, і де послідовність нуклеїнової кислоти фланкована сайтами розщеплення нуклеази "цинкові пальці", де молекула являє собою вектор.
4. Спосіб одержання трансгенної рослини, за яким: трансформують рослинну клітину або рослинну тканину виділеною молекулою нуклеїнової кислоти за п. 3; і регенерують цілу рослину.
5. Спосіб видалення ділянки ДНК в рослині, яка містить молекулу нуклеїнової кислоти, за яким: надають першу послідовність нуклеїнової кислоти, розпізнаваної нуклеазою "цинкові пальці"; надають касету експресії гену селектованого маркера; надають другу послідовність нуклеїнової кислоти, яка розпізнається нуклеазою "цинкові пальці", де селектований маркер фланкований першою і другою послідовностями нуклеїнової кислоти, які розпізнаються нуклеазою "цинкові пальці", і де перша послідовність нуклеїнової кислоти і друга послідовність нуклеїнової кислоти фланковані гомологічними послідовностями; вводять нуклеазу "цинкові пальці" у життєздатну рослинну клітину, де нуклеаза "цинкові пальці" сконструйована для розщеплення геномної ДНК в першій та другій послідовностях нуклеїнових кислот; експресують нуклеазу "цинкові пальці" тканиноспецифічним або специфічним для стадії розвитку чином; і застосовують нуклеазу "цинкові пальці"! для видалення ділянки ДНК в пилку і/або насінині рослини, в результаті чого селектований маркер відсутній в геномній ДНК в пилку і/або насінині рослини.
б. Спосіб за п. 5, в якому кожну половину мономера нуклеази "цинкові пальці" експресують окремо, і при з'єднанні одна з одною вони разом утворюють функціональний комплекс.
те екс виш я киш ЩА Више В УТ ЕІ 5 що о м Що СОМ ЧЕ ІЗ : й и й овен чик чи вки М ке - Ж АВЛНорен Е с рОАВН279 і ще сбжко кесх . ЖЕ ГК Ай щ сани Ен. ік з чаю і. шен в.
МН -Я в КК ж ще В , ОМ -х й Б ії Й ктнвенх вартно Я сво зе - й КК мк дженнях АКНЕ ОоК я ї 5 ж Й я АВНОІВ реа? НМ она паля і кое ни У ськ ВА п угона Кові й і і за ї х ТА Поч А НІ ї с а ІН а Я же - ; хи чЧіг. і викна нні мем лани у х ї яка ; х В Е і Е х і ї х х Я Ремсюеєт. Ь дв є пня ді ль ная зи М ьо щу ие - 6 я » Я - В й шк шо Кави жілче ще змов канва ше І й а іде о Сеніна У з. МОМ вена сао КВ сх оте : їь ЕЕ ИН и х яв Я У не - й
Фіг. Тиго щи У2 дшОВКаЗ ЗТ мі Й ДІдсі? ргойюєєма 1 Вер Молб шо без сне ВІНІНО ті ГОР АШЬИО реотоюгуй сс ВІМОІМО ВІТЕ / я й | ' | | РАТ УЗ Вефію мат І аювморіютови | 10100000 лов ут КВ? МАК УЗ і | і | і Ї ! ! І Мій кносв) й 4 ! те с у ; НИ: мав ОО) нар ГО ОМА Воміега тома вомаа| Моро | ! ОО умуонюу жодна енканнй жен нн кв ши шк ще | «епфнінаткісннввавидну» ев роАБ5380 зу5 Вр
ФІГ. З
7.0 Кк шинсннятчявтняачктвитткжтянняляєттнячня КВ ; М ме! Ме х х : т Моя НЯ КИМ дно с Б ВККю Я шашок ше АН ГИ знанні пня тінню юнантнноссть ИЗАВОТІЯ ЕМО пенесняннвтеютеннияння рпАВВгтУ у д Я й ;. їЖр- о 34 17 16 25 35 я 4 49 59 52 55 МТ РівЯ кою еВ КК ор КК оон ну ово КВ т ке хх о ве Ко рн Кн м ке Кен о кн во оо ВА ОНКО п и Он В и и вн шк и пу и ни А о У уж и АН КІ Ух у ВОМ и и М гу п нн в ЧИ и у о о НН А в Саузеря-блотни: РІ: розщеплення МЛМ; що виявляється за депомоатокьраєі ве
Фіг. 4 АвювезУОтня то ЕК ; Ї І ЗВОДУ МУЗ ї і й ї І Оргдетня | з 4 Ї таА ваеяв 1 Гу ее погум | т Орафжз МІЯ. | | ! І | дионри у тиме - Кі зр ЕЇ у зни -ня СУМУ ротом. | ще Ї Р дено Ме Ціооу | шини | ВИВІЗ ресів У? ! Г лонд вок А Я 1 і ї . . Кі | і І | Н 17 дяк з ТОМА Вжкбег В КЕ ! нелія і Гуметені я ї ці 1 Н Н - Н і |! їз ей. І і Й і : й сооЙК осонні ний Е у з їй Ж я родео381 зажі во з 44 Фіг; а кь паща на нн у о а ин У й Ліз Ме м ов3: 3 г1емМи р РО пенаннотнвотомсоконяо ВО АНОВОЇ Емепів нонкнннннянноннєнннян РОДВОБОХ 1ікож 14 5 085 35 32 30 41 45 39 54 45 56 МТ Різак ру уст ий ж сел ЕК фу шт и ФЛ, бо; ж жит Же аж Курт КИ ще ев я у ен вия но о пн Ва -х по ши нКг гпаитю: Ббкемчтп же я я пи Ж Би ж р м шо Ка ня ее ик ав ти ов тат и ВАС и паштет НК ВВ сажки ЮЕ ото и Беккі ВО фе Ше ско ми кН НВ ие и у Те В п рот Б ші анна нн ян кни в я АН ке Ер ВВ Ему тт тра ке хх Кол ел три | пд му я І с пай гі те ов ех ок ОМ ноут вис т ща и ин и а и МН я ЖЕКи люк ях КЕ стра ф кре ик ра КАК Саузерн-блотцни РТ: розщеплення МайЛиеї, що виявляється за допомогою Прі
Фіг. 4Ь і У, с | ТК З КЕЖЕКНИ Де МК п. ІБН ВИКО -явї Я МНЕ с ОВС ВИК В г с с коле с ЗД В лою НМЬ ВИН п Й се нен о. о. ванаюм а с ВУВГМЬ Я ВКА . о с о. СЕ в с кВ ЕЕ о о вічно с ко з п і Що 6 я п яв. ТА ІТК. й І й і с о інв деВОВН я ВТ Чан
Нє Бони нн у ваві-яв- кеВ ав тя 101010 пюзлаьевілолною а. 0 БНО 1110011 пеоелаєюнюзост о п, | 0 Бав-49-1-10х5380-46- 115015 10 не мевновіої 00000 рН и МЮУ 10010 пзнеленуютьнкаою 0001 буовллеввовавом о о с о о о ї п ваві-ла іа (пох ово ів ного Ех БІВ В- 1 17хвЗВВ ав БО. 011111 пеерквмелозою НЕ Ванни 0 озолвилеаєвіваятом союз 1111 о» п а її я В Є Е Е В я
Фіг. 6
КБУ А п в в в п м ЗНО ВО В ОО о о в В В КК ВН те ло ев во мно во АК ВЕ о зе ее в в В о В Є нн А о в У Ен НЕ ВО ОК я МР п т Ж ті яежх тт Ж соду зх зєси сх Ж оку тт Куди птн ех жах жи нн В М М зе зв М М о о о м Ми»: м БО ОО КО В ОО БВ ОО ОН о Еш НН С В В С С С В о Жак на В Б ОП нн и мое пе Бо ее о ие в ее от в ке о в в завча ли кока ооо Ко Ко в ОН ВЕукІЗ ВОМ ОВ МО ВТ ОК ВО В ОВ ТНК Е5 Ма КЕ НЯ Домежожжютько жк жеже яю уж дж дю ду хх хх КА жо яж ку ж жи жи ЖЖ ло ХУ ЖЖ КУ ХУ Жь КАЖУ Кк КУ ЖА я дя кт КА хх Кк» ЖЖ хх дя Кн КА п уж ж чж уд м очи Кк джу уж кож Ж дж хв у пк дж кжнь КОСІ З в о В Ов я БЕ ке ВК БОЮТ О О ЕВЕК ВН Б БЕНОБ5 не и нн а рес не вав звж» ЗОБОВ ОО А КЕ В АВ ВО В КВ КВК В КН КК ск ВОК ве НО шо ни о о о нн о м М М я нн В М М В В В Я ен в я аву св ВВ В Б о о п Б С НН о о в В он ВИС КО З С ОК ВК ЗК ОО В ОК С В В В В КО КВ ЗО ОК їх ЦЕ що рат ю ут хеє те п осук ЖТАЖТгІ ЖАЄ лек У КТ Ж ХУ СУК Ж ю т тро ку кут тех я в и В В ОО В СО В В ОО ОК СВ СВУ ве п п ,,,,....оЦСЦССС ЦЮ с нини М не в о п В В ок В КК ВК ша ДЖ ек мотелі лк мету чук окт суку жк Мч Ж мкл Ко чн Чи ма Кк р ЧА я чи ЗА МА Хе чл КАХ ЧА Му чук ЧК Чт чн ЗК нй Уют сю ТК ЕІ НА В в В и В В В В В Оу веБ ТУ: ВИКО ОО асо хво ее ВО ОБ ЗО В У Ши и на нн В М В ККУ ман Я ен ен М я ЗвЕеме сім БАСВОМОВ КЕ ВА ОВ ОН КН ЕКО Кв ЕК КН вен ем ЕНН з ЗБ ОО ПП ОО
ФНг. В кв - ЕЕ ЗІЗ Ех ен ни НК КК п п в п о ах СКМ ТА кожи «ж КУЧМИ В АК у КИ ВК КК І Ю Же й ЗМК ВК ВВ яке КБ ОК ОК УК МВВ НН М й 7 о т ЗЛАК КК МАКАХ я сх ЗюМЕК х сок ЕК КК . ДЖЕ ід лес ЖК КОЖ ку, В ОІВ Хх КК ВА сви «МК ЖК, уж Ж Ж КК жи хкЖ ск ЖК ШО ходи нн о я дон» - АВ ЕК МО ЗОБУ М и НИ в М КН В НЕ ЕН В а нн ОВК КК КО М Соова міч тах МЕЖ КК ху о ОК КК дою муку мк лу ок т т А Ж да Звук деки кими сх ВЕНИ аа ОО КК ОК ДІДОМ ян ут тю Же юань ще Ка: Жро унчамюк» дж ХМК ЖК я де МЕЖА «КА ЖУК, ЖК МК ЗК КНЖУЖ ЖУК ЧАК ЧР Кн КК КОЖ ЖЖ ЖЖ Ки Жим ХК ЧА КК ЖУК ЖК ЖИ ХУЖУ й ЖЖ дюЖх Ки ЧК Ж КАЖУ Меч Ж ик їаех ду: ВЕК КВ ок т КК КЕКВ КВК Я сек ; Я сю ; аж їх ЕЕ ОКО З В Зах а Я ОО МЕТІ КА КО ФР ЖАУАИ ДИКККК Во ву КВ дк ле КАНА КА Ж ще ФІ УКВ КК кн З: ОККО нен нн Кия Ки иихИНи ПИ - енер (ще тах а МОХ КОКО ке КК КК КМ УК о оохоюто схе КОКО КВ В хвою МА ТЕМ ВМІВ о НИ В в в В В З а о В Со ІЕЕ КИ КК Я коки шко «ЖЖ меж жук же ЖК ЗЕМ ввяє ВИК КО ОК МТ ОД по ежннеюнюют вет ке котюх хюкнвютюютя КЕ УК Ж. ВЕРОФК КК око кіт сок ОК ТКУ КК КОЖ она маку млин зум кн т п АК ЛАК ДАКАУАА (А АНА КА М чАКтК змо НН се Ес нн В ВО зай ще ВО КС ОВК КК В КО КТ В ЕВ ОО я о І НН щен СЕ МОСК КК ВК я ве Б ОО ОО В ВК А ВК КА жи З ОКХ КМУ ККУ до КК КО МК укоси ко косе єю окон Марку БЕБІ ОКУ КК ОК ої МКМ ОМ ТиА пи ИН НИННВНИН Я ТІ КРОК КК дян ВК КК КК КК КК УК сн В ВК КК МКК ден вх вени в а ОО ІМ п В ОО Па Б Кок ЖЕ В зх 1235 хндумюлнкнику кни М АД АК КАК ЖУК Ж ДАНА КУН КАТЮ ККУ юю КНУ Кен о кит ке ВМ КК МК Ек Кк шух Х дів КОЛУ х УКВ МИ Ки В КУКИ и В ЕІ ку КВ ЗИЖИ КО КК Мужик ж дю жк докжлжк а же ж ж ви вв КЕ НЕОН в и КН КВ о В КЕКВ о о В КК Ме ЖЖ: о омоохухмум мм уже М М Ж кю ХК ММ ММ МДУ «МОМ КУ МУМІ М ХМ ММ А ХУХЮЄЬ М ММ МУК ов Юм КАК ХУ ДЛ МКМ ХУ МУЖА хх ой КУТА в Ам Мо ут ЕХ; Я ІД пуху юттєють тех зккллт тК х т я учи т пкт ех уд ок КАкідн чуми ла іх ник уки Ж ЖЖ КК КА ЖЕ КА мА ОК ЖК одн «жкж муку КК КЖ жк КК ж КУ З ЩІ мує оюлтюую м аж єююк, юю ких зюкхюья юку клю ок КАТЮ ю ММК ЮК ЧА УМСА ТК ККЖ АХА У КАК КА КАТЮ УК УМ «КК ККАЛ ЖУКА Ки кт ша ЕМВ ех ЕД кеклеюухкююк кю ук хх иа ЖК УК ЖУК МК ЖЮЧК ТЯ ХК ОК ОКОХ УКХ ХК ХК КК хх ЗК ХЕХКХК ЧЕК МКК, хек Ки ОКХ ХК ККУ ЖУК Кк ХК ХМК оо хокею М мк ом
В. я ХЕ -Е ДЖЕ лежав жук Ж дек му ми юю вх в ЖК ХА ЖЖ іл пдТЮЖ дум ЖЖ Ж Ж дк Ж КУ Ж КВК Ж УЖ ККУ Ж ЖЖ Ж КАСІ ЖИ ЖИ чук «Ж Ж ЖЖ Ж кЖ Ж Ух и ЖЖ ЖЖ Ж Ж, ЖК Кю дк жк кн С МИ Де Х ТЕ ШК слежунжежеж юю жк оюкукт нижню кк кжеж ЖиЖ ЖЖ жююя АХ ЖМХЖЮ КУ я КК СК ЖЖ ХХХ КК МКК Ж ЖЖ ХКУХ ЮЛ Ж КК М КК в АЮ Ж УЖ мюжкя ККУ єю тю июня УЖ
ЖЕ. КВ ум тт жмут куток мук АК КК КАоли ДАМА УК Мини КУЧХ СКК ЖК АСК А и К КкХ уми ХХХ КК ЖЖ Кук сюкнцдижнм ЖкАкхКН МОЖ ЗНО ЕХ ЖЕД хеенкуєюмкьюю в ккк худих юку вх» хх К МОСК ХК Ж ХУМУК хх КМ ММ КК КИ ХУ М КИ М УМ ДЕ МОМ думи ДАК КК кА см МКК кА ку жу її КУ пло АК ЛУ КАМ Ж Я ЖК р ді «КЛ МКМ Ж кет КК ЗК АЖ (КК МАЖ АЖ лю «МАСАЖІ Ж УК ЖЖУ ЖАКА ОВКЖ ХМ КК КАЖУ КЖАЖ Ж КВ ТАКИ ЖК Ж МА Ж ЖЖ Ж ЖЖ КАК КАК КЖ КАК К Ж ЖК жи жах ке дБх З І Е Що ху жук ЖК М КК ХУ МІХ» СКК КИ ЖУК ЖК ОК МУ КА ЖК МИХ ЛУК Ж ЖДТУ КУМ АК КУМ УМ Ж КМ МУ АИМ КУМ МУК УУУУ УНК КУКА ЖЖ КИ КА шлак кпк паху й ще жу ВИК ТЕ З, ККЕМ ИН КК ж ТК КК, кож хв хжхв яю МКК ККУ МКК чу вх склоож же сег схоже ЗБЕ ЩЕаЕдІ сек У КО І ОВ кю мок МОВАХ ов ох ни ЖИВА ЖЖ несюднлеттютюєяянютююєюе ках КК КО В У КЕ М НК нн нн ЗНУ щи КК ЕЕ КК МАК КОЮ дах Ж ЖЩЕЩУ меуемсудкюькууєвть ж ку УТ КУ ух УК му і КАЖУЖ ДЖ Сн ЖЖ ци М УААХ КАК Ж КАК Ю яж Ж УК Ж ча мк КК ЖУКА ля с ХУ Ж ЗК ЖЕКу ме Кум юухх КУМ КА мвккк кох щі й їх Ба яд. Мои Храми ти у ви ВИК Ки КІ Ки
МЖК. ПО ОКУ К У КАЖУ я АТХ АОС ОВУ Кк КК КК а ки х ЕЕ т сах У спожи Ж АК КИ ККД ШК ПУ КИ ЖЖ КК КК МИ К КЖ УКХ КІЖ МІХ КУ УЖ ЖУК КІ МТК АК КИТ ІК А МУ ХУММЧ. Лем ща те ЕКО микесххит тк ють АК жу юю км ом МІХ дих дк АРОК мч ЗАТ й А РКК ЖЖ ІК ОНЕУ КОХ Ж, ЧК, ЗНМ ІККОКЬ КК ЖІ КК ЖА Ж Кр КАС Ж ЖК чн «ЖЖ КК ви Ж пк Ж жк ж ЖЖ жах У ХХХ ЖЖ 0 ШЕЖАТУ дулуачачннняюьчач кою доля А ноя «Кік ААУ УХА ЧАНК юю ча дк ЖЦукЖи сх Ус соідмкчим ху «ок ух «медкхикя мскх КК хкум клею ж ук ень кичкухчкою Мк тя їж ЩА й СХ АДА пилкуюттт лит дю вв і юю дм уюю ЛАК МСА УМХ Ж А ХКАЖ УМ СУК КУ КККАУКАЖ УК МИ ЖЖКУ ХХ ІК КЖАЮК ХУ ККУ ЖК ХА ХХ УКХ КК ЖК, Ж Ж УК ох ЖЖ жу жиє. Ти ЗЖЖИХ Жде ІДУ, пухких ооо уки ХЖ ЖУК КК ЖК КАК Ж ЖК ККУ од. МКМ М УМ Ж до о ККУ ТУ КМ ЖУК Ж зе КК КК АК КА ЖК ЗВ 0 ФЕВ, смереки ж ворс ют ловлю ут кт дл тки ЖК ЖІ ХКЖХ ФК уКНХ ЖУХУЖ дух ЖК КК ЖК ФК ЖК ЖК ТК Ж МУ ки жк є У Же де деевм м чечухх ЗЕ ЖЕ: ЗУ п ї ДМЖУ. жк км У КК МКК «У ОККЖ ІК КИ п ОККО ХК юю КИ МИСУ ЗТ УЖ ДИ ККУ МКУ МК КА КАК АК УК МАК АКТА МУК КК УЖ УК М ХК УК КК КК У КАХУ Тл ЗЕ МЕ: т МК. ШМК дююжлчеажююх ючч ж жи чити ов а Ж жи МЖК Ж и ЖЖ ЖЖ Ж ЖК ЖЖ АК ЮК ЖЖ, КК КА Ж ЖК КИ МКК ИЙ юю УК Ж Ж УКХ ЖК УК и ККУ УК Ж Ж ххЖТЖ їж Кх ВЕК ШО; о хосмлвююютєтоау ек ово окт ох депйм м сх пп джу міх ку ком КА дю Мел АК КК ЯК око ДК ХО укН ж Кл ЖКоКУ ки КК ФК «ЖК Ки ЖЖ КУ «Кк ск ХКЖію жикж НК ЕТ 0 ПКД окркнююнк й Кк нн «КК с тн сих УЮ УХХту хо Ж мстх сухо жк: АК тет Ан тут ме ЗК Кк жен мк ЗК о ; х х мех -3 З 0 думі піччи ми кл маю же хі є КАК АМОХАХА МК ЗКУ ЛИ Ж АЖ АЖЮЮ УЖ ЖЖ ЖЖ ЮК, Ж ЖЖ кт я КАЖУ я МКК ОК УЖ ЮК КК ЖК ЖУК ЖК ту юю МАК УЖ и Ж Ж, а Б ВА ТЯ У лехухлюеєтиючучвт ххх метчик ок хе чт чх селам лак Жодвля ЛК лу ди Кам МАКУХА и МАХ кьЖКцх КА УК не к че Чх ХККК ск Кк цк з укужмжек кидки Че кккжню Зд УТА КЕН м ХЕ Хе жд ЖА КК ХК ЮК ЖЖ АТАКА ТИ ЖИ КУ КАТА КК ЖЖ КН КИ КАЖУ ЖК Ж МУК КЕ Ж Ж ЖК ЖУК КК ЖЖ КК ОКО УК УК Ж А ХА КИ ТИ КИ КУ АКА А КК ШТ лЕЖУ ШАХ БУ а ІЙ 5 крем ут ух ми юю й им ую Ту УК У КАК АК ЖУК ЖУК МКК ЖЖ КК ХК УКУК КУ КК В УК ККУ МЖК МКМ МЖК ТКУ УК Ж МУК тю ІИшЕ ЗВКАХ кох у КЗ їз іх би их прОСЧТУВЖЕНОЕ продевження
ЗЕМКООСКНЕ МЕД ТК ХК ВК КВК ВЕК КК КК ОК КО о В ЕК ЕХ ошни пешнннннннннннннннннни І ж Ку; кенежтеннжиюкктє нен тени В ПОД ВК ПТ ЕП о В фу ЕФ змехеннюнннннсст нн он нин С нн БК ФО. сенсеенннннюння с ОНР ВЕ: сееяннннннтяяттятя в и: нин о о ФОВУЦІ ММ» сення ШЕУ ЖУТЬ нженеежееюююттьтьвю ней В ОК СЕ ов ЖШДЩО Кр юю и М ОО інши нн нн
В ЯК»
ями аа ВКМ ках ІЩЕ; хо вх яв-ае за НО:
Зав не ВЕБ зе зв во
ЗЖакаЯ сваха ВККОБЕНКМНЄ шк вух ФНг, ї В кн ер песня нн дн кв пос НА ові ні ес в ов рн ев ну пр МОМ КМ ИМЯ Жим к МАЯК нях акт ков, Би ни нн ЦЦ.Оц г есе ЦЕ ї ВО ря Ме Тмуч Ох ПТУ: вовка рн в ПЕ миши я ЕМ т ле т ОВ : ІЗ я сон ав: п ЕЕ, І.
Не и нн НА о ох о я: ее з Я КЕ Ки ср « Же Ві Б коли Я нн А ВН У М ОО тим мм якому німе Ме ОО я : Ж и щф( ЩЕ 2 ен сі МНН З ВВ МИСІ тик ут м ВЕН а ПИЛОМ а ФЛШУТНО В ШМК о Е. ї ВН я На Баня ЕЛЕ ЛКК ток б Е ооо ШИ Я о вв : Вин В ер ях ї ни : фе ЕК ЕЕ фе КО що ПЕ Бий ї пе нн ох В соток етно ння Ми ар у НН ж ши їх ПОМ они ї ан о і а и я ї В НН ОВ У сну кю Ва а о і ї пн я як 7 р І п нн а В С С оо | КЕ Ок Ж Ва Б. пе ви : пз в : Ел р я о.
В, тихим шин окис теки Я ом ни ЕВ Я Я ї ши нн и ПЕК й ж Н ПЕ НИ КЕ Ко в Кв в.
ВК В а а их і : ви а зе я : МО но и и Ед х ще ни пк В ЕЕ о о Вк ка Кк ВЕНИ кн пи и и ММ ТИМ КЛ І и я вну М І я В : Ме нн ех : НЕОН М 5 пн и о Ин. - і ї он НН й й Ж - Б сфе ШИБКИ фе о Ще Ех КЕ В ВВ ВН: ОКИХ, оо ох НВ дере акті Би ни | ї У в М ВО р р х МН а 0000 т ин о Ж Ку ки ж де в о ОН НАННЯ Ер оо НВ нн КИ / Кк пк БЕ КЕИТИ я ВОНО во жк сек, зак : он і в А В, ї м в Ж а ях ї Борша В о ОВ В Бета о виь ї о нн Ки А КА х пн Ве тео й леж Митник ки НК У комі Сея З КОшно Вин пон 0 й ї кОм Кк З о пи ТМ ВИ ВЖИ ах 5 и КК и ож Е: по ан в ж У ом т ЕК поко о й Ж ОК ми Не ОК Кк а НИВИ НН Фіг, 8
Он ее ОК КК КК СЕ ще сист ОО с. ХК ЗК Е КЗ . с ї Ех пи. с пня ОК сооев с КК ИКМИН; с па СО ОО я с КК ОКО с г с ОО КК ду Я с КЕ В; же с ше МО ОО я с я ПМК ВК ДИКІ ЕЕ вн М УК ППИИИ ПИЖИМКІТИ ОО СИ МОЯ ТИМИ що 5 ПИШИ я ОО с шо с ен п ас ОН ож МКМ Со КК ТИХ ЕНН ВВНВ ИШК ПО ОМ ху, Х. ПИТИ 5 Ко ТЕ Он ЕК СО ОО Я Пе ОО я с ОО -Не ПВНЕК В п у оС о ВІДМ ох МОЯ БУ с я т: ОО а с Я шовк ПЕООК ВЕН ПЕКИ ен с ДО «кд. «Ж ПО У ОО с о БК З ПОКИ ДИН ЗОБІ с ОО КИЕВ ПК Ши Ж с о п КУ В ння ХЕ с ОХ КК оКях СКУ ІЕС Ж с екон су. ОО кА: ОО с о у як па ПЕВ хх Со ОО М В я що ДОК шк КО со ЗО Я КУ я МА сс Со ЕЕ ооо в ПВ ЗВІе я Во ШИ, БК 5. КН ПДВ ПИТИЕ СМ ня сс. ОО Е Воно Ка і кс За Х вн пі с ЯК КОДІВ ПИЛИ. ПЕВ ДДДДДЦДЦДЦДЦДДСЦСЦ С.О Бі с х ЕН її с с я її п о с с Й ЕЕ с не с З с КК» оо щу ОБО ТВО ОО ВОНО пен в вон, ЛК ЕЛЕН ЛИ с пи СЕМЕН пОДВЕИи В ВВ ПК В ОВО ОБ ОО як г о КЕКВ ЛИ ПИШИ пе хв; 5 ШК ЕЕ ЕВ БО с с Ми МИСОК НН ПИШИ У ПЕ ев ВОНК ОО з ПО я ПИ, ОК ПН ПЕВНЕ СИНИ ше ОК КОН ОО х й Я ШЕ с я кі с ЕВ ща ПАЛ По НН ЯкхХ кс а» КК ОО МУ с с шо п ИННЕНН сс СО ОО Я ЗМ ОНяКХХ ОО ОК ЗЕ ОО ПЕКЛО СО В с СУ КК К ОКО ПИ СМИЦИТ, ОК ПМ ПИ ПІ се вн я ин ПЕКОККО Я ПО я Я ОО КЕ в ЗЕ ро ШИХ п с мин с ООЕК НН ТИНИ ОХ ТИКИ ОО СС. що КЕКС т с щк НН За с ОО У» ЛИ ен КИТ ОО ТМ с КОХ я с х с З СОЯ с В ВО с ЗВ шк
НН. ОБО ОУН аа я М Як с є у ща с Ух Оу КК В ОК с КЗ ПО КЕНЕ оС. 5 як ЕХ с п зу кох в х ОО каско ес х Зоя с х МОУ ЕК ОО СО 5 ОО с о по її г НЕО ча ПЕК с ПМ ОО ж ОК ОК ХК оя х: с ОККО КЕ с МЕЖ 0: ХО ХХ о ОКО ОО З ОО ОО с ОО НИ Я с ж ОБО сно с Зоя КК В, МОУ й з ШОВ с с и УЗ ОВ с ас с Я и Я а с с Ж ООН ПО ЕК во о о КО ст п я Ох С ССС ЗХ УМ дова КУХОАнНих КОХ ОК ПИИКИИШМИ КИНЕ ШИНКИНИКИИИИЕ КК ПЕН КН М МИ КК й УК Ос Зоя КУ я я ПЕКИ ПИСК с ОКУ ОВК ня с ня с я с ОО ооо Я 1 с ККУ я ЕК СО ОБ с Я. що с се ОО с ЗОВ п. с с о я КО ОО с КО ПИЛКИ ИН З с НЕ жу ЗА с ОО ЗАВ с Я о с С М с МОЄ Ки ОХ сс о ше с ях СЯ ОО У ДК ПЕОКЕК ОХ ОО ЕЕ КЕШ ую с СО У ДСК КК ЗО я еСОКУ ОО ЗО й с с ТИШІ ИН НК ЕНН НКИ ПИШИ ПИШИ хх ОО ПИ НН ТНК НХ ПИ с ше Н с ОО ТАК с. ТО коя Я с кох ОО 5 ЗЕ с У КЕКККХЕ ОК ОО х и с Ох ЕЕ що с УМ с ОМ КОХ у
0. З ХВ ОО З У ХО СИН ПКЕЕ ОВ ПМК ПИ ЕМ хх ОО ХО . с ОХ ООН У КК жшК ще поко ОНИ СИТІ МІП ЗО ММК М ох ти о» КЕ: ПОПИТИ ОО УКХ ПОПИ З ХХ ж - УК Кк ях Я ОО КО ОО ХК Тих Ж СОЯ с ха ОО КО ЕВ ОХ ОККО Б о ПО ВУ ВО В: ОК с ОО ЗО ОХ Ж МК У ХМ МНК Зх СІК ПУХ ХМ Ве КАК ОХ оо ЗКУ ПК Ух ТИКИ ШЕУ с. е Кок МКК щи ОО ПКНКНЕ с. ОО ПК ОМ МИПЖУТИИИ с МЕ ко жує 3 МКК сад КЕ з МЕ, хх
М.
1 ь 00000 й 3 й ї : М о М ни ПО оком тин тю нлялия 5: о : КК о и 0 ОК КК У т шо єї 0 що : о 0000 : "5 і. : 00000 те" НН ні ж й 16 Е 0 ; 0 ВИМ 0 КВН : кої: : 11 , 0 ж-00 ВИН ЖЖ УСС с 0000 : ОО : КК КВ ВУ ї - її ЕЕ ; ОВО ОО о ВХ : 00000000 ан ПО и В й КОКО Б - З: Ж.
Як у й її 00000000 НН : с а : 11111111 ня 00 Б : кю шь ! Фіг о м неон он овен . пе нн в о сн Яке Ко ок с. с г с МК о. и и вки а я о с в3 с с їй г в с в ЕК и 508 и п пе МК шо я пе
Ж. ше п с вуз Б зо КЕ с пожониВ п ОЕ ша С. пу ще а Е. Бе С ее ММ у Б Ко о шин І вза о Ощ п Ой п п о я о їй с с ввло пох с и о '' с п у и о о. по а. по он о ВВ шен о с 83442 с пи о ПОМ ке пок я п нн сок не й. НЕ Шок КО ю п пом у й о ї о шов 0 п я и а кн я - с с взлв КО о. З ОА сни я и во Й с 0 5 о 5. ее п о у г 1» типа 0 пе о ен я с п п о пед пи Оу ее пе ва а Ох о зовн 83-24 о. с 5 ой Б па ШК н с с вс с 3325 її с о. с 0: перо 5 о т с є а ее У ОН В п я о 0. с о с ВК я -29 і с с Ж шин Моя о 8. поро що оо п ше о в у с с с 8333 по ни Мн х ен КК КВК не ня с я ко о. с о ПО дя її. о с ва ля с я ПН но Мо о ноу Як их Ве пак 0. с нь о п п о ДЕ о ЕК п Я С: с м я я Т с нано о п. ме, с у о и. 2 Шен о о в п сх ов З с я о. п п Я п п о я п. о шах вх 0 і ша п 835 с с о її. о, пк а п ен Кк ок т они кв М Я о Но, о В о я о о, с с во я сн ОО пов СХ к од вю пер ОКО ек ДЯ ; п І Фіг
UAA201210056A 2010-01-22 2011-01-21 Спосіб видалення ділянки днк в рослині UA113493C2 (xx)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29762810P 2010-01-22 2010-01-22
PCT/US2011/022135 WO2011091311A2 (en) 2010-01-22 2011-01-21 Excision of transgenes in genetically modified organisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA113493C2 true UA113493C2 (xx) 2017-02-10

Family

ID=44307617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201210056A UA113493C2 (xx) 2010-01-22 2011-01-21 Спосіб видалення ділянки днк в рослині

Country Status (19)

Country Link
US (3) US9695432B2 (uk)
EP (1) EP2525649B1 (uk)
JP (2) JP2013517774A (uk)
KR (1) KR101951489B1 (uk)
CN (1) CN102843904B (uk)
AR (1) AR079968A1 (uk)
AU (3) AU2011207387B2 (uk)
BR (1) BR112012017896A2 (uk)
CA (1) CA2787674C (uk)
CL (1) CL2012002007A1 (uk)
CO (1) CO6592070A2 (uk)
EA (1) EA031356B1 (uk)
GE (1) GEP201606544B (uk)
IL (2) IL220870A (uk)
MX (1) MX2012008485A (uk)
NZ (1) NZ600546A (uk)
UA (1) UA113493C2 (uk)
WO (1) WO2011091311A2 (uk)
ZA (1) ZA201204519B (uk)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA031322B1 (ru) * 2010-01-22 2018-12-28 Дау Агросайенсиз Ллс Клетка или клеточная линия для экспрессии экзогенных нуклеотидных последовательностей и применение клетки или клеточной линии
EA201391373A1 (ru) 2011-03-23 2014-07-30 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Способы получения сложного локуса трансгенных признаков
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
EP2748323B1 (en) * 2011-08-22 2019-05-01 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome
US9605273B2 (en) 2012-01-23 2017-03-28 Dow Agrosciences Llc Herbicide tolerant cotton event pDAB4468.19.10.3
SG10201702445TA (en) 2012-04-25 2017-04-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
UA119135C2 (uk) * 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
BR102013032129B1 (pt) * 2012-12-13 2022-06-07 Dow Agrosciences Llc Método para identificar a presença de um polinucleotídeo de dna doador exógeno inserido dentro de um único locus genômico eucariótico alvo
BR112015026197B1 (pt) 2013-04-16 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc Método para modificação marcada de um lócus genômico de interesse em uma célula de rato pluripotente
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
JP6649258B2 (ja) 2013-09-04 2020-02-19 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー ドナー挿入を判定するための作物における迅速ターゲッティング解析
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9228207B2 (en) 2013-09-06 2016-01-05 President And Fellows Of Harvard College Switchable gRNAs comprising aptamers
US9322037B2 (en) 2013-09-06 2016-04-26 President And Fellows Of Harvard College Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof
CA2926534A1 (en) 2013-11-04 2015-05-07 Dow Agrosciences Llc A universal donor system for gene targeting
RU2685914C1 (ru) 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
US20150165054A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting caspase-9 point mutations
ES2784754T3 (es) 2014-06-06 2020-09-30 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para modificar un locus objetivo
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
CN108064129A (zh) 2014-09-12 2018-05-22 纳幕尔杜邦公司 玉米和大豆中复合性状基因座的位点特异性整合位点的产生和使用方法
LT3221457T (lt) 2014-11-21 2019-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nukreipiančios genetinės modifikacijos būdai ir kompozicijos, naudojant suporuotas kreipiančiąsias rnr sekas
EP3365357B1 (en) 2015-10-23 2024-02-14 President and Fellows of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
EP3472315A4 (en) 2016-06-20 2019-11-27 Dow Agrosciences LLC METHOD AND COMPOSITIONS FOR PRODUCING TARGETED RECOMBINATION AND BREAKING CONNECTION BETWEEN CHARACTERISTICS
AU2017306676B2 (en) 2016-08-03 2024-02-22 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
CA3043019A1 (en) * 2016-11-21 2018-05-24 Dow Agrosciences Llc Site specific integration of a transgene using intra-genomic recombination via a non-homologous end joining repair pathway
US11634721B2 (en) 2016-12-14 2023-04-25 Dow Agrosciences Llc Reconstruction of site specific nuclease binding sites
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
WO2018165504A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
IL306092A (en) 2017-03-23 2023-11-01 Harvard College Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
JP2020534795A (ja) 2017-07-28 2020-12-03 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ファージによって支援される連続的進化（ｐａｃｅ）を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
JP2022526908A (ja) 2019-03-19 2022-05-27 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
AU2021267940A1 (en) 2020-05-08 2022-12-08 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US11242534B1 (en) 2020-07-31 2022-02-08 Inari Agriculture Technology, Inc. INHT31 transgenic soybean
WO2022026566A1 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Inari Agriculture Technology, Inc. Inir17 transgenic maize
US20240011043A1 (en) * 2020-07-31 2024-01-11 Inari Agriculture Technology, Inc. Generation of plants with improved transgenic loci by genome editing
US11753677B2 (en) 2021-11-10 2023-09-12 Encodia, Inc. Methods for barcoding macromolecules in individual cells

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5352605A (en) 1983-01-17 1994-10-04 Monsanto Company Chimeric genes for transforming plant cells using viral promoters
EP0222493A1 (en) 1985-10-04 1987-05-20 Lubrizol Genetics Inc. TR-based sub-TI plasmids
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5004863B2 (en) 1986-12-03 2000-10-17 Agracetus Genetic engineering of cotton plants and lines
EP0270496B1 (de) 1986-12-05 1993-03-17 Ciba-Geigy Ag Verbessertes Verfahren zur Transformation von pflanzlichen Protoplasten
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US5322938A (en) 1987-01-13 1994-06-21 Monsanto Company DNA sequence for enhancing the efficiency of transcription
US5359142A (en) 1987-01-13 1994-10-25 Monsanto Company Method for enhanced expression of a protein
US5244802A (en) 1987-11-18 1993-09-14 Phytogen Regeneration of cotton
US5416011A (en) 1988-07-22 1995-05-16 Monsanto Company Method for soybean transformation and regeneration
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US6051753A (en) 1989-09-07 2000-04-18 Calgene, Inc. Figwort mosaic virus promoter and uses
ATE196318T1 (de) 1989-10-31 2000-09-15 Monsanto Co Promotor für transgene pflanzen
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
WO1991010725A1 (en) 1990-01-22 1991-07-25 Dekalb Plant Genetics Fertile transgenic corn plants
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
DE69334225D1 (de) 1992-07-07 2008-07-31 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US7060876B2 (en) 1992-07-07 2006-06-13 Japan Tobacco Inc. Method for transforming monocotyledons
US5362865A (en) 1993-09-02 1994-11-08 Monsanto Company Enhanced expression in plants using non-translated leader sequences
AU687863B2 (en) 1993-09-03 1998-03-05 Japan Tobacco Inc. Method of transforming monocotyledon by using scutellum of immature embryo
US5635055A (en) 1994-07-19 1997-06-03 Exxon Research & Engineering Company Membrane process for increasing conversion of catalytic cracking or thermal cracking units (law011)
US5723765A (en) * 1994-08-01 1998-03-03 Delta And Pine Land Co. Control of plant gene expression
EG23907A (en) * 1994-08-01 2007-12-30 Delta & Pine Land Co Control of plant gene expression
US5846797A (en) 1995-10-04 1998-12-08 Calgene, Inc. Cotton transformation
US5773695A (en) 1996-01-26 1998-06-30 North Carolina State University Plant nuclear scaffold attachment region and method for increasing gene expression in transgenic cells
US5850019A (en) 1996-08-06 1998-12-15 University Of Kentucky Research Foundation Promoter (FLt) for the full-length transcript of peanut chlorotic streak caulimovirus (PCLSV) and expression of chimeric genes in plants
JPH11514534A (ja) 1996-09-05 1999-12-14 ユニリーバー・ナームローゼ・ベンノートシヤープ 乳酸菌から誘導される塩誘発プロモーターおよび所望のタンパク質産生のための乳酸菌でのその使用
AU720780B2 (en) 1997-01-20 2000-06-15 Plant Genetic Systems N.V. Pathogen-induced plant promoters
US5981840A (en) 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
US5922564A (en) 1997-02-24 1999-07-13 Performance Plants, Inc. Phosphate-deficiency inducible promoter
CN1301300A (zh) 1998-02-20 2001-06-27 曾尼卡有限公司 花粉特异性启动子
AR014072A1 (es) 1998-02-26 2001-01-31 Pioneer Hi Bred Int Molecula de acido nucleico aislada que tiene una secuencia nucleotidica para un promotor que es capaz de iniciar una transcripcion constitutiva en unacelula de planta, construccion adn, vector, celula huesped, metodo para expresar en forma constitutiva una secuencia nucleotidica heteroloca en una
EP1056862A1 (en) 1998-02-26 2000-12-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Family of maize pr-1 genes and promoters
US6635806B1 (en) 1998-05-14 2003-10-21 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for expression of transgenes in plants
US6307123B1 (en) 1998-05-18 2001-10-23 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for transgene identification
JP2000083680A (ja) 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
CA2359868A1 (en) 1999-01-14 2000-07-20 Monsanto Company Soybean transformation method
US6429357B1 (en) 1999-05-14 2002-08-06 Dekalb Genetics Corp. Rice actin 2 promoter and intron and methods for use thereof
US6232526B1 (en) 1999-05-14 2001-05-15 Dekalb Genetics Corp. Maize A3 promoter and methods for use thereof
US6207879B1 (en) 1999-05-14 2001-03-27 Dekalb Genetics Corporation Maize RS81 promoter and methods for use thereof
US6194636B1 (en) 1999-05-14 2001-02-27 Dekalb Genetics Corp. Maize RS324 promoter and methods for use thereof
US6677503B1 (en) 1999-06-23 2004-01-13 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Sunflower anti-pathogene proteins and genes and their uses
EP1263977A2 (en) * 2000-02-28 2002-12-11 Yale University Methods and compositions to reduce or eliminate transmission of a transgene
US6388170B1 (en) 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
WO2002083867A2 (en) * 2001-04-17 2002-10-24 Icon Genetics, Inc. Ires enabled gene trapping in plants
CA2474486C (en) * 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
WO2003066823A2 (en) * 2002-02-07 2003-08-14 Hybrigene, Inc Prevention of transgene escape in genetically modified perennials
KR100537955B1 (ko) 2003-10-29 2005-12-20 학교법인고려중앙학원 꽃가루 특이적 유전자 발현 프로모터
PT2025756E (pt) 2003-11-18 2011-09-28 Bayer Bioscience Nv Inserção direccionada de adn em plantas
AU2006232828B2 (en) * 2005-04-04 2011-01-27 Bayer Cropscience Nv. Methods and means for removal of a selected DNA sequence
KR101419729B1 (ko) * 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
US7838729B2 (en) 2007-02-26 2010-11-23 Monsanto Technology Llc Chloroplast transit peptides for efficient targeting of DMO and uses thereof
WO2008145757A1 (en) * 2007-05-31 2008-12-04 Vrije Universiteit Brussel Targeted genome modifications in plants
EP2167666A2 (en) 2007-06-29 2010-03-31 Pioneer Hi-Bred International Inc. Methods for altering the genome of a monocot plant cell
EP2205749B1 (en) 2007-09-27 2016-05-18 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
HUE029544T2 (en) 2008-02-29 2017-03-28 Monsanto Technology Llc MON87460 maize plant event and preparations and methods for detecting it
EP2298883B1 (en) * 2008-05-28 2016-07-27 Kyoto University Novel selection marker gene and use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP2525649B1 (en) 2020-01-08
JP2013517774A (ja) 2013-05-20
CN102843904A (zh) 2012-12-26
WO2011091311A3 (en) 2011-11-17
KR20120116494A (ko) 2012-10-22
JP2016144458A (ja) 2016-08-12
US9695432B2 (en) 2017-07-04
AU2017265039A1 (en) 2017-12-07
IL220870A0 (en) 2012-09-24
EP2525649A2 (en) 2012-11-28
AU2015202859A1 (en) 2015-06-18
BR112012017896A2 (pt) 2015-09-01
WO2011091311A2 (en) 2011-07-28
CA2787674A1 (en) 2011-07-28
AU2015202859B2 (en) 2017-10-19
AU2011207387A1 (en) 2012-07-05
JP6420270B2 (ja) 2018-11-07
EA201290678A1 (ru) 2012-12-28
US20190112614A1 (en) 2019-04-18
MX2012008485A (es) 2012-08-17
IL248459B (en) 2018-06-28
CO6592070A2 (es) 2013-01-02
AR079968A1 (es) 2012-02-29
NZ600546A (en) 2014-08-29
ZA201204519B (en) 2013-09-25
CN102843904B (zh) 2015-01-21
IL220870A (en) 2016-11-30
EP2525649A4 (en) 2013-07-31
AU2011207387B2 (en) 2015-02-26
CL2012002007A1 (es) 2012-10-19
KR101951489B1 (ko) 2019-04-22
EA031356B1 (ru) 2018-12-28
CA2787674C (en) 2022-09-06
GEP201606544B (en) 2016-09-26
US20110191877A1 (en) 2011-08-04
US20160257967A1 (en) 2016-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA113493C2 (xx) Спосіб видалення ділянки днк в рослині
JP6833903B2 (ja) アブラナ属の変異アセトヒドロキシ酸シンターゼ遺伝子
RU2667424C2 (ru) Способы и композиции для избирательной регуляции экспрессии белка
US8129588B2 (en) Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue
US20200140874A1 (en) Genome Editing-Based Crop Engineering and Production of Brachytic Plants
AU2010343047B2 (en) Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants
US20150135372A1 (en) Transgenic Plants With Enhanced Agronomic Traits
US20230210075A1 (en) Nucleic Acid Sequence for Detecting Soybean Plant DBN8002 and Detection Method Therefor
EP3713395A1 (en) Modified plants with enhanced traits
CN102725414A (zh) 用于通过在转化过程中诱导bbm提供可育植物的方法
US20210371868A1 (en) Flowering time-regulating gene cmp1 and related constructs and applications thereof
CN110881367A (zh) 一种玉米事件t抗-4及其使用方法
US20220275383A1 (en) Sterile genes and related constructs and applications thereof
EA034044B1 (ru) Устойчивые к засухе растения