UA103917C2 - Застосування sns-595 для лікування суб'єктів з онкологічними захворюваннями, які мають знижену активність brca2 - Google Patents

Description

імунотерапію і їх комбінації. Комбінації включають одночасне, а також послідовне введення.

У деяких варіантах здійснення додатковий терапевтичний засіб вибраний з алкілуючих агентів, антиметаболітів, інгібіторів Аврора-кінази, антагоністів пурину, антагоністів піримідину, отрути перевірочної точки збирання веретена, мітотичних інгібіторів, інгібіторів і отрут топоізомерази І, інгібіторів топоізомерази І, антинеопластичних антибіотиків, нітрозосечовин, комплексів неорганічних іонів, ферментів, гормонів і аналогів гормонів, інгібіторів ЕСЕК (рецепторів епідермального фактора росту), антитіл і похідних антитіл, ІМІЮ (імуномодулюючих лікарських засобів), інгібіторів НОАС (деацетилази гістонів), інгібіторів Всі-2, інгібіторів тирозинкінази, що стимулюється МЕС, інгібіторів

МЕСРБЕР, інгібіторів протеасоми, інгібіторів циклінзалежної кінази, інгібіторів РАБР (полімерази І полі (АДФ-рибози), інгібіторів ароматази і дексаметазону.)

У конкретному варіанті здійснення, комбінована терапія включає введення 5М5-595 і щонайменше одного терапевтичного засобу, вибраного з доцетакселу, таксотеру, вінорелбіну, капецитабіну, доксорубіцину, госереліну, золедронової кислоти, паклітакселу, памідронату, анастрозолу, екземестану, циклофосфаміду, епірубіцину, фулвестранту, летрозолу, гемцитабіну, лейпроліду, філграстиму, 6-С5Е або фактора, стимулюючого колонії гранулоцитів, пегфілграстиму, тореміфену, тамоксифену, бевацизумабу, трастузумабу, 5-фторурацилу, метотрексату, трабектидину, епоетину альфа і дарбепоетину альфа. У іншому варіанті здійснення комбінована терапія включає введення

ЗМ5-595 і засобу, підтримуючого лікування.

Винахід також стосується схем введення, курсів введення і способів застосування 5М5-595 у суб'єктів з онкологічними захворюваннями, що мають порушену активність ВКСА2.

У визначених варіантах здійснення винахід стосується фармацевтичних композицій, що містять

ЗМ5-595 і фармацевтично прийнятний носій, ад'ювант або розріджувач, для лікування суб'єктів з онкологічними захворюваннями, що мають знижену активність ВКСА2. 5. Короткий опис креслень

Фіг. 1 ілюструє інгібування росту клітин китайського хом'ячка, які мутантні відносно ВКСА2 (МС8) і комплементовані відносно функціонального ВКСА2 (МС8-В2) в присутності доксорубіцину.

Фіг. 2 ілюструє інгібування росту клітин МС8 і МС8-В2 в присутності 5М5-595.

Фіг. З ілюструє розростання колонії клітин саркоми людини 0-205 (клітин дикого типу і клітин з виснаженим запасом ВЕСА2 при використанні міРНК (малої інтерферуючої РНК)) після обробки доксорубіцином.

Фіг. 4 ілюструє розростання колонії клітин саркоми людини 0-205 (клітин дикого типу і клітин з виснаженим запасом ВКСА?2 при використанні міРНК) після обробки 5М5-595.

На Фіг. 5 представлений гель-електрофорез в пульсуючому полі (РЕСЕ) для 18-годинного періоду обробки 5М5-595 і доксорубіцином, кожним окремо і при спільній обробці з афідиколіном протягом часу увімкнення 240 секунд.

На Фіг. 6 представлений РЕСОЕ для 24-годинного періоду обробки 5М5-595 і доксорубіцином, кожним окремо і при спільній обробці з афідиколіном протягом часу увімкнення від 60 до 240 секунд.

Фіг. 7 ілюструє відмінності ушкоджуючої ДНК активності 5М5-595 і доксорубіцину, як демонструється продукцією більш дрібних фрагментів ДНК після обробки доксорубіцином, ніж 5М5- 595, для 18-годинного періоду РЕОБЕ.

Фіг. 8 ілюструє відмінності ушкоджуючої ДНК активності 5М5-595 і доксорубіцину, як демонструється продукцією більш дрібних фрагментів ДНК після обробки доксорубіцином, ніж 5М5- 595, для 24-годинного періоду РЕОБЕ.

Фіг. 9 ілюструє ефективність клонування клітин 5РОВ8 після обробка кожним з афідиколіну, 5М5- 595 і доксорубіцину, і кожним з 5М5-595 і доксорубіцину при спільній обробці з афідиколіном.

Фіг. 10 ілюструє частоту реверсії мутації НРЕТ (гена гіпоксантин-гуанін фосфорибозилтрансферази) клітин 5РОВ після обробки афідиколіном, 5М5-595 і доксорубіцином, і кожним з 5М5-595 і доксорубіцину при спільній обробці з афідиколіном. 6. Докладний опис винаходу 6.1 Визначення

Всі технічні і наукові терміни, що використовуються в даному описі, мають таке ж значення, яке звичайно зрозуміле середньому фахівцеві в даній галузі. Всі патенти, заявки, опубліковані заявки і інші публікації повністю включені в даний опис шляхом посилання. У випадку, коли є множина визначень для представленого в даному описі терміну, то, якщо немає інших вказівок, переважне значення мають ті, які наведені в даному розділі.

Використовуваний в даному описі термін "ЗМ5-595" означає (ї)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3-метокси-4- (метиламіно)-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонову кислоту, в також будь- яку іонну форму, солі, сольвати, наприклад, гідрати або інші форми вказаної сполуки, включаючи їх суміші. Таким чином, композиції, що містять ЗМ5-595, можуть включати (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3- метокси-4-(метиламіно)-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонову кислоту або її іонну форму, сіль, сольват, наприклад, гідрат, або іншу форму сполуки. У деяких варіантах здійснення

ЗМ5-595 представлена у вигляді фармацевтично прийнятної солі. У деяких варіантах здійснення 5М5-

595 включає композицію, що складається по суті з (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3-метокси-4-(метиламіно)- 1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонової кислоти, включаючи менше ніж 0,5 95 мас. інших сполук або домішок на основі загальної маси композиції. Такі домішки включають сполуки, що мають кістяк тіазоліл-оксо-нафтиридин-З-карбонової кислоти, такі як (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)- гідрокси-4-метиламіно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-З-карбонова кислота, (к)- 1,4-дигідро-7-((35,45)-3-метоксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3- карбонова кислота і/або //((ї3)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3-гідроксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2- тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонова кислота. Ілюстративні композиції 5М5-595 описані у тимчасовій заявці на патент США Мо 61/141856, повний зміст якої включений в дану заявку шляхом посилання.

Використовуваний в даному описі термін "енантіомерно чиста 5М5-595" стосується 5М5-595, яка по суті не містить ((-)-1,4-дигідро-7-(35,45)-3-метокси-4-(метиламіно)-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2- тіазоліл)-1,8-нафтиридин-З-карбонової кислоти. Іншими словами, енантіомерно чиста 5ЗМ5-595 представляє енантіомерний надлишок «-» форми. Термін "енантіомерно чиста" або "чистий енантіомер" означає, що сполука містить більше ніж приблизно 95 95, 96 Фо, 97 Ус, 98 о, 99 о, 99,5 Об, 99,6 95, 99,7 95, 99,8 95 або 99,9 95 мас. 5М5-595.

Використовувані в даному описі, якщо немає інших вказівок, терміни "лікувати" і "лікування" стосуються полегшення або зменшення тяжкості захворювання або симптому, пов'язаного із захворюванням або станом, що піддається лікуванню.

Використовувані в даному описі терміни "запобігати", "запобігання" і інші форми вказаного слова включають інгібування початку або прогресування захворювання або розладу або симптому конкретного захворювання або розладу. У деяких варіантах здійснення суб'єкти з сімейним анамнезом онкологічних захворювань є кандидатами для застосування профілактичних схем лікування. Загалом, в контексті онкологічних захворювань, термін "запобігання" стосується введення лікарського засобу перед початком ознак або симптомів онкологічного захворювання, зокрема, у суб'єктів, що мають ризик розвитку онкологічного захворювання.

Використовуваний в даному описі, і якщо немає інших вказівок, термін "ведення пацієнта" включає запобігання рецидиву конкретного захворювання або розладу у суб'єкта, який страждав ним, подовження часу ремісії захворювання або розладу, яким страждав суб'єкт, зниження смертності суб'єктів і/або підтримання зниження тяжкості або уникнення симптому, пов'язаного із захворюванням або станом у підлягаючого веденню пацієнта.

Використовуваний в даному описі термін "суб'єкт" означає тварину, звичайно ссавця, включаючи людину. Використовуваний в даному описі термін "пацієнт" означає людину.

Використовуваний в даному описі термін "зразок" або "біологічний зразок" стосується тканини або екстракту, включаючи клітину і фізіологічну рідину, по якій можна одержати інформацію відносно статусу ВКЕСА?2 у суб'єкта за допомогою способів аналізу, відомих в даній галузі. Звичайно, біологічний зразок являє собою зразок крові. Однак зразок може бути взятий з одного або більше з різноманітних джерел у суб'єкта, включаючи зразки біологічних рідин або зразки тканини. Прийнятні зразки тканини включають різні типи пухлинної або злоякісної тканини, тканини органів, такі як зразки, взяті при біопсії. Зразок може оброблятися перед використанням, наприклад, як це відбувається при одержанні плазми з крові, розбавленні в'язких рідин і тому подібних видах обробки. Способи обробки зразка можуть включати фільтрацію, перегонку, екстракцію, концентрацію, інактивацію створюючих перешкоди компонентів, додавання реагентів і тому подібні.

Використовувані в даному описі, якщо немає інших вказівок, терміни "терапевтично ефективна кількість" і "ефективна кількість" сполуки стосуються кількості, достатньої для забезпечення терапевтичної сприятливої дії при лікуванні, профілактиці захворювання і/або веденні пацієнта, що має дане захворювання, для затримки або мінімізації одного або більше симптомів, пов'язаних із захворюванням або розладом, що підлягає лікуванню. Терміни "нерапевтично ефективну кількість" і "ефективну кількість" можуть включати кількість, яка загалом поліпшує терапію, зменшує або усуває симптоми або причини захворювання або розладу або підвищує терапевтичну ефективність іншого терапевтичного засобу.

Використовуваний в даному описі, якщо немає інших вказівок, термін "фармацевтично прийнятна сіль" включає без обмеження сіль кислотної або основної групи, яка може бути присутньою в сполуках за даним винаходом. У визначених кислотних умовах сполука може утворювати широку різноманітність солей з різними неорганічними і органічними кислотами. Кислоти, які можуть використовуватися для одержання фармацевтично прийнятних солей таких основних сполук, являють собою такі, які утворюють солі, що містять фармацевтично прийнятні аніони, включаючи без обмеження ацетат, бензолсульфонат, бензоат, бікарбонат, бітартрат, бромід, кальцію едетат, камсилат, карбонат, хлорид, бромід, йодид, цитрат, дигідрохлорид, едетат, едисилат, естолат, есилат, фумарат, глюцептат, глюконат, глутамат, гліколіларсанілат, гексилрезорцинат, гідрабамін, гідроксинафтоат, ізетіонат, лактат, лактобіонат, малат, малеат, манделат, метансульфонат (мезилат), метилсульфат, мускат, напсилат, нітрат, пантотенат, фосфат/дифосфат, полігалактуронат, саліцилат, стеарат, сукцинат, сульфат, танат, тартрат, теоклат, триетіодид і памоат. У визначених основних умовах, сполука може утворювати основні солі з різними фармакологічно прийнятними катіонами.

Необмежувальні приклади таких солей включають солі лужних або лужноземельних металів і, зокрема, солі кальцію, магнію, натрію, літію, цинку, калію і заліза.

Використовуваний в даному описі, якщо немає інших вказівок, термін "гідрат" означає 5М5-595 або її сіль, яка, крім того, включає стехіометричну або не стехіометричну кількість води, пов'язаної нековалентними міжмолекулярними силами. Гідрати 5М5-595 можуть бути кристалічними або не кристалічними.

Використовуваний в даному описі, якщо немає інших вказівок, термін "сольват" означає сольват, утворений внаслідок асоціації однієї або більше молекул розчинника із сполукою за даним винаходом.

Термін "сольват" включає гідрати (наприклад, моногідрат, дигідрат, тригідрат, тетрагідрат і тому подібні). Сольвати 5М5-595 можуть бути кристалічними або не кристалічними.

Використовувана в даному описі проміжна фраза "що перебувають по суті" обмежує об'єм домагання визначеними матеріалами, і додаткові матеріали суттєвим способом не впливають на основні і нові характеристики заявленого предмета винаходу.

Терміни "спільне введення" або "в комбінації з" включають введення двох або більше терапевтичних засобів (наприклад, 5М5-595 або композиції за даним винаходом і іншого протиракового засобу або іншого активного засобу) або одночасно, або спільно, або послідовно без певних часових меж. У одному варіанті здійснення 5М5-595 і щонайменше один інший засіб присутні в клітині або в організмі суб'єкта в один і той же час або здійснюють свій біологічний або терапевтичний ефект в один і той же час. У одному варіанті здійснення терапевтичні засоби містяться в одній і тій же композиції або стандартній лікарській формі. У іншому варіанті здійснення терапевтичні засоби знаходяться в окремих композиціях або стандартних лікарських формах.

Термін "засіб підтримуючого лікування" стосується будь-якого активного засобу, який лікує, запобігає, справляється або усуває побічний або небажаний ефект лікування 5М5-595 окремо або в комбінації з іншими терапевтичними засобами. Приклади описані в даний заявці. 6.2 5М5-595

Сполука для застосування в способах за даним винаходом, включаючи комбіновану терапію, і в композиціях за даним винаходом, являє собою енантіомерно чисту (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3- метокси-4-(метиламіно)-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-З-карбонову кислоту, яка також відома як 5М5-595 або АС-7352. Радою по номенклатурі лікарських засобів, прийнятою в США (ОБАМС) сполуці привласнена назва "ворелоксин".

ЗМ5-595 має наступну хімічну структуру: (6) і носно М ї - їз сн и

У визначених варіантах здійснення в способах і композиціях за даним винаходом застосовуються фармацевтично прийнятні солі, сольвати, гідрати або проліки ЗМ5-595.

У визначених варіантах здійснення 5М5-595 вводиться у вигляді композиції, що складається по суті з енантіомерно чистої (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3-метокси-4-(метиламіно)-1-піролідиніл|-4-оксо-1- (2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонової кислоти, що включає менше ніж 0,5 95 мас. інших сполук або домішок на основі загальної маси композиції. Такі домішки включають сполуки, що мають кістяк тіазоліл-оксо-нафтиридин-З-карбонової кислоти, такі яко /(ж)-1,4-дигідро-7-(35,45)-гідрокси-4- метиламіно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,85-нафтиридин-3-карбонова кислота, (ж)-1,4-дигідро-7- (35,45)-3-метоксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонова кислота імабо (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3-гідроксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3- карбонова кислота.

ЗМ5-595 може бути одержана способами, відомими фахівцеві в даній галузі, наприклад, відповідно до процедури, описаної в заявці на патент США Мо 12/650390, поданої 30 грудня 2009 р.; міжнародної публікації Мо УМО 2007/146335; патенті США Мо 5817669; і заявці на патент Японії Мо Неї 10-173986, повні змісти яких включені в дану заявку шляхом посилання. Визначені ілюстративні фармацевтичні композиції, що містять 5М5-595, і способи їх застосування описані в заявках на патенти США МоМо 2005/0203120; 2005/0215583; 2006/0025437; 2006/0063795, 2006/0247267 і тимчасових заявках на патенти США МоМо 61/240161, поданої 4 вересня 2009 р., 61/240113, поданої 4 вересня 2009 р., і 61/288213, поданої 18 вересня 2009 р., які повністю включені в даний опис шляхом посилання. 6.3 Способи лікування

Процес гомологічної рекомбінаційний репарації (НЕК) являє собою основний шлях репарації ДНК,

яка діє на двониткові розриви (058) і міжниткові поперечні зшивання. НКК забезпечує механізм безпомилкового видалення пошкодження, присутнього в ДНК, яка була реплікована. Таким чином,

НЕК діє вирішальним способом, в координації з механізмом перевірочних точок контролю 5 і 52, для усунення хромосомних розривів перед тим як відбувається клітинний розподіл. Див. публікацію

Тпотрзоп сеї аї., Миштайоп Незеагсп/Рипдатепіа! апа Моіесшаг Меснапізєт5 ої Миїадепевів, 2001, 477, 131-153.

Злоякісні клітини з мутаціями ВКСА2, що порушує активність ВКСА2, можуть мати порушену гомологічну рекомбінантну репарацію. Без передбачуваного зв'язку з якою-небудь конкретною теорією функції, такі клітини можуть мати більш високу чутливість до лікування 5М5-595, тому що лікування

ЗМ5-595 може привести до збільшення числа двониткових розривів ДНК, які не можуть бути відновлені внаслідок недостатньої НЕК у вказаних клітинах. Аналогічним способом, якщо активність

ВЕКСАЗ в клітинах знижена, в порівнянні з нормальними рівнями, наприклад, наявністю понижувальної регуляції експресії ВКСА2, такі клітини можуть мати більш високу чутливість до 5М5-595. Таким чином, способи за даним винаходом включають лікування, профілактику або ведення суб'єкта з онкологічним захворюванням, наприклад, пацієнта, що має мутацію ВКСА2, введенням терапевтично ефективної кількості 5М5-595. У визначених варіантах здійснення способи включають лікування онкологічних захворювань молочної залози, яєчників, передміхурової залози, підшлункової залози і інших онкологічних захворювань у суб'єкта, такого як пацієнт, у якого виявляється мутація ВКСА2. У одному варіанті здійснення онкологічне захворювання являє собою рак молочної залози у суб'єкта, такого як пацієнтка, у якої виявляється мутація ВКСА2.

У визначених варіантах здійснення способи включають лікування онкологічних захворювань молочної залози, яєчників, передміхурової залози, підшлункової залози і інших онкологічних захворювань, де в злоякісній клітині виявляється мутація ВКСА2. У одному варіанті здійснення онкологічне захворювання являє собою рак молочної залози, де в злоякісній клітині виявляється мутація ВКСА2.

У іншому аспекті винахід стосується способу ідентифікації суб'єкта для лікування 5М5-595, що включає діагностику мутації ВКСА2 у суб'єкта.

У визначених варіантах здійснення способи за даним винаходом включають забезпечення контакту злоякісної клітини у суб'єкта або одержаної у суб'єкта що має мутацію ВЕСА2, з терапевтично ефективною кількістю 5М5-595. Загалом, кількість 5М5-595, що використовується, ефективна для викликання двониткових розривів ДНК. Контакт може відбуватися іп міїго, іп мімо або ех мімо. У одному варіанті здійснення спосіб включає забезпечення контакту злоякісної клітини іп мімо.

У одному варіанті здійснення винахід стосується способу ідентифікації страждаючого онкологічним захворюванням суб'єкта, прийнятного для лікування 5М5-595, що включає: (а) одержання біологічного зразка у кандидата, страждаючого онкологічним захворюванням; (Б) скринінг біологічного зразка для виявлення мутації ВКСА2; і (с) якщо у кандидата є мутація ВКСА2, ідентифікацію кандидата як суб'єкта, що страждає на онкологічні захворювання, прийнятного для лікування 5М5-595. У іншому варіанті здійснення кандидати, ідентифіковані як страждаючі онкологічними захворюваннями суб'єкти, прийнятні для лікування 5М5-595, одержують лікування 5М5-595.

У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу ідентифікації одного або більше страждаючих на онкологічні захворювання суб'єктів, прийнятних для лікування 5М5-595, з множини страждаючих на онкологічні захворювання суб'єктів, що є кандидатами для лікування. Спосіб включає ідентифікацію одного або більше суб'єктів, які страждають на онкологічні захворювання, що мають мутацію ВКСА2, з множини суб'єктів, які страждають на онкологічні захворювання, прийнятних для лікування 5М5-595. У одному варіанті здійснення один або більше прийнятних суб'єктів одержують лікування 5М5-595.

У одному варіанті здійснення один або більше суб'єктів, у яких рівні активності ВКСА2 знаходяться в нормальному діапазоні (або значно не знижені), не одержують лікування 5М5-595. У визначених варіантах здійснення всі суб'єкти, у яких рівні активності ВКСА2 знаходяться в нормальному діапазоні (або значно не знижені), не одержують лікування 5М5-595. Наприклад, суб'єкт, у якого рівень активності ВЕСА2 є нормальним (або значно не знижений), може одержувати лікування з використанням альтернативного терапевтичного засобу, такого як хіміотерапевтичний засіб, на протиракову активність якого не впливає статус ВКСА2. Альтернативно, суб'єкт, що має нормальну або майже нормальну активність ВЕКСА2, може одержувати лікування 5М5-595 з використанням іншого протоколу лікування, такого як схема лікування, при якій дози 5М5-595 вводяться частіше або використовуються більш високі дози 5М5-595, ніж ті, які розглядалися б для пацієнта, у якого активність ВКСА2 знижена.

У одному варіанті здійснення один або більше суб'єктів, у яких не виявляється мутація ВЕСА2, не одержують лікування 5М5-595. У визначених варіантах здійснення всі суб'єкти, у яких не виявляється мутація ВЕСА2, не одержують лікування 5М5-595. Наприклад, суб'єкт, що не має мутацію ВКСА2, може лікуватися з використанням альтернативного терапевтичного засобу, такого як хіміотерапевтичний засіб, на протиракову активність якого не впливає мутація ВКСА2. Альтернативно,

суб'єкт, що не має мутацію ВКСА2, може лікуватися 5М5-595 з використанням іншого протоколу лікування, такого як схема лікування, при якій дози ЗМ5-595 вводяться частіше або використовуються вищі дози 5М5-595, ніж ті, які розглядалися б для пацієнта, що має мутацію ВКСА2.

Мутацію ВКСА? в злоякісній клітині можна діагностувати будь-якою прийнятною методикою, відомою в даній галузі, такою як генне секвенування, включаючи тестуючий аналіз ВКАСАпаїузізФ від компанії Мугіаай Сепеїіс І арогайогіє5, Іпс., мультиплексна залежна від лігування ампліфікація зондів (МІ РА), високодозволяючий аналіз кривої розплаву (див., Ошїтезпе еї аї!., Агсп Раїйої Гар Меа, 2006, 130:185-187 і Такапо еї аі,, ВМС Сапсег, 2008, 8:59), тест усікання білка (РТТ), денатуруючий градієнтний гель-електрофорез (ОССЕ) і/або денатуруюча високоефективна рідинна хроматографія (ОНРІС).

У визначених варіантах здійснення мутації в ВЕСА2 являють собою дрібні делеції або вставки, які можуть бути виявлені нарівні з суцільним протеїном. Способи за даним винаходом включають лікування страждаючих на онкологічні захворювання суб'єктів з будь-якою мутацією ВКСА2, відомою фахівцеві в даній галузі. Приклади таких мутацій включають, наприклад, 999аеї5, 6174аеїт, ввозаеї!сС, 4486деї!с, 5445аеї5 і 2024де1І5, 76Зіп5АТ, 763іп5АТ, 983деіА4САС, АЗО58Т, 375684еіІАСАСс, 3908аеїто, 4706деідААс, 5804деІТТАА, С6137А, 6174деїт, 6305іп5А, 9132де!С, аеі2352іп512, дир9700, аеп518 і інші, описані, наприклад, Готап еї аї., У Ммаї! Сапсег Іпб5і, 2001, 93(16):1215-1223; Рею еї аї., У Маї!

Сапсег Іпві, 1999, 91(11):943-949; і Умаїсп еї аї!., «АМА, 2006, 295(12): 1379-88.

Без зв'язку з якою-небудь визначеною теорією, вважається, що 5М5-595 викликає сайт-селективне пошкодження ДНК селективним інтеркалуванням в ДНК і отруєнням топоізомерази ІЇ, що приводить до залежного від реплікації пошкодження ДНК, безповоротної зупинки 2 і швидкого апоптозу. Навпаки, схеми лікування на основі антрацикліну викликають опосоредковані топоїзомеразою ІІ двониткові розриви (058) ДНК, а також ушкоджуючу ДНК активність за допомогою не пов'язаних з топоїзомеразою ІІ механізмів, включаючи генерування аддуктів ДНК, утворення поперечних зшивань

ДНК і продукцію реактивних видів кисню (КО5). Див. Сем 0., Віоспет РІагтасої 1999, 57:727-41.

Цільові взаємодії ДНК-ферменту при терапії 5М5-595 відрізняються від механістичних більш різнорідними і високо інтеркаляційними антрациклінами, які застосовуються клінічно (О'КейШу еї аї.,

Віоспетівігу 2002, 41:7989-97; Мапад ., Маї Вем Мої! Сеї Віої, 2002, 3:430-40). Вказані відмітні ознаки вказують на те, що роль ВКСА?2 в репарації викликаного 5М5-595 пошкодження ДНК не можна безпосередньо перенести з даних, що стосуються антрациклінів, таких як доксорубіцин, або інгібіторів топоїзомерази Ії, таких як етопозид. Дані, представлені в розділі "Приклади", які демонструють сенсибілізацію клітин з мутацією ВЕСА2 до 5М5-595, підтверджують роль ВКСА?2 в репарації пошкодження ДНК, викликаного 5М5-595.

У визначених варіантах здійснення способи лікування за даним винаходом включають введення суб'єкту дози приблизно від 10 до 100 мг/м 5М5-595. У визначених варіантах здійснення способи лікування включають введення суб'єкту дози приблизно 10-100 мг/м", приблизно 20-90 мг/м, приблизно 30-90 мг/м", приблизно 40-90 мг/м", приблизно 30-80 мг/м-, приблизно 40-80 мг/м? або приблизно 30-50 мг/м".

У деяких варіантах здійснення способи включають введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості 5М5-595 в комбінації з терапевтично ефективною кількістю другого активного засобу. У деяких варіантах здійснення другий активний засіб являє собою терапевтичне антитіло до ракового антигену, гематопоетичний фактор росту, цитокін, протираковий засіб, антибіотик, інгібітор сох-2, імуномодулюючий засіб, імуносупресивний засіб, кортикостероїд або його фармакологічно активний мутант або похідне. У інших варіантах здійснення другий активний засіб являє собою алкілуючий агент, антинеопластичний антибіотик, антиметаболіт, платиновий координаційний комплекс, інгібітор або отруту топоізомерази Ії, інгібітор СОК (циклінзалежної кінази), інгібітор Аврора-кінази, антагоніст пурину, антагоніст піримідину, веретенну отруту, мітотичний інгібітор, інгібітор топоіїзомерази |, нітрозосечовину, комплекс неорганічних іонів, фермент, гормон або аналог гормону, інгібітор ЕСЕК, антитіло або похідне антитіла, ІМІО, інгібітор НОАС, інгібітор Всі-2, інгібітор тирозинкінази, що стимулюється МЕСРЕ, інгібітор МЕСЕК, інгібітор протеасоми, інгібітор ароматази, інгібітор РАКР, дексаметазон або опромінення. 6.3.1 Суб'єкти

У визначених варіантах здійснення способів за винаходом підлягаючий лікуванню суб'єкт являє собою тваринну, наприклад, ссавця або примата, що не є людиною. У конкретних варіантах здійснення суб'єкт являє собою людину-пацієнта. Суб'єкт може бути чоловічої або жіночої статі.

Зокрема, суб'єкти, що підлягають лікуванню відповідно до способів за даним винаходом, включають суб'єктів, які страждають на рак молочної залози, яєчників, підшлункової залози або передміхурової залози, і мають знижену активність ВКСА2. У конкретному варіанті здійснення, суб'єкт страждає на рак молочної залози. У визначених варіантах здійснення рак молочної залози був стійким до попереднього лікування і/або після попереднього лікування стався його рецидив. Зниження активності ВКСА?2 може бути пов'язане з будь-якою мутацією ВКСА2, відомою фахівцям в даній галузі. У багатьох варіантах здійснення, мутація ВЕСА2 являє собою мутацію, яка порушує активність

ВКСА2, яка може виявлятися в різних механістичних формах. Наприклад, мутація може порушити експресію ВЕСА2, тобто кількість протеїну ВЕКСА2, що продукується в клітинах, або мутація може порушити біологічну активність протеїну, таку як взаємодія ВЕСАЗ2 з іншим протеїном або нуклеїновою кислотою, або ферментативну активність протеїну ВЕСА2. Мутація або недостатня активність ВЕСА2 може діагностуватися у суб'єкта будь-якою методикою, що вважається прийнятною фахівцем в даній галузі. Ілюстративні методики описані в публікаціях Опсодепе, 1998, 16(23): 3069-82, Кигпеївом ві аї.,

Маїшге Медісіпе, 2008, 14, 875-881, ЮОштезпе еї аї., Агосп Ратої І ар Мед, 2006, 130:185-187 і ТаКапо еї аІ.,, ВМО Сапсетг, 2008, 8:59.

Даний винахід також включає способи лікування суб'єкта незалежно від віку суб'єкта, хоча деякі захворювання і розлади більш поширені в визначених вікових групах. У деяких варіантах здійснення суб'єкт являє собою людину-пацієнта у віці щонайменше 18 років. У деяких варіантах здійснення вік пацієнта становить 10, 15, 18, 21, 24, 35, 40, 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80 або 85 років або більше.

У деяких варіантах здійснення способи за винаходом знаходять застосування у пацієнтів у віці щонайменше 50 років, хоча дані способи можуть також здійснити сприятливий вплив на пацієнтів більш молодого віку. У інших варіантах здійснення вік пацієнтів становить щонайменше 55, щонайменше 60, щонайменше 65 і щонайменше 70 років. У визначених варіантах здійснення способи за винаходом можуть застосовуватися у пацієнтки, у якої є особистий анамнез раннього початку раку молочної залози (до 50-літнього віку) або раннього початку раку молочної залози і яєчників в будь- якому віці. У іншому варіанті здійснення пацієнтка являє собою жінку, що має сімейний анамнез раку молочної залози або раку молочної залози і яєчників. У іншому варіанті здійснення пацієнт являє собою чоловіка з особистим або сімейним анамнезом раку молочної залози у чоловіків.

У визначених варіантах здійснення способи за даним винаходом включають лікування суб'єктів, які раніше не одержували лікування з приводу онкологічних захворювань. У інших варіантах здійснення способи включають лікування суб'єктів, які раніше одержували лікування, але не реагують на стандартні способи лікування, а також суб'єктів, які одержують лікування в цей час по причині онкологічного захворювання. Наприклад, можливо, суб'єкти раніше одержували лікування або в цей час одержують лікування по причині онкологічного захворювання з використанням стандартної схеми лікування, відомої практикуючому онкологу.

У деяких варіантах здійснення суб'єкт раніше не піддавався лікуванню 5М5-595. У деяких варіантах здійснення суб'єкт раніше піддавався лікуванню 5М5-595. 6.3.2 Дозування

У визначених репрезентативних варіантах здійснення спосіб лікування, профілактики і ведення пацієнтів з онкологічними захворюваннями за даним винаходом включає введення суб'єкту ефективної кількості 5М5-595 будь-яким прийнятним шляхом введення. Загалом, спосіб включає введення суб'єкту на основі площі поверхні тіла дози приблизно 10-100 мг/м 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб за винаходом включає введення дози приблизно 20-90 мг/м 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб за винаходом включає введення дози приблизно 40-90 мг/м? 5М5- 595. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 30-50 мг/м? 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 30-90 мг/м 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 40-90 мг/м 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 30-80 мг/м? 5М5-595. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 40-80 мг/м2 5М5-595.

У одному варіанті здійснення 5М5-595 вводиться внутрішньовенно і в кількості приблизно 10, 15, 18, 21, 24, 25, 27, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55,60, 63, 70, 72, 75, 80, 85, 90, 95 або 100 мг/м? (яка може вводитися в одній або дробних дозах) в один день.

Досвідчений практикуючий онколог при лікуванні онкологічного захворювання звичайно використовує одиницю дозування, яка забезпечує апроксимацію впливу на суб'єкт активного інгредієнта, що вводиться. Може використовуватися будь-яка прийнятна одиниця дозування.

Наприклад, використовувана одиниця дозування може апроксимувати вплив на основі розрахунку площі поверхні тіла. Розрахунки поверхні тіла (ВБА) для людини можуть розраховуватися, наприклад, з використанням формули МозіейПег:

ВЗА (м) - (зріст (см) х маса тіла (кг)/36001772.

Такою найбільш поширеною одиницею дозування є міліграм активної сполуки на квадратний метр площі поверхні тіла (мг/м).

Як інший приклад, введена доза 5М5-595 може бути виражена в одиницях, відмінних від мг/м.

Наприклад, дози можуть бути виражені в міліграмах активної сполуки на кілограм маси тіла (мг/кг).

Середньому фахівцеві в даній галузі цілюом зрозуміло, як перетворити дозу для пацієнта з мг/м? в мг/кг, зумовлену ростом мабо масою тіла пацієнта (див., пер:/лимли да. дом/сдег/сапсег/апітайтгате.йіт). Наприклад, доза 1-30 мг/м" для людини масою 65 кг приблизно дорівнює 0,026-0,79 мг/кг. Можуть також використовуватися інші одиниці дозування.

У визначених варіантах здійснення введена доза 5М5-595 може бути доставлена у вигляді одного болюсу (наприклад, внутрішньовенної ін'єкції) або протягом більш тривалого періоду часу (наприклад,

безперервною інфузією або періодичним введенням болюсних доз). Введення 5М5-595 може повторюватися доти, поки у суб'єкта не виявиться стабілізація перебіг або зворотний розвиток захворювання, або доти, поки у суб'єкта не виявиться прогресування захворювання або неприйнятна токсичність препарату. Стабільний перебіг захворювання або його відсутність визначається способами, відомими в даній галузі, такими як оцінка симптомів, фізикальне обстеження і інші загальноприйняті параметри.

Кількість 5М5-595, що вводиться відповідно до способів за даним винаходом, залежить від різних чинників, таких як загальний стан здоров'я суб'єкта, що піддається лікуванню, тяжкості розладу або симптом розладу, активного інгредієнта, що вводиться, шляхів введення, частоти введення, інших присутніх медикаментозних засобів і думки призначаючого лікування лікаря. Підлягаючу введенню кількість лікар може визначити емпірично.

У деяких варіантах здійснення частота введення знаходиться в діапазоні від приблизно однієї дози на добу до однієї дози на місяць. У визначених варіантах здійснення препарат вводиться один раз на день, через день, З дні підряд, 4 дні підряд, в 1-й і 4-й дні, в 1-й і 2-й дні, в 1-й і З-ій дні, один раз на тиждень, двічі на тиждень, три рази на тиждень, один раз на два тижні, один раз на три тижні або один раз на чотири тижні. У одному варіанті здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом вводиться один раз на тиждень протягом трьох тижнів. У іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом вводиться один раз кожні три тижні. У одному варіанті здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом вводиться один раз на три тижні. У іншому варіанті здійснення фармацевтична композиція за даним винаходом вводиться один раз на чотири тижні.

У визначених варіантах здійснення 5М5-595 вводиться суб'єкту в один або більше циклів введення. Циклічна терапія включає введення однієї або більше доз 505-595 з подальшим періодом відпочинку і повторення даного циклу введення/відпочинку. Циклічна терапія може знизити розвиток стійкості до одного або більше видів лікування, уникнути або знизити побічні ефекти одного або більше видів лікування і/або підвищити ефективність або тривалість лікування.

Отже, в одному варіанті здійснення доза 5М5-595 вводиться один раз на тиждень, в три- або шеститижневому циклі при періоді відпочинку від приблизно 1 до приблизно 30 днів між дозами. У деяких варіантах здійснення період очікування становить 14 днів, причому перша доза вводиться в 1-й день, а наступна доза вводиться на 15-й день. Таким чином, можна сказати, що лікування в таких випадках може проводитися з використанням "14-денного циклу". У деяких варіантах здійснення дози можуть вводитися з інтервалом 28 днів, тобто в 28-денному циклі.

У іншому варіанті здійснення спосіб введення включає цикл, де цикл включає введення дози 5М5- 595 суб'єкту один раз на тиждень протягом трьох тижнів з подальшим періодом, щонайменше 14 днів, протягом якого сполука або композиція не вводиться суб'єкту, і де цикл повторюється множину разів.

У іншому варіанті здійснення період, протягом якого не вводиться сполука або композиція, становить 18 днів. У іншому варіанті здійснення період, протягом якого сполука або композиція не вводиться, становить 21 день. У іншому варіанті здійснення період, протягом якого сполука або композиція не вводиться, становить 28 днів. Частота, число і тривалість циклів введення можуть збільшуватися або зменшуватися.

У одному варіанті здійснення спосіб за даним винаходом включає: ї) введення суб'єкту дози 5М5- 595, наприклад, приблизно 40-90 мг/м; ії) очікування протягом періоду, щонайменше шести днів, коли суб'єкту зовсім не вводиться 5М5-595; і ії) введення суб'єкту іншої дози 5М5-595, наприклад, приблизно 40-90 мг/м 5М5-595. У одному варіанті здійснення стадії ії)- ії) повторюються множину разів.

У одному варіанті здійснення спосіб за винаходом включає: ії) введення суб'єкту дози 5М5-595, наприклад, приблизно 30-50 мг/м; ії) очікування протягом періоду, щонайменше шести днів, коли суб'єкту зовсім не вводиться 5М5-595; і ії) введення суб'єкту іншої дози 5М5-595, наприклад, приблизно 30-50 мг/м". У одному варіанті здійснення стадії ії)- ії) повторюються множину разів.

У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення дози приблизно 40 мг/м", приблизно 45 мг/м2, приблизно 48 мг/м7, приблизно 50 мг/м7, приблизно 60 мг/м", приблизно 72 мг/м-, приблизно 75 мг/м, приблизно 80 мг/м-, або приблизно 90 мг/м 5М5-595 в кожній з попередніх стадій і) і іїї).

У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування страждаючого раком молочної залози суб'єкта, що має знижену активність ВКСА2, що включає введення суб'єкту дози приблизно 48 мг/м2 5М5-595 один раз на три тижні. У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування страждаючого раком молочної залози суб'єкта що має мутацію ВКСА2, що включає введення суб'єкту дози приблизно 60 мг/м 5М5-595 один раз на три тижні. У іншому варіанті здійснення винахід стосується способу лікування страждаючого раком молочної залози суб'єкта, що має мутацію ВКСА2, що включає введення суб'єкту дози приблизно 75 мг/м" 5М5-595 один раз на три тижні.

У визначених варіантах здійснення спосіб введення включає введення суб'єкту дози 5М5-595 два рази на тиждень протягом двох тижнів (введення в 1-й, 4-й, 8-й і 11-й дні). У іншому варіанті здійснення спосіб введення включає введення суб'єкту дози 5М5-595 один раз на тиждень. У іншому варіанті здійснення спосіб введення включає введення суб'єкту дози 5М5-595 один раз на два тижні. У іншому варіанті здійснення спосіб введення включає введення суб'єкту дози 5М5-595 один раз на три тижні. У іншому варіанті здійснення спосіб введення включає введення суб'єкту дози 5М5-595 один раз на чотири тижні.

У одному варіанті здійснення доза приблизно 40-80 мг/м 5М5-595 вводиться суб'єкту один раз на три тижні, де тритижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше один раз. У іншому варіанті здійснення доза приблизно 40-80 мг/м 5М5-595 вводиться суб'єкту один раз на чотири тижні, де чотиритижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше один раз. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози приблизно 48 мг/м 5М5-595 один раз на три тижні, де тритижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше один раз. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози приблизно 60 мг/м 5М5-595 один раз на чотири тижні, де чотиритижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше один раз. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози приблизно 75 мг/м? 5М5-595 один раз на чотири тижні, де чотиритижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше один раз.

У одному варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози приблизно 40-80 мг/м 5М5- 595 один раз на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше двічі або щонайменше три рази. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози приблизно 30-50 мг/м 5М5-595 двічі на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше два рази. У іншому варіанті здійснення доза 5М5-595 становить приблизно 50 мг/м один раз на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше три рази. У іншому варіанті здійснення доза 5М5-595 становить приблизно 60 мг/м? один раз на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше три рази. У іншому варіанті здійснення доза 5М5-595 становить приблизно 72 мг/м? один раз на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше три рази. У іншому варіанті здійснення спосіб включає введення суб'єкту дози 5М5-595 приблизно 40 мг/м: двічі на тиждень, де однотижневий період включає цикл лікування, і цикл лікування повторюється щонайменше двічі.

Всі способи і дозування, вказані в даному описі, стосуються лікування або профілактики онкологічних захворювань або передракового стану. 6.3.3 Додаткові активні засоби

Потрібно також розуміти, що 5М5-595 і фармацевтичні композиції, що містять 5М5-595, можуть використовуватися при видах додаткової комбінованої терапії з іншими активними засобами або медичними процедурами.

ЗМ5-595 і її фармацевтичні композиції можуть вводитися одночасно, перед або після одного або більше інших бажаних активних засобів або медичних процедур. Конкретна комбінація видів лікування (засобів або процедур), що підлягає використанню в комбінованій схемі, повинна підбиратися з урахуванням сумісності бажаних видів лікування і/або процедур і бажаного терапевтичного ефекту, який повинен бути досягнутий. Потрібно також розуміти, що способи лікування, що використовуються, можуть забезпечити досягнення бажаного ефекту відносно того ж розладу (наприклад, 5М5-595 може вводитися одночасно з іншим активним засобом, що застосовується для лікування того ж розладу), або вони можуть забезпечувати досягнення різних ефектів (наприклад, боротьбу з будь-якими побічними ефектами). Необмежувальні приклади таких засобів і процедур включають хірургічні втручання, променеву терапію (наприклад, можна як декілька прикладів привести гамма-опромінення, променеву терапію пучком нейтронів, променеву терапію електронним променем, протонну терапію, брахітерапію і системні радіоїзотопи), ендокринну терапію, модифікатори біологічної реакції (інтерферони, інтерлейкіни і фактор пухлинного некрозу (ТМЕ), гіпертермію і кріотерапію, засоби для ослаблення будь-яких побічних ефектів (наприклад, протиблювотні засоби) і інші затверджені хіміотерапевтичні протиракові засоби).

Приклади хіміотерапевтичних протиракових засобів, які можуть застосовуватися як другі активні засоби в комбінації з 5М5-595, включають без обмеження, алкілуючі агенти (наприклад, мехлоретамін, хлорамбуцил, циклофосфамід, мелфалан, іфосфамід), антиметаболіти (наприклад, метотрексат), інгібітори Аврора-кінази (наприклад, 5М5-314), антагоністи пурину і антагоністи піримідину (наприклад,

Б-фторурацил (5-ЕУ)), гемцитабін), отрути веретена (наприклад, алкалоїди барвінку, такі як вінбластин, вінкристин, вінорелбін), мітотичні інгібітори (наприклад, таксани, такі як паклітаксел, доцетаксел, таксотер), інгібітори отрути або топоізомерази ІЇ (наприклад, епіподофілотоксини, такі як етопозид, теніпозид; антрацикліни, такі як доксорубіцин, даунорубіцин, ідарубіцин), інгібітори топоіїзомерази (наприклад, іринотекан, топотекан, камптотецин), антинеопластичні антибіотики (наприклад, блеоміцин, мітоміцин, афідиколін; антрацендіони, такі як мітоксантрон), нітрозосечовини (наприклад, кармустин, ломустин), неорганічні іони (наприклад, платинові комплекси, такі як цисплатин,

карбоплатин, оксаліплатин), ферменти (наприклад, аспарагіназа), гормони і аналоги гормонів (наприклад, тамоксифен, лейпролід, флутамід, мегестрол), інгібітори ЕСЕК (Не!1, ЕгЬВ-1) (наприклад, гефітиніб), антитіла (наприклад, бевацизумаб, ритуксимаб), похідні антитіл (наприклад, ранібізумаб),

ІМІО (наприклад, талідомід, леналідомід), інгібітори НОАС (наприклад, воріностат), інгібітори Всі-2 (наприклад, облімерсен), інгібітори МЕСЕ тирозинкінази, що стимулюється (наприклад, сорафеніб, сунітиніб), інгібітори МЕСЕЕК (наприклад, трастузумаб), інгібітори протеасоми (наприклад, бортезоміб), інгібітори циклінзалежної кінази (сак) (наприклад, 5М5-032, селіцикліб), інгібітори РАКР (наприклад,

В5І-201), інгібітори ароматази (наприклад, анастрозол, екземестан, летрозол), трабектидин і дексаметазон.

У одному варіанті здійснення приклади хіміотерапевтичних протиракових засобів, які можуть застосовуватися як другі активні засоби в комбінації з 5М5-595, включають доцетаксел, вінорелбін, капецитабін, доксорубіцин, госерелін, золедронову кислоту, паклітаксел, памідронат, анастрозол, екземестан, циклофосфамід, епірубіцин, фулвестрант, летрозол, гемцитабін, лейпролід, філграстим (0-С5Е або фактор, стимулюючий колонії гранулоцитів), тореміфен, тамоксифен, дексразоксан, трастузумаб, пегфілграстим, епоетин альфа і дарбепоетин альфа. У визначених варіантах здійснення

ЗМ5-595, в комбінації з одним або більше з вказаних терапевтичних засобів може застосовуватися для лікування раку молочної залози.

У одному варіанті здійснення терапевтичний засіб вибраний з паклітакселу, цисплатину, карбоплатину, гемцитабіну, топотекану, алтретаміну, трабектидину і циклофосфаміду. У визначених варіантах здійснення 5М5-595 в комбінації з одним або більше з вказаних терапевтичних засобів може застосовуватися для лікування раку яєчників.

У одному варіанті здійснення другий засіб вибраний з мітоксантрону, преднізону, паклітакселу, доцетакселу, естрамустину, доксорубіцину, госереліну, лейпроліду і дегареліксу. У визначених варіантах здійснення 5М5-595 в комбінації з одним або більше з вказаних засобів може застосовуватися для лікування раку передміхурової залози.

Деякі визначені протиракові засоби, які можуть застосовуватися в комбінації з 5М5-595, включають без обмеження карбоплатин, цисплатин, гемцитабін і комбінації будь-яких двох або більше з них.

У інших варіантах здійснення додатковий активний засіб являє собою засіб підтримуючого лікування, такий як протиблювотний засіб або хіміопротективний засіб. Визначені протиблювотні засоби включають без обмеження фенотіазини, бутирофенони, бензодіазепіни, кортикостероїди, антагоністи серотоніну, канабіноїди і антагоністи МК! рецепторів. Приклади фенотіазинових протиблювотних засобів включають без обмеження прохлорперазин і триметобензамід. Приклади бутерофенонових протиблювотних засобів включають без обмеження галоперидол. Приклади бензодіазепінових протиблювотних засобів включають без обмеження лоразепам. Приклади кортикостероїдних протиблювотних засобів включають без обмеження дексаметазон. Приклади протиблювотних засобів у вигляді антагоністів рецепторів серотоніну (рецепторів 5-НТЗ) включають без обмеження доласетрону мезилат (наприклад, Аплетей8), гранісетрон (наприклад, Куїгіке), ітасетрон, ондасетрон (наприклад, 2оїтапФ), палоносетрон (наприклад, Аїохіт), рамосетрон, тропісетрон (наприклад, МамобрапФ), батаноприд, дазоприд, рензаприд. Приклади канабіноїдних протиблювотних засобів включають без обмеження дронабінол. Приклади антагоністів МК1 рецепторів включають без обмеження апрепітант (наприклад, Етепаф).

Інші засоби підтримуючого лікування включають хіміопротективні засобу, такі як аміфостин (наприклад, ЕШуок), дексразоксан (наприклад, 7іпесагафФ), лейковорин (фолінова кислота) і месна (наприклад, Мезпехо); тромбопоетичні фактори росту, такі як інтерлейкін-11 (1-11, опрелвекін, наприклад, МештедаФф); бісфосфонати, такі як памідронат динатрію (наприклад, АгедіафФ), етидронат динатрію (наприклад, Оідгопе!Фф) і золедронова кислота (наприклад, 2отеїаф)); і антагоністи ТМЕ, такі як інфліксимаб (наприклад, Кептісадеф)).

У визначених варіантах здійснення введення 5М5-595 виконується в комбінації з одним або більше засобами підтримуючої терапії для пом'якшення або запобігання синдрому лізису пухлини (ТІ 5) або його складовим симптомам. Засоби лікування, прийнятні для запобігання або пом'якшення

Т5 (або будь-якого з його симптомів, включаючи гіперкаліємію, гіперфосфатемію, гіперурикемію, гіпокальцинемію і гостру ниркову недостатність), включають, наприклад, алопуринол (наприклад, 7УуюоргітФ), расбуриказу (наприклад, ЕЇїйекф)) і полістиролсульфонат натрію (наприклад, Кауехаїацеф).

Лейкаферез може виконуватися, наприклад, до 72 годин після першого лікування 5М5-595. 6.4 Комбінована терапія з іншими активними засобами

У визначених варіантах здійснення спосіб за винаходом включає введення 5М5-595 або фармацевтичних композицій за винаходом в комбінації з одним або більше іншими активними засобами і/або в комбінації з променевою терапією або хірургічним лікуванням.

Введення суб'єкту 5М5-595 і додаткових активних засобів може відбуватися одночасно або послідовно одним і тим же або різними шляхами введення. Придатність конкретного шляху введення, що використовується для конкретного активного засобу, залежить від самого активного засобу (наприклад, того, чи може він вводитися перорально без руйнування перед надходженням в кровотік) і захворювання, що піддається лікуванню. Шляхи введення, що рекомендуються для того або іншого активного засобу відомі середнім фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, настільний лікарський довідник Рпузісіапе" ОезкКк Кегтегепсе, (63га ейд., 2009) (далі іменується "Рпузісіапе" ОезК Кетегепсе").

У одному варіанті здійснення другий активний засіб вводиться внутрішньовенно або підшкірно і один або два рази на день в кількості від приблизно 1 до приблизно 1000 мг, від приблизно 5 до приблизно 500 мг, від приблизно 10 до приблизно 375 мг або від приблизно 50 до приблизно 200 мг.

У іншому варіанті здійснення винахід стосується способів лікування, профілактики і/або ведення суб'єкта з онкологічним захворюванням, що має мутацію ВКСА2, що включає введення 5М5-595 в поєднанні з (наприклад, до, під час або після) звичайним лікуванням, що включає без обмеження хірургічне лікування, імунотерапію, біологічну терапію, променеву терапію або іншу немедикаментозну терапію, що використовується в цей час для лікування, профілактики і ведення пацієнтів з онкологічними захворюваннями.

У одному варіанті здійснення 5М5-595 може водитися в кількості приблизно 10-100 мг/м, приблизно 20-90 мг/м, приблизно 30-80 мг/м", приблизно 40-80 мг/м", приблизно 40-90 мг/м, приблизно 30-90 мг/м? або приблизно 30-50 мг/м, окремо або в комбінації з другим активним засобом, описаним в даний заявці, перед, під час або після застосування звичайного лікування.

У одному варіанті здійснення другий засіб вибраний з групи, що складається з карбоплатину, цисплатину, гемцитабіну і комбінацій будь-яких двох або більше з них.

У одному варіанті здійснення комбіноване лікування включає введення 5М5-595 і карбоплатину. У одному варіанті здійснення комбіноване лікування включає введення 5М5-595 і цисплатину. У одному варіанті здійснення комбіноване лікування включає введення 5М5-595 і гемцитабіну.

У одному варіанті здійснення способи за винаходом включають введення 5М5-595 в комбінації з дозою від приблизно 5 мг/м? до приблизно 200 мг/м цисплатину. Наприклад, один варіант здійснення включає введення цисплатину в дозі приблизно 50 або 70 мг/м? один раз на 3-4 тижні. Один варіант здійснення включає введення цисплатину в дозі приблизно 50 або 70 мг/м? один раз на З тижні. ІНШИЙ варіант здійснення включає введення цисплатину в дозі приблизно 75 або 100 мг/м? один раз на З тижні. У іншому варіанті здійснення введення цисплатину проводиться в дозі приблизно 20 мг/м? на день до 5 днів. Цисплатин може вводитися внутрішньовенною інфузією, внутрішньовенним болюсним вливанням, болюсною ін'єкцією або підшкірною ін'єкцією. У одному варіанті здійснення введення цисплатину проводиться один раз на 3-4 тижні, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів або один раз на три тижні. У одному варіанті здійснення введення цисплатину здійснюється щодня протягом 5 днів, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів або один раз на три тижні. У одному варіанті здійснення введення цисплатину здійснюється один раз на тиждень протягом З тижнів, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів або один раз на три тижні.

У одному варіанті здійснення способи за винаходом включають введення 5М5-595 в комбінації з карбоплатином в дозі від приблизно 50 мг/м? до приблизно 400 мг/м7. Наприклад, один варіант здійснення включає введення карбоплатину в дозі приблизно 300 або приблизно 360 мг/м? один раз на З тижні. Один варіант здійснення включає введення карбоплатину в дозі приблизно 300 або 360 мг/м? один раз на 4 тижні. Карбоплатин може вводитися внутрішньовенною інфузією, внутрішньовенним болюсним вливанням, болюсною ін'єкцією або підшкірною ін'єкцією. У одному варіанті здійснення введення карбоплатину проводиться один раз на З тижні, тоді як введення 5М5- 595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів йди один раз на три тижні. У одному варіанті здійснення введення карбоплатину проводиться один раз на тиждень протягом З тижнів, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів або один раз на три тижні.

У одному варіанті здійснення способи за винаходом включають введення 5М5-595 в комбінації з дозою гемцитабіну від приблизно 100 мг/м? до приблизно 1500 мг/м. Наприклад, один варіант здійснення включає введення гемцитабіну в дозі приблизно 1000 або 1250 мг/м? один раз на тиждень протягом щонайменше 4 тижнів. Гемцитабин може вводитися внутрішньовенною інфузією, внутрішньовенним болюсним вливанням, болюсною ін'єкцією або підшкірною ін'єкцією. У одному варіанті здійснення введення гемцитабіну проводиться один раз на тиждень протягом періоду до 4 тижнів, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів або один раз на три тижні. У одному варіанті здійснення введення гемцитабіну проводиться двічі на тиждень протягом 2 тижнів, тоді як введення 5М5-595 відбувається один раз на тиждень протягом трьох тижнів.

У визначених варіантах здійснення другий активний засіб спільно вводиться з 5М5-595 або вводиться з відстрочкою 1-50 годин. У визначених варіантах здійснення спочатку вводиться 5М5-595 з подальшим введенням другого активного засобу з відстрочкою 1-50 годин. У інших варіантах здійснення, спочатку вводиться другий активний засіб з подальшим введенням 5М5-595 з відстрочкою 1-50 годин. У деяких варіантах здійснення відстрочка становить 24 години.

У іншому варіанті здійснення спосіб за винаходом включає: а) введення суб'єкту з онкологічним захворюванням, що має мутацію ВЕСА2, 5М5-595 в дозі приблизно 10-100 мг/м: і 5) введення суб'єкту терапевтично ефективної кількості засобу підтримуючого лікування.

Засіб підтримуючого лікування вводиться відповідно до схеми введення, доцільною для даної речовини. Наприклад, різні засоби підтримуючого лікування для лікування нудоти мають різні схеми введення. Хоча деякі такі засоби вводяться профілактично, інші вводяться спільно із сполуками або композицією за винаходом, тоді як ще одні вводяться після введення 5М5-595. Ілюстративні приклади засобів підтримуючого лікування, їх доз і схем введення можна знайти в довіднику Рпузісіапє" Оевк

Кегїегепсе. Деякі ілюстративні засоби для підтримуючого лікування описані в заявці на патент США Мо 2006-0025437, зміст якої повністю включений в дану заявку шляхом посилання. 6.5 Фармацевтичні композиції і лікарські форми

У способах за винаходом застосовуються фармацевтичні композиції, що містять 5М5-595, і фармацевтично прийнятні носії, такі як розріджувачі або ад'юванти, або в комбінації з іншими активними інгредієнтами, такими як інший протираковий засіб. У клінічній практиці 5М5-595 може вводитися будь-яким звичайним шляхом, включаючи без обмеження пероральне, парентеральне, ректальне або інгаляційне введення (наприклад, в формі аерозолю). Парентеральні лікарські форми можуть вводитися суб'єктам різними шляхами, включаючи без обмеження підшкірний, внутрішньовенний (включаючи болюсну ін'єкцію), внутрішньом'язовий і внутрішньоартеріальний. У зв'язку з тим, що їх введення звичайно обходить природні захисні механізми суб'єкта проти заражаючих факторів, парентеральні форми є стерильними або здатними стерилізуватися перед введенням суб'єкту. Приклади парентеральних лікарських форм включають без обмеження розчини, готові для ін'єкції, сухі продукти, готові до розчинення і суспендування в фармацевтично прийнятному носії для ін'єкції, суспензії, готових для ін'єкції і емульсії. У одному варіанті здійснення 5М5-595 вводиться внутрішньовенною ін'єкцією.

Фармацевтичні композиції для парентерального введення можуть являти собою емульсії або однорідні розчини. Прийнятні носії, які можуть використовуватися для одержання парентеральних лікарських форм, добре відомі фахівцям в даній галузі. Приклади включають без обмеження воду для ін'єкції ОБР, водний носій, такий як без обмеження розчин хлориду натрію для ін'єкцій, розчин Рінгера для ін'єкцій, розчин декстрози для ін'єкцій, розчин декстрози і хлориду натрію для ін'єкцій і лактований розчин Рінгера для ін'єкцій, носії, що змішуються з водою, такі як, без обмеження, етиловий спирт, поліетиленгліколь і поліпропіленгліколь; і неводні носії, такі як, без обмеження, нафтове масло, тваринне масло, олія рослинного або синтетичного походження, таке як арахісове масло, соєва олія, мінеральне масло, кунжутна олія і тому подібні; етилолеат, ізопропілміристат і бензилбензоат.

Вказані фармацевтичні композиції можуть також містити ад'юванти, зокрема, змочувальні, ізотонізуючі, емульгуючі, диспергуючі і стабілізуючі агенти. Стерилізація може здійснюватися декількома шляхами, наприклад, з використанням фільтра з розміром пір 0,2 мкм, опроміненням або нагріванням. Див. керівництво Кептіпдіоп'є Рпаптасецшціїса! Зсіепсев, 2151 єд., Маск Рибіївпіпа, Еавіоп,

РА (2005) (Кетіпдіоп'є, що далі називається "Рпагптасецііса! Зсіепсе5"). Вони можуть бути також одержані в формі стерильних твердих фармацевтичних композицій, які можуть розчинятися під час застосування в стерильній воді або будь-якому іншому ін'єктованому стерильному середовищі.

Фармацевтичні композиції можуть застосовуватися при одержанні окремих, одиночних стандартних лікарських форм. Фармацевтичні композиції і лікарські форми містять сполуки і один або більше ексципієнтів.

Фармацевтичні композиції і лікарські форми можуть також містити один або більше додаткових активних інгредієнтів. Приклади можливих других або додаткових активних інгредієнтів описані в даний заявці.

У визначених варіантах здійснення фармацевтична композиція за винаходом являє собою одну стандартну лікарську форму. Фармацевтичні композиції і стандартні лікарські форми за винаходом містять профілактично або терапевтично ефективну кількість сполуки або композиції і звичайно один або більше фармацевтично прийнятний носій або ексципієнт. Термін "носій" стосується розріджувача, ад'юванта (наприклад, ад'юванта Фрейнда (повного і неповного)), ексципієнта або носія, з яким вводиться терапевтичний засіб. Приклади прийнятних фармацевтичних носіїв описані в посібнику

Ветіпдіоп'є Рпагтасеціїса! 5сіепсев.

Типові фармацевтичні композиції і лікарські форми містять один або більше ексципієнтів.

Прийнятні ексципієнти добре відомі фахівцям в галузі фармації, і необмежувальні приклади прийнятних ексципієнтів включають крохмаль, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, крейду, силікагель, стеарат натрію, моностеарат гліцерину, тальк, хлорид натрію, сухе зняте молоко, гліцерин, пропіл, гліколь, воду, етанол і тому подібне. Те, чи прийнятний конкретний ексципієнт для включення в фармацевтичну композицію або лікарську форму, залежить від різноманітних чинників, добре відомих в даній галузі, включаючи без обмеження шлях, яким лікарська форма буде вводитися суб'єкту, і визначені активні інгредієнти в лікарській формі. При бажанні, фармацевтична композиція або стандартна лікарська форма може також містити невеликі кількості змочувальних або емульгуючих агентів або агентів, що забуферюють рн.

Сполуки, які збільшують розчинність одного або більше з активних інгредієнтів, описаних в даний заявці, можуть бути також включені в парентеральні лікарські форми. Наприклад, циклодекстрин і його похідні можуть використовуватися для збільшення розчинності активних інгредієнтів. Див., наприклад, патент США Мо 5134127, повний зміст якого включений в даний опис шляхом посилання. рН фармацевтичної композиції або лікарської форми може також регулюватися для поліпшення доставки одного або більше активних інгредієнтів. Аналогічним способом, можуть регулюватися полярність розчинника-носія, його іонна сила або тонічність для поліпшення доставки. Сполуки, такі як стеарати, можуть також додаватися до фармацевтичних композицій або лікарських форм для переважної зміни гідрофільності або ліпофільності одного або більше активних інгредієнтів з тим, щоб поліпшити доставку. У цьому відношенні, стеарати можуть служити як ліпідний носій для препаративної форми, як емульгуючий агент або поверхнево-активна речовина і як посилюючий доставку або посилюючий проникнення агент. Можуть використовуватися різні солі, гідрати або сольвати активних інгредієнтів для додаткового регулювання властивостей фармацевтичної композиції, що одержується внаслідок.

Крім того, даний винахід стосується фармацевтичних композицій і лікарських форм, які містять одну або більше сполук, що знижують швидкість, з якою буде руйнуватися активний інгредієнт. Такі композиції, які називаються в даному описі "стабілізаторами", включають без обмеження антиоксиданти, такі як аскорбінова кислота, буфери рН або сольові буфери.

Фармацевтичні композиції і одиночні стандартні лікарські форми можуть приймати форму розчинів, суспензій, емульсії, порошку і тому подібних. Такі композиції і лікарські форми містять профілактично або терапевтично ефективну кількість профілактичного або терапевтичного засобу, в визначених варіантах здійснення в очищеній формі, разом з прийнятною кількістю носія з тим, щоб забезпечити форму для прийнятного введення суб'єкту. Препаративна форма повинна бути прийнятною для виду введення. У одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції і одиночні стандартні лікарські форми є стерильними і в формі, прийнятній для введення людям або іншим суб'єктам.

Фармацевтична композиція за даним винаходом складається для сумісності з передбачуваним шляхом введення. Приклади шляхів введення включають без обмеження парентеральні шляхи (тобто відмінні від введення через травний тракт), наприклад, внутрішньовенне, інтрадермальне, підшкірне, внутрішньом'язове, інгаляцію, інтраназальне, трансдермальне, місцеве, трансмукозальне, внутрішньопухлинне і внутрішньосиновіальне введення. У визначеному варіанті здійснення композиція складається відповідно до звичайних процедур у вигляді фармацевтичної композиції, пристосованої для внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньом'язового, інтраназального або місцевого введення людям. У визначених варіантах здійснення фармацевтична композиція складається відповідно до звичайних процедур для підшкірного введення людям. У одному варіанті здійснення фармацевтичні композиції для внутрішньовенного введення являють собою розчини в стерильному ізотонічному водному буфері. При необхідності, рармацевтична композиція може також включати солюбілізуючий агент і місцевий анестетик, такий як лігнокаїн, для полегшення болю в ділянці ін'єкції.

Приклади лікарських форм включають без обмеження рідкі лікарські форми, прийнятні для парентерального введення суб'єкту; і стерильні тверді лікарські форми (наприклад, кристалічні або аморфні тверді лікарські форми), вологовміст яких може відновлюватися для забезпечення рідких лікарських форм, прийнятних для парентерального введення суб'єкту. Ілюстративною твердою формою є ліофілізована тверда речовина.

Фармацевтична композиція, форма і тип лікарських форм за винаходом будуть звичайно варіюватися залежно від їх застосування. Наприклад, лікарська форма, що застосовується при визначеному лікуванні захворювання, може містити великі кількості одного або більше активних інгредієнтів, ніж лікарська форма, що застосовується при підтримуючому лікуванні тієї ж інфекції.

Аналогічним способом, парентентальна лікарська форма може містити менші кількості одного або більше активних інгредієнтів, ніж пероральна лікарська форма, що застосовується для лікування того ж захворювання або розладу. Дані і інші аспекти, в яких визначені лікарські форми за даним винаходом будуть відрізнятися одна від одної, будуть цілком зрозумілі фахівцям в даній галузі. Див., наприклад, Кетіпдіоп'є Рпагтасеціїса! Зсіепсев.

Загалом, інгредієнти фармацевтичних композицій за даним винаходом постачаються або окремо, або змішані разом в стандартній лікарській формі, наприклад, у вигляді сухого ліофілізованого порошку або безводного концентрату в герметично запаяному контейнері, такому як ампула або саше, з вказівкою кількості активного засобу. Коли фармацевтична композиція призначена для введення шляхом інфузії, вона може бути диспергована, причому інфузійний флакон містить стерильну воду або сольовий розчин фармацевтичної міри очищення. Коли фармацевтична композиція вводиться шляхом ін'єкції, то ампула стерильної води або сольового розчину для ін'єкцій може надаватися з тим, щоб інгредієнти могли змішуватися перед введенням. У одному варіанті здійснення лікарські форми за винаходом містять достатню кількість ЗМ5-595 для забезпечення можливості введення доз 5М5-595 в межах діапазону приблизно 10-100 мг/м на день, або на тиждень, що вводяться у вигляді однієї одноденної дози або у вигляді дробових доз протягом дня, що, можливо, приймаються з їжею.

У визначених варіантах здійснення фармацевтичні лікарські форми за винаходом включають первинний контейнер, що містить 5Ме5-595. У визначених варіантах здійснення первинний контейнер знаходиться всередині непрозорого вторинного контейнера. У одному варіанті здійснення первинний контейнер являє собою скляний флакон, такий як флакон з прозорого скла, а вторинний контейнер являє собою непрозорий, вистелений фольгою пакет, включаючи вистелений металевою фольгою пакет, такий як вистелений алюмінієвою фольгою пакет. У одному варіанті здійснення фармацевтичні лікарські форми за винаходом містять прозорий скляний флакон, що містить 5М5-595, де прозорий скляний флакон знаходиться всередині непрозорого пакету, вистелений алюмінієвою фольгою. Крім того, ілюстративні фармацевтичні лікарські форми включають ті, які описані в документі УМО 2008/016668, повністю включеному в даний опис шляхом посилання. У одному варіанті здійснення лікарські форми за винаходом містять приблизно 1-2000, 1-1000, 1-500, 1-300, 1-100 або 1-50 мг 5М5- 595. Конкретні лікарські форми за винаходом містять приблизно 10, 15, 18, 21, 24, 25, 30, 40, 48, 50, 60, 70, 72, 75, 80, 90, 100, 150, 200, 300 мул 500 мг 5М5-595.

Зрозуміло, що попередній детальний опис і супроводжуючі приклади є просто ілюстративними і не повинні сприйматися як обмеження об'єму предмета винаходу. Різні зміни і модифікації описаних варіантів здійснення будуть очевидні для фахівців в даній галузі. Такі зміни і модифікації, включаючи без обмеження ті, які стосуються способів застосування за винаходом, можуть бути внесені без відходу від його суті і об'єму. Патенти, патентні публікації і інші публікації, наведені в даному описі, включені в нього шляхом посилання. 7. Приклади

Визначені варіанти здійснення заявленого предмета винаходу ілюструються наступними необмежувальними прикладами.

Наступні лінії клітин використовувалися в описаних в даний заявці прикладах. Всі лінії клітин культивували в модифікованому за способом Дульбекко середовищі Ігла з додаванням 9 95 фетальної телячої сироватки і пеніциліну-стрептоміцину (90 ЕД/мл) (ОМЕМ), при 37"С і атмосфері 5 95 СО».

Лінія клітин 5РОВ8 несе спонтанно виникаючу мутацію в гені Прі, і була виділена у вигляді стійкого до 6-тіогуаніну (6) клону з лінії клітин фібробластів китайського хом'ячка У79. Мутація в межах гена прії являє собою тандемну дуплікацію екзону 7, інтрону 6 і ділянки 3' екзону 6, яка приводить до експресії нефункціонального протеїну НРКТ (Ббаге еї аІ., 5отаї СеїЇ Мої Сепеї, 1996, 22:201-210; і

Неїієдау еї аї., У Мої Віої, 1998, 279(4):687-694). Вказана дуплікація може бути втрачена за допомогою

НЕ, що повертає до дикого типу ген Пргі, який може бути вибраний в НА5Т (50 мкМ гіпоксантину, 10

МКМ І-азасерину, 5 мкМ тимідину) (Неїедау еї аІ. 1998). У ОМЕМ додавали 6ТО (5 мкг/мл) для знищення клітин, які зазнають спонтанного повернення в вихідний стан. Додавання 6ТО у вказаній концентрації не впливає ні на швидкість росту вказаних мутантів, ні на процедуру аналізу рекомбінації.

Лінію клітин 0-2 О5 (остеосаркоми людини) одержували з АТСС (НТВ-96).

Лінії клітин МС8 ії МС8-В2 утворюється з клітин фібробластичного ряду М79 яєчників китайського хом'ячка. МС8 має мутацію в гені ргса2, і МС8-В2 являє собою дану лінію клітин, доповнену людською хромосомою 13 (що містить ген Бгса2; КгааКтап-мап дег 7меї евї аї., Мої! Сеї! Віої, 2002, 22(2):669-679).

Наступні хімічні сполуки використовувалися в аналізах, описаних в даній заявці.

Порошок афідиколіну (Зідта) розчиняли в ДМСО до концентрації більше ніж 0,2 9.

Доксорубіцин (бЗідта) і камптотецин (Зідта) розчиняли в диметилсульфоксиді (ДМСО). Доза обробки не перевищувала 0,2 95 ДМСО. Аліквотні кількості тримали при -20 "С.

Розчин 5М5-595 (10 мг 5М5-595 на мл водного розчину 4,5 95 Ю-сорбіту доводили до рН 2,5 метансульфоновою кислотою) тримали при кімнатній температурі.

Розведення для обробки проводило безпосередньо перед обробкою в ОМЕМ.

Гамма опромінення виконували в камері С5797 (1,9 Гр/хв).

Приклад 1: Аналіз інгібування росту

Вплив ВКСА2 на чутливість до 5М5-595 оцінювали аналізом проліферації мутантних клітин китайського хом'ячка (МС8) і комплементованих відносно функціонального ВКСА2 (УС8-82).

Активність 5М5-595 в даних аналізах порівнювали з доксорубіцином. Наступний протокол використали для аналізу:

День 1 1. 4000 клітин/ямку висівали в 9б6-ямковий планшет так, що половина планшета містила клітини

МС8, а інша половина містила клітини МС8-82. Останню колонку залишали вільною від клітин як фоновий контроль. 2. Планшет інкубували при 37 "С в атмосфері 5 95 СО».

День 2 1. Середовище видаляли і 50 мкл свіжого середовища додавали в кожну ямку. 2. У першій колонці середовище видаляли і додавали 200 мкл або 0,5 мкМ доксорубіцину, або 1,5 мкм 5М5-595. 3. 100 мкл з першої колонки переносили у другу колонку і змішували. 100 мкл з другої колонки переносили в третю колонку і змішували, і так далі до кінця планшета. Одну колонку залишали необробленою. Планшет інкубували при 37 "С в атмосфері 5 95 СО». 4. Після 4-часової обробки планшет промивали двічі 100 мкл РВ5 і додавали 250 мкл середовища.

Планшет інкубували при 37 "С в атмосфері 5 95 СО».

День 7 1. Після інкубації протягом 120 год. планшет промивали 100 мкл РВЗ ії 100 мкл резазурину (10 мкг/мл в повному середовищі ОМЕМ, що не містить фенолу червоного). 2. Планшет інкубували при 37 "С в атмосфері 595 СО протягом 1 год., і флуоресценцію вимірювали при Ет (емісії) 530 нм/Ех (збудженні) 590 нм.)

На Фіг. 1 ї 2 ілюструється інгібування росту мутантних клітин китайського хом'ячка (МС8) і комплементованих відносно функціонального ВКСА2 (МС8-82) в присутності, відповідно, доксорубіцину і 5ЗМ5-595. У клітинах, мутантних відносно ВКСА2, було ідентифіковане п'ятикратне збільшення чутливості до 5М5-595, в порівнянні з клітинами, що експресують функціональний ВЕСА2 (ІСво 0,14 мкМ в порівнянні з 0,72 мкМ). Чутливість до доксорубіцину була збільшена приблизно в 4 рази (ІСво 0,05 мкМ в порівнянні з 0,19 мкМ).

Приклад 2: Аналіз росту колоній

Вплив ВКСА?2 на чутливість до 5М5-595 оцінювали аналізом з використанням міРНК розростання колоній у клітин 0-2 05, що включають клітини дикого типу, в порівнянні з клітинами з виснаженим запасом ВКСА2. Активність 5М5-595 у вказаних аналізах оцінювали клоногенним виживанням і порівнювали з доксорубіцином. Наступний протокол використали для аналізу:

День 1 1. 200000 клітин висівали в кожну з 2 ямок в б-ямковому планшеті і інкубували протягом ночі при 37 "С і атмосфері 5 95 СО».

День 2 1. Одержували наступні реагенти:

А: Тест: 50 мкл 2 мкМ 5івксСАЗ2 (зі зЗепоте 5ЗМАКТроої, Опагтасоп) т 150 мкл ОрИМЕМ (сіБрсо)

В: Контроль (без міРНК): 200 мкл ОРІМЕМ

С: 2 мкл Опагтагесі 1 (Опаптасоп) ж 198 мкл ОрРІМЕМ 2. Реагентам давали можливість відстоятися при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. 3. Реагенти АкС і ВС змішували, і їм давали можливість відстоятися при кімнатній температурі протягом 20 хв. 4. Середовище в ямці замінювали 1,6 мл середовища, що не містить антибіотики (ОМЕМ, сірсо). 5. Додавали 400 мкл реагентів А«В або ВС і змішували в ямці. Планшет інкубували при 37 2.

День З 1. Після 24 год. обробки міРНК клітини трипсинізували і підраховували. 2. Клітини висівали в чашки діаметром 100 мм при густині 500 або 1000 клітин/чашку в 10 мл середовища і інкубували протягом 4 год. 3. Через 4 год. додавали речовини, що тестуються, і планшети інкубували протягом 14 днів.

День 17 1. Клітини в планшетах збирали і фіксували в метиленовому синьому (4 г/л в метанолі), і підраховували колонії, що містять більше ніж 50 клітин.

Розростання колоній на Фіг. З і 4 ілюструє, що клітини О-2 О5 з виснаженням запасу ВКСА2, використовуючи міРНК, в 4,6 разів більш чутливі до обробки 5М5-595, ніж клітини дикого типу.

Приклад 3: Гель-електрофорез в пульсуючому полі (РЕСЕ) 2 мільйони клітин (2х105у 5РО8 висівали у флакони (75 см3) і інкубували протягом ночі. У подальшому клітини обробляли 5М5-595 (20 мкМ) або доксорубіцином (3 мкМ) і піддавали спільній обробці афідиколіном (3 мкМ) протягом 4 год. перед вплавляти в агарозну вставку (1 х106 клітин/70 мкл 1 95 ІпСегі Адагозе, ВМА). Вставки переносили в 0,5 М ЕОТА 1 95 М-лаурилсаркозил і протеиназу

К (1 мг/мл) і інкубували при 50 "С протягом 48 год. і потім промивали чотири рази в ТЕ-буфері (2 год. між кожним промиванням) перед завантаженням на агарозний сепараційний гель (195 агарозу хромосомного сорту, Віо-Кад). Сепарацію виконували на системі СНЕБЕ ОК ІІІ зуєтет (ВіокКай; кут поля 120", час включення 240 секунд, 4 в/см) протягом 18 год. або протягом 24 годин при часі включення від 60 до 240 секунд. Гель забарвлювали етидієм бромідом протягом 5 год. і в подальшому аналізували скануючим ридером флуоресценції (МоІесшіаг Ітадег ЕХ, ВіоКай) з використанням програмного забезпечення Оцапіаїйме Опе.

На Фії. 5 і фіг. 6 представлені дані аналізу РЕСЕ клітин, оброблених 5М5-595, доксорубіцином і при спільній обробці з афідиколіном. На фіг. 5 представлений цикл РЕСЕ протягом 18 год. при часі включення 240 секунд. На Фіг. 6 представлений сеанс РЕСЕ протягом 24 год. при часі включення від 60 до 240 секунд. Дані демонструють продукцію більш дрібних фрагментів ДНК в клітинах, оброблених доксорубіцином, в порівнянні з клітинами, обробленими 5М5-595.

На Фіг. 7 представлені дані, що ілюструють продукцію маленьких фрагментів ДНК після обробки доксорубіцином і 5М5-595 протягом 18-годинного сеансу РЕСЕ при часі включення 240 секунд.

Відмінність ушкоджуючої ДНК активності 5М5-595 і доксорубіцину демонструється продукцією маленьких фрагментів ДНК в клітинах, оброблених доксорубіцином, в порівнянні з клітинами, обробленими ЗМ5-595.

На Фіг. 8 представлені дані, що ілюструють продукцію маленьких фрагментів ДНК після обробки доксорубіцином і 5М5-595 протягом 24-годинного сеансу РЕСЕ при часі включення від 60 до 240 секунд. І в цьому випадку клітини, оброблені доксорубіцином, продукують менші фрагменти ДНК, ніж клітини, оброблені 5М5-595.

Приклад 4: Аналіз рекомбінації

Кожну колбу (75 смУу) інокулювали 1,5х105 клітин 5РОЗВ за 24 год. до обробки 5М5-595 (2 мкМ) або доксорубіцином (0,5 мкМ) і при спільній обробці з афідиколіном (0,5 мкМ). Після 4 год. обробки колби двічі промивали РВ5 і додавали 20 мл ОМЕМ. Потім клітки інкубували протягом 48 год. для витягання перед висіванням на чашки Петрі. Ефективність клонування вимірювали висіванням 500 клітин в 10 мл середовища, по 2 чашки Петрі на дозу. НРЕТ ж ревертанти відбирали висіванням 3х109 клітин/чашку в присутності НА5Т (50 мкМ гіпоксантину, 10 мкМ І -азасерину, 5 мкМ тимідину), по З чашки на дозу. Відповідно, через 7 і 10 днів клітини з чашок збирали, і колонії фіксували і забарвлювали з використанням метиленового синього в метанолі (4 г/л). Підраховували колонії, що містять більше ніж 50 клітин.

На Фіг. 9 ілюструється ефективність клонування клітин 5РОВ після обробки афідиколіном або 5М5- 595, або доксорубіцином окремо, або при спільній обробці з афідиколіном. Як видно з представлених даних, обробка 5М5-595 або доксорубіцином значно порушувала ефективність клонування.

Афідиколін (блокатор 5-фази) спричиняв зниження цитотоксичності обох лікарських засобів, причому це було більш значуще для 5М5-595 (р-0,007), ніж для доксорубіцину (р-0,04). Це демонструє, що компонент цитотоксичності 5М5-595 викликається під час З-фази, і що більша частина цитотоксичності є незалежною від 5-фази.

На Фіг. 10 ілюструється частота реверсії клітин 5РОВ після обробки афідиколіном або 5М5-595 або доксорубіцином окремо і при спільній обробці з афідиколіном. Обробка 5М5-595 і доксорубіцином збільшувала частоту реверсії у клітин 5РОВ8, що відображає збільшений рівень явищ гомологічної рекомбінації. Блок 5-фази (спільна обробка афідиколіном) не здійснювала ефект на частоту реверсії, викликаної 5М5-595, але значно зменшував викликані доксорубіцином явища рекомбінації (р-0,04). Це демонструє, що викликані 5М5-595 явища рекомбінації НЕК є незалежними від 5-фази, на відміну від доксорубіцину, при якій компонент викликаної НЕК рекомбінації викликається під час 5-фази. Ці дані, крім того, диференціюють молекулярний механізм дії 545-595 від механізму дії доксорубіцину.

Приклад 5: Фармацевтична композиція, прийнятна для ін'єкції або внутрішньовенної інфузії

Ілюстративний приклад прийнятної фармацевтичної композиції включає: 10 мг 5М5-595 ї (ж)-1,4- дигідро-7-((35,45)-3-метоксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонової кислоти (де кількість ЗМ5-595 становить щонайменше 99,95 95, а кількість (ж)-1,4-дигідро-7-((35,45)-3- метоксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-З-карбонової кислоти становить менше ніж приблизно 0,05 95) на мілілітр (мл) водного 4,5 95 розчину ЮО-сорбіту, рН якого доводили до 2,5 метансульфоновою кислотою. Одна послідовність операцій для приготування такого розчину включає наступну для одержання розчину з концентрацією 100 мг/10 мл: 100 мг активної композиції, яка складається по суті з щонайменше 99,95 95 5М5-595 і менше ніж 0,05 95 (-)-1,4-дигідро-7-(35,45)-

З-метоксі-4-аміно-1-піролідиніл|-4-оксо-1-(2-тіазоліл)-1,8-нафтиридин-3-карбонової кислоти, і 450 мг О- сорбіту, додавали до дистильованої води; об'єм доводили до об'єму 10 мл; і рН одержаного розчину доводили до 2,5 метансульфоновою кислотою. Одержана композиція була прийнятна також для ліофілізації. Потім вологовміст ліофілізованої форми відновлювали стерильною водою до прийнятної концентрації перед використанням.

Приклад 6: Фармацевтична композиція, прийнятна для ін'єкції або внутрішньовенної інфузії

Ілюстративний приклад прийнятної фармацевтичної композиції включає: 10 мг загальної кількості

ЗМ5-595 і домішки (де кількість 5М5-595 становить щонайменше приблизно 99,95 95 і загальна кількість домішок становить менше ніж приблизно 0,05 95) на 1 мл водного розчину 4,5 95 сорбіту, рн якого доводиться до рН 2,5 метансульфоновою кислотою. Одна послідовність операцій для приготування такого розчину включає наступну для одержання розчину з концентрацією 100 мг/10 мл: 100 мг композиції, що складається по суті з щонайменше 99,95 95 5М5-595 і менше ніж 0,05 95 домішок, і додавали 450 мг ЮО-сорбіту до дистильованої води; об'єм доводили до об'єму 10 мл; і рн одержаного розчину доводили до рН 2,5 метансульфоновою кислотою. Одержана композиція була прийнятна також для ліофілізації. Потім вологовміст ліофілізованої форми відновлювали стерильною водою до прийнятної концентрації перед використанням.

Варіанти здійснення заявленого предмета винаходу, описаного вище, призначені для розгляду лише як ілюстративні, і фахівці в даній галузі зрозуміють або зможуть не більше ніж за допомогою звичайного експериментування встановити численні еквіваленти визначених сполук, матеріалів і процедур. Всі такі еквіваленти вважаються такими, що входять в об'єм заявленого предмета винаходу і охоплюються прикладеною формулою винаходу.

ДИ КК У ТУ УТ МУ Кук ізо Т707У--О т т ! 3 УС

ТО Б. у !

Ши яса ов у ! й

Ті | ш

З ; ї ШЕ - х ої

Ро ї ї їх

Ах М шк . х ще

Н о. ре Е ! В - и с ОО ши ши ! "их ши и ния я

Чокеорувцив (МЕМ шиншил шшшишшаии ши

Фіг. 1 иа нини МК КЕТК ТАКТ КАСІ ВЕЖ Є тет НТК пн шия ій --Усв

Е, ії я відновлений СВ і «а ія і їх є Я а що не г: урн кан пов пи ни я» щ оегеоопопоссєкуююьнтянив 0 0.5 ї їв К мем 8М8-596

Фіг. я їй е і свй у - тя

Ше - скан МО : пк . ще» Я шко. Ви ще

В 5 з нВВОАЕ я 103 Ех ці

З : - ! . і 51 я 5 ! ! 5 :

Ка ;

ШО і а й Я й В кепка мМ

Фіг. З й по як ж ло 4 Ж й ре ! вчя Е

З | м

З ох ! го сао ЦО НБН АЮ

О. З - Е: пов пивні зі вв вв вені й 1 ; о о 15 мав

ВИЗ нм

Фіг. Я щ Б Ще В не Го Тс Не жо

КЕ НЯ р ма ою че ря Ж їх Я чт ще 2. МЕ в З АЖ НК ФО че В Но я іл шок х а як КЗ - як | ром 5, т - с др 53 щЕоо - боса й МНН БО ЯНА СОН. О. о на сени нн ЗОНИ г ! і я й ек Е ЯЕ

У с її

ГІ ре щ : : 2 2 Й о як, СИ І Пю І « Я шо щ І

І І Я їх ї ж ЧА» п :

КЕ ИЙ : : Бе ТИ; с», Мих суЯ «Ех З І СОЯ 07 т й те и ПЕ х : п ї

Фіг. 5 є НІ е а ря т й -к в В шо В

В Ко -Х же . «ДЕ - т . с 5 г. 2 КУ ще ЖЕ щу м

Ко мо ця Х БА косо в

В а сш Ши т м о

Бе ху З о Її і їй

З щЩ їй ЩО й ах а ї КУ ГОНШНЕЯ " М яй о ІЙ й : В : ї а 38 - : : :

Ю : : хх г: с Я с щ : о ! Її

Тед 1 : х ОА З З тя

КО. щу :

У 0 : : : : ; і і : ! йо бик В : : З а ОВ ; : ; пев її

Ве Не : ; мн Кк

Фіг. б

Ж та

В

Я Непошкоджена Повкоджена ДНК в |. ЛНК іо: ід Я ш пекти тини ння тики длдлня г раки не Ка що В Ж | сення ДОоЖКсОорУуВщин ах м Шк сш х /в й -

А З І сен БНВ-595

НВ р шен 15бу

Гяй ее СУ І до ль , а пл 4) ьк ШО щ - ,

Ган ; й щи нин пом: ло ПИ винний полин Подання 24 зв лава 04 02

Фіг. 7

Непоогжеза я онтуки дик Пошкоджена ДИК

Е шо і я панянок

КЕ | о Докеоруйіцив я є пеютеою кі Но Ж н г; 1 у шк лю

Бех ЕЕ ; домо г ще І і

СЕ

СБ мі) В и: НЕ і фено же і; я митні пиши зими зовн попімвннювввнннннь поенннннинн мотив панна и їв з я па ца ах жі фіг. 5 лай я 180 4 й і е 160 Е

У Е м 120 -

Я «004 кю

З

8 вВо- т ї во 5 0

Я

204 їх ! о ние Мак а ух ТЕ ше ж т М

Б що БЕ що : У и є ба Ге) ж т яку 2 ве; З БОБ я ча си ра о -х Ж т ЕХ ка

Я щі

Фіг. 9 14 12 с ко 10 і в 85 п | як 8: ще щ щ

З 4 В г ї : ШЕ!

КІ ! я с. 5. Не 7 Е їх В ще пс

Ку ої їк Б В шох г в аа В

В З ще ОВ го В

Гу В Бе 2 як га жк я ВОше , а - пе ря за щ й й в 12 ж

Ге

Фіг. 10