UA10385U - METHOD FOR DIAGNOSING Ph' LEUKEMIAS WITH THE AID OF SPECIFIC PRIMERS - Google Patents
METHOD FOR DIAGNOSING Ph' LEUKEMIAS WITH THE AID OF SPECIFIC PRIMERS Download PDFInfo
- Publication number
- UA10385U UA10385U UAU200503775U UAU200503775U UA10385U UA 10385 U UA10385 U UA 10385U UA U200503775 U UAU200503775 U UA U200503775U UA U200503775 U UAU200503775 U UA U200503775U UA 10385 U UA10385 U UA 10385U
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- primers
- stage
- polymerase chain
- chain reaction
- synthesis
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 25
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 14
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 11
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 abstract 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 208000014767 Myeloproliferative disease Diseases 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000002559 cytogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000033761 Myelogenous Chronic BCR-ABL Positive Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N thymol Chemical compound CC(C)C1=CC=C(C)C=C1O MGSRCZKZVOBKFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N Aesculin Natural products OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1Oc2cc3C=CC(=O)Oc3cc2O PLXMOAALOJOTIY-FPTXNFDTSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100024365 Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 101000833314 Homo sapiens Arf-GAP domain and FG repeat-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000235 Myeloperoxidases Proteins 0.000 description 1
- 102000003896 Myeloperoxidases Human genes 0.000 description 1
- 235000012093 Myrtus ugni Nutrition 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101000746496 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) GTP-binding protein ypt3 Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 244000061461 Tema Species 0.000 description 1
- 239000005844 Thymol Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000013394 immunophenotyping Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 206010024378 leukocytosis Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 210000004214 philadelphia chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229960000790 thymol Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Опис винаходуDescription of the invention
Пропонована корисна модель відноситься до медицини, а більш конкретно - до засобів діагностики лейкемії. 2 Згадані засоби застосовують у повсякденній практиці. Вони включають дослідження таких цитологічних критеріїв, як форма та розмір клітин, характер зернистості цитоплазми, ядерно-цитоплазматичне співвідношення, структура ядра, а також доповнюються використанням протоколів для детекції характерної генномної перебудови за допомогою полімеразної ланцюгової реакції з специфічними праймерами.The proposed useful model relates to medicine, and more specifically to leukemia diagnostics. 2 The mentioned means are used in everyday practice. They include the study of such cytological criteria as the shape and size of cells, the nature of the granularity of the cytoplasm, the nuclear-cytoplasmic ratio, the structure of the nucleus, and are also supplemented by the use of protocols for the detection of characteristic genomic rearrangements using polymerase chain reaction with specific primers.
Згадані протоколи можуть бути застосовані в клінічній гематології для детекції наявності гібридного 70 роуаві у хворих на мієлопроферативні захворювання в тих випадках, коли стандартні протоколи не засвідчують наявності бег/арі перебудови.The mentioned protocols can be applied in clinical hematology to detect the presence of hybrid 70 roavi in patients with myeloproliferative diseases in cases where standard protocols do not confirm the presence of beg/ari rearrangement.
Методи діагностики лейкемій, які застосовують у повсякденній практиці, включають використання простих цитологічних критеріїв, таких як форма та розмір клітин, характер зернистості цитоплазми, ядерно-цитоплазматичне співвідношення, структура ядра тощо. Ці методи доповнюються також цитохімічними 12 методами (визначення активності кислої фосфатази, мієлопероксидази, РАБ реакція) (1). На підставі результатів, що дають ці методи, можна встановити діагноз у більшості пацієнтів.Methods of diagnosis of leukemias, which are used in everyday practice, include the use of simple cytological criteria, such as the shape and size of cells, the nature of the granularity of the cytoplasm, the nuclear-cytoplasmic ratio, the structure of the nucleus, etc. These methods are complemented by 12 cytochemical methods (determination of activity of acid phosphatase, myeloperoxidase, RAB reaction) (1). Based on the results of these methods, a diagnosis can be established in most patients.
Для уточнення природи конкретного лейкемічного клону необхідне імунофенотипування та цитогенетичний аналіз. Використання моноклональних антитіл, імунофлуоресцентних та імуноферментних методів дозволяє більш точно встановлювати рідкісні форми та варіанти лейкемій і, таким чином, застосовувати відповідні протоколи лікування (2; З).To clarify the nature of a specific leukemic clone, immunophenotyping and cytogenetic analysis are necessary. The use of monoclonal antibodies, immunofluorescent, and immunoenzymatic methods allows more accurate identification of rare forms and variants of leukemias and, thus, the application of appropriate treatment protocols (2; C).
Хромосомні транслокації виявляють при більшості неоплазій людини і, переважно, саме вони зумовлюють один чи декілька етапів пухлинного розвитку.Chromosomal translocations are found in most human neoplasias and, mostly, they cause one or more stages of tumor development.
У зв'язку з цим результати цитогенетичного аналізу, під час якого виявляють характерні аномалії (транслокації, інверсії, делеції тощо) шляхом диференційного забарвлення хромосом, мають самостійне діагностичне і прогностичне значення |4; 6)Ї. Першим подібним маркером пухлинного росту була маленька в б-забарвлена хромосома, описана в 1960Ор. і названа філадельфійською (РИ) І7|. Утворення даної хромосоми обумовлене реципрокною транслокацією між 9 і 22 хромосомами І (9:22) (д34: 411) (8). Її виявили приблизно у 9590 хворих на хронічну гранулоцитарну лейкемію, а також у 25-3095 дорослих та 2-1095 дітей, хворих на гостру лімфобластну лейкемію (ГЛЛ) (|9). На молекулярному рівні утворення філадельфійскої хромосоми о супроводжується утворенням нового злитого рег/арі гена (представленого на 5- кінці ділянкою гена бБсг, а на сIn this regard, the results of cytogenetic analysis, during which characteristic anomalies (translocations, inversions, deletions, etc.) are detected by differential staining of chromosomes, have an independent diagnostic and prognostic value |4; 6) She. The first such marker of tumor growth was a small b-colored chromosome described in 1960. and named Philadelphia (RI) I7|. The formation of this chromosome is due to reciprocal translocation between 9 and 22 chromosomes I (9:22) (d34: 411) (8). It was found in approximately 9,590 patients with chronic granulocytic leukemia, as well as in 25-3,095 adults and 2-1,095 children with acute lymphoblastic leukemia (ALL) (|9). At the molecular level, the formation of the Philadelphia chromosome o is accompanied by the formation of a new fused reg/ari gene (represented at the 5-end by a region of the bBsg gene, and on c
З-кінці -ділянкою гена арі (10). Як показали численні експерименти, саме продукт транскрипції гена Беаг/арі є головним етіологічним моментом у розвитку РІ" лейкемії. Наявність цього гена в клітинах крові та кісткового о мозку дозволяє виявляти Рі! хромосому методами молекулярної біології. Га»)From the end - a section of the ari gene (10). As numerous experiments have shown, it is the Beag/ari gene transcription product that is the main etiological factor in the development of RI" leukemia. The presence of this gene in blood and bone marrow cells allows detection of the RI! chromosome by molecular biology methods. Ha")
На сьогодні молекулярно-біологічні методи включають методи з використанням геномних зондів |11; 121, 3о полімеразної ланцюговою реакції (13; 14), флюоресценцію іп зіш гібридизацію (РІЗН) (151, "РОК іп сеї!" (16) тощо. --Today, molecular biological methods include methods using genomic probes |11; 121, 3o polymerase chain reaction (13; 14), fluorescence IP hybridization (RIZN) (151, "ROC IP sei!" (16), etc. --
Найбільш близьким до пропонованого способу за кількістю суттєвих ознак є відомий спосіб діагностики РИ! лейкемій за допомогою специфічних праймерів, який включає операції отримання зразка крові хворого, приготування реакційної суміші для синтезу кДНК, яка містить РНК, відповідний праймер, зворотну транскиптазу «The closest to the proposed method in terms of the number of essential features is the well-known method of diagnosing RI! leukemia with the help of specific primers, which includes the operations of obtaining a patient's blood sample, preparing a reaction mixture for the synthesis of cDNA, which contains RNA, the appropriate primer, reverse transcriptase "
М-МІМ (сірсоВвК/), РНазін, і аМмТР та буфер для зворотної транскриптази, проведення синтезу при температурі З 36,8..37,22с протягом 50-70 хвилин, використання аліквоти реакційної суміші для проведення ампліфікації, при с цьому на першому етапі проводять серію циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних "з праймерів при заданому температурному режимі синтезу, далі проводять другий етап полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі, а продукти ампліфікації аналізують у агарозному гелі і прогнозують подальший перебіг захворювання |Г.Д. Телегеєв, М.В. Дибков, М.В. -з 15 Божко, Н.М.Третяк, С.С.Малюта Молекулярно-біологічна діагностика неопластичних захворювань крові //M-MIM (sirsoVvK/), RNazin, and aMMTR and a buffer for reverse transcriptase, carrying out the synthesis at a temperature of 36.8..37.22 s for 50-70 minutes, using an aliquot of the reaction mixture for amplification, while on the first stage, a series of polymerase chain reaction cycles are carried out using the appropriate primers at a given temperature regime of synthesis, then a second stage of the polymerase chain reaction is carried out using the appropriate primers at a given temperature regime, and the amplification products are analyzed in an agarose gel and the further course of the disease is predicted |H. D. Telegeev, M. V. Dybkov, M. V. -z 15 Bozhko, N. M. Tretyak, S. S. Malyuta Molecular and biological diagnosis of neoplastic blood diseases //
Цитология и генетика, 1998, 7.32, М1, С.71-78.|.Cytology and genetics, 1998, 7.32, M1, P.71-78.|.
І ав | Недолік описаного способу полягає в недостатній достовірності отриманих результатів діагностики, зокрема, у хворих на мієлопрофілеративні захворювання. Це викликано тим, що праймери, які використовують у о згаданому способі, не враховують факту високої нестабільності пухлинного генному. Це в деяких випадках (ее) 50 призводить до неможливості отримання позитивної ланцюгової реакції при наявності характерної геномної перебудови (Брег/абі). сл В основу пропонованого винаходу поставлено задачу створення такого методу діагностики, який би підвищив достовірність отриманих результатів діагностики у хворих на мієлопрофілеративні захворювання за рахунок створення умов для зменшення негативних моментів полімеразної ланцюгової реакції шляхом врахування 959 нестабільності пухлинного геному. с Поставлена задача вирішується у пропонованому способі, який, як і відомий спосіб діагностики Рі" лейкемій за допомогою специфічних праймерів, який включає операції отримання зразка крові хворого, приготування реакційної суміші для синтезу кКДНК, яка містить РНК, відповідний праймер, зворотну транскиптазу М-МІ М (сіосовКкІ), РНазін, і аМТР та буфер для зворотної транскриптази, проведення синтезу при температурі 60 т-36,8...37,22С протягом 50-70 хвилин, використання аліквоти реакційної суміші для проведення ампліфікації, при цьому на першому етапі проводять серію циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі синтезу, далі проводять другий етап полімеразної ланцюгової реакції з використанням відповідних праймерів при заданому температурному режимі, а продукти ампліфікації аналізують у агарозному гелі і прогнозують подальший перебіг захворювання, а, відповідно до пропозиції, як бо праймери під час приготування реакційної суміші для синтезу КДНК використовують, відповідно, праймери РпПІ-їAnd av | The disadvantage of the described method is the insufficient reliability of the obtained diagnostic results, in particular, in patients with myeloproliferative diseases. This is caused by the fact that the primers used in the mentioned method do not take into account the fact of high instability of the tumor genome. This in some cases (ee) 50 leads to the impossibility of obtaining a positive chain reaction in the presence of a characteristic genomic rearrangement (Breg/abi). sl The proposed invention is based on the task of creating such a diagnostic method that would increase the reliability of the obtained diagnostic results in patients with myeloproliferative diseases by creating conditions for reducing the negative moments of the polymerase chain reaction by taking into account 959 instability of the tumor genome. c The task is solved in the proposed method, which, like the known method of diagnosing Ri" leukemia with the help of specific primers, which includes the operations of obtaining a patient's blood sample, preparing a reaction mixture for the synthesis of cDNA, which contains RNA, a suitable primer, reverse transcriptase M-MI M (siosovKkI), RNazin, and aMTP and buffer for reverse transcriptase, carrying out the synthesis at a temperature of 60 t-36.8...37.22C for 50-70 minutes, using an aliquot of the reaction mixture for amplification, while at the first stage a series of polymerase chain reaction cycles are carried out using the appropriate primers at a given synthesis temperature, then the second stage of the polymerase chain reaction is carried out using the appropriate primers at a given temperature, and the amplification products are analyzed in an agarose gel and the further course of the disease is predicted, and, according to the proposal , like primers during the preparation of reaction c primers for cDNA synthesis are used, respectively, RpPI primers
(5-СТСТТСОСТОТТСАССОСАСОСТО-3) та РНІ-г (Х-ВОСТТАСАСТОТТАТСТОСАСТОСС-3), а на другому етапі полімеразної ланцюгової реакції використовують праймери РА-ї (Х-СТОСАААТООТАСАТТССОСТСАС-3) та РА-Г (5-ААССАОСООСТТСАСТСАСАСС-3).(5-СТСТТСОСТОТТСАССОСАСОСТО-3) and РНИ-г (Х-ВОСТТАСАСТОТТАТСТОСАСТОС-3) and at the second stage of the polymerase chain reaction, primers RA (Х-СТОСАААТОТАСАТТССОТСАС-3) and RA-Г (5-ААСАОСОOSTТСАССАССС-3) are used.
Використання пропонованого способу з праймерами РНІ-, РпІ-г, РИА-ї, Ри-г дає можливість підвищити достовірність отриманих результатів діагностики у хворих на мієлопрофілеративні захворювання за рахунок створення умов для зменшення негативних моментів полімеразної ланцюгової реакції і врахування факту високої нестабільності пухлинного генному та отримання позитивної ланцюгової реакції при наявності характерної геномної перебудови (реаг/абі). 70 Використовували зразки крові хворих, які лікувалися в гематологічних клініках м. Києва. РНК отримували за відомою методикою (|17)Ї. Реакційна суміш для синтезу кКДНК містила 1-5мкг РНК, 10 рмМ праймера А!1 (5-ТОАТТАТАСОССТААСАСССОА-3)), 20 од. зворотної транскиптази М-МІ М (бірсоВвк/), 10-20 од. РНазіну, ІіммМ амтР, буфер для зворотної транскриптази. Загальний об'єм суміші склав 4О0мкл. Синтез проводили при 372 протягом 1 год. Аліквоти реакційної суміші (5-10 мкл) використовували для проведення ампліфікації. На першому 7/5 етапі проводили 30 циклів полімеразної ланцюгової реакції з використанням праймерів РНІ-ї та РпЇ-г в об'єміThe use of the proposed method with primers RNI-, RpI-g, RIA-i, Ry-g makes it possible to increase the reliability of the obtained diagnostic results in patients with myeloproliferative diseases by creating conditions for reducing the negative moments of the polymerase chain reaction and taking into account the fact of high instability of the tumor gene and obtaining a positive chain reaction in the presence of a characteristic genomic rearrangement (reaction/abi). 70 Blood samples from patients who were treated in hematology clinics of Kyiv were used. RNA was obtained according to the known method (|17)Y. The reaction mixture for the synthesis of cDNA contained 1-5 μg of RNA, 10 ppm of primer A!1 (5-TOATTATASOSSTAAAASSSOA-3)), 20 units. reverse transcriptase M-MI M (birsoVvk/), 10-20 units. RNase, ImmM amtR, buffer for reverse transcriptase. The total volume of the mixture was 400 μl. The synthesis was carried out at 372 for 1 hour. Aliquots of the reaction mixture (5-10 μl) were used for amplification. At the first 7/5 stage, 30 cycles of the polymerase chain reaction were carried out using the primers RNI-i and RpI-r in volume
ЗО мкл, за умов, що рекомендовані фірмою-виготовлювачем Тад-полімерази. Температурний режим синтезу: 9490 - 18 сек, 5590 - 1всек, 7220- 1хв. Далі проводили другий етап ПЛР з використанням праймерів Рі-і та Ри-г 9490 - 24 сек, 5820 -18 сек, 7290 - 1 хв. Продукти ампліфікації аналізували в 395 агарозному гелі.3 μl, under the conditions recommended by the manufacturer of Tad polymerase. Synthesis temperature regime: 9490 - 18 sec, 5590 - 1 sec, 7220 - 1 min. Next, the second stage of PCR was carried out using primers Ri-i and Ri-g 9490 - 24 sec, 5820 -18 sec, 7290 - 1 min. Amplification products were analyzed in a 395 agarose gel.
Полімеразна ланцюгова редакція застосовується для отримання значної кількості певних ділянок молекулиPolymerase chain editing is used to obtain a significant number of specific regions of a molecule
ДНК. Це досягається проведенням декількох (до 40) циклів, кожен з яких складається із стадії денатурації, стадії віджигу та стадії синтезу. На стадії синтезу відбувається копіювання ДНК ланцюга (на ділянці, обмеженій спеціально підібраними праймерами) термостабільним ферментом. У нашому випадку напрацьовували ділянку гібридного гена рег/арі. У зв'язку з тим, що розрив у генах бБсг та арі відбувається на значних за розміром ділянках, це робить проблематичним застосуванням ДНК в полімеразній ланцюговій реакції, тому в діагностиці використовують дослідження РНК, яка має значно менший розмір. Через те ПЛР розпочинали 7 з отримання ДНК копії (КДНК), яку синтезували за допомогою зворотної транскриптази, використовуючи РНК як матрицю і праймер А1 як затравку. Перший етап ПЛР, що проводили з використанням праймерів РпІ-ї та РАІ-г, не дав необхідної для візуального виявлення в агарозному гелі такої кількості продукту. Тому проводили другий етап ПЛР, використовуючи аліквоту ПЛР продукту з першого етапу та інші (внутрішні) праймери РНА-ї та Р-г. ІФ)DNA. This is achieved by carrying out several (up to 40) cycles, each of which consists of a denaturation stage, an annealing stage and a synthesis stage. At the synthesis stage, the DNA chain is copied (in the area limited by specially selected primers) by a thermostable enzyme. In our case, a section of the reg/ari hybrid gene was developed. In connection with the fact that the break in the bBsg and ari genes occurs in large areas, this makes the use of DNA in the polymerase chain reaction problematic, therefore, in diagnostics, the study of RNA, which has a much smaller size, is used. Because of that, PCR was started 7 by obtaining a DNA copy (cDNA), which was synthesized with the help of reverse transcriptase, using RNA as a template and primer A1 as a seed. The first stage of PCR, which was carried out using the primers PpI-i and RAI-g, did not give the amount of product necessary for visual detection in an agarose gel. Therefore, the second stage of PCR was performed, using an aliquot of the PCR product from the first stage and other (internal) primers RNA-i and P-r. IF)
Приклад 1. соExample 1. co
Отримана електрофореграма продукту ПЛР при дослідженні крові хворого К. Хворий 1956 р.н., ліквідатор аварії на ЧАЕС. Вперше на прийомі в травні 1999 року, в гемограмі з 1992р. - нейтрофільний лейкоцитоз з8 «9 тенденцією до зростання. Аналіз крові 7.07.1999р.: Ер - 5х10", НЬ - 143 г/л, І - 114х109, е- 295, п - 595, с - о ббоб, л-1895, м - 1095, ШОЕ - 12мм/год. Наступний аналіз крові 31.08.2000 р. Ер - 5х1072, Нр-168Гг/л, тр - 250х109, 1 - 18,9х109, е - 2965, п - 795, с - 6495, л - 2095, м - 795, ШОЕ -7мм/год. Стаціонарне лікування - проводили з 5.09.2000 р. по 19.09.2000 р. При надходжені: скарги за загальну слабкість, болі в суглобах.Obtained electrophoreogram of the PCR product during the examination of the blood of the patient K. Khvoryy, born in 1956, liquidator of the accident at the Chernobyl nuclear power plant. For the first time at the reception in May 1999, in the hemogram from 1992. - neutrophilic leukocytosis with an increasing tendency. Blood analysis on July 7, 1999: Er - 5x10", Hb - 143 g/l, I - 114x109, e - 295, p - 595, c - o bbob, l - 1895, m - 1095, ESR - 12mm/h. The next blood test was on August 31, 2000. Er - 5x1072, Hr-168Hg/l, tr - 250x109, 1 - 18.9x109, e - 2965, p - 795, c - 6495, l - 2095, m - 795, SHOE - 7mm/h Inpatient treatment - was carried out from 09/05/2000 to 09/19/2000 When received: complaints of general weakness, pain in the joints.
Об'єктивно: шкіра чиста, печінка та селезінка не збільшені. Аналіз крові 6.09.2000 р.: Ер - 5,3х10"?, Нь - 176г/л, тр - 275хХ109, 1 - 15,7х109, е - 296, п - 795, с - 6695, л-1695, м - 995, ШОЕ - Тмм/год. « 20 Дослідження кісткового мозку: бласти - 2,095, нейтроф., пром - 0,595, мієл -8,595, п -2495, с - 27,595, еоз - 2 с О,БУб, л - 10,595, м - 2,095, пл. кл -1,595, еритробл - 0,595, нормоцити баз. -1,595, нормоцити поліхр. 4,590, нормоцити кс. - 8,095. При цитохімічному дослідженні лужної фосфатази нейтрофілів не виявили. Біохімічний :з» аналіз крові 6.09.2000 р. - незначне підвищення тимолової проби, інші показники в нормі.Objectively: the skin is clean, the liver and spleen are not enlarged. Blood analysis on September 6, 2000: Er - 5.3x10"?, N - 176g/l, tr - 275xX109, 1 - 15.7x109, e - 296, p - 795, c - 6695, l-1695, m - 995, ESR - Tmm/hour « 20 Bone marrow research: blasts - 2,095, neutrophils, prom - 0,595, myel -8,595, p -2495, s - 27,595, eoz - 2 s O,BUb, l - 10,595, m - 2.095, white blood cells -1.595, erythrocytes - 0.595, normocytes base -1.595, normocytes polychrome - 4.590, normocytes KS - 8.095. No neutrophils were detected during the cytochemical study of alkaline phosphatase. Biochemical: blood analysis on September 6, 2000. - slight increase in thymol test, other indicators are normal.
УЗД: печінка та селезінка - не збільшені.Ultrasound: the liver and spleen are not enlarged.
Невизначеність клінічної картини обумовило проведення тесту на наявність РИ" хромосоми. Використання - стандартного набору праймерів (В1, АТ, В2, АЗ) не виявило Беаг/арі -перебудову.The uncertainty of the clinical picture led to the test for the presence of the RI" chromosome. The use of a standard set of primers (B1, AT, B2, AZ) did not reveal the Beag/ari rearrangement.
При проведенні аналізу крові методом ПЛР з використанням праймерів, що згадані у пропонованому способі, о виявили фрагмент гену регарі розміром 530 п.н. На підставі цього поставили діагноз: хронічна мієлоїдна с лейкемія (ХМ, вперше виявлена, початкова стадія. 20 Приклад 2 бо Аналіз крові хворого Є. (гостра лімфобластна лейкемія 12, не Т-клітинний варіант, 1 гострий період) с проводили з використанням на першому раунді праймерів Рпі-і та РпІ-т, а на другому - праймерів ВЗ та А2.When conducting a blood analysis by the PCR method using the primers mentioned in the proposed method, a fragment of the Regari gene with a size of 530 bp was detected. On the basis of this, a diagnosis was made: chronic myeloid leukemia (XM, first detected, initial stage. 20 Example 2 bo Blood analysis of patient E. (acute lymphoblastic leukemia 12, non-T-cell variant, 1 acute period) was carried out using the first in the round of primers Rpi-i and Rpi-t, and in the second - primers VZ and A2.
Виявлено перебудований фрагмент гену Брег/арі розміром 200 п.н. Виходячи з результату аналізу, було поставлено діагноз Рі-позитивна лейкемія та скориговано протоколи лікування. Приклад ЗA reconstructed fragment of the Breg/ari gene with a size of 200 bp was detected. Based on the results of the analysis, a diagnosis of Ri-positive leukemia was made and the treatment protocols were adjusted. Example C
Також аналогічно проводили аналіз крові хворого П. з підозрою на ХМЛ. Використання розроблених (РПІ-ї,Blood analysis of patient P. with suspicion of CML was also performed similarly. The use of developed (RPIs,
Рпі-т, РА-ї, Рі-г) та стандартних праймерів (В1, АТ, В2, АЗ) не виявило Бег/арі -перебудови, що визначило с подальшу тактику лікування хворого. Ці дані свідчать про високу ефективність пропонованого способу у діагностиці хворих з невизначеним діагнозом. Використання пропонованого способу дає змогу виявляти мінімальну кількість патологічних клітин (10-4-140-5), що дозволяє проводити ранню діагностику. Даний метод бо дозволяє прогнозувати подальший перебіг захворювання, оцінювати цитогенетичну ремісію та ефективність лікування.Rpi-t, RA-i, Ri-g) and standard primers (B1, AT, B2, AZ) did not reveal Beg/ari rearrangements, which determined the subsequent tactics of the patient's treatment. These data indicate the high efficiency of the proposed method in the diagnosis of patients with an uncertain diagnosis. Using the proposed method makes it possible to detect the minimum number of pathological cells (10-4-140-5), which allows for early diagnosis. This method makes it possible to predict the further course of the disease, evaluate cytogenetic remission and the effectiveness of treatment.
Таким чином, пропонований спосіб, у якому використовують праймери РІ (5-СТСТТСОСТОТТСАССОСАСОСТО-3) та РНІ-г (Х-ВОСТТАСАСТОТТАТСТОСАСТОСС-3), а на другому етапі полімеразної ланцюгової реакції опраймери РН- (5-СТЗСАДАТОСТАСАТТССОСТСАС-3) та /Р-г в5 (5-ААСОСАОСООСсСТТСАСТСАСАСС-3), дає змогу детектувати наявність гібридного Бег/арі гена у випадку, коли стандартний набір праймерів не дозволяє це зробити.Thus, the proposed method in which primers RI (5-СТСТТСОСТОТСАССОСАСОСТО-3) and РНИ-г (Х-ВОСТТАСАСТОТТАСТОССОС-3) are used, and at the second stage of the polymerase chain reaction, primers РН- (5-СТЗСАДАТОСАТССОСТСАС-3) and /Р -г в5 (5-ААСОСАОСОСССТТСАСТСАССС-3), allows you to detect the presence of a hybrid Beg/ari gene in the case when the standard set of primers does not allow this.
Література: 1.Бутенко ЗА., Глузман Д.Ф., Зак К.П. и др. Цитохимия и електронная микроскопия клеток крови и кроветворньїх органов //Киев, Наукова Думка, 1074,244с. 2.Глузман Д.Ф., Бебешко В.Г., Надгорная В.А. и др. Змбриональное кроветворение и гемобластозь! у детей. // Киев, Наукрва Думка, 1988,200с.Literature: 1. Butenko ZA., Gluzman D.F., Zak K.P. et al. Cytochemistry and electron microscopy of blood cells and hematopoietic organs // Kyiv, Naukova Dumka, 1074, 244p. 2. Gluzman D.F., Bebeshko V.G., Nadgornaya V.A. etc. Embryonic hematopoiesis and hemoblastosis! in children // Kyiv, Naukrva Dumka, 1988, 200 p.
З. Пинчук В.Г., Глузман Д.Ф., Надгорная В.А. и др. Иммуноцитохимические методьії и моноклональнье антитела в онкогематологии // Киев, Наукова Думка, 1990,233 с. 4.Воепт, Т.Н. Каррбіїв А спготозотаї! равів ої ЇІМтрпоїа таїїдпапсу іп тап // Е.).Віоспет, 1989-М.185,Р.1-17. 70 5. М.). Сііпе Тне тоїіесціаг разіз опеикетіа // Тпе Мем Епдіапа дошгпаї! ої Меадісіпе, 1994.-М.330,М5.-Р.328-336. 6. Т.Н. Кабрбріїв Спготозотаї Ігапзіосайопзв іп питап сапсег /Майиге, 1994.- М.372, М.6502-Р.143-149, 7. Можеїї РС, Нипдепога ЮА. А тіпше спготовоте іп питап спгопіс дгапціосуйіс ІеиКетіа // Зсіепсе 1960.-Z. Pinchuk V.G., Gluzman D.F., Nadgornaya V.A. et al. Immunocytochemical methods and monoclonal antibodies in oncohematology // Kyiv, Naukova Dumka, 1990, 233 p. 4. Voept, T.N. Karrbiiv A spgotozotai! raviv oi YIMtrpoia taiidpapsu ip tap // E.).Viospet, 1989-M.185, R.1-17. 70 5. M.). Siipe Tne toiiiesciag raziz opeiketia // Tpe Mem Epdiapa doshgpai! of Meadisipe, 1994.-M.330, M5.-R.328-336. 6. T.N. Kabrbriev Spgotozotai Igapziosayopzv ip pitap sapseg / Mayige, 1994.- M.372, M.6502-R.143-149, 7. Mozheyi RS, Nypdepoga YuA. A tipshe spgotovote ip pitap spgopis dgaptsiosuiis IeiKetia // Zsiepse 1960.-
М.132, Р. 1497-1499. 8. КоулЛеу 90. А пем/ сопвівіепі спготовота! арпогтаїйу іп спгопіс туеодепоиз Іеикаетіа ідепійей ру /5 Зчіпасгіпе Ппогезсепсе апа Сіетва віаіпіпу // Майиге- 1973.-М.243, М5405-Р.290-293. 9. Телегеев Г.Д., Дьібков М.В., Карпенко О.И., Черепенко Е.И. Молекулярнье основьі! Рі-лейкемий и пути их лечения Биополимерь и клетка 1994; 10(5):78-92. 10. Сівпі2ку МІ. Моїесшаг теспапізте ої Всег-АбБі-іпдисед опсодепевзів // СуюКіпез Моїшаг Тпегару 1996-M.132, R. 1497-1499. 8. ColeLeu 90. A pem/ sopviviepi preparation! arpogtaiyu ip spgopis tueodepoiz Ieikaetia idepiyei ru /5 Zchipasgipe Ppogezsepse apa Sietva viaipipu // Mayige- 1973.-M.243, M5405-R.290-293. 9. Telegeev G.D., Dybkov M.V., Karpenko O.I., Cherepenko E.I. Molecular basis! Re-leukemia and ways of its treatment Biopolymer and cell 1994; 10(5):78-92. 10. Sivpi2ku MI. Moyesshag tespapizte oi Vseg-AbBi-ipdised opsodepevziv // SuyuKipez Moishag Tpegaru 1996-
М2, МА. - Р.251-261. 11. Е.М. Боцшійет Оеїесіоп ої зресіїс зедцепсез атопд ОМА Ігадтепів зерагаїедй ру де! еІесігоїогевів. //M2, MA. - R.251-261. 11. E.M. Botsshiyet Oeiyesiop oi zresiis zedcepsez atopd OMA Igadtepiv zeragaiedy ru de! eIesigoiogeviv. //
У. Мої.ВіоІ.-1975- М.98, М.3- Р.503-517. 12. б. Оговмеїй, Т. Мепмоега, Т мап Адійомеп еї аІ. Те сПпгопіс туеїосуїйс сеї Ппе К 562 сопіаіпз аU. Moi.VioI.-1975- M.98, M.3- R.503-517. 12. b. Ogovmeiy, T. Mepmoega, T map Adiyomep eyi aI. Te sPpgopis tueiosuiys sei Ppe K 562 sopiaipz a
БгеаКроіїпі іп о рсго апа о оргодисев а спітегіс Бсг/с-арі ігапесгірі // МоІесшаг апа Сеїїшаг Віоіоду, 1986-М.6,42.-Р.607-616. 13. Е.5. Камавзакі, 5.5. Сіагк, М.М. Соупе еї а Оіадповів ої спгопіс туеїрій апа асше ІутрпосуййсBgeaKroiipi ip o rsgo apa o orgodisev a spitegis Bsg/s-ari igapesgiri // MoIesshag apa Seiiishag Vioiodu, 1986-M.6,42.-R.607-616. 13. E.5. Kamavzaki, 5.5. Siagk, M.M. Soupe ei a Oiadpoviv oi spgopis tueiriy apa asshe Iutrposuiys
Іеикетіаз Бу аеїейоп ої ІеиКептіа-зресіїс тЕМА зедцепсез атрійіеа іп мійго. // Ргос. Май. Асад. сі. О5А, т 1988. - М.85, М15.-Р.5698-5702. 14. Мацйгег .у)., ЧУЧапввзеп У., Ті! Е., еї аї. ОеїЇейоп ої сПпітегіс ВСК-АВІ депез іп асше ІутрпорбіавіїсIeiketiaz Bu aeieyop oi IeiKeptia-zresiis tEMA zedcepsez atriiiea ip miigo. // Rhosz. May Asad si. O5A, volume 1988. - M.85, M15.-R.5698-5702. 14. Matsygeg .y)., CHUCHapvvzep U., Ti! Eh, hey, hey. OeiYeiop oi sppitegis VSK-AVI depez ip asshe Iutrporbiaviis
Іеикетіа Бу (пе роїутегазе спаїп геасійоп // Те І апсеї.-1991.-М.337, М 8749.-Р.1055-1058. ю зо 15. Ткаспик О.С., МУевіргоок С.А., АпагеейМ., еї аІ. Оефесіоп ої Бег-АБІ їивіоп іп спгопіс туеодепоийвYeiketia Bu (per roiutegase spaip geasiyop // Te I apsei.-1991.-M.337, M 8749.-R.1055-1058. yu zo 15. Tkaspik O.S., Muevergook S.A., Apageei M., ei aI.
Іеикетіа Бу іп зіш Нубгіаігавоп // Зсіепсе -1990 - М.250, М.4980, Р.559-562 со 16. М.Тевіоп, о-Мапіпеїйї, Р.Рагаредої ек оа. А пем/ теїйой ої "їп-сеї гемегве (гапзсіріазе-роїутегазе (У спаійп геасіоп" їог о дейесіоп ої Всі/арі | гапесгірів іп спгопіс туеїсій ІеиКкетіа райепів. // Віоса- 1996.-М.87, М.9 - Р.З 884-3 892. о 17. СпотсгупеКкі Р., Зассні М. Зіпдіе-зіер теїфой ої АКМА ізоїайоп ру асій оцапідіпит деIeiketia Bu ip zish Nubgiaigavop // Zsiepse -1990 - M.250, M.4980, R.559-562 p. A pem/ teiioi oi "yip-sei hemegve (gapssyriaze-roiutegaze (U spaiip geasiop" yog o deyesiop oi Vs/ari | gapesgiriv ip spgopis tueisii IeiKketia rayepiv. // Viosa- 1996.-M.87, M.9 - R .Z 884-3 892. o 17. SpotsgupeKki R., Zassni M. Zipdie-zier teifoi oyi AKMA isoiaiop ru asii otsapidipit de
Іпіосуапаїе-рпепо!-спіогоїогт ехігасіоп // Апа)мї. Віоспет. -1987. -М.І 62, Р. 156-159.Ipiosuapaie-rpepo!-spiogoiogt ehigasiop // Apa)mi. Viospet. -1987. -M.I 62, R. 156-159.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200503775U UA10385U (en) | 2005-04-20 | 2005-04-20 | METHOD FOR DIAGNOSING Ph' LEUKEMIAS WITH THE AID OF SPECIFIC PRIMERS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| UAU200503775U UA10385U (en) | 2005-04-20 | 2005-04-20 | METHOD FOR DIAGNOSING Ph' LEUKEMIAS WITH THE AID OF SPECIFIC PRIMERS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA10385U true UA10385U (en) | 2005-11-15 |
Family
ID=74506024
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAU200503775U UA10385U (en) | 2005-04-20 | 2005-04-20 | METHOD FOR DIAGNOSING Ph' LEUKEMIAS WITH THE AID OF SPECIFIC PRIMERS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| UA (1) | UA10385U (en) |
-
2005
- 2005-04-20 UA UAU200503775U patent/UA10385U/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Moss et al. | Comprehensive human cell-type methylation atlas reveals origins of circulating cell-free DNA in health and disease | |
| Chen et al. | From tissues to cell types and back: single-cell gene expression analysis of tissue architecture | |
| CN103608818B (en) | The antenatal ploidy identification device of Noninvasive | |
| US20180068058A1 (en) | Methods and compositions for sample identification | |
| Cirillo et al. | Liquid biopsy in lymphoma: Molecular methods and clinical applications | |
| CN104120181B (en) | The method and device of GC corrections is carried out to chromosome sequencing result | |
| CN109983134A (en) | The analysis of Cell-free DNA in urine and other samples | |
| UA126898C2 (en) | Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations | |
| CN107849607A (en) | The single-molecule sequencing of plasma dna | |
| CN105917008A (en) | Gene expression panel for prognosis of prostate cancer recurrence | |
| Luddi et al. | Clues to non-invasive implantation window monitoring: isolation and characterisation of endometrial exosomes | |
| CN105765083A (en) | Method to estimate the age of tissues and cell types based on epigenetic markers | |
| CN103797129A (en) | Resolving genome fractions using polymorphism counts | |
| CN106498076A (en) | For diagnosing the method and composition of symptom | |
| CN103403183A (en) | Noninvasive detection of fetal genetic abnormality | |
| JP2022524208A (en) | Methods and compositions for identifying tumor models | |
| CN108441552B (en) | One kind serum/plasma miRNA marker relevant to intrahepatic cholestasis of pregnancy auxiliary diagnosis and its application | |
| US20220392640A1 (en) | Systems and methods for predicting therapeutic sensitivity | |
| US20230151358A1 (en) | Single step sample preparation for next generation sequencing | |
| Zucherato et al. | Identification of suitable reference genes for mesenchymal stem cells from menstrual blood of women with endometriosis | |
| Shegekar et al. | The emerging role of liquid biopsies in revolutionising cancer diagnosis and therapy | |
| Kilpatrick et al. | Automated detection of rare fetal cells in maternal blood: eliminating the false-positive XY signals in XX pregnancies | |
| Hahn et al. | Noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies and Mendelian disorders: new innovative strategies | |
| CN101671736B (en) | Gene detection kit used for detecting cell chimerism or individual recognition | |
| WO2023102313A1 (en) | Systems and methods for identifying regions of aneuploidy in a tissue |