TWI856450B - 一種治療靶向異常細胞的新穎方法，及其使用之細胞毒性細胞 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種治療對一成分(ingredient)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的靶向異常細胞的方法，及其使用之細胞毒性細胞，包括向患有疾病的個體施用一有效量的與該成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)。

Description

一種治療靶向異常細胞的新穎方法，及其使用之細胞毒性細胞
本發明涉及一種治療對一成分(ingredient)具有抗性(resistant)、難治性(refractory)、不敏感(insensitive)、無反應性(non-responsive)或反應性不足(inadequately responsive)的靶向異常細胞(targeted abnormal cells)的方法，及其使用之細胞毒性細胞(cytotoxic cells)；更具體地涉及一種治療對一成分具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的靶向異常細胞(包括但不限於抗性細胞(resistant cells))的方法，以及其使用與該成分複合的細胞毒性細胞(cytotoxic cells complexed with the ingredient)。
細胞毒性細胞在對抗感染或腫瘤侵襲(tumour invasion)過程中發揮作用。有兩種類型的細胞毒性細胞：那些參與先天或天然免疫的細胞，例如自然殺手細胞、γδT細胞和NKT細胞；以及那些參與後天性或獲得性免疫的細胞，例如細胞毒性T淋巴球(Rey et al.,2005。)
靶向異常細胞療法是使用設計為瞄準具有獨特生物標誌物的異常細胞而不影響其他細胞的成分的治療。靶向異常細胞療法，例如癌症靶向療法在過去的幾十年中得到了發展(Lupu et al.,2016)。然而，靶向異常細胞療法仍然面臨著許多挑戰。第一個主要的挑戰是可用於靶向異常 細胞療法的藥物很少。事實上，許多成分，諸如鈷妥珠單抗(codrituzumab)、索拉珠單抗(solanezumab)、bimagrumab、塔羅金單抗(tralokinumab)和巴可西珠單抗(bococizumab)顯示出與異常細胞上表達的生物標誌物特異性地交互作用(或結合)的巨大潛力，在第一期臨床試驗中取得成功，但是它們在第二/三期臨床試驗中被確定為無效或者沒有足夠的功效。換句話說，藥物開發過程無法完成，並且因此所有的這些眾多具有巨大潛力的成分都不能夠在業界使用。
第二個主要挑戰是抗藥性。舉例來說，美國食品藥物管理局批准的藥物(FDA批准的藥物)例如曲妥珠單抗(trastuzumab)或西妥昔單抗(cetuximab)當它首次被施予患者時可能是有效的，殺死靶向異常細胞並且減少靶向異常細胞的數量。然而，一段時間後，同一種藥物在殺死靶向異常細胞的效率已經被證實會大幅地降低(Lee M.Ellis and Daniel J.Hicklin,2009)。
為了解決抗藥性問題，自2012年以來，人們試圖提高他們對抗藥性以及疾病的理解，以開發基於其他成分或其他獨特的生物特徵的新型靶向異常細胞療法(Bottsford-Miller et al.,2012)。然而，開發一種新藥從最初的想法到一完成品是一個複雜的過程，此過程可能需要長達12-15年和花費超過10億美元(Hughes et al.,2011)，而且大多數顯示出巨大潛力的成分在臨床試驗中往往會失敗。此外，即使其中一種潛在成分成功通過藥物開發過程並且獲得美國食品藥品管理局(FDA)的批准，異常細胞仍然可能對這種新藥產生抗性。
因此，仍然迫切需要一種解決市場上幾乎沒有治療藥物 (curative drug)能治療靶向異常細胞問題以及解決抗藥性問題的方法。本發明的發明人認為，細胞毒性細胞有解決這些問題以及被應用在特異性靶向異常細胞的細胞治療的潛力。
此外，目前有效的療法在大多數患者中受到稱為『免疫抑制微環境(the immunosuppressive microenvironment)』關鍵障礙的限制(David H.Munn and Vincenzo Bronte,2016)。因此，目前仍然迫切需要一種解決幾乎沒有治療藥物(curative drug)能治療位於免疫抑制微環境中的異常細胞的問題。
本發明的目的在於提供一種體外或體內治療異常細胞的方法，更具體地用於治療對當前FDA批准的藥物(FDA-approved drugs)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞。
本發明的第二個目的是提供能夠治療異常細胞的新型(novel)細胞毒性細胞，更具體地用於治療對當前FDA批准的藥物(FDA-approved drugs)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞。
本發明的第三個目的是提供一種增加免疫細胞進入包含異常細胞的病灶中的遷移能力的方法；更具體地進入包含對當前FDA批准的藥物(FDA-approved drugs)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的病灶(lesion)。
本發明的第四個目的是提供能夠增加免疫細胞進入包含異常細胞的病灶中的遷移能力的新型細胞毒性細胞；更具體地進入包含對當 前FDA批准的藥物(FDA-approved drugs)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的病灶(lesion)。
本發明的第五個目的是基於化學結合技術(chemical conjugation technology)提供一種與成分(ingredient)共軛(conjugated)的細胞毒性細胞，其中該成分在治療疾病或在治療患有疾病的個體上無效或沒有足夠的功效。
本發明的第六個目的是提供一種提高對當前FDA批准的藥物有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體的治療效果的方法。
本發明的第七個目的是提供一種提高在第一期臨床試驗中取得成功，但在第二期或第三期臨床試驗中失敗的成分有效性的方法。
在第一個方面，本發明提供了一種治療疾病的方法，包括向患有疾病的個體施用有效量的效應細胞(effector cells)；該效應細胞包含一表面和複合(complexed)到效應細胞表面的靶向單元群體(population of targeting units)；其中群體中的靶向單元包含第一成分(first ingredient)；並且第一成分的特徵在於：(a)它與疾病相關的異常細胞所表達的生物標誌物(biological marker)表現出特異性交互作用(specific interaction)；(b)它不是由效應細胞(effector cell)所產生的；以及(c)在臨床試驗結束時，它被確定為在治療患有疾病的個體上是無效的或沒有足夠的功效，或者被斷定為在治療疾病上是無效的或沒有足夠的功效。
在第二個方面，本發明更進一步提供了一種增加免疫細胞進入到疾病病灶的遷移能力的方法，包括對患有疾病的個體施用有效量的效 應細胞(effector cells)；該效應細胞包含一表面和複合(complexed)到效應細胞表面的靶向單元群體(population of targeting units)；其中群體中的靶向單位包含第一成分，並且第一成分的特徵在於：(a)它與位於疾病病灶的異常細胞所表達的生物標誌物(biological marker)表現出特異性交互作用(specific interaction)；(b)它不是由效應細胞所產生的；(c)在臨床試驗結束時，它被確定為在治療患有疾病的個體上是無效的或沒有足夠的功效，或者被斷定為在治療疾病上是無效的或沒有足夠的功效。
在一些實施例中，該方法係用來增加免疫細胞的遷移能力(migratory capacity)以進入患有疾病個體的病灶。
在第三方面，本發明更進一步提供了一種減少與疾病相關的異常細胞數量的體外(in vitro)方法，包括使與疾病相關的多個異常細胞與有效量的效應細胞接觸；該效應細胞包含一表面和複合於效應細胞表面的靶向單元群體(population of targeting units)；其中群體中的靶向單位包含第一成分(first ingredient)；並且所述第一成分的特徵在於：(a)它與疾病相關的異常細胞所表達的生物標誌物表現出特異性交互作用；(b)它不是由效應細胞所產生的；以及(c)它被確定為在治療與疾病相關的異常細胞上是無效的或沒有足夠的功效。
在一些實施例中，效應細胞是細胞毒性細胞。
在一些實施例中，大約或超過5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或99.5%被施用於個體的細胞是包含複合到效應細胞表面的靶向單元群體的效應細胞。在一些實施例中，被施用於個體的所有細胞 都是包含複合到效應細胞表面的靶向單元群體(population of targeting units)的效應細胞。
在一些實施例中，個體是脊椎動物。較佳地，個體是選自哺乳類動物選自由鼠類、猿猴、人類、農場動物、運動動物、寵物以及其他哺乳類動物所組成的群組。較佳地，個體是人類。
在一些實施例中，效應細胞包含多於3000個靶向單元/每個細胞。在一些實施例中，群體中每個靶向單元包含至少一個第一成分。
在一些實施例中，效應細胞每個細胞包含至少2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、10500、11000、11500、12000、12500、13000、13500、14000、14500、15000、15500、16000、16500、17000、17500、18000、18500、19000、19500、20000、40000、60000、80000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、170000、190000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、320000、340000、360000、380000、400000個靶向單元。
在一些實施例中，效應細胞是CD16+細胞。
在一些實施例中，第一成分包含Fc受體識別區(Fc receptor recognized region)。
在一些實施例中，第一成分是抗體。較佳地，第一成分是誘導抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的IgG亞型單株抗體；或者第一成分是其他抗體；或者第一成分包含抗原結合單元(antigen-binding unit)。
在一些實施例中，Fc受體識別區是抗體的Fc區。
在一些實施例中，抗體是HER1、HER2、HER3、HER4、上皮生長因子受體(EGFR)、CD20、CD19、ErbB2、ErbB3、CD28、似胰島素生長因子1受體(IGF1R)、IMC-1121、Met、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGFRα、PDGFRβ、CD22、CD79b、CD32B、似胰島素生長因子1(IGF-1)、似胰島素生長因子1受體(IGF-1R)、似胰島素生長因子2(IGF-2)、OPN、Ang-2、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、ROR1、程式性細胞死亡-配體1(PD-L1)、血管內皮生長因子受體1(VEGFR1)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)或血管內皮生長因子受體3(VEGFR3)。在一些實施例中，效應細胞與針對下列的一個、兩個或更多個的抗體複合：HER1、HER2、HER3、HER4、上皮生長因子受體(EGFR)、CD20、CD19、ErbB2、ErbB3、CD28、似胰島素生長因子1受體(IGF1R)、IMC-1121、Met、血管內皮生長因子(VEGF)、PDGFRα、PDGFRβ、CD22、CD79b、CD32B、似胰島素生長因子1(IGF-1)、似胰島素生長因子1受體(IGF-1R)、似胰島素生長因子2(IGF-2)、OPN、Ang-2、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、上皮細胞黏附分子(EpCAM)、ROR1、程式性細胞死亡-配體1(PD-L1)、血管內皮生長因子受體1(VEGFR1)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、血管內皮生長因子受體3(VEGFR3)(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，抗體是多株抗體、單株抗體、嵌合抗體(chimeric antibody)、人源化抗體(humanized antibody)或全人類抗體(fully human antibody)。
在一些實施例中，第一成分不是核酸(nucleic acid)。
在一些實施例中，效應細胞能夠介導(mediating)抗體依賴性細胞毒殺作用(antibody-dependent cell cytotoxicity，ADCC)反應。
在一些實施例中，效應細胞能夠誘導CD3+T細胞的遷移(migration)。
在一些實施例中，在與表達生物標誌物(biological marker)的標靶細胞(target cells)共同培養後，效應細胞表達CD107a。
在一些實施例中，在與表達生物標誌物的標靶細胞共同培養後，效應細胞表達干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)和/或腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)。
在一些實施例中，表面是效應細胞的外表面(outer surface)。在一些實施例中，表面是效應細胞細胞膜的外表面。在一些實施例中，表面是效應細胞的膜結構(membrane structure)的外表面。
在一些實施例中，標靶細胞(target cells)是Raji、Daudi、K562、其他與液體腫瘤相關的標靶細胞、A549、SK-OV-3、BT-474、其他與固體腫瘤相關的標靶細胞，或其他與疾病相關的標靶細胞。
在一些實施方式中，該第一成分是FDA批准用來治療疾病的成分。
在一些實施方式中，該第一成分是利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)、埃洛妥珠單抗(elotuzumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab)、庫沙珠單抗(cusatuzumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、帕尼 單抗(panitumumab)或阿瑪西單抗(amatuximab)。
在一些實施例中，該第一成分已經在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分。
在一些實施例中，『在第一期臨床試驗中成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分的第一成分』是一種在第一期臨床試驗中取得成功但是因為在第二/三期臨床試驗中被確定為是無效的或沒有足夠的功效，所以未被FDA批准用來治療該疾病的成分。例如鈷妥珠單抗(codrituzumab)是一種在第一期臨床試驗中取得成功，但不是FDA批准的用來治療疾病的成分的第一成分。
在一些實施例中，該第一成分是鈷妥珠單抗(codrituzumab)、索拉珠單抗(solanezumab)、bimagrumab、塔羅金單抗(tralokinumab)或巴可西珠單抗(bococizumab)。
在一些實施例中，被施用於個體的效應細胞源於自體的(autologous)效應細胞或同種異體的(allogeneic)效應細胞。
在一些實施例中，效應細胞是自體的效應細胞。在一些其他實施例中，效應細胞源自同種異體的個體，並且因此是同種異體的效應細胞。在自體的細胞治療中，患者接受源自他們自己身體的自體效應細胞。在同種異體的細胞治療中，患者接受源自非該患者的捐贈者(同種異體的個體)的同種異體效應細胞。
在一些實施例中，該方法包括(a)取得一群自體效應細胞或同種異體的效應細胞；(b)將一個或更多個第一成分複合(complexing)到自體效應細胞或同種異體的效應細胞；並且(c)將來自步驟(b)經複合 的細胞施用於個體，從而治療該個體的疾病。在一些實施例中，步驟(a)至(c)在24小時內完成。在一些實施例中，來自步驟(b)經複合的細胞(效應細胞)是在施用前未誘導(inducing)細胞擴增(cell expansion)的情況下被施用。
在一些實施例中，該疾病選自由過度增生的疾病(hyperproliferative diseases)、末期疾病(advanced stage disease)、HIV或其他病毒感染性疾病、真菌感染性疾病(fungi infectious diseases)、細菌感染性疾病(bacteria infectious diseases)、原蟲感染性疾病(protozoan infectious diseases)、自身免疫性疾病(autoimmune diseases)、神經元疾病(neuronal diseases)、造血細胞相關的疾病(hematopoietic cell-related diseases)、代謝綜合症(metabolic syndromes)和致病性疾病(pathogenic diseases)所組成的群組。
在一些實施例中，該疾病是選自由固體腫瘤和液體腫瘤所組成的群組的過度增生的或末期的疾病。
在一些實施例中，過度增生的疾病是癌症、固體腫瘤或異體腫瘤的一種包括棘皮瘤(Acanthoma)、腺細胞癌(Acinic cell carcinoma)、聽神經瘤(Acousticneuroma)、胺端小痣性黑色素瘤(Acral lentiginous melanoma)、汗腺頂端汗腺瘤(Acrospiroma)、急性嗜酸性粒細胞白血病(Acute eosinophilicleukemia)、急性淋巴母細胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia)、急性巨核母細胞白血病(Acute megakaryoblastic leukemia)、急性單核細胞白血病(Acute monocytic leukemia)、急性成熟骨髓芽球性白血病(Acutemyeloblastic leukemia with maturation)、急性髓源型樹突狀細胞白血病(Acute myeloid dendritic cell leukemia)、急性骨髓性白血病(Acute myeloid leukemia)、急性前髓細胞白血病(Acute promyelocytic leukemia)、牙釉母細胞瘤(Adamantinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺樣囊狀癌(Adenoid cysticcarcinoma)、腺瘤(Adenoma)、牙源性腺瘤樣腫瘤(Adenomatoid odontogenictumor)、腎上腺皮質癌(Adrenocortical carcinoma)、成人型T細胞白血病(Adult T-cell leukemia)、侵略性NK細胞白血病(Aggressive NK-cellleukemia)、愛滋病相關癌症(AIDS-Related Cancers)、愛滋病相關淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、肺泡狀軟組織肉瘤(Alveolar soft part sarcoma)、造釉細胞性纖維瘤(Ameloblastic fibroma)、肛門癌(Anal cancer)、間變性大細胞淋巴瘤(Anaplastic large cell lymphoma)、甲狀腺未分化癌(Anaplasticthyroid cancer)、血管免疫芽細胞性T細胞淋巴瘤(Angioimmunoblastic T-celllymphoma)、血管平滑肌脂肪瘤(Angiomyolipoma)、血管肉瘤(Angiosarcoma)、闌尾癌(Appendix cancer)、星狀細胞瘤(Astrocytoma)、非典型畸胎/類橫紋肌細胞瘤(Atypical teratoid rhabdoid tumor)、基底細胞癌(Basal cell carcinoma)、類基底細胞癌(Basal-like carcinoma)、B細胞白血病(B-cell leukemia)、B細胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)、Bellini集合管癌(Belliniduct carcinoma)、膽道癌(Biliary tract cancer)、膀胱癌(Bladder cancer)、胚細胞瘤(Blastoma)、骨癌(Bone Cancer)、骨腫瘤(Bone tumor)、腦幹膠質瘤(Brain Stem Glioma)、腦瘤(Brain Tumor)、乳癌(Breast Cancer)、布倫內羅氏瘤(Brenner tumor)、支氣管腫瘤(Bronchial Tumor)、支氣管肺泡腺癌(Bronchioloalveolar carcinoma)、棕色瘤(Brown tumor)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma)、原發部位不明的癌(Cancer of Unknown PrimarySite)、類癌瘤(Carcinoid Tumor)、 癌(Carcinoma)、原位癌(Carcinoma in situ)、陰莖癌(Carcinoma of the penis)、原發部位不明轉移癌(Carcinoma of Unknown Primary Site)、癌肉瘤(Carcinosarcoma)、Castleman氏病(Castleman’s Disease)、中樞神經系統胚胎性腫瘤(Central NervousSystem Embryonal Tumor)、小腦星狀細胞瘤(Cerebellar Astrocytoma)、大腦星狀細胞瘤(Cerebral Astrocytoma)、子宮頸癌(Cervical Cancer)、膽管癌(Cholangiocarcinoma)、軟骨癌(Chondroma)、軟骨肉瘤(Chondrosarcoma)、脊索瘤(Chordoma)、絨毛膜癌(Choriocarcinoma)、脈絡叢乳頭狀瘤(Choroidplexus papilloma)、慢性淋巴性白血病(Chronic Lymphocytic Leukemia)、慢性單核細胞白血病(Chronic monocytic leukemia)、慢性粒細胞性白血病(Chronic myelogenous leukemia)、慢性骨髓增生性疾病(ChronicMyeloproliferative Disorder)、慢性嗜中性白血病(Chronic neutrophilicleukemia)、透明細胞腫瘤(Clear-cell tumor)、大腸癌(Colon Cancer)、大腸直腸癌(Colorectal cancer)、顱咽管瘤(Craniopharyngioma)、皮膚T細胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma)、Degos氏病(Degos disease)、隆突性皮膚纖維肉瘤(Dermatofibrosarcoma protuberans)、皮樣囊腫(Dermoid cyst)、結締組織增生性小圓細胞腫瘤(Desmoplastic small round cell tumor)、彌漫型大B細胞淋巴瘤(Diffuse large B cell lymphoma)、胚胎發育不良性神經上皮腫瘤(Dysembryoplastic neuroepithelial tumor)、胚胎性癌(Embryonal carcinoma)、內胚竇瘤(Endodermal sinus tumor)、子宮內膜癌(Endometrial cancer)、子宮內膜癌(Endometrial Uterine Cancer)、子宮內膜樣瘤(Endometrioid tumor)、腸道T細胞淋巴瘤(Enteropathy-associated T-cell lymphoma)、室管膜母細胞瘤 (Ependymoblastoma)、室管膜瘤(Ependymoma)、上皮樣肉瘤(Epithelioidsarcoma)、紅血球性白血病(Erythroleukemia)、食道癌(Esophageal cancer)、敏感性神經胚細胞瘤(Esthesioneuroblastoma)、Ewing氏家族腫瘤(Ewing Family of Tumor)、Ewing氏家族肉瘤(Ewing Family Sarcoma)、Ewing氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、生殖細胞瘤(Extracranial Germ Cell Tumor)、性腺外生殖細胞瘤(Extragonadal Germ Cell Tumor)、肝外膽管癌(Extrahepatic Bile Duct Cancer)、乳房外Paget氏病(Extramammary Paget’s disease)、輸卵管癌(Fallopian tube cancer)、胎內胎(Fetus in fetu)、纖維瘤(Fibroma)、纖維肉瘤(Fibrosarcoma)、濾泡性淋巴瘤(Follicular lymphoma)、濾泡性甲狀腺癌(Follicular thyroid cancer)、膽囊癌(Gallbladder Cancer)、膽囊癌(Gallbladder cancer)、神經節膠質細胞瘤(Ganglioglioma)、神經節細胞瘤(Ganglioneuroma)、胃癌(Gastric Cancer)、胃淋巴癌(Gastric lymphoma)、腸胃道癌(Gastrointestinal cancer)、胃腸道類癌腫瘤(Gastrointestinal Carcinoid Tumor)、胃腸道間質腫瘤(Gastrointestinal Stromal Tumor)、胃腸道間質腫瘤(Gastrointestinal stromal tumor)、生殖細胞瘤(Germ cell tumor)、胚細胞瘤(Germinoma)、妊娠性絨毛膜癌(Gestational choriocarcinoma)、妊娠性滋養細胞腫瘤(Gestational Trophoblastic Tumor)、骨巨細胞瘤(Giant cell tumor of bone)、多形性神經膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme)、神經膠質瘤(Glioma)、大腦神經膠瘤病(Gliomatosis cerebri)、球狀血管瘤(Glomus tumor)、升糖素瘤(Glucagonoma)、性腺胚瘤(Gonadoblastoma)、顆粒層細胞瘤(Granulosa cell tumor)、毛細胞白血病(Hairy Cell Leukemia)、毛細胞白血病(Hairy cell leukemia)、頭頸癌(Head and Neck Cancer)、頭頸癌(Head andneck cancer)、心臟癌(Heart cancer)、血管母細胞瘤(Hemangioblastoma)、血管外皮細胞瘤(Hemangiopericytoma)、血管肉瘤(Hemangiosarcoma)、血液惡性腫瘤(Hematological malignancy)、肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma)、肝脾T細胞淋巴癌(Hepatosplenic T-cell lymphoma)、遺傳性乳癌與卵巢癌症候群(Hereditary breast-ovarian cancer syndrome)、何杰金氏淋巴瘤(HodgkinLymphoma)、何杰金氏淋巴瘤(Hodgkin’s Lymphoma)、下咽癌(Hypopharyngeal Cancer)、下視丘腦神經膠質瘤(Hypothalamic Glioma)、炎性乳腺癌(Inflammatory breast cancer)、眼球內黑色素瘤(Intraocular Melanoma)、胰島細胞癌(Islet cell carcinoma)、胰島細胞瘤(Islet Cell Tumor)、少年性骨髓單核球白血病(Juvenile myelomonocytic leukemia)、卡波西氏肉瘤(Kaposi Sarcoma)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s Sarcoma)、腎癌(Kidney Cancer)、肝門部膽管腫瘤(Klatskin tumor)、卵巢克魯根勃氏瘤(Krukenberg tumor)、喉癌(Laryngeal Cancer)、喉癌(Laryngeal cancer)、惡性雀斑樣黑色素瘤(Lentigo maligna melanoma)、白血病(Leukemia)、嘴唇及口腔癌症(Lip and Oral Cavity Cancer)、脂肪肉瘤(Liposarcoma)、肺癌(Lung cancer)、黃體瘤(Luteoma)、淋巴管瘤(Lymphangioma)、淋巴管肉瘤(Lymphangiosarcoma)、淋巴上皮瘤(Lymphoepithelioma)、淋巴細胞性白血病(Lymphoid leukemia)、淋巴瘤(Lymphoma)、巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma)、惡性纖維組織細胞瘤(Malignant fibrous histiocytoma)、惡性骨纖維組織細胞瘤(Malignant Fibrous Histiocytoma of Bone)、惡性神經膠質瘤(Malignant Glioma)、惡性間皮瘤(Malignant Mesothelioma)、惡性周邊神經鞘瘤(Malignant peripheral nerve sheath tumor)、惡性橫紋肌瘤(Malignant rhabdoid tumor)、惡性蠑螈瘤(Malignanttriton tumor)、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT lymphoma)、被套細胞淋巴瘤(Mantle cell lymphoma)、肥胖細胞白血病(Mast cell leukemia)、縱隔腔生殖細胞瘤(Mediastinal germ cell tumor)、縱隔腔腫瘤(Mediastinal tumor)、髓質性甲狀腺癌(Medullary thyroid cancer)、神經管胚細胞癌(Medulloblastoma)、髓上皮瘤(Medulloepithelioma)、黑色素瘤(Melanoma)、腦脊髓膜瘤(Meningioma)、Merkel氏細胞瘤(Merkel CellCarcinoma)、間皮瘤(Mesothelioma)、原發不明鱗狀細胞癌之頸部轉移(Metastatic Squamous Neck Cancer with Occult Primary)、轉移性尿路上皮癌(Metastatic urothelial carcinoma)、混合米勒氏腫瘤(Mixed Mullerian tumor)、單核球白血病(Monocytic leukemia)、口癌(Mouth Cancer)、黏液素癌(Mucinous tumor)、多發性內分泌腫瘤症候群(Multiple Endocrine Neoplasia Syndrome)、多發性骨髓瘤(Multiple Myeloma)、多發性骨髓瘤(Multiple myeloma)、蕈狀肉芽腫(Mycosis Fungoides)、蕈狀肉芽腫(Mycosis fungoides)、骨髓發育不良疾病(Myelodysplastic Disease)、骨髓發育不良症候群(Myelodysplastic Syndromes)、骨髓性白血病(Myeloidleukemia)、骨髓性肉瘤(Myeloid sarcoma)、骨髓增生性疾病(Myeloproliferative Disease)、黏液瘤(Myxoma)、鼻腔癌(Nasal Cavity Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngeal Cancer)、鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma)、腫瘤(Neoplasm)、神經鞘瘤(Neurinoma)、 神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經母細胞瘤(Neuroblastoma)、神經纖維瘤(Neurofibroma)、神經瘤(Neuroma)、結節性惡性黑色素瘤(Nodular melanoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma)、非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma)、非黑色素瘤的皮膚癌(Non melanoma SkinCancer)、非小細胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer)、眼部腫瘤(Ocularoncology)、寡星狀細胞瘤(Oligoastrocytoma)、寡樹突神經膠質瘤(Oligodendroglioma)、嗜酸細胞瘤(Oncocytoma)、視神經鞘腦膜瘤(Opticnerve sheath meningioma)、口腔癌(Oral Cancer)、口腔癌(Oral cancer)、口咽癌(Oropharyngeal Cancer)、骨肉瘤(Osteosarcoma)、卵巢癌(OvarianCancer)、卵巢癌(Ovarian cancer)、卵巢上皮癌(Ovarian Epithelial Cancer)、卵巢生殖細胞腫瘤(Ovarian Germ Cell Tumor)、卵巢低惡性瘤(Ovarian LowMalignant Potential Tumor)、乳腺博德氏Paget疾病(Paget’s disease of thebreast)、肺上溝癌(Pancoast tumor)、胰臟癌(Pancreatic Cancer)、胰臟癌(Pancreatic cancer)、乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid cancer)、乳突瘤病(Papillomatosis)、副神經節瘤(Paraganglioma)、鼻竇癌(Paranasal SinusCancer)、副甲狀腺癌(Parathyroid Cancer)、陰莖癌(Penile Cancer)、血管周圍上皮樣細胞瘤(Perivascular epithelioid cell tumor)、咽癌(PharyngealCancer)、嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)、中分化松果體實質腫瘤(PinealParenchymal Tumor of Intermediate Differentiation)、松果體母細胞瘤(Pineoblastoma)、垂體細胞瘤(Pituicytoma)、垂體腺瘤(Pituitary adenoma)、腦下垂體瘤(Pituitary tumor)、漿細胞腫瘤(Plasma Cell Neoplasm)、胸膜肺母細胞瘤(Pleuropulmonary blastoma)、多胚瘤(Polyembryoma)、前體T淋巴母細胞淋巴瘤(Precursor T-lymphoblastic lymphoma)、原發性中樞神經系統淋巴瘤(Primary central nervous system lymphoma)、原發性滲出液淋巴瘤(Primary effusion lymphoma)、原發性肝細胞癌(Primary Hepatocellular Cancer)、原發性肝癌(Primary Liver Cancer)、原發性腹膜癌(Primary peritoneal cancer)、原始神經外胚層腫瘤(Primitive neuroectodermal tumor)、前列腺癌(Prostate cancer)、腹膜假黏液瘤(Pseudomyxoma peritonei)、直腸癌(Rectal Cancer)、腎細胞癌(Renal cell carcinoma)、與在第15號染色體上NUT基因相關的呼吸道癌(Respiratory Tract Carcinoma Involving the NUT Gene on Chromosome15)、視網膜母細胞瘤(Retinoblastoma)、橫紋肌瘤(Rhabdomyoma)、橫紋肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma)、Richter轉化(Richter’s transformation)、薦椎尾骨畸胎瘤(Sacrococcygeal teratoma)、唾液腺癌(Salivary Gland Cancer)、肉瘤(Sarcoma)、許旺氏細胞瘤(Schwannomatosis)、皮脂腺癌(Sebaceous glandcarcinoma)、繼發性腫瘤(Secondary neoplasm)、精原細胞瘤(Seminoma)、漿液性腫瘤(Serous tumor)、支持間質細胞瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、性索基質細胞瘤(Sex cord-stromal tumor)、Sezary症候群(Sezary Syndrome)、印戒細胞癌(Signet ring cell carcinoma)、皮膚癌(Skin Cancer)、小藍圓細胞腫瘤(Small blue round cell tumor)、小細胞癌(Small cell carcinoma)、小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer)、小細胞淋巴癌(Small cell lymphoma)、小腸癌(Small intestine cancer)、軟組織肉瘤(Soft tissue sarcoma)、體抑素瘤(Somatostatinoma)、煤煙疣(Soot wart)、脊髓腫瘤(Spinal Cord Tumor)、脊髓腫瘤(Spinal tumor)、脾臟緣帶淋巴瘤(Splenic marginal zone lymphoma)、鱗狀上皮細胞瘤(Squamous cell carcinoma)、胃癌(Stomach cancer)、表淺散播型黑色素瘤(Superficial spreading melanoma)、小腦幕上原始神經外胚層腫瘤(Supratentorial Primitive Neuroectodermal Tumor)、表面上皮間質腫瘤(Surface epithelial-stromal tumor)、滑膜肉瘤(Synovial sarcoma)、T細胞急性淋巴性白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia)、T細胞大顆粒淋巴球白血病(T-cell large granular lymphocyte leukemia)、T細胞白血病(T-cellleukemia)、T細胞淋巴瘤(T-cell lymphoma)、T細胞前淋巴球白血病(T-cellprolymphocytic leukemia)、畸胎瘤(Teratoma)、末期淋巴癌(Terminallymphatic cancer)、睪丸癌(Testicular cancer)、鞘細胞瘤(Thecoma)、咽喉癌(Throat Cancer)、胸腺癌(Thymic Carcinoma)、胸腺瘤(Thymoma)、甲狀腺癌(Thyroid cancer)、腎盂和輸尿管的移行上皮細胞癌(Transitional CellCancer of Renal Pelvis and Ureter)、移行上皮細胞癌(Transitional cellcarcinoma)、臍尿管癌(Urachal cancer)、尿道癌(Urethral cancer)、泌尿生殖腫瘤(Urogenital neoplasm)、子宮肉瘤(Uterine sarcoma)、葡萄膜黑色素瘤(Uveal melanoma)、陰道癌(Vaginal Cancer)、瓦-馬二氏症(Verner Morrisonsyndrome)、疣狀癌(Verrucous carcinoma)、視覺通路神經膠質瘤(VisualPathway Glioma)、陰門癌(Vulvar Cancer)、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、沃辛瘤(Warthin’s tumor)、威爾姆斯腫瘤(Wilms’ tumor)及其組合中的至少一者。在一些實施例中，所靶向的癌症細胞代表癌症細胞群內的子群體(subpopulation)，例如癌症幹細胞。在一些實施例中，癌症屬於造血群系(hematopoietic lineage)，例如淋巴瘤(lymphoma)(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，HIV或其他病毒感染性疾病是由病毒感染引起的。需要刺激保護性免疫反應的傳染性病毒的實例包括：逆轉錄病毒科(例如人類免疫缺乏病毒，例如人類免疫缺陷病毒第一型(HIV-1)(也稱為第三型人類T細胞白血球病毒(HTLV-III)、淋巴腺病相關病毒(LAV)或者第三型人類T細胞白血球病毒/淋巴腺病相關病毒(HTLV-III/LAV)、或者HIV-III；以及其他分離株，例如HIV-LP；小核醣核酸病毒科(Picornaviridae)(例如小兒麻痺病毒(polio viruses)、A型肝炎病毒(hepatitis A virus)；腸病毒(enteroviruses)、人類柯沙奇病毒(human coxsackie viruses)、鼻病毒(rhinoviruses)、埃可病毒(echoviruses))；杯狀病毒科(Caliciviridae)(例如引起腸胃炎的病毒株)；披衣病毒科(Togaviridae)(例如馬腦炎病毒(equine encephalitis viruses)、德國麻疹病毒(rubella viruses))；黃熱病毒科(Flaviviridae)(例如登革熱病毒(dengue viruses)、腦炎病毒(encephalitis viruses)、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；桿狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis viruses)、狂犬病病毒)；絲狀病毒科(Filoviridae)(例如伊波拉病毒(ebola viruses))；副黏液病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流行性感冒病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus))；正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流行性感冒病毒)；本揚病毒科(Bunyaviridae，例如漢他病毒(Hantaan viruses)、斑嘎病毒(bunga viruses)、沙蠅病毒(phleboviruses)和奈諾病毒(Nairo viruses))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(Reoviridae)(例如裏奧病毒(reoviruses)、環狀病 毒和輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、肝去氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(B型肝炎病毒)；小DNA病毒科(Parvoviridae)(小病毒)；乳多瘤病毒科(Papovaviridae)(乳突狀瘤病毒(papilloma viruses)、多瘤病毒(polyoma viruses))；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)第一型和第二型、水痘帶狀疱疹病毒(varicella zoster virus)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、皰疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variola viruses)、牛痘病毒(vaccinia viruses)、痘病毒(pox viruses))；以及虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲豬瘟病毒(African swine fever virus))；以及未分類的病毒(例如，海綿狀腦病的致病病原體(the etiological agents of Spongiform encephalopathies)、D型肝炎病原體(the agent of delta hepatitis)(被認為是B型肝炎的缺陷型衛星病毒)、非A型肝炎、非B型肝炎的病原體(第一類=內部傳播；第二類=非胃腸地傳播(parenterally transmitted)(例如C型肝炎))；諾瓦克(Norwalk)和相關的病毒，以及星狀病毒(astro viruses))。細菌感染性疾病是由細菌感染引起的。需要保護性免疫反應的刺激的傳染性細菌的例子包括：幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylons)、伯氏疏螺旋體、退伍軍人症嗜肺桿菌、分枝桿菌屬(例如，結核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、細胞內分枝桿菌、堪塞斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌(M.gordonae))、金黃色葡萄球菌、淋病雙球菌、腦膜炎雙球菌、李斯特單胞菌、化膿鏈球菌(A群鏈球菌)、無乳鏈球菌(B群鏈球菌)、鏈球菌(草綠色鏈球菌群)、糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌(厭氧性的物種)、肺炎鏈球菌、致病的彎曲桿菌、腸球菌、流感嗜血桿菌、炭疽芽孢桿菌、白喉桿菌、棒狀桿菌、紅斑丹毒絲菌、產氣莢膜 梭狀芽孢桿菌、破傷風芽孢梭菌、產氣腸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌、敗血性巴氏桿菌、類桿菌、具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠狀鏈桿菌、梅毒螺旋體、細弱螺旋體、鉤端螺旋體屬和以色列放線菌。需要保護性免疫反應的刺激的傳染性真菌的例子包括：新型隱球酵母孢菌、莢膜組織孢漿菌、小型似球孢菌、皮炎芽生菌、砂眼衣原體、白色念珠菌。其他傳染性生物體(即原生生物)包括：惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)和弓蟲(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一成分與選自由下列組成的群組的生物標誌物表現出特異性的交互作用，癌症抗原、醣脂(glycolipid)、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化簇(cluster of differentiation)抗原、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白質(adhesion protein)、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體受體(ligand receptor)、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原(epithelial mucin antigen)、人類上皮細胞特異抗原(human epithelium specific antigen)、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白(multidrug resistance related protein)、Neu致癌基因蛋白(Neu oncogene protein)、神經元特異性烯醇酶(neuron specific enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原(prostate specific antigen)、神經細胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子(ganglioside molecule)、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶(tyrosinase)、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長 因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、和黑色素瘤相關抗原(MAGE)或者其任何組合；或者第一成分與選自由下列組成的群組的癌症抗原表現出特異性的交互作用，HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3(ERBB3))、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(程式性細胞死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細胞移行抑制因子(MIF)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1，CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子 受體3(FGFR3)、一種殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、ROR1、ROR2、程式性細胞死亡-1(PD-1，CD279)、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA-4，CD152)、TIM-3(HAVCR2)、一種免疫檢查點受體(immune checkpoint receptor)、一種免疫檢查點受體配體、一種受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor)、一種腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptorprotein)、一種免疫球蛋白、一種細胞激素受體、一種整合素(integrin)和活化自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)或者其組合。
在一些實施例中，靶向單元是通過共軛(conjugated)到第一成分的第一鏈接器(first linker)和共軛到效應細胞表面的第二鏈接器(second linker)之間的交互作用，複合到效應細胞的表面。
在一些實施例中，第一鏈接器共價(covalently)或非共價(non-covalently)性地共軛(conjugated)到第一成分；或第二鏈接器共價或非共價性地共軛到效應細胞的表面；或其組合。
在一些實施例中，第一鏈接器或第二鏈接器共軛到第一成分的天然官能基團(native functional group)或效應細胞的表面，其中該天然官能基團為胺基酸、糖基(sugar)或一胺基。
在一些實施例中，天然官能基團包括糖、胺基或者胺基酸；或者其中天然官能基團不是疊氮修飾(azide-modified)的糖，例如N-疊氮基乙醯基唾液酸(N-azidoacetyl sialic acid，SiaNAz)；或者，其中天然官能基團包括胺基酸選自由離胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸和色胺酸所組成的群組(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第二鏈接器直接地、共價性地連接(linked)到效應細胞的天然官能基團；其中第二鏈接器與效應細胞的天然官能基團之間的直接、共價性聯接(covalent link)是通過將效應細胞與第二鏈接器接觸而製備，使得第二鏈接器直接地、共價性地連接(linked)到天然官能基團(native functional group)(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一鏈接器和第二鏈接器選自由以下組成的群組：一DNA結合結構域(DNA binding domain)和一標靶DNA；一白胺酸拉鍊(leucine zipper)和標靶DNA；生物素(biotin)和卵白素(avidin)；生物素和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)；攜鈣素結合蛋白(calmodulin-binding protein)和攜鈣素(calmodulin)；一荷爾蒙和一荷爾蒙受體；凝集素(lectin)和一碳水化合物；一細胞膜受體和一受體配體(receptor ligand)；一酵素和一受質(substrate)；一抗原和一抗體；一促效劑和一拮抗劑；多核苷酸雜交序列(polynucleotide hybridizing sequences)；一適體(aptamer)和一標靶；以及一鋅指(zinc finger)和一標靶DNA。
在一些實施例中，兩個鏈接器中的至少一個包含聚乙二醇區域(PEGregion)或NHS酯(NHS ester)；或者其中第一成分通過偶合基團(coupling group)與第一鏈接器共軛(conjugated)，其中偶合基團是NHS酯或其他經活性化的酯、鹵烷(alkyl)或鹵醯(acyl halide)、一雙功能交聯劑(bifunctional crosslinker)或順丁烯二醯亞胺基團(maleimide group)(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一鏈接器與第二鏈接器之間的結合親和力小於250nM。較佳者，第一鏈接器與第二鏈接器之間的結合親和力小於 200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、60pM、50pM、20pM、15pM、10pM、5pM或2pM。
在一些實施例中，第一成分和效應細胞被1nm到400nm的長度隔開。較佳者，第一成分和效應細胞被1、2、5、10、15、20、30、32、35、40、45、50、60、62、65、70、75、80、90、100、120、150、180、200、220、250、280、300、320、350或380nm的長度隔開；或者1nm到200nm之間、1nm到100nm之間、1nm到50nm之間、5nm到100nm之間或5nm到50nm之間。
在一些實施例中，靶向單元和效應細胞被1nm到20nm或1nm到33nm的長度隔開。較佳者，靶向單元和效應細胞被2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30或32nm的長度隔開。
在一些實施例中，第一鏈接器對生物標誌物的結合親和力(binding affinity)小於250nM。較佳者，第一鏈接器對生物標誌物的結合親和力小於200nM、100nM、50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、60pM、50pM、20pM、15pM、10pM、5pM或2pM。
在一些實施例中，第一鏈接器是第一多核苷酸(polynucleotide)，並且第二鏈接器是第二多核苷酸。
在一些實施例中，第一多核苷酸是由去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，或其類似物，或其任何組合所組成的化合物。較佳者，第二多核苷酸是由去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸，或其類似物，或其任何組合所組成的化合物(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，兩個多核苷酸中的至少一個是DNA、RNA 或肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)分子，或其任何組合(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，兩個多核苷酸中的至少一個的長度為4nt到500nt。
在一些實施例中，兩個多核苷酸中的至少一個的長度是5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200、300、400或500nt。
在一些實施例中，第一多核苷酸包含第一單鏈區(first single-stranded region)，並且第二多核苷酸包含與第一單鏈區互補的第二單鏈區，其中靶向單元通過第一單鏈區和與第一單鏈區互補的第二單鏈區之間的交互作用複合到效應細胞的表面(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一多核苷酸和第二多核苷酸基本上地或完全性地彼此互補。例如兩個多核苷酸共享至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或者100%的互補性(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一多核苷酸或第二多核苷酸包含一序列選自20個核苷酸的聚GGTT(20-mer poly-GGTT)、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、23個核苷酸的序列SEQ ID NO：25(23-mer SEQ ID NO：25)，和SEQ ID NO：26。
在一些實施例式中，鏈接器被設計成具有大約或少於約90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%，或更低的GC含量。在一些實施例中，鏈接器被選擇為具有大約或多於約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，或更多的GC含量。在一些實施例中，鏈接器被設計成包含或由重複1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或者20次或重複直至到達鏈接器末端的1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10個核苷酸的序列組成(例如AAA......或ATAT......)。在一些實施例中，鏈接器被選擇為具有約或大於約30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或者更高的Tm(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一鏈接器包含第一反應基團(first reactive group)，並且第二鏈接器包含第二反應基團，並且其中靶向單元通過由第二反應基團和第一反應基團之間的反應(reaction)形成的共價鍵複合到效應細胞的表面。
在一些實施例中，細胞毒性細胞是免疫細胞、淋巴球、自然殺手細胞、γδT細胞、其他T淋巴球、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、細胞激素誘導的殺手細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)、淋巴激素活化的殺手細胞(lymphokine-activated killer cells，LAK)、細胞溶解型T細胞(cytolytic T cells，CTL)或腫瘤浸潤淋巴球(tumor-infiltrating lymphocytes，TIL)。
在一些實施例中，諸如效應細胞的細胞源自於細胞系(cell line)。細胞系的實例包括但不限於Raw264.7、U-937、oNK、NK92、NK3.3、KHYG-1、NKL，和其基因轉殖的變種。細胞系可從本領域的技術人員已知的多種來源取得(參見例如美國典型培養物保藏中心(the American Type Culture Collection，ATCC)(Manassas，維吉尼亞州))(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，諸如效應細胞的細胞是T細胞。T細胞包括表達CD3的所有細胞，包括CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD4+CD8+T細胞。T細胞包括初始型(naive)和記憶型細胞(例如TCM、TEM和TEMRA)、輔助細胞(例如Th1、Th2、Th3、Th9、Th7、TFH)、效應細胞(例如CTL或Tc細胞)、NKT細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TILs)、調節型細胞(例如Treg和Tr1細胞)、淋巴球活化的殺手細胞(lymphocyte-activated killer cells)、αβT細胞、γδT細胞(γδT細胞)，和T細胞群系相似的獨特類型。在一些實施例中，T細胞是活化的T細胞(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，諸如效應細胞的細胞是富含細胞激素誘導的殺手(Cytokine Induced Killer，CIK)細胞的細胞群。富集(enriching)細胞激素誘導的殺手細胞的方法描述於美國專利第10,744,207號中，該方法通過引用併入本文。在一些實施例中，諸如效應細胞的細胞是胚胎幹細胞(embryonic stem cell，ESC)，例如來自胚胎幹細胞細胞系(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，效應細胞在免疫功能不全的小鼠(immune compromised mouse)中是非致瘤性的(non-tumorigenic)；或該效應細胞在被γ射線照射後在同種異體的個體中是非致瘤性的。
在一些實施例中，效應細胞更進一步包含一不活化的腫瘤抑制基因(inactive tumor suppressor gene)或突變且高度表達的致癌基因。
在一些實施例中，效應細胞在施用(administration)前被儲存在或低於0℃。
在一些實施例中，效應細胞在施用前被儲存在或低於-20°C、-80℃、-130℃，或者-196℃。
在一些實施例中，該疾病為癌症，並且與疾病相關的異常細胞是癌症細胞。較佳者，該疾病為腫瘤，並且與疾病相關的異常細胞是腫瘤細胞。較佳者，該疾病為細菌感染疾病，並且與疾病相關的異常細胞是細菌所感染的細胞。較佳者，該疾病為HIV或其他病毒感染性疾病，並且與疾病相關的異常細胞是HIV或其他病毒所感染的細胞。較佳者，該疾病為真菌感染性疾病，並且與疾病相關的異常細胞為真菌所感染的細胞。較佳者，該疾病為原蟲感染性疾病，並且與疾病相關的異常細胞是原蟲所感染的細胞。較佳者，與疾病相關的異常細胞是位於與疾病相關的異常位置的健康或異常細胞。較佳者，與疾病相關的異常細胞是位於疾病病灶的健康或異常細胞。較佳者，與疾病相關的異常細胞是位於疾病病灶的處於病理狀態的(pathological conditions)細胞。
在一些實施例中，細胞毒性細胞是自然殺手細胞，其特性在於：(A)它存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017；(B)它包含一條染色體，並且該染色體的染色體DNA序列與存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017的自然殺手細胞相應染色體的染色體DNA序列是至少80%相同； 或者(C)它具有以下特性：i)表達CD16受體；ii)在繼代培養至少3個月後保有其增殖的能力；以及iii)x)不包含合成的、基因改造的和/或特意地遞送(deliberately delivered)的編碼CD16受體的多核苷酸，或y)通過使用微滴式數位核酸偵測系統(ddPCR)分析細胞毒性細胞的基因組去氧核醣核酸(genomic DNA)，CD16 F176F探針可檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)與CD16F176V探針可檢測到的去氧核醣核酸分子(DNA molecule)的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列是SEQ ID NO：27，並且CD16 F176V探針的序列是SEQ ID NO：28。
較佳者，細胞毒性細胞更進一步的特性在於：(1)細胞毒性細胞和自然殺手細胞系NK3.3源自不同的個體；(2)細胞毒性細胞源自患有癌症的個體；(3)細胞毒性細胞源自高加索男性；或(4)細胞毒性細胞和具有存放編號ATCC CRL-2407的自然殺手細胞源自同一個體；或其任何組合。
在一些實施例中，細胞毒性細胞源自存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017的自然殺手細胞。
在一些實施例中，細胞毒性細胞中染色體的染色體 DNA(chromosomal DNA)序列與存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017的自然殺手細胞相應染色體的染色體DNA序列是至少85、90、95、96、97、98、99%、99.99%或99.995%相同的。
在一些實施例中，染色體是選自由下列組成的群組：1號染色體、2號染色體、3號染色體、4號染色體、5號染色體、6號染色體、7號染色體、8號染色體、9號染色體、10號染色體、11號染色體、12號染色體、13號染色體、14號染色體、15號染色體、16號染色體、17號染色體、18號染色體、19號染色體、20號染色體、21號染色體、22號染色體、X染色體，以及Y染色體。
在一些實施例中，染色體是細胞毒性細胞的1號染色體、2號染色體、3號染色體、4號染色體、5號染色體、6號染色體、7號染色體、8號染色體、9號染色體、10號染色體、11號染色體、12號染色體、13號染色體、14號染色體、15號染色體、16號染色體、17號染色體、18號染色體、19號染色體、20號染色體、21號染色體、22號染色體、X染色體或Y染色體，並且對應的染色體分別為存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017的自然殺手細胞的1號染色體、2號染色體、3號染色體、4號染色體、5號染色體、6號染色體、7號染色體、8號染色體、9號染色體、10號染色體、11號染色體、12號染色體、13號染色體、14號染色體、15號染色體、16號染色體、17號染色體、18號染色體、19號染色體、20號染色體、21號染色體、22號染色體、X染色體或Y染色體。
在一些實施例中，細胞毒性細胞的全基因組與存放在NPMD具有存放編號NITE BP-03017的自然殺手細胞的全基因組是至少95%、 96%、97%、98%、99%、99.5%、99.995%，或99.9995相同的。
在一些實施例中，細胞毒性細胞在繼代培養至少4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年，或8年後能夠增殖。
在一些實施例中，效應細胞更進一步表達CD2、CD45、CD4、CD25、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46、CD27、OX40、CD107a、NKG2A、程式性細胞死亡-1(PD-1)、TIGIT、SIRPα或CD158，或其任何組合。
在一些實施例中，CD16受體是CD16a受體或CD16b受體。
在一些實施例中，編碼CD16受體的所表達的多核苷酸位於一號染色體q臂的第1q23.3位點。
在一些實施例中，編碼CD16受體的多核苷酸包含SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：31的核苷酸序列。
在一些實施例中，CD16受體包含SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33或SEQ ID NO：34的胺基酸序列。
在一些實施例中，細胞毒性細胞是γδT細胞；或細胞毒性細胞是Vδ1T細胞、Vδ2T細胞、Vδ3T細胞、Vδ5T細胞，或Vγ9Vδ2T細胞。
在一些實施例中，效應細胞更進一步表達CD3、NKp46、CD56、CD16、NKG2D、NKp44、CD25、CD38、程式性細胞死亡-1(PD-1)、NKp30、CD18、TIGIT、DNAM-1、CD36、CD103、CCR7、CXCR3、干擾素γ(IFNγ)、顆粒酶B(Granzyme B)或CD69，或其任何組合。
在一些實施例中，在與標靶細胞共同培養後，效應細胞更進一步表達顆粒酶B。
在一些實施例中，其中：(1)至少4%的效應細胞每個細胞表達至少400個NKp46分子；(2)至少10%的效應細胞每個細胞表達至少400個CD56分子；(3)至少10%的效應細胞每個細胞表達至少400個CD16分子；(4)至少30%的效應細胞每個細胞表達至少40個NKG2D分子；(5)至少1%的效應細胞每個細胞表達至少400個NKp44分子；(6)至少80%的效應細胞每個細胞表達至少400個CD69分子；或(7)至少40%的效應細胞每個細胞表達至少400個CXCR3分子；或其任何組合。
在一些實施例中，其中：(1)至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的效應細胞每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000或者200000個NKp46分子；(2)至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、 2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD56分子；(3)至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、 430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD16分子；(4)至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或者70%的效應細胞每個細胞表達至少50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000、1000000、1250000、 1500000、1750000、2000000、2250000、2500000、2750000、3000000、3250000、3500000、3750000、4000000、4250000、4500000、4750000、5000000、5250000、5500000、5750000、6000000、6250000、6500000、6750000或者7000000個NKG2D分子；(5)至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000或者200000個NKp44分子；(6)至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或者90%的效應細胞每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、 340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD69分子；或者(7)至少50%、55%、60%、63%、67%、70%、73%、77%、80%、83%、87%、90%、93%、97%或者90%的效應細胞每個細胞表達至少6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CXCR3分子；或者其任何組合。
在一些實施例中，其中：(1)至少4%的效應細胞表達NKp46，其中表達NKp46的效應細胞平均每個細胞表達至少400個NKp46分子； (2)至少10%的效應細胞表達CD56，其中表達CD56的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD56分子；(3)至少10%的效應細胞表達CD16，其中表達CD16的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD16分子；(4)至少30%的效應細胞表達NKG2D，其中表達NKG2D的效應細胞平均每個細胞表達至少40個NKG2D分子；(5)至少1%的效應細胞表達NKp44，其中表達NKp44的效應細胞平均每個細胞表達至少400個NKp44分子；(6)至少80%的效應細胞表達CD69，其中表達CD69的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD69分子；或者(7)至少40%的效應細胞表達CXCR3，其中表達CXCR3的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CXCR3分子；或者其任何組合。
在一些實施例中，其中：(1)至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞表達NKp46，其中表達NKp46的效應細胞平均每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000 或者200000個NKp46分子；(2)至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞表達CD56，其中表達CD56的效應細胞平均每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD56分子；(3)至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞表達CD16，其中表達CD16的效應細胞平均每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、 85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD16分子；(4)至少30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%或者70%的效應細胞表達NKG2D，其中表達NKG2D的效應細胞平均每個細胞表達至少50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、 580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000、700000、710000、720000、730000、740000、750000、760000、770000、780000、790000、800000、810000、820000、830000、840000、850000、860000、870000、880000、890000、900000、910000、920000、930000、940000、950000、960000、970000、980000、990000、1000000、1250000、1500000、1750000、2000000、2250000、2500000、2750000、3000000、3250000、3500000、3750000、4000000、4250000、4500000、4750000、5000000、5250000、5500000、5750000、6000000、6250000、6500000、6750000或者7000000個NKG2D分子；(5)至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或者50%的效應細胞表達NKp44，其中表達NKp44的效應細胞平均每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000或者200000個NKp44分子；(6)至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%或者90%的效應細胞表達CD69，其中表達CD69的效應細胞平均每個細胞表達至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、 2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CD69分子；或者(7)至少40%、45%、50%、55%、60%、63%、67%、70%、73%、77%、80%、83%、87%、90%、93%、97%或者90%的效應細胞平均每個細胞表達至少6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、15000、20000、25000、30000、35000、40000、45000、50000、55000、60000、65000、70000、75000、80000、85000、90000、95000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、或者200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、300000、310000、320000、330000、340000、350000、360000、370000、380000、390000、400000、410000、420000、430000、440000、450000、460000、470000、 480000、490000、500000、510000、520000、530000、540000、550000、560000、570000、580000、590000、600000、610000、620000、630000、640000、650000、660000、670000、680000、690000或者700000個CXCR3分子；或者其任何組合。
在一些實施例中，10%~90%的效應細胞是效應記憶型T細胞(EM細胞)(effector memory T cells，EM cells)。
在一些實施例中，15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%或者89%的效應細胞是效應記憶型T細胞(EM細胞)。
在一些實施方式中，90%~10%的效應細胞是終端分化的效應記憶型T細胞(TDEM細胞)(terminally differentiated effector memory T cells,TDEM cells)。
在一些實施例中，85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、14%、13%、12%或者11%的效應細胞是終端分化的效應記憶型T細胞(TDEM細胞)。
在一些實施例中，靶向單元是第一種類型(first type)的靶向單元，並且效應細胞更進一步包含複合到效應細胞表面的第二種類型靶向單元群體，其中在第二種類型靶向單元群體中的靶向單元包含第二成分，其特徵在於(a)它表現出與生物標誌物或與疾病相關的異常細胞表達的不同生物標誌物的特異性結合(specific binding)；(b)它不是由效應細胞產生的。在一些實施例中，該第二成分為抗體。在一些實施例中，第二成分是 誘導抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的IgG亞型單株抗體；或者第二成分是其他抗體；或者第二成分包含抗原結合單元(antigen-binding unit)。在一些實施例中，第二成分不是核酸(nucleic acid)。在一些實施例中，第二成分是FDA批准的用來治療疾病的成分。在一些實施例中，第二成分是利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)、妥珠單抗(elotuzumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab)、庫沙珠單抗(cusatuzumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、paintumumab或者阿瑪西單抗(amatuximab)。在一些實施例中，第二成分已經在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分。在一些實施例中，第二成分是鈷妥珠單抗(codrituzumab)、索拉珠單抗(solanezumab)、bimagrumab、塔羅金單抗(tralokinumab)或者巴可西珠單抗(bococizumab)。
圖1A是呈現曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(trastuzumab-complexed human CD16+ natural killer cells)和無複合的人類CD16+自然殺手細胞(non-complexed human CD16+ natural killer cells)之間殺死曲妥珠單抗反應性的癌細胞(trastuzumab-responsive cancer cells)的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖1B是呈現曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(trastuzumab-complexed human CD16+ natural killer cells)和無複合的人類CD16+自然殺手細胞(non-complexed human CD16+ natural killer cells)之間殺 死抗曲妥珠單抗的(trastuzumab-resistant)癌細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖2是呈現曲妥珠單抗(trastuzumab)、人類CD16+自然殺手細胞、與曲妥珠單抗共同培養的人類CD16+自然殺手細胞，以及曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞對於抗曲妥珠單抗的癌細胞的細胞毒殺效力的長條圖。
圖3A-3B是在第10天收集的γδT細胞的直方圖。
圖4A-4B是在第14天收集的γδT細胞的直方圖。
圖5A是源自QuaniumTM Simply Cellular®試劑盒的螢光染料PE共軛小鼠抗人類CD56的標準曲線。
圖5B是源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒的螢光染料PE-Cy7共軛小鼠抗人類CD16的標準曲線。
圖5C是源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒的螢光染料PE-Cy7共軛小鼠抗人類NKG2D的標準曲線。
圖5D是源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒的螢光染料PE-Cy7共軛小鼠抗人類NKp44的標準曲線。
圖5E是源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒的螢光染料PE-Cy7共軛小鼠抗人類NKp46的標準曲線。
圖6A是呈現曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(trastuzumab-complexed human gamma delta T cells)和無複合的人類γδT細胞(non-complexed human gamma delta T cells)之間殺死正常癌症細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖6B是呈現曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(trastuzumab-complexed human gamma delta T cells)和無複合的人類γδT細胞(non-complexed human gamma delta T cells)之間殺死抗曲妥珠單抗癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells)的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖7A是呈現西妥昔單抗複合的人類γδT細胞(cetuximab-complexed human gamma delta T cells)和無複合的人類γδT細胞(non-complexed human gamma delta T cells)之間殺死正常癌細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖7B是呈現西妥昔單抗複合的人類γδT細胞(cetuximab-complexed human gamma delta T cells)和無複合的人類γδT細胞(non-complexed human gamma delta T cells)之間殺死抗西妥昔單抗(cetuximab-resistant)癌細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖8A是呈現缺氧對成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)和無複合的人類細胞毒性細胞(non-complexed human cytotoxic cells)的細胞毒殺功能影響的長條圖。
圖8B是呈現乳酸(一種代謝廢物)對成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)的細胞毒殺功能影響的長條圖。
圖8C是呈現腹水萃取物(ascites extract)(包含免疫抑制性的細胞激素(immunosuppressive cytokines))對成分複合的人類細胞毒性細胞(ingredient-complexed human cytotoxic cells)的細胞毒殺功能影響的長條圖。
圖9A說明成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cell)遷移研究的檢驗設計(assay design)。
圖9B是呈現成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)進入到癌細胞所在區域的遷移能力的長條圖。
圖10A說明CD3+T細胞遷移研究的檢驗設計。
圖10B是呈現成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)對CD3+T細胞進入到癌細胞所在區域的遷移能力影響的長條圖。
圖11是呈現與不同數量的曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(human gamma delta T cells complexed with different number of trastuzumab)之間殺死抗曲妥珠單抗癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells)的細胞毒性功能比較的長條圖。
圖12是呈現與不同數量的利妥昔單抗複合的人類γδT細胞(human gamma delta T cells complexed with different number of rituximab)之間殺死抗利妥昔單抗癌細胞(rituximab-resistant cancer cells)的細胞毒性功能比較的長條圖。
圖13是呈現與不同數量的利妥昔單抗複合的人類γδT細胞(human gamma delta T cells complexed with different number of rituximab)之間進入到癌細胞所在區域的遷移能力比較的長條圖。
圖14是呈現抗GPC3的抗體複合的人類CD16+自然殺手細胞(the anti-GPC3 antibody-complexed human CD16+ natural killer cells)和無複合的人類CD16+自然殺手細胞(non-complexed human CD16+ natural killer cells)之間殺死癌症細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
圖15是呈現抗GPC3的抗體複合的人類γδT細胞(the anti-GPC3 antibody-complexed human gamma delta T cells)和無複合的人類γδT細胞(non-complexed human gamma delta T cells)之間殺死癌症細胞的細胞毒殺功能比較的長條圖。
術語『成分』，例如『第一成分』或者『第二成分』是指施用於個體時帶來一些有益效果的任何物質、分子、化合物、蛋白質、細胞或者活性成分。有益效果包括生物標誌物的識別；異常細胞的識別；與由異常細胞表達的生物標誌物特異性的交互作用；與由異常細胞表達的生物標誌物特異性交互作用(或者結合)；疾病、症狀、病症(disorder)或者病理狀況的改善；診斷測定的實現(enablement of diagnostic determinations)；大體上地抵禦疾病、症狀、病症或病理狀況；以及減少或預防疾病、症狀、病症或病情的發作。成分的實例包括但不限於細胞、抗體、荷爾蒙或者其他配體、凝集素、碳水化合物、核酸(RNA或DNA)雜交序列、適體、其他成分以及類似者(參見美國專利第10,744,207號)。
術語『有效量』是指足以有益地影響或生成想要結果的成分的量。對『有效量』的其他定義為本領域的技術人員所熟知，例如在教科書或文件如美國專利第10,744,207號中所描述的，其通過引用併入本文(參見美國專利第10,744,207號)。
術語『FDA批准的用來治療疾病的成分』是指被FDA批准用來治療疾病的任何成分。例如利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)以及妥珠單抗(elotuzumab)是FDA 批准用來治療不同癌症或腫瘤的成分。
術語『成分已經在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分』是指任何可能表現出治療疾病的潛力並且已經在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分的成分，因為例如該成分在第二/三期試驗中被確定為是無效的或沒有足夠的功效。例如鈷妥珠單抗(codrituzumab)是一種在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療癌症或腫瘤的成分的成分。
術語『抗原結合單元』大體上是指對抗原具有高度親和力的部分(moiety)。抗原結合單元的非限制性實例包括適體和抗體(參見美國專利第10,744,207號)。在一些實施例中，一些成分例如包含抗原結合單元的第一成分是包含Fc受體識別區的抗體，並且因此這些成分能夠被Fc受體識別(例如被Fcγ受體識別)。在一些實施例中，一些成分例如包含抗原結合單元的第一成分是IgG亞型的單株抗體。
術語『細胞毒性細胞』是指任何具有殺死或破壞其他活細胞能力的細胞；例如細胞毒性T細胞、自然殺手細胞、γδT細胞、巨噬細胞或者任何其他具有殺死或破壞其他活細胞能力或者介導任何細胞毒性包括但不限於抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的細胞。
術語『疾病的病灶』是指器官或組織中遭受由疾病引起或與疾病相關的損傷或異常變化的任何區域，例如卵巢癌的病灶。
術語『與疾病相關的異常細胞』大體上是指任何遭受由疾病引起或與疾病相關的異常變化的細胞，並且因此該細胞具有至少一異常地特性，例如任何分子的異常表達或者該細胞位於異常的微環境 (microenvironment)中。
術語『在治療患有疾病的個體上被確定為是無效的或者沒有足夠功效的成分』大體上是指任何成分(例如FDA批准的用來治療疾病的成分)，其在治療患有疾病的個體方面被確定為是無效的或者沒有足夠的功效(在該成分的施用前或後)的，因為例如(1)個體或個體的異常細胞對該成分是無反應性的、反應性不充分、不敏感的、難治性的或者有抗性的，或者(2)在個體的異常細胞沒有足夠的能夠被該成分特異性地識別的生物標誌物。
術語『在臨床試驗結束時被斷定為在治療疾病上是無效的或沒有足夠的功效的成分』大體上是指在例如第二/三期臨床試驗中被斷定或被確定為在治療疾病上是無效的或沒有足夠的功效的任何成分(例如在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准的用來治療疾病的成分的成分)。
術語『gdT細胞』、『γδT細胞』或者『γδT細胞(gamma delta T cells)』是指T細胞的一個子集(subset)，在它們的表面表達了獨特的T細胞受體(TCR)鏈組合，γδTCR(而非αβTCR)，該γδTCR由TCR-γ鏈，例如Vγ2、Vγ3、Vγ4、Vγ5、Vγ8、Vγ9、Vγ11，和TCR-δ鏈組成，例如Vδ1、Vδ2、Vδ3以及Vδ5。術語『gdT細胞』具體而言包括gdT細胞的所有子集以及其組合(參見Pistoiaet al.,2018；WO2020117862A1)。
第一鏈接器(first linker)和第二鏈接器(second linker)之間的交互作用可以是直接的或間接的。大體上，間接的交互作用是由一個或更多的中間化合物介導的(mediated)交互作用。中間化合物可以是與一個或兩個鏈接器(one or both linkers)相同或不同的類型。在一些實施例中，第一和 第二鏈接器是相同的並且通過與中間化合物同時交互作用而交互作用。例如第一和第二鏈接器可以是相同的抗體，其通過同時結合中間化合物的方式彼此間接交互作用，且該中間化合物包含兩或更多拷貝(copies)的被抗體針對的抗原。在一些實施例中，第一鏈接器和第二鏈接器是不同的。在一些實施例中，第一和第二鏈接器直接地交互作用。大體上，直接交互作用是不需要與中間化合物交互作用的交互作用。在一些實施例中，靶向單元包含與第一多核苷酸(first polynucleotide)共軛(conjugated)的靶向部分，並且治療單元(therapeutic unit)包含與第二多核苷酸共軛(conjugated)的治療劑(therapeutic agent)，且其中所述靶向單元和所述治療單元通過第一多核苷酸和第二多核苷酸之間的互補性或者利用銜接子多核苷酸(adapter polynucleotide)形成複合物。第一和第二多核苷酸可以直接地交互作用，例如通過彼此雜交。第一和第二多核苷酸可以間接地交互作用，例如通過與中間化合物交互作用。在一些實施例中，中間化合物是銜接子多核苷酸(adapter polynucleotide)，例如本文所述。例如第一和第二多核苷酸可以通過與部分的銜接子多核苷酸的互補性間接地交互作用。在一些實施例中，第一和第二鏈接器是彼此反應以形成共價鍵的反應性基團(reactive groups)。每個反應性基團可能首先與其附接到的實體(例如靶向部分或治療劑)直接反應以形成共價鍵(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，第一鏈接器和第二鏈接器通過與一種或多種的中間化合物交互作用間接地交互作用。例如第一鏈接器多核苷酸(first linker polynucleotide)和第二鏈接器多核苷酸(second linker polynucleotide)可能通過與銜接子多核苷酸的不同部分的互補性而交互作用。銜接子多核苷 酸可以包括DNA、RNA、核苷酸類似物、非典型的核苷酸(non-canonical nucleotides)、標記的核苷酸、修飾的核苷酸，或其組合。銜接子多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的或者部分雙鏈的(partial duplex)。大體上，部分雙鏈的銜接子包含一個或更多的單鏈區以及一個或更多的雙鏈區。雙鏈的銜接子可以包含彼此相互雜交的兩個獨立寡核苷酸(oligonucleotides)(也稱為『寡核苷酸雙鏈體』(oligonucleotide duplex))，並且雜交可能留下一個或更多個的3'突出端、一個或更多個的5'突出端、一個或更多個的因錯配和/或未配對的核苷酸導致的凸起(bulges)，或這些的任何組合。與第一鏈接器多核苷酸和第二鏈接器多核苷酸皆交互作用的銜接子多核苷酸可以包含相連的主鏈(contiguous backbone)。例如第一和第二鏈接器可以與單鏈銜接子多核苷酸的不同部分雜交。或者，第一鏈接器多核苷酸可以與雙鏈鏈接器的第一條鏈雜交，第二鏈接器多核苷酸可以與雙鏈鏈接器的第二條鏈雜交，並且銜接子的第一條和第二條鏈可以彼此雜交，使得第一和第二鏈接器通過與雙鏈銜接子多核苷酸的序列互補性間接地交互作用。銜接子多核苷酸或者可以包含不相連的主鏈(discontiguous backbone)，例如當兩個或更多的雙鏈銜接子多核苷酸(例如2、3、4、5或更多)在鏈中雜交時，其第一鏈接器多核苷酸與鏈的一端雜交，並且第二鏈接器多核苷酸與鏈的另一端雜交(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，主體複合物(subject complex)包含靶向單元和治療單元，其中每一個單元都包含一鏈接器，鏈接器交互作用把兩個單元匯集在一起形成複合物。例如通過第一和第二鏈接器之間的交互作用，共軛到第一鏈接器的第一部分(例如靶向部分)與共軛到第二鏈接器 的第二部分(例如治療劑或細胞)形成複合物。在一些實施例中，鏈接器之間的交互作用是共價鍵的形成。在一些實施例中，鏈接器之間的交互作用是非共價性的交互作用，例如靜電的、疏水性的、氫鍵、凡得瓦或磁性的交互作用。在一些實施例中，鏈接器之間的交互作用是可逆的交互作用，使得靶向單元和治療單元之間形成的複合物是可逆複合物(reversible complex)。大體上，可逆複合物是能夠通過改變複合物所經受的一種或更多種的條件破壞的複合物，例如含有可逆複合物的溶液的條件。例如可逆交互作用可以通過改變溫度(例如施加熱)、改變pH值(例如降低或提高pH值)、酶活性(例如酶降解)、改變離子強度(例如降低鹽濃度)、或其中的兩個或更多個的組合破壞。可逆交互作用的一個實例是兩個互補性多核苷酸之間的交互作用。例如第一鏈接器可以是具有與第二鏈接器多核苷酸的單鏈區互補的單鏈區的多核苷酸，因此鏈接器無需進一步處理而是通過序列互補性彼此雜交。作為另一個實例，第一鏈接器可以是具有雙鏈區的多核苷酸，該雙鏈區與雙鏈或者單鏈的第二鏈接器多核苷酸的其中一個區互補，使得第一和第二鏈接器之間的交互作用是通過處理結合部分(combine moieties)來使鏈接器的互補部分成為單鏈來觸發的(參見美國專利第10,744,207號)。
包含在本文所公開的主體複合物中的靶向單元通常包含靶向部分(例如成分)，靶向部分賦予靶向單元通過表現出較佳的交互作用或結合來區分標靶與非標靶的能力。因此，靶向單元的靶向部分(例如成分)包括跟對複合物混合物中的非標靶化合物或複合物相比對標靶化合物或複合物具有更高的結合親和力的化合物或複合物。靶向部分可以基於對所需 標靶例如與標靶細胞相關的生物標誌物具有或產生後具有結合親和力選擇(參見美國專利第10,744,207號)。
靶向部分例如成分可能被導向到的細胞的相關生物標誌物包括細胞表面標誌物。細胞表面標誌物的非限制性實例包括碳水化合物、醣脂、醣蛋白、存在於造血群系細胞上的CD(分化簇)抗原(例如CD2、CD4、CD8、CD21等)、γ-麩胺醯基轉胜肽酶、黏附蛋白(例如ICAM-1、ICAM-2、ELAM-1、VCAM-1)、荷爾蒙、生長因子、細胞激素以及其他配體受體、離子通道、以及膜結合形式的免疫球蛋白μ鏈。在一些實施例中，與標靶細胞相關的生物標誌物以每個細胞大約或小於約100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50或者更少的拷貝(copies)存在於標靶細胞的表面上。在一些實施例中，標靶細胞群中與標靶細胞表面相關的生物標誌物的平均密度為每個細胞大約或小於約100000、50000、10000、5000、1000、750、500、100、50或者更少的拷貝數。在一些實施例中，對比於距離標靶細胞更遠的液體或組織中所發現的標誌物濃度，例如細胞分泌生物標誌物的地方，標靶細胞周圍的液體或它所在的組織中有更高濃度的(increased concentration)標誌物，生物標誌物藉此方式與標靶細胞相關聯，。特別感興趣的是與疾病或疾病狀態相關的生物標誌物；進一步特別感興趣的是由與疾病或疾病狀態相關的標靶細胞(例如異常細胞)表達的疾病相關生物標誌物。大量與疾病相關的生物標誌物已經被鑑定出來，並且相應的靶向部分已經被生成，例如指向甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein，AFP)、C反應蛋白(CRP)、癌抗原50(CA-50)、與卵巢癌相關的癌抗原125(CA-125)、與乳癌相關的癌抗原15-3(CA15-3)、與胃腸道癌相關的癌抗 原19(CA-19)和癌抗原242、癌胚抗原(CEA)、癌相關的抗原(CAA)、染色顆粒素A、上皮黏蛋白抗原(MC5)、人類上皮特異性抗原(HEA)、Lewis(a)抗原、黑色素瘤抗原、黑色素瘤相關的抗原100、25以及150、類黏蛋白癌相關的抗原、多重抗藥性相關的蛋白(MRPm6)、多重抗藥性相關的蛋白(MRP41)、Neu致癌基因蛋白(C-erbB-2)、神經元特異烯醇酶(NSE)、P-醣蛋白(mdr1基因產物)、多重抗藥性相關的抗原、p170、多重抗藥性相關的抗原、前列腺特異性抗原(PSA)、CD56以及NCAM的靶向部分(參見美國專利第10,744,207號)。
適合用於共軛(conjugating)到治療劑(例如細胞毒性細胞)或者靶向部分(例如成分、抗體)的鏈接器可以是結合對(binding pair)的成員。結合對的第一個成員大體上對結合對的第二個成員表現出比對非成員的分子更高的親和力。結合對的實例包括但不限於抗原-抗體、受體-荷爾蒙、受體-配體、促效劑-拮抗劑、凝集素-碳水化合物、多核苷酸(RNA或DNA)雜交序列、適體-靶標、卵白素-生物素、鏈霉抗生物素蛋白-生物素、白胺酸拉鍊-標靶多核苷酸、鋅指-標靶多核苷酸、以及類似者。在一些實施例中，鏈接器是附接到細胞的外源性鏈接器。在本文中，『外源性的』用於代表鏈接器不是由它所共軛的細胞產生的。例如從獨立來源的外源性鏈接器可以與細胞混合來把鏈接器共軛到細胞(參見美國專利第10,744,207號)。
本文所述的鏈接器和部分(moieties)可以通過任何本領域已知的合適方式共軛。共軛到靶向部分(例如成分、抗體)或者治療單元(例如細胞)的鏈接器可以通過共價性或者非共價性的聯接結合(linkage)。在一些實施例中，鏈接器共軛到靶向部分(例如成分、抗體)或治療單元的天 然官能基團(native functional group)，例如細胞表面上天然官能基團或者蛋白質中的天然基團(native group)。細胞表面可以包含任何合適的天然官能基團，例如胺基酸和糖。例如試劑包括順丁烯二醯亞胺(maleimide)、二硫化物和醯化反應過程可以被用來與細胞表面蛋白上的半胱胺酸形成直接共價鍵。醯胺偶合反應(Amide coupling)可以被用在天冬胺酸鹽和麩胺酸鹽以形成醯胺鍵。重氮陽離子偶合反應(Diazonium coupling)、醯化和烷基化可以被用在細胞表面上的酪胺酸以形成醯胺鍵鍵聯(amide bond linkage)。任何的胺基酸(20個胺基酸或者任何非天然胺基酸)皆可能可以被用來與細胞表面形成直接的共價鍵，其為寡核苷酸的附接。該20種胺基酸是異白胺酸、白胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、色胺酸和纈胺酸(必需胺基酸)，以及丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、麩胺酸、麩醯胺、甘胺酸、脯胺酸、絲氨酸和酪胺酸，非必需胺基酸，以及精胺酸和組胺酸。在一些實施例中，天然官能基團可以是胺基酸，例如離胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸或者色胺酸。在其他實施例中，天然官能基團是離胺酸。在一些其他實施例中，天然官能基團可以是N端的絲胺酸或者蘇胺酸(參見美國專利第10,744,207號)。
一些實施例中，鏈接器可以使用偶合基團(coupling group)共軛至靶向單元或治療單元。例如偶合基團可以是經活化的酯(例如NHS酯、1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)酯、二環己基碳二亞胺(dicyclohcxylcarbodiimide，DCC)酯等)，或者烷基或醯基鹵化物(例如-Cl、-Br、-I)。在一些實施例中，經活化的酯是經分離的和/或經純化的。在一些實施例中，經活化的酯 是原位生成的和/或使用的。在一些例子中，偶合基團可以直接地共軛到治療劑(例如作為治療劑使用的細胞的表面)而無需對天然官能基團(例如，胺基酸)預先修飾。例如鏈接器可以通過與靶向部分(例如抗體、適體)或者細胞表面上的胺基酸形成鍵結(例如醯胺鍵或酯鍵)共軛到靶向單元或治療單元。在一些實施例中，偶合基團是NHS酯，其與靶向單元或治療單元上的親核性天然官能基團反應，產生醯化產物。例如天然官能基團可以是胺，其通過NHS酯形成醯胺結合。或者，天然官能基團可以是羥基或者巰基，它們可以通過NHS酯分別形成酯鍵聯或者巰基酯鍵聯結合(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，鏈接器可以使用雙功能性交聯劑(bifunctional crosslinker)共軛至靶向單元或治療單元。雙功能性交聯劑可以包含兩個能夠偶合到兩個不同功能性的標靶，例如胜肽、蛋白質、大分子、半導體納米晶體(semiconductor nanocrystals)或者受質的不同的反應性基團。該兩個反應性基團可以是相同的或不同的，並且包括但不限於如巰基、羧酸酯、羰基、胺、羥基、醛、酮、活性氫、酯、巰基或者光反應性部分(photoreactive moieties)的反應性基團。在一些實施例中，交聯劑(cross-linker)可以在官能端上含有一個胺反應性基團和一個巰基反應性基團。在其他實施例中，雙功能性交聯劑(bifunctional crosslinker)可以是NHS-PEO-順丁烯二醯亞胺(NHS-PEO-Maleimide)，其包含允許(allow)含有胺和含有巰基的分子(amine- and sulfhydryl-containing molecules)共價結合的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯和順丁烯二醯亞胺基團。可以用來把鏈接器共軛到靶向單元或治療單元的異雙功能性交聯劑(heterobifunctional cross-linkers)的其他實例包 括但不限於：胺反應性+巰基反應性交聯劑、羰基反應性+巰基反應性交聯劑、胺反應性+光反應性交聯劑、巰基反應性+光反應性交聯劑、羰基反應性+光反應性交聯劑、羧酸酯反應性+光反應性交聯劑以及精胺酸反應性+光反應性交聯劑(參見美國專利第10,744,207號)。
典型的交聯劑可以被分為以下類別(包含示例性官能基團)：1.胺反應性：交聯劑與含有胺(NH2)的分子偶合，例如異硫氰酸酯、異氰酸酯、醯疊氮、NHS酯、氯化磺醯、醛和乙二醛、環氧化物和環氧乙烷、碳酸鹽、芳基化試劑、亞胺酯、碳二亞胺、酸酐、炔烴等；2.巰基反應性：交聯劑偶合到含有巰基(SH)的分子，例如鹵代乙醯基和烷基鹵化物衍生物、順丁烯二醯亞胺、氮丙啶、丙烯醯基衍生物、芳基化試劑、巰基-二硫化物交換試劑等；3.羧酸酯反應性：交聯劑偶合到含有羧酸(COOH)的分子例如重氮烷和重氮乙醯基化合物例如鎖基二咪唑和碳二亞胺；4.羥基反應性：交聯劑偶合到含有羥基(-OH)的分子例如環氧化物和環氧乙烷、羰基二咪唑、用過碘酸鹽氧化的、N,N'-碳酸二琥珀醯亞胺酯或氯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯、酶促氧化、烷基鹵，異氰酸酯；5.醛和酮反應性：交聯劑偶合到含有醛(-CHO)或酮(R2CO)的分子例如用於席夫鹼形成反應或還原胺化反應的肼衍生物；6.活性氫反應性，例如，用於曼尼赫縮合反應和碘化反應的重氮衍生物；以及 7.光反應性，例如芳基疊氮化物和鹵化芳基疊氮化物、二苯甲酮、重氮化合物、二氮環丙烯衍生物(參見美國專利第10,744,207號)。
對於每個類別，即，特定化學物質是否靶向官能基團，存在一些子類別，因為一些反應性基團能夠與數種官能基團反應。對於每個的這些子類別都有許多化學品實例。許多這些化學品和上文子類別列表可以在“Bioconjugate Techniques” Greg T Hermanson著，Academic Press，聖地牙哥，1996年中被找到，其通過引用併入本文(參見美國專利第10,744,207號)。
在另一個實施例中，交聯劑(crosslinkers)包含聚乙二醇(PEG)，也稱為聚環氧乙烷(PEO)，間隔物(spacers)可以被用來作為具有純烴間隔物臂(purely hydrocarbon spacer arms)試劑的替代物。聚乙二醇間隔物(PEG spacers)提高了試劑和結合物的水溶性，降低了結合物聚集的可能性，並且增加了交聯的靈活性，致使降低對間隔物本身的免疫性反應。與包含不同PEG鏈長的異質混合物的典型聚乙二醇試劑相反，這些聚環氧乙烷試劑是具有確定的分子量和5臂長(arm length)間隔物的同質化合物，在交聯應用的優化和鑑定上提供較高的精確度。例如實施例中通過溶解5mg的NHS-PEO6-順丁烯二醯亞胺(Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，伊利諾伊州，61105)使用琥珀醯亞胺基-[(N-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-六乙二醇]酯來製備原液溶液(stock solution)(見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，共軛(conjugation)可以造成羧基或者羰基，或者其胺基或者硫代等價物。此類基團的實施例包括但不限於酮、醯亞胺、硫酮、醯胺、醯亞胺醯胺、硫醯胺、酯、亞胺酯、硫酯、胺甲酸酯、 脲、硫脲、碳酸酯、carbonimidates和carbonthioates。在一些實施例中，共軛可以造成腙或者肟鍵。在一些實施例中，共軛可以造成雙硫鍵。在一些實施例中，鏈接器可以使用天然化學連接(Native Chemical Ligation，NCL)方法共軛。鏈接器和偶合基團的其他實施例被公開在WO2010118235A1中，其通過引用併入本文(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實例中，鏈接器可以直接地共軛到細胞表面。當細胞膜(細胞表面、細胞的外面或其成分)在鏈接器附接(attachment)之前沒有被主動地修飾或改變時，細胞被『直接地』共軛。具體而言，因為附接是到細胞表面上的天然官能基團，『直接地』意味著天然官能基團在鏈接器共軛之前沒有被修飾過(參見美國專利第10,744,207號)。
用來共軛的緩衝溶液可以基於化學鏈接器或交聯劑的選擇(choice)以及維持細胞的生長條件(即，防止細胞裂解)而被選擇(selected)。在一些實施例中，緩衝溶液的pH範圍是從6~8並且不包含在化學鏈接器中用來與共軛鏈接器(例如單鏈多核苷酸)反應的相同官能基團。可以使用pH7.2，但是pH不必是中性的，並且通常來說取決於與化學反應和細胞條件的相容性(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，緩衝溶液是中性pH值的磷酸鹽緩衝溶液，使N-氫化琥珀醯亞胺(NHS)酯(例如NHS-PEO-順丁烯二醯亞胺)可以被用作偶合基團。反應大體上在允許鏈接器和部分(moiety，例如抗體、適體、細胞表面)共軛的條件下進行。在使用NHS酯交聯劑和磷酸鹽緩衝溶液的一些實施例中，反應在中性pH值(例如pH7.2)和室溫進行所指定的時間週期(例如大約1、3、5、10、15、20、30、45、60或者更多分鐘)(參 見美國專利第10,744,207號)。
鏈接器可以是多核苷酸。示例性多核苷酸包括但不限於去氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、嗎啉基(morpholino)以及鎖核酸(LNA)、乙二醇核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)、單鏈DNA(ssDNA)、適體(aptamer)以及其他核酸部分例如氟化核酸。在一些實例中，鏈接器可以是適體。適體是可以採用三維結構並且結合特定標靶分子的寡核苷酸(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，本揭露提供一種細胞包含至少兩種不同的靶向單元(例如第一類型和第二類型)複合到其外表面，其中每一種不同的靶向單元包含相異的成分，且該成分不是由其複合的細胞產生的，並且與生物標誌物中的不同結合位點(binding site)(例如不同的表位(epitope))或與不同的生物標誌物特異性地交互作用(例如第一類型與第一表位或者第一生物標誌物特異性地交互作用(或結合)並且第二類型與第二表位或第二生物標誌物特異性地交互作用(或結合)。在一些實施例中，細胞複合到多於2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或者更多的不同靶向單元。在一些實施例中，在同一細胞表面上一個靶向單元與另一個靶向單元的比例為1比X，其中X為大約或大於約1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100或者更多(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，本揭露提供一種含有一成分的經共軛的活細胞，該成分不是由細胞通過轉錄和轉譯過程產生的，而是通過外源性的方式與細胞相關聯的(參見美國專利第10,744,207號)。
方法：
在使成分與第一多核苷酸反應以產生靶向單元的步驟，以及使活細胞與第二多核苷酸反應以產生共軛細胞的步驟中，有種類繁多的可用技術。例如第一多核苷酸可以使用雙功能性的交聯劑被共軛到成分。雙功能性的交聯劑可以包含兩個不同的反應性基團，其能夠與兩個不同的功能性標靶偶合，例如胜肽、蛋白質、大分子、半導體納米晶體或者受質。該兩個反應性基團可以是相同或不同的，並且包括但不限於諸如巰基、羧酸酯、羰基、胺、羥基、醛、酮、活性氫、酯、巰基或者光反應性部分的反應性基團。在一些實施例中，交聯劑可以在官能端上具有一個胺反應性基團(amine-reactive group)和一個巰基反應性基團(thiol-reactive group)。在其他實施例中，雙功能性的交聯劑可以是NHS-PEO-順丁烯二醯亞胺，其包含N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯和順丁烯二醯亞胺基團，其允許含胺和含巰基的分子共價結合(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，對比於距標靶細胞更遠的液體中所發現的標誌物濃度，例如細胞分泌或以其他方式釋放生物標誌物(也稱為細胞外標誌物)的地方，標靶細胞周圍的液體或它所在的組織中有更高濃度的(increased concentration)標誌物，生物標誌物藉此方式與標靶細胞相關聯。在一些實施例中，細胞外標誌物是細胞分泌或以其他方式釋放的標記物用來反應細胞或者組織損傷。例如，CK-MB和肌鈣蛋白I在胸痛發作後4至8小時釋放，並且在發生不可逆損傷(即，壞死)後釋放。Nourin-1是心臟組織反應心肌缺血(myocardial ischemia)在5分鐘內釋放的炎症多肽(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，施用複合物(細胞毒性細胞包含複合到細 胞毒性細胞表面的靶向單元群體)是治療的一部分。該療法可以用於神經性疾病、病症或者缺乏(deficit)。該療法可以改善功能和/或認知恢復。治療可以用於中風、周邊動脈疾病、神經系病、或者任何其他需要組織再生、血管重建或者局部抗發炎作用的疾病或者病症，包括但不限於神經性病症、疾病或者缺乏，例如帕金森氏病，阿茲海默症、中風或者肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；溶體儲積症；心血管病症例如心肌梗塞、充血性心衰竭、周邊動脈疾病、糖尿病性潰瘍、傷口癒合；肺部疾病包括自發性肺部纖維化、呼吸窘迫症候群、慢性阻塞性肺病、自發性肺部高血壓、囊腫纖維化和哮喘；代謝或炎症性病症例如糖尿病(一型或二型)、風濕性關節炎、骨性關節炎、狼瘡(lupus)、克隆氏症(crohn's disease)、發炎性腸道疾病或者移植物抗宿主疾病(graft versus host disease)；導致失明的視網膜疾病例如年齡相關的黃斑點退化、斯特格氏病(Stargardt disease)、糖尿病視網膜病變、色素性視網膜炎；以及脫髓鞘病例如多發性硬化症、腦性麻痺、腦橋中央髓鞘溶解症、運動失調(癆瘵性)、橫貫性脊髓炎、Devic病(Devic’s disease)、進行性多部腦白質病、視神經炎、腦白質失養症(leukodystrophies)、格林-巴利症候群(Guillain-Barre syndrome)、抗MAG周邊神經病變以及夏柯-馬利-杜斯氏病(Charcot-Marie-tooth disease)(參見美國專利第10,744,207號)。
施予個體的複合物可以是任何合適的形式例如醫藥組合物的組成部分，醫藥組合物可以另外包含一種或者更多的醫藥學上可接受的載體和可選擇地的一種或多種另外的治療劑(例如混合組合物中)。醫藥學上可接受的載體包括但不限於與醫藥學上給藥相容的溶劑、分散介質、包 衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑以及相似者。參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences(2005)。適合用於注射給藥的製劑，例如包括水性無菌注射溶液(aqueous sterile injection solutions)，其可以包含抗氧化劑、緩衝溶液、抑菌劑、以及使製劑與預定接受者的血液等滲(isotonic with the blood)的溶質；及水性和非水性無菌懸浮液，其可能包含助懸劑和增稠劑。補充的活性化合物(Supplementary active compounds)也可以摻入組合物中。醫藥組合物通常被配製為與其預定的施藥途徑相容的。施藥途徑的實例包括注射例如靜脈內、皮內、皮下、口服(例如吸入)、經皮的(外用的)、經黏膜和直腸給藥。用於注射、皮內或者皮下施用的溶液或者懸浮液可以包含以下的一種或更多種組成(components)：無菌稀釋劑例如注射用水、生理鹽水溶液、固定油(fixed oils)、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成的溶劑；抗菌劑例如苯甲醇或者對羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑抗壞血酸或硫酸氫鈉；螯合劑例如乙二胺四乙酸；緩衝溶液例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽，以及用於調節滲壓性的試劑例如氯化鈉或葡萄糖。pH值可以用酸或鹼調整例如鹽酸或者氫氧化鈉。注射製劑可以封裝在由玻璃或塑料製成的安瓿(ampoules)、可拋棄式注射器或者多劑量的小瓶中(參見美國專利第10,744,207號)。
在一些實施例中，協同性地有效治療量(synergistically effective therapeutic amount)的複合物產生比複合物成員單獨使用時的累加效果更大的效果(參見美國專利第10,744,207號)。
實施例
以下是利用本發明的實施例和本發明的技術和特徵的詳細 說明，然而，這些實施例並非用以限定本發明，任何熟悉本技術的人在不脫離本發明的精神和範圍的前提下所做的任何更動和潤飾都應包含於本發明的範圍內。
實施例1：成分複合的細胞毒性細胞(ingredient-complexed cytotoxic cells)在殺傷成分反應性(ingredient-responsive)或抗成分(ingredient-resistant)的癌細胞的細胞毒殺功能(Cytotoxic function)
下面描述製備成分複合的自然殺手細胞和成分複合的γδT細胞的具體實施方式，以及其用途，但本發明的應用不限於此，這意味著任何成分與任何細胞毒性細胞共軛都旨在包括在本發明的範圍內。
實施例1-1：成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞在殺傷成分反應性(ingredient-responsive)或者抗成分(ingredient-resistant)的癌細胞的細胞毒殺功能
實施例1-1-1 培養人類CD16 + 自然殺手細胞
本實施例中使用存放在NPMD具有寄存編號NITE BP-03017的人類CD16+自然殺手細胞系(稱為『oNK細胞』)。將存放在NPMD具有寄存編號NITE BP-03017的人類CD16+自然殺手細胞以100~1000xg的速度離心3~5分鐘。去除上清液。用1mL細胞培養基重新懸浮細胞後，把細胞懸浮液放置於第一容器(first container)中，使第一容器含有6.54×105個人類CD16+自然殺手細胞在40mL的細胞培養基中；其中，細胞培養基包含：(1)0.5%-30%(體積百分比，vol%，v/v)的人類血小板裂解物(Human platelet lysate)； (2)100-3000IU/mL的介白素2(IL-2)；以及(3)培養基選自由DMEM培養基(Dulbecco's Modified Eagle培養基)、Eagle's最低必需培養基的α修飾(alpha modification of Eagle's minimum essentialmedium)和XVIVO 10培養基，或其任何組合；並且其中，第一容器為例如T-75培養瓶、T-150培養瓶、T-225培養瓶或者G-Rex培養裝置；其中，G-Rex培養裝置係在底部配置有透氣並且不透水的薄膜來充分通氣培養的培養容器。
至少7天的培養後，獲得包含經培養的oNK細胞的細胞懸浮液(稱為『經培養的oNK細胞懸浮液』)。
實施例1-1-2 經培養的細胞的細胞狀態和細胞表面標誌物的檢測
本實施例有兩組實驗試驗。利用實施例1-1-1的培養方法分別培養第一批具有寄存編號NITE BP-03017的人類CD16+自然殺手細胞和第二批其有寄存編號NITE BP-03017的人類CD16+自然殺手細胞，以獲得第一組實驗試驗的經培養的oNK細胞懸浮液和第二組實驗試驗的經培養的oNK細胞懸浮液。第一批人類CD16+自然殺手細胞總共培養35天，而第二批人類CD16+自然殺手細胞則培養很長一段時間直到至少202天。
將各個細胞懸浮液樣品離心，該細胞懸浮液樣品在本實施例(實施例1-1-2)中的不同時間點獲得；去除上清液，將細胞重新懸浮於緩衝溶液中，然後與1μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)；3μL的CD56螢光標記抗體(商品號318304，Biolegend，美國)、CD3螢光標記抗體(商品號300410，Biolegend，美國)和CD2螢光標記抗體(商品號300222， Biolegend，美國)混合物；或者1μL的CD16螢光標記抗體(商品號302016，Biolegend，美國)混和。使用細胞分選儀(cell sorter)或者流式細胞儀檢測(1)細胞是否被碘化丙啶染色；(2)細胞是否表現出CD56分子、CD3分子和/或CD2分子；以及(3)細胞是否表現出CD16受體。
請參考表1和表2。表1顯示了從第一組實驗試驗獲得的經培養的oNK細胞懸浮液的結果，表2顯示了第二組實驗試驗獲得的經培養的oNK細胞懸浮液的結果。
表1中，第一欄『天』表示培養天數；第二欄『PI+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的總細胞數為100%時，正在經歷凋亡或已經死亡的細胞的百分比；因為自然殺手細胞、CD4+T細胞和CD8+T細胞全都會表達CD56+(Pernick,N，2018)，所以第三欄『CD56+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的細胞總數為100%時，自然殺手細胞、CD4+T細胞以及CD8+T細胞總數的百分比；因為T細胞均表達CD3+(Pernick,N，2018)，所以第四欄『CD3-』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的細胞總數為100%，非T細胞的細胞的百分比；因為自然殺手細胞、外周血T細胞和大多數胸腺細胞都表達CD2+(Pernick,N，2018)並且本實驗中待檢測的細胞源自外周血，所以第五欄『CD2+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中細胞總數為100%時，自然殺手細胞和T細胞總數的百分比；第六欄『CD56+CD3-』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的細胞總數為100%時，自然殺手細胞的百分比；第七欄『CD56+CD2+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的細胞總數為100%時，自然殺手細胞和T細胞總數的百分比；由於自然殺手細胞和巨噬細胞表現出CD16+(Pernick,N，2018)，並且CD16參與抗體依賴性細胞毒殺作用 (ADCC)，第八欄『CD16+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中細胞總數為100%，具有ADCC功能的自然殺手細胞和巨噬細胞總數的百分比；第九欄『CD56+CD16+』表示以經培養的oNK細胞懸浮液中的自然殺手細胞(即CD56+CD3-細胞)總數為100%時，具有ADCC功能的自然殺手細胞的百分比。
表2中第一至第八欄的標示與表1相同；當第九欄『殺傷測試』標有『
Figure 111147737-A0305-02-0070-11
』符號時，表示在某個時間點該經培養的oNK細胞懸浮液中細胞的細胞毒性功能被同時測試並且確認該細胞具有細胞毒性功能。
Figure 111147737-A0305-02-0070-3
Figure 111147737-A0305-02-0070-4
Figure 111147737-A0305-02-0071-5
實施例1-1-3 經培養的細胞的活化標誌物、抑制標誌物以及其他NK細胞標誌物的檢測。
本實施例使用通過揭露於實施例1-1-1中的培養方法培養93天獲得的細胞懸浮液(稱為經93天培養的oNK細胞懸浮液)。將經93天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞平均分成19組。將第一組細胞離心；去除上清液，並將細胞重新懸浮於緩衝溶液中，然後與1μL的CD56螢光標記抗體(商品號318304，Biolegend，美國)、1μL的CD3螢光標記抗體(商品號300410，Biolegend，美國)以及1μL的CD2螢光標記抗體(商品號300222，Biolegend，美國)混和，以同時標記表達CD56分子、CD3分子和/或CD2分子的細胞。最後，細胞分選儀或流式細胞儀被用來分析細胞是否表現CD56分子、CD3分子和/或CD2分子，並計算具有各種細胞表面標誌物的細胞的百分比。
將其餘18組中的細胞離心；去除上清液，並將細胞重新懸浮於緩衝溶液中，然後分別與1μL的CD16螢光標記抗體(商品號302016，Biolegend，美國)、CD45螢光標記抗體(商品號368512，Biolegend，美國)、CD4螢光標記抗體(商品號300514，Biolegend，美國)、CD8螢光標記抗體(商品號344706，Biolegend，美國)、CD19螢光標記抗體(商品號302210，Biolegend，美國)、CD25螢光標記抗體(商品號302614，Biolegend，美國)、NKp30螢光標記抗體(商品號325214，Biolegend，美國)、NKG2D螢光標記抗體(商品號320812，Biolegend，美國)、NKp44螢光標記抗體(商品號325116，Biolegend，美國)、NKp46螢光標記抗體(商品號331916，Biolegend，美國)、CD27螢光標記抗體(商品號47-0279-42，Invitrogen，美國)、OX40螢光標記抗體(商品號350004，Biolegend，美國)、CD107a螢光標記抗體(商品號328630，Biolegend，美國)、NKG2A螢光標記抗體(商品號FAB1059P，R&D Systems，美國)、程式性細胞死亡-1螢光標記抗體(商品號367406，Biolegend，美國)、TIGIT螢光標記抗體(商品號372704，Biolegend，美國)、SIRPα螢光標記抗體(商品號372104，Biolegend，美國)以及CD158螢光標記抗體(商品號FAB1848P，R&D Systems，美國)混和。
最後，細胞分選儀被用以分析細胞是否表現CD16受體、CD45標誌物、CD4標誌物、CD8標誌物、CD19標誌物、CD25標誌物、NKp30標誌物、NKG2D標誌物、NKp44標誌物、NKp46標誌物、CD27標誌物、OX40標誌物、CD107a標誌物、NKG2A標誌物、程式性細胞死亡-1標誌物、TIGIT標誌物、SIRPα標誌物以及CD158標誌物。
在這些標誌物中，CD16、CD25、NKp30、NKG2D、NKp44、 NKp46以及CD107a是活化標誌物(activation markers)，而NKG2A、程式性細胞死亡-1、TIGIT、SIRPα、CD27、OX40以及CD158是抑制標誌物(inhibitory markers)。根據本領域技術人員的知識，活化標誌物的表達增強NK細胞的抗腫瘤活性，而抑制標誌物的表達則強化NK細胞功能的抑制。
請參見表3，表3顯示從實施例1-1-1獲得的細胞懸浮液中細胞的活化標誌物、抑制標誌物以及其他NK細胞標誌物的測試結果。
表3顯示經純化的CD16+群表達CD56(98.0±0.2%)、CD2(99.5±0.2%)、CD45(99.7±0.1%)、CD4(0.8±0.3%)、CD3(0.0±0.0%)、CD8(0.0±0.0%)、CD19(0.0±0.0%)、CD16(85.7±7.0%)、CD25(42.3±13.1%)、NKp30(93.6±4.3%)、NKG2D(46.1±17.4%)、NKp44(75.1±13.3%)、NKp46(46.4±16.9%)、CD27(0.62±0.08%)、OX40(0.11±0.03%)、CD107a(96.1±4.3%)、NKG2A(0.14±0.15%)、程式性細胞死亡-1(27.0±19.4%)、TIGIT(4.3±6.5%)、SIRPα(3.2±3.0%)以及CD158(0.4±0.3%)。分析後可知，上述經純化的CD16+細胞群中，表達CD16受體的細胞均具有CD3-CD56+的特徵。較佳地，上述經純化的CD16+細胞群中表達CD16受體的細胞為CD2、CD45、CD4陽性，並且CD8和CD19陰性。CD4陽性是一個意想不到的結果。
Figure 111147737-A0305-02-0073-6
Figure 111147737-A0305-02-0074-7
實施例1-1-4 製備曲妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞和西妥昔單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞
經培養的oNK細胞懸浮液被用來製備成分複合的人類CD16+自然殺手細胞，該經培養的oNK細胞懸浮液(本發明的經16天培養的oNK細胞懸浮液，稱為經16天培養的oNK細胞懸浮液)是利用揭露於實施例1-1-1的培養方法培養16天而獲得。在使用互補性的細胞鏈接器(cell linker)和成分鏈接器(ingredient linker)將成分例如曲妥珠單抗或者西妥昔單抗結合到經16天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞後，獲得曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液或者西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液。
將成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗、阿崙單抗、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)、妥珠單抗(elotuzumab)、鈷妥珠單抗(codrituzumab))結合至細胞(例如本實驗中經培養的oNK細胞懸浮液中的所有細胞、寄存於NPMD具有寄存編號NITE BP-03017的人類CD16+自然殺手細胞、其他自然殺手細胞、γδT細胞、其他T淋巴球、巨噬細胞或者其他細胞毒性細胞)的程序如下：(A)製備細胞鏈接器並且把細胞鏈接器結合(binding)到細胞以製備細胞-單鏈DNA共軛物(cell-ssDNA conjugate)的步驟；(B)製備成分鏈接器並且把成分鏈接器結合(binding)到成分以製備成分-單鏈DNA共軛物(ingredient-ssDNA conjugate)的 步驟；(C)混合細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA共軛物，以通過細胞鏈接器及其在成分鏈接器上的互補性序列結合(combine)細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA共軛物，進而製備成分複合的細胞，例如成分複合的人類CD16+自然殺手細胞或者成分複合的人類γδT細胞。
其中步驟(A)的製備細胞鏈接器並且把細胞鏈接器結合(binding)到細胞包括以下步驟(a1)~(a4)：
步驟(a1)取得第一單鏈DNA，其中第一單鏈DNA的序列為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：7。
步驟(a2)第一單鏈DNA的5'端被修飾為5'端經巰基修飾的第一單鏈DNA(5’ end thiol-modified first single strand DNA)，以獲得細胞鏈接器原液(cell linker stock)。細胞鏈接器原液也可商業性地購自Integrated DNA Technologies。實際的修飾方法對本領域的技術人員來說是已知的或者顯而易見的(Zimmermann,J，2010)。
步驟(a3)將10~500μL的細胞鏈接器原液和0.1~10μL的NHS-順丁烯二醯亞胺(NHS-Maleimide)(可商業性地購自Fisher Scientific)混合並且反應(incubated)1~60分鐘。
步驟(a4)將自步驟(a3)獲得的混合物與1×106~1×108個細胞(例如經培養的oNK懸浮液中包括經培養的oNK細胞的所有細胞)混合並反應(incubated)1~60分鐘，以獲得細胞-單鏈DNA共軛物。
步驟(B)的製備成分鏈接器並且把成分鏈接器結合(binding)到成分包括以下步驟(b1)~(b4)：
步驟(b1)取得第二單鏈DNA，其中第二單鏈DNA的序列 為SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或者SEQ ID NO：8，並且第二單鏈DNA的序列是與第一單鏈DNA互補性的鏈。
步驟(b2)第二單鏈DNA的5'端被修飾為5'端經巰基修飾的第二單鏈DNA(5’ end thiol-modified second single strand DNA)，以獲得成分鏈接器原液。成分鏈接器原液也可商業性地購自Integrated DNA Technologies。實際的修飾方法對本領域的技術人員來說是已知的或者顯而易見的(Zimmermann,J，2010)。
步驟(b3)將10~500μL的成分鏈接器原液和0.1~10μL的NHS-順丁烯二醯亞胺(可商業性地購自Fisher Scientific)混合並反應(incubated)1~60分鐘。
步驟(b4)將自步驟(b3)獲得的混合物與成分(例如10~100μL的成分原液，其可商業性地購自Roche)混合並反應(incubated)10分鐘至3小時以獲得成分-單鏈DNA共軛物。
將細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA共軛物混合，以獲得成分複合的細胞，例如曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞或者西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞。
實施例1-1-5曲妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞在殺傷曲妥珠單抗反應性(trastuzumab-responsive)或抗曲妥珠單抗的(trastuzumab-resistant)人類乳癌細胞的細胞毒殺功能
xCELLigence即時細胞分析系統(xCELLigenceReal Time Cell Analysis System，xCELLigence RTCA system，ACEA Biosciences Inc.，美國)在本實施例中被用來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒殺能力 (cytotoxic ability)。本實施例包括用來進行細胞毒殺測試的96孔xCELLigence E-盤(96 well xCELLigence E-Plate)，並且xCELLigence E-盤中的孔被分成對照孔、ACE1702 ET2實驗孔、ACE1702 ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔(target cell maximum lysis control well)。
在本實施例中使用的效應細胞是經37天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞和曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞，其中曲妥珠單抗是針對HER2蛋白的抗體，具有產品名稱Herceptin(購自Roche，瑞士)。標靶細胞是人類乳癌細胞系BT474(HTB-20，購自ATCC)或者BT474的衍生抗曲妥珠單抗株BT474克隆5(BT474’s derived trastuzumab-resistant clone，BT474 Clone 5；CRL-3247，購自ATCC)。將標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5)接種在對照孔、ACE1702 ET2實驗孔、ACE1702 ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔中，使每個孔含有20000個標靶細胞，然後將細胞靜置30分鐘。
將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液(ACE1702)樣品添加到ACE1702 ET2實驗孔和ACE1702 ET5實驗孔，並使效應細胞數與標靶細胞數(BT474或者BT474 Clone 5)的比值分別為2和5。將經37天培養的oNK細胞懸浮液(Ctrl-oNK)樣品添加到Ctrl-oNK ET2實驗孔和Ctrl-oNK ET5實驗孔，使效應細胞數與標靶細胞數(BT474或者BT474 Clone 5)的比值也分別為2和5。添加與樣品十分之一等體積的裂解緩衝溶液到標靶細胞最大化裂解對照孔；未添加任何樣品或裂解緩衝溶液 至對照孔。將xCELLigence E-盤置入xCELLigence即時細胞分析系統中以檢測在37℃和5%二氧化碳的條件下細胞指數(cell index，CI)的即時變化(real time change)。
其中，附著(attached to)在xCELLigence E-盤底部的標靶細胞數越多，xCELLigence即時細胞分析系統檢測到的細胞指數(cell index)越高。因此，細胞指數(cell index)可以被用來轉換實驗孔中裂解的標靶細胞的百分比。將細胞指數(cell index)轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞的百分比的公式為：裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(實驗孔的細胞指數-標靶細胞最大化裂解對照孔的細胞指數)÷(對照孔的細胞指數-標靶細胞最大化裂解對照孔的細胞指數)〕×100%
請參考圖1A和1B。圖1A是呈現曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(trastuzumab-complexed human CD16+ natural killer cells)和無複合的人類CD16+自然殺手細胞(non-complexed human CD16+natural killer cells)之間在殺傷曲妥珠單抗反應性的癌細胞(trastuzumab-responsive cancer cells，曲妥珠單抗反應性的人類乳癌細胞系BT474)的細胞毒殺功能比較的長條圖。圖1B是呈現曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞和無複合的人類CD16+自然殺手細胞之間在殺傷抗曲妥珠單抗的癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells，抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474 Clone 5)的細胞毒殺功能比較的長條圖。如圖1A和1B所示，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)殺傷曲妥珠單抗反應性的人類乳癌細胞系BT474和抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474 Clone 5的能力 相似。出乎意料的是，曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE1702，其為與曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞)對曲妥珠單抗反應性的人類乳腺癌細胞系BT474和抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474 Clone 5的殺傷能力也相似。
請進一步參考圖2。圖2是呈現曲妥珠單抗、人類CD16+自然殺手細胞、與曲妥珠單抗共同培養的人類CD16+自然殺手細胞、以及曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞對於抗曲妥珠單抗的癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells)的細胞毒殺效力的長條圖。如圖2所示，高劑量的曲妥珠單抗(4μg)只能殺死小量抗曲妥珠單抗的癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells)，而且，與1.93ng曲妥珠單抗共同培養的人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK+1.93ng曲妥珠單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的效果。出乎意料的是，與1.93ng曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE-oNK-HER2，其為與1.93ng曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞)的殺傷效果顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的殺傷效果，並且導致大約2倍的細胞毒殺增加量。這是一個出乎意料的結果，並且代表曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞中的曲妥珠單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)在殺死抗曲妥珠單抗的癌細胞(trastuzumab-resistant cancer cells)上表現出協同效應(synergy)。
因此，成分複合的細胞毒性細胞例如通過複合曲妥珠單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)獲得的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE1702)可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏 感、無反應性或反應性不足的異常細胞；因此成分複合的細胞毒性細胞例如曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE1702)能夠解決沒有藥可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的曲妥珠單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-1-6西妥昔單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞在殺傷西妥昔單抗反應性或抗西妥昔單抗的人類結腸癌細胞的細胞毒殺功能(Cytotoxic function)
本實施例的實驗方法與實施例1-1-5的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0080-12
經16天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0080-15
西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞，其中西妥昔單抗是針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的抗體，具有商品名Erbitux(購自Merck，Bristol-Myers-Squibb)；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0080-16
對西妥昔單抗沒有抗性的人類肺腺癌細胞系HCC827-luc(human lung adenocarcinoma cell line HCC827-luc)(JCRB1516，購自JCRB)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0080-18
抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29(human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29)(HTB-38，購自ATCC)。
本發明的發明人預期： (1)人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)在殺傷西妥昔單抗反應性的人類肺腺癌細胞系HCC827-luc(cetuximab-responsive human lung adenocarcinoma cell line HCC827-luc)和抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29(cetuximab-resistant human colorectal adenocarcinoma cell line HT-29)的能力相似。出乎意料的是，西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞對西妥昔單抗反應性的人類肺腺癌細胞系HCC827-luc和抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29的殺傷能力也相似；(2)西妥昔單抗只能夠殺死小量抗西妥昔單抗的癌細胞，並且與西妥昔單抗共同培養的人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK+西妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的效果。出乎意料的是，與西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞的殺傷效果顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且這表明在西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞中，西妥昔單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)在殺死抗西妥昔單抗的癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合西妥昔單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)獲得的西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應 性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的西妥昔單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-1-7西妥昔單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞殺傷西妥昔單抗反應性或者抗西妥昔單抗的人類舌癌細胞的細胞毒殺功能
本實施例的實驗方法與實施例1-1-5的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞是
Figure 111147737-A0305-02-0082-20
經56天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0082-21
西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0082-23
對西妥昔單抗沒有抗性的人類舌部鱗狀癌細胞系HSC-4(human tongue squamous carcinoma cell line HSC-4)(JCRB0264，購自JCRB)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0082-24
抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀癌細胞系SAS(JCRB0260，購自JCRB)。
本發明的發明人預期：(1)人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)殺傷西妥昔單抗反應性的人類舌部鱗狀癌細胞系HSC-4(cetuximab-responsive human tongue squamous carcinoma cell line HSC-4)和抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀癌細胞系SAS的能力相似。出乎意料的是，西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞對西妥昔 單抗反應性的人類舌部鱗狀癌細胞系HSC-4和抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀癌細胞系SAS的殺傷能力也相似；(2)西妥昔單抗只能夠殺死小量抗西妥昔單抗的癌細胞，並且與西妥昔單抗共同培養的人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK+西妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的效果。出乎意料的是，與西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞的殺傷效果顯著高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且表明在西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞中，西妥昔單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)在殺傷抗西妥昔單抗的癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合西妥昔單抗和人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)獲得的西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，以解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的西妥昔單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2：成分複合的人類γδT細胞殺在傷成分反應性或抗成分的癌細胞的細胞毒殺功能
實施例1-2-1培養人類γδT細胞
從自體或者同種異體個體獲得外周血單核細胞(PBMC)，其中該自體或同種異體的個體是健康的個體或者癌症患者。較佳地，外周血單核細胞從健康捐贈者獲得。
將5管外周血單核細胞(管子編號：#1217-01、#1217-02、#1217L-01、1217L-02以及#1231，獲得自不同捐贈者)分別放置於37℃水浴中以解凍細胞。
在最少量的製備中，將每管中的1mL解凍後的外周血單核細胞(PBMC)分別與9mL完全生長培養基混合，以懸浮細胞；其中完全生長培養基是以RPMI-1640為基底(可商業性地購自Gibco、Sigma Aldrich、Biological Industries、STEMCELL Technologies等)並且添加1%(v/v)~30%(v/v)人類血小板裂解物(可商業性地購自StemCell Technologies、Sigma Aldrich、Millipore等)和100~2500IU/mL(0.0612~1.53μg/mL)人類介白素2(IL-2)。將細胞懸浮液於室溫中以400xg離心3-5分鐘，然後以5mL新鮮的完全生長培養基替換上清液。將含有5×106~200×106個細胞的細胞懸浮液轉移到培養容器(例如T-75培養瓶、T-150培養瓶、T-225培養瓶、G-Rex培養裝置等)中，並把培養基體積加滿至培養容器的最大容量。G-Rex培養裝置是底部配置可透氣且不可透水的薄膜以充分通氣培養的培養容器。培養基中添加1%~30%人類血小板裂解物，並在第0天摻入0.1~20μM的唑來磷酸(Zoledronate)和200-3000IU/mL的人類IL-2。在第2天和第4天，細胞培養中被補充100~2500IU/mL的人類IL-2。在第7天，以添加1%~30%人類血小板裂解物且含有100~2500IU/mL人類IL-2的新鮮完全生長培養基更換細胞培養(cell culture)。在第9天和第11天，在細胞培養中補充100~2500IU/mL 的人類IL-2。在第10天和第14天，收集每批經培養的細胞中的含有γδT細胞的細胞懸浮液(cell suspensions comprising gamma delta T cells；稱為『γδT細胞懸浮液』)。
以含有100-2500IU/mL的IL-2和1%-30%人類血小板裂解物的新鮮完全生長培養基更換細胞培養(cell culture)，以進行後續擴增。類似的擴增程序可以被實施於新鮮分離的外周血單核細胞的較大量培養。
實施例1-2-2經培養的細胞的細胞狀態和細胞表面標誌物的檢測
將從實施例1-2-1獲得的細胞於室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，再以1mL的磷酸鹽緩衝食鹽水(DPBS)重新懸浮並洗滌細胞沉澱物。然後將細胞懸浮液再離心一次，並且去除上清液。以Dulbecco’s磷酸鹽緩衝食鹽水(DPBS)重新懸浮細胞沉澱物，並將0.1mL的細胞懸浮液(5×105個細胞)分裝至1.5mL微量離心管(eppendorf)中。將一微升螢光染料FITC共軛的抗TCRVδ2(BioLegend，#331406)和PE-Cy5共軛的抗CD3(BioLegend，#300410)抗體與一等分的細胞懸浮液(one aliquoted cell suspension)混合。將被抗TCRδ2和抗CD3抗體染色後的細胞(The anti-TCRδ2 and anti-CD3 antibodies-stained cells)分別以PE共軛的小鼠抗人類CD56(BioLegend，#304606)、小鼠抗人類CD16(BioLegend，#331406)、小鼠抗人類NKG2D(BioLegend，#320812)、小鼠抗人類NKp44(BioLegend，#325116)、小鼠抗人類NKp46(BioLegend，#331916)、APC-Cy7共軛的抗CD107a(BioLegend，#328630)以及PE共軛的抗CD69(BioLegend，#310906)抗體在室溫避光條件下分別地染色10分鐘。另一等分的細胞懸浮液用Alexa Fluor®488共軛的TCRαβ(BioLegend，#306712)和PE-Cy5共軛的CD3抗體在室溫避光染色10分鐘。然後，將細胞混合物於室溫中以400xg離心3分鐘。去除上清液，再以1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mLDPBS重新懸浮的活的TCRVδ2+/CD3+圈選細胞(DPBS-resuspended viable TCRVδ2+/CD3+gated cells)的CD56+、CD16+、NKG2D+、NKp44+、NKp46+、CD107a+以及CD69+群體的百分比和/或平均螢光強度。
請參考圖3A~3B和圖4A~4B。圖3A~3B是在第10天收集到的γδT細胞的直方圖。圖4A~4B是在第14天收集到的γδT細胞的直方圖。
為了將圖3A、3B、4A和4B中PE共軛的小鼠抗人類CD56抗體(BioLegend，#304606)和PE-Cy7共軛的小鼠抗人類CD16抗體(BioLegend，#331406)、小鼠抗人類NKG2D抗體(BioLegend，#320812)、小鼠抗人類NKp44抗體(BioLegend，#325116)、和小鼠抗人類NKp46抗體(BioLegend，#331916)的平均螢光強度轉換為細胞表面上每種受體(CD56、CD16、NKG2D、NKp44和NKp46)的平均數目，因而建立源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒(Bangs Laboratories,Inc.#815)的標準曲線。QuantumTM Simply Cellular®試劑盒中有5瓶微球(4個群體『#1、#2、#3和#4』是包裹(coated)遞增數量的抗小鼠IgG Fc抗體，1個為未包裹的空白樣品)。將十微升抗小鼠IgG Fc抗體結合微球，包括#1、#2、#3和#4，微球分別與5μg/mL的一種相應抗體(PE共軛的小鼠抗人類CD56，和PE-Cy7共軛的小鼠抗人類CD16、小鼠抗人類NKG2D、小鼠抗人類NKp44，或者小鼠抗人類NKp46抗體)於總共0.1mL的反應體積中、室溫條件下反應10分鐘。 空白微球則在沒有相應抗體的情況下反應。用0.5mLDPBS洗滌微球，然後於室溫中以400xg條件下將懸浮液離心5分鐘。去除上清液並以流式細胞儀分析懸浮後的QSC微球。將採集到的每個微球的平均螢光強度值插入製造商提供的計算表(QuickCal V2.3)的相應欄位，以依照製造商的指示生成相應的標準曲線。建立標準曲線後(請參考圖5A~5E)，將PE共軛的小鼠抗人類CD56和PE-Cy7共軛的小鼠抗人類CD16、小鼠抗人類NKG2D、小鼠抗人類NKp44、或者小鼠抗人類NKp46抗體染色的γδT細胞的平均螢光強度值插入QuickCal表以轉換成在細胞表面上每種受體的相應數量(請參閱表4)。
從表4到表6，五批γδT細胞(即#1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02和#1231)被投入NK樣標誌物譜(NK-like marker profile)分析。表4中，五批PBMC衍生的γδT細胞是以前文提到的擴增程序進行擴增。在第10天，γδT細胞(CD3+TCRVδ2+)的百分比佔總T淋巴球(CD3+)的50.28%和89.50%之間。在第14天，γδT細胞的百分比佔總T淋巴球的32.84%~91.00%之間。兩天的T細胞的百分比都佔總細胞的93.00%~98.35%之間。關於類自然殺手細胞(NK)的γδT細胞(natural killer cell(NK)-like γδT cells)的細胞毒殺功能，病原體識別受體CD56(pathogen recognition receptor CD56)、抗體依賴性細胞毒性受體CD16+(antibody-dependent cellular cytotoxicity receptor CD16+)、人類自然細胞毒性受體NKG2D+、NKp44+和NKp46+、去顆粒標誌物CD107+(degranulation marker CD107+)和早期活化標誌物CD69+的表達被進行分析。在第10天，五批γδT細胞中的CD56+、CD16+、NKG2D+、NKp44+ 和NKp46+群體的百分比分別介於28.25%~44.77%、28.43%~71.05%、97.79%~99.25%、17.22%~21.20%和17.00%~22.18%之間。這些批次的細胞的表面受體的平均數量分別為45297~59450、8486~55095、30722~54176、8790~10943和7448~9171。CD107a+群體的百分比居於1.40%~7.05%之間，而#1231中CD69+群體的百分比為35.63%。在第14天，五批次的γδT細胞中的CD56+、CD16+、NKG2D+、NKp44+和NKp46+群體的百分比分別介於28.82%~56.49%、30.67%~72.99%、96.19%~97.38%、14.22%~25.49%和12.60%~24.95%之間。這些批次的細胞的表面受體的平均數量分別為32871~55575、11503~54094、28527~36013、9134~10306和7108~9392。CD107a+群體的百分比居於0.76%~3.61%之間，而#1231中CD69+群體的百分比為24.82%。
在表5中，#1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02和#1231批次的PBMC衍生的γδT細胞在第10天和第14天分別展示了在總T淋巴球中不超過5.21%和7.23%的CD56+CD3-(NK)群體。在第10天和第14天，這五批細胞在總T淋巴球中呈現的CD3+Vαβ+群體的百分比分別介於4.18%至40.07%和4.43%~54.84%。
在γδT群體的子群(subsets)中，有初始(naïve)(CD45RA+CD27+)、中央記憶型(CD45RA-CD27+)、效應記憶型(CD45RA-CD27-)和終端分化(CD45RA+CD27-)群體。在表6中，#1217-01、#1217-02、#1217L-01、#1217L-02和#1231批次的PBMC衍生的γδT細胞在第10天包含8.72%~36.91%的初始群體、7.45%~23.87%的中央記憶型群體、10.93%~38.64%的效應記憶型群體和19.15%~52.02%的終端分化群 體。在第14天，#1231γδT細胞的初始、中央記憶型、效應記憶型和終端分化群體的百分比分別為40.76%、17.81%、9.79%和31.63%。
NK細胞毒性受體(CD56、CD16、NKG2D、NKp44和NKp46)和去顆粒標誌物(CD107a)的表達使γδT細胞的NK樣抗腫瘤活性(NK-like anti-tumor activity)增強，效應記憶和終端分化群體的增加則有助於γδT細胞定位於腫瘤的炎症微環境(inflammatory microenvironment)。CD69的表達(CD69 expression)代表γδT細胞的活化。
其顯示本實驗中的γδT細胞表達更多細胞毒性受體(CD56、CD16、NKG2D、NKp44和NKp46)、更多去顆粒標誌物(CD107a)以及更多CD69。
Figure 111147737-A0305-02-0089-8
表5.CD56+CD3-和CD3+Vαβ+群體佔從實施例1-2-1獲得的總T淋巴球的百分比(以T淋巴球數為100%)
Figure 111147737-A0305-02-0090-9
Figure 111147737-A0305-02-0090-10
實施例1-2-3製備曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞、西妥昔單抗複合的人類γδT細胞、利妥昔單抗複合的人類γδT細胞以及阿維魯單抗複合的人類γδT細胞
以揭露於實施例1-2-1的培養方法培養14天獲得的γδT細胞懸浮液(本發明的14天γδT細胞懸浮液，稱為14天γδT細胞懸浮液)製備成分複合的人類γδT細胞。使用互補性的細胞鏈接器和成分鏈接器將諸如曲妥珠單抗或西妥昔單抗的成分結合(binding)到14天γδT細胞懸浮液中的細胞後，獲得曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液、西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液、利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液、或 阿維魯單抗複合的人類γδT細胞懸浮液。
將成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗、阿崙單抗、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)、妥珠單抗(elotuzumab)、鈷妥珠單抗(codrituzumab))結合(binding)到細胞(例如本實驗中γδT細胞懸浮液中的所有細胞)的過程與實施例1-1-4的過程相同。
將細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA共軛物混合後，獲得成分複合的細胞，例如曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞、西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞、利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞、或阿維魯單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞。
實施例1-2-4曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞殺傷曲妥珠單抗反應性或者抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞的細胞毒殺功能
本實施例的實驗方法與實施例1-1-5的實驗方式幾乎相同，除了本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0091-25
14天γδT細胞懸浮液中的細胞(Ctrl-gdT)或者
Figure 111147737-A0305-02-0091-27
曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞(ACE-gdT-HER2)。
請參考圖6A和6B。圖6A是呈現曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞和無複合的人類γδT細胞之間在殺死曲妥珠單抗反應性癌細胞(曲妥珠單抗反應性人類乳腺癌細胞系BT474)的細胞毒殺功能比較的長條圖。圖6B是呈現曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞和無複合的人類γδT細胞之間在殺死抗曲妥珠單抗的癌細胞(抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474 Clone 5)的細胞毒殺功能比較的長條圖。如圖6A和6B所示，人類γδT細 胞(Ctrl-gdT)殺傷曲妥珠單抗反應性的人類乳癌細胞系BT474和抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474 Clone 5的能力相似。出乎意料的是，曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(ACE-gdT-HER2，其為與曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞)對曲妥珠單抗反應性的人類乳腺癌細胞系BT474和抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞系BT474克隆5(BT474 Clone 5)的殺傷能力也相似。
根據圖6A和圖6B以及圖1A、圖1B和圖2的實驗結果，本發明的發明人預期：曲妥珠單抗只能夠殺死小量抗曲妥珠單抗的癌細胞，並且與曲妥珠單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+曲妥珠單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(ACE-gdT-HER2，其為與曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞)的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，且表示曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞中，曲妥珠單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺死抗曲妥珠單抗的癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合曲妥珠單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)獲得的曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞(ACE-gdT-HER2)，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的曲妥珠單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難 治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-5 西妥昔單抗複合的人類γδT細胞殺傷西妥昔單抗反應性或抗西妥昔單抗的人類癌症細胞的細胞毒性功能
本實施例的實驗方法與實施例1-1-6的實驗方法幾乎相同，除了本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0093-29
16天γδT細胞懸浮液中的細胞(Ctrl-gdT)或者
Figure 111147737-A0305-02-0093-30
西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞(ACE2016)。
請參考圖7A和7B。圖7A是呈現西妥昔單抗複合的人類γδT細胞和無複合的人類γδT細胞之間在殺傷西妥昔單抗反應性的癌細胞(西妥昔單抗反應性的人類腺癌細胞系HCC827(cetuximab-responsive human adenocarcinoma cell line HCC827))的細胞毒殺功能比較的長條圖。圖7B是呈現西妥昔單抗複合的人類γδT細胞和無複合的人類γδT細胞之間在殺傷抗西妥昔單抗的癌細胞(抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29)的細胞毒殺功能比較的長條圖。如圖7A和7B所示，人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷西妥昔單抗反應性的人類腺癌細胞系HCC827和抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29的能力相似。出乎意料的是，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞(ACE2016，其為與西妥昔單抗複合的人類γδT細胞)對西妥昔單抗反應性的人類腺癌細胞系HCC827和抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29的殺傷能力也相似。
根據圖7A和圖7B以及圖1A、圖1B和圖2的實驗結果，本發明的發明人預期：西妥昔單抗只能夠殺死小量抗西妥昔單抗的癌細胞，且與西妥昔 單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+西妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與西妥昔單抗複合的人類γδT細胞(ACE2016，其為與西妥昔單抗複合的人類γδT細胞)的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且這表明在西妥昔單抗複合的人類γδT細胞中，西妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺死抗西妥昔單抗的癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合西妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)而獲得的西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如西妥昔單抗複合的人類γδT細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的西妥昔單抗)具有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-6 西妥昔單抗複合的人類γδT細胞在殺傷西妥昔單抗反應性或抗西妥昔單抗的人類舌癌細胞的細胞毒殺功能
本實施例的實驗方法與實施例1-1-7的實驗方法幾乎相同，除了本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0094-31
16天γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0094-32
西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞。
本發明的發明人預期：(1)人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷西妥昔單抗反應性的人類舌 部鱗狀癌細胞系HSC-4(cetuximab-responsive human tongue squamous carcinoma cell line HSC-4)和抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀癌細胞系SAS的能力相似。出乎意料的是，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞對西妥昔單抗反應性的人類舌部鱗狀癌細胞系HSC-4和抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀癌細胞系SAS的殺傷能力也相似；(2)西妥昔單抗只能夠殺滅小量抗西妥昔單抗的癌細胞，並且與西妥昔單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+西妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與西妥昔單抗複合的人類γδT細胞的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且這表明在西妥昔單抗複合的人類γδT細胞中，西妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺傷抗西妥昔單抗癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合西妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)獲得的西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如西妥昔單抗複合的人類γδT細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的西妥昔單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-7 利妥昔單抗複合的人類γδT細胞殺傷利妥昔單抗反應性或抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞的細胞毒性功能
本實施例使用CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定法(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay)(Promega，美國)來檢測所培養的效應細胞對標靶細胞的細胞毒殺能力。首先，CELLSTAR® 96孔盤(商品號655083，購自Greiner)中的孔被分成：(1)標靶對照孔(target control well)、(2)利妥昔單抗基底孔(rituximab basal well)、(3)利妥昔單抗和標靶實驗孔、(4)Ctrl-gdT基底孔、(5)Ctrl-gdT和標靶實驗孔、(6)Ctrl-gdT和利妥昔單抗基底孔、(7)Ctrl-gdT與利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔、(8)ACE-gdT基底孔，以及(9)ACE-gdT與標靶細胞實驗孔。
本實驗中使用的效應細胞是
Figure 111147737-A0305-02-0096-33
16天γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0096-35
利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；其中利妥昔單抗為針對CD20蛋白的抗體，具有商品名為Mabthera(購自Creative BioLabs、Roche、Amgen、Pfizer)。
本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0096-36
對利妥昔單抗沒有抗性的懸浮性人類Burkitt氏淋巴瘤細胞系Raji(human Burkitts lymphoma cell line Raji)(CCL-86，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0096-37
抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞系 Raji-2R80(rituximab-resistant human lymphoma cell line Raji-2R80)(本發明的發明人從Raji建立此抗利妥昔單抗株Raji-2R80(rituximab-resistant clones Raji-2R80)；開發抗利妥昔單抗株的方法對本領域的技術人員而言是已知的或將是顯而易見的，例如根據參考文獻(1)Czuczman et al.Clin.Cancer Res.(2008)；14：1561.-1570(10.1158/1078-0432.CCR-07-1254)；或者(2)Jazirehi et al.Cancer Res.(2007)；67：1270-1281(10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)開發。
把標靶細胞(Raji或者Raji-2R80細胞)接種於：標靶對照孔、利妥昔單抗和標靶實驗孔、Ctrl-gdT和標靶實驗孔、Ctrl-gdT與利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔，以及ACE-gdT與標靶細胞實驗孔、使得每孔含有5000個標靶細胞。
把利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液(ACE-gdT-CD20)樣品添加到：ACE-gdT基底孔以及ACE-gdT和標靶細胞實驗孔，使得效應細胞數對標靶細胞(Raji或者Raji-2R80細胞)數的比例分別為2、5或者10。
把16天γδT細胞懸浮液(Ctrl-gdT)樣品添加至：Ctrl-gdT基底孔、 Ctrl-gdT和標靶實驗孔、Ctrl-gdT和利妥昔單抗基底孔以及Ctrl-gdT和利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔，使得效應細胞數與標靶細胞(Raji或者Raji-2R80細胞)數的比例分別為2、5或者10。
將0.8、2或者4ng的利妥昔單抗分別添加至『Ctrl-gdT和利妥昔單抗基底孔』以及『Ctrl-gdT和利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔』。因此，『Ctrl-gdT和利妥昔單抗基底孔』中利妥昔單抗的量分別與『ACE-gdT基底孔』中聯接(linked to)到細胞的利妥昔單抗總量相同，其中，效應細胞數與標靶細胞數的比例為2、5或者10；『Ctrl-gdT和利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔』中利妥昔單抗的量分別與『ACE-gdT和標靶細胞實驗孔』中聯接(linked to)到細胞的利妥昔單抗總量相同，其中，效應細胞數與標靶細胞數的比例為2、5或者10。
CELLSTAR® 96孔盤在37℃、5%CO2中培養4小時。培養4小時後，將培養物與50μL的CellTiter-Glo®受質(CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定試劑盒，Promega，商品號G7570中提供)混合，並且在室溫避光反應12分鐘。通過冷光讀盤儀(luminescence plate reader，Synergy H1，BioTek Instruments，美國)測量和記錄每個孔的冷光。
其中，保留在孔中的活細胞數越多，通過Synergy H1系統檢測到的冷光量越高。因此，冷光可以被轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞的百分比。用來將冷光轉換為實驗孔中裂解的標靶細胞百分比的公式如下：『利妥昔單抗和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞百分比(%) =1-〔(利妥昔單抗和標靶細胞實驗孔的冷光-利妥昔單抗基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『Ctrl-gdT和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞百分比(%)=1-〔(Ctrl-gdT和標靶實驗孔的冷光-Ctrl-gdT基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『Ctrl-gdT和利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔』中裂解的標靶細胞百分比(%)=1-〔(Ctrl-gdT和利妥昔單抗以及標靶細胞實驗孔的冷光-Ctrl-gdT和利妥昔單抗基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『ACE-gdT和標靶細胞實驗孔』中裂解的標靶細胞百分比(%)=1-〔(ACE-gdT和標靶細胞實驗孔的冷光-ACE-gdT基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
本發明的發明人預期：(1)人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷利妥昔單抗反應性的Raji細胞和抗利妥昔單抗的Raji-2R80細胞的能力相似。出乎意料的是，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞對利妥昔單抗反應性的Raji細胞和抗利妥昔單抗的Raji-2R80細胞的殺傷能力也相似；(2)利妥昔單抗只能夠殺死小量抗利妥昔單抗的癌細胞，而且，與利妥昔單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+利妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與利妥昔單抗複合的人類γδT細胞的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效 果。這是一個出乎意料的結果，並且表明利妥昔單抗複合的人類γδT細胞中，利妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺死抗利妥昔單抗的癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合利妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)而獲得的利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如利妥昔單抗複合的人類γδT細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的利妥昔單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-8 利妥昔單抗複合的人類γδT細胞殺死正常或抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞的細胞毒殺功能
本實施例的實驗方法與實施例1-2-7的實驗方法幾乎相同，除了：本實驗中使用的標靶細胞是
Figure 111147737-A0305-02-0100-38
對利妥昔單抗沒有抗性的人類淋巴瘤細胞系Daudi(human lymphoma cell line Daudi)(CCL-213，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0100-39
抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞系Daudi-RR(本發明的發明人由Daudi建立了這個抗利妥昔單抗株Daudi-RR；開發該抗利妥昔單抗株的方法對本領域的技術人員已知的，或者將是顯而易見的，例如根據參考文獻(1)Czuczman等人，Clin.Cancer Res.(2008)；14：1561-1570(10.1158/1078-0432.CCR-07-1254)；或者(2)Jazirehi等人，Cancer Res.(2007)；67；1270-1281(10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)開發。
本發明的發明人預期：(1)人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷利妥昔單抗反應性的Daudi細胞和抗利妥昔單抗的Daudi-RR細胞的能力相似。出乎意料的是，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞對利妥昔單抗反應性的Daudi細胞和抗利妥昔單抗的Daudi-RR細胞的殺傷能力也相似；(2)利妥昔單抗只能夠殺死小量抗利妥昔單抗的癌細胞，並且與利妥昔單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+利妥昔單抗)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與利妥昔單抗複合的人類γδT細胞的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且表明利妥昔單抗複合的人類γδT細胞中，利妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺死抗利妥昔單抗癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合利妥昔單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)所獲得的利妥昔單抗複合的人類γδT細胞(Ctrl-gdT)，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞，例如利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的利妥昔單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-9阿維魯單抗複合的人類γδT細胞在殺傷阿維魯單抗反應性或者抗阿維魯單抗的人類乳癌細胞的細胞毒殺功能
本實施例的實驗方法與實施例1-2-7的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0102-40
16天γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0102-41
阿維魯單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞，其中阿維魯單抗是針對程式性細胞死亡-配體1蛋白的抗體，具有商品名Bavencio®(購自Merck KGaA，Pfizer)；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0102-44
對阿維魯單抗沒有抗性的人類乳癌細胞系MDA-MB-231(HTB-26，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0102-46
抗阿維魯單抗人類乳癌細胞系MDA-MB-468(HTB-132，購自ATCC)。
本發明的發明人預期：(1)人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷阿維魯單抗反應性的人類乳癌細胞系MDA-MB-231和抗阿維魯單抗的人類乳癌細胞系MDA-MB-468的能力相似。出乎意料的是，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞對阿維魯單抗反應性的人類乳癌細胞系MDA-MB-231和抗阿維魯單抗的人類乳癌細胞系MDA-MB-468的殺傷能力也相似；(2)阿維魯單抗只能夠殺死小量抗阿維魯單抗的癌細胞，並且與阿維魯單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+avelumab)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與阿維魯單抗複合的 人類γδT細胞的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且這表明在阿維魯單抗複合的人類γδT細胞中，阿維魯單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺傷抗阿維魯單抗癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合阿維魯單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)所獲得的阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合的細胞毒性細胞例如阿維魯單抗複合的人類γδT細胞能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的avelumab)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例1-2-10 阿維魯單抗複合的人類γδT細胞殺傷正常或抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞的細胞毒性功能
本實施例的實驗方法與實施例1-2-9的實驗方法幾乎相同，除了：本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0103-48
對阿維魯單抗沒有抗性的人類肺癌細胞系H1650(CRL-5883，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0103-49
抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞系H2087(CRL-5922，購自ATCC)。
本發明的發明人預期：(1)人類γδT細胞(Ctrl-gdT)殺傷阿維魯單抗反應性的人類肺癌細胞系H1650和抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞系H2087的 能力相似。出乎意料的是，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞對正常的人類肺癌細胞系H1650和抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞系H2087的殺傷能力也相似；(2)阿維魯單抗只能夠殺死小量抗阿維魯單抗的癌細胞，並且與阿維魯單抗共同培養的人類γδT細胞(Ctrl-gdT+avelumab)的殺傷效果沒有顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的效果。出乎意料的是，與阿維魯單抗複合的人類γδT細胞的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Ctrl-gdT)的殺傷效果。這是一個出乎意料的結果，並且這表明阿維魯單抗複合的人類γδT細胞中，阿維魯單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)在殺傷抗阿維魯單抗癌細胞上表現出協同效應。
因此，成分複合的細胞毒性細胞，例如通過複合阿維魯單抗和人類γδT細胞(Ctrl-gdT)所獲得的阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，可以被用來治療對成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞，因此成分複合細胞毒性細胞，例如阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，能夠解決沒有藥物可以治療對目前FDA批准的藥物(例如FDA批准的阿維魯單抗)有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞的問題，以及提高成分在對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的個體中的治療效果。
實施例2：與成分反應性或抗成分的標靶細胞共同培養後，成分複合的細胞毒性細胞的活化標誌物(Activation marker)和細胞毒性分 子(Cytotoxic molecule)的表達
CD107a是活化標誌物，且干擾素γ、腫瘤壞死因子α和顆粒酶B(granzyme B)是細胞毒性分子。因此，細胞毒性細胞中CD107a、干擾素γ、腫瘤壞死因子α以及顆粒酶B的表達被用來表示細胞毒性細胞的活化狀態。
實施例2-1：與成分反應性或抗成分的標靶細胞共同培養後，成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
實施例2-1-1 與曲妥珠單抗反應性或抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞共同培養後，曲妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例包括用來進行細胞毒性測試的96孔細胞培養盤，且96孔細胞培養盤中的孔被分成ACE1702 ET2實驗孔、ACE1702 ET5實驗孔、ACE1702 ET10實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET10實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET10實驗孔、標靶對照孔以及培養基背景對照孔。
本實施例中使用的效應細胞是經32天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞或曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞，並且標靶細胞為敏感性的BT-474(HTB-20，購自ATCC)或抗藥性的BT-474clone 5細胞系(CRL-3247，購自ATCC)，其為貼附型的人類乳癌細胞系。
將標靶細胞BT-474或者BT-474 clone 5接種於ACE1702 ET2實驗孔、ACE1702 ET5實驗孔、ACE1702 ET10實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET10實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET10實驗孔以及標靶對照孔；因此，每孔含有10000個標靶細胞，將細胞靜置30分鐘，然後，細胞培養盤於37℃和5%二氧化碳的條件下培養2小時。
將經16天培養的oNK細胞懸浮液(Ctrl-oNK)或曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液(ACE1702)樣品添加到ACE1702 ET2實驗孔、ACE1702 ET5實驗孔、ACE1702 ET10實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET10實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-oNK和曲妥珠單抗ET10實驗孔，並使效應細胞數與標靶細胞(標靶細胞)數的比例為2、5以及10。將細胞培養盤置於37℃及5%二氧化碳的條件下的培養箱5小時。
將96孔細胞培養盤以400xg離心5分鐘。去除上清液，並用0.2mL的DPBS洗滌細胞沉澱物。然後以包含1：50稀釋的FITC-抗人類腫瘤壞死因子α抗體(BioLegend，商品號502906)、抗PE-抗人類CD56抗體(BioLegend)、PE/Cy7-抗人類干擾素γ抗體(BioLegend，商品號502528)、Alexa Fluor 647-抗人類顆粒酶B抗體(BioLegend)以及APC-Cy7-抗人類CD107a抗體(BioLegend，商品號328630)的100uL DPBS將經洗滌的細胞沉澱物染色(stained)10分鐘。將被染色的細胞離心，並用0.2mL的DPBS洗滌。以0.5mL的DPBS重新懸浮經洗滌的細胞，並且進一步分析CD56陽性圈選的細胞群體(CD56-positive gated populations)的腫瘤壞死因子-α +、干擾素 -γ +、顆粒酶B+和CD107a+的百分比。亦分析CD56陽性圈選的細胞群體的平均螢光強度。
本發明的發明人預期：
(1)與BT-474癌細胞或BT-474 clone 5癌細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)僅表達少量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474癌細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)將會表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474 clone 5癌細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)不會表達和在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於BT-474細胞的情況，添加曲妥珠單抗能夠高度活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)，進而能透過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制破壞(destroy)BT-474腫瘤細胞；然而，對於BT-474 clone 5細胞的情況，添加曲妥珠單抗未能高度地活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與BT-474或者BT-474 clone 5癌細胞共同培養，曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE1702)表達大量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a等多種分子的表達 程度相似。與等量的曲妥珠單抗造成的人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的活化狀態相比，觀察到ACE1702對BT-474和BT-474 clone5兩者的細胞毒性皆顯著增強。這些結果表明，如與添加曲妥珠單抗相比(不能高度活化人類CD16+自然殺手細胞進而破壞抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞)，複合的曲妥珠單抗(complexed Trastuzumab)能夠高度地活化曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE1702)，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞BT-474腫瘤細胞以及抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞。
實施例2-1-2 與西妥昔單抗反應性或抗西妥昔單抗的人類結腸癌細胞共同培養後，西妥昔單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0108-3
經45天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0108-4
西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0108-5
對西妥昔單抗沒有抗性的人類結腸直腸腺癌細胞系HCC827-luc(human colorectal adenocarcinoma cell line HCC827-luc)(JCRB1516，購自JCRB)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0108-50
抗西妥昔單抗的人類結腸直腸腺癌細胞系HT-29(HTB-38，購自ATCC)。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與NCI-H508癌症細胞或HT-29癌細胞共同培 養，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)僅表達少量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加西妥昔單抗的情況下與HCC827-luc癌症細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)將會表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加西妥昔單抗的情況下與HT-29癌症細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)不會表達和在添加西妥昔單抗的情況下與HCC827-luc癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於HCC827-luc細胞的情形，添加西妥昔單抗能夠高度活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞(destroy)HCC827-luc腫瘤細胞；然而，對於HT-29細胞的情形，添加西妥昔單抗未能高度活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗西妥昔單抗的HT-29腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與HCC827-luc或HT-29癌細胞共同培養，西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與西妥昔單抗共培養(未能高度活化人類CD16+自然殺手細胞以破壞抗西妥昔單抗的HT-29腫瘤細胞)相比，複合的西妥昔單抗(complexed cetuximab)能高度活化西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HCC827-luc腫瘤細 胞和抗西妥昔單抗的HT-29腫瘤細胞。
實施例2-1-3 與西妥昔單抗反應性或者抗西妥昔單抗的人類舌癌細胞共同培養後，西妥昔單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0110-7
經37天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0110-8
西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞；以及(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0110-9
對西妥昔單抗沒有抗性的人類舌部鱗狀癌細胞細胞系HSC-4(JCRB0264，購自JCRB)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0110-10
抗西妥昔單抗的人類舌鱗狀細胞癌細胞系SAS(JCRB0260，購自JCRB)。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與HSC-4癌細胞或SAS癌細胞共同培養，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)僅表達少量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加西妥昔單抗的情況下與HSC-4癌細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)將會表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加西妥昔單抗的情況下與SAS癌細胞共同培養時，人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)不會表達和在添加西妥昔單抗的情況下與HSC-4癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於HSC-4細胞的情形， 添加西妥昔單抗能夠高度活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HSC-4腫瘤細胞；然而，對於SAS細胞的情形，添加西妥昔單抗未能高度活化人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制破壞抗西妥昔單抗SAS腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與HSC-4或SAS癌症細胞共同培養，西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞表達大量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a等多種分子的表達程度相似。與等量的西妥昔單抗造成的人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的活化狀態相比，觀察到西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞對HSC-4和SAS的細胞毒性都顯著增強。這些結果表明，與西妥昔單抗共培養(未能高度活化人類CD16+自然殺手細胞來破壞抗西妥昔單抗的SAS腫瘤細胞)相比，複合的西妥昔單抗(complexed cetuximab)能夠高度活化西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HSC-4腫瘤細胞和抗西妥昔單抗的SAS腫瘤細胞。
實施例2-2：與成分反應性或抗成分的標靶細胞共同培養後，成分複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達。
實施例2-2-1 與曲妥珠單抗反應性或者抗曲妥珠單抗的人類乳癌細胞共同培養後，曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同， 除了本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0112-11
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0112-12
曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與BT-474癌細胞或者BT-474 clone 5癌細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474 clone 5癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加曲妥珠單抗的情況下與BT-474癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於BT-474細胞的情形，添加曲妥珠單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞BT-474腫瘤細胞；然而，對於BT-474 clone 5細胞的情形，添加曲妥珠單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與BT-474或者BT-474 clone 5癌細胞共同培養，曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與曲妥珠單抗共同培養(未能高度地活化人類γδT細胞來破壞抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞)相比，複合的曲妥珠單抗(complexed Trastuzumab)能夠高度活化曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞BT-474腫瘤細胞和抗曲妥珠單抗的BT-474 clone 5腫瘤細胞。
實施例2-2-2 與西妥昔單抗反應性的肺癌細胞或抗西妥昔單抗的人類結腸癌細胞共同培養後，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-2的實驗方法幾乎相同，除了本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0113-13
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0113-14
西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與HCC827-luc癌細胞或者HT-29癌細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加西妥昔單抗的情況下與HCC827-luc癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加西妥昔單抗的情況下與HT-29癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加西妥昔單抗的情況下與HCC827-luc癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對HCC827-luc細胞的情形，添加西妥昔單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HCC827-luc腫瘤細胞；然而，對於HT-29細胞的情形，添加西妥昔單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性 細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗西妥昔單抗HT-29腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與HCC827-luc或者HT-29癌細胞共同培養，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與西妥昔單抗共同培養(未能高度活化人類γδT細胞來破壞抗西妥昔單抗的HT-29腫瘤細胞)相比，複合的西妥昔單抗(complexed cetuximab)能夠高度活化西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞NCI-H508腫瘤細胞和抗西妥昔單抗的HT-29腫瘤細胞。
實施例2-2-3與西妥昔單反應性或抗西妥昔單抗的人類舌癌細胞共同培養後，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0114-15
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0114-16
西妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0114-17
對西妥昔單抗沒有抗性的人類舌部鱗狀癌細胞系HSC-4(JCRB0264，購自JCRB)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0114-19
抗西妥昔單抗的人類舌部鱗狀細胞癌細胞系SAS(JCRB0260，購自JCRB)。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與HSC-4癌細胞或SAS癌細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加西妥昔單抗的情況下與HSC-4癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加西妥昔單抗的情況下與SAS癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加西妥昔單抗的情況下與HSC-4癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於HSC-4細胞的情形，添加西妥昔單抗能夠高度活化人類γδT細胞(Ctrl-oNK)，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HSC-4腫瘤細胞；然而，對於SAS細胞的情形，添加西妥昔單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗西妥昔單抗SAS腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與HSC-4或SAS癌細胞共同培養，西妥昔單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與西妥昔單抗共同培養(未能高度活化人類γδT細胞來破壞抗西妥昔單抗的SAS腫瘤細胞)相比，複合的西妥昔單抗(complexed cetuximab)能夠高度活化西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞HSC-4腫瘤細胞和抗西妥昔單抗的SAS腫瘤細胞兩者。
實施例2-2-4 與利妥昔單抗反應性或抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞共同培養後，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0116-20
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0116-22
利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0116-23
對利妥昔單抗沒有抗性的人類Burkitt氏淋巴瘤細胞系Raji(CCL-86，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0116-24
抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞系Raji-2R80(或者Raji-2RH；本發明的發明人從Raji建立此抗利妥昔單抗株Raji-2R80或者Raji-2RH；開發抗利妥昔單抗株的方法對本領域的技術人員而言是已知的或將是顯而易見的，例如根據參考文獻(1)Czuczman et al.Clin.Cancer Res.(2008)；14：1561.-1570(10.1158/1078-0432.CCR-07-1254)；或者(2)Jazirehi et al.Cancer Res.(2007)；67：1270-1281(10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)開發。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與Raji癌細胞、Raji-2R80癌細胞或Raji-2RH共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加利妥昔單抗的情況下與Raji癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶 B以及CD107a。然而，在添加利妥昔單抗的情況下與Raji-2R80(或者Raji-2RH)癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加利妥昔單抗的情況下與Raji癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於Raji細胞的情形，添加利妥昔單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞Raji腫瘤細胞；然而，對於Raji-2R80(或者Raji-2RH)細胞的情形，添加利妥昔單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗利妥昔單抗Raji-2R80(或者Raji-2RH)腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與Raji、Raji-2R80、或者Raji-2RH癌細胞共同培養，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a的多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與利妥昔單抗共同培養(未能高度活化人類γδT細胞來破壞抗利妥昔單抗Raji-2R80腫瘤細胞)相比，複合的利妥昔單抗(complexed rituximab)能夠高度活化利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞Raji腫瘤細胞和抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)腫瘤細胞。
實施例2-2-5 與利妥昔單抗反應性或抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞共同培養後，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同， 除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0118-25
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0118-26
利妥昔單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0118-27
對利妥昔單抗沒有抗性的人類淋巴瘤細胞系Daudi(CCL-213，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0118-28
抗利妥昔單抗的人類淋巴瘤細胞系Daudi-RR(本發明的發明人從Daudi建立此抗利妥昔單抗株Daudi-RR；開發抗利妥昔單抗株的方法對本領域的技術人員而言是已知的或將是顯而易見的，例如根據參考文獻Jazirehi et al.Cancer Res.(2007)；67：1270-1281(10.1158/0008-5472.CAN-06-2184)開發。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與Daudi癌細胞或者Daudi-RR癌細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加利妥昔單抗的情況下與Daudi癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加利妥昔單抗的情況下與Daudi-RR癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加利妥昔單抗的情況下與Daudi癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於Daudi細胞的情形，添加利妥昔單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞Daudi腫瘤細胞；然而，對於Daudi-RR細胞的情形，添加利妥昔單 抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗利妥昔單抗的Daudi-RR腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與Daudi或者Daudi-RR癌細胞共同培養，利妥昔單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與利妥昔單抗共同培養(未能高度地活化人類γδT細胞來破壞抗利妥昔單抗Daudi-RR腫瘤細胞)相比，複合的利妥昔單抗(complexed rituximab)能夠高度活化利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞Daudi腫瘤細胞和抗利妥昔單抗的Daudi-RR腫瘤細胞。
實施例2-2-6 與阿維魯單抗反應性或抗阿維魯單抗的人類乳癌細胞共同培養後，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0119-29
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0119-30
阿維魯單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0119-31
對阿維魯單抗沒有抗性的人類乳癌細胞系MDA-MB-231(HTB-26，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0119-32
抗阿維魯單抗的人類乳癌細胞系MDA-MB-468(HTB-132，購自ATCC)。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與MDA-MB-231癌症細胞或者MDA-MB-468癌症細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加阿維魯單抗的情況下與MDA-MB-231癌症細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加阿維魯單抗的情況下與MDA-MB-468癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加阿維魯單抗的情況下與MDA-MB-231癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。此結果表明，對於MDA-MB-231細胞的情形，添加阿維魯單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞MDA-MB-231腫瘤細胞；然而，對於MDA-MB-468細胞的情形，添加阿維魯單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗阿維魯單抗MDA-MB-468腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與MDA-MB-231或者MDA-MB-468癌症細胞共同培養，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與阿維魯單抗共同培養(未能高度地活化人類γδT細胞來破壞抗阿維魯單抗MDA-MB-468腫瘤細胞)相比，複合的阿維魯單抗(complexed avelumab)能夠高度活化阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，進而 通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞MDA-MB-231腫瘤細胞和抗阿維魯單抗的MDA-MB-468腫瘤細胞。
實施例2-2-7 與阿維魯單抗反應性或抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞共同培養後，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達
本實施例的實驗方法與實施例2-1-1的實驗方法幾乎相同，除了：(1)本實驗中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0121-33
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0121-34
阿維魯單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；並且(2)本實驗中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0121-35
對阿維魯單抗沒有抗性的人類肺癌細胞系H1650(CRL-5883，購自ATCC)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0121-36
抗阿維魯單抗的人類肺癌細胞系H2087(CRL-5922，購自ATCC)。
本發明的發明人預期：
(1)無論是與H1650癌細胞或者H2087癌細胞共同培養，人類γδT細胞僅表達少量的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B以及CD107a。
(2)在添加阿維魯單抗的情況下與H1650癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將會表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a。然而，在添加阿維魯單抗的情況下與H2087癌細胞共同培養時，人類γδT細胞將不會表達和在添加阿維魯單抗的情況下與H1650癌細胞共同培養時一樣多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及 CD107a。此結果表明，對於H1650細胞的情形，添加阿維魯單抗能夠高度活化人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞H1650腫瘤細胞；然而，對於H2087細胞的情形，添加阿維魯單抗未能高度活化人類γδT細胞進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞抗阿維魯單抗的H2087腫瘤細胞。
(3)出乎意料的是，無論是與H1650或者H2087癌細胞共同培養，阿維魯單抗複合的人類γδT細胞表達大量的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B以及CD107a，並且兩組中諸如腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B、CD107a等多種分子的表達程度相似。這些結果表明，與阿維魯單抗共同培養(未能高度地活化人類γδT細胞來破壞抗阿維魯單抗的H2087腫瘤細胞)相比，複合的阿維魯單抗能夠高度活化阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，進而通過諸如抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的機制來破壞H1650腫瘤細胞和抗阿維魯單抗的H2087腫瘤細胞。
實施例3：免疫抑制微環境(immunosuppressive microenvironment)對成分複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒殺功能的影響
實施例3-1：缺氧對成分複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒殺功能的影響
本實施例使用乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢定試劑盒(Lactate dehydrogenase(LDH)cytotoxicity assay kit)(商品號88954，Pierce Biotechnology，美國)來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒殺能力。本實施例包括用來進行細胞毒殺測試的96孔培養盤，並且孔被分為效應細胞自發性的LDH釋放對照孔(Effector cell spontaneous LDH release control wells， ESR，包括ACE1702自發性的LDH釋放對照孔(ACE1702 spontaneous LDH release control wells)和Ctrl-oNK自發性的LDH釋放對照孔(Ctrl-oNK spontaneous LDH release control wells))、標靶細胞自發性的LDH釋放對照孔(Target cell spontaneous LDH release control wells)(TSR)、實驗孔(包括ACE1702實驗孔和Ctrl-oNK實驗孔)、標靶細胞最大化的LDH釋放對照孔(Target cell maximum LDH release control well)(TMR)、體積校正對照孔(VCC，此孔是用來校正加入裂解緩衝液導致的體積增加)，以及培養基背景對照孔(CMB，此孔是用來校正可能存在於含有血清的培養基中的LDH活性引起的貢獻量(contributions))。
本實施例中使用的效應細胞是
Figure 111147737-A0305-02-0123-37
經26天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞(Ctrl-oNK)，或者
Figure 111147737-A0305-02-0123-38
曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞(ACE1702)，並且標靶細胞為貼附性的人類卵巢癌細胞系SK-OV-3(HTB-77，購自ATCC)。
將標靶細胞接種於標靶細胞自發性的LDH釋放對照孔(TSR)、實驗孔和標靶細胞最大化的LDH釋放對照孔(TMR)中；因此，每個孔包含1.2×104個標靶細胞，並將細胞靜置2~4小時。
將效應細胞(ACE1702或者Ctrl-oNK)和標靶細胞(SK-OV-3)於37℃以缺氧條件(0%氧氣的條件)預處理18小時。將預處理過的效應細胞(ACE1702或者Ctrl-oNK)加到效應細胞自發性的LDH釋放對照孔(ESR)和實驗孔中，並使效應細胞數對標靶細胞數的比例為5。把等體積的含血清培養基加到體積校正對照孔(VCC)和培養基背景對照孔(CMB)中。
效應細胞和標靶細胞於96孔培養盤中以缺氧的條件共同培養18小時，並且在收穫上清液前，把10μL的裂解緩衝液添加到標靶細胞最大化的LDH釋放對照孔(TMR)和體積校正對照孔(VCC)。
96孔培養盤於室溫以400xg離心3分鐘，然後將50μL上清液從每個孔分別轉移到一個不同的新96孔盤的新孔中。在顯微鏡下觀察孔，以檢查是否存在任何細胞。將50μL的反應混合物(Reaction Mixture)(含有乳酸脫氫酶的受質『四唑鹽(tetrazolium salt)』；可商業性地從Pierce Biotechnology購得；乳酸脫氫酶細胞毒性檢定試劑盒，商品號88954)加到每個新孔並且輕輕混合，然後於室溫反應5-15分鐘。將終止溶液(Stop Solution)加到每個新孔，並測量在490nm和680nm的吸光度。
OD490-OD680越大，從裂解的標靶細胞釋放的乳酸脫氫酶越多，因此OD490-OD680可用以轉換為實驗孔中裂解的標靶細胞的百分比。請參考乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢定試劑盒(商品號88954，Pierce Biotechnology，美國)中描述的公式來把OD490-OD680轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞的百分比。
請參考圖8A。圖8A是呈現缺氧對成分複合的細胞毒性細胞和無複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒殺功能影響的長條圖。將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液(ACE1702)中的細胞於缺氧條件中預處理，然後與卵巢癌細胞系SK-OV-3細胞在缺氧條件下於E/T比例為5、37℃共同培養18小時，並且SK-OV-3細胞的裂解百分比為43%。關於Ctrl-oNK的細胞毒性(cytotoxicity)，被經24天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞(Ctrl-oNK)裂解的SK-OV-3百分比為25%。結果顯示，在免疫抑制微環 境例如缺氧條件中，與Ctrl-oNK細胞相比，ACE1702細胞對人類卵巢癌細胞系SK-OV-3細胞有更高的細胞毒性(cytotoxicity)。
實施例3-2：乳酸(代謝廢物)對成分複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒性功能的影響。
本實施例的實驗方法與實施例3-1的實驗方法幾乎相同，除了：
(1)本實驗中使用的效應細胞為曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞；以及
(2)效應細胞在室溫下以0或75mM乳酸預處理1小時，而非在37℃以缺氧條件(0%氧氣條件)預處理18小時。
(3)實驗孔包括0mM乳酸實驗孔和75mM乳酸實驗孔。
(4)將96孔培養盤中的效應細胞和標靶細胞共同培養15小時。
請參考圖8B。圖8B是呈現乳酸(一種代謝廢物)對成分複合的細胞毒性細胞的細胞毒殺功能影響的長條圖。將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞(ACE1702)以75mM乳酸預處理，然後與卵巢癌細胞系SK-OV-3細胞在E/T比例為5、37℃條件下共同培養15小時，並且SK-OV-3細胞的裂解百分比為80%。關於以0mM乳酸預處理的ACE1702的細胞毒性(cytotoxicity)，SK-OV-3細胞的裂解百分比為90%(p>0.05)。結果顯示，在免疫抑制微環境例如酸性條件中，ACE1702細胞對人類卵巢癌細胞系SK-OV-3細胞有更高的細胞毒性(cytotoxicity)。
實施例3-3：腹水萃取物(包含免疫抑制性的細胞激素 (immunosuppressive cytokines))對成分複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒性功能的影響
本實施例的實驗方法與實施例3-1的實驗方法幾乎相同，除了：
(1)本實驗中使用的效應細胞為曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞(ACE1702)；以及
(2)效應細胞並未在缺氧條件(0%氧氣條件)、37℃中預處理18小時。
(3)實驗孔包括0%腹水萃取物實驗孔和50%腹水萃取物實驗孔。
(4)於不存在或存在50%(v/v%)腹水萃取物的情況下，將96孔培養盤中的效應細胞和標靶細胞於E：T比例為10條件在oNK生長培養基中共同培養18小時。其中腹水萃取物是根據以下方法獲得： 由醫生進行腹部穿刺術。簡言之，將穿刺針緩慢插入患有卵巢癌的人類個體腹部，以從人類個體抽取腹水(abdomen fluid)。將抽取的腹水以1500xg離心5分鐘，以去除自由漂浮的細胞(free-floating cells)。收集上清液作為腹水萃取物。通過顯微鏡或者流式細胞儀檢查腹水萃取物，以確保腹水萃取物是無細胞的。
請參考圖8C。圖8C是呈現腹水萃取物(包含免疫抑制性的細胞激素)對成分複合的人類細胞毒性細胞的細胞毒殺功能影響的長條圖。在50%(v/v%)腹水萃取物存在的情況下，將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞(ACE1702)與卵巢癌細胞系SK-OV-3 細胞於E/T比例為5、37℃下共同培養18小時，SK-OV-3細胞的裂解百分比為90%。關於在沒有腹水萃取物的情況下培養的ACE1702的細胞毒性(cytotoxicity)，SK-OV-3細胞的裂解百分比為95%(p>0.05)。結果顯示，ACE1702細胞在免疫抑制微環境例如包含免疫抑制性的細胞激素中，對人類卵巢癌細胞系SK-OV-3細胞保持高細胞毒性(cytotoxicity)。
實施例4：成分複合的細胞毒性細胞對個體中抗成分的固體腫瘤(ingredient-resistant solid tumor)的細胞毒性
實施例4-1：成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞對個體中抗成分的固體腫瘤(ingredient-resistant solid tumor)的細胞毒性
在第0天，表達螢光酵素的抗曲妥珠單抗的乳癌細胞系BT474 Clone 5(Luciferase-expressing trastuzumab-resistant breast cancer cell line BT474 Clone 5，CRL-3247，購自ATCC)經腹膜注射至25隻雌性NOG小鼠(Jackson Laboratory)的每隻小鼠中。將小鼠隨機地分成5組。
(1)Ctrl-oNK組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以經24天培養的oNK細胞懸浮液中的5000000個細胞處理(treated)。
(2)ACE1702組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的5000000個細胞處理。
(3)Ctrl-oNK和曲妥珠單抗組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以經24天培養的oNK細胞懸浮液中的5000000個細胞和2.75ng的曲妥珠單抗(針對HER2蛋白具有商品名Herceptin的抗體購自Roche，瑞士)處理。因此，施用到Ctrl-oNK和曲妥珠單抗組小鼠的曲妥珠單抗量(2.75ng的曲妥珠單抗)，與施用到ACE1702組小鼠的聯接(linked to)到細胞的曲妥珠單 抗(the total amount of the trastuzumab linked to the cells)總量相同。
(4)曲妥珠單抗組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天用2.75ng的曲妥珠單抗處理。
(5)對照組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天用賦形劑(僅細胞培養基，例如實施例1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)處理。
在第0、3、7、10、14、和17天、以及在第17天之後至實驗結束間的每一週，以AMI HTX(光譜成像)檢測冷光。
本發明的發明人預期： 小鼠的螢光圖像顯示：用曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞處理的小鼠，其生物冷光圖像展現出顯著性的減少。因此，本發明的成分複合的細胞毒性細胞能夠治療個體體內的中抗成分固體腫瘤以及治療位於免疫抑制微環境中的異常細胞例如固體腫瘤。
為了進一步了解本發明的成分複合的細胞毒性細胞減少諸如固體腫瘤的位於免疫抑制微環境中的異常細胞的機制，本發明的發明人繼續進行實施例5和實施例6的細胞遷移研究(cell migration studies)。
實施例4-2 成分複合的人類γδT細胞對個體的抗成分固體腫瘤(ingredient-resistant solid tumor)的細胞毒性
在第0天將表達螢光酵素的抗曲妥珠單抗乳癌細胞系BT474 Clone 5(Luciferase-expressing trastuzumab-resistant breast cancer cell line BT474 Clone 5，CRL-3247，購自ATCC)經腹膜注射到25隻雌性NOG小鼠(Jackson Laboratory)的每隻小鼠中。把小鼠隨機分成5組。
(1)Ctrl-gdT組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以16天γδT細胞懸浮液中的10000000個細胞處理。
(2)ACE-gdT-HER2組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的10000000個細胞處理。
(3)Ctrl-gdT和曲妥珠單抗組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天以16天γδT細胞懸浮液中的10000000個細胞和2.75ng的曲妥珠單抗(針對HER2蛋白具有商品名Herceptin的抗體購自Roche，瑞士)處理。因此，施用到Ctrl-gdT和曲妥珠單抗組小鼠的曲妥珠單抗量(2.75ng的曲妥珠單抗)，與施用到ACE-gdT-HER2組小鼠聯接到細胞的曲妥珠單抗的總量(the total amount of the trastuzumab linked to the cells)相同。
(4)曲妥珠單抗組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天用2.75ng的曲妥珠單抗處理。
(5)對照組的小鼠在第0、3、7、10、14和17天用賦形劑(僅細胞培養基，例如實施例1-2-1中描述的完全生長培養基)處理。
在第0、3、7、10、14和17天以及第17天之後每週直到實驗結束，通過AMI HTX(光譜成像)檢測冷光。
本發明的發明人預期： 小鼠的冷光圖像顯示：用曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞處理的小鼠，其生物冷光圖像展現出顯著性的減少。因此，本發明的成分複合的細胞毒性細胞能夠治療個體中抗成分的固體腫瘤(ingredient-resistant solid tumor)以及治療位於免疫抑制微環境中的異常細胞例如固體腫瘤。
為了進一步了解本發明的成分複合的細胞毒性細胞減少諸如固體腫瘤的位於免疫抑制微環境中的異常細胞的機制，本發明的發明人繼續進行了實施例5和實施例6的細胞遷移研究。
實施例5：成分複合的細胞毒性細胞遷移研究
請參考圖9A。圖9A說明成分複合的細胞毒性細胞遷移研究的檢驗設計。本實施例中使用的外池(outer chamber)是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。外池的孔被分成培養基孔和SK-OV-3孔。本實施例中使用的內池是聚碳酸酯細胞培養插入物(polycarbonate cell culture inserts)(Millipore，商品號PITP01250)。把細胞培養基(例如實施例1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)或者有2×105個SK-OV-3細胞(標靶細胞)的細胞培養基接種在外池的孔中。經2小時附著後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入到外池的每個孔中，並將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的1×106個細胞接種到每個內池中培養19小時。
收穫外池中的細胞並且以PE-共軛的小鼠抗人類CD56(BioLegend，#304606)和PE-Cy5-共軛的CD3抗體於室溫避光下染色10分鐘。然後將細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，再以1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD56+/CD3-圈選細胞(DPBS-resuspended CD56+/CD3- gated cells)。
請參考圖9B。圖9B是呈現成分複合的細胞毒性細胞進入到癌細胞所在區域的遷移能力的長條圖。圖9B顯示在培養基孔中僅檢測到少 量曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(曲妥珠單抗複合的oNK細胞表達CD56和CD16)；反之，在SK-OV-3孔中檢測到大量曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(曲妥珠單抗複合的oNK細胞表達CD56和CD16)。此外，SK-OV-3孔中曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞的數量是其於培養基孔中的9.1倍。也就是說，與移動到含有培養基的外池的成分複合的細胞毒性細胞的數目相比，成分複合的細胞毒性細胞穿過位於聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且遷移到含有標靶細胞的外池的數量顯著性地增加了9.1倍(每個條件實施了三次，並且數據表示為平均值±SD。使用t檢定進行統計分析。**，p<0.01。)
本發明的發明人預期，如果把前文所述的SK-OV-3替換為對成分具有抗性的標靶細胞(例如BT-474 clone 5細胞系、HT-29細胞系和SAS細胞系)，內池中大量與成分複合的細胞毒性細胞(成分複合的細胞毒性細胞)也能夠穿過位於聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且移動到包含對成分具有抗性的標靶細胞的外池。
實施例6：CD3 + T細胞遷移研究
實施例6-1：成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞對CD3 + T細胞遷移能力的影響
請參考圖10A。圖10A說明CD3+T細胞遷移研究的檢驗設計。本實施例中使用的外池是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。本實施例中使用的內池是具有3μm孔徑的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物；商品號PITP01250)。
本實施例有四組，它們為(1)培養基組、(2)SK-OV-3組、 (3)ACE1702組以及(4)SK-OV-3和ACE1702組。
(1)培養基組：將細胞培養基(例如實施例1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)加入外池培養19小時。將上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞(donor-derived PBMC cells)接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(2)SK-OV-3組：將4×105個SK-OV-3細胞(標靶細胞)接種於外池培養19小時。將上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(3)ACE1702組：將曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的1×106個細胞接種於外池培養19小時。將上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置於新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(4)SK-OV-3和ACE1702組：將4×105個SK-OV-3細胞(標靶細胞)和曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的1×106個細胞接種於外池培養19小時。將上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
收穫外池中的細胞並在室溫以CD3抗體避光染色10分鐘。然後將細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，然後以1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mLDPBS 重新懸浮後的CD3+圈選細胞(DPBS-resuspended CD3+ gated cells)。
請參考圖10B。圖10B是呈現成分複合的細胞毒性細胞對CD3+T細胞進入到癌症細胞所在區域的遷移能力影響的長條圖。圖10B顯示培養基組的外池含有35個CD3+T細胞；SK-OV-3組的外池含有8031個CD3+T細胞；ACE1702組的外池含有2257個CD3+T細胞；SK-OV-3和ACE1702組的外池含有23183個CD3+T細胞。亦即，與移動到含有培養基的外池的CD3+T細胞數相比，穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且遷移至單獨含有標靶細胞、單獨含有ACE1702、及ACE1702與標靶細胞共同培養的外池的CD3+T細胞數量分別顯著增加高達229.5倍、64.5倍以及662.4倍(每個條件施行了三次並且數據表示為平均值±SD。使用t檢定進行統計分析。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。)
這些結果顯示，包含標靶細胞例如SK-OV-3細胞的外池(病灶模擬(lesion simulation))中的成分複合的細胞毒性細胞將顯著性地增加CD3+T細胞進入病灶的遷移能力。
經由比較SK-OV-3組和ACE1702組的CD3+T細胞遷移效能(efficacy)，它顯示SK-OV-3和ACE1702組的外池的標靶細胞(例如SK-OV-3)和成分複合的細胞毒性細胞，在CD3+T細胞遷移功效上出人意料地表現出協同效應。
如果把前文所述的SK-OV-3替換為對成分具有抗性的標靶細胞(例如BT-474 clone 5細胞系、HT-29細胞系以及SAS細胞系)，本發明的發明人預期將會有類似於前文所述實驗的結果，包括：(1)保留包含對該成分具有抗性的標靶細胞的外池(病灶 模擬)中，與成分複合的細胞毒性細胞(成分複合細胞毒性細胞)將顯著性地增加CD3+T細胞進入病灶的遷移能力；並且(2)在外池中的對成分具有抗性的標靶細胞和成分複合的細胞毒性細胞，將出人意料地在CD3+T細胞遷移功效上表現出協同效應。
實施例6-2：成分複合的人類γδT細胞對CD3 + T細胞和CD56 + CD3 - NK細胞遷移能力的影響
本實施例中有四組，其為(1)培養基組、(2)SK-OV-3組、(3)ACE-gdT-HER2組、以及(4)SK-OV-3和ACE-gdT-HER2組。
(1)培養基組：將細胞培養基(例如實施例1-2-1中描述的完全生長培養基)加至外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
(2)SK-OV-3組：將4×105個SK-OV-3細胞(標靶細胞)接種於外池培養19小時。將上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
(3)ACE-gdT-HER2組：把曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的1×106個細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
(4)SK-OV-3和ACE-gdT-HER2組：將4×105個SK-OV-3細胞(標靶細胞)和曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的1×106個細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後將1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置在新外池裡的內池，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
收穫外池中的細胞並且在室溫以CD56和CD3抗體避光染色10分鐘。然後將細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，然後以1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並且以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD3+和CD56+CD3-圈選細胞(DPBS-resuspended CD3+ and CD56+CD3- gated cells)。
本發明的發明人預期在包含標靶細胞例如SK-OV-3細胞的外池(病灶模擬)中的成分複合的細胞毒性細胞將顯著性地增加CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞進入病灶的遷移能力。經由比較SK-OV-3組和ACE-gdT-HER2組的CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移效能，預期SK-OV-3和ACE-gdT-HER2組外池中的標靶細胞(例如SK-OV-3)和成分複合的細胞毒性細胞，在CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞遷移功效上出乎意料地地表現出協同效應。
如果把前文所述的SK-OV-3替換成對成分具有抗性的標靶細胞(例如BT-474 clone 5細胞系、HT-29細胞系以及SAS細胞系)，本發明的發明人預期將會有類似於前文所述實驗的結果，包括：
(1)在包含對該成分有抗性的標靶細胞的外池(病灶模擬)中，與該成分複合的細胞毒性細胞(成分複合的細胞毒性細胞)將顯著性 地增加CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞進入病灶的遷移能力；並且
(2)在外池中的對成分具有抗性的標靶細胞和成分複合的細胞毒性細胞，將出人意料地在CD3+T細胞和CD56+CD3-NK細胞的遷移功效上表現出協同效應。
實施例7：複合的成分數量對成分複合的細胞毒性細胞功能的影響
實施例7-1：複合的成分數量對成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞功能的影響
實施例7-1-1與不同數量的成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的製備
本實驗中，使用通過實施例1-1-1中揭露的培養方法培養24天獲得的經培養的oNK細胞懸浮液(本發明的經24天培養的oNK細胞懸浮液，稱為經24天培養的oNK細胞懸浮液)來製備與不同數量的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)複合的人類CD16+自然殺手細胞。
通過把不同量的細胞鏈接器結合至經24天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，以製備細胞-單鏈DNA共軛物，然後根據實施例1-1-4中描述的化學共軛技術將細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA混合後，獲得與不同數量的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)複合的人類CD16+自然殺手細胞。
將成分複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液與藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體(phycoerythrin-conjugated goat-anti-human Fab antibody)(例如，購自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)混合，使得經複合的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)與藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體特異性地交互作用。
為了將藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體的平均螢光強度轉換成為複合在每一個人類CD16+自然殺手細胞上成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)的數量，建立源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒(Bangs Laboratories,Inc.#815)的標準曲線。QuantumTM Simply Cellular®試劑盒中有5瓶微球(4種群體『#1、#2、#3和#4』包覆了增量的抗人類IgG抗體，1個未包覆的空白)。十微升的抗人類IgG抗體結合微球，包括#1、#2、#3和#4微球，個別與1μg/mL的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)在0.1mL總反應體積中於室溫反應30分鐘。對於空白微球，施行類似的程序，但不添加成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)。然後通過上文提到的藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體檢測曲妥珠單抗結合的(trastuzumab-bound)#1至#4微球和空白微球。用0.5mL的DPBS洗滌微球，並且把懸浮液在室溫以400xg離心5分鐘。把上清液去除並且通過流式細胞儀分析懸浮的QSC微球。把採集到的每個微球的平均螢光強度值插入(inserted into)製造商提供的計算表(QuickCal V2.3)的相應欄，以按照製造商的指示生成相應的標準曲線。在個別地建立每種成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)的絕對數量的標準曲線後，把0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥 昔單抗或者阿維魯單抗)插到QuickCal表來轉換成被藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體染色的人類CD16+自然殺手細胞的相應螢光強度值，該自然殺手細胞每個細胞與0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子複合。
使用細胞分選儀(BD FACSMelody、BD FACSAria III、SONY SH800S等)來分離每個細胞與0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子(例如曲妥珠單抗分子、西妥昔單抗分子、利妥昔單抗分子或者阿維魯單抗分子)複合的人類CD16+自然殺手細胞。
以下實施例7-1-2至7-1-5中使用的效應細胞有九種：
(1)與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(Ctrl-oNK細胞)：本組使用經28天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞。
(2)與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(3)與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(4)與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(5)與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個 細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(6)與20000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與15000至25000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(7)與30000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與25000至35000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(8)與50000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與45000至55000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
(9)與130000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞：本組中使用每個細胞與125000至135000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞。
實施例7-1-2複合的成分數量對成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的細胞毒性功能的影響
本實施例中使用CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定(Promega，美國)來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒性能力。首先，CELLSTAR®96孔盤(商品號655083，購自Greiner)中的孔被分成：
(1)標靶對照孔、
(2)與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔、
(3)與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔、
(4)與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔、
(5)與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔、
(6)與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔、
(7)與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶細胞實驗孔、
(8)與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及
(9)與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶細胞實驗孔。
(10)與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及
(11)與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶細胞實驗孔。
本實施例中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0140-39
人類乳癌細胞系BT474(HTB-20，購自ATCC)或者
Figure 111147737-A0305-02-0140-41
BT474衍生的抗曲妥珠單抗株BT474 Clone 5(CRL-3247，購自ATCC)。
把標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種於：標靶對照孔、與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔、與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔、與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔，以及與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔，使的每個孔含有5000個標靶細胞。
把經培養28天的oNK細胞懸浮液樣品添加至：與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加至：與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加至：與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加至：與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加至：與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔，以及與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔。
這些孔中，效應細胞數對標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)數的比例在每一組中是相同的。
CELLSTAR®96孔盤在37℃、5%CO2培養4小時。經4小時培 養後，把培養物與50uL的CellTiter® Glo受質(CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定試劑盒中提供，Promega，商品號G7570)混合，並且在室溫無光反應12分鐘。通過冷光讀盤儀(Synergy H1，BioTek Instruments，美國)測量和記錄每個孔的冷光。
其中，留在孔中的活細胞數越多，通過Synergy Hl系統檢測到的冷光就越高。因此，冷光可以被用來轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞百分比。用來把冷光轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞百分比的公式如下：『與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔的冷光-與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔的冷光-與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔的冷光-與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔的冷光-與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞 基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞和標靶實驗孔的冷光-與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
本發明的結果顯示：與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如，每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)能夠殺死更多的BT474細胞(p<0.05)；相對比的，與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞不能夠殺死更多的抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞；並且與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如，每個細胞與3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)能夠殺死更多的抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞HCC827和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果表明：與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個西妥 昔單抗分子複合)能夠殺死更多的HCC827細胞(或者HSC-4細胞)(p<0.05)；相對比的，與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞不能夠殺死更多的抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)；並且與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成利妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果表明：與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的Raji細胞(p<0.05)；相對比的，與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞不能夠殺死更多的抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)；並且與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)(p<0.05)。
此外，本發明的結果表明，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成阿維魯單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果表明：與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)能夠殺死更多的MDA-MB-231細胞(或者H1650)(p<0.05)；相對比的，與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞不能夠殺死更多的抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)；並且與Ctrl-oNK細胞相比，每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)能夠殺死更多的抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)(p<0.05)。
實施例7-1-3在與成分反應性或者抗成分性的標靶細胞共同培養後，複合的成分數對成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞的活化標誌物和細胞毒性分子的表達的影響
本實施例包括用來進行細胞毒性測試的96孔細胞培養盤，並且96孔細胞培養盤中的孔被分為：與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、 與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、標靶對照孔，以及培養基背景對照孔。
這個實施例中使用的標靶細胞是敏感的BT-474(HTB-20，購自ATCC)或者抗性的BT-474 clone 5細胞系(CRL-3247，購自ATCC)，它們是貼附型的人類乳癌細胞系。
把BT-474或者BT-474 clone 5標靶細胞接種於以下的孔：與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔、與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔，以及標靶對照孔。因此，每孔包含10000個標靶細胞，並且將細胞靜置30分鐘，然後把細胞培養盤在37℃和5%二氧化碳的條件下培養2小時。
把經培養23天的oNK細胞懸浮液樣品添加到與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔。
把每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加到與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔。
把每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類 CD16+自然殺手細胞樣品添加到與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔。
把每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加到與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔。
把每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞樣品添加到與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞實驗孔。
這些孔中，效應細胞數對標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)數的比例是1：1。把細胞培養盤置入培養箱在37℃和5%二氧化碳的條件下培養5小時。
把96孔細胞培養盤以400xg離心5分鐘。去除上清液，並用0.2mL的DPBS洗滌細胞沉澱物。然後用100uL含有以1：50稀釋的FITC-抗人類腫瘤壞死因子α抗體(BioLegend，商品號502906)、抗PE-抗人類CD56抗體(BioLegend)、PE/Cy7-抗人干擾素γ抗體(BioLegend，商品號502528)、Alexa Fluor 647-抗人類顆粒酶B抗體(BioLegend)和APC-Cy7-抗人類CD107a抗體(BioLegend，商品號328630)的DPBS染色洗滌後的細胞沉澱物，染色10分鐘。把染色過的細胞離心並用0.2mL的DPBS洗滌。用0.5mL的DPBS重新懸浮洗滌後的細胞，然後進一步分析CD56陽性圈選細胞群的腫瘤壞死因子-α +、干擾素-γ +、顆粒酶B+和CD107a+的百分比。亦分析CD56陽性圈選細胞群體的平均螢光強度。
本發明的發明人預期： 相較於Ctrl-oNK細胞在與BT474細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a，每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)在與BT474細胞共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)；相比之下，和Ctrl-oNK細胞在與BT474 Clone 5細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞在與抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞共培養後不能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a；並且和Ctrl-oNK細胞在與BT474 Clone 5細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)在與抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a。
本發明的發明人預期，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞HCC827和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-oNK細胞在與HCC827細胞(或者HSC-4細胞)共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與 1000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)在與HCC827細胞(或者HSC-4細胞)共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)；相比之下，和Ctrl-oNK細胞在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後不能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a；並且每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
本發明的發明人預期，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成利妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或Raji-2RH)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-oNK細胞在與Raji細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)在與Raji細胞共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)； 相比之下，和Ctrl-oNK細胞在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後不能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a；並且和Ctrl-oNK細胞在與Raji-2R80共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成阿維魯單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-oNK細胞在與MDA-MB-231細胞(或者H1650)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個avelumab分子複合)在與MDA-MB-231細胞(或者H1650)共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)； 相比之下，和Ctrl-oNK細胞在與抗a阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞在與抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後不能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a；並且和Ctrl-oNK細胞在與MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)在與抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
實施例7-1-4複合的成分數對成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞遷移的影響
本實施例中使用的外池是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。本實施例中使用的內池是聚碳酸酯細胞培養插入物(Millipore，商品號PITP01250)。本實施例中有六組，它們是：
(1)與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)接種於外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把經36天培養的oNK細胞懸浮液中的1×106個細胞接種到每一個內池中培養19小時。
(2)與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶 細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)接種在外池。貼附2小時後，將孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種到每一個內池培養19小時。
(3)與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種到每一個內池培養19小時。
(4)與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種到每一個內池培養19小時。
(5)與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞 接種到每一個內池培養19小時。
(6)與30000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與25000至35000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種到每一個內池培養19小時。
收穫外池中的細胞，然後在室溫以PE-共軛的小鼠抗人類CD56(BioLegend，#304606)和PE-Cy5-共軛的CD3抗體避光染色10分鐘。然後把細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，接著用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD56+/CD3-圈選細胞。
本發明的結果顯示，與移動到含有BT474細胞的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，內池中更多數量的每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個曲妥珠單抗分子複合)能夠穿過聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，然後移動到包含BT474細胞的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，相似量的每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞穿過聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，進而移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞的外池，並且，內池中更 多數量的每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個曲妥珠單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，進而移動到含有抗曲妥珠單抗BT474Clone 5細胞的外池(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合人類CD16+自然殺手細胞替換成西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞HCC827-luc和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果顯示：與移動到含有HCC827-luc細胞(或者HSC-4細胞)的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個西妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到包含HCC827-luc細胞(或者HSC-4細胞)的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜進而移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個西妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成利妥昔單抗複合人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果顯示：與移動到含有Raji細胞的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個利妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有Raji細胞的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗利妥昔單抗Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜進而移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個利妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗利妥昔單抗Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成阿維魯單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且將BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有類似於上述實驗的結果。即，本發明的結果顯示： 與移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個阿維魯單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)的外池的Ctrl-oNK細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個阿維魯單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)的外池(p<0.05)。
實施例7-1-5人類CD16 + 自然殺手細胞複合不同數量的成分對CD3 + T細胞遷移能力的影響
本實施例中使用的外池是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。本實施例中使用的內池是具有3μm孔徑的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物；Millipore，商品號PITP01250)。
本實施例有六組，它們為：
(1)與0個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)和1×106個經33天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞接種於外池培養19小時。把上清液 轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
(2)與1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)和1×106個每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
(3)與3000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)和1×106個每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
(4)與6000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)和1×106個每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中 的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
(5)與12000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)和1×106個每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
(6)與30000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞組：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474Clone5細胞)和1×106個每個細胞與25000至35000個曲妥珠單抗分子複合的人類CD16+自然殺手細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞的遷移。
收穫外池中的細胞並且在室溫用CD3抗體避光染色10分鐘。然後將細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD3+圈選細胞。
本發明的發明人預期：內池中大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插 入物底部的膜並且移動到含有BT474細胞和每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞和每個細胞與少量曲妥珠單抗分子複合的oNK細胞的外池，直到複合的曲妥珠單抗的數達到每個細胞超過3000個曲妥珠單抗分子。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成西妥昔單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞HCC827和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期，大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且移動到含有HCC827細胞(或者HSC-4細胞)和每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的oNK細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠通過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)和每個細胞與少量西妥昔單抗分子複合的oNK細胞的外池，直到複合的西妥昔單抗數達到每個細胞超過3000個西妥昔單抗分子。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成利妥昔單抗複合人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換為標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有與前文所述實驗相似的結果。即，本發明的發明人預期，大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且移動到包含Raji細胞和每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的oNK細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底 部的膜來移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)和每個細胞與少量利妥昔單抗分子複合的oNK細胞的外池，直到複合的利妥昔單抗數達到每個細胞超過3000個利妥昔單抗分子。
本發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞替換成阿維魯單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞，並且把BT474和BT474Clone5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有與前文所述實驗相似的結果。即，本發明的發明人預期，大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)和每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的oNK細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)和每個細胞與少量阿維魯單抗分子複合的oNK細胞的外池，直到複合的阿維魯單抗量達到每個細胞超過3000個阿維魯單抗分子。
實施例7-2：複合的成分數對成分複合的人類γδT細胞功能的影響
實施例7-2-1 與不同數量的成分複合的人類γδT細胞的製備
本實施例中，使用通過實施例1-2-1中揭露的培養方法培養16天獲得的經培養的γδT細胞懸浮液(本發明的16天γδT細胞懸浮液，稱為16天γδT細胞懸浮液)來製備與不同數量的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)複合的人類γδT細胞。
通過把不同量的細胞鏈接器結合至16天γδT細胞懸浮液中的細胞，以製備細胞-單鏈DNA共軛物，然後根據實施例1-1-4中描述的化學共軛技術把細胞-單鏈DNA共軛物和成分-單鏈DNA混合，以獲得與不同數量的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)複合的γδT細胞。
將成分複合的人類γδT細胞懸浮液與藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體(例如購自Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)混合，使得經複合的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)與藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體特異性地交互作用。
為了把藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體的平均螢光強度轉換成複合在每一個人類γδT細胞上成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)的數量，建立了源自QuantumTM Simply Cellular®試劑盒(Bangs Laboratories,Inc.#815)的標準曲線。QuantumTM Simply Cellular®試劑盒中有5瓶微球(4種群體『#1、#2、#3和#4』包覆了增量的抗人類IgG抗體，1個未包覆的空白)。十微升的抗人類IgG抗體結合微球，包括#1、#2、#3和#4微球，個別地與1μg/mL的成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)在0.1mL總反應體積中於室溫反應30分鐘。對於空白微球，施行類似的程序，但不添加成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)。然後通過上述的藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體檢測曲妥珠單抗結合的#1至#4微球和空白微球。用0.5mL的DPBS洗滌微球，並且把懸浮液在室溫以400xg離心5分鐘。去除上清液，並以流式細胞儀分析懸浮的QSC微球。把採集到的每個 微球的平均螢光強度值插入製造商提供的計算表(QuickCal V2.3)的相應欄進而按照製造商的指示生成相應的標準曲線。在個別地建立每種成分(例如曲妥珠單抗、西妥昔單抗、利妥昔單抗或者阿維魯單抗)的絕對數量的標準曲線後，接著把0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子(例如曲妥珠單抗分子、西妥昔單抗分子、利妥昔單抗分子或者阿維魯單抗分子)插入到QuickCal表來轉換成藻紅蛋白共軛的山羊抗人類Fab抗體染色後的人類γδT細胞的相應螢光強度值，該γδT細胞每個細胞與0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子複合。
使用細胞分選儀(BD FACSMelody、BD FACSAria III、SONY SH800S等)來分離每個細胞與0、1000±500、3000±500、6000±500、12000±3000、20000±5000、30000±5000、50000±5000或者130000±5000個成分分子(例如曲妥珠單抗分子、西妥昔單抗分子、利妥昔單抗分子或者阿維魯單抗分子)複合的人類γδT細胞。
實施例7-2-2至7-2-5的每個實施例中使用了九種效應細胞：
(1)與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用16天的γδT細胞懸浮液中的細胞。
(2)與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(3)與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細 胞。
(4)與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(5)與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(6)與20000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與15000至25000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(7)與30000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與25000至35000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(8)與50000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與45000至55000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
(9)與130000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞：本組中使用每個細胞與125000至135000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞。
實施例7-2-2複合的成分數對成分複合的人類γδT細胞的細胞毒性功能的影響
本實施例中使用CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定 (Promega，美國)來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒性能力。首先，把CELLSTAR®96孔盤(商品號655083，購自Greiner)中的孔分成：
(1)標靶對照孔、
(2)與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔、
(3)與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔、
(4)與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔、
(5)與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔、
(6)與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔、
(7)與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶細胞實驗孔、
(8)與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及
(9)與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶細胞實驗孔。
(10)與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及
(11)與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶細胞實驗孔。
本實施例中使用的標靶細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0164-42
人類乳癌細胞系BT474(HTB-20，購自ATCC)或者
Figure 111147737-A0305-02-0164-43
BT474衍生的抗曲妥珠單抗株BT474 Clone 5(CRL-3247，購自ATCC)。
把標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種於：標靶對照孔、與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔、與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔、與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔，以及 與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔，使得每孔含有5000個標靶細胞。
把16天的γδT細胞懸浮液樣品(Ctrl-gdT細胞)添加至：與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加至：與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加至：與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加至：與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔。
把每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加至：與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔，以及與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔。
在這些孔中，效應細胞數對標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)數的比例在每一組中是相同的。
CELLSTAR®96孔盤在37℃、5%CO2培養4小時。培養4小時後，把培養物與50uL的CellTiter® Glo受質(CellTiter-Glo®冷光細胞活性檢定試劑盒中提供，Promega，商品號G7570)混合，並且在室溫避光反應12分鐘。通過冷光讀盤儀(Synergy H1，BioTek Instruments，美國)測量和記錄每個孔的冷光。
其中，留在孔中的活細胞數量越多，通過Synergy Hl系統檢測到的冷光越高。因此，冷光能夠被用來轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞百分比。用來把冷光轉換成實驗孔中裂解的標靶細胞百分比的公式如下：『與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔的冷光-與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔的冷光-與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔的冷光-與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔』 中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔的冷光-與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
『與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔』中裂解的標靶細胞的百分比(%)=1-〔(與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞和標靶實驗孔的冷光-與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞基底孔的冷光)÷(標靶對照孔的冷光)〕×100%
結果表明：與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)能夠殺死更多的BT474細胞(p<0.05)；相比之下，請參閱圖11，與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞不能夠殺死更多的抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞；並且與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)能夠殺死更多的抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞HCC827和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有與前文所述實驗類似的結果。即，本發明的結果顯示：與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的 gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的HCC827細胞(或者HSC-4細胞)(p<0.05)；相比之下，與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞不能夠殺死更多的抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)；並且與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)(p<0.05)。
此外，結果表明，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成利妥昔單抗複合的人類γδT細胞(抗CD20抗體複合的人類γδT細胞)，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有與前文所述實驗類似的結果。即，結果表明：與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000、12000、20000、50000或者130000個利妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的Raji細胞(p<0.05)；相比之下，請參閱圖12，與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞不能夠殺死更多的抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)；並且每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000、12000、20000、50000 或者130000個利妥昔單抗分子複合)能夠殺死更多的抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述的曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有與前文所述實驗相似的結果。即，本發明的結果顯示：與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)能夠殺死更多的MDA-MB-231細胞(或者H1650)(p<0.05)；相比之下，與Ctrl-gdT細胞相比，每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞不能夠殺死更多的抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)；並且每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)能夠殺死更多的抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)。
實施例7-2-3在與成分反應性或者抗成分的標靶細胞共同培養後，複合的成分數對成分複合的人類γδT細胞中活化標誌物和細胞毒性分子的表達的影響
本實施例包括用來進行細胞毒性測試的96孔細胞培養盤，並且把96孔細胞培養盤中的孔分為：與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、 與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔，以及培養基背景對照孔。
此實施例中使用的標靶細胞是敏感的BT-474(HTB-20，購自ATCC)或者抗性的BT-474 clone 5細胞系(CRL-3247，購自ATCC)，它們是貼附性的人類乳癌細胞系。
把BT-474或者BT-474 clone 5標靶細胞接種於下列的孔：與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔、與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔，以及標靶對照孔。因此，每孔含有5000個標靶細胞，並且將細胞靜置30分鐘，然後細胞培養盤在37℃和5%二氧化碳的條件下培養2小時。
把16天的gdT細胞懸浮液樣品添加到與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔。
把每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加到與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔。
把每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類 γδT細胞樣品添加到與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔。
把每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加到與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔。
把每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞樣品添加到與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞實驗孔。
這些孔中，效應細胞數對標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)數的比例在每一組中是相同的。把細胞培養盤置入培養箱在37℃和5%二氧化碳的條件下培養5小時。
把96孔細胞培養盤以400xg離心5分鐘。去除上清液，並以0.2mL的DPBS洗滌細胞沉澱物。然後用100uL含有以1：50稀釋的FITC-抗人類腫瘤壞死因子α抗體(BioLegend，商品號502906)、抗PE-抗人類CD56抗體(BioLegend)、PE/Cy7-抗人類干擾素γ抗體(BioLegend，商品號502528)、Alexa Fluor 647-抗人類顆粒酶B抗體(BioLegend)以及APC-Cy7-抗人類CD107a抗體(BioLegend，商品號328630)的DPBS染色洗滌過的細胞沉澱物10分鐘。把染色後的細胞離心並用0.2mL的DPBS洗滌。用0.5mL的DPBS重新懸浮洗滌過的細胞，然後進一步分析CD56陽性圈選細胞群的腫瘤壞死因子α +、干擾素γ +、顆粒酶B+和CD107a+的百分比。亦分析CD56陽性圈選細胞群的平均螢光強度。
本發明的發明人預期：相較於Ctrl-gdT細胞在與BT474細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a，每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者 12000個曲妥珠單抗分子複合)在與BT474細胞共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)；相比之下，和Ctrl-gdT細胞在與BT474 Clone 5細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞在與抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞共同培養後，不能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a；並且和Ctrl-gdT細胞在與BT474 Clone 5細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個曲妥珠單抗分子複合)在與抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞HCC827和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-gdT細胞在與HCC827細胞(或者HSC-4細胞)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)在與HCC827細胞(或者HSC-4細胞)共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)； 相比之下，和Ctrl-gdT細胞在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後，不能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a；並且每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個西妥昔單抗分子複合)在與抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或Raji-2RH)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-gdT細胞在與Raji細胞共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)在與Raji細胞共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)；相比之下，和Ctrl-gdT細胞在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後，不能 夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a；並且每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與3500、6000或者12000個利妥昔單抗分子複合)在與抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期：和Ctrl-gdT細胞在與MDA-MB-231細胞(或者H1650)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)在與MDA-MB-231細胞(或者H1650)共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)；相比之下，和Ctrl-gdT細胞在與抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後表達的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a相比，每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞在與抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後，不能夠表達更多的腫瘤壞死因子α、干擾素γ、顆粒酶B和CD107a；並且每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞 與3500、6000或者12000個阿維魯單抗分子複合)在與抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)共同培養後，能夠表達更多的腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ、顆粒酶B和CD107a(p<0.05)。
實施例7-2-4複合的成分數量對成分複合的人類γδT細胞的遷移的影響
本實施例中使用的外池是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。本實施例中使用的內池是聚碳酸酯細胞培養插入物(Millipore，商品號PITP01250)。本實施例有六組，它們是：
(1)與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個16天的γδT細胞懸浮液中的細胞接種到每個內池並培養19小時。
(2)與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與500至1500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞接種到每個內池並培養19小時。
(3)與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell 細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與2500至3500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞接種到每個內池並培養19小時。
(4)與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與5500至6500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞接種到每個內池並培養19小時。
(5)與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與9000至15000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞接種到每個內池並培養19小時。
(6)與30000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把2×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種在外池。貼附2小時後，把孔徑為3μm的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物)插入外池，然後把1×106個每個細胞與25000至35000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞接種到每個內池並培養19小時。
收穫外池中的細胞然後用FITC-共軛的小鼠抗人類TCRVd2 (BioLegend，#331406)和PE-Cy5-共軛的CD3抗體在室溫避光染色10分鐘。然後把細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，接著用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的TCRVd2+/CD3+圈選細胞。
本發明的結果顯示，與移動到含有BT474細胞的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，內池中更多數量的每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個曲妥珠單抗分子複合)能夠穿過再聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有BT474細胞的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個曲妥珠單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞的外池(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞NCI-H508和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的結果顯示： 與移動到含有HCC827細胞(或者HSC-4細胞)的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個西妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有HCC827細胞(或者HSC-4細胞)的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個西妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細胞)的外池(p<0.05)。
此外，請參閱圖13。圖13指出，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，圖13指出：與移動到含有Raji細胞的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個利妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有Raji細胞的外池(p<0.05)； 相比之下，與移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個利妥昔單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)的外池(p<0.05)。
此外，本發明的結果顯示，如果把前文所述曲妥珠單抗複合人類γδT細胞替換成阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有類似於上述實驗的結果。即，本發明的結果顯示：與移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，更多數量的每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞(例如每個細胞與1000、3000、6000、12000或者30000個阿維魯單抗分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜然後移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)的外池(p<0.05)；相比之下，與移動到含有抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)的外池的Ctrl-gdT細胞量相比，相似數量的每個細胞與1000~3000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗阿維魯單抗MDA-MB-468(或者H2087)的外池，並且內池中更多數量的每個細胞與超過3000個阿維魯單抗分子複合的 gdT細胞(例如每個細胞與6000、12000或者30000個avelumab分子複合)能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，並且移動到含有抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)的外池(p<0.05)。
實施例7-2-5與不同數量的成分複合的人類γδT細胞對CD3 + T細胞和CD56 + CD3 - NK細胞遷移能力的影響
本實施例中使用的外池是24孔盤(ThermoScientific，商品號142475)。本實施例中使用的內池是具有3μm孔徑的聚碳酸酯細胞培養插入物(Millicell細胞培養插入物；Millipore，商品號PITP01250)。
本實施方式有14組包括(1)組、(2)組、(3)組、(3)’組、(4)組、(4)’組、(5)組、(5)’組、(6)組、(6)’組、(7)組、(7)’組、(8)組、(8)’組，它們是：
(1)培養基組((1)組)：把gdT細胞的基底培養基(RPMI-1640，購自Sigma-Aldrich、ThermoFisher Scientific、ATCC等)置入外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞和CD56+CD3-的遷移。
(2)僅有標靶細胞組((2)組)：把4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T細胞和CD56+CD3-的遷移。
(3)與0個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個16天γδT細胞懸浮液中的細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((3)組)或者不存在((3)’組)的情況下接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-細胞的遷移。
(4)與1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個每個細胞與500到1500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((4)組)或者不存在((4)’組)的情況下接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-細胞的遷移。
(5)與3000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個每個細胞與2500到3500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((5)組)或者不存在((5)’組)的情況下接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-NK 細胞的遷移。
(6)與6000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個每個細胞與5500到6500個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((6)組)或者不存在((6)’組)的情況下接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
(7)與12000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個每個細胞與9000到15000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((7)組)或者不存在((7)’組)的情況下接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-NK細胞的遷移。
(8)與30000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞組：把1×106個每個細胞與25000到35000個曲妥珠單抗分子複合的人類γδT細胞在4×105個標靶細胞(BT474或者BT474 Clone 5細胞)存在((8)組)或者不存在((8)’組)的情況下接種於外池中培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐 贈者來源的PBMC細胞接種到放置於新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中CD3+T和CD56+CD3-細胞的遷移。
收穫外池中的細胞並且用CD3抗體在室溫避光染色10分鐘。然後把細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，並且用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD3+和CD56+CD3-圈選細胞。
本發明的發明人預期：內池中大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜並且移動到含有BT474細胞和每個細胞與至少1000個曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗曲妥珠單抗的BT474 Clone 5細胞和每個細胞與小量曲妥珠單抗分子複合的gdT細胞的外池，直到複合的曲妥珠單抗的數量達到每個細胞超過3000個曲妥珠單抗分子。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成西妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞NCI-H508和HT-29(或者HSC-4和SAS)，將會有類似於前文所述實驗的結果。即，本發明的發明人預期大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，然後移動到含有HCC827細胞(或者HSC-4細胞)和每個細胞與至少1000個西妥昔單抗分子複合的gdT細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗西妥昔單抗的HT-29細胞(或者SAS細 胞)和每個細胞與小量西妥昔單抗分子複合的gdT細胞的外池，直到複合的西妥昔單抗數量達到每個細胞超過3000個西妥昔單抗分子。
此外，本發明的發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成利妥昔單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換為成標靶細胞Raji和Raji-2R80(或者Raji-2RH)，將會有與前文所述實驗相似的結果。即，本發明的發明人預期大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，然後移動到含有Raji細胞和每個細胞與至少1000個利妥昔單抗分子複合的gdT細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗利妥昔單抗的Raji-2R80(或者Raji-2RH)和每個細胞與小量利妥昔單抗分子複合的gdT細胞的外池，直到複合的利妥昔單抗的數量達到每個細胞超過3000個利妥昔單抗分子。
此外，本發明人預期，如果把前文所述曲妥珠單抗複合的人類γδT細胞替換成阿維魯單抗複合的人類γδT細胞，並且把BT474和BT474 Clone 5細胞替換成標靶細胞MDA-MB-231和MDA-MB-468(或者H1650和H2087)，將會有與前文所述實驗相似的結果。即，本發明的發明人預期，大量的CD3+T細胞能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜，然後移動到含有MDA-MB-231細胞(或者H1650)和每個細胞與至少1000個阿維魯單抗分子複合的gdT細胞的外池，但是CD3+T細胞不能夠穿過在聚碳酸酯細胞培養插入物底部的膜來移動到含有抗阿維魯單抗的MDA-MB-468(或者H2087)和每個細胞與小量阿維魯單抗分子複合的gdT細胞的外池，直到複合的阿維魯單抗數量達到每個細胞超過3000個阿維魯 單抗分子。
實施例8：與被斷定在治療疾病中是無效的或者沒有足夠的功效的成分複合的細胞毒性細胞，以及該成分複合的細胞毒性細胞在治療疾病中的用途
鈷妥珠單抗(Codrituzumab)(GC33)是一種針對磷脂肌醇聚糖3(glypican-3，GPC3)的抗體。磷脂肌醇聚糖3(GPC3)在一些類型的腫瘤例如肝細胞癌中被過度表達。儘管鈷妥珠單抗在第一期臨床試驗中是成功的，但是它在第二期臨床試驗中失敗了，因此鈷妥珠單抗不是FDA批准的用來治療腫瘤例如肝細胞癌的成分(Takahiro Nishida和Hiroaki Kataoka，2019)。
下面描述了製備鈷妥珠單抗複合的自然殺手細胞和鈷妥珠單抗複合的γδT細胞的具體實施方式，以及其用途，但是本發明的應用不限於此，其意味著任何被斷定為在治療疾病上是無效的或者沒有足夠的功效的成分被與任何細胞毒性細胞結合均包括在本發明的範圍內。
實施例8-1：與被斷定為在治療疾病上是無效的或者沒有足夠的功效的成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞，以及該成分複合的人類CD16 + 自然殺手細胞在治療疾病上的用途
實施例8-1-1：鈷妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞殺傷人類肝細胞癌細胞系的細胞毒性功能
本實施例使用xCELLigence即時細胞分析系統(xCELLigence RTCA system，ACEA Biosciences Inc.，美國)來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒性能力：
(1)xCELLigence E-盤中的孔被分為對照孔、鈷妥珠單抗C2實驗孔、鈷妥珠單抗C5實驗孔、鈷妥珠單抗codrituzumab C10實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET10實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET10實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔。
(2)本實施例中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0186-44
經23天培養的oNK細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0186-45
鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞；以及
(3)本實施例中所使用的標靶細胞為人類肝細胞癌細胞系HuH-7(JCRB0403，購自JCRB)。
把HuH-7標靶細胞接種於對照孔、鈷妥珠單抗C2實驗孔、鈷妥珠單抗C5實驗孔、鈷妥珠單抗C10實驗孔、Ctrl-oNK ET2實驗孔、Ctrl-oNK ET5實驗孔、Ctrl-oNK ET10實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET10實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔；因此，每個孔包含20000個標靶細胞，並且將細胞靜置30分鐘。
把40000、100000或者200000個鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞分別加到ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔、ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔和ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔；因此，效 應細胞數(鈷妥珠單抗複合人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的總細胞)對HuH-7細胞(標靶細胞)數的比例為2、5和10。
把經23天培養的oNK懸浮液中的40000、100000或者200000個細胞和1.10、2.75或者5.5ng的鈷妥珠單抗(購自Creative Biolabs)兩者分別添加到『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』、『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』，或者『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』。因此，效應細胞數(經23天培養的oNK懸浮液中的總細胞)對HuH-7細胞(標靶細胞)數的比例為2、5或者10；『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』、『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』或者『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』中鈷妥珠單抗的量分別與『ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔』、『ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔』或者『ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔』中聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
把1.10、2.75或者5.5ng的鈷妥珠單抗(購自Creative Biolabs)分別添加到『鈷妥珠單抗C2實驗孔』、『鈷妥珠單抗C5實驗孔』或者『鈷妥珠單抗C10實驗孔』。因此，『鈷妥珠單抗C2實驗孔』、『鈷妥珠單抗C5實驗』或者『鈷妥珠單抗C10實驗孔』中鈷妥珠單抗的量分別與『ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔』、『ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔』、『ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔』中聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
把與樣品十分之一等體積的裂解緩衝溶液添加入標靶細胞最大化裂解對照孔；無樣品或裂解緩衝溶液被添加到對照孔。把xCELLigence E-盤放置於xCELLigence即時細胞分析系統中以檢測在37℃和5%二氧化碳的條件下細胞指數(cell index，CI)的即時變化。請參考圖 14。圖14顯示鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞(ACE-GPC3-oNK)的殺傷效果顯著性地高於人類CD16+自然殺手細胞(Ctrl-oNK)的殺傷效果。
本發明的發明人預期：通過比較鈷妥珠單抗C2實驗孔(或者鈷妥珠單抗C5實驗孔或者鈷妥珠單抗C10實驗孔)和Ctrl-oNK ET2實驗孔(或者Ctrl-oNK ET5實驗孔或者Ctrl-oNK ET10實驗孔)的細胞毒性功效，預期『ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔』(或者『ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔』或者『ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔』)中的鈷妥珠單抗和Ctrl-oNK在細胞毒性功效上出乎意料地表現出協同作用，並且『ACE-GPC3-oNK ET2實驗孔』(或者『ACE-GPC3-oNK ET5實驗孔』或者『ACE-GPC3-oNK ET10實驗孔』)中細胞的殺傷能力顯著性地高於『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』(或者『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』或者『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』)中細胞的殺傷能力。
實施例8-1-2：鈷妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞對個體中肝細胞癌(固體腫瘤)的細胞毒性
在第0天把表達螢光酵素的肝細胞癌細胞系HuH-7(JCRB1600，購自JCRB)經腹膜注射到25隻雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)的每一隻中。把小鼠隨機分成5組。
(1)在第0、3、7、10、14和17天用經24天培養的oNK細胞懸浮液中的5000000個細胞處理Ctrl-oNK組中的小鼠。
(2)在第0、3、7、10、14和17天用鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的5000000個細胞處理ACE-GPC3-oNK組中的小鼠。
(3)在第0、3、7、10、14和17天用經23天培養的oNK細胞懸浮液中的5000000個細胞和2.75ng的鈷妥珠單抗(購自Creative BioLabs)處理Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗組的小鼠。因此，施用到Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗組小鼠的鈷妥珠單抗量(2.75ng的鈷妥珠單抗)，與施用到ACE-GPC3-oNK組小鼠的聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
(4)在第0、3、7、10、14和17天用2.75ng鈷妥珠單抗處理鈷妥珠單抗組中的小鼠。
(6)在第0、3、7、10、14和17天用賦形劑(僅細胞培養基例如實施例1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)處理對照組中的小鼠。
在第0、3、7、10、14、和17天、以及第17天至實驗結束間的每週，利用AMI HTX(光譜成像)檢測冷光。
本發明的發明人預期：
(1)小鼠的冷光圖像指出：用鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞處理小鼠，生物冷光圖像顯示出了顯著性的減少。因此，本發明的成分複合的細胞毒性細胞能夠治療個體的固體腫瘤以及治療位於免疫抑制微環境的異常細胞例如固體腫瘤。
(2)與『Ctrl-oNK組』和『鈷妥珠單抗組』小鼠的細胞毒性功效相比，預期鈷妥珠單抗和Ctrl-oNK在『ACE-GPC3-oNK組』小鼠的細胞毒性功效上出人意料地表現出協同作用，並且『ACE-GPC3-oNK組』小鼠的細胞毒性功效顯著性地高於『Ctrl-oNK和鈷妥珠單抗組』小鼠的細胞毒性功效。
實施例8-1-3：鈷妥珠單抗複合的人類CD16 + 自然殺手細胞對CD3 + T細胞遷移能力的影響
本實施例中有四組，其為(1)培養基組、(2)HuH-7組、(3)ACE-GPC3-oNK組以及(4)HuH-7和ACE-GPC3-oNK組。
(1)培養基組：把細胞培養基(如實施例1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)添加到外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(2)HuH-7組：把4×105個HuH-7細胞(標靶細胞)接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
ACE-GPC3-oNK組：把1×106個鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液細胞培養基(例如實驗1-1-1中描述的細胞培養基、DMEM培養基或者XVIVO 10培養基)中的細胞添加到外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(4)HuH-7和ACE-GPC3-oNK組：把4×105個HuH-7細胞(標靶細胞)和1×106個鈷妥珠單抗複合的人類CD16+自然殺手細胞懸浮液中的細胞接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐 贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
收穫外池中的細胞然後用CD3抗體在室溫避光染色10分鐘。然後把細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。把上清液去除，然後用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並且通過流式細胞術分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD3+圈選細胞。
本發明的發明人預期在包含標靶細胞例如HuH-7細胞的外池(病灶模擬)中的成分複合的細胞毒性細胞，將顯著性地增加CD3+T細胞進入病灶的遷移能力。通過比較HuH-7組和ACE-GPC3-oNK組的CD3+T細胞遷移功效，預期HuH-7和ACE-GPC3-oNK組外池中標靶細胞(例如HuH-7)和成分複合的細胞毒性細胞在CD3+T細胞遷移效能上出人意料地表現出協同效應。
實施例8-2：與被斷定為在治療疾病上是無效的或者沒有足夠的功效的成分複合的人類γδT細胞，以及該成分複合的人類γδT細胞在治療疾病上的用途
實施例8-2-1：鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞殺傷人類肝細胞癌細胞系的細胞毒性功能
本實施例中使用xCELLigence即時細胞分析系統(xCELLigence RTCA system，ACEA Biosciences Inc.，美國)來檢測效應細胞對標靶細胞的細胞毒殺能力：
(1)xCELLigence E-盤中的孔被分為對照孔、鈷妥珠單抗C2實驗孔、鈷妥珠單抗C5實驗孔、鈷妥珠單抗C10實驗孔、Ctrl-gdT ET2 實驗孔、Ctrl-gdT ET5實驗孔、Ctrl-gdT ET10實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET10實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔。
(2)本實施例中使用的效應細胞為
Figure 111147737-A0305-02-0192-46
16天的γδT細胞懸浮液中的細胞，或者
Figure 111147737-A0305-02-0192-47
鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞；以及
(3)本實驗中使用的標靶細胞為人類肝細胞癌細胞系HuH-7(JCRB0403，購自JCRB)。
把HuH-7標靶細胞接種於對照孔、鈷妥珠單抗C2實驗孔、鈷妥珠單抗C5實驗孔、鈷妥珠單抗C10實驗孔、Ctrl-gdT ET2實驗孔、Ctrl-gdT ET5實驗孔、Ctrl-gdT ET10實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET2實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET5實驗孔、Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET10實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔、ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔以及標靶細胞最大化裂解對照孔；因此，每個孔包含20000個標靶細胞，並且允許細胞靜置30分鐘。
把40000、100000或者200000個鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞，分別添加到ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔、ACE-gdT-GPC3ET5實驗孔和ACE-gdT-GPC3ET10實驗孔；因此，效應細胞數(鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的總細胞)對HuH-7細胞(標靶細胞)數的比例為2、5和10。
把16天的γδT細胞懸浮液中的40000、100000或者200000 個細胞和1.10、2.75或者5.5ng的鈷妥珠單抗(購自Creative Biolabs)全部分別添加到『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』、『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』，或者『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』。因此，效應細胞數(16天的γδT細胞懸浮液中的總細胞)對HuH-7細胞(標靶細胞)數的比例為2、5或者10；『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』、『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』或者『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』中鈷妥珠單抗的量分別與『ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔』、『ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔』或者『ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔』中聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
把1.10、2.75或者5.5ng的鈷妥珠單抗(購自Creative Biolabs)分別添加到『鈷妥珠單抗C2實驗孔』、『鈷妥珠單抗C5實驗孔』或者『鈷妥珠單抗C10實驗孔』。因此，『鈷妥珠單抗C2實驗孔』、『鈷妥珠單抗C5實驗』或者『鈷妥珠單抗C10實驗孔』中鈷妥珠單抗的量分別與『ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔』、『ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔』、『ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔』中聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
把與樣品十分之一等體積的裂解緩衝溶液加入標靶細胞最大化裂解對照孔中；無樣品或裂解緩衝溶液被添加到對照孔中。把xCELLigence E-盤放置於xCELLigence即時細胞分析系統中以檢測在37℃和5%二氧化碳的條件下細胞指數(CI)的實時變化。請參考圖15。圖15顯示，與鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞(Cryo-ACE-NgdT-GPC3)的殺傷效果顯著高於人類γδT細胞(Cryo-Ctrl-NgdT)的殺傷效果。
本發明的發明人預期：通過比較鈷妥珠單抗C2實驗孔(或 者鈷妥珠單抗C5實驗孔或者鈷妥珠單抗C10實驗孔)和Ctrl-gdT ET2實驗孔(或者Ctrl-gdT ET5實驗孔或者Ctrl-gdT ET10實驗孔)的細胞毒性功效，預期『ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔』(或者『ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔』或者『ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔』)中的鈷妥珠單抗和Ctrl-gdT在細胞毒性功效上出乎意料地表現出協同效應，並且『ACE-gdT-GPC3 ET2實驗孔』(或者『ACE-gdT-GPC3 ET5實驗孔』或者『ACE-gdT-GPC3 ET10實驗孔』)中細胞的殺傷能力顯著高於『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET2實驗孔』(或者『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET5實驗孔』或者『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗ET10實驗孔』)中細胞的殺傷能力。
實施例8-2-2：鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞對個體的肝細胞癌(固體腫瘤)的細胞毒性
在第0天把表達螢光酵素的肝細胞癌細胞系HuH-7(JCRB1600，購自JCRB)經腹膜注射到25隻雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)的每一隻中。把小鼠隨機分成5組。
(1)在第0、3、7、10、14和17天，用16天的γδT細胞懸浮液中的5000000個細胞處理Ctrl-gdT組中的小鼠。
(2)在第0、3、7、10、14和17天，用鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的5000000個細胞處理ACE-gdT-GPC3組中的小鼠。
(3)在第0、3、7、10、14和17天，用16天的γδT細胞懸浮液中的5000000個細胞和2.75ng的鈷妥珠單抗(購自Creative BioLabs)處理Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗組的小鼠。因此，施用到Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗組小鼠的鈷妥珠單抗量(2.75ng的鈷妥珠單抗)和施用到ACE-gdT-GPC3組小 鼠的聯接到細胞的鈷妥珠單抗總量相同。
(4)在第0、3、7、10、14和17天，用2.75ng的鈷妥珠單抗處理鈷妥珠單抗組中的小鼠。
(5)在第0、3、7、10、14和17天，用賦形劑(僅細胞培養基例如實施例1-2-1中描述的完全生長培養基)處理對照組小鼠。
在第0、3、和7天、以及第7天至實驗結束間的每週，利用AMI HTX(光譜成像)檢測冷光。
本發明的發明人預期：
(1)小鼠的冷光圖像指出：用鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞處理小鼠，其生物冷光圖像顯示出顯著性的減少。因此，本發明的成分複合的細胞毒性細胞能夠治療個體的固體腫瘤以及治療位於免疫抑制微環境的異常細胞例如固體腫瘤。
(2)與『Ctrl-gdT組』和『鈷妥珠單抗組』小鼠的細胞毒性功效相比，預期鈷妥珠單抗和Ctrl-gdT在『ACE-gdT-GPC3組』小鼠的細胞毒性功效中出人意料地表現出協同作用，並且『ACE-gdT-GPC3組』小鼠的細胞毒性功效顯著性地高於『Ctrl-gdT和鈷妥珠單抗組』小鼠的細胞毒性功效。
實施例8-2-3：鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞對CD3 + T細胞遷移能力的影響
本實施例中有四組，其為(1)培養基組、(2)HuH-7組、(3)ACE-gdT-GPC3組以及(4)HuH-7和ACE-gdT-GPC3組。
(1)培養基組：把細胞培養基(例如實施例1-2-1中描述的 完全生長培養基)加入外池。兩小時後，把內池插到外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(2)HuH-7組：把4×105個HuH-7細胞(標靶細胞)接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(3)ACE-gdT-GPC3組：把1×106個鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞，接種於外池並培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
(4)HuH-7和ACE-gdT-GPC3組：把1×106個鈷妥珠單抗複合的人類γδT細胞懸浮液中的細胞和4×105個HuH-7細胞(標靶細胞)接種於外池培養19小時。把上清液轉移入新的外池。然後把1×106個捐贈者衍生的PBMC細胞接種到放置在新外池中的內池裡，用於後續3小時的培養，以評估PBMC細胞中的CD3+T細胞的遷移。
收穫外池中的細胞然後用CD3抗體在室溫避光染色10分鐘。然後把細胞混合物在室溫以400xg離心3分鐘。去除上清液，然後用1mL的DPBS重新懸浮細胞沉澱物。重複離心，並以流式細胞儀分析0.5mL的DPBS重新懸浮後的CD3+圈選細胞。
本發明的發明人預期在包含標靶細胞例如HuH-7細胞的外 池(病灶模擬)中的成分複合的細胞毒性細胞將顯著性地增加CD3+T細胞進入病灶的遷移能力。通過比較HuH-7組和ACE-gdT-GPC3組的CD3+T細胞遷移功效，預期HuH-7和ACE-gdT-GPC3組外池中的標靶細胞(例如HuH-7)和成分複合的細胞毒性細胞在CD3+T細胞遷移功效上出人意料地表現出協同效應。
從本發明的實施例、個體的免疫系統、和成分的醫藥機制來看，本領域的技術人員將理解，可以使用基於本發明揭露的內容、教導或指出的所有成分與所有細胞毒性細胞複合(complexed with)(或共軛(conjugated with)或聯接(linked to))能夠用來提高該成分(例如FDA批准的藥物或者第一期臨床試驗取得成功但是第二期或第三期臨床試驗失敗的成分)在治療對該成分有抗性、難治性、不敏感、無反應性或反應性不足的異常細胞中的有效性。因此，本發明的成分複合的細胞毒性細胞可以被用來治療與多種疾病相關的多種異常細胞例如過度增殖性疾病、晚期疾病、HIV或者其他病毒感染性疾病、真菌感染性疾病、細菌感染性疾病、原蟲感染性疾病、自身免疫性疾病、神經元疾病、造血細胞相關的疾病、代謝綜合症以及致病性疾病。
以上描述僅為本發明的較佳實施例，並非用以限制本發明的專利申請範圍。因此，任何不脫離本文所公開的精神的改動或改變，均應包含在本發明專利申請的範圍內。
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Claims (47)

  1. 一種效應細胞用於製備治療一疾病之醫藥組成物的用途；其中該效應細胞包含一表面和複合到該表面的一靶向單元群體；其中該靶向單元群體中的靶向單元包含一第一成分；並且該第一成分的特徵在於：(a)該第一成分與疾病相關的一異常細胞所表達的一生物標誌物表現出特異性的交互作用；(b)該第一成分非由該效應細胞製得(produced)；以及(c)該第一成分被確定為在治療患有該疾病的個體上是無效的，或患有該疾病的個體對該第一成分是有抗性的，或者該第一成分在臨床試驗結束時，被斷定為在治療該疾病是無效的。
  2. 一種效應細胞用於製備增加免疫細胞進入一疾病的病灶的遷移能力之醫藥組成物的用途；其中該效應細胞包含一表面和複合到該表面的一靶向單元群體；其中，在該靶向單元群體中的靶向單元包含一第一成分；並且該第一成分的特徵在於：(a)該第一成分與位於該疾病的病灶的一異常細胞所表達的一生物標誌物表現出特異性的交互作用；(b)該第一成分非由該效應細胞製得(produced)；以及(c)該第一成分被確定為在治療患有該疾病的一個體上是無效的，或患有該疾病的該個體對該第一成分是有抗性的，或者該第一成分在臨床試驗結束時，被斷定為在治療該疾病是無效的。
  3. 一種減少一疾病的相關的一異常細胞數量的體外方法，包括將複數個該疾病相關的該異常細胞與一有效量的效應細胞接觸；該效應細胞包含一表面和複合到該表面的一靶向單元群體；其中，該靶向單元群體中的靶向單元包含一第一成分；並且該第一成分的特徵在於：(a)該第一成分與該疾病相關的該異常細胞所表達的一生物標誌物表現出特異性的交互作用；(b)該第一成分非由該效應細胞製得(produced)；以及(c)該第一成 分被確定為在治療與該疾病相關的該異常細胞上是無效的，或該疾病相關的該異常細胞對該第一成分是有抗性的。
  4. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞是細胞毒性細胞。
  5. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中每個該效應細胞含有超過3000個靶向單元。
  6. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞是CD16+細胞。
  7. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分包含一Fc受體識別區。
  8. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分是誘導抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)的IgG亞型單株抗體(monoclonal antibody of an IgG subtype)；或者該第一成分是其他抗體；或者該第一成分包含抗原結合單元(antigen-binding unit)。
  9. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分不是一核酸。
  10. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞能夠介導(mediating)抗體依賴性細胞毒殺作用(ADCC)反應。
  11. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞能夠誘導CD3+T細胞的遷移(migration)。
  12. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中，與表達該生物標誌物的標靶細胞共同培養後，該效應細胞表達CD107a。
  13. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中，與表達該生物標誌物的標靶細胞共同培養後，該效應細胞表達干擾素-γ(IFN- γ)或者腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，或者其組合。
  14. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分是FDA批准用來治療該疾病的成分。
  15. 如申請專利範圍第14項中所述之用途，其中該第一成分為利妥昔單抗(rituximab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、阿崙單抗(alemtuzumab)、阿維魯單抗(avelumab)、達雷木單抗(daratumumab)、妥珠單抗(elotuzumab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、沃斯妥珠單抗(vorsetuzumab)、庫沙珠單抗(cusatuzumab)、德瓦魯單抗(durvalumab)、帕尼單抗(panitumumab)或者阿瑪西單抗(amatuximab)。
  16. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分已經在第一期臨床試驗中取得成功但不是FDA批准用來治療該疾病的成分。
  17. 如申請專利範圍第16項中所述之用途，其中該第一成分是鈷妥珠單抗(codrituzumab)、索拉珠單抗(solanezumab)、bimagrumab、塔羅金單抗(tralokinumab)或者巴可西珠單抗(bococizumab)。
  18. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞源於自體效應細胞或者同種異體的效應細胞。
  19. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞係在施用前沒有誘導細胞擴增的情況下被施用。
  20. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該疾病選自由過度增生的疾病、晚期疾病、HIV或其他病毒感染性疾病、真菌感染性疾病、細菌感染性疾病、原蟲感染性疾病、自身免疫性疾病、神經元疾病、造血細胞相關的疾病、代謝綜合症和致病性疾病所組成的群組。
  21. 如申請專利範圍第20項中所述之用途，其中該疾病係選自由 固體腫瘤和液體腫瘤所組成的群組的過度增生的疾病或者晚期疾病。
  22. 如申請專利範圍第21項中所述之用途，其中該第一成分與該生物標誌物表現出特異性的交互作用，且該生物標誌物選自由癌症抗原、醣脂、醣蛋白、呈現於一造血群系細胞上的分化抗原叢、γ-麩胺醯基轉胜肽酶(gamma-glutamyltranspeptidase)、黏附蛋白、荷爾蒙、生長因子、細胞激素、配體受體、離子通道、膜結合形式的一免疫球蛋白μ鏈、甲型胎兒蛋白(alfa-fetoprotein)、C-反應蛋白、嗜鉻血液細胞分泌素A、上皮黏蛋白抗原、人類上皮細胞特異抗原、路易士(a)(Lewis(a))抗原、多重抗藥性相關蛋白、Neu致癌基因蛋白、神經元特異性烯醇酶(enolase)、P型醣蛋白、多重抗藥性相關抗原、p170、多重抗藥性相關抗原、前列腺特異性抗原、神經细胞黏附分子(NCAM)、神經節苷脂分子、MART-1、熱休克蛋白、唾液酸多醣(sialylTn)、酪胺酸酶、黏蛋白-1(MUC-1)、HER-2/neu、KSA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、p53、RAS、上皮成長因子受體(EGF-R)、血管內皮生長因子(VEGF)、和黑色素瘤相關抗原(MAGE)或者其任何組合；或者所述第一成分與選自由下列組成的群組的癌症抗原表現出特異性的交互作用，HER2/neu(ERBB2)、人類表皮生長因子受體3(HER3(ERBB3))、上皮成長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、GD2、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA4)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33(Siglec-3)、CD52(CAMPATH-1抗原)、CD326(上皮細胞黏附分子(EpCAM))、CA-125(黏蛋白16(MUC16))、基質金屬蛋白酶9(MMP9)、DLL3、CD274(程式性細胞死亡-配體1(PD-L1))、癌胚抗原(CEA)、MSLN(間皮素(mesothelin))、糖抗原19-9(CA19-9)、CD73、CD205(DEC205)、CD51、c-MET、TRAIL-R2、胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)、CD3、巨噬細 胞移行抑制因子(MIF)、葉酸受體α(folate receptor alpha；FOLR1)、聚落刺激因子1(CSF1)、OX-40、CD137、運鐵蛋白受體(TfR)、黏蛋白1(MUC1)、CD25(介白素-2受體(IL-2R))、CD115(聚落刺激因子1受體(CSF1R))、介白素1B(IL1B)、CD105(內皮糖蛋白(Endoglin))、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(KIR)、CD47、癌胚抗原(CEA)、介白素-17A(IL-17A)、DLL4、CD51、血管生長素2(angiopoietin2)、神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1)、CD37、CD223(淋巴細胞活化基因-3(LAG-3))、CD40、LIV-1(SLC39A6)、CD27(腫瘤壞死因子受體超家族7(TNFRSF7))、CD276(B7-H3)、Trop2、密連蛋白1(Claudin1，CLDN1)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、TIM-1(HAVcr-1)、癌胚抗原相關細胞黏附分子5(CEACAM5)、CD70、LY6E、B細胞成熟抗原(BCMA)、CD135(FLT3)、APRIL、TF(F3)、nectin-4、FAP、GPC3、纖維母細胞生長因子受體3(FGFR3)、殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors；KIRs)、ROR1、ROR2、程式性細胞死亡-1(CD279)、細胞毒性T細胞抗原-4(CTLA-4，CD152)、TIM-3(HAVCR2)、免疫檢查點受體(immune checkpoint receptor)、免疫檢查點受體配體、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor)、腫瘤壞死因子(TNF)受體蛋白(TNF receptor protein)、免疫球蛋白、細胞激素受體、整合素(integrin)和活化自然殺手細胞的受體(activating NK cell receptors)或者其組合所組成的群組。
  23. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該靶向單元是通過共軛(conjugated)到該第一成分的一第一鏈接器(first linker)和共軛到該效應細胞表面的一第二鏈接器(second linker)之間的交互作用而複合(complexed)到該效應細胞的表面。
  24. 如申請專利範圍第23項中所述之用途，其中該第一鏈接器共 價性地(covalently)或非共價性地共軛到該第一成分；或者該第二鏈接器共價性地或非共價性地共軛到該效應細胞的表面；或其組合。
  25. 如申請專利範圍第23項中所述之用途，其中該第一鏈接器或該第二鏈接器共軛到該第一成分或該效應細胞的表面的天然官能基團，其中該天然官能基團是胺基酸、糖或胺基。
  26. 如申請專利範圍第25項中所述之用途，其中該天然官能基團包括糖、胺基或者胺基酸。
  27. 如申請專利範圍第26項中所述之用途，其中該天然官能基團不是疊氮修飾的糖；抑或是，該天然官能基團包括胺基酸選自由離胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、天冬胺酸、麩胺酸和色胺酸所組成的群組。
  28. 如申請專利範圍第25項中所述之用途，其中該第二鏈接器直接地、共價性地聯接到該效應細胞的天然官能基團；其中該第二鏈接器與效應細胞的天然官能基團之間的直接、共價性聯接是通過把所述效應細胞與所述第二鏈接器接觸來製備，使得第二鏈接器直接地、共價性地聯接到該天然官能基團。
  29. 如申請專利範圍第23項中任一項所述之用途，其中該第一鏈接器和該第二鏈接器選自由以下組成的群組：DNA結合結構域和標靶DNA；白胺酸拉鍊和標靶DNA；生物素和卵白素；生物素和鏈霉抗生物素蛋白；攜鈣素結合蛋白和攜鈣素；荷爾蒙和荷爾蒙受體；凝集素和碳水化合物；細胞膜受體和受體配體；酵素和受質；抗原和抗體；促效劑和拮抗劑；多核苷酸雜交序列；適體和標靶；以及鋅指和標靶DNA。
  30. 如申請專利範圍第23項中任一項所述之用途，其中兩個鏈接器中的至少一個含有PEG區或NHS酯；或者其中該第一成分通過耦合基團 (coupling group)共軛到該第一鏈接器，其中耦合基團是NHS酯或其他經活性化的酯、鹵烷或鹵醯、雙功能交聯劑(a bifunctional crosslinker)或順丁烯二醯亞胺基團(maleimide group)。
  31. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該第一成分和該效應細胞被1nm到400nm的長度隔開。
  32. 如申請專利範圍第23項中任一項所述之用途，其中該第一鏈接器是一第一多核苷酸，並且該第二鏈接器是一第二多核苷酸。
  33. 如申請專利範圍第32項中所述之用途，其中該兩個多核苷酸中的至少一個的長度為4nt到500nt。
  34. 如申請專利範圍第32項中所述之用途，其中該第一多核苷酸包含第一單鏈區，並且該第二多核苷酸包含與第一單鏈區互補的第二單鏈區，其中該靶向單元通過第一單鏈區和與第一單鏈區互補的第二單鏈區之間的交互作用複合到該效應細胞的表面。
  35. 如申請專利範圍第23項中任一項所述之用途，其中該第一鏈接器包含一第一反應基團，且該第二鏈接器包含一第二反應基團，並且其中該靶向單元通過由第二反應基團和第一反應基團之間的反應形成的共價鍵複合到該效應細胞的表面。
  36. 如申請專利範圍第4項中所述之用途，其中該細胞毒性細胞是免疫細胞、淋巴球、自然殺手細胞、γδT細胞、其他T淋巴球、巨噬細胞、單核細胞、嗜中性白血球、樹突細胞、細胞激素誘導的殺手細胞(cytokine-induced killer cells，CIK)、淋巴激素活化的殺手細胞(lymphokine-activated killer cells，LAK)、細胞溶解型T細胞(cytolytic T cells，CTL)或腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。
  37. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應 細胞在免疫功能不全的小鼠中是非致瘤性的；或者該效應細胞被γ射線照射後，在同種異體的個體中是非致瘤性的。
  38. 如申請專利範圍第4項中所述之用途，其中該細胞毒性細胞是自然殺手細胞，其特性在於：(A)它寄存在NPMD具有寄存編號NITE BP-03017；(B)它包含一條染色體，並且該染色體的染色體去氧核醣核酸序列與寄存在NPMD具有寄存編號NITE BP-03017的自然殺手細胞相應染色體的染色體去氧核醣核酸序列是至少80%相同的；或者(C)它具有以下特性：i)表達CD16受體；ii)在繼代培養至少3個月後保有其增殖的能力；以及iii)x)不包含合成的、基因改造的和/或特意地遞送的編碼CD16受體的多核苷酸，或者y)通過使用ddPCR系統分析細胞毒性細胞的基因組去氧核醣核酸，CD16 F176F探針可檢測到的去氧核醣核酸分子與CD16 F176V探針可檢測到的去氧核醣核酸分子的比例等於或大於1，其中CD16 F176F探針的序列是SEQ ID NO：27並且CD16 F176V探針的序列是SEQ ID NO：28。
  39. 如申請專利範圍第38項中所述之用途，其中該細胞毒性細胞進一步的特性在於：(1)該細胞毒性細胞和自然殺手細胞系NK3.3係源自不同的個體；(2)該細胞毒性細胞源自患有癌症的個體；(3)該細胞毒性細胞源自高加索男性；或者(4)該細胞毒性細胞和具有寄存編號ATCC CRL-2407的自然殺手細胞係源自同一個體； 或其任何組合。
  40. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞更進一步表達CD2、CD45、CD4、CD25、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46、CD27、OX40、CD107a、NKG2A、程式性細胞死亡-1(PD-1)、TIGIT、SIRPα或者CD158，或者其任何組合。
  41. 如申請專利範圍第4項中所述之用途，其中該細胞毒性細胞是γδT細胞。
  42. 如申請專利範圍第41項中所述之用途，其中該細胞毒性細胞是Vδ1T細胞、Vδ2T細胞、Vδ3T細胞、Vδ5T細胞或者Vγ9Vδ2T細胞。
  43. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該效應細胞更進一步表達CD3、NKp46、CD56、CD16、NKG2D、NKp44、CD25、CD38、程式性細胞死亡-1、NKp30、CD18、TIGIT、DNAM-1、CD36、CD103、CCR7、CXCR3、干擾素γ、顆粒酶B或者CD69，或者其任何組合。
  44. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中，與表達該生物標誌物的標靶細胞共同培養後，該效應細胞進一步表達顆粒酶B。
  45. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中：(1)至少4%的該效應細胞每個細胞表達至少400個NKp46分子；(2)至少10%的該效應細胞每個細胞表達至少400個CD56分子；(3)至少10%的該效應細胞每個細胞表達至少400個CD16分子；(4)至少30%的該效應細胞每個細胞表達至少40個NKG2D分子；(5)至少1%的該效應細胞每個細胞表達至少400個NKp44分子；(6)至少80%的該效應細胞每個細胞表達至少400個CD69分子；或(7)至少40%的該效應細胞每個細胞表達至少400個CXCR3分子； 或其任何組合。
  46. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中：(1)至少4%的該效應細胞表達NKp46，其中表達NKp46的效應細胞平均每個細胞表達至少400個NKp46分子；(2)至少10%的該效應細胞表達CD56，其中表達CD56的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD56分子；(3)至少10%的該效應細胞表達CD16，其中表達CD16的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD16分子；(4)至少30%的該效應細胞表達NKG2D，其中表達NKG2D的效應細胞平均每個細胞表達至少40個NKG2D分子；(5)至少1%的該效應細胞表達NKp44，其中表達NKp44的效應細胞平均每個細胞表達至少400個NKp44分子；(6)至少80%的該效應細胞表達CD69，其中表達CD69的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CD69分子；或者(7)至少40%的該效應細胞表達CXCR3，其中表達CXCR3的效應細胞平均每個細胞表達至少400個CXCR3分子；或者其任何組合。
  47. 如申請專利範圍第1-3項中任一項所述之用途，其中該靶向單元是第一種類型的靶向單元，並且該效應細胞更包含複合到效應細胞表面的一第二種類型的靶向單元群體，其中該第二種類型靶向單元群體中的靶向單元包含一第二成分，其特徵在於(a)該第二成分表現出與該生物標誌物間或與該異常細胞表達的另一生物標誌物間的特異性結合；且(b)該第二成分不是由該效應細胞產生。
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