TWI841543B - 生產海藻糖之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種生產海藻糖之方法，包括以任何順序混合並反應下列之步驟，(i) 至少一種α-磷酸化酶，其能夠催化來自一糖原料及來自至少一磷源的α-D-葡萄糖1-磷酸中間體之產物；(ii) 至少一種海藻糖磷酸化酶，其能夠催化來自一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與一葡萄糖基質所產生的海藻糖，其中該海藻糖磷酸化酶為一海藻糖磷酸化酶變體，其具有與一野生型海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列在至少一個胺基酸位置上不同的胺基酸序列，(iii) 至少一種糖原料，其透過該α-磷酸化酶的催化作用產生一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一副產物；以及(iv) 至少一種選自由一磷酸及該磷酸的一無機鹽所組成之群組的磷源。
Description
本發明涉及一種生產海藻糖之方法。更具體而言，本發明涉及透過使用廉價的糖原料與經由隨後的酶促反應具有高產率的不同的穩定酶來生產海藻糖之方法，包括使一葡糖基單醣及α-D-葡萄糖1-磷酸反應、將葡萄糖及α-D-葡萄糖1-磷酸轉化為海藻糖及無機磷酸鹽之步驟。本發明之方法包括使用具有功能特徵的酶與酶變體，該功能特徵導致該生產海藻糖之方法的效力提高，這類用於生產海藻糖的酶例如海藻糖磷酸化酶、α-磷酸化酶及/或葡萄糖異構酶。
本領域已經描述了數種以生物技術生產海藻糖((2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羥甲基)-6- [(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羥基-6-(羥甲基)氧雜-2-基]氧基氧雜-3,4,5-三醇)的不同合成途徑，使用不同的原料如麥芽糖、澱粉以及蔗糖，包括不同的酶與不同的酶活性。
例如，美國專利US 5,565,341，US 5,643,775，以及PCT專利公開WO 1998/044116揭露了一種生產海藻糖之方法，透過在磷酸化酶存在下使一糖原料及一磷酸及/或其無機鹽作用以產生α-葡萄糖1-磷酸鹽，並在一海藻糖磷酸化酶存在下使產生的α-葡萄糖1-磷酸與葡萄糖接觸。
磷酸化酶為催化從一無機磷酸鹽向一受體分子中添加一磷酸基團的酶。
催化海藻糖的可逆磷酸裂解的磷酸化酶為本領域已知的並被稱為海藻糖磷酸化酶。海藻糖磷酸化酶可以基於其所催化的反應機理來加以區分。
第一組海藻糖磷酸化酶催化海藻糖的磷酸裂解，同時保留了異頭構型，其使用無機磷酸鹽作為一葡糖基受體進入葡萄糖與α-D-葡萄糖1-磷酸(alpha-D-glucose 1- phosphate, aG1P)，因此被歸類為保留磷酸化酶。這種第一組的海藻糖磷酸化酶已被國際生物化學暨分子生物學聯合會指定為EC編號EC2.4.1.231，並且已從各種真核真菌被描述功能特徵。
第二組海藻糖磷酸化酶為反轉海藻糖磷酸化酶，其已被指定EC編號為EC 2.4.1.64且其催化海藻糖的磷酸裂解，其中構型轉化為葡萄糖與β-D-葡萄糖1-磷酸。因此，這些磷酸化酶具有與EC 2.4.1.231海藻糖磷酸化酶不同的反應機制。
具體而言，本發明考慮了EC編號為EC 2.4.1.231的某些磷酸化酶，其能夠在其他反應之中，將葡萄糖及α-D-葡萄糖-1磷酸鹽(“aG1P”)轉化為海藻糖，或者在無機磷酸鹽存在下能夠將海藻糖的磷酸化裂解轉化為葡萄糖及α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)。
海藻糖磷酸化酶的工業用途是由於它們的生化特徵，亦即，催化海藻糖的磷酸裂解，是可逆的。因此，海藻糖磷酸化酶特別適用於催化葡萄糖與α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)轉化為海藻糖及無機磷酸鹽。
海藻糖磷酸化酶催化的反應是可逆的(平衡反應)，且可以根據反應的具體方向進行基質或產物抑制。為了獲得工業上相關量的所需產物，需要海藻糖磷酸化酶催化具有高比活性的基質之轉化。此外，該海藻糖磷酸化酶的其他動力學因素，例如基質選擇性以及KM
可能對產物產率具有重要的作用。其他相關方面可包括但不限於區域選擇性、其他因素的抑制(例如粗萃取物組成分，基質污染物或副產物)，以及在合適的宿主中的重組可溶性表現。
野生型海藻糖磷酸化酶的主要缺點為，即使在25°C至40°C的中等溫度下，溶液中的酶活性仍快速喪失，這也顯著地限制了它們的應用。針對工業應用，需要在高於30°C的溫度下，或甚至高於40°C的溫度下，仍可持續幾天的高穩定性。使用不具熱穩定性的酶進行反應的時間長，且在處理時間內需要更大量的酶，通常透過在整個過程中重複添加酶來進行。例如，來自平菇(Pleurotus ostreatus
)的海藻糖磷酸化酶在25°C下顯示出約1.3小時的半衰期，在約41°C下顯示3分鐘的半衰期(Schwarz等人，J Biotechnol 129, 140-150 (2007年)，Han等人，Protein Expression and Purification 30, 194-202 (2003年))。來自裂褶菌(Schizophyllum commune
)以及舞菇(Grifola frondosa
)的海藻糖磷酸化酶稍微穩定些，在30°C下的半衰期為4.8小時，在37°C下的半衰期為1小時(Schwarz等人，J Biotechnol 129, 140-150 (2007年))。
在本領域中應用了各種策略來解決這些缺點。例如，添加海藻糖、甘油以及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)可增加海藻糖磷酸化酶的穩定性(Klimacek等人，Biotechnology Techniques 13: 243-248, 1999年，Eis等人，Biochem J 341, 385-393 (1999年)，Schwarz等人，J Biotechnol 129, 140-150 (2007年))。透過添加20%PEG 4000達到最佳穩定化，其導致來自裂褶菌(Schizophyllum commune
)的海藻糖磷酸化酶在30°C、40°C以及50°C下的半衰期分別為4.5天、2.2小時以及6分鐘 (Klimacek等人，Biotechnology Techniques 13: 243-248, 1999年，Eis等人，Biochem J 341, 385-393 (1999年))。雖然添加PEG 4000改善了酶的穩定性，但對於在40°C或高於40°C的應用加上幾小時到幾天的處理時間，這種改進仍然是不夠的。PEG 4000的存在可能進一步干擾透過酶促反應獲得的產物的工業規模成本結構以及下游加工的要求。
來自裂褶菌的海藻糖磷酸化酶的半衰期也可透過分別在30°C、40°C以及50°C下固定22天、3.3天以及2小時來改善(Klimacek等人，Biotechnology Techniques 13: 243-248, 1999年)。然而，由於昂貴的載體及製造成本，固定化導致更高的酶生產成本，而且僅在酶可以回收並重複使用多個循環時在工業實用性方面是有效的。另外，固定化限制了酶促反應產物的過程以及下游加工的選擇。
因此，使用海藻糖磷酸化酶的合成反應在25°C至35°C的溫度範圍內進行並不令人驚訝(Schwarz等人，J of Biotechnology 129 140-150 (2007年)，Saito等人，Appl Microbiol Biotechnol 50:193-198 (1998年)，Saito等人，Appl Microbiol Biotechnol 64: 4340-4345 (1998年))。
通常，在酶催化領域，較高的反應溫度加速了產物形成速率，從而增加了產物的空間時間產率。產物形成的空間時間產率為描述在反應時間內每個反應體積(通常以升為單位表示)製造的產物量的數值。產物形成速率為在該溫度下酶穩定性範圍內的溫度的函數。因此，需要具有足夠熱穩定性的酶以提高空間時間。熱酶穩定性通常與長時間的作用穩定性相關。作用穩定的酶能夠在中等溫度下進行反應，但是在反應開始時每單位初始酶活性的處理時間更長。然而，透過增加酶活性輸入，不穩定的酶當然也可實現在升高的溫度下或更長的處理時間具有增加的空間時間產率；然而，這顯著降低了每個酶單位的空間時間產率，並增加了酶成本對該作用的貢獻。酶的熱穩定性反而降低了對成本的貢獻。
用於改善酶性能及其在工業製程中的適用性的另一種方法為酶工程。該技術涉及開發具有改善性質的起始酶之變體(回顧文獻請參見，例如，S. Lutz, U.T. Bornscheuer, Protein Engineering Handbook, Wiley VCH, Weinheim, 2009年)。其中，透過酶工程改進了磷酸化酶。例如，美國專利公開號US2013-0029384揭露了屬於糖基水解酶家族13的蔗糖磷酸化酶之變體，其具有改善的熱穩定性。迄今為止，EC編號EC2.4.1.231的海藻糖磷酸化酶的變體局限於用於闡明該海藻糖磷酸化酶的反應機制之變體。基於這些變體，Goedl等人(Biochem J 397; 491-500; 2006年)發現來自裂褶菌的海藻糖磷酸化酶的胺基酸位置D379、H403、R507以及K512的取代導致活性降低。具有以下單點突變D379N、H403A、R507A以及K512A之一的變體顯示出降低的海藻糖磷酸解活性。Goedl等人(FEBS J 275; 903-913, 2008年)更具體地發現來自裂褶菌的海藻糖磷酸化酶的突變R507A以及K512A對野生型(kcat/KM
)的海藻糖磷酸化酶的催化效率具有影響。
由於本領域可獲得的野生型海藻糖磷酸化酶在用於生產海藻糖的酶促方法的每個方面都令人不甚滿意，而且如本領域所述之有效改善海藻糖磷酸化酶的工業實用性的嘗試並未成功，因此需要透過使用與野生型海藻糖磷酸化酶相比有利的新穎海藻糖磷酸化酶，特別是在高溫下的作用穩定性，以改進海藻糖工業生產之方法。
據此，本發明的基本問題為提供用於改進工業生產海藻糖之製造方法。
該問題透過本發明之方法以雙酶的形式解決，較佳以三酶作用的形式，採用衍生自本領域已知的酶候選序列所改進的海藻糖磷酸化酶序列變體，特別是衍生自兩種不同生物的序列，其對作用效率具有最高影響。蔗糖磷酸化酶與葡萄糖異構酶候選物及其序列變體也用於本發明之上下文中，從而允許海藻糖生產過程具有增加之功效。
於第一方面，本發明涉及一種生產海藻糖之方法，包括以任何順序混合及反應以下物品之步驟，
a) 至少一種α-磷酸化酶，其能夠催化來自一糖原料及來自至少一磷源的α-D-葡萄糖1-磷酸中間體之產物，該糖原料係選自由蔗糖及澱粉所組成之群組，該磷源係選自由一磷酸及該磷酸的一無機鹽所組成之群組；
b) 至少一種海藻糖磷酸化酶，其能夠催化來自一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與一葡萄糖基質所產生的海藻糖，其中該海藻糖磷酸化酶為一海藻糖磷酸化酶變體，其具有與一野生型海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列在至少一個胺基酸位置上不同的胺基酸序列；
c) 至少一種選自由蔗糖及澱粉所組成之群組的糖原料，其透過該α-磷酸化酶的催化作用產生一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一選自果糖副產物及澱粉副產物之群組的副產物；以及
d) 至少一種選自由一磷酸及該磷酸的一無機鹽所組成之群組的磷源。
於一較佳具體實施例中，該方法還包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質與該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種選自由蔗糖及澱粉所組成之群組的糖原料，以及該至少一種磷源的步驟。
於另一較佳具體實施例中，該方法還包括以任何順序混合並反應至少一種葡萄糖異構酶與該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種選自由蔗糖及澱粉所組成之群組的糖原料，以及該至少一種磷源的步驟。
於該第一方面之另一較佳具體實施例中，其亦為與其相關的所有具體實施例之一較佳具體實施例，該方法之特徵在於該葡萄糖基質係透過該至少一種葡萄糖異構酶的催化作用由一果糖副產物產生，及/或該葡萄糖基質在任何順序中作為一外部反應物在一單獨的步驟中補充。
於本發明之上下文中，特別理解的是，該至少一種α-磷酸化酶將蔗糖作為一種糖原料轉化為α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與果糖副產物。在存在該至少一種葡萄糖異構酶的情況下，該果糖副產物可以進一步轉化為葡萄糖，然後可以作為一葡萄糖基質，用於轉化該至少一種海藻糖磷酸化酶。此外，並且至少部分地，葡萄糖基質可以在該至少一種葡萄糖異構酶的存在下根據本發明之方法單獨補充到該反應中。在不存在葡萄糖異構酶的情況下，該方法需要單獨補充葡萄糖基質以透過該至少一種海藻糖磷酸化酶進行轉化。
於另一較佳具體實施例中，該方法之特徵在於存在選自由下列所組成之群組的二種或更多種下列轉化：
a) 至少一種糖原料通過該至少一種α-磷酸化酶與該至少一種磷源的磷酸裂解轉化為一種α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一副產物；
b) 透過該至少一種海藻糖磷酸化酶將一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與一葡萄糖基質轉化為海藻糖；
c) 透過該至少一種葡萄糖異構酶將該果糖副產物轉化為一葡萄糖基質。
於本發明之上下文中，該至少一種α-磷酸化酶係透過使用磷酸鹽作為一葡糖基受體轉化為α-D-葡萄糖1-磷酸(alpha-D-glucose 1-phosphate, aG1P)來催化蔗糖或澱粉之磷酸裂解的酶。該至少一種α-磷酸化酶較佳為一蔗糖磷酸化酶或一葡聚醣磷酸化酶(例如，以EC 2.4.1.1所定義之葡聚醣磷酸化酶)。最佳地，該α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，其中該蔗糖磷酸化酶(也稱為“SP”或“SP酶”)較佳由酶分類EC 2.4.1.7所定義，而該至少一種海藻糖磷酸化酶較佳為由該酶分類EC2.4.1.231所定義之海藻糖磷酸化酶(也稱為“TP”或“TP酶”)。本發明之至少一種葡萄糖異構酶(也稱為“GI”或“GI酶”)較佳為該酶分類EC 5.3.1.5所定義之木糖異構酶。
於另一較佳具體實施例中，本發明之方法的特徵在於
a) 一種雙酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種糖原料、該葡萄糖基質，以及該至少一種磷源反應及混合；及/或
b) 一種三酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶，較佳地其中該至少一種α-磷酸化酶為蔗糖磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該至少一種糖原料，較佳地其中該糖原料為蔗糖，以及該至少一種磷源反應及混合；及/或
c) 一種三酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該至少一種糖原料，以及該葡萄糖基質與該至少一種磷源反應及混合。
於本發明之上下文中，應當理解的是，製備該生產海藻糖之方法可以在該至少一種α-磷酸化酶以及該至少一種海藻糖磷酸化酶的存在下以雙酶作用進行。不考慮使用蔗糖及/或澱粉作為一糖原料，需要將該葡萄糖基質補充到反應中，並且將產生與海藻糖等摩爾量的澱粉副產物及/或果糖副產物。
於另一較佳具體實施例中，本發明之方法的特徵在於存在選自由下列所組成之群組的二種或更多種下列轉化：
a) 至少一種糖原料通過該至少一種α-磷酸化酶與該至少一種磷源的磷酸裂解轉化為一種α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一副產物；
b) 透過該至少一種海藻糖磷酸化酶將該α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與該葡萄糖基質轉化為海藻糖；
c) 透過該至少一種葡萄糖異構酶將該果糖副產物轉化為一葡萄糖基質。
其中步驟b)的葡萄糖基質補充到轉化作用中或在步驟c)中獲得。
於本發明之上下文中還應當理解的是的是，該生產海藻糖之方法可以在該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶，以及該至少一種海藻糖磷酸酶的存在下以三酶作用進行。在使用蔗糖作為至少一種糖原料時，不需要向反應中加入葡萄糖基質，而是透過葡萄糖異構酶的催化轉化果糖原位產生，從而降低果糖副產物之產率。 無論如何，可任選地補充葡萄糖基質。在使用澱粉作為至少一種糖原料的三酶作用中，該至少一種葡萄糖異構酶不能原位地將澱粉副產物轉化為葡萄糖，並且需要補充葡萄糖基質。
較佳地，至少一種或多種轉化在分開的容器中進行。於本發明之上下文中，“在分開的容器中進行”之特徵表示一個或多個單獨的轉化步驟彼此獨立地進行。具體而言，依序地執行在不同容器中進行的一個或多個單獨之轉換步驟。
於本發明之上下文中，進一步理解的是，對於在不同的分開的容器中進行的雙酶做用，較佳在不同的分開的容器中依序進行，具體而言，於第一單獨的轉化步驟中，可以進行透過α-磷酸化酶產生α-葡萄糖1-磷酸，而於第二步中，α-葡萄糖1-磷酸透過一海藻糖磷酸化酶與葡萄糖反應。對於在不同容器中進行的三酶作用，較佳為在不同容器中依序進行，具體而言，第一容器中α-磷酸化酶的第一轉化，第二容器中葡萄糖異構酶的第二轉化，以及第三個容器中的海藻糖磷酸化酶的第三轉化可以各自單獨進行，或者作為第一種替代選擇，α-磷酸化酶的第一轉化以及葡萄糖異構酶的第二轉化可以於第一容器中組合，然後於第二容器中進行海藻糖磷酸化酶的第三轉化，或作為第二種替代選擇，α-磷酸化酶的第一轉化可於第一容器中進行，然後於第二容器中進行葡萄糖異構酶及海藻糖磷酸化酶的第二及第三轉化。
更佳地，來自每個單獨容器的反應產物可以從反應液中純化，然後於另一個單獨的容器中進行隨後的轉化。具體而言，在單獨的容器中進行隨後的轉化之前，各個反應產物可以彼此分離，例如將所需產物自不需要的副產物中分離。合適的手段及方法或從特定反應液中純化一種或多種單獨的反應產物及/或用於將反應產物彼此分離為本領域技術人員已知的。
同樣較佳的是，至少一個或多個轉化在相同的容器中進行。於本發明之上下文中，“在相同的容器中進行”之特徵表示各個反應步驟於一反應環境中進行，允許各個轉化的生產流程及/或動力學以及相應的反應中間體或產物的形成，可透過添加及/或減少及/或不活化，例如，透過化學或熱不活化，單個組成分或輸入材料，而於一或另一方向上受影響及/或移位。具體而言，該糖原料、磷源、葡萄糖基質以及任何酶可以本文之任何順序添加。該葡萄糖基質可原位形成(例如，透過果糖副產物與葡萄糖異構酶反應)及/或加入該反應混合物中。
於該第一方面之一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有具體實施例的一較佳具體實施例，該方法之特徵在於
a) 針對該雙酶作用，同時或依次以任何順序混合該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種糖原料、該葡萄糖基質，以及該至少一種磷源；及/或
b) 針對該三酶作用，同時或依次以任何順序混合該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該至少一種糖原料，以及該至少一種磷源；及/或
c) 針對三酶作用，同時或依次以任何順序混合該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該至少一種糖原料、該葡萄糖基質，以及該至少一種磷源。
於本發明之上下文中，術語“以任何順序”包括依序或同時進行步驟，例如透過混合及/或反應該糖原料、磷源，任選的葡萄糖基質及/或任何酶。 具體而言，在工業規模生產中預混合某些基質及/或某些酶然後透過添加其他基質及/或酶來引發轉化反應可能是有用的，或者透過對某種基質配量以調節酶的活性可能是有用的。例如，可以預先混合所有醣類原料、磷源、任選的葡萄糖基質，以及除了至少一種α-磷酸化酶之外的任何酶，然後透過添加該至少一種α-磷酸化酶開始反應，該至少一種α-磷酸化酶催化第一單獨轉化步驟。為了本發明之目的，術語“以任何順序”還包括，在整個反應的時間過程中，依序向該混合物加入或在反應過程中多次補充該糖原料、磷源，任選的葡萄糖基質，任何酶，或任何前述物質之任何組合。
於本發明之上下文中，術語“混合”描述了使該反應物，即糖原料、磷源、任選的葡萄糖基質，及/或任何酶接觸之行為。“混合”的行為可包括例如(i)將反應物倒入一反應容器中，(ii)將一種或多種某些反應物從分離的隔室釋放到含有其他反應物的反應容器中(例如透過細胞裂解或均質化將其從一完整細胞中釋放到含有其他反應物的培養基中)，或(iii)使沒有酶的反應物溶液通過在一固定床反應器中固定的酶，其中這些步驟(i)-(iii)中的每一個可以進一步包括物理攪拌，如攪拌或搖動。
適用於本發明方法的磷酸無機鹽包括，但不限於，磷酸鉀與磷酸鈉。
於一具體實施例中，對於1kg的該糖原料，該磷源以0.1 mmol至10 mol，例如1 mmol至1 mol，或例如10 mmol至400 mmol的濃度存在。
適用於本發明方法的澱粉包括，但不限於，可溶性澱粉、澱粉、糖原、糊精，以及葡聚醣。
較佳地，該方法在至少20°C至80°C的溫度下進行，較佳至少30°C至80°C，較佳至少39°C至80°C，更佳至少40°C至80°C，更佳至少39°C至60°C，甚至更佳至少40°C至60°C，且最佳至少45°C至60°C。
甚至更佳為，該方法在至少20°C至最高80°C，21°C至最高80°C，22°C至最高80°C，23°C至最高80°C，24°C至最高80°C，25°C至最高80°C，26°C至最高80°C，27°C至最高80°C，28°C至最高80°C，29°C至最高80°C，較佳為至少30°C至最高80°C，31°C至最高80°C，32°C至最高80°C，33°C至最高80°C，34°C至最高80°C，35°C至最高80°C，36°C至最高80°C，37°C至最高80°C，38°C至最高80°C，39°C至最高80°C，更佳為至少40°C至最高80°C，41°C至最高80°C，42°C至最高80°C，43°C至最高80°C，44°C至最高80°C，45°C至最高80°C，46°C至最高80°C，47°C至最高80°C，48°C至最高80°C，49°C至最高80°C，甚至更佳為至少39°C至最高60°C，40°C至最高60°C，41°C至最高60°C，42°C至最高60°C，43°C至最高60°C，44°C至最高60°C，45°C至最高60°C，46°C至最高60°C，47°C至最高60°C，48°C至最高60°C，49°C至最高60°C，且最佳為至少45°C至最高60°C的溫度下進行。
在本發明之含義中應當理解的是，對於在該方法的過程中進行的每個單獨的轉化，特定溫度可為最佳的。於本發明之一甚至更佳的具體實施例中，該方法的一次或多次轉化分別在至少20°C至最高80°C，21°C至最高80°C，22°C至最高80°C，23°C至最高80°C，24°C至最高80°C，25°C至最高80°C，26°C至最高80°C，27°C至最高80°C，28°C至最高80°C，29°C至最高80°C，較佳為至少30°C至最高80°C，31°C至最高80°C，32°C至最高80°C，33°C至最高80°C，34°C至最高80°C，35°C至最高80°C，36°C至最高80°C，37°C至最高80°C，38°C至最高80°C，39°C至最高80°C，更佳為至少40°C至最高80°C，41°C至最高80°C，42°C至最高80°C，43°C至最高80°C，44°C至最高80°C，45°C至最高80°C，46°C至最高80°C，47°C至最高80°C，48°C至最高80°C，49°C至最高80°C，甚至更佳為至少39°C至最高60°C，40°C至最高60°C，41°C至最高60°C，42°C至最高60°C，43°C至最高60°C，44°C至最高60°C，45°C至最高60°C，46°C至最高60°C，47°C至最高60°C，48°C至最高60°C，49°C至最高60°C，且最佳為至少45°C至最高60°C的溫度下進行。最佳為，該方法中至少包含由一海藻糖磷酸化酶轉化α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與葡萄糖基質的任何步驟係在至少20°C至最高80°C，21°C至最高80°C，22°C至最高80°C，23°C至最高80°C，24°C至最高80°C，25°C至最高80°C，26°C至最高80°C，27°C至最高80°C，28°C至最高80°C，29°C至最高80°C，較佳為至少30°C至最高80°C，31°C至最高80°C，32°C至最高80°C，33°C至最高80°C，34°C至最高80°C，35°C至最高80°C，36°C至最高80°C，37°C至最高80°C，38°C至最高80°C，39°C至最高80°C，更佳為至少40°C至最高80°C，41°C至最高80°C，42°C至最高80°C，43°C至最高80°C，44°C至最高80°C，45°C至最高80°C，46°C至最高80°C，47°C至最高80°C，48°C至最高80°C，49°C至最高80°C，甚至更佳為至少39°C至最高60°C，40°C至最高60°C，41°C至最高60°C，42°C至最高60°C，43°C至最高60°C，44°C至最高60°C，45°C至最高60°C，46°C至最高60°C，47°C至最高60°C，48°C至最高60°C，49°C至最高60°C，且最佳為至少45°C至最高60°C的溫度下進行。
於一具體實施例中，將該至少一種糖原料混合並以蔗糖或澱粉的形式反應，較佳為其中該蔗糖或澱粉以1 mM至最高2000 mM，例如自100 mM至最高2000 mM，或自500 mM至最高2000 mM，或自1000 mM至最高2000 mM的濃度範圍加入該反應中。
較佳地，該至少一種糖原料係以蔗糖的形式混合並反應，較佳為其中該蔗糖係以一自100 mM至最多2000 mM，較佳為自500 mM至最多2000 mM，更佳為自1000 mM至最多2000 mM的濃度範圍加入該反應中。
甚至更佳為，該至少一種糖原料係以蔗糖的形式混合並反應，較佳為其中該蔗糖係以一自100 mM至最多2000 mM，200 mM至最多2000 mM，300 mM至最多2000 mM，400 mM至最多2000 mM，500 mM至最多2000 mM，600 mM至最多2000 mM，700 mM至最多2000 mM，800 mM至最多2000 mM，900 mM至最多2000 mM，1000 mM至最多2000 mM，1100 mM至最多2000 mM，1200 mM至最多2000 mM，1300 mM至最多2000 mM，1400 mM至最多2000 mM，1500 mM至最多2000 mM，1600 mM至最多2000 mM，1700 mM至最多2000 mM，1800 mM至最多2000 mM，1900 mM至最高2000 mM，較佳為以500 mM至最多2000 mM，600 mM至最多2000 mM，700 mM至最多2000 mM，800 mM至最多2000 mM，900 mM至最多2000 mM，1000 mM至最多2000 mM，1100 mM至最多2000 mM，1200 mM至最多2000 mM，1300 mM至最多2000 mM，1400 mM至最多2000 mM，1500 mM至最多2000 mM，1600 mM至最多2000 mM，1700 mM至最多2000 mM，1800 mM至最多2000 mM，1900 mM至最高2000 mM的範圍，且更佳為以1000 mM至最多2000 mM，1100 mM至最多2000 mM，1200 mM至最多2000 mM，1300 mM至最多2000 mM，1400 mM至最多2000 mM，1500 mM至最多2000 mM，1600 mM至最多2000 mM，1700 mM至最多2000 mM，1800 mM至最多2000 mM，1900 mM至最高2000 mM的濃度範圍加入該反應中。
於一較佳具體實施例中，本發明之方法係以三酶作用進行，該作用包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一種磷源、至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，其中該方法之特徵在於使用至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶能夠使每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.1 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.2 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.5 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，較佳為至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，甚至更佳為至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP。
較佳地，本發明之方法以三酶作用進行，該方法包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一種磷源、至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.1 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.2 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.5 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，較佳為至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，甚至更佳為至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP。
於另一較佳具體實施例中，本發明之方法係以雙酶作用進行，包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一種磷源、至少一種葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種不添加一葡萄糖異構酶的海藻糖磷酸化酶的步驟，其中該方法之特徵在於使用至少一種海藻糖磷酸化酶，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶能夠使每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自一糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少3.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少4.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少3 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.25 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，或至少4.75 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP。較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，且該糖原料為蔗糖。
較佳地，本發明之方法係以一雙酶作用進行，包括以任何順序混合並應至少一種糖原料、至少一種磷源、至少一種葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種不添加一葡萄糖異構酶的海藻糖磷酸化酶的步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自一糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少3.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少4.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少3 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.25 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，或至少4.75 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP。較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，且該糖原料為蔗糖。
較佳地，該提供每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率的至少一種海藻糖磷酸化酶為根據本文所述之任一方面及/或具體實施例之海藻糖磷酸化酶變體。
於本發明之上下文中，應當理解的是，術語“每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率”係指空間時間產率(亦即，每反應體積與每次獲得的海藻糖產物的量)，其係為在反應過程中經歷反應的每千單位(kU)(千單位，1,000單位)的海藻糖磷酸化酶酶活性所產生的。海藻糖磷酸化酶活性係透過本領域已知的標準酶測定法測定，例如透過使用本發明實施例部分中概述的海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I。根據本發明方法的每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率為或者可以在酶轉化過程中的任何時間被確定，直到反應完成時，其中透過酶促轉化不再形成海藻糖產物。
較佳地，透過在至少20°C至最高80°C，較佳為至少30°C至最高80°C，更佳至少39°C至最高80°C，更佳至少40°C至最高80°C，更佳至少39°C至最高60°C，甚至更佳至少40°C至最高60°C，以及最佳至少45°C至最高60°C的反應溫度下進行該方法達到每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率。
甚至更佳為，透過在以下一反應溫度下進行該方法達到每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率：至少20°C至最高80°C，21°C至最高80°C，22°C至最高80°C，23°C至最高80°C，24°C至最高80°C，25°C至最高80°C，26°C至最高80°C，27°C至最高80°C，28°C至最高80°C，29°C至最高80°C，較佳為至少30°C至最高80°C，31°C至最高80°C，32°C至最高80°C，33°C至最高80°C，34°C至最高80°C，35°C至最高80°C，36°C至最高80°C，37°C至最高80°C，38°C至最高80°C，39°C至最高80°C，更佳為至少40°C至最高80°C，41°C至最高80°C，42°C至最高80°C，43°C至最高80°C，44°C至最高80°C，45°C至最高80°C，46°C至最高80°C，47°C至最高80°C，48°C至最高80°C，49°C至最高80°C，甚至更佳為至少39°C至最高60°C，40°C至最高60°C，41°C至最高60°C，42°C至最高60°C，43°C至最高60°C，44°C至最高60°C，45°C至最高60°C，46°C至最高60°C，47°C至最高60°C，48°C至最高60°C，49°C至最高60°C，且最佳為至少45°C至最高60°C。
於一較佳具體實施例中，本發明之方法在至少30°C至70°C，較佳39°C至60°C，更佳40°C至60°C的反應溫度下進行一三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一種磷源、至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，其中該方法的特徵在於使用至少一種海藻糖磷酸化酶，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶能夠使每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.1 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.2 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.5 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，較佳為至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，甚至更佳為至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP。
較佳地，本發明之方法在至少30°C至70°C，較佳39°C至60°C，更佳40°C至60°C的反應溫度下進行一三酶作用，包括以任何順序混合並反應一種糖原料，至少一種磷源，至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶，至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.1 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.2 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.5 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，較佳為至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，甚至更佳為至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP。
在一同樣較佳具體實施例中，本發明之方法在至少30°C至70°C，較佳39°C至60°C，更佳40°C至60°C的溫度下進行一雙酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料，至少一種磷源，至少一種葡萄糖基質，至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，而不加入一葡萄糖異構酶，其中該方法之特徵在於使用至少一種海藻糖磷酸化酶，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶能夠使每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少3.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少4.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少3 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.25 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，或至少4.75 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP。較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，且較佳地該糖原料為蔗糖。
本發明之方法在至少30°C至70°C，較佳39°C至60°C，更佳40°C至60°C的溫度下進行一雙酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料，至少一種磷源，至少一種葡萄糖基質，至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，而不加入一葡萄糖異構酶，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少3.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少4.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少3 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.25 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，或至少4.75 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP。較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，且較佳地該糖原料為蔗糖。
較佳地，在特定溫度下提供每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率的該至少一種海藻糖磷酸化酶為根據本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例的較佳具體實施例，該至少一種海藻糖磷酸化酶係衍生自屬於擔子菌門(Basidomycota)的一生物體，較佳來自屬於傘菌綱(Agaricomycetes)的一生物體，且更佳來自屬於由裂摺菌屬(Schizophyllum)、側耳屬(Pleurotus)、奇果菌屬(Grifola)、蘑菇屬(Agaricus)、栓菌屬(Trametes)、革蓋菌屬(Coriolus)、栓菌屬(Trametes)、附毛菌屬(Trichaptum)，以及摺孔菌屬(Lenzites)所組成之群組的屬的一生物體，甚至更佳衍生自裂摺菌屬(Schizophyllum)及奇果菌屬(Grifola)，且最佳來自裂摺菌(Schizophyllum commune
)，或來自舞菇(Grifola frondosa
)的一生物體。
於第一方面之一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有實施例的較佳具體實施例，該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，其中該特徵定義為：
(A) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後，較佳在1M蔗糖存在下，一殘餘酶活性為30%至100%。
在這種情況下，特徵(A)較佳為一熱穩定性，其在52°C下作用15分鐘後，較佳在1M蔗糖存在下，且定義為一殘餘酶活性為30%至90%，較佳為自38%至90%，較佳為自39%至90%，更佳為自42%至90%，更佳為自54%至90%，更佳為自55%至90%，甚至更佳為自63%至90%，甚至更佳為自64%至90%，甚至更佳為自65%至90%，甚至更佳為自68%至90%，且最佳為自64%至86%；及/或 自30%至90%，較佳為自31%至90%，較佳為自32%至90%，較佳為自33%至90%，較佳為自34%至90%，較佳為自35%至90%，較佳為自36%至90%，較佳為自37%至90%，較佳為自38%至90%，較佳為自39%至90%，更佳為自40%至90%，更佳為自41%至90%，更佳為自42%至90%，更佳為自43%至90%，更佳為自44%至90%，更佳為自45%至90%，更佳為自46%至90%，更佳為自47%至90%，更佳為自48%至90%，更佳為自49%至90%，甚至更佳為自50%至90%，甚至更佳為自51%至90%，甚至更佳為自52%至90%，甚至更佳為自53%至90%，甚至更佳為自54%至90%，甚至更佳為自55%至90%，甚至更佳為自60%至90%，甚至更佳為自61%至90%，甚至更佳為自65%至90%，甚至更佳為自70%至90%，甚至更佳為自75%至90%，且最佳為自72% to 81%，及/或
自38%至100%，較佳為自55%至100%，較佳為自60%至100%，較佳為自70%至100%，較佳為自75%至100%，較佳為自76%至100%，較佳為自77%至100%，較佳為自78%至100%，較佳為自79%至100%，更佳為自80%至100%，更佳為自81%至100%，更佳為自82%至100%，更佳為自83%至100%，更佳為自84%至100%，更佳為自85%至100%，更佳為自86%至100%，更佳為自87%至100%，更佳為自88%至100%，更佳為自89%至100%，甚至更佳為自90%至100%，甚至更佳為自91%至100%，甚至更佳為自92%至100%，甚至更佳為自93%至100%，甚至更佳為自94%至100%，甚至更佳為自95%至100%，甚至更佳為自96%至100%，甚至更佳為自97%至100%，甚至更佳為自98%至100%，甚至更佳為自99%至100%，且最佳為100%。
(B) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後，較佳在1M蔗糖存在下，一Tm50值至少為52°C；
(C) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後，較佳在1M蔗糖存在下，一Tm50值介於52°C至90°C之間
在這種情況下，特徵(C)較佳為在52°C下作用15分鐘後，較佳在1M蔗糖存在下，的熱穩定性，其特徵在於
一Tm50- 值
，介於52 °C以及90 °C之間，較佳為介於52 °C以及80 °C之間，較佳為介於52.5 °C以及80 °C之間，較佳為介於53 °C以及80 °C之間，較佳為介於53.5 °C以及80 °C之間，更佳為介於54 °C以及80 °C之間，較佳為介於54.5 °C以及80 °C之間，甚至更佳為介於55 °C以及80 °C之間，較佳為介於55.5 °C以及80 °C之間，較佳為介於56 °C以及80 °C之間，較佳為介於56.5 °C以及80 °C之間，較佳為介於57 °C以及80 °C之間，較佳為介於57.5 °C以及80 °C之間，甚至更佳為介於52 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於52.5 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於53 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於53.5 °C以及70 °C之間，更甚至更佳為介於54 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於54.5 °C以及70 °C之間，甚至更甚者更佳為介於55 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於55.5 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於56 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於56.5 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於57 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於57.5 °C以及70 °C之間，甚至更佳為介於52 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於52.5 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於53 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於53.5 °C以及65 °C之間，更甚至更佳為介於54 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於54.5 °C以及65 °C之間，甚至更甚者更佳為介於55 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於55.5 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於56 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於56.5 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於57 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於57.5 °C以及65 °C之間，甚至更佳為介於52 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於52.5 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於53 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於53.5 °C以及60 °C之間，更甚至更佳為介於54 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於54.5 °C以及60 °C之間，甚至更甚者更佳為介於55 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於55.5 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於56 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於56.5 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於57 °C以及60 °C之間，甚至更佳為介於57.5 °C以及60 °C之間，且最佳為介於52 °C以及57.5 °C之間。
(D) 一熱穩定性，其中該熱穩定性為一作用穩定性之形式，其特徵在於一為3小時至9天或更長的半衰期，較佳為24小時至9天或更長的半衰期，更佳為4天至9天或更長的半衰期，較佳在1M蔗糖存在下。
較佳地，該特徵(D)為一熱穩定性，其特徵在於
一作用穩定性
，其特徵為在45°C下的半衰期為3小時至9天或更長，較佳為24小時至9天或更長，較佳為39小時至9天或更長，較佳為2天至9天或更長，更佳為4天至9天或更長，更佳為5.5天至9天或更長，更佳為至少7天至9天或更長，甚至更佳為至少9天或更長，以及最佳為9天；及/或
一作用穩定性
，其特徵為在45°C下的半衰期為24小時至9天或更長，更佳為39小時至9天或更長，更佳為2天至9天或更長，更佳為4天至9天或更長，更佳為5.5天至9天或更長，更佳為7天至9天或更長，甚至更佳為至少9天或更長，以及最佳為9天；及/或
一作用穩定性
，其特徵為在45°C下的半衰期為4天至9天或更長，較佳為5.5天至9天或更長，更佳為7天至9天或更長，甚至更佳為至少9天或更長，以及最佳為9天。
較佳地，特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵的該至少一種海藻糖磷酸化酶為一種根據本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體。
於本文所述之任一方面以及具體實施例的一較佳具體實施例中，該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，且能夠進行一三酶作用，該三酶作用包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一個磷源、至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶，至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.1 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.2 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少1.5 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，較佳為至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，甚至更佳為至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少1.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少2.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.6 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，至少1.8 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP，或至少2.0 g/(L*h)/kU TP至最高10 g/(L*h)/kU TP。
於本發明之一較佳具體實施例中，該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，且能夠進行一三酶作用，該三酶作用包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，該海藻糖磷酸化酶具有每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的特定產率，且該海藻糖磷酸化酶為一種根據本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體。
於本文所述之任一方面以及具體實施例的同樣較佳具體實施例中，該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，且能夠進行一雙酶作用，該雙酶作用包括以任何順序混合並反應至少一種糖原料、至少一個磷源、至少一種葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，而不添加一葡萄糖異構酶，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少3.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少3.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP，至少4.1 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.2 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.3 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.4 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.6 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.7 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少4.9 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，至少5 g/(L*h)/kU TP至最高100 g/(L*h)/kU TP，或至少3 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少3 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高90 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高80 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高70 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高60 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高50 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高40 g/(L*h)/kU TP，至少4.8 g/(L*h)/kU TP至最高30 g/(L*h)/kU TP，或至少4.25 g/(L*h)/kU TP至最高25 g/(L*h)/kU TP，至少4.5 g/(L*h)/kU TP至最高20 g/(L*h)/kU TP，或至少4.75 g/(L*h)/kU TP至最高15 g/(L*h)/kU TP。較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，且較佳地該糖原料為蔗糖。
於本發明之一較佳具體實施例中，該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，且能夠進行一雙酶作用，該雙酶作用包括以任何順序混合並反應一種葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶的步驟，而不添加一葡萄糖異構酶，該海藻糖磷酸化酶具有每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的特定產率，且該海藻糖磷酸化酶為一種根據本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是所有前述具體實施例的一較佳具體實施例，該至少一種海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶變體，其中該變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列至少20%同源及/或相同，其中該變體包含或由2個至最多15個，3個至最多15個，4個至最多15個，5個至最多15個，6個至最多15個，7個至最多15個，8個至最多15個，9個至最多15個，10個至最多15個，11個至最多15個，12個至最多15個，13個至最多15個，14個至最多15個，或15個選自由以下所組成之群組的下列胺基酸位置：
a) 712A、712G、712I、712M、712P或712V，較佳為712M，及/或
b) 383A、383G、383I、383L、383M、383V、383N、383C、383Q、383S或383T，較佳為 383A、383G、383M、383V、383N、383C、383Q、383S或383T，更佳為 383G、383V、383C、383S或383T，甚至更佳為383V或383T，且最佳為383V，及/或
c) 114A、114G、114I、114M、114P或114V，較佳為 114I，及/或
d) 118為118A、118G、118I、118L、118M、118P或118V，較佳為 118V，及/或
e) 225A、225G、225I、225L、225M、225P或225V，較佳為 225I、225L、225M或225V，且更佳為 225V，及/或
f) 304G、304I、304L、304M、304P或304V，較佳為 304I或304L，且更佳為 304I，及/或
g) 323A、323G、323I、323L、323M、323P，或323V，較佳為 323I或323V，且更佳為 323I，及/或
h) 349W或349Y，較佳為 349Y，及/或
i) 357A、357I、357L、357M、357P或357V，較佳為 357A，及/或
j) 487A、487G、487I、487L、487M、487P或487V，較佳為 487A、487M、487G、487L或487V，更佳為 487A，及/或
k) 550A、550G、550I、550L、550M或550P，較佳為 550I或550P，且更佳為 550I，及/或
l) 556N、556C、556Q或S556T，較佳為 556T，及/或
m) 564D或564E，較佳為 564E，及/或
n) 590N、590C、590Q、590S、590T、590A、590G、590I、590L、590M、590P或590V，較佳為 590N、590G或590A，更佳為 590N，及/或
o) 649D或649E，較佳為 649E，
其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
本領域技術人員將理解如何鑑定海藻糖磷酸化酶的任何野生型序列之胺基酸位置，該位置對應於SEQ ID NO: 1中的上述位置。為了澄清，且不限制本發明之公開內容，表1所示為其他野生型海藻糖磷酸化酶的序列位置的編號及胺基酸，其對應於SEQ ID NO: 1的位置114、118、225、304、323、349、383、487、550、556、564、590、649，以及712。例如，舞菇海藻糖磷酸化酶的可比較位置對應於前一句所述之位置為SEQ ID NO: 160的位置108、112、221、300、319、345、379、483、544、550、558、584、643、707。
為了本發明之目的，海藻糖磷酸化酶的胺基酸位置的任何取代，其對海藻糖磷酸化酶的催化活性為必不可少的，特別是在SEQ ID NO: 1的海藻糖磷酸化酶的胺基酸位置D379、H403、R507以及K512處的任何取代，或在SEQ ID NO: 81及/或SEQ ID NO: 160的海藻糖磷酸化酶的胺基酸位置D375、H399、R503以及K508處的任何取代，或本領域已知並描述的其他海藻糖磷酸化酶的任何類似位置，在根據本發明產生海藻糖磷酸化酶變體時，應排除這些位置被取代。
於一較佳具體實施例中，如本文所定義之海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少77%同源及/或相同，其中該變體或多胜肽於選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、564，以及649所組成之群組的二個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代， 其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
較佳地，在本文中，該海藻糖磷酸化酶變體於一選自由胺基酸位置712、118、487，以及590所組成之群組的胺基酸位置包含至少另一個胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
在本文中，該海藻糖磷酸化酶變體之較佳特徵在於與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的同源性及/或同一性為至少77.1%，至少77.2%，至少77.3%，至少77.4%，至少77.5%，至少77.6%，至少77.7%，至少77.8%，至少77.9%，78.0%，至少78.1%，至少78.2%，至少78.3%，至少78.4%，至少78.5%，至少78.6%，至少78.7%，至少78.8%，至少78.9%，至少79.0%，至少79.1%，至少79.2%，至少79.3%，至少79.4%，至少79.5%，至少79.6%，至少79.7%，至少79.8%，至少79.9%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，較佳為至少85%，或至少86%，或至少87%%，或至少88%，或至少89%，更佳為至少90%，或至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95，更佳為至少96%，或至少97%，或至少98%，最佳為至少99%，至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%，或100%。
於第一方面之另一較佳實施例中，其也是與之相關的所有先前實施例之一較佳實施例，該海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列與SEQ NO：1的胺基酸序列至少68%同源及/或相同，其中該變體或多胜肽於選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556，以及564所組成之群組的二個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代， 其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
較佳地，在本文中，該變體於一選自由胺基酸位置712、118、487、 590，以及649所組成之群組的胺基酸位置包含至少另一個胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
在本文中，該海藻糖磷酸化酶變體之較佳特徵在於與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列的同源性及/或同一性為至少69%，至少70%，至少71%，至少72%，至少73%，至少74%，至少75%，或至少76%，或至少77%，至少77.1%，至少77.2%，至少77.3%，至少77.4%，至少77.5%，至少77.6%，至少77.7%，至少77.8%，至少77.9%，至少78.0%，至少78.1%，至少78.2%，至少78.3%，至少78.4%，至少78.5%，至少78.6%，至少78.7%，至少78.8%，至少78.9%，至少79.0%，至少79.1%，至少79.2%，至少79.3%，至少79.4%，至少79.5%，至少79.6%，至少79.7%，至少79.8%，至少79.9%，至少80%，至少81%，至少82%，至少83%，至少84%，較佳至少85%，或至少86%，或至少87%，或至少88%，或至少89%，更佳至少90%，或至少91%，或至少92%，或至少93% ，或至少94%，或至少95，甚至更佳至少96%，或至少97%，或至少98%，最佳至少99%，至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%，或100%。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實施例，該變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少63%同源及/或相同，其中該變體或多胜肽於選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、556，以及564所組成之群組的二個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代， 其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
較佳地，在本文中，該變體於一選自由胺基酸位置712、118、487、 550、590，以及649所組成之群組的胺基酸位置包含至少另一個胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO: 1中的一比對位置。
在本文中，該海藻糖磷酸化酶變體之較佳特徵在於與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之同源性及/或同一性為至少64%，或至少65%，或至少66%，或至少67%，或至少68%，或至少69%，至少70%，至少71%，至少72%，至少73%，至少74%，至少75%，或至少76%，或至少77%，至少77.1%，至少77.2%，至少77.3%，至少77.4%，至少77.5%，至少77.6% ，至少77.7%，至少77.8%，至少77.9%，78.0%，至少78.1%，至少78.2%，至少78.3%，至少78.4%，至少78.5%，至少78.6%，至少78.7%，至少78.8%，至少78.9%，79.0%，至少79.1%，至少79.2%，至少79.3%，至少79.4%，至少79.5%，至少79.6%，至少79.7%，至少79.8%，至少79.9%，至少80%，至少81%，至少82% ，至少83%，至少84%，較佳至少85%，或至少86%，或至少87%，或至少88%，或至少89%，更佳至少90%，或至少91% ，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%，甚至更佳至少96%，或至少97%，或至少98%，並且最佳至少99%，至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%，或100%。
較佳地，本發明之海藻糖磷酸化酶包含或由選自由下列序列組成之群組的一胺基酸序列組成： SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189，以及SEQ ID NO: 190。
更佳地，本發明之海藻糖磷酸化酶包含或由選自由以下序列組成之群組的一胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 185，以及SEQ ID NO: 188。
於本發明之一較佳具體實施例中，本文所述之任一具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述。
較佳地，本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶變體，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵：
(A) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一殘餘酶活性為30%至100%；及/或
(B) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50
-值至少為52°C；及/或
(C) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50
值介於52°C至90°C之間；及/或
(D) 一熱穩定性，其中該熱穩定性為一作用穩定性之形式，其特徵在於一為3小時至9天或更長的半衰期，較佳為24小時至9天或更長的半衰期，更佳為4天至9天或更長的半衰期。
較佳地，本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶變體，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，其中該變體進一步
(i) 提供如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述之每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)的產率；及/或
(ii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，並具有如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述之每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)的產率；及/或
(iii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，並具有如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述之每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)的產率。
較佳地，本文所述之任一方面及/或具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體之特徵在於其
(i) 能夠達到每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP；及/或
(ii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP；及/或
(iii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP，其中較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為蔗糖磷酸化酶，且其中較佳地該糖原料較佳為蔗糖。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實施例，該海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO: 1所示之胺基酸序列至少80%同源及/或至少80%相同，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 1的胺基酸位置712、383、10、114、118、192、197、220、225、304、306、318、323、339、349、357、459、476、481、484、487、488、506、511、526、530、532、533、537、550、556、564、590、649、667、703 以及705所組成之群組， 較佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 1的胺基酸位置712、383、114、118、192、197、220、225、304、306、318、323、339、349、357、459、476、481、484、487、488、506、511、526、530、532、533、537、550、556、564、590、667、703，以及705所組成，更佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 1的胺基酸位置712、383、114、118、225、304、323、349、357、487、550、556、564、590，以及649所組成，最佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 1的胺基酸位置383、225、304、323、487、550、556、564、590，以及705所組成。
較佳地，該海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少80%相同及/或至少80%同源，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由胺基酸位置L712、P383、V10、L114、I118、S192、S197、Y220、N225、A304、D306、P318、T323、L339、F349、 G357、A459、Q476、E481、A484、Q487、K488、A506、A511、R526、E530、G532、D533、D537、V550、S556、T564、D590、A649、R667、A703，以及K705所組成之群組，較佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由胺基酸位置L712、P383、L114、I118、S192、S197、Y220、N225、A304、D306、P318、T323、L339、F349、G357、A459、Q476、E481、A484、Q487、K488、A506、A511、R526、E530、G532、D533、D537、V550、S556、T564、D590、R667、A703，以及K705所組成之群組，更佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由胺基酸位置L712、P383、L114、I118、N225、A304、T323、F349、G357、Q487、V550、S556、T564、D590，以及A649所組成之群組，最佳地，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由胺基酸位置P383、N225、A304、T323、Q487、V550、S556、T564、D590，以及K705所組成之群組。
在其一較佳實施例中，這也是本文所述之所有先前實施例之一較佳實施例，該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列包含一個或多個取代，其中該取代選自由下列所組成之群組：
- 在SEQ ID NO: 1的V10位置處的一個胺基酸取代，該取代為V10R、V10H或V10K，較佳為V10R；
- 在SEQ ID NO: 1的L114位置處的一個胺基酸取代，該取代為L114A、L114G、L114I、L114M、L114P或L114V，較佳為L114I；
- 在SEQ ID NO: 1的I118位置處的一個胺基酸取代，該取代為I118A、I118G、I118L、I118M、I118P或I118V，較佳為I118V；
- 在SEQ ID NO: 1的S192位置處的一個胺基酸取代，該取代為S192A、S192G、S192I、S192L、S192M、S192P或S192V，較佳為S192V；
- 在SEQ ID NO: 1的S197位置處的一個胺基酸取代，該取代為S197A、S197G、S197I、S197L、S197M、S197P或S197V，較佳為S197G；
- 在SEQ ID NO: 1的Y220位置處的一個胺基酸取代，該取代為Y220F或Y220W，較佳為Y220F；
- 在SEQ ID NO: 1的N225位置處的一個胺基酸取代，該取代為N225A、N225G、N225I、N225L、N225M、N225P或N225V，較佳為N225I、N225L、N225M或N225V，以及更佳為N225V；
- 在SEQ ID NO: 1的A304位置處的一個胺基酸取代，該取代為A304G、A304I、A304L、A304M、A304P或A304V，較佳為A304I；
- 在SEQ ID NO: 1的D306位置處的一個胺基酸取代，該取代為D306R、D306H或D306K，較佳為D306H；
- 在SEQ ID NO: 1的P318位置處的一個胺基酸取代，該取代為P318R、P318H或P318K，較佳為P318H；
- 在SEQ ID NO: 1的T323位置處的一個胺基酸取代，該取代為T323A、T323G、T323I、T323L、T323M、T323P，或T323V，較佳為T323I；
- 在SEQ ID NO: 1的L339位置處的一個胺基酸取代，該取代為L339A、L339G、L339I、L339L、L339M、L339P或L339V，較佳為L339I；
- 在SEQ ID NO: 1的F349位置處的一個胺基酸取代，該取代為F349W或F349Y，較佳為F349Y；
- 在SEQ ID NO: 1的G357位置處的一個胺基酸取代，該取代為G357A、G357I、G357L、G357M、G357P或G357V，較佳為G357A；
- 在SEQ ID NO: 1的P383位置處的一個胺基酸取代，該取代為P383A、P383G、P383I、P383L、P383M、P383V、P383N、P383C、P383Q、P383S或P383T，較佳為P383V或P383S，更佳為P383V；
- 在SEQ ID NO: 1的A459位置處的一個胺基酸取代，該取代為A459N、A459C、A459Q或A459S、A459T，較佳為A459S；
- 在SEQ ID NO: 1的Q476位置處的一個胺基酸取代，該取代為Q476A、Q476G、Q476I、Q476L、Q476M、Q476P或Q476V，較佳為Q476G；
- 在SEQ ID NO: 1的E481位置處的一個胺基酸取代，該取代為E481A、E481G、E481I、E481L、E481M、E481P或E481V，較佳為E481I；
- 在SEQ ID NO: 1的A484位置處的一個胺基酸取代，該取代為A484N、A484C、A484Q、A484S或A484T，較佳為A484S；
- 在SEQ ID NO: 1的Q487位置處的一個胺基酸取代，該取代為Q487A、Q487G、Q487I、Q487L、Q487M、Q487P或Q487V，較佳為Q487A、Q487G、Q487L或Q487V，更佳為Q487A；
- 在SEQ ID NO: 1的K488位置處的一個胺基酸取代，該取代為K488A、K488G、K488I、K488L、K488M、K488P或K488V，較佳為K488A；
- 在SEQ ID NO: 1的A506位置處的一個胺基酸取代，該取代為A506N、A506C、A506Q、A506S 或A506T，較佳為A506S；
- 在SEQ ID NO: 1的A511位置處的一個胺基酸取代，該取代為A511N、A511C、A511Q、A511S或A511T，較佳為A511S；
- 在SEQ ID NO: 1的R526位置處的一個胺基酸取代，該取代為R526D或R526E 較佳為R526E；
- 在SEQ ID NO: 1的E530位置處的一個胺基酸取代，該取代為E530A、E530G、E530I、E530L、E530M、E530P、E530V，較佳為E530V；
- 在SEQ ID NO: 1的G532位置處的一個胺基酸取代，該取代為G532R、G532H或G532K，較佳為G532R；
- 在SEQ ID NO: 1的D533位置處的一個胺基酸取代，該取代為D533A、D533G、D533I、D533L、D533M、D533P或D533V，較佳為D533G；
- 在SEQ ID NO: 1的D537位置處的一個胺基酸取代，該取代為D537A、D537G、D537I、D537L、D537M、D537P或D537V，較佳為D537M；
- 在SEQ ID NO: 1的V550位置處的一個胺基酸取代，該取代為V550A、V550G、V550I、V550L、V550M或V550P，較佳為V550I；
- 在SEQ ID NO: 1的S556位置處的一個胺基酸取代，該取代為S556N、S556C、S556Q或S556T，較佳為S556T；
- 在SEQ ID NO: 1的T564位置處的一個胺基酸取代，該取代為T564D或T564E，較佳為T564E；
- 在SEQ ID NO: 1的D590位置處的一個胺基酸取代，該取代為D590N、D590C、D590Q、D590S、D590T、D590A、D590G、D590I、D590L、D590M、D590P或D590V，較佳為D590N或D590A，更佳為D590N；
- 在SEQ ID NO: 1的A649位置處的一個胺基酸取代，該取代為A649D或A649E，較佳為A649E；
- 在SEQ ID NO: 1的R667位置處的一個胺基酸取代，該取代為R667D、R667E、R667R、R667H或R667K，較佳為R667E或R667K、更佳為R667E；
- 在SEQ ID NO: 1的A703位置處的一個胺基酸取代，該取代為A703D或A703E，較佳為A703E；
- 在SEQ ID NO: 1的K705位置處的一個胺基酸取代，該取代為K705N、K705C、K705Q、K705S或K705T，較佳為K705N；以及
- 在SEQ ID NO: 1的L712位置處的一個胺基酸取代，該取代為L712A、L712G、L712I、L712M、L712P或L712V，較佳為L712M。
較佳地，該海藻糖磷酸化酶包含或由選自由以下序列組成之群組的一胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159以及SEQ ID NO: 190。
較佳地，該胺基酸序列係選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159以及SEQ ID NO: 190。
於第一方面之該具體實施例及其任何較佳具體實施例的上下文中，該海藻糖磷酸化酶變體之較佳特徵在於與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列之同源性及/或同一性為至少81%， 或至少82%，或至少83%，或至少84%，或至少85%，更佳至少86%，或至少87%，或至少88%，或至少89%， 或至少90%，更佳至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%，最佳至少96%，或至少97%，或至少98%，或至少99%，至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%，或100%。
於本發明之一較佳具體實施例中，前述具體實施例中任一個海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述。
較佳地，本文所述任一具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵：
(A) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一殘餘酶活性為30%至100%；及/或
(B) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50-值至少為52°C；及/或
(C) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50值介於52°C至90°C之間；及/或
(D) 一熱穩定性，其中該熱穩定性為一作用穩定性之形式，其特徵在於一為3小時至9天或更長的半衰期，較佳為24小時至9天或更長的半衰期，更佳為4天至9天或更長的半衰期。
較佳地，前述具體實施例中任一個海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述，並且進一步
(i) 提供如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述之每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)的產率；及/或
(ii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述；及/或
(iii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述。
較佳地，本文所述之任一個具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體的特徵在於其
(i) 能夠達到每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP；及/或
(ii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP；及/或
(iii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP，其中較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為蔗糖磷酸化酶，且其中較佳地該糖原料較佳為蔗糖。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實施例，該海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO: 81及/或SEQ ID NO: 160，較佳為SEQ ID NO: 160，所示之胺基酸序列至少85%或86%相同，及/或至少85%或86%同源，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳為SEQ ID NO: 160，的胺基酸位置108、112、221、300、319、345、379、483、544、550、558、584、643，以及707所組成之群組，且其係較佳選自由SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳為SEQ ID NO: 160，的胺基酸位置108、112、221、300、319、379、483、544、550，以及558所組成之群組，且其係更佳選自由SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳為SEQ ID NO: 160，的胺基酸位置108、221、319、379、483、550，以及558所組成之群組。
較佳地，該海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO: 81所示之胺基酸序列至少85%或86%相同，及/或至少85%或86%同源，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 81的胺基酸位置L108、V112、N221、A300、T319、F345、P379、I483、V544、S550、Q558、N584、A643，以及L707所組成之群組，其係較佳地選自由SEQ ID NO: 81的胺基酸位置L108、V112、N221、A300、T319、P379、I483、V544、S550，以及Q558所組成之群組，且其係更佳地選自由SEQ ID NO: 81的胺基酸位置L108、V112、T319、P379、I483、S550，以及Q558所組成之群組。
同樣較佳的是，該海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO: 160所示之胺基酸序列至少85%或86%相同，及/或至少85%或86%同源，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或更多個胺基酸位置係選自由SEQ ID NO: 160的胺基酸位置L108、V112、N221、A300、T319、F345、P379、V483、V544、S550、Q558、N584、A643，以及L707所組成之群組，其係較佳地選自由SEQ ID NO: 81的胺基酸位置L108、V112、N221、A300、T319、P379、V483、V544、S550，以及Q558所組成之群組，且其係更佳地選自由SEQ ID NO: 81的胺基酸位置L108、V112、T319、P379、V483、S550，以及Q558所組成之群組。
在其一較佳實施例中，這也是本文所述之所有先前實施例之一較佳實施例，該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列包含一個或多個取代，其中該取代係選自由下列組成之群組：
a) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第L108個位置處的一個胺基酸取代，該取代為L108A、L108G、L108I、L108M、L108P或L108V，較佳為L108I；
b) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第V112個位置處的一個胺基酸取代，該取代為V112A、V112G、V112L、V112M、V112P或V112I，較佳為V112I；
c) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第N221個位置處的一個胺基酸取代，該取代為N221A、N221G、N221I、N221L、N221M、N221P或N221V，較佳為N221I、N221L、N221M或N221V，以及更佳為N221V；
d) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第A300個位置處的一個胺基酸取代，該取代為A300G、A300I、A300L、A300M、A300P或A300V，較佳為A300I或A300L，以及更佳為A300I；
e) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第T319個位置處的一個胺基酸取代，該取代為T319A、T319G、T319I、T319L、T319M、T319P，或T319V，較佳為T319I或T319V，以及更佳為T319I；
f) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第P379個位置處的一個胺基酸取代，該取代為P379A、P379G、P379I、P379L、P379M、P379V、P379N、P379C、P379Q、P379S或P379T，較佳為P379A、P379G、P379M、P379V、P379N、P379C、P379Q、P379S或P379T、更佳為P379G、P379V、P379C或P379S，或P379T、even 更佳為P379V或P379T，以及最佳為P379V；
g) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第I483個位置處的一個胺基酸取代，該取代為I483A、I483G、I483I、I483L、I483M、I483P或I483V，較佳為I483A、I483G、I483L、I483M或I483V、更佳為I483A；
h) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第Q483個位置處的一個胺基酸取代，該取代為Q483A、Q483G、Q483I、Q483L、Q483M、Q483P或Q483V，較佳為Q483A、Q483G、Q483L、Q483M或Q483V、更佳為Q483A；
i) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第V544個位置處的一個胺基酸取代，該取代為V544A、V544G、V544I、V544L、V544M或V544P，較佳為V544I或V544P，以及更佳為V544I；
j) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第S550個位置處的一個胺基酸取代，該取代為S550N、S550C、S550Q或S550T，較佳為S550T；
k) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第Q558個位置處的一個胺基酸取代，該取代為Q558D或Q558E，較佳為Q558E；
l) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第D558個位置處的一個胺基酸取代，該取代為D558N、D558C、D558Q、D558S、D558T、D558A、D558G、D558I、D558L、D558M、D558P或D558V，較佳為D558N、D558G或D558A，以及更佳為D558N；
m) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第A643個位置處的一個胺基酸取代，該取代為A643D或A643E，較佳為A643E；
n) 在SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 160，較佳SEQ ID NO: 160，的第L707個位置處的一個胺基酸取代，該取代為L707A、L707G、L707I、L707M、L707P或L707V，較佳為L707M。
較佳地，在本文中，該海藻糖磷酸化酶包含或由選自由下列序列所組成之群組的一胺基酸序列組成：SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188，以及SEQ ID NO: 189，以及較佳為選自由下列序列所組成之群組 SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 185，以及SEQ ID NO: 188。
於第一方面及其任何較佳具體實施例之該具體實施例的上下文中，該海藻糖磷酸化酶變體之較佳特徵在於該胺基酸序列與SEQ ID NO: 81及/或SEQ ID NO: 160，較佳為SEQ ID NO: 160，的同源性及/或同一性為至少85%，更佳至少86%，或至少87%，或至少88%，或至少89%，或至少90%，還更佳至少90%， 至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%，最佳至少96%，或至少97%，或至少98%，或至少99%，至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8% ，特別是至少99.9%，或100%。
於本發明之一較佳具體實施例中，前述具體實施例中任一個的海藻糖磷酸化酶變體為一海藻糖磷酸化酶變體，其特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述。
較佳地，本文所述任一具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵：
(A) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一殘餘酶活性為30%至100%；及/或
(B) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50-值至少為52°C；及/或
(C) 一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52°C下作用15分鐘後的一Tm50值介於52°C至90°C之間；及/或
(D) 一熱穩定性，其中該熱穩定性為一作用穩定性之形式，其特徵在於一為3小時至9天或更長的半衰期，較佳為24小時至9天或更長的半衰期，更佳為4天至9天或更長的半衰期。
較佳地，前述具體實施例中任一項的海藻糖磷酸化酶變體之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵，如本文所述之任一方面及/或具體實施例中所述，且進一步
(i) 在特定溫度下提供每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)產率，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述；及/或
(ii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述；及/或
(iii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，如本文所述之任一方面及具體實施例中所述。
較佳地，本文所述任一具體實施例的海藻糖磷酸化酶變體之特徵在於其
(i) 能夠達到每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自該糖原料蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP；及/或
(ii) 能夠實現一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶，較佳為一蔗糖磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0 g/(L*h)/kU TP至100 g/(L*h)/kU TP；及/或
(iii) 能夠實現一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異構酶之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的產率為至少3 g/(L*h) /kU TP至100 g/(L*h) /kU TP，其中較佳地，該至少一種α-磷酸化酶為蔗糖磷酸化酶，且其中較佳地該糖原料較佳為蔗糖。
於第一方面之另一較佳實施例中，這也是所有先前實施例及與之相關的較佳實施例之一較佳實施例，本發明之方法的特徵在於該至少一種海藻糖磷酸化酶為一海藻糖磷酸化酶，較佳地，如上述任何前述具體實施例中所定義之海藻糖磷酸化酶變體。
更佳地，本發明之方法的特徵在於該至少一種海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組中的任一種：
a) SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189，以及SEQ ID NO: 190，更佳為其中該至少一種海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組：SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 185，以及SEQ ID NO: 188；及/或
b) SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159以及SEQ ID NO: 190，以及較佳為選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159以及SEQ ID NO: 190；及/或
c) SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188，以及SEQ ID NO: 189，較佳為選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 185，以及SEQ ID NO: 188；及/或
d) SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 180，以及SEQ ID NO: 188。
同樣較佳的是，該至少一種海藻糖磷酸化酶變體包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由下列所組成之群組中的任一種：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169，以及SEQ ID NO: 170，較佳為選自由下列序列所組成之群組SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 89，以及SEQ ID NO: 104。
於第一方面的另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實施例，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，較佳為一衍生自屬於放線菌門、芽孢桿菌屬，b變形菌綱、梭菌屬，g變形菌綱，或芽孢桿菌屬之生物的一蔗糖磷酸化酶，更佳為屬於雙歧桿菌或乳桿菌目，甚至更佳屬於雙歧桿菌科、乳桿菌科、明串珠菌科或鏈球菌科，甚至更佳屬於雙歧桿菌屬，以及最佳屬於嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum
)以及巨大雙歧桿菌(Bifidobacterium magnum
,)，並且最佳地屬於巨大雙歧桿菌。
較佳地，在本文中，該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，其中該蔗糖磷酸化酶與選自SEQ ID NO: 202及/或SEQ ID NO: 205，較佳SEQ ID NO: 202所組成之群組的一胺基酸序列具有至少75%的序列同一性及/或序列同源性。
較佳地，在本文中，該至少一種α-磷酸化酶為一野生型蔗糖磷酸化酶之變體，其與SEQ ID NO: 202的胺基酸序列具有至少75%的序列同一性及/或序列同源性。
甚至更佳地，該至少一種α-磷酸化酶為一來自巨大雙歧桿菌的野生型蔗糖磷酸化酶之變體，其與SEQ ID NO: 202的胺基酸序列具有至少75%的序列同一性及/或序列同源性。
於另一較佳具體實施例中，該蔗糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列具有與SEQ ID NO: 202至少84%同源性及/或同一性，其中該胺基酸序列相較於SEQ ID NO: 202為工程化的，使得其於一或多個胺基酸位置包含一個或多個取代，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置92、124、148、188、231、371、461，較佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置92、124、148、188、231，更佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置124、148、188，且最佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置148、188。
較佳地，此外，相較於SEQ ID NO: 202，該胺基酸序列為工程化的，使得其包含二個或更多個取代，其中該額外的取代胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置92、124、148、157、188、231、371，以及461。
甚至更佳地，該蔗糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列與SEQ ID NO: 202具有至少84%同源性及/或同一性，其中該胺基酸序列相較於SEQ ID NO: 202為工程化的，使得其於一或多個胺基酸位置包含一個或多個取代，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置E92、S124、A148、Q188、I231、L371、T461，較佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置E92、S124、A148、Q188、I231，更佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置S124、A148、Q188，以及最佳地，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置A148、Q188。
同樣更佳地，此外，相較於SEQ ID NO: 202，該胺基酸序列為工程化的，使得其包含二個或更多個取代，其中該額外的取代胺基酸位置各自獨立地選自胺基酸位置E92、S124、A148、T157、Q188、I231、L371，以及T461。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，這也是所有先前實施例之一較佳具體實施例，相較於SEQ ID NO: 202，該胺基酸序列為工程化的，使得其於一或多個胺基酸位置包含一個或多個取代，其中於一或多個胺基酸位置的取代各自獨立地選自由下列取代所組成之群組：
(i) 位置E92以A、R、N、D、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y或V取代； 較佳以A、I、L或V取代； 最佳以L取代；
(ii) 位置S124以A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、Y或V取代； 較佳以R、H、K、N、M、C、S、T或Q取代； 甚至更佳以Q、K或T取代； 更佳地以K、T取代； 最佳以K取代；
(iii) 位置A148以R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V取代；較佳以R、H，或K取代；更佳以K或R取代；且最佳以K取代；
(iv) 位置T157以A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y，或V取代；且較佳以D取代；
(v) 位置Q188以A、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V取代；較佳以F、W，或Y取代；且最佳以Y取代；
(vi) 位置I231以A、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V取代；較佳以A、I、L，或V取代；且最佳以V取代；
(vii) 位置L371以A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、Y，或V取代；較佳以A、I、L，或V取代；且最佳以A取代；
(viii) 位置T461以A、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、Y，或V取代；較佳以G或P取代；且最佳以G取代。
出於本發明之目的，應當理解的是，選擇了替代的野生型α-磷酸化酶，較佳為選擇蔗糖磷酸化酶，或其變體，其中替代的蔗糖磷酸化酶及/或變體以增加的熱穩定性為特徵，透過低水解活性，以及相較於本領域中的野生型蔗糖磷酸化酶，在高蔗糖濃度下有效產生α-葡萄糖1-磷酸。
於另一較佳具體實施例中，該蔗糖磷酸化酶具有特徵(E)、(F)、(G)、(H)或其任何組合中的至少一種：
(E) 一Tm50值至少66.5°C至最高90°C，且最佳至少68.0°C至最高72°C，至少68.5°C至最高72°C，或至少68.0°C至最高70°C；
(F) 在70°C下作用15分鐘後的一殘餘活性為至少25%至最高100%，最佳為至少50%至最高64%；
(G) P/H比率為至少200%至最高600%，最佳為至少275%至最高373%；
(H) 在30°C下使用20單位(U)加熱純化的蔗糖磷酸化酶，在24小時內自1M蔗糖與1M磷酸形成α-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的活性為至少300 mM至最高1000 mM，最佳為至少300 mM至最高501 mM，至少350 mM至最高501 mM，至少354 mM至最高501 mM，至少367 mM至最高501 mM，至少400 mM至最高501 mM，至少422 mM至最高501 mM，至少450 mM至最高501 mM，至少484 mM至最高501 mM。
較佳地，於本發明之上下文中，且較佳地在該較佳具體實施例之上下文中，該蔗糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由以下序列組成之群組： SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: NO：210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218，以及SEQ ID NO: 219，較佳地，選自由下列序列組成之群組：SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218，以及SEQ ID NO: 219。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是前述具體實施例之一較佳具體實施例，與SEQ ID NO: 202的胺基酸序列的同源性及/或同一性為至少75.0%、至少75.1%、至少75.2%、至少75.3%、至少75.4%、至少75.5%、至少75.6%、至少75.7%、至少75.8%、至少75.9%、 76.0%、至少76.1%、至少76.2%、至少76.3%、至少76.4%、至少76.5%、至少76.6%、至少76.7%、至少76.8% 、至少76.9%、77.0%、至少77.1%、至少77.2%、至少77.3%、至少77.4%、至少77.5%、至少77.6%、至少77.7%、至少77.8%、至少77.9%、78.0%、至少78.1%、至少78.2%、至少78.3%、至少78.4%、至少78.5%、至少是78.6%、至少78.7%、至少78.8%、至少78.9%、79.0%、至少79.1%、至少79.2%、至少79.3%、至少 79.4%、至少79.5%、至少79.6%、至少79.7%、至少79.8%、至少79.9%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、較佳為至少85%，或至少86%，或至少87%，或至少88%，或至少89%、更佳為至少90%，或至少91%，或至少92%，或至少93%，或至少94%，或至少95%、甚至更佳至少96%，或至少97%，或至少98%、最佳至少99%、至少99.1%，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或在至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%，或100%。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是所有先前具體實施例以及與其相關的較佳具體實施例之一較佳具體實施例，該至少一種α-磷酸化酶為如上述任一前述具體實施例中所定義之蔗糖磷酸化酶。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實例，該至少一種葡萄糖異構酶為一木糖異構酶，其衍生自屬於鏈黴菌屬(Streptomyces)、放線菌屬(Actinomyces)、游動放線菌屬(Actinoplanes)、產氣單胞菌屬(Aeromonas)、節桿菌屬(Arthrobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、類桿菌屬(Bacteroides)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、短桿菌屬(Brevibacterium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、海鞘屬(Ciona)、枸櫞桿菌屬(Citrobacter)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、德庫菌屬(Desemzia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、埃希氏菌屬(Escherichia)、地芽孢桿菌屬(Geobacillus)、麩胺酸桿菌屬(Glutamicibacter)、戈登氏菌屬(Gordonia)、大麥屬(Hordeum)、毛螺梭菌屬(Lachnoclostridium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、白念珠菌屬(Leuconostocaceae)、微桿菌屬(Microbacterium)、小雙孢菌屬(Microbispora)、小單孢菌屬(Micromonospora)、結核分枝桿菌屬(Mycobacterium)、土壤絲菌屬(Nocardia)、類諾卡氏菌屬(Nocardiopsis)、仙人掌屬(Opuntia)、根囊鞭菌屬(Orpinomyces)、類節桿菌屬(Paenarthrobacter)、副伯克氏菌屬(Paraburkholderia)、副大腸桿菌屬(Paracolobacterium)、果膠桿菌屬(Pectobacterium)、梨囊鞭菌屬(Piromyces)、假諾卡氏菌屬(Pseudonocardia)、酵母屬(Saccharomyces)、八疊球菌屬(Sarcina)、畢赤酵母屬(Scheffersomyces)、蛇鞭柱屬(Selenicereus)、鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、鏈孢囊菌屬(Streptosporangium)、嗜熱厭氧菌屬(Thermoanaerobacter)、嗜熱厭氧小桿菌屬(Thermoanaerobacterium)、嗜熱多孢菌屬(Thermopolyspora)、熱袍菌屬(Thermotoga)、棲熱菌屬(Thermus)、弧菌屬(Vibrio)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)或發酵單胞菌屬(Zymomonas)之任一個生物 ，更佳為屬於鏈黴菌屬、放線菌屬、節桿菌屬、地芽孢桿菌屬或熱厭氧桿菌屬中的任何一個，最佳為屬於鏈黴菌屬。
於本發明之上下文中，較佳在包括與其相關的所有較佳具體實施例的第一方面的上下文中，該葡萄糖異構酶為一與SEQ ID NO: 220的胺基酸序列具有至少95%序列同一性及/或序列同源性的葡萄糖異構酶變體，其中該葡萄糖異構酶的胺基酸序列於一或多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該一個或多個胺基酸位置各自獨立地選自由SEQ ID NO: 220胺基酸位置10、33、34、35、53、59、89、90，以及95所組成之群組，較佳地，選自SEQ ID NO: 220胺基酸位置R10、A33、L34、D35、F53、I59、A89、T90，以及T95。
於本發明之一較佳具體實施例中，其也是所有前述具體實施例之一較佳具體實施例，該葡萄糖異構酶較佳包含一個或多個取代，其中該取代選自由下列所組成之群組：
在SEQ ID NO: 220的R10位置上之一胺基酸取代，該取代為R10H或R10K，較佳為R10K；
在SEQ ID NO: 220的A33位置上之一胺基酸取代，該取代為A33I、A33L、A33V、A33G、A33N、A33M、A33C、A33S、A33Q或A33T，較佳為A33I或A33N，最佳為A33I；
在SEQ ID NO: 220的L34位置上之一胺基酸取代，該取代為L34F、L34W、L34Y或L34P，較佳為L34F；
在SEQ ID NO: 220的D35位置上之一胺基酸取代，該取代為D35G、D35N、D35M、D35C、D35S、D35Q或D35T，較佳為D35C或D35S，更佳為D35S；
在SEQ ID NO: 220的F53位置上之一胺基酸取代，該取代為F53A、F53I、F53L或F53V，較佳為F53L；
在SEQ ID NO: 220的I59位置上之一胺基酸取代，該取代為I59F、I59W、I59Y或I59P，較佳為I59F；
在SEQ ID NO: 220的A89位置上之一胺基酸取代，該取代為A89I、A89L或A89V，較佳為A89V；
在SEQ ID NO: 220的T90位置上之一胺基酸取代，該取代為T90G、T90N、T90M、T90C、T90S或T90Q，較佳為T90S；
在SEQ ID NO: 220的T95位置上之一胺基酸取代，該取代為T95F、T95W、T95Y、T95P、T95R、T95H或T95K，較佳為T95Y或T95R，更佳為T95Y。
於第一方面之一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有具體實施例之一較佳具體實施例，該葡萄糖異構酶具有特徵(I)、(K)、(L)，以及(M)中的至少一種，或其任何組合，其中該特徵
(I) 為該葡萄糖異構酶活性增加，用於在果糖濃度為50 mM下，將果糖轉化為葡萄糖，相較於SEQ ID NO: 220的葡萄糖異構酶，至少為增加1.1倍至3.0倍活性；
(K) 為該葡萄糖異構酶活性增加，用於在果糖濃度為200 mM下，將果糖轉化為葡萄糖，相較於SEQ ID NO: 220的葡萄糖異構酶，至少為增加1.2倍至3.0倍活性；
(L) 為該葡萄糖異構酶的熱穩定性，表示為該葡萄糖異構酶在74°C下作用15分鐘後的殘餘活性，其中這種殘餘活性至少為30%至最多100%；
(M) 為該葡萄糖異構酶的kM
值在50 mM與190 mM之間，最佳在140 mM與152 mM之間；及/或小於190 mM，最佳小於155 mM，最佳152 mM。
較佳地，於本發明之上下文中，較佳在包括與其相關的所有較佳具體實施例的第一方面的上下文中，該葡萄糖異構酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 220至SEQ ID NO: 240的序列所組成之群組，較佳為選自由SEQ ID NO: 221至SEQ ID NO: 240的序列所組成之群組，更佳為選自由SEQ ID NO: 232至SEQ ID NO: 240的序列所組成之群組。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是前述具體實施例之一較佳具體實施例，與SEQ ID NO: 220的胺基酸序列的同源性及/或同一性為至少95%，或較佳至少95.5%， 或至少96%，或至少96.5%，或至少97%，或至少97.5%，或至少98%，或至少98.5%，或至少99%，最佳至少99.1% ，或至少99.2%，或至少99.3%，或至少99.4%，或至少99.5%，或至少99.6%，或至少99.7%，或至少99.8%，特別是至少99.9%， 或100%。
於第一方面之另一較佳具體實施例中，其也是所有先前具體實施例以及與其相關的較佳具體實施例之一較佳具體實施例，該至少一種葡萄糖異構酶為如上述任一前述具體實施例中所定義的葡萄糖異構酶。
於第一方面之另一較佳實施例中，其也是所有先前實施例和與之相關的較佳實施例之一較佳實施例，本發明之方法的特徵在於，
i) 該至少一種α-磷酸化酶為以一蔗糖磷酸化酶的形式，其包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218，以及SEQ ID NO: 219，較佳地，選自由下列序列組成之群組SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: NO：215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218，以及SEQ ID NO: 219；及/或
ii) 該至少一種海藻糖磷酸化酶係以一海藻糖磷酸化酶的形式，該海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由下列序列所組成之群組：SEQ ID NO: SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201；較佳地，選自由以下序列所組成之群組SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190；及/或
iii) 該至少一種葡萄糖異構酶為以一葡萄糖異構酶的形式，該葡萄糖異構酶包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO: 220至SEQ ID NO: 240的序列所組成之群組。
於另一較佳具體實施例中，本發明之方法的特徵在於該方法中使用的一種或多種酶存在於純化的、部分純化的，或非純化的製劑中。
於本發明之上下文中，術語“純化的”通常係指一種或多種酶已經從任何來源進行生化純化，較佳來自任何生物來源，較佳在表現之後，更佳地，在其在該生物體內的重組表現後，使該酶具有功能與催化活性，以進行其指定的催化反應。生化純化包括技術人員在蛋白質化學、分子生物學及/或蛋白質生物化學領域中已知的所有方法，包括，但不限於，使用沉澱劑、在升高的溫度下作用、液/固分離以從液相中除去細胞碎片及核酸、微濾、離心、高液體離子交換管柱色層分析、所有親和色層分析方法、分批純化，尺寸排阻色層分析等。
於本發明之上下文中，術語“部分純化的”通常係指一種或多種酶已經從任何來源生化純化，較佳來自任何生物來源，較佳在其在該生物體內表現後，更佳地，在其在該生物體內的重組表現後，透過本領域技術人員已知的任何方式或方法並如上所述，除了目標酶之外，酶製劑還可含有其他組成分及/或污染物。應當理解的是，術語“部分純化的”可以指任何種類的含有酶或目標酶或由其組成的蛋白質製劑，其中這種蛋白質製劑允許每種酶的相應催化活性，以使本發明之方法能夠包括其所有部分及/或後續反應或轉化。
於本發明之上下文中，術語“未純化的”通常係指包含本發明的一種或多種目標酶的任何種類的蛋白質製劑，其中一種或多種酶來自任何來源，較佳來自任何生物來源，較佳在其在該生物體內表現後，更佳地，在其在該生物體內重組表現後，不進行特定的純化程序。於本發明之上下文中，未純化的酶特別指酶製劑，其中酶由生產宿主表現，並由這種宿主分泌到發酵液中，或透過破壞或裂解宿主而自該生產宿主中釋放，產生粗裂解物，且其中這種發酵液或粗裂解物可直接作為酶製備。除了目標酶之外，獲得的酶製劑可以含有其他組成分及/或污染物。應當理解的是，術語“未純化的”可指任何種類的含有或由目標酶或酶組成的蛋白質製劑，其中這種蛋白質製劑允許每種酶的相應催化活性，以使本發明之方法能夠包括其所有部分及/或後續反應或轉化。
較佳地，該一種或多種酶以非固定形式或固定形式存在，較佳為其中一種或多種酶固定在一載體上。
較佳地，用於固定一種或多種本發明酶的合適載體選自適合偶聯及/或結合一種或多種目標酶的任何種類的化學或生物基質，較佳透過吸附性結合或共價結合的方法在結合至官能化聚合物樹脂上，更佳為透過靜電相互作用、疏水相互作用、化學連接劑、交聯、包埋到聚合物基質中，或透過親和結合的方法。
於另一較佳具體實施例中，其也是與其相關的所有先前具體實施例之一較佳具體實施例，該一種或多種酶由含有一種或多種編碼一種、二種、三種，甚是更多種單個重組蛋白的核酸序列的表現元件所表現，它適用於表現由這種核酸序列編碼的蛋白質。
一般已知基於本文公開的胺基酸序列衍生這種核酸分子。較佳地，該核酸序列取決於用於表現該海藻糖磷酸化酶的表現系統及/或用於表現本文所述之任何酶。酶的表現元件可選自表現元件，例如重組質體、重組附加型表現載體、酵母人工染色體，以及重組基因組整合的核酸元件，其包含或由編碼本發明酶的核酸分子組成。用於表現海藻糖磷酸化酶及/或表現本文所述任何酶的較佳表現元件為重組質體與重組基因組整合的核酸元件，其包含或由編碼酶的核酸分子組成。本發明透過轉染或基因組整合引入用於表現海藻糖磷酸化酶的較佳表現系統及/或用於表現本文所述之任何酶。較佳的表現系統為大腸桿菌、芽孢桿菌、巴斯德畢赤酵母菌以及真菌表現系統，如曲霉屬(Aspergillus sp .
)。
於又一個具體實施例中，本發明涉及一種方法，其中使用含有編碼海藻糖磷酸化酶及/或本文所述任何酶的核酸分子的載體。較佳地，該載體為一表現載體。用於表現酶的合適載體已在現有技術中描述。
於一較佳具體實施例中，本發明涉及表現海藻糖磷酸化酶及/或本文所述任何酶之方法。所述方法包括培養如該說明書中所揭露之宿主生物體，其中該宿主生物體包含一表現載體，其中該表現載體包含編碼一海藻糖磷酸化酶及/或本發明任何酶的核酸分子，在允許表現該核酸分子的條件下，並收穫該海藻糖磷酸化酶及/或用於本文所述之任何酶。
於又一具體實施例中，本發明涉及含有本發明載體之宿主生物體。已經描述了含有用於表現酶的載體之合適宿主，且較佳地，該宿主生物體為大腸桿菌(E. coli
)、芽孢桿菌(Bacillus sp
)、巴斯德畢赤酵母菌(P. pastoris
)或真菌表現系統如麴菌屬(Aspergillus sp.
)，較佳為大腸桿菌及巴斯德畢赤酵母菌。將這種載體整合到該宿主生物體中的方法也是已知的。
於本文中，該一種或多種酶在宿主生物中表現，該宿主生物選自酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞，以及細菌細胞。
於本發明之上下文中，該酵母細胞可以衍生自各種物種，包括，但不限於，釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae
)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe
)、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica
)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、棉阿舒囊黴(Ashbya gossypii
)、破壁酵母(Cyberlindnera jadinii
)、巴斯德畢赤酵母菌(Pichia pastoris
)、乳酸克魯維酵母菌(Kluyveromyces lactis
)、多形漢遜酵母菌(Hansenula polymorpha
)、博伊丁氏假絲酵母菌(Candida boidinii
)、解腺嘌呤阿氏酵母菌(Arxula adeninivorans
)、紅發夫酵母菌(Xanthophyllomyces dendrorhous
)或白色念珠菌(Candida albicans
)物種，最佳來自釀酒酵母物種的細胞。
此外，真菌細胞可以衍生自各種物種，包括，但不限於，絲狀真菌，屬於嗜熱絲孢菌屬(Thermomyces)，頂孢黴菌屬(Acremonium)，麴菌屬(Aspergillus)，青黴菌屬(Penicillium)，毛黴菌屬(Mucor)，脈孢菌屬(Neurospora)，木黴屬(Trichoderma)等的任何成員，而細菌細胞可為來自大腸桿菌與枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis
)等物種的細胞。
於本發明之一較佳具體實施例中，該方法的一種或多種轉化在本文所述的一種或多種宿主生物中進行及/或實施。
於本發明範圍內，本文描述及使用之海藻糖磷酸化酶及/或一種或多種另外的酶作為全長酶存在。於本發明範圍內，本文描述及使用之海藻糖磷酸化酶及/或一種或多種另外的酶作為片段存在。較佳地，該片段保留海藻糖磷酸化酶及/或本文所述之任何其他酶活性，較佳為本文定義與各自公開的海藻糖磷酸化酶活性。
於本發明之每個及任何方面之一具體實施例中，包括其任何具體實施例，使用如本文公開之TP測定法I及/或TP測定法II測定在給定溫度與給定時間後的Tm50值及/或殘餘活性，及/或根據本公開的任何海藻糖磷酸化酶的作用穩定性。
於本發明之每個及任何方面之一具體實施例中，包括其任何具體實施例，使用如本文公開之蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I及/或蔗糖磷酸化酶(SP)測定法II測定根據本發明之任何蔗糖磷酸化酶在給定溫度及給定時間後的Tm50值及/或殘餘活性。
於本發明之每個及任何方面之一具體實施例中，包括其任何具體實施例，使用如本文公開之葡萄糖異構酶(GI)測定法I及/或葡萄糖異構酶(GI)測定法II測定根據本發明之任何葡萄糖異構酶在給定溫度及給定時間後的Tm50值及/或殘餘活性。
應當理解的是，本發明之每個及任何方面的任何酶，較佳至少一種海藻糖磷酸化酶，至少一種α-磷酸化酶及/或至少一種葡萄糖異構酶，包括其任何具體實施例，以下列形式之一存在：液體溶液、乾燥粉末、凍乾粉末，或固定形式。
於本發明之每個及任何方面的具體實施例中，包括其任何具體實施例，適用以下定義。
定義同源性
：於本發明之含義中，較佳使用BLASSP將同源性計算為同一性(Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997年) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402；Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schäffer, and Yi-Kuo Yu (2005年) “Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices.” FEBS J. 272:5101-5109)，較佳為使用BLASTP 2.2.29+版本(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，較佳為使用以下設定：
· 欄位“輸入查詢序列”：查詢子範圍：無
· 欄位“選擇搜索設定”：資料庫：非多餘蛋白質序列(nr)；可選參數：無
· 欄位“程序選擇”：演算法：blastp (蛋白質-蛋白質BLAST)
· 演算法參數：欄位“一般參數”：最大目標序列：100；短查詢：自動調整短輸入序列之參數；預期門檻：10；字元大小：3；查詢範圍中的最大匹配數：0
· 演算法參數：欄位“評分參數”：矩陣：BLOSUM62；差距成本：存在：11擴展：1；成分調整：條件成分分數矩陣調整
· 演算法參數：欄位“過濾器與屏蔽”：過濾器：無； 屏蔽：無。
對具有超過35%查詢覆蓋率的序列結果進行過濾。
定義熱穩定性
：出於本說明書之目的，酶的熱穩定性為這種酶在升高的溫度下作用一給定時間後保持酶活性的性質。由此可以在任何測定條件下測定酶活性。為了本發明之目的，透過測量一種或多種下列特徵來確定某種酶的熱穩定性之改善：
-Tm50 值
：為了本發明之目的，該Tm50值為在該溫度下在合適的緩衝液中作用15分鐘後酶具有其初始活性的50%之溫度。該初始活性為沒有溫度處理的相應酶的活性，即在室溫下作用15分鐘。該酶活性原則上可以透過使用任何活性測定法來確定；為了本發明之目的，已經如下所述以及在實施例中所述使用海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I或II，蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或II，或葡萄糖異構酶(GI)測定法I或II各自用於海藻糖磷酸化酶(TP)、蔗糖磷酸化酶(SP)或葡萄糖異構酶(GI)。其中，用於測量Tm50值的合適緩衝液為50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，如實施例中所述。為了測量海藻糖磷酸化酶(TP)的Tm50值，50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7有時還含有如實施例中所述的1M蔗糖。
-作用穩定性 / 半衰期
：為了本發明之目的，在合適的緩衝液中以及在合適的溫度下測定長期穩定性。該半衰期定義為酶在t = 0分鐘時具有50%活性的持續時間。酶活性原則上可以透過使用任何活性測定法來確定；為了本發明之目的，如下所述以及在實施例中所述使用海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I或II、蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或II，或葡萄糖異構酶(GI)測定法I或II各自用於海藻糖磷酸化酶(TP)、蔗糖磷酸化酶(SP)或葡萄糖異構酶(GI)。其中，用於測量作用穩定性的合適緩衝液為50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，如實施例中所述。為了測量海藻糖磷酸化酶(TP)的作用穩定性，50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7還含有實施例中所述的1M蔗糖。
-15 分鐘 /52°C 後的殘餘活性
：為了本發明之目的，15分鐘/52°C後的殘餘活性定義為在52°C下作用15分鐘後酶的活性，相較於未在52°C下作用15分鐘的酶活性。透過將在52°C下作用15分鐘後的活性除以未在52°C下作用的活性並將該值乘以100以獲得殘餘活性值(百分比)來計算殘餘活性。酶活性原則上可以透過使用任何活性測定法來確定。為了本發明之目的，海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I或II、蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或II，或葡萄糖異構酶(GI)測定法I或II各自用於海藻糖磷酸化酶(TP)、蔗糖磷酸化酶(SP)或葡萄糖異構酶(GI)已如下所述並如實施例中所述使用。
-15 分鐘 /52.5°C 後的殘餘活性
：為了本發明之目的，15分鐘/52.5°C後的殘餘活性定義為酶在52.5°C下作用15分鐘後的活性，相較於未在52.5°C下作用的酶活性。透過將在52.5°C下作用15分鐘後的活性除以未在52.5°C下作用的活性並將該值乘以100以獲得殘餘活性值(百分比)來計算殘餘活性。酶活性原則上可以通過使用任何活性測定法來確定。出於本發明之目的，海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I或II、蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或II，或葡萄糖異構酶(GI)測定法I或II各自用於海藻糖磷酸化酶(TP)、蔗糖磷酸化酶(SP)或葡萄糖異構酶(GI)已如下所述並如實施例中所述使用。
-15 分鐘 /70°C 後的殘餘活性
：為了本發明之目的，15分鐘/70°C後的殘餘活性定義為在70°C下作用15分鐘後酶的活性，相較於未在70°C下作用的酶活性。透過將在70°C下作用15分鐘後的活性除以未在70°C下作用的活性並將該值乘以100以獲得殘餘活性值(百分比)來計算殘餘活性。酶活性原則上可以通過使用任何活性測定法來確定。出於本發明之目的，海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I或II、蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或II，或葡萄糖異構酶(GI)測定法I或II各自用於海藻糖磷酸化酶(TP)、蔗糖磷酸化酶(SP)或葡萄糖異構酶(GI)，已如下所述並如實施例中所述使用。
每千單位 ( kU) 海藻糖磷酸化酶 ( TP) 的產率之定義
：每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶(TP)的產率計算方法為：將來以雙酶法或三酶法中自糖原料產生的海藻糖每升反應體積的量分別除以反應時間以及以千單位加入到該反應中的海藻糖磷酸化酶(TP)催化活性的量。海藻糖磷酸化酶(TP)單位透過本領域已知的標準酶測定法確定。海藻糖磷酸化酶(TP)單位可以透過使用如本發明上下文中概述的海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I來確定，其特徵在於海藻糖的量以每立方克海藻糖脫水率的形式給出，且反應時間以小時表示。根據本發明方法的每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶的產率是或可以在酶轉化過程中的任何時間確定，直到反應完成時，其中透過酶促轉化不再形成海藻糖產物。該糖原料可為蔗糖或澱粉，且較佳為蔗糖。如果該方法在分開的連續步驟中進行，則對於包含海藻糖磷酸化酶作為反應一部分的步驟，是或可以確定每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶(TP)的產率；然後，用於這種分離步驟的酶促轉化的基質是在任何前面的步驟中從糖原料獲得的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)中間體。
海藻糖磷酸化酶 (TP) 的磷酸化活性以及合成活性之定義
：由於海藻糖磷酸化酶(TP)催化海藻糖的可逆磷酸裂解，可以在海藻糖磷酸解或合成的方向上測定活性。為了本發明之目的，磷酸解活性定義為在無機磷酸鹽存在下對於α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)以及葡萄糖在下述條件下作為海藻糖磷酸化酶(TP)測定法I的海藻糖裂解活性。合成活性定義為在下文描述為海藻糖磷酸化酶(TP)測定法II的條件下從α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)以及葡萄糖合成海藻糖的活性。在本發明範圍內，任何活性以及海藻糖磷酸化酶的任何活性於一具體實施例中為一催化活性。
海藻糖磷酸化酶 (TP) 測定法 I 之定義
：使用連續偶聯測定法在30°C下常規測定磷酸解活性，其中由海藻糖產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)透過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液含有：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7、2.5 mM NADP、10 μM葡萄糖1,6-二磷酸、10 mM MgCl2
、225 mM海藻糖，3 U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
海藻糖磷酸化酶 (TP) 測定法 II 之定義
：使用以下條件在40°C下常規測定合成活性：50 mM鈉MES緩衝液pH 7、100 mM α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)，以及100或500 mM濃度的葡萄糖，如所提供的。透過基於在酸性條件下以鉬酸鹽形成複合物的測定法測量釋放的磷酸鹽，不連續地測定反應進程。透過硫酸亞鐵還原鉬酸鹽絡合物並產生藍色，其在750 nm下光度分析。對於分析，將250 μL樣品與250 μL 0.5M HCl以及500 μL鉬酸鹽試劑(在3.5%硫酸中，73.2 g/L Fe(II)SO4
*7H2
O以及10 g/L鉬酸銨*4H2
O)混合。在室溫(RT)下作用15-30分鐘後，於750 nm處測量吸光值。使用外部標準品量化樣品中無機磷酸鹽的量。
蔗糖磷酸化酶 (SP) 的磷酸化活性之定義
：為了本發明之目的，蔗糖磷酸化酶的磷酸解活性定義為磷酸化蔗糖裂解成α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)以及果糖的活性。使用如下所述並在實施例中指定的蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I或蔗糖磷酸化酶(SP)測定法II常規測定蔗糖磷酸化酶的磷酸解活性。
蔗糖磷酸化酶 (SP) 水解活性之定義
：為了本發明之目的，蔗糖磷酸化酶的水解活性定義為使用如下所述的蔗糖磷酸化酶(SP)測定法III將水解α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)裂解為葡萄糖以及無機磷酸鹽的活性。
蔗糖磷酸化酶 (SP) 測定法 I 之定義
：蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I包括在30°C下使用連續偶聯測定法，其中由蔗糖基質產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)透過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液含有：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7、2.5 mM NADP、10 μM葡萄糖1,6-二磷酸、10 mM MgCl2
、250 mM蔗糖、3 U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。
蔗糖磷酸化酶 (SP) 測定法 II 之定義
：或者，可以如所述在未偶聯測定中測定磷酸化活性。 簡言之，在500 mM蔗糖以及200 mM磷酸鉀緩衝液pH 7的存在下，將蔗糖磷酸化酶在30°C下作用。在離散的時間點，取20 μl樣品並通過加入80 μL 0.25M HCl使其不活化。中和樣品並測定α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)濃度。為了測定α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)濃度，將10 μL樣品加入到含有48 mM磷酸鉀緩衝液、2 mM MgCl2
、0.7 mM NADP、3.8 mM葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，以及3.3 U/mL磷酸葡糖苷酶的90μL檢測試劑中。在室溫下作用20分鐘後，測定340 nm處的吸光值。以衍生自具有已知量的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)之樣品的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)校準曲線定量α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的量。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。
蔗糖磷酸化酶 (SP) 測定法 III 之定義
：透過加入含有100 mM α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)以及50 mM 2-(N-嗎啉代)乙磺酸緩衝液pH 7的溶液並在30°C下作用以測定蔗糖磷酸化酶的水解活性。在離散的時間點，取100 μl樣品並透過加入200 μL 1M HCl使其不活化。中和樣品並如實施例1中所述測定α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)濃度。簡言之，將10 μL樣品加入到含有48 mM磷酸鉀緩衝液、2 mM MgCl2
、0.7 mM NADP、3.8 mM葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，以及3.3 U/mL磷酸葡糖苷酶的90μL檢測試劑中。在室溫下作用20分鐘後，測定340 nm處的吸光值。以衍生自具有已知量的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的樣品的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)校準曲線定量α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的量。透過α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)-濃度隨時間的線性回歸從初始斜率計算水解活性。1U定義為在特定條件下每分鐘催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)水解裂解的酶量。如果蔗糖磷酸化酶來自未經純化的無細胞萃取物，則進行熱純化步驟以除去宿主背景的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解活性。因此，將細胞萃取物在55°C下作用15分鐘。透過離心將含有可溶性酶的經熱純化的無細胞萃取物與碎片分離。相較於另一種野生型酶，該野生型酶或其變體的蔗糖磷酸化酶的水解活性降低表示α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)在由固有酶特性引起的反應中具有更高的穩定性。
葡萄糖異構酶 (GI) 測定法 I 之 定義
：透過使用以下條件監測40°C下果糖形成葡萄糖來測定葡萄糖異構酶活性：50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7、10 Mg2+
(作為MgCl2
或MgSO4
)、0.2 mL/mL反應葡萄糖異構酶製劑(以50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7稀釋，以達到最大產率18%)以及如所提供的50或200 mM濃度的果糖。透過葡萄糖異構酶的作用從果糖產生的葡萄糖使用不連續偶聯測定法測定，其中葡萄糖通過己糖激酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。 D-GLUCOSE-HK套組(HK/G6P-DH形式)以微孔盤形式使用(產品編號K-GLUHK-110A或K-GLUHK-220A，購自Megazyme International Ireland公司，威克洛，愛爾蘭)。根據製造商的建議進行測定，並使用外部標準品量化樣品中的葡萄糖量。
葡萄糖異構酶 (GI) 測定法 II 之 定義
：透過在以下條件下監測來自果糖的葡萄糖之形成以進行測量葡萄糖異構酶活性的反應：50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7、10 mM MgSO4
、0.05 mL/mL反應葡萄糖異構酶製劑(以50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7稀釋至最大產率18%)，50-1000 mM果糖濃度，以及40°C。透過每毫升反應添加0.1 mL 0.25M HCl來淬滅反應。透過葡萄糖異構酶的作用自果糖產生的葡萄糖使用不連續偶聯測定法測定，其中葡萄糖通過葡萄糖氧化酶轉化為葡糖酸內酯。過氧化氫(該反應的副產物)被辣根過氧化物酶用於氧化2,2'-連氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，產生有色產物，其在405 nm處顯示吸光值。 將10 μL等分的酸猝滅反應物與90 μL含有50 mM磷酸鉀緩衝液pH6、1 mM ABTS、5 U/mL葡萄糖氧化酶，以及1 U/mL辣根過氧化物酶的測定混合物混合。於30°C下作用60-70分鐘後，測量405 nm處的吸光值(終點測量)。使用外部標準品量化樣品中的葡萄糖量。
P/H 比率 之 定義
：蔗糖磷酸化酶的P/H比率為各蔗糖磷酸化酶的磷酸化水解以及水解活性之間的比率。透過將使用這種蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶(SP)測定法I測定的磷酸化活性除以使用相同蔗糖磷酸化酶的蔗糖磷酸化酶(SP)測定法III測定的水解活性，並將該值乘以100來計算，以獲得該蔗糖磷酸化酶的P/H比的百分比。
α-D- 葡萄糖 1- 磷酸 (aG1P) 形成
：為了本發明之目的，透過在溶液中作用20 U的每種加熱純化的蔗糖磷酸化酶來測試在高濃度的基質蔗糖中形成α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的蔗糖磷酸化酶的效率。在30°C下，含有1M蔗糖以及1M磷酸鹽緩衝液(pH 7)作用24小時，隨後定量反應混合物的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)濃度。透過將10 μL樣品添加至含有48 mM磷酸鉀緩衝液、2 mM MgCl2
、0.7 mM NADP、3.8 mM葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，以及3.3 U/mL磷酸葡糖苷酶的90 μL檢測試劑來測定α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)濃度。在室溫下作用20分鐘後，測定340 nm處的吸光值。以衍生自具有已知量的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的樣品的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)校準曲線定量α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)的量。
於一具體實施例中，如果沒有相反指出，則定義由多胜肽，或透過海藻糖磷酸化酶變體，較佳為本發明的任何海藻糖磷酸化酶顯示或將顯示的任何活性、酶活性、磷酸解活性，以及合成活性，且分別透過本文公開之方法及測定法確定。
表 1.
序列識別號之概述。
表 2.
在與SEQ ID NO: 1比對後不同野生型海藻糖磷酸化酶在位置114、118、225、304、323、349、383、487、550、556、564、590、649處的胺基酸及相應位置(使用Clustal omega進行比對(Goujon M, McWilliam H, Li W, Valentin F, Squizzato S, Paern J, Lopez R Nucleic acids research 2010 Jul, 38 Suppl: W695-9))。 實施例
實施例
1
：野生型酶的選殖以及突變體的產生
重組表現菌株之製備：野生型酶的所有基因，即來自裂褶菌(S. commune
)的海藻糖磷酸化酶基因、來自舞菇(G. frondosa
)的海藻糖磷酸化酶基因、來自巨大雙歧桿菌(B. magnum
)的蔗糖磷酸化酶基因，以及來自鏈黴菌SK的葡萄糖異構酶基因，經密碼子優化以在大腸桿菌中表現，並由Eurofins MWG Operon或Geneart Thermo Fisher Scientific公司合成。將基因選殖到表現載體pLE1A17 (pRSF-1b的衍生物，Novagen公司)中。所得質體用於轉型至大腸桿菌BL21(DE3)，大腸桿菌W3110或大腸桿菌W3110衍生物，其攜帶內源酶基因的某些缺失(統稱為“表現宿主”)。
分子生物學方法：透過現有技術中已知的標准定點誘變技術產生酶的突變體。
實施例
2
：酶製劑之製備
海藻糖磷酸化酶(TP)製劑之製備：透過接種培養基I (4.6 g/L酵母萃取物，9.3 g/L蛋白腖，25 mM Na2
HPO4
*12H2
O，25 mM KH2
PO4
，50 mM NH4
Cl2
，Na2
SO4
，5 g/L甘油，0.5 g/L葡萄糖*1H2
O，2 mM MgSO4
，50 μg/mL卡那黴素)在搖瓶中表現含有重組海藻糖磷酸化酶(TP)的表現宿主，具有新鮮的過夜培養物。培養物在37°C下生長至600 nm的光密度為0.6-0.8。以0.1 mM IPTG終濃度誘導培養物。於24-25°C下過夜表現。為了製備不含蔗糖的細胞萃取物，透過離心收穫細胞並懸浮在含有50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2 mM MgCl2
、0.5 mg/mL溶菌酶，以及20U/mL核酸酶的緩衝液中。透過超音波處理破壞細胞。透過離心將含有可溶性酶的無細胞萃取物與碎片分離。為了以蔗糖作為穩定劑製備細胞萃取物，透過離心收穫細胞並懸浮在含有100 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2 mM MgCl2
、0.5 mg/mL溶菌酶，以及20U/mL核酸酶的緩衝液中。通過超音波處理破壞細胞。透過離心將含有可溶性酶的無細胞萃取物與碎片分離，並以2M蔗糖溶液以1：2比例稀釋。
蔗糖磷酸化酶(SP)製劑之製備：透過接種培養基I (4.6 g/L酵母萃取物，9.3 g/L蛋白腖，25 mM Na2
HPO4
*12H2
O，25 mM KH2
PO4
，50 mM NH4
Cl2
，Na2
SO4
，5 g/L甘油，0.5 g/L葡萄糖*1H2
O，2 mM MgSO4
，50 μg/mL卡那黴素)表現含有重組蔗糖磷酸化酶(SP)的表現宿主，具有新鮮的過夜培養物。培養物在37°C下生長至600 nm的光密度為0.6-0.8。以0.1 mM IPTG終濃度誘導培養物。於30°C下過夜表現。使用如別處所述的熟知方法製備無細胞萃取物。透過離心收穫細胞並懸浮在含有50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2 mM MgCl2
、0.5 mg/mL溶菌酶，以及20U/mL核酸酶的緩衝液中。透過超音波處理或反覆冷凍/解凍循環進行細胞破碎。透過離心將含有可溶性酶的無細胞萃取物與碎片分離。
葡萄糖異構酶(GI)製劑之製備：透過接種培養基I (4.6 g/L酵母萃取物，9.3 g/L蛋白腖，25 mM Na2
HPO4
*12H2
O，25 mM KH2
PO4
，50 mM NH4
Cl2
，Na2
SO4
，5 g/L甘油，0.5 g/L葡萄糖*1H2
O，2 mM MgSO4
，50 μg/mL卡那黴素)表現含有重組蔗糖磷酸化酶(SP)的表現宿主，具有新鮮的過夜培養物。培養物在37°C下生長至600 nm的光密度為0.8-1.0。 以0.1 mM IPTG終濃度誘導培養物。在30°C下過夜表現。透過離心收穫細胞然後進行化學酶解，完成無細胞萃取物之製備。為此，將細胞懸浮於含有50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，1x CelLytic™ B細胞裂解試劑(Sigma公司)，2 mM Mg2+
(作為MgCl2
或MgSO4
)，0.5 mg/mL溶菌酶，以及20 U/mL的核酸酶緩衝液中，並在30°C下作用45分鐘。透過在3,270×g以及4°C下離心30分鐘，從碎片中分離出含有可溶性酶的無細胞萃取物。
實施例
3
：蔗糖對熱穩定性之影響
將來自實施例2的SEQ ID NO: 1的海藻糖磷酸化酶(TP)的50 μL等分試樣(含有及不含1M蔗糖)在36至53.7°C的溫度下作用15分鐘。透過離心分離變性蛋白質。使用以下測定法確定所得上清液以及不具熱不活化步驟的細胞萃取物的活性：使用連續偶聯測定法在30°C下測定磷酸解活性，其中由海藻糖產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)透過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液包含：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2.5 mM NADP，10μM葡萄糖1,6-二磷酸，10 mM MgCl2
、225 mM海藻糖，3 U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。圖1為含有及不含1M蔗糖作為穩定劑的SEQ ID NO: 1的變性圖譜，顯示相較於沒有熱不活化的酶製劑所獲得的殘餘活性。添加1M蔗糖導致Tm50從大約40°C增加至47.5°C。因此選擇1M蔗糖作為海藻糖磷酸化酶(TP)的穩定劑。
實施例
4
：海藻糖磷酸化酶
(TP)
變體之殘餘活性
將來自實施例2的SEQ ID NO: 1-79，SEQ ID NO: 84-159，以及SEQ ID NO: 190的50 μL等分試樣的海藻糖磷酸化酶(TP)酶製劑與1M蔗糖在52°C下作用15分鐘。透過離心分離變性蛋白質。使用以下測定法確定所得上清液以及不具熱不活化步驟的細胞萃取物的活性：使用以下條件在40°C下測定合成活性：50 mM鈉MES緩衝液pH 7，100 mM α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)，以及500 mM葡萄糖。透過基於在酸性條件下以鉬酸鹽形成複合物的測定法測量釋放的磷酸鹽，不連續地測定反應進程。透過硫酸亞鐵還原鉬酸鹽絡合物並產生藍色，其係在750 nm下進行光度分析。針於分析，將250 μL樣品與250 μL 0.5M HCl以及500 μL鉬酸鹽試劑(73.2 g/L Fe(II)SO4
*7H2
O以及10 g/L鉬酸銨*4H2
O在3.5%硫酸中)混合。在室溫下作用15-30分鐘後，於750 nm處測量吸光值。使用外部標準品量化樣品中無機磷酸鹽的量。1U定義為在特定條件下催化產生1 μmol無機磷酸鹽的酶量。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。產生的殘餘活性列於表3中。
表 3.
在52°C下作用15分鐘後的殘餘活性(%)
將來自實施例2的SEQ ID NO: 160-189的海藻糖磷酸化酶(TP)的50 μL等分試樣與1M蔗糖在52.5°C下作用15分鐘。透過離心分離變性蛋白質。使用以下測定法確定所得上清液以及不具熱不活化步驟的細胞萃取物之活性：使用以下條件在40°C下測定合成活性：50 mM鈉MES緩衝液pH 7，100 mM α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)，以及500 mM葡萄糖。透過基於在酸性條件下用鉬酸鹽形成複合物的測定法測量釋放的磷酸鹽，不連續地測定反應進程。透過硫酸亞鐵還原鉬酸鹽絡合物並產生藍色，其係在750nm下進行光度分析。針對分析，將250 μL樣品與250 μL 0.5M HCl以及500 μL鉬酸鹽試劑(73.2 g/L Fe(II)SO4
*7H2
O以及10 g/L鉬酸銨*4H2
O在3.5%硫酸中) 混合。在室溫下作用15-30分鐘後，於750 nm處測量吸光值。使用外部標準品量化樣品中無機磷酸鹽的量。1U定義為在特定條件下催化產生1 μmol無機磷酸鹽的酶量。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。產生的殘餘活性列於表4中。可以看出，SEQ ID NO: 176、178、180、185以及SEQ ID NO: 188的殘餘活性高於50%，這表示這些序列的Tm50值高於52.5°C。
表 4.
在52°C作用15分鐘後的殘餘活性%
實施例
5
：以蔗糖測定海藻糖磷酸化酶
(TP)
之
Tm50
值
將來自實施例2的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 180 ，以及SEQ ID NO: 188的海藻糖磷酸化酶(TP)的50 μL等分試樣與1M蔗糖在36至53.7°C下作用15分鐘。透過離心分離變性蛋白質。使用以下測定法確定所得上清液以及不具熱不活化步驟的細胞萃取物的活性：使用連續偶聯測定法在30°C下測定磷酸解活性，其中由海藻糖產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)通過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。通過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液含有：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2.5 mM NADP，10μM葡萄糖1,6-二磷酸，10 mM MgCl2
、225 mM海藻糖，3U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。將Tm50值確定為酶具有50%殘餘活性的溫度(表5)。
表 5.
含有1M蔗糖的50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中海藻糖磷酸化酶(TP)的Tm50值
實施例
6
：測定蔗糖磷酸化酶
(SP)
的
Tm50
值
將來自實施例2的SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 218 and SEQ ID NO: 219的蔗糖磷酸化酶(SP)的50 μL等分試樣在50°C至-80°C下作用15分鐘。在冰上進行再生步驟30分鐘後，離心除去沉澱的蛋白質後，使用以下測定法測定上清液中的蔗糖磷酸化酶活性：使用連續偶聯測定法在30°C下測定蔗糖磷酸化酶的磷酸解活性，其中由蔗糖基質產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)透過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液包含：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2.5 mM NADP，10μM葡萄糖1,6-二磷酸，10 mM MgCl2
、250 mM蔗糖，3U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。此外，使用相同的測定法測定未經熱處理的細胞萃取物的活性。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。將Tm50值確定為酶具有50%殘餘活性的溫度(表6)。
表6.
蔗糖磷酸化酶(SP)的Tm50值
實施例
7
：葡萄糖異構酶
(GI)
之熱穩定性
透過在不同溫度下進行熱不活化，然後進行活性測量來確定葡萄糖異構酶變體的變性曲線。將來自實施例2的葡萄糖異構酶製劑分成幾個等分試樣。將60 μL等分試樣的每種葡萄糖異構酶變體在65-85°C的溫度下作用15分鐘。透過在4°C以及3,270xg下離心10分鐘來分離變性蛋白質。使用以下測定法測定上清液的活性：透過使用以下條件監測40°C下果糖形成葡萄糖來測定葡萄糖異構酶活性：50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，10 Mg2+
(作為MgCl2
或MgSO4
)，0.2 mL/mL反應葡萄糖異構酶製劑(在50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中稀釋，以達到最大產率18%)以及200 mM果糖。透過葡萄糖異構酶的作用從果糖產生的葡萄糖使用不連續偶聯測定法測定，其中葡萄糖透過己糖激酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。D-GLUCOSE-HK套組(HK/G6P-DH形式)以微孔板形式使用(產品編號為K-GLUHK-110A或K-GLUHK-220A，購自Megazyme International Ireland公司，威克洛，愛爾蘭)。根據製造商的建議進行測定，並使用外部標準品量化樣品中的葡萄糖量。使用相同的測定法直接測定每種葡萄糖異構酶變體的另一等分試樣的活性而不進行熱不活化。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。將Tm50值確定為酶具有50%殘餘活性的溫度(表7)。
表 7 .
50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中葡萄糖異構酶變體的Tm50值
實施例
8
：作用穩定性之測定
SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 180 and SEQ ID NO: 188的海藻糖磷酸化酶(TP)之作用穩定性於45°C下在含有1M蔗糖的50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中測定。將含有1M蔗糖的來自實施例2的酶製劑在含有1M蔗糖的50 mM磷酸鉀緩衝液(pH 7)中稀釋，並於45°C下作用16天。隨時間取樣並使用以下測定法測量活性：使用連續偶聯測定法在30°C下測定磷酸解活性，其中由海藻糖產生的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)透過磷酸葡糖苷酶轉化為葡萄糖-6-磷酸。透過葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸與NADP轉化為6-磷酸-葡萄糖酸鹽以及NADPH。檢測基於測量NADPH在340 nm處的吸光值。測定溶液含有：75 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，2.5 mM NADP，10 μM葡萄糖1,6-二磷酸，10 mM MgCl2
、225 mM海藻糖，3 U/mL磷酸葡糖苷酶，以及3.4U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。1U定義為在特定條件下催化1 μmol的α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)產生的酶量。透過將熱處理後的活性除以未經熱處理的活性並乘以100來計算殘餘活性。結果顯示在圖2中。SEQ ID NO: 1顯示在最初3小時內的快速活性喪失以及半衰期約為1小時。 正如Tm50值所預期的那樣，新變體顯示出極大改善的作用穩定性。SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 65以及SEQ ID NO: 78顯示出最高的改善，具有半衰期約 8.8天。相較於野生型酶，這構成了200多倍的改善。
實施例
9
：海藻糖合成：在不同溫度下之三酶
(3E)
作用
將蔗糖磷酸化酶(SP)加到含有110 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5，1.25M蔗糖、一葡萄糖異構酶(GI)，以及一預熱至30°C、45°C、50°C或55°C的海藻糖磷酸化酶(TP)的反應等分試樣中。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是從缺失菌株中加熱純化的(例如在55°C、60°C或任何其它合適溫度下加熱15分鐘)，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化， 如沉澱或色層分析法。將反應在30°C、45°C、50°C或55°C下以500 rpm作用。蔗糖磷酸化酶(SP)可以選自SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219； 海藻糖磷酸化酶(TP)可以選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201； 葡萄糖異構酶(GI)可以選自SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240。隨時間取樣並透過HPLC測定果糖、葡萄糖、蔗糖，以及海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250 x 4,6 mm (Phenomenex公司)，管管柱溫度度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10 μL。使用外標法量化樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖，以及海藻糖的量。或者，可以使用SEQ ID NO: 10或11的蔗糖磷酸化酶(SP)及/或SEQ ID NO: 11的葡萄糖異構酶(GI)。
實施例
10
：海藻糖之合成：在不同蔗糖濃度下的三酶
(3E)
作用
與實施例5類似，將蔗糖磷酸化酶(SP)加入到含有110 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5，葡萄糖異構酶(GI)，海藻糖磷酸化酶(TP)，以及300 mM或1M蔗糖的反應等分試樣中。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是從缺失菌株中加熱純化的(例如在55°C、60°C或任何其它合適溫度下加熱15分鐘)，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化， 如沉澱或色層分析法。蔗糖磷酸化酶(SP)可以選自SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219； 海藻糖磷酸化酶(TP)可以選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201； 葡萄糖異構酶(GI)可以選自SEQ ID NO: 220、SEQ ID NO: 221、SEQ ID NO: 222、SEQ ID NO: 223、SEQ ID NO: 224、SEQ ID NO: 225、SEQ ID NO: 226、SEQ ID NO: 227、SEQ ID NO: 228、SEQ ID NO: 229、SEQ ID NO: 230、SEQ ID NO: 231、SEQ ID NO: 232、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240。將反應在45°C，500 rpm作用。隨時間取樣並透過HPLC測定果糖、葡萄糖、蔗糖以及海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250x4,6mm (Phenomenex公司)，管柱溫度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10 μL。使用外標法量化樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖以及海藻糖的量)。
實施例
11
：海藻糖合成：雙酶
(2E)
作用
將蔗糖磷酸化酶(SP)加到含有110 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5，300 mM蔗糖、300 mM葡萄糖，以及預熱至30°C、50°C或55°C的海藻糖磷酸化酶(TP)的反應等分試樣中。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是從缺失菌株中加熱純化的(例如在55°C、60°C或任何其它合適溫度下加熱15分鐘)，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化， 如沉澱或色層分析法。將反應在30°C、50°C或55°C以500 rpm作用。蔗糖磷酸化酶(SP)可以選自SEQ ID NO: SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203、SEQ ID NO: 204、SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 206、SEQ ID NO: 207、SEQ ID NO: 208、SEQ ID NO: 209、SEQ ID NO: 210、SEQ ID NO: 211、SEQ ID NO: 212、SEQ ID NO: 213、SEQ ID NO: 214、SEQ ID NO: 215、SEQ ID NO: 216、SEQ ID NO: 217、SEQ ID NO: 218、SEQ ID NO: 219； 海藻糖磷酸化酶(TP)可以選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 33、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 43、SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 49、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 59、SEQ ID NO: 60、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 64、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 69、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72、SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79、SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 81、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 85、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 87、SEQ ID NO: 88、SEQ ID NO: 89、SEQ ID NO: 90、SEQ ID NO: 91、SEQ ID NO: 92、SEQ ID NO: 93、SEQ ID NO: 94、SEQ ID NO: 95、SEQ ID NO: 96、SEQ ID NO: 97、SEQ ID NO: 98、SEQ ID NO: 99、SEQ ID NO: 100、SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102、SEQ ID NO: 103、SEQ ID NO: 104、SEQ ID NO: 105、SEQ ID NO: 106、SEQ ID NO: 107、SEQ ID NO: 108、SEQ ID NO: 109、SEQ ID NO: 110、SEQ ID NO: 111、SEQ ID NO: 112、SEQ ID NO: 113、SEQ ID NO: 114、SEQ ID NO: 115、SEQ ID NO: 116、SEQ ID NO: 117、SEQ ID NO: 118、SEQ ID NO: 119、SEQ ID NO: 120、SEQ ID NO: 121、SEQ ID NO: 122、SEQ ID NO: 123、SEQ ID NO: 124、SEQ ID NO: 125、SEQ ID NO: 126、SEQ ID NO: 127、SEQ ID NO: 128、SEQ ID NO: 129、SEQ ID NO: 130、SEQ ID NO: 131、SEQ ID NO: 132、SEQ ID NO: 133、SEQ ID NO: 134、SEQ ID NO: 135、SEQ ID NO: 136、SEQ ID NO: 137、SEQ ID NO: 138、SEQ ID NO: 139、SEQ ID NO: 140、SEQ ID NO: 141、SEQ ID NO: 142、SEQ ID NO: 143、SEQ ID NO: 144、SEQ ID NO: 145、SEQ ID NO: 146、SEQ ID NO: 147、SEQ ID NO: 148、SEQ ID NO: 149、SEQ ID NO: 150、SEQ ID NO: 151、SEQ ID NO: 152、SEQ ID NO: 153、SEQ ID NO: 154、SEQ ID NO: 155、SEQ ID NO: 156、SEQ ID NO: 157、SEQ ID NO: 158、SEQ ID NO: 159、SEQ ID NO: 160、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 162、SEQ ID NO: 163、SEQ ID NO: 164、SEQ ID NO: 165、SEQ ID NO: 166、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 168、SEQ ID NO: 169、SEQ ID NO: 170、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO: 172、SEQ ID NO: 173、SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO: 175、SEQ ID NO: 176、SEQ ID NO: 177、SEQ ID NO: 178、SEQ ID NO: 179、SEQ ID NO: 180、SEQ ID NO: 181、SEQ ID NO: 182、SEQ ID NO: 183、SEQ ID NO: 184、SEQ ID NO: 185、SEQ ID NO: 186、SEQ ID NO: 187、SEQ ID NO: 188、SEQ ID NO: 189、SEQ ID NO: 190、SEQ ID NO: 191、SEQ ID NO: 192、SEQ ID NO: 193、SEQ ID NO: 194、SEQ ID NO: 195、SEQ ID NO: 196、SEQ ID NO: 197、SEQ ID NO: 198、SEQ ID NO: 199、SEQ ID NO: 200、SEQ ID NO: 201。隨時間取樣並透過HPLC測定果糖、葡萄糖、蔗糖，以及海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250x4,6mm (Phenomenex公司)，管柱溫度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10 μL。使用外標法量化樣品中果糖、葡萄糖、蔗糖以及海藻糖的量)。
實施例
12
：
KM
值之測定
在以下條件下在50-1000 mM果糖的不同果糖濃度下測定葡萄糖異構酶變體的活性：10 mM MgSO4
、50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.0，40°C，使用以下測定：透過在以下條件下監測來自果糖的葡萄糖之形成以進行測量葡萄糖異構酶活性的反應：50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7，10 mM MgSO4
、0.05 mL/mL反應葡萄糖異構酶製劑(以50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7稀釋至最大產率18%)，50-1000 mM果糖濃度，以及40°C。透過每毫升反應添加0.1 mL 0.25M HCl來淬滅反應。透過葡萄糖異構酶的作用從果糖產生的葡萄糖使用不連續偶聯測定法測定，其中葡萄糖透過葡萄糖氧化酶轉化為葡糖酸內酯。過氧化氫(該反應的副產物)被辣根過氧化物酶用於氧化2,2'-連氮基-雙(3-乙基苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS)，產生有色產物，其在405 nm處顯示吸光值。 將10 μL等分的酸猝滅反應物與90 μL含有50 mM磷酸鉀緩衝液pH6，1 mM ABTS，5 U/mL葡萄糖氧化酶，以及1 U/mL辣根過氧化物酶的測定混合物混合。在30°C下作用60-70分鐘後，測量405 nm處的吸光值(終點測量)。使用外部標準品量化樣品中的葡萄糖量。將得到的活性擬合到Michaelis-Menten反應式中，從該反應式得到用於提供的葡萄糖異構酶變體的果糖的米氏常數KM
。從表7中可以看出，兩種測試變體顯示果糖的KM
低於野生型葡萄糖異構酶。
表 7 ：
葡萄糖異構酶的KM
值
實施例
13
：海藻糖合成：於
30°C
、
39°C
，以及
40°C
下的三酶作用
將含有磷酸鉀緩衝液pH 7.5、蔗糖以及MgSO4
的反應等分試樣分別預熱至30°C、39°C或40°C，並加入蔗糖磷酸化酶(SP)、葡萄糖異構酶(GI)，以及海藻糖磷酸化酶(TP)製劑(終濃度：200 mM血清，10 mM MgSO4
、50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5、0.75 U/mL 蔗糖磷酸化酶(SP)、2.25 U/mL葡萄糖異構酶(GI)、0.5 U/mL海藻糖磷酸化酶(TP))。含有SEQ ID NO: 160的海藻糖磷酸化酶(TP)製劑之反應物具有以下最終組成物：200 mM乳糖、10 mM MgSO4
、50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5、0.405 U/mL 蔗糖磷酸化酶(SP)、1.215 U/mL葡萄糖異構酶(GI)、0.27 U/mL海藻糖磷酸化酶(TP)。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是熱純化的(在60°C下加熱15分鐘)，從缺失菌株中獲得，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化，例如沉澱或色層分析法。根據製造商的說明，使用來自GE Helathcare公司的PD-10管柱將市售GI Sternenzym GI 3000 (Sternenzym GmbH&Co.KG，Ahrensburg)脫鹽，並在50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中流洗。將市售固定化的GI Sweetzyme IT Extra (Novozymes，Sigma＃G4166)研磨成細粉。將反應物分別在500 rpm以及30°C、39°C或40°C的溫度下振盪作用。
23小時後取樣，透過HPLC測定海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250x 4,6mm (Phenomenex公司)，管柱溫度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10 μL)。使用外部標準品測量樣品中海藻糖的量。
表8中顯示了在30°C、39°C，以及40°C下使用不同海藻糖磷酸化酶(TP)但使用相同的蔗糖磷酸化酶(SP)以及葡萄糖異構酶(GI) 23小時後形成的海藻糖的量以及每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶(TP)的產率。
表 8 ：
在30°C、39°C或40°C下23小時後形成海藻糖。
該數據顯示，相較於野生型序列SEQ ID NO: 1以及SEQ ID NO: 160，使用海藻糖磷酸化酶(TP)變體有利於海藻糖合成過程中的海藻糖合成(三酶作用)，溫度為39°C以及40°C。
表9所示為使用不同的蔗糖磷酸化酶(SP)製劑以及SEQ ID NO: 1的海藻糖磷酸化酶(TP)製劑或SEQ ID NO: 65的海藻糖磷酸化酶(TP)製劑分別在23小時後的海藻糖形成以及每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶(TP)的產率。在所有測定中，將相同的葡萄糖異構酶(GI)製劑加入到反應中。
表 9 ：
在30°C、39°C或40°C下23小時後形成海藻糖。
該數據顯示，透過海藻糖磷酸化酶(TP)變體而非野生型酶產生海藻糖的優點獨立於該作用中存在的蔗糖磷酸化酶(SP)候選物。此外，顯而易見的是，不同的蔗糖磷酸化酶(SP)適合於海藻糖合成。
表10所示為使用不同的葡萄糖異構酶(GI)操作以及SEQ ID NO: 1的海藻糖磷酸化酶(TP)製劑或SEQ ID NO: 65的海藻糖磷酸化酶(TP)製劑在23小時後的海藻糖形成以及每千單位(kU)海藻糖磷酸化酶(TP)之產率。在所有測定中，將相同的蔗糖磷酸化酶(SP)製劑加入到反應中。
表 10 ：
在30°C、39°C或40°C下23小時後形成海藻糖。
該數據顯示，透過海藻糖磷酸化酶(TP)變體而非野生型酶產生海藻糖的優點獨立於該作用中存在的葡萄糖異構酶(GI)候選物。此外，顯而易見的是，不同的葡萄糖異構酶(GI)適合於海藻糖合成。
實施例
14
：海藻糖合成：在
200 mM
、
600 mM
以及
900 mM
蔗糖下的三酶
(3E)
作用
將含有磷酸鉀緩衝液pH 7.5、蔗糖以及MgSO4
的反應等分試樣預熱至30°C，並向其中加入蔗糖磷酸化酶(SP)、葡萄糖異構酶(GI)，以及海藻糖磷酸化酶(TP)製劑(最終濃度：分別為200 mM、600 mM或900 mM，10 mM MgSO4
、50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5，0.525 U/mL 蔗糖磷酸化酶(SP)、1.575 U/mL葡萄糖異構酶(GI)、0.35 U/mL海藻糖磷酸化酶(TP))。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是熱純化的(在60°C下加熱15分鐘)，從缺失菌株中獲得，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化，例如沉澱或色層分析法。根據製造商的說明，使用來自GE Helathcare公司的PD-10管柱將市售GI Sternenzym GI 3000 (Sternenzym GmbH&Co.KG，Ahrensburg)脫鹽，並在50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7中流洗。 將市售固定化的GI Sweetzyme IT Extra (Novozymes，Sigma＃G4166)研磨成細粉。將反應於30°C下以500 rpm作用。
隨時間取樣並透過HPLC測定海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250x 4,6mm (Phenomenex公司)，管柱溫度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10 μL。使用外部標準品測量樣品中海藻糖的量。 結果如表11所示。
表 11 ：
使用200、600或900 mM蔗糖在23小時後形成海藻糖。
該數據顯示，在三酶作用的海藻糖合成過程中，海藻糖磷酸化酶(TP)以及酶製劑在高達900 mM蔗糖中不顯示基質抑制。
實施例
15
：海藻糖合成：在
30°C
、
42°C
以及
43°C
下進行雙酶
(2E)
作用
將含有磷酸鉀緩衝液pH 7.5、蔗糖、葡萄糖以及MgSO4
的反應等分試樣分別預熱至30°C、42°C或43°C，並向其中加入蔗糖磷酸化酶(SP)以及海藻糖磷酸化酶(TP)(終濃度：200 mM蔗糖、200 mM葡萄糖、10 mM MgSO4
、50 mM磷酸鉀緩衝液pH 7.5、0.525 U/mL蔗糖磷酸化酶(SP)、0.35 U/mL海藻糖磷酸化酶(TP))。為了避免α-D-葡萄糖1-磷酸(aG1P)降解副反應，所有酶都是熱純化的(在60°C下加熱15分鐘)，從缺失菌株中獲得，或使用本領域已知的任何生物化學方法純化，例如沉澱或色層分析法。根據製造商的說明，使用來自GE Helathcare公司的PD-10管柱將市售GI Sternenzym GI 3000 (Sternenzym GmbH&Co.KG，Ahrensburg)脫鹽，並在pH 7的50 mM磷酸鉀緩衝液中流洗。將反應分別在30°C、42°C或43°C下以500 rpm作用。
隨時間取樣並透過HPLC測定海藻糖的量(管柱：Luna 5µm NH2
100Å, 250x4,6mm (Phenomenex公司)，管柱溫度：40°C，流動相：80/20(v/v)乙腈/水 ，等度分析，流速：2 mL/分鐘，進樣：10μL。使用外部標準品測量樣品中海藻糖的量。
結果顯示在表12中。
表 12 ：
在30°C、42°C以及43°C下23小時後形成海藻糖。
該數據顯示，相較於野生型序列SEQ ID NO: 1，使用海藻糖磷酸化酶(TP)變體有利於海藻糖合成過程(雙酶作用)中的海藻糖合成，溫度為42°C以及43°C。
通過附圖、實施例、表格以及序列表進一步說明本發明，從中可以採取進一步的特徵、具體實施例，以及優點，其中：
圖 1
所示為於存在以及不存在1M蔗糖的情況下，添加穩定劑的SEQ ID NO: 1的野生型海藻糖磷酸化酶的殘餘活性%對溫度函數的圖；以及
圖 2
所示為SEQ ID NO: 1的野生型海藻糖磷酸化酶以及本發明之各種海藻糖磷酸化酶的殘餘活性對時間函數的圖。
<110> C-樂克塔股份有限公司c-LEcta GmbH紐馬塔宏有限公司New Matterhorn,LLC
<120> 生產海藻糖之方法
<130> C71299TW
<150> EP 17204211.1/EP 18174349.3
<151> 2017-11-28/2018-05-25
<160> 240
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 737
<212> PRT
<213> 裂褶菌(Schizophyllum commune)
<220>
<223> >SEQ ID NO：1
<400> 1
<210> 2
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >SEQ ID NO：2
<400> 2
<210> 3
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >SEQ ID NO：3
<400> 3
<210> 4
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >SEQ ID NO：4
<400> 4
<210> 5
<211> 737
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >SEQ ID NO：79
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<210> 80
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<212> PRT
<213> 簇生垂幕菇(Hypholoma sublateritium)FD-334 SS-4
<220>
<223> >KJA27491.1
<400> 80
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<211> 732
<212> PRT
<213> 舞菇(Grifola frondosa)
<220>
<223> ADM15725.1海藻糖磷酸化酶
<400> 81
<210> 82
<211> 737
<212> PRT
<213> 秀珍菇(Pleurotus ostreatus)
<220>
<223> KDQ33172.1
<400> 82
<210> 83
<211> 751
<212> PRT
<213> 環柄香菇(Lentinus sajor-caju)
<220>
<223> Q9UV63.1
<400> 83
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<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：84
<400> 84
<210> 85
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：85
<400> 85
<210> 86
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：86
<400> 86
<210> 87
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：87
<400> 87
<210> 88
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：88
<400> 88
<210> 89
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：89
<400> 89
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<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：90
<400> 90
<210> 91
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：91
<400> 91
<210> 92
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：92
<400> 92
<210> 93
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：93
<400> 93
<210> 94
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：94
<400> 94
<210> 95
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：95
<400> 95
<210> 96
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：96
<400> 96
<210> 97
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：97
<400> 97
<210> 98
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：98
<400> 98
<210> 99
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：99
<400> 99
<210> 100
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：100
<400> 100
<210> 101
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：101
<400> 101
<210> 102
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：102
<400> 102
<210> 103
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：103
<400> 103
<210> 104
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：104
<400> 104
<210> 105
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：105
<400> 105
<210> 106
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：106
<400> 106
<210> 107
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：107
<400> 107
<210> 108
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：108
<400> 108
<210> 109
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：109
<400> 109
<210> 110
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：110
<400> 110
<210> 111
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：111
<400> 111
<210> 112
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：112
<400> 112
<210> 113
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：113
<400> 113
<210> 114
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：114
<400> 114
<210> 115
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：115
<400> 115
<210> 116
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：116
<400> 116
<210> 117
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：117
<400> 117
<210> 118
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：118
<400> 118
<210> 119
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：119
<400> 119
<210> 120
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：120
<400> 120
<210> 121
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：121
<400> 121
<210> 122
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：122
<400> 122
<210> 123
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：123
<400> 123
<210> 124
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：124
<400> 124
<210> 125
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：125
<400> 125
<210> 126
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：126
<400> 126
<210> 127
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：127
<400> 127
<210> 128
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：128
<400> 128
<210> 129
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：129
<400> 129
<210> 130
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：130
<400> 130
<210> 131
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：131
<400> 131
<210> 132
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：132
<400> 132
<210> 133
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：133
<400> 133
<210> 134
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：134
<400> 134
<210> 135
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：135
<400> 135
<210> 136
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：136
<400> 136
<210> 137
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：137
<400> 137
<210> 138
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：138
<400> 138
<210> 139
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：139
<400> 139
<210> 140
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：140
<400> 140
<210> 141
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：141
<400> 141
<210> 142
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：142
<400> 142
<210> 143
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：143
<400> 143
<210> 144
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：144
<400> 144
<210> 145
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：145
<400> 145
<210> 146
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：146
<400> 146
<210> 147
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：147
<400> 147
<210> 148
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：148
<400> 148
<210> 149
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：149
<400> 149
<210> 150
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：150
<400> 150
<210> 151
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：151
<400> 151
<210> 152
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：152
<400> 152
<210> 153
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：153
<400> 153
<210> 154
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：154
<400> 154
<210> 155
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：155
<400> 155
<210> 156
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：156
<400> 156
<210> 157
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：157
<400> 157
<210> 158
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：158
<400> 158
<210> 159
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：159
<400> 159
<210> 160
<211> 732
<212> PRT
<213> 舞菇(Grifola frondosa)
<220>
<223> SEQ ID NO：160
<400> 160
<210> 161
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：161
<400> 161
<210> 162
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：162
<400> 162
<210> 163
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：163
<400> 163
<210> 164
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：164
<400> 164
<210> 165
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：165
<400> 165
<210> 166
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：166
<400> 166
<210> 167
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：167
<400> 167
<210> 168
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：168
<400> 168
<210> 169
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：169
<400> 169
<210> 170
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：170
<400> 170
<210> 171
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：171
<400> 171
<210> 172
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：172
<400> 172
<210> 173
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：173
<400> 173
<210> 174
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：174
<400> 174
<210> 175
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：175
<400> 175
<210> 176
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：176
<400> 176
<210> 177
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：177
<400> 177
<210> 178
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：178
<400> 178
<210> 179
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：179
<400> 179
<210> 180
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：180
<400> 180
<210> 181
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：181
<400> 181
<210> 182
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：182
<400> 182
<210> 183
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：183
<400> 183
<210> 184
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：184
<400> 184
<210> 185
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：185
<400> 185
<210> 186
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：186
<400> 186
<210> 187
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：187
<400> 187
<210> 188
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：188
<400> 188
<210> 189
<211> 732
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：189
<400> 189
<210> 190
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >SEQ ID NO：190
<400> 190
<210> 191
<211> 737
<212> PRT
<213> 裂褶菌(Schizophyllum commune)H4-8
<220>
<223> >XP_003035156.1 glycosyltransferase family 4 protein[Schizophyllum commune H4-8]>EFJ00254.1 glycosyltransferase family 4 protein[Schizophyllum commune H4-8]
<400> 191
<210> 192
<211> 626
<212> PRT
<213> 朱紅菌(Trametes cinnabarina)
<220>
<223> >CDO74881.1糖基轉移酶家族4蛋白[朱紅菌]
<400> 192
<210> 193
<211> 735
<212> PRT
<213> 鴻禧菇(Hypsizygus marmoreus)
<220>
<223> >KYQ39707.1海藻糖磷酸化酶[鴻禧菇]
<400> 193
<210> 194
<211> 735
<212> PRT
<213> 彩絨栓菌(Trametes versicolor)
<220>
<223> >XP_008036133.1海藻糖磷酸化酶[彩絨栓菌(FP-101664 SS1]>EIW60750.1海藻糖磷酸化酶[彩絨栓菌(FP-101664 SS1]
<400> 194
<210> 195
<211> 739
<212> PRT
<213> 肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)
<220>
<223> >A6YRN9.1 RecName：全名=海藻糖磷酸化酶；AltName：全名=海藻糖磷酸化酶；縮寫=TSase；Flags：前驅物>ABR88135.1海藻糖磷酸化酶[肺形側耳]
<400> 195
<210> 196
<211> 737
<212> PRT
<213> 雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)
<220>
<223> >XP_006458503.1假設的蛋白AGABI2DRAFT_190782[雙孢蘑菇變種bisporus H97]>EKV50461.1假設的蛋白AGABI2DRAFT_190782[雙孢蘑菇變種bisporus H97]
<400> 196
<210> 197
<211> 737
<212> PRT
<213> 雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)
<220>
<223> >XP_007326883.1假設的蛋白AGABI1DRAFT_111552[雙孢蘑菇變種burnettii JB137-S8]>EKM83027.1假設的蛋白AGABI1DRAFT_111552[雙孢蘑菇變種burnettii JB137-S8]
<400> 197
<210> 198
<211> 733
<212> PRT
<213> 硫色絢孔菌(Laetiporus sulphureus)
<220>
<223> >KZT11205.1糖基轉移酶家族4蛋白[硫色絢孔菌93-53]
<400> 198
<210> 199
<211> 736
<212> PRT
<213> 密褐褶菌(Gloeophyllum trabeum)
<220>
<223> >XP_007863746.1海藻糖轉移酶[密褐褶菌ATCC 11539]>EPQ58616.1海藻糖轉移酶[密褐褶菌ATCC 11539]
<400> 199
<210> 200
<211> 693
<212> PRT
<213> 舞菇(Grifola frondosa)
<220>
<223> >OBZ75413.1海藻糖磷酸化酶[舞菇]
<400> 200
<210> 201
<211> 650
<212> PRT
<213> 絨毛栓菌(Trametes pubescens)
<220>
<223> >OJT04097.1海藻糖磷酸化酶[絨毛栓菌]
<400> 201
<210> 202
<211> 504
<212> PRT
<213> 巨大雙歧桿菌(Bifidobacterium magnum)
<220>
<223> 野生型
<400> 202
<210> 203
<211> 504
<212> PRT
<213> 長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)
<220>
<223> 野生型
<400> 203
<210> 204
<211> 506
<212> PRT
<213> 動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)
<220>
<223> 野生型
<400> 204
<210> 205
<211> 503
<212> PRT
<213> 嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)
<220>
<223> 野生型
<400> 205
<210> 206
<211> 504
<212> PRT
<213> 青春雙歧桿菌(Bifidobacterium adolescensis)
<220>
<223> 野生型
<400> 206
<210> 207
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >E92L
<400> 207
<210> 208
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >S124Q
<400> 208
<210> 209
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >S124K
<400> 209
<210> 210
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >S124T
<400> 210
<210> 211
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >A148R
<400> 211
<210> 212
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >A148K
<400> 212
<210> 213
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >T157D
<400> 213
<210> 214
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >Q188Y
<400> 214
<210> 215
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >I231V
<400> 215
<210> 216
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >L371A
<400> 216
<210> 217
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >T461G
<400> 217
<210> 218
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >A148K_Q188Y
<400> 218
<210> 219
<211> 504
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> >A148K_T157D_Q188Y_L371A_T461G
<400> 219
<210> 220
<211> 388
<212> PRT
<213> 鏈黴菌SK(Streptomyces sp.SK)
<400> 220
<210> 221
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 221
<210> 222
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 222
<210> 223
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 223
<210> 224
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 224
<210> 225
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 225
<210> 226
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 226
<210> 227
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 227
<210> 228
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 228
<210> 229
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 229
<210> 230
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 230
<210> 231
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 231
<210> 232
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 232
<210> 233
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 233
<210> 234
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 234
<210> 235
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 235
<210> 236
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 236
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 237
<210> 238
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 238
<210> 239
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 239
<210> 240
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID 220的變體
<400> 240
Claims (18)
- 一種生產海藻糖之方法，包括以任何順序混合及反應以下物品之步驟，a)至少一種α-磷酸化酶，其能夠催化來自一糖原料及來自至少一磷源的α-D-葡萄糖1-磷酸中間體之產物，該糖原料包括蔗糖，該磷源係選自由一磷酸及該磷酸的一無機鹽所組成之群組；b)至少一種海藻糖磷酸化酶，其能夠催化來自一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與一葡萄糖基質所產生的海藻糖，其中該海藻糖磷酸化酶為一海藻糖磷酸化酶變體，其具有與一野生型海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列在至少一個胺基酸位置上不同的胺基酸序列；c)至少一種包括蔗糖的糖原料，其透過該α-磷酸化酶的催化作用產生一α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一選自果糖副產物的副產物；d)至少一種選自由一磷酸及該磷酸的一無機鹽所組成之群組的磷源；以及e)一葡萄糖基質及/或至少一種葡萄糖異構酶；其中該至少一種海藻糖磷酸化酶包含一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列為與如SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列至少90%相同，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該胺基酸取代係選自由SEQ ID NO：1的胺基酸取代P383A、P383G、P383M、P383V、P383N、P383C、P383Q、P383S、P383T、N225V、N225L、N225I、N225M、A304I、A304L、T323I、T323V、Q487A、Q487G、Q487L、Q487M、V550P、S556T、T564E、D590N、D590G以及K705N所組成之群組；或 其中該至少一種海藻糖磷酸化酶包含一胺基酸序列組成，其中胺基酸序列為與如SEQ ID NO：81及/或SEQ ID NO：160所示之胺基酸序列至少95%相同，其中該海藻糖磷酸化酶的胺基酸序列於一個或更多個胺基酸位置包含一胺基酸取代，其中該胺基酸取代係選自由SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：160的胺基酸取代P379V、L108I、V112I、N221V、A300I、T319I、S550T、Q558E、A643E以及L707M所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法之特徵在於以下二種或更多種轉化，該轉化係選自由下列所組成之群組：a)至少一種糖原料通過該至少一種α-磷酸化酶與該至少一種磷源的磷酸裂解轉化為一種α-D-葡萄糖1-磷酸中間體以及一副產物；b)透過該至少一種海藻糖磷酸化酶將該α-D-葡萄糖1-磷酸中間體與該葡萄糖基質轉化為海藻糖；c)透過該至少一種葡萄糖異構酶將該果糖副產物轉化為一葡萄糖基質。
- 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該方法之特徵進一步在於：a)一種雙酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種糖原料、該葡萄糖基質，以及該至少一種磷源反應及混合；及/或b)一種三酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該至少一種糖原料，以及該至少一種磷源反應及混合；及/或c)一種三酶作用，包括使該至少一種α-磷酸化酶、該至少一種海藻糖磷酸化酶、該至少一種葡萄糖異構酶、該葡萄糖基質、該至少一種糖原料，以及該至少一種磷源反應及混合。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法係在一至少30℃至最高80℃的溫度下進行。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該至少一種糖原料係蔗糖，該蔗糖係以100mM至最高2000mM的濃度範圍加入該反應中。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶之特徵在於選自由特徵(A)、(B)、(C)，以及(D)所組成之群組的一種或多種特徵：(A)一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52℃下作用15分鐘後的一殘餘酶活性為30%至100%；及/或(B)一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52℃下作用15分鐘後的一Tm50-值至少為52℃；及/或(C)一熱穩定性，其中該熱穩定性之特徵在於該酶在52℃下作用15分鐘後的一Tm50值介於52℃至90℃之間；及/或(D)一熱穩定性，其中該熱穩定性為一作用穩定性之形式，其特徵在於一為3小時至9天或更長的半衰期。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該方法之特徵在於使用一至少一種能夠實現以下之海藻糖磷酸化酶(i)一種三酶作用，包括以任何順序混合並反應至少一種α-磷酸化酶、至少一種葡萄糖異構酶以及至少一種海藻糖磷酸化酶(trehalose phosphorylase、TP)之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自蔗糖產生海藻糖的產率為至少1.0g/(L*h)/kU TP至100g/(L*h)/kU TP；及/或(ii)一種雙酶作用，包括以任何順序混合並反應一葡萄糖基質、至少一種α-磷酸化酶，以及至少一種海藻糖磷酸化酶(TP)而不添加一葡萄糖異 構酶之步驟，其中每千單位(kU)的海藻糖磷酸化酶(TP)自糖原料產生海藻糖的產率為至少3g/(L*h)/kU TP至100g/(L*h)/kU TP。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該變體於以下胺基酸位置的二個或更多個位置包含一胺基酸取代，該胺基酸位置係選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、564，以及649所組成之群組，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該海藻糖磷酸化酶變體於一選自由胺基酸位置712、118、487，以及590所組成之群組的胺基酸位置包含至少另一胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該變體於以下胺基酸位置的二個或更多個位置包含一胺基酸取代，該胺基酸位置係選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556，以及564所組成之群組，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該海藻糖磷酸化酶變體於一選自由胺基酸位置712、118、487、590，以及649所組成之群組的胺基酸位置包含至少另一胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該變體於以下胺基酸位置的二個或更多個位置包含一胺基酸取代，該胺基酸位置係選自由胺基酸位置383、114、225、304、323、349、357、556，以及564所組成之群組，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第12項所述之方法，其中該海藻糖磷酸化酶變體於一選自由胺基酸位置712、118、487、550、590，以及649所組成之 群組的胺基酸位置包含至少另一胺基酸取代，其中該胺基酸編號係指SEQ ID NO：1中的一比對位置。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶包含或由一胺基酸序列組成，其中該胺基酸序列係選自由以下任何一種所組成之群組：a)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189，以及SEQ ID NO：190；及/或b)SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159以及SEQ ID NO：190；及/或c)SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、 SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188，以及SEQ ID NO：189；及/或d)SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：180，以及SEQ ID NO：188。
- 如申請專利範圍第1至8項任一項所述之方法，其中該至少一種海藻糖磷酸化酶包含或由一選自由以下任一種所組成之群組的胺基酸序列組成SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169，以及SEQ ID NO：170。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該至少一種α-磷酸化酶為一蔗糖磷酸化酶，其中該蔗糖磷酸化酶與一選自由以下所組成之群組的胺基酸序列具有至少75%的序列同一性：SEQ ID NO：202以及SEQ ID NO：205。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該至少一種葡萄糖異構酶為一種與SEQ ID NO：220所示之胺基酸序列具有至少95%序列同一性的葡萄糖異構酶。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中，i)該至少一種α-磷酸化酶為以一蔗糖磷酸化酶之形式，其包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由以下序列所組成之群組：SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：215、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：217、SEQ ID NO：218以及SEQ ID NO：219；及/或ii)該至少一種海藻糖磷酸化酶為以一海藻糖磷酸化酶的形式，其包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由以下序列所組成之群組：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO： 155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190；及/或iii)該至少一種葡萄糖異構酶為以一葡萄糖異構酶之形式，其包含或由一胺基酸序列組成，該胺基酸序列係選自由SEQ ID NO：220至SEQ ID NO：240序列所組成之群組。
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