TWI836766B - 外泌體的生產及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種大量生產外泌體的方法，其是使用循環拉伸生物反應器來刺激細胞釋放外泌體。另外，本發明也提供一種具有癌症特異性抗HLA-G蛋白之外泌體，其用作遞送載體以遞送用於治療癌症的治療劑。

Description

外泌體的生產及其用途

本發明涉及一種大量生產外泌體的方法，其是使用循環拉伸生物反應器來刺激細胞釋放外泌體。此外，本發明涉及一種具有癌症特異性抗HLA-G蛋白之外泌體。

近年來，各製藥公司投入大量資源來開發新型藥物載體，期望能更高效、更精準地遞送小分子或生物製劑。由於外泌體具有低免疫原性、良好的生物相容性、生物活性、對細胞的低排斥性，以及針對微環境的奈米尺寸，故長久以來被視為藥物載體的最佳候選者。除了上述優勢外，外泌體還擁有其他的顯著特性，如親和力高、易被目標細胞吞噬、易於在細胞內降解和釋放藥物，並且能避免被免疫系統消耗等。

本發明提供一種促進外泌體生產的方法，其包含：(a)提供一循環拉伸生物反應器(cyclic tensile bioreactor)，其中該循環拉伸生物反應器包含一培養槽(culture chamber)、一具有一拉脹結構(auxetic structure)的生物相容性聚合物材料(biocompatible polymeric material)和複數個拉伸元件(tensile component)，該生物相容性聚合物材料和該複數個拉伸元件置於該培養槽內，該生物相容性聚合物材料包含一生產外泌體的細胞，且該生 物相容性聚合物材料的兩端與該複數個拉伸元件連接；(b)該複數個拉伸元件重複拉伸該生物相容性聚合物材料以施加一循環拉伸力(cyclic tensile force)；以及(c)收集因受該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力而從該生產外泌體的細胞所釋放的外泌體。

本發明也提供一種外泌體，其包含一融合蛋白，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白(exosomal transmembrane protein)，以及該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白。本發明進一步提供一種治療患有癌症的個體的方法，包含施予一組合物至該患有癌症的個體，其中該組合物包括一治療性外泌體，且該治療性外泌體包含上述融合蛋白和一抗癌劑。

本發明透過調整親代細胞培養參數，建立一個高品質、可量產、經工程化修飾之外泌體平台。經由3D動態刺激過程，親代細胞(HEK 293)能分泌大量高純度外泌體的生物產物。在本發明中，構架了三個平台，包括一靶向HLA-G的基因修飾膜、一外泌體量產系統以及載藥設計的結合。本發明能夠達到數項成果：(1)在動態培養環境下，HEK293分泌的外泌體量可以產生45-300倍、高度表現CD63的外泌體，其可為治療方面提供高品質和高數量的外泌體；(2)由於化療藥物載量低，故能高效率、無副作用的殺死癌細胞；(3)CARExo攜帶抗HLA-G蛋白以及miRNA 34a，故能抑制腫瘤的惡化，和延緩腫瘤轉移進程；和(4)在動物模型中，CARExo展現良好的腫瘤大小控制且無癌細胞轉移。本發明認為CARExo具有成為未來患者之有效抗癌武器的高潛力，且有巨大的潛力和商機。

本文所用的術語「一」或「一個」是用於描述本發明的要素 和元件。此術語僅用以方便描述和提供本發明的基本構想。此描述應理解為包括一個或至少一個，除非明確另有說明，否則單數亦包括複數。當在申請專利範圍中與單詞「包含/包括/具有」合併使用時，術語「一/一個」可以表示一個或超過一個。

在申請專利範圍中使用的術語「或」，表示「及/或」，除非明確指出僅表示其他選項，或除非其他選項彼此不相容。

本發明提供一種促進外泌體生產的方法，其包含：(a)提供一循環拉伸生物反應器，其中該循環拉伸生物反應器包含一培養槽、一具有一拉脹結構的生物相容性聚合物材料和複數個拉伸元件，該生物相容性聚合物材料與該複數個拉伸元件置於該培養槽內，該生物相容性聚合物材料包含一生產外泌體的細胞，且該生物相容性聚合物材料的兩端與該複數個拉伸元件連接；(b)該複數個拉伸元件重複拉伸該生物相容性聚合物材料以施加一循環拉伸力；以及(c)收集因受該複數個拉伸元件施加之循環拉伸力而從該生產外泌體的細胞所釋放的外泌體。

在一具體實施例中，該生物相容性聚合物材料包含一基於甲基丙烯醯基為主的聚合物(methacryloyl-based polymer)。在一個較佳的具體實施例中，該基於甲基丙烯醯基為主的聚合物包含甲基丙烯醯化明膠(gelatin methacryloyl，GelMa)、甲基丙烯醯化膠原蛋白(collagen methacryloyl)、甲基丙烯醯化透明質酸(hyaluronic acid methacryloyl，HAMa)、甲基丙烯醯化硫酸軟骨素(chondroitin sulfate methacryloyl)、甲基丙烯醯化幾丁聚醣(chitosan methacryloyl)、甲基丙烯醯化海藻酸鹽(alginate methacryloyl)或具有甲基丙烯醯基的脫細胞胞外基質(decellularized extracellular matrix with methacryloyl，dECMMa)。在一更佳的具體實施例中，該甲基丙烯醯化明膠包含甲基丙烯醯化魚明膠(fish gelatin methacryloyl，FGelMa)或甲基丙烯醯化豬明膠(porcine gelatin methacryloyl，PGelMa)。再者，該甲基丙烯醯化明膠是由來自魚或豬的明膠、甲基丙烯酸酐(methacrylic anhydride)和一溶液(例如磷酸鹽緩衝溶液)進行製備。因此，該基於甲基丙烯醯基為主的聚合物是可生物降解的且具有生物相容性。

在本發明中，該生物相容性聚合物材料的濃度會影響該生物相容性聚合物材料的拉脹功能，而拉脹功能會進一步影響外泌體的生產。因此，本發明使用不同濃度的生物相容性聚合物材料來影響外泌體的產量。例如，GelMa的濃度範圍是5wt%至30wt%，藻酸鹽甲基丙烯醯基的濃度範圍是1wt%至10wt%，膠原甲基丙烯醯基的濃度範圍是0.5wt%至10wt%，HAMa的濃度範圍是1wt%至10wt%，dECMMa的濃度範圍是1wt%至10wt%。在一具體實施例中，該生物相容性聚合物材料的濃度範圍為0.1wt%至50wt%。在一較佳的具體實施例中，該生物相容性聚合物材料的濃度範圍為0.2wt%至40wt%。在一更佳的具體實施例中，該生物相容性聚合物材料的濃度範圍為0.5wt%至30wt%。

在本發明中，可透過稀釋調節該生物相容性聚合物材料的濃度。例如，如果該生物相容性聚合物材料是FGelMa，可混合20公克的FGelMa與80公克的蒸餾水來製備出20wt%的FGelMa。

此外，該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料能夠承受該拉伸元件所施加的至少5%拉伸形變(tensile strain)而不被撕裂。在一具體實施例中，該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料的機械強度可承受2.5- 50%的拉伸形變。在一較佳的具體實施例中，該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料的機械強度可承受5-40%的拉伸形變。在一更佳的具體實施例中，該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料的機械強度可承受10-30%的拉伸形變。

在一些方面，術語「拉伸形變」定義為因施加拉伸力或應力(stress)而導致一固體變形或伸長。換言之，當施加的力試圖拉伸物體時，而造成物體的長度增加時，就產生拉伸形變。拉伸形變可以用以下之數學公式表示：ε=△L/L，其中ε=拉伸形變，△L=長度變化，L=原始長度。

在本發明中，該生物相容性聚合物材料被設計成兩端比身體寬的啞鈴形狀。因此，該生物相容性聚合物材料可分為兩個部分：一個部分為具有拉脹結構的第一聚合物材料，另一個部分則包含兩個具有剛性結構的第二聚合物材料。因此，各個該具有剛性結構的第二聚合物材料的機械強度都高於該具有拉脹結構的第一聚合物材料的機械強度。這兩個第二聚合物材料會分別連接到該第一聚合物材料的兩端。細胞會被加載到該第一聚合物材料的拉脹結構內。因此，該第一聚合物材料是用來裝載細胞，而該第二聚合物材料則用於提供該第一聚合物材料與該複數個拉伸元件之間適當的連接。

在一具體實施例中，該生物相容性聚合物材料包含一第一聚合物材料以及兩個第二聚合物材料。在一較佳的具體實施例中，兩個該第二聚合物材料分別連接至該第一聚合物材料的兩端。在一更佳的具體實施例中，該第一聚合物材料用於裝載該生產外泌體的細胞，以及該第二聚合物材料是用於連接第一聚合物材料和該複數個拉伸元件。在另一具體實施例中， 該第一聚合物材料是FGelMa，而該第二聚合物材料是GelMa。

該生產外泌體的細胞可透過已知的方法加載到該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料中。該生產外泌體的細胞加載進入該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料後，本發明就能獲得一裝載細胞的拉脹支架。在本發明中，該生物相容性聚合材料是一裝載細胞的FGelMa，且該裝載細胞的FGelMa是透過將該生產外泌體的細胞與FGelMa進行混合後所獲得的。

該生產外泌體的細胞可以是，例如，原代細胞(primary cells)、細胞株、存在於多細胞生物體內的細胞，或基本上任何其他類型的細胞源和生產外泌體細胞材料的形式存在。術語「生產外泌體的細胞(exosome-producing cell)」可以理解為涉及在合適的條件下能夠生產外泌體之任何類型的細胞，例如在懸浮培養或在貼壁培養或是在任何其他類型的培養系統。該生產外沁體的細胞還可以包括在體內產生外泌體的細胞。該生產外泌體的細胞可選自廣範圍的細胞和細胞株，其可在懸浮培養基或貼壁培養基中生長或適於懸浮生長。該生產外泌體的細胞可以選自：間質幹細胞(mesenchymal stem cell)或基質細胞(stromal cells)(例如從骨髓、脂肪組織、華通氏膠(Wharton’s jelly)、周產期組織(perinatal tissue)、胎盤、牙芽(tooth buds)、臍帶血、皮膚組織等獲得)、纖維母細胞(fibroblasts)、羊膜細胞(amnion cell)(更具體的任選地表現各種早期標記物羊膜上皮細胞(amnion epithelial cell))、骨髓抑制細胞(myeloid suppressor cells)、M2極化巨噬細胞(M2 polarized macrophage)、脂肪細胞(adipocyte)、和內皮細胞(endothelial cell)等。特別感興趣的細胞株包括人類臍帶內皮細胞(human umbilical cord endothelial cells，HUVEC)、人胚胎腎(human embryonic kideny，HEK)細胞、內皮細胞株(如微血管或淋巴管內皮細胞)、紅血球細胞、紅血球先驅細胞、軟骨細胞、不同來源的間質幹細胞(MSC)、羊膜細胞、羊膜上皮(AE)細胞、透過羊膜穿刺術獲得或來自胎盤的任何細胞、來自氣道或肺泡的上皮細胞、纖維母細胞，內皮細胞等。此外，免疫細胞(如B細胞、T細胞、NK細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突細胞(DC))也都在本發明的範圍內，且基本上任何類型能夠產生外泌體的細胞都包括在本發明之範圍內。一般來說，外泌體基本上可來自任何細胞源、原代細胞源或永生化細胞株(immortalized cell line)。特別感興趣的細胞株包括人類臍帶內皮細胞(HUVEC)、人胚胎腎(HEK)細胞(如HEK293細胞、HEK293T細胞、無血清HEK293細胞、懸浮HEK293細胞)、內皮細胞株(如微血管或淋巴管內皮細胞)、紅血球細胞、紅血球先驅細胞、軟骨細胞、不同來源的MSC、羊膜細胞、羊膜上皮(AE)細胞、透過羊膜穿刺術所獲得或來自胎盤的任何細胞、來自氣道或肺泡的上皮細胞，纖維母細胞，內皮細胞等。在一具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含哺乳動物細胞。在一較佳的具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含胎腎細胞(embryonic kidney cells)。在一更佳的具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含HEK293細胞。因此，該生產外泌體的細胞能夠生產出保留外泌體生物特性的外泌體，且該外泌體可能有CD9、CD63、CD81和HSP70的表現。

在本發明中，在該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料中有複數個孔洞。該複數個孔洞被設計成能增加該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料中的拉脹結構的拉脹功能。此外，該複數個孔洞能使 培養液流入該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料中以培養細胞。在一具體實施例中，該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料包含複數個孔洞。此外，該複數個孔洞可根據拉脹的需要而具有不同的態樣。在一具體實施例中，該孔洞的形狀包括球形、橢圓形、菱形或紡錘形。在一較佳的實施例中，該孔洞的形狀為紡錘形。在另一具體實施例中，紡錘形孔洞的長度是1至5mm，寬度是0.1至0.5mm。在一較佳的具體實施例中，紡錘形孔洞的長度為2至4mm，寬度為0.2至0.4mm。此外，該複數個孔洞被設計成能貫穿該生物相容性聚合物材料或該第一聚合物材料的結構。

在一些具體實施例中，該培養槽內充滿一培養液，且該生物相容性聚合物材料置於該培養液中。在一具體實施例中，該培養槽包含一培養液。

在各種具體實施例中，該複數個拉伸元件施加循環拉伸力。該複數個拉伸元件的循環拉伸力使該具有拉脹結構的生物相容性聚合物材料產生形變。在一具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力是2.5至50%的拉伸形變。在一較佳的具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力是5至40%的拉伸形變。在一更佳的具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力是10至30%的拉伸形變。在另一具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力的頻率為0.1至4Hz。在一較佳的具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力的頻率為0.2至2Hz。在一更佳的具體實施例中，該複數個拉伸元件所施加的循環拉伸力的頻率為0.3至1Hz。在一具體實施例中，該複數個拉伸元件的循環拉伸力在該生物相容性聚合物材料上提供循環單軸拉伸力。在另一具體實施例 中，該複數個拉伸元件的循環拉伸力是以與該生物相容性聚合物材料水平的方向來施力。因此，透過循環拉伸力來處理含有該生產外泌體的細胞的該生物相容性聚合物材料以去刺激細胞釋放外泌體。

在本發明中，循環拉伸力施加於該生物相容性聚合物材料的時間超過一週，然後從該生物相容性聚合物材料中的該生產外泌體的細胞收集外泌體。在一具體實施例中，該步驟(c)中收集外泌體是在施加循環拉伸力後約一週、約兩週、約三週、約一個月、約兩個月或約三個月進行。在一較佳的具體實施例中，該步驟(c)中收集外泌體是在施加循環拉伸力後約一至兩個月進行。在另一具體實施例中，在施加循環力一個月後收集之外泌體的數量在0.1x10⁶/細胞至2x10⁶/細胞之間。在一較佳的具體實施例中，施加循環力一個月後收集的外泌體數量在0.5x10⁶/細胞至1.5x10⁶/細胞之間。

當對細胞施加循環拉伸力時，細胞會從單細胞變為自身組裝的三維(3D)細胞球體並表現大量的Yes相關蛋白(Yes-assocaited protein，YAP)。本發明證明循環拉伸力能刺激細胞大量表現YAP蛋白，而YAP蛋白能使細胞形成3D球體，從而顯著的增加外泌體的分泌。在一具體實施例中，在循環拉伸力下，該生產外泌體的細胞的態樣變成3D細胞球體。在另一具體實施例中，在循環拉伸力下，該生產外泌體的細胞表現大量的YAP蛋白。因此，使用本發明的循環拉伸生物反應器的3D細胞培養方法能大量生產外泌體。

本發明提供一種多核苷酸(polynucleotide)，其包含一編碼一融合蛋白的序列，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白， 且該靶向蛋白包含一抗人類白血球抗原G(human leukocyte antigen G，HLA-G)蛋白。

此外，該編碼融合蛋白的序列是一核酸序列。在一些方面，該編碼融合蛋白的序列包含一編碼靶向蛋白的第一序列和一編碼外泌體跨膜蛋白的第二序列。在一具體實施例中，該編碼融合蛋白的序列包含SEQ ID NO：1。在一較佳的具體實施例中，該編碼抗HLA-G蛋白(靶向蛋白)的第一序列包含SEQ ID NO：1。

在本發明中，該外泌體跨膜蛋白是一跨膜蛋白或一與膜相關的蛋白。在另一具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD53、CD63、CD81、CD82、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受體、介白素受體(interleukin receptor)、免疫球蛋白、MHC-I、MHC-II、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、ARRDC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B 或其組合。在一較佳的具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD63或CD81。在一更佳的具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD63。

在本發明中，該多核苷酸進一步包含一啟動子，該啟動子可操作地連接至該編碼融合蛋白的序列。本文中所用的「啟動子」，是指能夠賦予、活化或增強核酸在細胞中之表現的合成或天然衍生的分子。一啟動子可包含一或多個特定的轉錄調節序列以進一步增強表現和/或改變其空間表現和/或時序表現。在一些具體實施例中，啟動子能驅動並且連接到該編碼融合蛋白的序列的上游。能連接的啟動子並沒有特別的限制，只要能在目標細胞中展現啟動子的活性即可。能連接到該編碼融合蛋白的序列的啟動子的實施例包含，但不限於，EFS啟動子、巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子、CK8啟動子、MHC啟動子、MYOD啟動子、hTERT啟動子、SRalpha啟動子、SV40啟動子、LTR啟動子、CAG啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子等。在一具體實施例中，該多核苷酸還包含一用以調節該編碼融合蛋白的序列的啟動子。

再者，本發明進一步提供一種載體，其中該載體攜帶該多核苷酸。因此，具有該編碼融合蛋白的序列的多核苷酸位於在該載體中。在本發明中，可使用一或多種載體，它們可分別攜帶不同的序列片段。

在一具體實施例中，該載體是一質體載體、非病毒載體或病毒載體。當本發明的載體是一質體載體時，所使用的質體載體沒有特別的限制，可以是任何質體載體(例如克隆質體載體和表現質體載體)。包含本發明之多核苷酸的質體載體的製備，是透過已知的方法將本發明的多核苷酸插入質體載體中。在一較佳的具體實施例中，該病毒載體包含腺病毒載體 (adenovirus vector)、腺相關病毒載體(adeno-associated virus vector，AAV vector)、慢病毒載體(lentiviral vector)、逆轉錄病毒(retrovirus)或仙台病毒(Sendaivirus)載體。在本專利說明書中，「病毒載體」還包括其衍生物。包含本發明之多核苷酸的病毒載體能透過已知的方法製備。在另一具體實施例中，該非病毒載體包含脂質體或脂質奈米顆粒。

在一些方面，該生產外泌體的細胞是用帶有該多核苷酸之載體轉染。因此，該生產外泌體的細胞通常包含該編碼融合蛋白的多核苷酸。因此，成功轉染的細胞能生產單細胞、雙細胞或多細胞的穩定細胞株。單一穩定細胞株有其優勢，因為僅需要轉染單一多核苷酸，可簡化外泌體的生產。

該生產外泌體的細胞較佳的是以該編碼融合蛋白的多核苷酸穩定的轉染，藉此能產生穩定的細胞株。此一優勢導致一致性的生產均一品質和產量的外泌體。該生產外泌體的細胞可以被至少一個多核苷酸基因修飾，基本上任何非病毒或病毒的方法都能將多核苷酸引入細胞。適合將多核苷酸引入該生產外泌體的細胞的方法包括：使用聚陽離子(如PEI)的轉染、基於脂質(如脂質體(RTM))的轉染劑、慢病毒轉導(transduction)、CRISPR-Cas引導插入、Flp-In系統、轉位子(transposon)系統、電穿孔、DEAE-葡萄聚醣轉染和磷酸鈣轉染。在選擇將多核苷酸引入該生產外泌體的細胞的方法時，需考慮各種參數，包括細胞來源的選擇、載體的性質和特性(例如，如果載體是一質體或微環(minicircle)，例如線性DNA多核苷酸或mRNA)、以及需達到的順應性和控制的程度。同樣地，透過使用細胞株開發領域熟知的技術，包括hTERT介導之永生化、轉錄因子永生化、E1/E2 永生化或其他病毒介導的永生化技術等，能使該生產外泌體的細胞永生化以產生穩定的細胞株。因此，成功轉染的生產外泌體的細胞能釋放出具有融合蛋白的外泌體。

在另外的方面，本發明提供一種用於產生一包含一融合蛋白的外泌體的方法，其包含：(1)將一多核苷酸引入一生產外泌體的細胞中，其中該多核苷酸包含一編碼一融合蛋白的序列，該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，且該靶向蛋白包含一抗人類白血球抗原G(HLA-G)蛋白；以及(2)使該生產外泌體的細胞生產該包含該融合蛋白的外泌體。

在一具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含哺乳動物細胞。在一較佳的具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含胎腎細胞。在一更佳的具體實施例中，該生產外泌體的細胞包含HEK293細胞。

本發明提供一種融合蛋白，其包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，其中該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包括SEQ ID NO：2。SEQ ID NO：2的胜肽序列是由SEQ ID NO：1的核酸序列所產生。

本發明進一步提供一種細胞，其包含一融合蛋白，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包括SEQ ID NO：2。在一具體實施中，該細胞是一生產外泌體的細胞。

在一些方面，該靶向蛋白直接與該外泌體跨膜蛋白連接以形成該融合蛋白。外泌體跨膜蛋白的使用能讓靶向蛋白配置在外泌體膜的外 側。這種配置使靶向蛋白暴露於外部，使靶向蛋白能與組織上的分子結合。適當的外泌體跨膜蛋白可選自CD63、CD81、CD9、CD82、CD44、CD47、CD55、LAMP2B、ICAM、整合素(integrin)、ARRDC1、膜聯蛋白(annexin)和任何其他外泌體多肽，以及其任何組合、衍生物、結構域(domain)或區域所組成的群組。一個非限制性實施例可以是如CD63的蛋白質。

本發明進一步提供一種外泌體，其包含一融合蛋白，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包含SEQ ID NO：2。在一具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD63或CD81。在一較佳的具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD63。

在一具體實施例中，該外泌體進一步包含一治療劑。在一較佳的具體實施例中，該治療劑包含抗體、抗體片段、抗體衍生物、單域抗體、胞內抗體(intrabody)、單鏈可變片段、親和體(affibody)、酵素、轉運子(transporter)、腫瘤抑制因子、病毒或細菌抑制劑、細胞成分蛋白、DNA及/或RNA結合蛋白、DNA修復抑制劑、核酸酶、蛋白酶、整合酶(integrase)、轉錄因子、生長因子、細胞凋亡抑制劑和誘導劑、毒素、結構蛋白、神經營養因子(neurotrophic factors)、膜轉運子(membrane transporter)、核苷酸結合蛋白(nucleotide binding protein)、熱休克蛋白(heat shock protein)、CRISPR相關蛋白，及其組合。該治療劑能夠加載至外泌體內。因此，將治療劑引入/加載到該包含融合蛋白的外泌體內以獲得一治療性外泌體。

在一具體實施例中，該治療劑包含一抗癌劑。在一較佳的具體實施例中，該抗癌劑包含一化療劑。在一更佳的具體實施例中，該抗癌劑 包含一用於治療癌症的微小RNA(microRNA，miR)。

在另一具體實施例中，該化療劑包括類克(remicade)、多西紫杉醇(docetaxel)、希樂可舒貝(celecoxib)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、地塞米松(dexamethasone，Decadron®)、類固醇(steroid)、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑(cisplatinum)、替莫唑胺(temozolomide)、依妥普賽(etoposide)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide)、帝盟多(temodar)、卡鉑(carboplatin)、甲基苄肼(procarbazine)、格立得(gliadel)、他莫昔芬(tamoxifen)、拓普替康(topotecan)、甲氨蝶呤(methotrexate)、Arisa®、紫杉醇(taxol)、剋癌易(taxotere)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、白葉素(leucovorin)、抗癌妥(irinotecan)、截瘤達(xeloda)、CPT-11、干擾素α(interferon alpha)、聚乙二醇化干擾素α(例如，PEGINTRON-A)，凱希得平(capecitabine)、二氯二胺鉑(cisplatin)、賀癌平(herceptin)、賀疾妥(perjeta)、泛艾黴素(epirubicin)、派癌休(pemetrexed)、沙奧特帕(thiotepa)、氟達拉濱(fludarabine)、脂質體化道諾黴素(liposomal daunorubicin)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、太平洋紫杉醇(pacilitaxel)、長春花生物鹼(vinblastine)、IL-2、GM-CSF、達卡巴仁(dacarbazine)、溫諾平(vinorelbine)、唑來膦酸(zoledronic acid)、裴米索(palmitronate)、克拉黴素(biaxin)、補束剋(busulphan)、培尼皮質酮(prednisone)、硼替佐米(bortezomib，Velcade®)、雙磷酸鹽類藥物(bisphosphonate)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、阿黴素(doxorubicin，Doxil®)、甘昔維爾(ganciclovir)、艾黴素(adriamycin)、雌莫司汀磷酸鈉(estrainustine sodium phosphate，Emcyt®)、舒林達酸(sulindac)、伊妥普賽(etoposide)或其組合。在一較佳的具體實施例中， 該化療劑包含阿黴素(doxorubicin，DOX)、剋癌易(taxotere，Taxo)、二氯二胺鉑(cisplatin，Cisp)、賀癌平(herceptin)、賀疾妥(perjeta)、泛艾黴素(epirubicin，Epir)、環磷酸醯胺(cyclophosphamide，Cycl)、卡鉑(carboplatin，Carb)、吉西他濱(gemcitabine，Gemc)、派癌休(pemetrexed，Peme)或其組合。在一更佳的具體實施例中，該化療劑包含阿黴素。

在另一個具體實施例中，該用於治療癌症的微小RNA包含miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-497、miR-145、miR-206、miR-21、miR-99a、miR-30a、miR-30a、miR-9、miR-210、miR-192、miR-494、miR-221、miR-19a、miR-19b、miR-23b-3p、miR-122-5p、miR-193b-3p、miR-141、miR-375、miR-145、miR-196a-5p、miR-200c-3p、miR-1246、miR-1290、miR-21-5p、miR-127-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-339-5p或miR-409-3p。在另一具體實施例中，該用於治療癌症的微小RNA包含miR-34a。

本發明提供一種組合物，其包含一包含一融合蛋白的外泌體，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包含SEQ ID NO：2。

本發明提供一種治療患有癌症的個體的方法，其包含施予一組合物至該患有癌症的個體，其中該組合物包含一治療性外泌體，該治療性外泌體包含一融合蛋白和一抗癌劑，該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLAG蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包含SEQ ID NO：2。在一具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD63或CD81。在一較佳具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD63。

本發明進一步提供一種組合物用於製備治療癌症的藥物的 用途，其中該組合物包含一治療性外泌體，該治療性外泌體包含一融合蛋白和一抗癌劑，該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列包含SEQ ID NO：2。在一具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD63或CD81。在一較佳具體實施例中，該外泌體跨膜蛋白包含CD63。

術語「治療」包括但不限於降低、抑制或限制癌細胞的生長，降低、抑制或限制癌細胞的轉移或癌細胞的侵襲性或是轉移，或者降低、抑制或限制一種或多種癌症症狀或其轉移。如本文所用術語「抑制癌細胞的生長」，是指任何減緩癌細胞增殖及/或遷移的速率、阻止癌細胞增殖及/或遷移、殺死癌細胞或降低細胞活力，以致癌細胞的生長速率比觀察到或預測之未處理的對照組癌細胞的生長速率低。術語「抑制生長」亦指癌細胞或腫瘤的大小減小或消失，且其轉移潛能亦降低。較佳的是，此細胞層級的抑制可以減小腫瘤的大小、阻止其生長並降低腫瘤的存在。

如本文所用的術語「癌症」或「腫瘤」，是指或描述哺乳動物中的生理狀況，其中細胞群的特徵是不受調節的細胞生長。癌症可以是一非實體腫瘤或一實體腫瘤。癌症的實例包括但不限於惡性腫瘤、淋巴瘤、胚細胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)和白血病。此類癌症更具體的實例包括乳癌、口腔癌、髓母細胞瘤(medulloblastoma)、前列腺癌、鱗狀細胞癌、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺腺癌、肺鱗狀細胞癌、腹膜癌、肝細胞癌(hepatocyte carcinoma)、胃腸癌、胰臟癌、神經膠質母細胞瘤(glioblastoma)、子宮頸癌、卵巢癌(ovarian cancer)、卵巢腺癌(ovarian adenocarcinoma)、肝癌、膀胱癌、肝腫瘤(hepatoma)、結 腸癌、結直腸癌(colorectal cancer)、胃癌、子宮內膜癌(endometrial carcinoma)或子宮肌瘤癌(uterine carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、腎臟癌、肝癌、外陰癌(vulvar carcinoma)、甲狀腺癌、肝癌和各種頭頸癌、血液腫瘤(hematologic malignancies)、急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia)、淋巴癌和白血病、黑色素瘤(melanoma)等。在一具體實施例中，該癌症包含乳癌、肺癌、口腔癌、肝癌、結直腸癌、神經膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、膀胱癌、胰臟癌或卵巢癌。在一較佳的實施例中，該癌症包含乳癌。

在一具體實施例中，該個體是動物，較佳為哺乳動物，更佳為人類。

在另一具體實施例中，該抗癌劑包含一化療劑及/或一用於治療癌症的微小RNA(miR)。在一較佳的具體實施例中，該化療劑包含阿黴素(DOX)、剋癌易(Taxo)、二氯二胺鉑(Cisp)、賀癌平、賀疾妥、泛艾黴素(Epir)、環磷酸醯胺(Cycl)、卡鉑(Carb)、吉西他濱(Gemc)、派癌休(Peme)或其組合。在一較佳的具體實施例中，該化療劑包括阿黴素。在另一具體實施例中，該用於治療癌症的微小RNA包含miR-34a。

在本發明中，該抗HLA-G蛋白是具有抗HLA-G功能的蛋白或胜肽。因此，該抗HLA-G蛋白能夠與HLA-G分子特異性結合。尤其是，本發明中的SEQ ID NO：2的序列對HLA-G具有較高的親和力。在一些方面，HLA-G分子表現在癌細胞上。因此，具有抗HLA-G蛋白的外泌體能與癌細胞特異性結合，並可作為治療癌症的藥物遞送工具。

在一些具體實施例中，該治療性外泌體與一醫藥上可接受的 載體一起施予。術語「醫藥上可接受的載體」是指與製劑的其他成分相容並且對接受者無害的任何載體、稀釋劑或賦形劑。醫藥上可接受之載體的選擇，可根據選擇的給藥途徑和標準用藥準則而定。該治療性外泌體可根據藥物製劑領域的標準配製成各種劑型。合適的劑型包含但不限於，例如，溶液、腸胃外溶液、注射液、錠劑、栓劑或懸浮劑。

本發明中包含治療性外泌體的組合物，能透過多種途徑施予個體，包括口服、腸胃外、舌下、經皮、直腸、經粘膜、局部、經由吸入、經頰施予(buccal administration)、胸膜內(intrapleural)、靜脈、動脈、腹膜、皮下、肌肉內、鼻內、脊髓(intrathecal)、關節內或其組合。在一較佳的具體實施例中，該組合物是透過靜脈或腸胃外施予的方式給藥。在另一具體實施例中，該組合物是以直接注射到腫瘤的方式施予。

對於腸胃外給藥的方式，活性劑可以與合適的載體或稀釋劑混合，例如、但不限於水、油(例如，植物油)、乙醇、生理食鹽水(例如，磷酸鹽緩衝生理食鹽水或生理食鹽水)、水性右旋糖(葡萄糖)和相關的糖溶液、甘油或甘醇(例如丙二醇或聚乙二醇)。亦可添加穩定劑、抗氧化劑和防腐劑。合適的抗氧化劑包括、但不限於亞硫酸鹽、抗壞血酸、檸檬酸及其鹽類、和乙二胺四乙酸(EDTA)鈉。適當的防腐劑包括、但不限於苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、對羥基苯甲酸甲酯(methyl-paraben)或對羥基苯甲酸丙酯(propyl-paraben)以及氯丁醇(chlorbutanol)。以腸胃外方式給藥的組合物，可以是水性或非水性溶液、分散液、懸浮液或乳液的形式。

根據本發明，該包含治療性外泌體之組合物的劑量，沒有特別的限制，只要是對治療有效的量即可。可根據活性成分、劑型、患者的年 齡和體重、給藥時間表、給藥方法等進行適當的變化。該組合物較佳為單位劑型。這種形式時，其製備被分為包括適量活性成分的單位劑量。

治療癌症的方法包含施予有效治療量的治療性外泌體，以降低、抑制或限制癌症的生長。術語「有效治療量」是指足以產生有益或所需的生物及或臨床結果的量。在一具體實施例中，「有效治療量」是與觀察到或預測之未治療對照癌症的生長速率相比，足以抑制、減少或限制癌細胞生長的量。

抗癌劑、miR或治療性外泌體的劑量通常在約0.0001或0.001或0.01毫克/公斤/天至約1000毫克/公斤/天的範圍內，但可以更高或更低，視各種因素而定，如組合物的活性、其生物可利用性、給藥方式和上述討論的各種因素。劑量和間隔時間可單獨調整，以提供足以維持治療或預防效果之外泌體的局部性及/或全身性濃度。例如，該組合物可每週施予一次、每週數次(例如，每隔一天)、每天一次或每天數次，視給藥的方式、特定的治療指示、以及主治醫師的判斷。本領域技術人員無需過多的實驗便能優化有效的局部劑量。在一具體實施例中，該化療劑的有效治療量的範圍為0.01至10毫克/公斤體重。在另一具體實施例中，該用於治療癌症的微小RNA的有效治療量的範圍為0.01至1毫克/公斤體重。

此外，在本發明中，包含融合蛋白之生產外泌體的細胞可應用於本發明的循環拉伸生物反應器中。作為遞送載體，外泌體有其優勢，因為它具有多種益處，例如缺乏免疫原性以及有效遞送到不同器官的能力。因此，使用本發明之循環拉伸生物反應器的培養方法，適合用以一致且大量生產保留外泌體之生物特性且包含融合蛋白的外泌體，使這些外泌體適合作 為藥劑(例如治療劑)的遞送工具。

圖1顯示有/沒有載物工程化(cargo engineering)之外泌體的形態與尺寸的驗證。圖1A顯示有/沒有載物工程化之外泌體之形態的驗證。圖1B顯示經/未經載物工程化之外泌體之尺寸的驗證。Exo：外泌體；及CARExo：載物外泌體。

圖2顯示使用西方墨點法(CD63、CD81、CD9、Alix、HSP-70和β-微管素(β-tubulin))和流式細胞分析技術，進行外泌體生物標記物的認定。圖2A顯示使用西方墨點法鑑定之外泌體的生物標誌物(CD63、CD81、CD9、Alix、HSP-70及β-微管素)。圖2B顯示使用流式細胞分析技術鑑定之外泌體的生物標誌物(CD63、CD81及CD9)。PE-A：紅藻素區域(phycoerythrin area)。

圖3顯示使用共軛焦顯微鏡評估MDA-MB-231細胞(F-肌動蛋白：紅色，細胞核：藍色)內留存之外泌體(綠色)。

圖4顯示使用螢光染色法比較乳癌細胞(MDA-MB-231)和正常乳房細胞(MCF-10A)對具有/不具有靶向功能之外泌體的攝取效果。外泌體：綠色，F-肌動蛋白：紅色，以及細胞核：藍色。

圖5顯示使用流式細胞分析技術比較乳癌細胞(MDA-MB-231)和正常乳房細胞(MCF-10A)對具有/不具有靶向功能之外泌體的攝取效果。

圖6顯示使用螢光染色法比較共同培養系統中乳癌細胞(MDA-MB-231)和正常乳房細胞(MCF-10A)對靶向外泌體的攝取效果。 外泌體：綠色，F-肌動蛋白：紅色，以及細胞核：藍色。HPF：人類肺纖維母細胞(human pulmonary fibroblast)。

圖7顯示具有/不具有靶向功能之外泌體對乳癌細胞(MDA-MB-231)和正常乳房細胞(MCF-10A)之細胞毒性的評估。

圖8顯示在CARExo的治療潛力中體內的生物分佈的評估。本發明使用MD-MBA-231細胞去建構異種移植(xenograft)之小鼠模型。

圖9顯示在外泌體中同時加載之miRNA和DOX的量。DOX：阿黴素(doxorubicin)。

圖10顯示載有miRNA和DOX之外泌體對MDA-MB-231的細胞毒性評估。

圖11顯示使用螢光染色法評估載有miRNA之外泌體(miR-34a@CARExo)對細胞內miRNA釋放的影響。CARExo：綠色，miR-34a：紅色，以及細胞核：藍色。

圖12顯示載有miRNA/DOX之CARExo於體內抑制乳癌腫瘤療效的驗證，以及腫瘤轉移至其他器官之評估。圖12A顯示載有miRNA/DOX的CARExo於體內抑制乳癌腫瘤之療效驗證。圖12B顯示載有miRNA/DOX的CARExo在其他器官中腫瘤轉移之療效評估。

圖13顯示使用螢光染色法比較具有/不具有靶向功能之外泌體在MB11(神經膠質母細胞瘤)、A549(非小細胞肺癌)、HepG2(肝細胞癌)、OECM(口腔鱗狀細胞癌(oral squamous carcinoma))、SKOV3(卵巢癌細胞株)和T24(泌尿膀胱癌(urinary bladder carcinoma))內的攝取作用。外泌體：綠色，F-肌動蛋白：紅色，以及細胞核：藍色。

圖14顯示具有/不具有靶向功能之載有DOX的外泌體對乳癌(MB231)、肺癌(HCC827)、口腔癌(OECM)、肝癌(HepG2)、結直腸癌(CaCO2)、髓母細胞瘤(U87)、泌尿膀胱癌(T24)、胰臟癌(MIA PaCa-2)和卵巢腺癌(SKOV3)的細胞毒性比較。乳房上皮細胞(Mammary epithelial cells，MePic)和人類肺纖維母細胞(HPF)是正常細胞。

圖15顯示具有/不具有靶向功能之載有各種化療劑的外泌體對乳癌(MB231)的細胞毒性比較。

圖16顯示載有細胞之FGelMa水凝膠的製備和循環拉伸培養系統的使用。圖16A為載有細胞的拉脹水凝膠之製備程序的圖解說明。圖16B顯示浸在培養液中的已製備完成的拉脹水凝膠。圖16C顯示載有細胞的拉脹水凝膠應用於動態拉伸培養系統，並在20%之形變(strain)和0.48Hz之頻率的循環拉伸下進行培養。

圖17顯示於拉伸培養系統中加載HEK293T之拉脹支架所生產之外泌體的產量比較，以及單個細胞所分泌之外泌體的產量比較。

圖18顯示在循環拉伸培養系統中的裝載HEK293T之拉脹支架內細胞形態以及YAP蛋白染色的差異。

圖19顯示在循環拉伸培養系統中，因YAP抑制劑維替泊芬(Verteporfin)對載有HEK293T的拉脹支架所造成的細胞形態、YAP蛋白染色以及外泌體分泌的差異。圖19A顯示在循環拉伸培養系統中，因YAP抑制劑維替泊芬對載有HEK293T的拉脹支架所造成的細胞形態和YAP蛋白染色的差異。圖19B顯示在循環拉伸培養系統中，因YAP抑制劑維替泊芬對載有HEK293T的拉脹支架所造成的外泌體分泌的差異。

圖20顯示在靜態和動態培養系統之間，與HEK293T相關之外泌體在形態、大小和生物標記物上的差異。

本發明可以以多種不同的形式具體實現，並且不應被解讀為限於本專利說明書所描述的實施例。所描述的實施例並不限制申請專利範圍所定的發明範圍。

材料與方法

載體的建構和細胞株的建立

透過分子克隆技術去合成編碼抗HLA-G VHH/CD63融合蛋白的序列並將其連接再一起插入進pcDNA3.4質體(Thermo Scientific)中，以產生一個抗HLA-G-CD63的表現質體(如pcDNA3.4-αHLA-G-CD63)。所插入之DNA序列是用Sanger定序法驗證。為了建立穩定的表現細胞株，透過使用Lipofectamine 3000試劑(Thermo Scientific)將pcDNA3.4-αHLA-G-CD63轉染到293T細胞。轉染後，透過在G418(800μg/mL，Invivogen)中培養選出穩定轉染的293T細胞。293T細胞能生產具有抗HLA-G/CD63融合蛋白的外泌體作為載物外泌體(cargo exosome，CARExo)。

編碼抗HLA-G蛋白的核酸序列為：

(SEQ ID No：1)。

抗HLA-G蛋白的胜肽序列為：

(SEQ ID No：2)。

Exo和CARExo的製造和特性

為了獲得外泌體(Exo或CARExo)，以2000g離心培養基15分鐘以去除細胞碎片，再用0.22μm的濾紙過濾。然後，以5000g超過濾(Amicon® Ultra,30kDa,Merck Millipore,Billerica,MA,USA)8分鐘濃縮上清液。收集的上清液用於切向流過濾(tangential flow filtration，TFF)(MAP.03-plus TFF System，Lefo Science，台北，台灣)，再以阻隔300kDa分子量的膜過濾，然後以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)(pH=7.4)回溶，詳細說明如上。所有樣本均在4℃下操作以便立即使用或儲存在-80℃下備用。分離後，Exo/CARExo以1%戊二醛(glutaraldehyde)於4℃固定過夜。洗滌後，將Exo/CARExo加載到鍍碳銅(formvar carbon)塗層網格上，以磷鎢酸(phosphotungstic acid)水溶液負染1分鐘。以穿透式電子顯微鏡(TEM，JEOL JEM-1400，東京，日本)分析Exo/CARExo的超微結構。

以奈米顆粒追踪分析(nanoparticle tracking analysis)(NTA，ZetaView®，Particle Metrix GmbH，梅爾布施，德國)分析外泌體的尺寸分佈和濃度。為了分析生物標誌物，將Exo/CARExo浸入並與塗有抗CD9抗體(ab239685，Abcam)、抗CD63抗體(ab239686，Abcam)和抗CD81抗 體(ab239687，Abcam)之磁性捕獲珠在室溫下輕輕混合12小時。洗滌掉預先結合的Exo/CARExo，並放置在DynaMag^TM(Invitrogen)上10分鐘，然後丟棄上清液。將與珠子結合的Exo/CARExo重新懸浮在緩衝液中，並在4℃下，與PE抗-CD9抗體(E-AB-F1086D，Elabscience，休斯頓,，德克薩斯州，美國)或PE抗-CD63抗體(ab205540，Abcam)，或抗CD81抗體(E-AB-F1073D，Elabscience)一起孵育2小時。使用BD Accuri^TM C6 Plus流式細胞分析技術(BD FACS，聖何塞，加利福尼亞州，美國)分析經PE(phycoerythrin，紅藻素)標記珠子所結合的Exo。再者，使用西方墨點法測定Exo/CARExo的特定生物標誌物，如CD63、CD81、HSP70、Alix和β-微管素(Abcam)。

外泌體攝取分析

將PKH26標記的Exo/CARExo混合在2mL的MDA-MB-231和MCF10A培養基中(10⁹Exo/mL)。首先，這兩種細胞株在載玻片孔(μ-slide well，ibidi GmbH，Gräfelfing，德國)中生長至60%匯合(confluence)，然後將培養基更換為含有PKH26標記的Exo培養基。在培養6、12和24小時後，將細胞用PBS洗滌兩次，固定，再以Alexa Fluor^TM 488 Phalloidin和DAPI染色。洗滌後，使用螢光顯微鏡(BX53，Olympus，東京，日本)進行細胞影像的拍攝。

細胞活性

細胞在含有Exo/CARExo的96孔中培養以用於不同的時間點的收集，收集培養基並用PBS溶液洗滌以去除任何殘留的培養基。四唑染料(tetrazolium dye)MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化 物，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(Sigma-Aldrich)，以1：9的比例與新鮮培養基混合，並評估細胞活性，其係透過作用於呼吸鏈(respiratory chain)進行。反應3小時後，去除MTT試劑，加入DMSO後靜置20分鐘，使甲臢結晶(formazan crystals)溶解，再重新均勻分佈於96孔中。在570nm的波長下定量吸光度以評估細胞活性。

免疫螢光分析

將MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A細胞(密度為5 x 10⁴細胞/毫升)接種到帶有蓋玻片的35毫米培養皿，使其粘附12小時。在37℃，在任一奈米探針(0和5μM)存在下，培養MDA-MB-231、MCF-7和MCF-10A細胞6小時。用PBS洗滌細胞一次，固定，並在PBS中使用含1% Triton X-100的4%多聚甲醛(paraformaldehyde)同時透化。然後在PBS中用0.1M的甘胺酸(glycine)驟冷(quenched)，並在4℃下用3%(wt/vol)BSA阻斷過夜。按照指示使用初級抗體和二級抗體對固定和透化的細胞進行染色。然後，細胞在室溫下用DAPI溶液染色5分鐘。山羊抗小鼠IgG H&L(Alexa Fluor® 647)(ab150115)和山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor® 488)(ab150077)購自Abcam(劍橋，英國)。使用雷射共軛焦顯微鏡(Zessis，LSM800，德國)觀察細胞形態。

裝載miRNA和阿黴素(DOX)之Exo/CARExo的製備

為了裝載外源物於Exo/CARExo，使用電穿孔轉染miR-34a和阿黴素。Exo/CARExo的量為1 x 10⁹(以NTA測量)，在電穿孔之前，先在緩衝液中與miR-34a混合。電穿孔後，Exo/CARExo在37℃下靜置一小時。然後與1mg的阿黴素混合，在37℃反應60分鐘，然後切換到4℃反 應30分鐘，再加入20μL的ExoQuick-TC(System Bioscience)混合均勻，於4℃反應16小時。反應後，於4℃、1500×g離心30分鐘，吸除上清液，加入200μL的PBS洗滌並離心去除，重複上述的PBS洗滌兩次，最後加入100μL的PBS以均勻分散外泌體。完成後，用NTA重新分析Exo/CARExo的數量，以及藥物輸送過程中損失之Exo/CARExo的量。

生物分佈

本發明使用腫瘤異種移植之小鼠模型(NOD/SCID γ(gamma)小鼠)評估Exo/CARExo在體內的腫瘤靶向作用。自尾靜脈注射100μL(5 x 10¹⁰Exo/CARExo)的PBS、Exo和CARExo。在不同的時間點對小鼠進行掃描，24小時後犧牲小鼠。

體內抗腫瘤作用

將0.1ml的MDA-MB-231細胞懸浮液(5 x 10⁶/100μL)注射到NOD/SCIDγ(NSG)裸鼠的右側以產生一個異種移植腫瘤模型。將帶有已建立之MDA-MB-231腫瘤(150-200mm³)的小鼠隨機分組，各組處理的情形如下：(i)PBS，作為控制組；(ii)Exo-miR；(iii)Exo-藥物；(iv)Exo-藥物-miR(藥物當量為5毫克/公斤和miR當量為0.1奈米莫耳/公斤)。每週自尾靜脈注射藥物，連續7週。稱重小鼠，並且每4天用卡尺測量腫瘤。使用下式計算腫瘤體積：腫瘤體積=(長x寬x寬)/2。

組織收集和蘇木精-伊紅(H&E)染色

腹膜注射劑量為1毫升/公斤的水合氯醛水溶液(aqueous chloral hydrate solution，3% w/v)以麻醉小鼠。然後犠牲小鼠，採集血液樣本並暴露其腹腔。在蘇木精-伊紅染色之前，收集肝、肺、脾、心臟和腎臟 樣本並暫時儲存在10%中性緩衝福爾馬林(NBF)中。

使用100mL的40% v/v甲醛水溶液、無水磷酸氫二鈉(6.5克)、磷酸二氫鈉(4.0克)和蒸餾水(900毫升)製備NBF(pH 7.2-7.4)。用10% NBF溶液將肝、脾、肺、心臟和腎臟組織回復。將組織切片脫水、包埋在石蠟中、切割並使用蘇木精和伊紅染色。

3D球體模型的建構

所有細胞均在適合各自的培養基中培養。每2或3天更換一次培養基。在脫細胞肺ECM包埋培養之前，本發明使用0.25% EDTA溶液(Gibco)內的胰蛋白酶處理以收集各種細胞類型，在1200rpm下離心10分鐘以收集細胞，再將細胞分散於各培養基中。將細胞懸浮液與ECM的預凝膠溶液(4wt%)混合，各種細胞的最終濃度為5 x 10⁶細胞毫升^-1。將各個包有細胞之預凝膠溶液的等分試樣(aliquots)，並轉移到多孔盤的孔中，置於37℃的培養箱中1小時。凝膠後，將癌細胞或內皮細胞的培養基添加到孔中。每2或3天更換各個培養基。

具拉脹結構之載有細胞的FGelMa水凝膠的製備

在本發明中，具拉脹結構之水凝膠是使用模板鍍模技術製造。考慮到具拉脹結構之載有細胞的水凝膠，應與拉伸生物反應器相容，故使用三種組件來生產該結構：聚醚多元醇(Pluronic)F-127溶液、GelMa和載有細胞的FGelMa。使用BioX生物列印機(Cellink，瑞典)於蒸餾水中濃度為30wt%之Pluronic F-127(Sigma-Aldrich)溶液，去設計和列印一個正模具。圖16顯示拉脹構造的一個代表性單位構型。對於模具列印，使用SolidWorks設計和開發一個立體微影(stereolithography，STL)模型。然後 將STL檔案轉換為g-代碼檔案，用以使用sli3er軟體來確定生物列印機的移動和列印路徑。將褪色墨水(fugitive ink)裝入配有內徑為150μm之可換鎖緊噴嘴(luer-locked nozzle)注射器筒後，施加170kPa的氣動壓力，將褪色墨水沉積在載玻片上以形成直徑約為250μm的細絲，使用移動速度為25μm/秒之注射器。拉脹結構的暫時模具是逐層製造(每層150μm)，直到結構的最終厚度達到2.1mm。然後將含有15wt% GelMa和0.5wt% I-2959的溫熱(37℃)PBS裝入模具中，形成固定部分，每側有能夠連接到拉伸生物反應器(ATMS Boxer QQA循環拉伸培養系統，Genemessenger，高雄，台灣)的兩個開口(圖16A)。將HEK293T(或其他正常細胞株和原代細胞)與含有0.5% I-2959之PBS中的10wt% FGelMa混合，以獲得載有細胞的FGelMa。將培養在培養基中的滙合細胞(confluent cell)用胰蛋白酶消化、離心，並以5 x 10⁶細胞/毫升的密度回溶於溫熱的FGelMa溶液中。將載有細胞之水凝膠載入試件(specimen)的拉脹部分。試件在37℃下孵育1分鐘以液化GelMa和FGelMa。暴露於紫外線照射(365nm)90秒後，將試件浸泡在冷的(4℃)PBS中10分鐘以溶解暫時的F-127(圖16B)。為了施加循環拉伸力，將試件固定在拉伸生物反應器中，並提供8ml的培養基；在培養期間，以0.48Hz的頻率連續向載有細胞之水凝膠施加20%的拉伸形變。在靜態條件下培養的試件作為控制組(圖16C)。所有的體外實驗都是在37℃、5%CO₂和100%濕度的細胞培養箱中進行；每2天更新培養基。

FGelMa的合成和特性，以及拉伸生物反應器的設計和應用，均描述於陳怡文等人(Materials & Design,Volume 195,October 2020,108982) 的文獻中，該文獻之全文以引用的方式併入本專利說明書內。

YAP抑制劑的處理

在稍早的結果中，本發明認為HEK293T的拉伸刺激是透過活化細胞YAP蛋白，其為一種在細胞行為上具有關鍵作用的機械敏感轉錄活化蛋白。因此，最後，本發明將載有HEK293T的拉脹支架暴露於YAP抑製劑維替泊芬(Verteporfin)(MedChemExpress，Monmouth Junction，紐澤西，美國)。培養一定的天數後，本發明使用免疫螢光染色和成骨相關蛋白(osteogenic-related proteins)，評估YAP在拉伸刺激中扮演的角色。

結果

驗證有/沒有載物工程化(cargo engineering)的外泌體特性。切向流過濾(TFF)技術所分離的Exo和CARExo，在其TEM圖像中，可觀察到形態上的結果。該結果顯示，即使透過載物工程化，外泌體的大小程度相似(圖1A)。它們清楚地呈現囊泡中空特徵和表面膜。NTA分析顯示，主峰的直徑分別是110nm(Exo)和120nm(CARExo)(圖1B)。這些結果證明外泌體的形態經載物工程化處理後維持穩定。

通常CD9、CD63、CD81、HSP71和Alix會富集在外泌體表面膜上，故使用抗CD9、抗CD63、抗CD81、抗HSP70和抗Alix之西a墨點法進行分析(圖2A)。細胞溶質標記物(cytosolic marker)β-微管素並不在外泌體內。本發明的結果顯示，CARExo具有相同之外泌體特徵標記物的表現。流式細胞分析顯示，在Exo組中所檢測到外泌體標記物CD9、CD63和CD81的量(圖2B)。此外，用載物工程化對外泌體的表面進行修飾並不影響親代外泌體的性能。

許多研究顯示，外泌體能夠用作對特定細胞標靶產生治療效果的理想運具(圖3)。因此，本發明進一步研究CARExo在MDA-MB-231細胞核之攝取。使用外泌體追踪試劑PKH67(綠色)染色CARExo，然後與MDA-MB-231共同培養24小時。然後，本發明進一步用F-肌動蛋白細胞支架試劑(紅色)和細胞核試劑DAPI(藍色)進行染色，共軛焦顯微鏡下的圖像顯示外泌體被攝取到細胞核層(YZ切片)。因此，此為CARExo在癌症精準治療方面具有高潛力的重要線索。

此外，為了進一步確認CARExo能特異性的靶向乳癌(MDA-MB-231)，本發明使用正常乳房細胞(MCF10A)進行比較(圖4)。MDA-MB-231和MCF-10A分別與Exo和CARExo在不同時間點孵育6小時、12小時和24小時後進行免疫螢光檢測。該結果顯示，231細胞對CARExo具有良好的親和力。12小時後，大量的CARExo被攝取，而Exo的量相對較少。

使用流式細胞技術測量外泌體的靶向率。MDA-MB-231和MCF-10A分別以CARExo和Exo處理6小時和24小時(圖5)。在6小時內，兩組的表現並無差異。然而，以CARExo處理24小時，本發明檢測到MDA-MB-231亞群大量的增加，而Exo的變化很小。CARExo精準的靶向MDA-MB-231，且比MCF-10A的靶向更有效率。

在CARExo與癌細胞(MDA-MB-231，紅色)和正常細胞(HDF，淺綠色)共同培養的實驗中，也可以發現CARExo(綠色)集中在癌細胞中，進一步證實CARExo對癌細胞具有特異性(圖6)。

圖7顯示CARExo、Exo和控制組(Ctl)對MD-MBA-231、 MCF 10A細胞的細胞毒性。共同培養6、12、24、48小時後，無論是CAExo還是Exo，細胞存活定量證明這些外泌體並無細胞毒性。這些結果代表三個獨立實驗。

為了進一步評估CARExo的體內治療潛力的生物分佈，本發明使用MDA-MB-231細胞去構建一個異種移植小鼠模型(圖8)。與體外結果一致，CARExo顯著的靶向腫瘤，因此肺和脾臟檢測到極少的信號，當肺和脾臟器官是正常的外泌體儲存位置。

此外，理想的電穿孔參數是在600mV至800mV的範圍內，其能使外泌體穩定地擕帶miR-34a(圖9)。該結果顯示700mV具有最佳的遞送效率，且CARExo能檢測到30ng的miR-34a，表示這種覆蓋效率運用在藥物遞送上具高潛力。在700mV的高效率下，CARExo能遞送癌症靶向藥物阿黴素(Dox)。結果進一步顯示，當Dox與20ng的miR-34a一起遞送時，亦具極佳的效率。上述結果顯示，該電穿孔參數能使外泌體同時穩定的攜帶兩種藥物。

然後，本發明進一步將測試組增加到六組：控制組(Ctl)、藥物(Drug)、miR、CARExo、CARExo-藥物(CARExo-Drug)、CARExo-miR-藥劑(CARExo-miR-Drug)，以區別癌細胞殺傷功效的驗證(圖10)。24小時和48小時後，CARExo-miR-藥物組的細胞殺傷效果優於其他組。只有CARExo組或藥物組的效果約為50%。由此可見，外泌體的混合物能夠在第一時間有效快速殺死癌細胞。

然後，本發明分別使用CARExo和miR-34a追踪劑染色(圖11)。如預期的再次驗證CARExo(綠色)包覆miR-34a(紅色)時呈現共定 位現象。

本發明欲進一步證明CARExo外泌體對於體內腫瘤抑制具有加成效應(圖12)。本發明設計了四組：控制組(Ctl)、CARExo-miR(裝載有miR-34a的CARExo)、CARExo-藥物(裝載有阿黴素的CARExo)和CARExo-藥物-miR(裝載有miR-34a和阿黴素的CARExo)透過動物實驗，將CARExo-藥物-miR皮下注射到小鼠體內，在不同時間點進行觀察。發現其對於腫瘤形成的抑制作用優於其他各組(圖12A)。在CARExo-藥物-miR組中的腫瘤體積和重量顯著的減少。然後，本發明欲確認對其他器官的細胞毒性。療效測試聚焦在肝和肺，以及其他的器官，包括心臟、腎臟和脾臟。HE染色顯示上述器官保留原始的形態(圖12B)。證明CARExo-Drug-miR是安全的，且精準的靶向腫瘤部位。

在圖13中，本發明還以不同癌症模型測試CARExo的療效：MB11(神經膠質母細胞瘤)、A549(非小細胞肺癌)、HepG2(肝細胞癌)、OECM(口腔鱗狀細胞癌)、SKOV3(卵巢癌細胞株)和T24(泌尿膀胱癌)。共軛焦圖像顯示，對這些癌細胞株而言，CARExo的攝取能力優於Exo。

此外，本發明設計了7組：控制組(Ctl)、DOX(阿黴素)、LipoDox(載有阿黴素的脂質體)、Exo(外泌體)、CARExo(載物外泌體)、DOX@Exo(載有阿黴素的外泌體)和DOX@CARExo(載有阿黴素的載物外泌體)，以測試不同的癌細胞株。在不同的癌細胞株中能看到類似的結果(圖14)。除了乳癌(MB231)外，還有肺癌(HCC827)、口腔癌(OECM)、肝癌(HepG2)、結直腸癌(CaCO2)、胰臟癌(MIAPaCa-2)、髓母細胞瘤 (U87)、泌尿膀胱癌(T24)和卵巢腺癌(SKOV3)等。可以發現DOX@CARExo能夠展現良好的細胞毒性。此外，在正常細胞中，CARExo的細胞毒性也低於DOX和Lipo-DOX。

此外，本發明還能透過外泌體作為載體，攜帶不同的化療藥物(例如，阿黴素(DOX)、剋癌易(Taxo)、二氯二胺鉑(Cisp)、泛艾黴素(Epir)、環磷酸醯胺(Cycl)、卡鉑(Carb)、吉西他濱(Gemc)和派癌休(Peme)，以殺死癌細胞(圖15)。該結果顯示，將化療藥物載入到CARExo會比Exo更有效地殺死癌細胞(MDA-MB-231)，且與之前DOX的結果具有相同的趨勢。因此，在作為抗癌藥物載體上，CARExo具有更多的應用。

不同濃度(10%、12.5%和15%)的水凝膠支架，在不同時間點被施以循環拉伸應力，外泌體的分泌效率有明顯的變化(圖17)。在15% FGelMa支架中，釋放的外泌體超過12.5%和10%。此外，本發明還評估每個細胞的外泌體的分泌效率。在循環拉伸處理1個月後，在15%、11.5%和10%之FGelMa水凝膠支架中，外泌體的分泌量分別約為1.03 x 10⁶/細胞、0.92 x 10⁶/細胞和0.81 x 10⁶/細胞。本發明還將本實驗與市場上專門用以生產外泌體的生物反應器進行比較。從結果可以發現，FiberCell系統能長時間連續的收集外泌體，但一個月後的產量約為0.44 x 10⁶/細胞，遠低於本發明的系統。另一個CelCradle^TM是一種類似於懸浮培養的生物反應器，不能長期收集外泌體，因此只能測試兩週左右，產量也比本發明的系統小。

本發明另外使用細胞骨架(F-肌動蛋白，綠色)、機械敏感標記物(YAP，紅色)和細胞核(藍色)進行螢光染色，來鑑定在拉伸刺激下，水凝膠支架所包裹之細胞的變化(圖18)。如圖18所示，細胞經循環 拉伸力拉伸3天後，可以發現細胞從單個細胞變成自我組裝的三維細胞球體，而靜態培養組的細胞仍然是單細胞。經機械力刺激而形成的三維細胞球體，在球體周圍表現大量的YAP蛋白，但靜態培養的細胞幾乎不表現，因此本發明推測經機械力刺激的細胞大量表現YAP蛋白，並在3D球體形成後增加外泌體的分泌。

隨後，在循環拉伸刺激過程中，加入YAP蛋白抑制劑(維替泊芬)。螢光染色顯示，在未添加抑制劑的實驗組中，YAP蛋白的表現、細胞球體的形態、外泌體的分泌量都和之前的結果一致(圖19A)。添加抑制劑之實驗組的細胞形態為單細胞，不能自我組裝以形成三維球體，其與靜態培養的細胞類似，外泌體的分泌量也大量減少至循環拉伸刺激組的5%(圖19B)。因此推測在三維培養下，連續的機械刺激能透過活化YAP蛋白使細胞形成三維球體，大量增加外泌體的分泌。

為了確認靜態/動態拉伸後細胞分泌之外泌體的出現，本發明透過標準TFF程序分離細胞外的囊泡(圖20)。穿透式電子顯微鏡和光學奈米尺寸分佈(Nanosight size distribution)分析證實小圓形粒子群的尺寸介於50至350nm之間，主峰位於122nm。西方墨點法分析證實在動態拉伸下，四穿膜蛋白(tetraspanin)外泌體標記物CD9、CD63、CD81、TSG101和細胞溶質標記物β-微管素大量的增加。在靜態拉伸下，另一種外泌體標記物CD9、CD63、CD81、TSG101，只是較適度的增加。相比之下，細胞溶質標記物β-微管素幾乎只在細胞裂解物中檢測到。合併觀之，這些結果證實因動態拉伸而成功分離出的類外泌體顆粒。

本領域的技術人員將上述概念理解為對用以傳達寄存申請 信息之方法的描述。本領域的技術人員理解這些只是說明性，並且有許多可能的等效物。

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Claims (9)

1. 一種組合物，其包含一包含一融合蛋白的外泌體，其中該融合蛋白包含一靶向蛋白和一外泌體跨膜蛋白，該靶向蛋白包含一抗HLA-G蛋白，且該抗HLA-G蛋白的序列是以SEQ ID NO：2所組成，其中該靶向蛋白與該外泌體跨膜蛋白連接，該靶向蛋白表現於該外泌體的膜的外側，且該外泌體跨膜蛋白將該靶向蛋白固定於該外泌體的膜上。
2. 如請求項1所述的組合物，其中該外泌體跨膜蛋白包含CD9、CD63或CD81。
3. 如請求項1所述的組合物，其中該外泌體包含一抗癌劑。
4. 如請求項3所述的組合物，其中該抗癌劑包含一化療劑或一用於治療癌症的微小RNA。
5. 一種組合物用於製備治療癌症的藥物的用途，其中該組合物包含一如請求項1或2所述的包含一融合蛋白的外泌體，且該外泌體進一步包含一抗癌劑。
6. 如請求項5所述的用途，其中該癌症包含乳癌、肺癌、口腔癌、肝癌、結直腸癌、神經膠質母細胞瘤、髓母細胞瘤、膀胱癌、胰臟癌或卵巢癌。
7. 如請求項5所述的用途，其中該抗癌劑包含一化療劑或 一用於治療癌症的微小RNA。
8. 如請求項7所述的用途，其中該化療劑包含阿黴素、剋癌易、二氯二胺鉑、賀癌平、賀疾妥、泛艾黴素、環磷酸醯胺、卡鉑、吉西他濱、派癌休或其組合。
9. 如請求項7所述的用途，其中該用於治療癌症的微小RNA包含miR-34a。

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