TWI835367B - 使用獲自懷孕女性之長游離片段進行之分子分析 - Google Patents
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Abstract
本文所描述之方法及系統涉及使用長游離DNA片段分析來自懷孕個體之生物樣本。常常使用甲基化CpG位點及單核苷酸多型性(SNP)之狀態分析生物樣本之DNA片段。CpG位點及SNP通常與最近的CpG位點或SNP間隔數百個或數千個鹼基對。在大部分游離DNA片段上找到兩個或更多個連續CpG位點或SNP係不大可能或不可能的。長於600 bp之游離DNA片段可包含多個CpG位點及/或SNP。與單獨短游離DNA片段相比,在長游離DNA片段上存在多個CpG位點及/或SNP可允許進行分析。長游離DNA片段可用於識別起源組織且/或用於提供關於懷孕女性體內胎兒之資訊。
Description
已報導孕婦體內之循環游離DNA之模態尺寸為約166 bp(Lo等人《科學轉化醫學(Sci Transl Med.)》2010;2:61ra91)。存在極少關於大於600 bp之片段之公佈數據。一個實例為報導使用PCR進行之來自母體血漿之Y染色體之鹼性蛋白Y2基因(
BPY2)之8 kb片段擴增的Amicucci等人的作品(Amicucci等人《臨床化學(Clin Chem)》2000;40: 301-2)。尚不知曉該數據是否可在整個基因體中通用。實際上,使用大規模平行短讀段定序技術,例如使用Illumina平台偵測例如大於600 bp之該等長DNA片段存在許多挑戰(Lo等人《科學轉化醫學》2010;2:61ra91;Fan等人, 《臨床化學》2010;56:1278-86)。此等挑戰包含:(1)Illumina定序平台之推薦尺寸範圍跨度通常為100-300 bp(De Maio等人《微生物基因體學(Micob Genom.)》2019;5(9));(2)DNA擴增應參與在流量槽上之定序文庫製備(經由PCR)或定序集群生成(經由橋式擴增)。此類擴增過程可促進擴增較短DNA片段,此部分歸因於以下事實:長DNA模板(例如> 600 bp)應需要相較於短DNA模板(例如< 200 bp)而言相對長之時間來完成子股合成。因此,在於Illumina平台上定序之前或期間之此等PCR過程之固定時間框內,子股未能在PCR過程期間完全生成之彼等長DNA分子將在下游分析中不可用;(3)長DNA分子將具有更大概率形成妨礙擴增之二級結構;(4)使用Illumina定序技術,長DNA分子將相較於短DNA分子而言更可能產生含有超過一個純系DNA分子之集群,此係因為文庫經變性、稀釋且擴散在二維表面上,接著進行橋式擴增(Head等人《生物技術(Biotechniques.)》2014;56:61-4)。
本文所描述之方法及系統涉及使用長游離DNA片段分析生物樣本。使用此等長游離DNA片段允許進行未經考慮之分析或用較短游離DNA片段不可能進行之分析。常常使用甲基化CpG位點及單核苷酸多型性(SNP)之狀態分析生物樣本之DNA片段。CpG位點及SNP通常與最近的CpG位點或SNP間隔數百個或數千個鹼基對。生物樣本中之大部分游離DNA片段之長度通常小於200 bp。因此,在大部分游離DNA片段上找到兩個或更多個連續CpG位點或SNP係不大可能或不可能的。包含長於600 bp或1 kb之游離DNA片段的長於200 bp之游離DNA片段可包含多個CpG位點及/或SNP。與單獨短游離DNA片段相比,在長游離DNA片段上存在多個CpG位點及/或SNP可允許進行更高效及/或更準確之分析。長游離DNA片段可用於識別起源組織且/或用於提供關於懷孕女性體內胎兒之資訊。另外,使用長游離DNA片段準確地分析來自孕婦之樣本為出乎意料的,此係因為吾人預期該等長游離DNA片段主要係母體起源。吾人不預期胎兒起源之長游離DNA片段以足以提供關於胎兒之資訊之量存在。
存在有SNP之長游離DNA片段可用於確定胎兒遺傳之單倍型。長游離DNA片段藉由具有多個CpG位點而可具有指示起源組織之甲基化模式。另外,三核苷酸重複序列及其他重複序列可存在於長游離DNA片段上。此等重複序列可用於確定胎兒之遺傳病症之可能性或胎兒親緣。長游離DNA片段之量可用於確定胎齡。類似地,在長游離DNA片段之末端處之模體亦可用於確定胎齡。長游離DNA片段(包含例如該等片段之量、長度分佈、基因體位置、甲基化狀態等)可用於確定懷孕相關病症。
本揭示案之此等及其他實施例詳細描述於下文中。舉例而言,其他實施例係關於與本文所描述之方法相關之系統、裝置及電腦可讀媒體。
可參考以下實施方式及隨附圖式來獲得對本揭示案之實施例之性質及優點的較佳理解。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年2月5日申請之美國臨時申請案第62/970,634號及2021年1月8日申請之美國臨時申請案第63/135,486號之優先權,該等案兩者之整個內容出於所有目的併入本文中。
術語
「
組織」對應於懷孕個體或其胎兒中歸併為功能單元之一組細胞。可在單一組織中找到超過一種類型之細胞。不同類型之組織可由不同類型之細胞(例如肝細胞、肺泡細胞或血球)組成,但亦可對應於來自不同生物之組織(母親與胎兒;已接受移植之懷孕個體中之組織;感染微生物或病毒之懷孕生物或其胎兒的組織)。「參考組織」可對應於用於確定組織特異性甲基化程度之組織。來自不同懷孕個體或其胎兒之相同組織類型之多個樣本可用於確定彼組織類型之組織特異性甲基化程度。
「
生物樣本」係指取自懷孕個體(例如人類(或其他動物),諸如孕婦、患病人員或疑似患病之懷孕人員、懷孕器官移植體接受者或疑似患有涉及器官(例如心肌梗塞中之心臟或中風中之腦或貧血中之造血系統)之疾病病程的懷孕個體)且含有所關注之一或多個核酸分子的任何樣本。生物樣本可為體液,諸如血液、血漿、血清、尿液、陰道液、陰道沖洗液、胸膜液、腹水、腦脊髓液、唾液、汗液、淚液、痰、支氣管肺泡灌洗液、乳頭排出液、來自身體不同部分(例如甲狀腺、乳房)之抽吸液、眼內液體(例如眼房液)等。亦可使用糞便樣本。在各種實施例中,已富集游離DNA之生物樣本(例如經由離心方案獲得之血漿樣本)中之大部分DNA可為游離的,例如多於50%、60%、70%、80%、90%、95%或99% DNA可為游離的。離心方案可包含例如3,000 g × 10分鐘獲得流體部分,及以例如30,000 g再離心10分鐘以移除殘餘細胞。作為生物樣本分析之一部分,可分析生物樣本之統計學上顯著數目個游離DNA分子(例如以提供準確量測結果)。在一些實施例中,分析至少1,000個游離DNA分子。在其他實施例中,可分析至少10,000或50,000或100,000或500,000或1,000,000或5,000,000個或更多個游離DNA分子。可分析至少相同數目個序列讀段。
「
序列讀段」係指自核酸分子之任何部分或全部定序之一串核苷酸。舉例而言,序列讀段可為自核酸片段定序之短串核苷酸(例如20-150個核苷酸)、在核酸片段之一個或兩個末端處之短串核苷酸或存在於生物樣本中之整個核酸片段的定序。序列讀段可以各種方式獲得,該等方式例如為使用定序技術或使用探針,例如在雜交陣列或如可用於微陣列中之捕獲探針中;或擴增技術,諸如聚合酶鏈反應(PCR)或使用單一引子進行的線性擴增或等溫擴增。作為生物樣本分析之一部分,可分析統計學上顯著數目個序列讀段,例如可分析至少1,000個序列讀段。作為其他實例,可分析至少10,000或50,000或100,000或500,000或1,000,000或5,000,000個或更多個序列讀段。
「
位點」(亦稱作「
基因體位點」)對應於單一位點,其可為單鹼基位置或一組相關鹼基位置,例如CpG位點或更大組相關鹼基位置。「基因座」可對應於包含多個位點之區。基因座可僅包含一個位點,此種情況將使得基因座在彼情形下等效於一位點。
「
甲基化狀態」係指既定位點處之甲基化狀態。舉例而言,位點可為甲基化的、未甲基化的或在一些情況下為未確定的。
各基因體位點(例如CpG位點)之「
甲基化指數」可指在該位點處顯示甲基化之DNA片段(例如如由序列讀段或探針確定)相對於涵蓋彼位點之讀段總數的比例。「讀段」可對應於獲自DNA片段之資訊(例如位點處之甲基化狀態)。讀段可使用優先雜交至在一或多個位點處具有特定甲基化狀態之DNA片段的試劑(例如引子或探針)來獲得。通常,該等試劑係在用視DNA分子之甲基化狀態而有差異地修飾或有差異地辨識DNA分子之方法處理後施用,該方法例如為亞硫酸氫鹽轉化、或甲基化敏感限制酶、或甲基化結合蛋白、或抗甲基胞嘧啶抗體、或辨識甲基胞嘧啶及羥甲基胞嘧啶之單分子定序技術(例如單分子即時定序及奈米孔定序(例如來自牛津奈米孔科技(Oxford Nanopore Technologies)))。
區之「
甲基化密度」可指顯示甲基化之區內之位點處之讀段數目除以涵蓋該區中之該等位點之讀段總數。位點可具有特定特徵,例如為CpG位點。因此,區之「CpG甲基化密度」可指顯示CpG甲基化之讀段數目除以涵蓋該區中之CpG位點(例如特定CpG位點、CpG島內之CpG位點或更大區)之讀段總數。舉例而言,人類基因體中各100 kb位元子之甲基化密度可由亞硫酸氫鹽處理之後在CpG位點處未轉化之胞嘧啶(其對應於甲基化胞嘧啶)總數測定為在100 kb區定位之序列讀段所涵蓋之所有CpG位點的比例。此分析亦可針對其他位元子尺寸,例如500 bp、5 kb、10 kb、50 kb或1 Mb等執行。區可為整個基因體或染色體或染色體之一部分(例如染色體臂)。CpG位點之甲基化指數與一區僅包含彼CpG位點時該區之甲基化密度相同。「甲基化胞嘧啶之比例」可指相對於所分析之胞嘧啶殘基,亦即包含該區中除CpG情形之外的胞嘧啶的總數而言顯示為甲基化(例如在亞硫酸氫鹽轉化之後未經轉化)的胞嘧啶位點「C's」數目。甲基化指數、甲基化密度、在一或多個位點處甲基化之分子計數及在一或多個位點處甲基化之分子(例如胞嘧啶)比例為「
甲基化程度」之實例。除亞硫酸氫鹽轉化以外,可使用本領域中熟習此項技術者已知之其他方法來查詢DNA分子之甲基化狀態,包含但不限於對甲基化狀態敏感的酶(例如甲基化敏感限制酶)、甲基化結合蛋白、使用對甲基化狀態敏感之平台進行的單分子定序(例如奈米孔定序(Schreiber等人《國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci)》 2013; 110: 18910-18915)及藉由單分子即時定序(例如來自太平洋生物科學(Pacific Biosciences)的單分子即時定序)(Flusberg等人《自然-方法(Nat Methods)》 2010; 7: 461-465))。
「
甲基化體」提供基因體中之複數個位點或基因座處之DNA甲基化之量的量度。甲基化體可對應於所有基因體、基因體之相當大部分或基因體之一或多個相對小之部分。
「
甲基化概況」包含與多個位點或區之DNA或RNA甲基化相關的資訊。與DNA甲基化相關之資訊可包含但不限於CpG位點之甲基化指數、區中之CpG位點之甲基化密度(簡稱MD)、CpG位點在相連區上之分佈、含有超過一個CpG位點之區內各個別CpG位點的甲基化模式或程度及非CpG甲基化。在一個實施例中,甲基化概況可包含超過一種類型之鹼基(例如胞嘧啶或腺嘌呤)之甲基化或非甲基化模式。基因體之相當大部分之甲基化概況可視為等效於甲基化體。哺乳動物基因體中之「DNA甲基化」通常指將甲基添加至CpG二核苷酸當中之胞嘧啶殘基的5'碳(亦即5-甲基胞嘧啶)。DNA甲基化可在例如CHG及CHH之其他情形下發生於胞嘧啶中,其中H為腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化亦可呈5-羥甲基胞嘧啶形式。亦已報導非胞嘧啶甲基化,諸如N
6-甲基腺嘌呤。
「
甲基化模式」係指甲基化及非甲基化鹼基之次序。舉例而言,甲基化模式可為單個DNA股、單個雙股DNA分子或另一類型之核酸分子上之甲基化鹼基之次序。作為一實例,三個連續CpG位點可具有以下甲基化模式中之任一者:UUU、MMM、UMM、UMU、UUM、MUM、MUU或MMU,其中「U」指示未甲基化位點且「M」指示甲基化位點。當吾人將此概念擴展至包含但不限於甲基化之鹼基修飾時,吾人將使用術語「
修飾模式」,其係指經修飾及非經修飾鹼基之次序。舉例而言,修飾模式可為單個DNA股、單個雙股DNA分子或另一類型之核酸分子上之經修飾鹼基之次序。作為一實例,三個連續潛在地可修飾位點可具有以下修飾模式中之任一者:UUU、MMM、UMM、UMU、UUM、MUM、MUU或MMU,其中「U」指示未經修飾位點且「M」指示經修飾位點。不基於甲基化之鹼基修飾之一個實例為諸如於8-側氧基-鳥嘌呤中之氧化變化。
術語「
高甲基化」及「
低甲基化」可指單個DNA分子之甲基化密度,其係如藉由其單分子甲基化程度所量測,例如分子內之甲基化鹼基或核苷酸數目除以彼分子內之可甲基化鹼基或核苷酸總數。高甲基化分子為其中單分子甲基化程度等於或高於臨限值之分子,該臨限值可根據不同應用而經界定。臨限值可為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。低甲基化分子為其中單分子甲基化程度等於或低於臨限值之分子,該臨限值可根據不同應用而經界定且可根據不同應用而變化。臨限值可為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
術語「高甲基化」及「低甲基化」亦可指DNA分子群體之甲基化程度,其係如藉由此等分子之多分子甲基化程度所量測。高甲基化分子群體為其中多分子甲基化程度等於或高於臨限值之分子群體,該臨限值可根據不同應用而經界定且可根據不同應用而變化。臨限值可為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。低甲基化分子群體為其中多分子甲基化程度等於或低於臨限值之分子群體,該臨限值可根據不同應用而經界定。臨限值可為5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%及95%。在一個實施例中,可將分子群體與一或多個經選擇之基因體區進行排比。在一個實施例中,一或多個經選擇之基因體區可與諸如遺傳病症、銘記病症、代謝病症或神經病症之疾病相關。一或多個經選擇之基因體區之長度可為50個核苷酸(nt)、100 nt、200 nt、300 nt、500 nt、1000 nt、2 knt、5 knt、10 knt、20 knt、30 knt、40 knt、50 knt、60 knt、70 knt、80 knt、90 knt、100 knt、200 knt、300 knt、400 knt、500 knt或1 Mnt。
術語「
定序深度」係指基因座經與基因座排比之序列讀段涵蓋之次數。基因座可能與核苷酸一樣小,或與染色體臂一樣大,或與整個基因體一樣大。定序深度可表示為50×、100×等,其中「×」係指基因座經序列讀段涵蓋之次數。定序深度亦可應用於多個基因座或全基因體,在此情況下,×可指基因座或單倍體基因體或全基因體分別經定序之平均次數。超深度定序可指定序深度為至少100×。
「
校準樣本」可對應於以下生物樣本:其臨床相關DNA之分率濃度(例如組織特異性DNA分率)為已知的或經由校準方法來測定,該校準方法例如使用對組織具有特異性之等位基因,諸如在懷孕個體中之移植中,由此等位基因存在於供體基因體中但不存在於可用作經移植器官之標記物之接受者基因體中。作為另一實例,校準樣本可對應於可自其確定末端模體之樣本。校準樣本可出於兩種目的使用。
「
校準數據點」包含「
校準值」及臨床相關DNA之經量測或已知的分率濃度(例如特定組織類型之DNA)。校準值可由如針對校準樣本測定之相對頻率(例如集合值)來測定,該校準樣本之臨床相關DNA之分率濃度為已知的。校準數據點可以各種方式,例如作為離散點或作為校準函數(亦稱為校準曲線或校準表面)經界定。校準函數可自校準數據點之額外數學轉換導出。
「
分離值」對應於涉及兩個值,例如兩個貢獻分率或兩個甲基化程度之差或比率。分離值可為簡單差或比率。作為實例,x/y以及x/(x+y)之正比為分離值。分離值可包含例如乘法因數之其他因數。作為其他實例,可使用該等值之函數之差或比率,例如兩個值之自然對數(ln)之差或比率。分離值可包含差及比率。
「
分離值」及「
集合值」(例如屬於相對頻率)為提供在不同分類(狀態)之間變化之樣本量度之參數(亦稱為度量)的兩個實例,且因此可用於確定不同分類。集合值可為分離值,例如當在樣本之一組相對頻率與一組參考相對頻率之間取差時,如可在集群中所做一般。
如本文所使用之術語「
分類」係指與樣本之特定特性相關之任何一或多個數字或一或多個其他字元。舉例而言,符號「+」(或字語「正」)可表示樣本歸類為具有缺失或擴增。分類可為二元的(例如正或負)或具有更多分類層級(例如1至10或0至1之等級)。
如本文所使用之術語「
參數」意謂表徵定量數據組及/或定量數據組之間的數值關係的數值。舉例而言,第一核酸序列之第一量與第二核酸序列之第二量之間的比率(或比率之函數)為參數。
術語「
尺寸概況」大體上關於生物樣本中之DNA片段之尺寸。尺寸概況可為提供一定量之各種尺寸之DNA片段的分佈的直方圖。各種統計參數(亦稱為尺寸參數或僅稱為參數)可用於區分一個尺寸概況與另一尺寸概況。一個參數為特定尺寸或尺寸範圍之DNA片段相對於所有DNA片段或相對於另一尺寸或範圍之DNA片段的百分比。
術語「
截止值」及「
臨限值」係指操作中所使用之預定數值。舉例而言,截止尺寸可指尺寸大於其之片段經排除之尺寸。臨限值可為一值,高於或低於該值,則特定分類適用。在此等情形中之任一者下均可使用此等術語中之任一者。截止值或臨限值可為表示特定分類或在兩個或更多個分類之間進行鑑別之「參考值」或衍生自該參考值。如技術人員應瞭解,此類參考值可以各種方式確定。舉例而言,可針對具有不同已知分類之兩個不同群組之個體確定度量,且可選擇參考值來表示一個分類(例如平均值)或兩個集群之度量之間的值(例如經選擇以獲得期望靈敏度及特異性)。作為另一實例,參考值可基於樣本之統計分析或模擬來確定。特定截止值、臨限值、參考值等可基於期望準確度(例如靈敏度及特異性)來確定。
「
懷孕相關病症」包含特徵在於母體及/或胎兒組織中之基因之異常相對表現量或母親及/或胎兒中之異常臨床特徵的任何病症。此等病症包含但不限於母親之子癇前症(Kaartokallio等人《科學報告(Sci Rep.)》 2015;5:14107;Medina-Bastidas等人《國際分子科學期刊(Int J Mol Sci.)》 2020;21:3597)、子宮內生長受限(Faxén等人《美國圍產期學期刊(Am J Perinatol.)》1998;15:9-13;Medina-Bastidas等人《國際分子科學期刊》2020;21:3597)、侵入性胎盤形成、早產(Enquobahrie等人《BMC懷孕與分娩(BMC Pregnancy Childbirth.)》2009;9:56)、新生兒溶血性疾病、胎盤功能不全(Kelly等人《內分泌學(Endocrinology.)》2017;158:743-755)、胎兒水腫(Magor等人《血液(Blood.)》2015;125:2405-17)、胎兒畸形(Slonim等人《美國國家科學院院刊》2009;106:9425-9)、HELLP症候群(Dijk等人《臨床研究期刊(J Clin Invest.)》2012;122:4003-4011)、全身性紅斑狼瘡(Hong等人《實驗醫學期刊(J Exp Med.)》 2019;216:1154-1169)及其他免疫疾病。
縮寫「
bp」係指鹼基對。在一些情況下,「bp」可用於表示DNA片段之長度,即使DNA片段可為單股的且不包含鹼基對。在單股DNA之情形下,「bp」可解釋為提供以核苷酸為單位之長度。
縮寫「
nt」係指核苷酸。在一些情況下,「nt」可用於表示以鹼基為單位之單股DNA長度。此外,「nt」可用於表示相對位置,諸如所分析之基因座之上游或下游。對於雙股DNA,除非上下文另外清楚地指示,否則「nt」仍可指單股長度而非兩股中之核苷酸總數。在關於技術概念化、數據顯示、處理及分析之一些情形下,「nt」及「bp」可互換使用。
術語「
機器學習模型」可包含基於使用樣本數據(例如訓練數據)對測試數據作出預測之模型,且因此可包含監督式學習。機器學習模型常常使用電腦或處理器來研發。機器學習模型可包含統計模型。
術語「
數據分析框架」可包含可將數據視為輸入且隨後輸出所預測結果之演算法及/或模型。「數據分析框架」之實例包含統計模型、數學模型、機器學習模型、其他人工智慧模型及其組合。
術語「
即時定序」可指涉及在定序所涉及之反應進展期間進行數據收集或監測的技術。舉例而言,即時定序可涉及光學監測或拍攝DNA聚合酶併有新鹼基。
術語「
子序列」可指小於對應於核酸分子之完全序列之一串鹼基。舉例而言,當核酸分子之完全序列包含5個或更多個鹼基時,子序列可包含1、2、3或4個鹼基。在一些實施例中,子序列可指形成單元之一串鹼基,其中單元以串聯連續方式重複多次。實例包含在與三核苷酸重複序列病症相關之基因座處重複之3 nt單元或子序列、作為微衛星重複5至50次之1 nt至6 nt單元或子序列、作為小衛星重複5至50次之10 nt至60 nt單元或子序列、或在其他遺傳元件中包含諸如
Alu重複序列。
術語「
約(
about/approximately)」可意謂在如藉由本領域中一般熟習此項技術者所測定之特定值之可接受誤差範圍內,其將部分地視該值如何經量測或測定,亦即量測系統之限制而定。舉例而言,根據本領域中之實踐,「約」可意謂在1或大於1個標準差內。可替代地,「約」可意謂既定值之至多20%、至多10%、至多5%或至多1%之範圍。可替代地,尤其關於生物系統或方法,術語「約」可意謂在值之一定數量級內、在5倍內且更佳在2倍內。當特定值描述於本申請案及申請專利範圍中時,除非另外說明,否則應假定術語「約」意謂在特定值之可接受誤差範圍內。術語「約」可具有如本領域中一般熟習此項技術者通常所理解之含義。術語「約」可指±10%。術語「約」可指±5%。
在提供一定範圍之值之情況下,應理解,除非上下文另外清楚地指示,否則亦特定地揭示在彼範圍上限與下限之間的各插入值,精確至下限單位之十分位。在陳述範圍內之任何陳述值或插入值之間的各較小範圍及彼陳述範圍內之任何其他陳述值或插入值均涵蓋在本揭示案的實施例內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包含在該範圍內或排除在該範圍外,且其中任一限值、無限值或兩個限值包含在該等較小範圍內之各範圍亦涵蓋於本揭示案內,受制於陳述範圍內之任何經特定地排除之限值。若陳述範圍包含限值中之一或兩者時,排除彼等所包含之限值中之任一者或兩者之範圍亦包含於本揭示案中。
可使用標準縮寫,例如bp,鹼基對;kb,千鹼基;pi,微微升;s或sec,秒;min,分鐘;h或hr,小時;aa,胺基酸;nt,核苷酸;及其類似者。
除非另外定義,否則本文所使用之所有技術及科學術語皆具有與本揭示案所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解之含義相同之含義。儘管在本揭示案之實施例之實踐或測試中可使用與本文所描述之方法及材料類似或等效之任何方法及材料,但現可描述一些潛在及例示性方法及材料。
游離DNA分子之分析主要涉及短游離DNA片段,此常常歸因於分析技術之限制。使用Illumina定序技術自長DNA分子獲得序列資訊之有限能力在小鼠游離DNA之新近定序結果中得以證實(Serpas等人《美國國家科學院院刊》2019;116:641-649)。野生型小鼠中使用Illumina定序之僅0.02%經定序之DNA分子在600 bp及2000 bp範圍內。即使使用來自太平洋生物科學之單分子即時(SMRT)技術(亦即PacBio SMRT定序)定序原先經製備用於Illumina定序之DNA文庫,仍存在僅0.33%之在600 bp及2000 bp範圍內之經定序之DNA分子。此等經報導數據表明,定序步驟將損失93%之存在於原始DNA文庫中之在600 bp及2000 bp範圍內之長DNA分子。
吾等推測,DNA文庫製備步驟亦將損失相當大比例之長游離DNA分子,此係歸因於PCR在擴增上文所描述之長DNA分子中之限制。Jahr等人使用凝膠電泳報導許多千鹼基,例如~10,000個千鹼基之大尺寸片段之存在(Jahr等人《癌症研究(Cancer Res.)》2001;61:1659-65)。然而,凝膠電泳影像中所示之波段將不易於提供凝膠中之此等分子之序列資訊,更不必說提供表觀遺傳資訊。
吾等先前已使用Oxford Nanopore Technologies定序平台來研究自母體血漿提取之游離DNA(Cheng等人《臨床化學(Clin Chem.)》2015;61:1305-6)。吾等觀測到極小比例之大於1 kb之長血漿DNA(0.06%至0.3%)。吾等假設此類低百分比可能為此平台之低定序準確度之結果。
在游離DNA之領域中,大部分研究聚焦於短DNA分子(例如< 600 bp)。包含長游離DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊之特性為未探索的。本揭示案提供分析長游離DNA分子之系統性方式,該系統性方式包含解碼其遺傳及表觀遺傳資訊以及其在非侵入性產前測試中之臨床效用,該非侵入性產前測試例如但不限於單基因病症之非侵入性偵測、胎兒基因體之闡明(例如非侵入性全胎兒基因體定序)、全基因體位準之重新突變之偵測、及諸如子癇前症及早產之懷孕相關病症的偵測/監測。
I. 游離DNA尺寸分析
獲自孕婦之游離DNA樣本經定序,且發現相當大部分之DNA片段為長的。長游離DNA片段之準確定序得到展現。此等長游離DNA分子之尺寸概況經分析。胎兒長游離DNA分子與母體長游離DNA分子之量經比較。長游離DNA分子可與參考基因體經更準確地排比。長游離DNA分子可用於確定單倍型遺傳。
懷孕晚期之孕婦之一個血漿DNA樣本係使用PacBio SMRT定序加以分析。雙股游離DNA分子與髮夾轉接子接合且經受利用零模波導及單個聚合酶分子進行之單分子即時定序(Eid等人《科學(Science.)》2009;323:133-8)。
吾等對11億個子讀段進行定序,其中65930萬個子讀段可與人類參考基因體(hg19)經排比。子讀段係由460萬個PacBio單分子即時(SMRT)定序孔生成,該等孔含有至少一個可與人類參考基因體經排比之子讀段。平均而言,SMRT孔中之各分子平均經定序143次。在此實例中,存在450萬個環形共同序列(CCS),表明可用於下游分析之450萬個游離DNA分子。各游離DNA之尺寸係藉由計數已經識別之鹼基數目由CCS測定。
圖 1A及
圖 1B顯示0 kb至20 kb之游離DNA之尺寸分佈。y軸顯示頻率。x軸顯示線性尺度(圖1A)或對數尺度(圖1B)上0 kb至20 kb之以鹼基對為單位之尺寸。因為定序係經由全長DNA分子執行,故各DNA分子之尺寸可直接藉由計數子讀段或CCS中之核苷酸數目來測定。DNA片段尺寸量測可使用可經由全長DNA片段讀取之任何定序平台來達成且不限於單分子定序器之使用。舉例而言,Sanger定序器可經由800 bp讀取。諸如藉由Illumina平台進行之短讀段定序可經由250 bp讀取。諸如Pacific Biosciences及Oxford Nanopore之單分子定序器可經由超過10,000 bp讀取。DNA片段之尺寸亦可在與例如人類參考基因體之參考基因體排比之後測定。DNA片段之尺寸可藉由雙邊定序、接著為與參考基因體之排比來測定。圖1B顯示長尾模式。在450萬個CCS當中,存在22.5%之大於200 bp之游離DNA、19.0%之大於300 bp之游離DNA、11.8%之大於400 bp之游離DNA、10.6%之大於500 bp之游離DNA、8.9%之大於600 bp之游離DNA、6.4%之大於1 kb之游離DNA、3.5%之大於2 kb之游離DNA、1.9%之大於3 kb之游離DNA、0.9%之大於4 kb之游離DNA及0.04%之大於10 kb之游離DNA。在現行PacBio SMRT結果中觀測到之最長游離DNA為29,804 bp。
懷孕個體之一個血漿DNA亦在Illumina定序平台上使用基於PCR之文庫製備方案經定序(Lun等人《臨床化學》2013;59:1583-94)。在1820萬個雙邊讀段當中,存在5.3%之大於200 bp之游離DNA、2.0%之大於300 bp之游離DNA、0.3%之大於400 bp之游離DNA、0.2%之大於500 bp之游離DNA、0.2%之大於600 bp之游離DNA(表1)。作為比較,吾等藉由集合來自5個懷孕個體之單分子即時定序數據(亦即總計440萬個CCS)來分析尺寸概況。與藉由Illumina定序平台獲得之對應大於600 bp之血漿DNA分子(0.2%)相比,吾等觀測到更多大於600 bp之血漿DNA分子(28.56%)。此等結果表明,PacBio SMRT定序可使得吾人能夠達成超過143倍之長DNA分子(長於600 bp)。吾等可使用單分子即時定序獲得4.77%之大於3 kb之血漿DNA分子,但在Illumina定序平台中不存在讀數。
與顯示使用Oxford Nanopore Technologies定序平台之極小比例之大於1 kb之長血漿DNA分子(0.06%至0.3%)的先前報導(Cheng等人《臨床化學》2015;61:1305-6)形成對比,吾等可獲得超過21倍之大於1 kb之血漿DNA(6.4%),表明PacBio SMRT定序在自長DNA群體獲得序列資訊中之有效程度高得多。
與諸如Illumina定序平台之雙邊短讀段定序相比,諸如PacBio SMRT技術之長讀段定序技術在確定長DNA片段之特徵(例如長度)方面具有多個優點。舉例而言,長讀段一般將允許吾人更準確地與人類參考基因體(例如hg19)排比。長讀段技術亦將允許吾人藉由直接計數經定序之核苷酸數目準確地測定血漿DNA分子之長度。相比之下,基於雙邊短讀段之血漿DNA尺寸評估為使用經排比雙邊讀段之最外座標推斷血漿DNA分子之尺寸的間接方法。對於此類間接途徑,排比中之誤差將引起準確尺寸推斷。在此方面,雙邊讀段之間的尺寸跨距增大將增加排比中之誤差概率。
血漿 DNA 片段尺寸截止值( ≥ X bp ) | 藉由單分子即時定序獲得之期望片段百分比( % ) | 藉由 Illumina 定序平台獲得之期望片段百分比( % ) |
200 | 50.32 | 5.3 |
300 | 46.43 | 2 |
400 | 35.05 | 0.3 |
500 | 32.34 | 0.2 |
600 | 28.56 | 0.2 |
700 | 26.74 | 0.00 |
800 | 24.50 | 0.00 |
900 | 23.08 | 0.00 |
1000 | 21.37 | 0.00 |
1100 | 20.06 | 0.00 |
1200 | 18.60 | 0.00 |
1300 | 17.36 | 0.00 |
1400 | 16.08 | 0.00 |
1500 | 14.94 | 0.00 |
1600 | 13.84 | 0.00 |
1700 | 12.83 | 0.00 |
1800 | 11.88 | 0.00 |
1900 | 11.00 | 0.00 |
2000 | 10.19 | 0.00 |
2100 | 9.43 | 0.00 |
2200 | 8.75 | 0.00 |
2300 | 8.10 | 0.00 |
2400 | 7.51 | 0.00 |
2500 | 6.96 | 0.00 |
2600 | 6.45 | 0.00 |
2700 | 5.99 | 0.00 |
2800 | 5.55 | 0.00 |
2900 | 5.15 | 0.00 |
3000 | 4.77 | 0.00 |
表
1.
游離
DNA
之
PacBio
與
Illumina
定序之間的尺寸分佈比較。
圖 2A及
圖 2B顯示0 kb至5 kb之游離DNA之尺寸分佈。y軸顯示頻率。x軸顯示線性尺度(圖2A)或對數尺度(圖2B)上0 kb至5 kb之以鹼基對為單位之尺寸。存在一系列伴隨週期性模式出現之主峰。該等週期性模式甚至延伸至在1 kb及2 kb範圍內之分子。具有最高頻率(2.6%)之峰係在166 bp下,其與使用Illumina技術之先前發現一致(Lo等人《科學轉化醫學》2010;2:61ra91)。圖2B中之鄰接主峰之間的距離為約200 bp,表明長游離DNA生成亦將涉及核小體結構。
圖 3A及
圖 3B顯示0 bp至400 bp之游離DNA之尺寸分佈。y軸顯示頻率。x軸顯示線性尺度(圖3A)或對數尺度(圖3B)上0 bp至400 bp之以鹼基對為單位之尺寸。先前報導(Lo等人《科學轉化醫學》 2010;2:61ra91)之在166 bp下具有最主峰且10 bp週期性出現於小於166 bp之分子中之特徵特點亦可使用本揭示案之新型方法再現。此等結果表明,藉由計數自本揭示案之單分子定序之鹼基數目測定分子尺寸為可靠的。
A. 針對胎兒DNA及母體DNA之尺寸分析
母體及胎兒DNA片段之尺寸經分析且經比較。作為一實例,一個孕婦之膚色血球層DNA及經匹配之胎盤DNA經定序以分別獲得59×及58×單倍體基因體涵蓋度。吾等識別總計822,409種資訊性單核苷酸多型性(SNP),其中母親為同型接合的且胎兒為異型接合的。胎兒特異性等位基因經定義為存在於胎兒基因體中但不存在於母體基因體中之彼等等位基因。吾等經由PacBio定序在母體血漿(M13160)中識別出2,652個胎兒特異性片段及24,837個共有片段(亦即攜載共有等位基因之片段;主要係母體起源)。胎兒DNA分率為21.8%。
圖 4A及
圖 4B顯示攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。x軸顯示線性尺度(圖4A)或對數尺度(圖4B)上0 kb至20 kb之以鹼基對為單位之尺寸。攜載共有等位基因之片段(主要係母體起源)及攜載胎兒特異性等位基因之片段(係胎盤起源)兩者均展現長尾分佈,表明來源於胎兒來源及母體來源兩者之長DNA分子的存在。對於主要母體起源之片段,存在22.6%之尺寸大於2 kb之血漿DNA分子,而對於胎兒起源之片段,存在8.5%之尺寸大於2 kb之血漿DNA分子。此等結果表明,胎兒DNA分子含有較少長DNA分子。存在於此關於血漿DNA之胎兒起源及母體起源之基於SNP之分析中的長DNA百分比似乎比在總尺寸分析中觀測到的長DNA百分比高得多。該差異可能歸因於以下事實:長DNA分子涵蓋一或多個SNP之概率高於短DNA分子涵蓋一或多個SNP之概率,且因此長DNA將有利地經選擇用於基於SNP之分析。偏離對應之原始池中之長DNA比例的加SNP標籤之長DNA分子之相對比例將受彼等分子的尺寸控制。在彼等胎兒特異性DNA片段當中,最長DNA片段為16,186 bp,而在彼等攜載共有等位基因之片段當中,最長片段為24,166 bp。
圖 5A及
圖 5B顯示攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。x軸顯示線性尺度(圖5A)或對數尺度(圖5B)上0 kb至5 kb之以鹼基對為單位之尺寸。對於胎兒特異性DNA片段及共有DNA片段兩者之彼等小於2 kb之片段,存在以週期性方式出現之主峰系列。主峰可能與核小體結構經排比。
圖 6A及
圖 6B顯示攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。x軸顯示線性尺度(圖6A)或對數尺度(圖6B)上0 kb至1 kb之以鹼基對為單位之尺寸。對於胎兒特異性DNA片段及共有DNA片段兩者之彼等小於1 kb之片段,存在以週期性方式出現之主峰系列。主峰可能與核小體結構經排比。似乎存在朝向共有DNA片段尺寸概況之左側之胎兒DNA尺寸概況之可觀測位移,表明胎兒DNA將包括比母體DNA更多之短DNA分子。
圖 7A及
圖 7B顯示攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。x軸顯示線性尺度(圖7A)或對數尺度(圖7B)上0 bp至400 bp之以鹼基對為單位之尺寸。先前報導(Lo等人《科學轉化醫學》 2010;2:61ra91)之在166 bp下具有最主峰且10 bp週期性出現於小於166 bp之胎兒分子及母體分子兩者中之特徵特點亦可使用本揭示案之新型方法再現。此等結果表明,藉由計數自本揭示案之單分子定序之鹼基數目測定分子尺寸為可靠的。
B. 尺寸及甲基化分析
長游離母體及胎兒DNA分子之甲基化程度經分析。發現胎兒DNA分子之甲基化程度低於母體DNA分子之甲基化程度。
在PacBio SMRT定序中,DNA聚合酶介導互補股中併入經螢光標記之核苷酸。在DNA合成期間產生之螢光脈衝之包含脈衝間持續時間及脈衝寬度之特徵將反映聚合酶動力學,該聚合酶動力學可用於使用吾等先前揭示案(2020年8月17日申請之名為「《核酸之鹼基修飾確定(DETERMINATION OF BASE MODIFICATIONS OF NUCLEIC ACIDS)》」之美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑確定例如但不限於5-甲基胞嘧啶的核苷酸修飾,該案之全部內容出於所有目的以引用之方式併入本文中。
在實施例中,吾等分別識別出95,210個攜載母體特異性等位基因之片段及2,652個攜載胎兒特異性等位基因之片段。母體特異性等位基因在本文中經定義為可自其中母親為異型接合的且胎兒為同型接合的SNP識別之存在於母體基因體中但不存在於胎兒基因體中之彼等等位基因。在此實例中,吾等識別出總計677,375種該等資訊性SNP。吾等測定各游離DNA分子之尺寸。在一個實施例中,當基因體中之甲基化狀態可變,例如CpG島之甲基化程度一般低於不具有CpG島之區之甲基化程度,以將由基因體情形引入之可變性降至最低時,吾人可電腦模擬來選擇大於1 kb、含有至少5個CpG位點且對應於小於5%之CpG密度(亦即分子中之CpG位點數目除以彼分子之總長度< 0.05)的片段以用於下游分析。
圖 8顯示攜載母體特異性等位基因之片段與攜載胎兒特異性等位基因之片段之間的單分子雙股DNA甲基化程度。y軸顯示以百分比為單位之單分子雙股DNA甲基化程度。x軸顯示攜載母體特異性等位基因之片段及攜載胎兒特異性等位基因之片段兩者。攜載胎兒特異性等位基因之片段之單分子雙股DNA甲基化程度(平均值:62.7%;四分位數範圍IQR:50.0%-77.2%)低於攜載母體特異性等位基因之片段的對應單分子雙股DNA甲基化程度(平均值:72.7%;IQR:60.6%-83.3%)(
P< 0.0001)。
圖 9A顯示藉由於R套裝(r-project.org/)中實施之核密度估計擬合之片段的單分子雙股DNA甲基化程度的經驗分佈。頻率示於y軸上。x軸顯示以百分比為單位之單分子雙股DNA甲基化程度。胎兒特異性長DNA片段之分佈係在母體特異性片段之分佈的左側中,表明較低單分子雙股DNA甲基化程度存在於胎兒DNA分子中。
圖 9B顯示使用單分子雙股DNA甲基化程度進行之接收者操作特徵(ROC)分析。y軸顯示靈敏度。x軸顯示特異性。使用單分子雙股DNA甲基化程度執行ROC分析以使用單分子雙股DNA甲基化程度研究區分胎兒DNA片段與母體DNA片段的動力,發現ROC曲線下面積(AUC)為0.62,大於0.5之隨機猜測結果。在實施例中,吾人可在單分子中利用甲基化狀態之空間模式(諸如甲基化狀態之序列)、經修飾鹼基與基因體座標之間的相對或絕對距離以進一步改善血漿中之片段的胎兒/母體起源確定。在實施例中,吾人可組合甲基化模式與其他片段化體學度量(fragmentomic metric)(亦即關於DNA片段化之參數),該等片段化體學度量包含但不限於偏好末端(Chan等人《美國國家科學院院刊》2016;113:E8159-8168)、末端模體(Serpas等人《美國國家科學院院刊》2019;116:641-649)、尺寸(Lo等人《科學轉化醫學》2010;2:61ra)、取向感知(亦即關於基因體內之特定元件,例如開放染色質區、片段化模式之取向(Sun等人《基因體研究(Genomes Res.)》 2019;29:418-427))、拓樸形式(例如線性對環形DNA分子(Ma等人《臨床化學》2019;65:1161-1170)),從而改善區分胎盤起源(胎兒起源)之片段的分類動力。
圖 10A及
圖 10B顯示根據片段尺寸變化之胎兒DNA片段及母體DNA片段兩者之單分子雙股DNA甲基化程度。y軸顯示以百分比為單位之單分子雙股DNA甲基化程度。x軸顯示0 kb至大於20 kb之尺寸(圖10A)及0 kb至大於1 kb之尺寸(圖10B)。另一方面,在長範圍(圖10A)及短範圍(圖10B)兩者內,胎兒特異性DNA分子之單分子雙股DNA甲基化程度一般低於母體特異性DNA分子之單分子雙股DNA甲基化程度。對於短DNA分子,此發現與孕婦血漿中胎兒DNA之甲基化程度低於母體DNA之甲基化程度的現行認識一致(Lun等人, 《臨床化學》2013;59:1583-94)。
在實施例中,因為胎兒DNA分子之甲基化程度相對地低於母體DNA分子之甲基化程度,故吾人將選擇單分子雙股DNA甲基化程度小於諸如但不限於80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%及5%之特定臨限值的分子,以在血漿DNA池中富集胎兒起源之游離DNA分子。舉例而言,對於> 1 kb之片段,胎兒DNA分率為2.6%。若吾等選擇單分子雙股甲基化程度< 50%之片段(> 1 kb),則彼等經進一步選擇之> 1 kb之片段的胎兒DNA分率將增加至5.6%(亦即115.4%增加)。在另一實例中,對於< 200 bp之片段,胎兒DNA分率為26.2%。若吾等選擇單分子雙股甲基化程度< 50%之片段(< 200 bp),則彼等經進一步選擇之> 200 bp之片段的胎兒DNA分率將增加至41.6%(亦即58.8%)。因此,在某些情形下,臨限單分子雙股DNA甲基化程度用於富集胎兒DNA之用途將對長DNA分子更有效。
C. 單倍型及長游離DNA甲基化
在實施例中,吾人可使用本揭示案中所描述之方法獲得各單個DNA分子之鹼基組成、尺寸及鹼基修飾。長游離DNA分子之SNP及甲基化資訊可用於單倍型分析。存在於本揭示案中披露之游離DNA池中之長DNA分子之使用將允許藉由根據但不限於公佈方法,利用存在於各共同序列中之單倍型資訊來定相基因體中的變異體(Edge等人《基因體研究》2017;27:801-812;Wenger等人《自然-生物技術(Nat Biotechnol.)》 2019;37:1155-1162)。根據游離DNA之序列資訊確定單倍型之實施方案與必須依賴於由組織DNA製備之長DNA的先前研究不同。基因體區內之單倍型有時可稱為單倍型區塊。單倍型區塊可視為染色體上已經定相之一組等位基因。在一些實施例中,根據支持在染色體上以物理方式連接之兩個等位基因之一組序列資訊以及不同序列之間的等位基因重疊資訊,單倍型區塊將儘可能長地延伸。
圖 11A及
圖 11B顯示孕婦母體血漿DNA中之經識別之長胎兒特異性DNA分子的實例。在彼等胎兒特異性DNA片段當中,吾等特此說明吾等發明之實施例使用一個與人類參考基因體之染色體10(chr10: 56282981-56299166)中之區排比(
圖 11A)且攜載7個胎兒特異性等位基因(
圖 11B)的16,186 bp分子。7個胎兒特異性等位基因中有6個與自母體及胎兒基因體之深度定序(使用Illumina平台)推斷之等位基因資訊一致的胎兒特異性等位基因(圖11B)。根據本揭示案中所描述之方法,其甲基化程度經測定為27.1%(圖11B),比母體特異性片段之平均程度(72.7%)低得多。此等結果表明,單分子雙股DNA甲基化模式將充當區分胎兒與母體起源之游離DNA分子的標記物。
圖 12A及
圖 12B顯示孕婦母體血漿DNA中之經識別之攜載共有等位基因之長母體DNA分子的實例。在彼等攜載共有等位基因之片段當中,與人類參考物之染色體6(chr6: 111074371-111098536)中之區排比(
圖 12A)且攜載18個共有等位基因(圖12B)之最長片段為24,166 bp。所有彼等共有等位基因皆與自母體及胎兒基因體之深度定序(使用Illumina平台)推斷之等位基因資訊一致(
圖 12B)。根據本揭示案中所描述之方法,其甲基化程度經測定為66.9%(圖12B)。長度約為千鹼基之游離DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊不能夠易於藉由使用諸如亞硫酸氫鹽定序(Illumina)之短讀段定序加以識別。
此處,吾等描述用於確定分子來源於孕婦或胎兒之相對可能性之方法。在孕婦中,攜載胎兒基因型之DNA分子實際上來源於胎盤,而大部分攜載母體基因型之DNA分子來源於母體血球。在此方法中,吾等首先根據針對胎盤及母體血球兩者之DNA分子之甲基化程度構建DNA分子的頻率分佈曲線。為了達成此舉,吾等將人類基因體分配至不同尺寸化位元子中。
圖 13顯示根據甲基化程度在1 kb至20 kb之不同解析度下之來自胎盤之DNA(紅色)及來自母體血球之DNA(藍色)的頻率分佈。頻率示於y軸上。甲基化程度示於x軸上。位元子尺寸之實例包含但不限於1 kb、2 kb、5 kb、10 kb、15 kb及20 kb。各位元子之甲基化程度係基於甲基化CpG位點數目除以CpG位點總數來測定。在測定所有位元子之甲基化程度之後,可針對不同位元子尺寸構建胎盤基因體及母體血球基因體中之各者的頻率分佈曲線。
基於長DNA分子之甲基化程度,其來源於胎盤或母體血球之可能性可藉由在此類甲基化程度下之兩種類型之DNA分子的相對豐度以及樣本中之胎兒DNA的分率濃度確定。
使
x及
y分別為在特定甲基化程度下之來源於胎盤及母體血球之DNA分子的頻率,且
f為樣本中之胎兒DNA的分率濃度。
DNA分子來源於胎兒之機率(
P)可經計算為:
根據前一實例,考慮16 kb及27.1%甲基化程度之血漿DNA分子。
圖 14A及
圖 14B顯示根據甲基化程度在16 kb(圖14A)及24 kb(圖14B)窗口內之來自胎盤之DNA(紅色)及來自母體血球之DNA(藍色)的頻率分佈。頻率示於y軸上。甲基化程度示於x軸上。基於16 kb片段之頻率分佈圖(
圖 14A),來源於胎盤及母體血球之DNA分子之頻率分別為0.6%及0.08%。當胎兒DNA分率為21.8%時,此DNA片段來源於胎盤之機率為64%,表明胎盤起源之可能性增加。
亦可計算24 kb及66.9%甲基化程度之血漿DNA分子的DNA分子來源於胎兒組織之機率。基於24 kb片段之頻率分佈圖,來源於胎盤及母體血球之DNA分子之頻率分別為0.05%及0.16%(
圖 14B)。此DNA片段來源於胎盤之機率為0.8%,表明其係胎盤起源為極不可能的。換言之,存在分子係母體起源之高可能性。
此計算可進一步藉由提及胎兒DNA及母體DNA之尺寸分佈曲線來考慮DNA分子之尺寸。該分析可例如但不限於使用貝氏定理(Bayes's theorem)、邏輯回歸、多元回歸及支持向量機、隨機森林分析、分類及回歸樹(CART)、K最近相鄰演算法來執行。
圖 15A及
圖 15B顯示與人類參考物之染色體8(chr8: 108694010-108712904)中之區(圖15A)排比且攜載7個母體特異性等位基因(圖15B)的血漿中之長DNA片段的尺寸為18,896 bp。所有彼等母體特異性等位基因皆與自母體及胎兒基因體之深度定序(Illumina技術)推斷之等位基因資訊一致(圖15B)。根據本揭示案中所描述之方法,其甲基化程度經測定為72.6%(圖15B),顯示與母體特異性片段之綜合甲基化程度(72.7%)相當。因此,此類分子將更可能歸類為母體起源之片段。長度約為千鹼基之游離DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊不能夠易於藉由使用諸如亞硫酸氫鹽定序(Illumina)之短讀段定序加以識別。
使用上文所描述之方法可計算此分子來源於胎盤之機率。基於19 kb片段之頻率分佈圖,來源於胎盤及母體血球之DNA分子之頻率分別為0.65%及0.23%。此DNA片段來源於胎盤之機率為43%,表明其係母體起源之可能性增加。
D. 臨床單倍型分析應用
在實施例中,分析孕婦血漿DNA中之短DNA分子及長DNA分子兩者之能力將允許吾等進行相對單倍型劑量(RHDO)分析(Lo等人《科學轉化醫學》2010;2:61ra91;Hui等人《臨床化學》 2017;63:513-524)且不要求先前獲自組織之父體或母體或胎兒基因型資訊。此能力將比先前可能的更具成本效益且臨床上適用。
圖 16繪示此關於吾人可如何使用孕婦體內之游離DNA進行RHDO分析之原理。自孕婦分離游離DNA且使其在階段1605經受SMRT定序。包含長DNA分子及短DNA分子之各分子之尺寸、等位基因資訊及甲基化狀態可根據本揭示案中所描述之方法加以測定。在階段1610,根據尺寸資訊,吾人可將經定序分子劃分成兩個類別,亦即長DNA分子及短DNA分子。用於確定長DNA類別及短DNA類別之截止值可包含但不限於150 bp、180 bp、200 bp、250 bp、300 bp、350 bp、400 bp、450 bp、500 bp、550 bp、600 bp、650 bp、700 bp、750 bp、800 bp、850 bp、900 bp、950 bp、1 kb、1.1 kb、1.2 kb、1.3 kb、1.4 kb、1.5 kb、1.6 kb、1.7 kb、1.8 kb、1.9 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、15 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、200 kb、300 kb、400 kb、500 kb或1 Mb。在實施例中,在階段1615,存在於長DNA分子中之等位基因資訊可用於構築母體單倍型,亦即Hap I及Hap II。短DNA分子可根據等位基因資訊與母體單倍型進行排比。因此,源自母體Hap I及Hap II之游離DNA分子(例如短DNA)數目可經測定。
在階段1620,單倍型之不平衡可經分析。不平衡可為分子計數、分子尺寸或分子甲基化狀態。在階段1625,可推斷胎兒之母體遺傳。若母體血漿DNA中之Hap I之劑量經過度呈現,則胎兒將可能遺傳母體Hap I。否則,胎兒將可能遺傳母體Hap II。包含但不限於逐次機率比檢定(SPRT)、二項式檢定、卡方檢定(Chi-squared test)、司徒頓t字檢定(Student's t-test)、非參數檢定(例如威爾卡森檢定(Wilcoxon test))及隱藏馬可夫模型(hidden Markov model)之不同統計途徑將用於確定哪個母體單倍型經過度呈現。
在實施例中,除計數分析之外,短DNA分子之甲基化及尺寸亦經測定且經指派至母體單倍型。兩個單倍型(亦即Hap I及Hap II)之間的甲基化不平衡可用於確定胎兒遺傳之母體單倍型。若胎兒已遺傳Hap I,則相較於攜載Hap II之等位基因的片段而言,在母體血漿中存在更多攜載Hap I之等位基因的片段。來源於胎兒之DNA片段的低甲基化會使Hap I之甲基化程度低於Hap II之甲基化程度。換言之,若Hap I之甲基化顯示低於Hap II之甲基化程度,則胎兒將更可能遺傳母體Hap I。否則,胎兒將更可能遺傳母體Hap II。在另一實施例中,個別片段來源於胎兒或母親之機率可如上文所描述加以計算。對於所有與Hap I排比之片段,此等片段來源於胎兒之集合機率可基於貝氏定理加以測定。類似地,此等片段來源於胎兒之集合機率可針對Hap II加以計算。隨後,胎兒遺傳Hap I或Hap II之可能性可基於兩個集合機率加以推斷。
在實施例中,兩個單倍型(亦即Hap I及Hap II)之間的尺寸延長或縮短可用於確定胎兒遺傳之母體單倍型。若胎兒已遺傳Hap I,則相較於攜載Hap II之等位基因的片段而言,在母體血漿中存在更多攜載Hap I之等位基因的片段。來源於胎兒之DNA片段將相對地短於來源於Hap II之DNA片段。換言之,若源自Hap I之分子含有比Hap II更多之短DNA,則胎兒將更可能遺傳母體Hap I。否則,胎兒將更可能遺傳母體Hap II。
在一些實施例中,吾人可執行母體Hap I與Hap II之間的計數、尺寸及甲基化合併分析以推斷胎兒的母體遺傳。舉例而言,吾人可使用邏輯回歸以組合包含計數、尺寸及甲基化狀態之彼等三個度量。
在臨床實踐中,關於計數、尺寸及甲基化狀態之基於單倍型之分析將允許判定未出生胎兒是否已遺傳與遺傳病症相關之母體單倍型,該等遺傳病症例如但不限於包含X染色體脆裂症、肌肉萎縮症、亨汀頓氏舞蹈症(Huntington disease)或β-地中海型貧血之單基因病症。本揭示案中單獨地描述涉及長游離讀段中之DNA序列之重複序列的病症偵測。
E. 長游離DNA分子之靶向定序
本揭示案中所描述之方法亦可應用於分析一或多個經選擇之長DNA片段。在實施例中,所關注之一或多個長DNA片段可首先藉由雜交方法進行富集,該雜交方法允許來自所關注之一或多個區之DNA分子與具有互補序列之合成寡核苷酸雜交。為了使用本揭示案中所描述之方法將所有尺寸、遺傳及表觀遺傳資訊解碼成一個,目標DNA分子在經受定序之前較佳不藉由PCR擴增,此係因為原始DNA分子中之鹼基修飾資訊將不轉移至PCR產物。
已研發出數種用於在不執行PCR擴增之情況下富集此等目標區域之方法。在另一實施例中,一或多個目標長DNA分子可經由使用集群規律間隔短回文重複序列(CRISPR)-CRISPR相關蛋白9(Cas9)系統加以富集(Stevens等人《公共科學圖書館·綜合(PLOS One)》2019;14(4):e0215441;Watson等人《實驗室研究(Lab Invest)》 2020;100:135-146)。即使該等CRISPR-Cas9介導之切割將更改原始長DNA分子之尺寸,其遺傳及表觀遺傳資訊仍得以保存且能夠使用本揭示案中所描述之方法獲得,包含但不限於鹼基含量、單倍型(亦即相)資訊、重新突變、鹼基修飾(例如4mC(N4-甲基胞嘧啶)、5hmC(5-羥甲基胞嘧啶)、5fC(5-甲醯基胞嘧啶)、5caC(5-羧基胞嘧啶)、1mA(N1-甲基腺嘌呤)、3mA(N3-甲基腺嘌呤)、7mA(N7-甲基腺嘌呤)、3mC(N3-甲基胞嘧啶)、2mG(N2-甲基鳥嘌呤)、6mG(O6-甲基鳥嘌呤)、7mG(N7-甲基鳥嘌呤)、3mT(N3-甲基胸腺嘧啶)、4mT(O4-甲基胸腺嘧啶)及8oxoG(8-側氧基鳥嘌呤)。在實施例中,首先將DNA樣本中之DNA分子之末端去磷酸化,以使其不易直接接合至定序轉接子。隨後,Cas9蛋白與引導RNA(crRNA)導向所關注之長DNA分子以產生雙股切割。接著,將藉由在兩側上進行雙股切割側接之所關注之長DNA分子接合至所選定序平台規定的定序轉接子。在另一實施例中,可用核酸外切酶處理DNA,以使Cas9蛋白未結合之DNA分子降解(Stevens等人《公共科學圖書館·綜合》2019;14(4):e0215441)。由於此等方法不涉及PCR擴增,故可對具有鹼基修飾之原始DNA分子進行定序,且確定鹼基修飾。
在實施例中,此等方法可用於藉由參考諸如人類參考基因體(hg19)之參考基因體設計引導RNA,例如長散佈核元件(LINE)重複序列來靶向大量共有同源序列之長DNA分子。在一個實例中,此類分析可用於分析母體血漿中之循環游離DNA,以偵測胎兒非整倍體(Kinde等人《公共科學圖書館·綜合》2012;7(7):e41162)。在實施例中,經去活化或『死』Cas9(dCas9)及其相關單引導RNA(sgRNA)可用於在不切割雙股DNA分子之情況下富集經靶向長DNA。舉例而言,sgRNA之3'端可經設計以攜帶額外通用短序列。吾人可使用與彼通用短序列互補之經生物素標記之單股寡核苷酸以捕獲dCas9所結合的彼等經靶向長DNA分子。在另一實施例中,吾人可使用經生物素標記之dCas9蛋白或sgRNA或兩者以促進富集。
在實施例中,吾人可執行尺寸選擇以在對所關注之一或多個特定基因體區無限制之情況下使用包含但不限於化學方法、物理方法、酶方法、基於凝膠之方法及基於磁珠之方法或合併遠不止該等途徑的方法的途徑富集長DNA片段。在其他實施例中,免疫沈澱可用於富集具有特定甲基化概況之DNA片段,諸如藉由使用抗甲基胞嘧啶抗體及甲基結合蛋白加以介導。經結合或捕獲DNA之甲基化概況可使用非甲基化感知定序來確定。
F. 基於長血漿DNA分子之胎兒遺傳分析之一般概念
圖 17繪示具有母體及胎兒起源之資訊之血漿DNA分子中之遺傳/表觀遺傳病症的確定。孕婦體內之長血漿DNA分子可根據該分子整體或部分[亦即區(a)]中之CpG位點之遺傳及/或表觀遺傳概況經確定係胎兒或母體起源。遺傳資訊可為但不限於序列資訊、單核苷酸多型性、插入、缺失、串聯重複序列、衛星DNA、微衛星、小衛星、反轉等。表觀遺傳資訊可為一或多個CpG位點之甲基化狀態以及其在血漿DNA分子中之相對次序。在另一實施例中,表觀遺傳資訊可為A、C、G或T中任一者之修飾。具有組織起源資訊之長血漿DNA可用於藉由確定此類長血漿DNA分子[亦即區(b)]中之遺傳及/或表觀遺傳病症之存在進行非侵入性產前測試。
圖 18繪示胎兒異常片段之識別。作為一實例,基於本揭示案之區(a)之甲基化模式識別長DNA片段係胎兒起源。吾人可基於此類胎兒起源之分子確定胎兒受遺傳或表觀遺傳病症影響之可能性。遺傳病症可涉及單核苷酸變異體、插入、缺失、串聯重複序列、衛星DNA、微衛星、小衛星、反轉等。遺傳病症之實例包含但不限於:β-地中海型貧血、α-地中海型貧血、鐮狀細胞性貧血、囊腫纖維化、性聯遺傳病症(例如血友病、杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy))、脊髓性肌肉萎縮症、先天性腎上腺增生等。表觀遺傳病症可例如甲基化增加(亦即高甲基化)或損失(低甲基化)之異常DNA甲基化程度。表觀遺傳病症之實例包含但不限於X染色體脆裂症、安裘曼氏症候群(Angelman's syndrome)、普-威二氏症候群(Prader-Willi syndrome)、面肩臂肌肉萎縮症(FSHD)、免疫缺乏症、著絲粒不穩定性及臉部異常(ICF)症候群等。可發現遺傳或表觀遺傳病症存在於區(b)中。
G. 改善定序準確度
定序準確度可用長游離DNA片段之序列讀段加以改善。在圖11B中,在長胎兒特異性DNA分子中之7個等位基因當中,有1個似乎在PacBio與Illumina定序之間不一致之等位基因。
圖 19A-19G顯示使用PacBio定序進行之游離DNA基因分型之誤差校正圖示。吾等目測到圖11B之彼等7個位點之子讀段排比結果。第1列指示基因體座標;第2列為參考序列。第3列及後續列指示經排比子讀段。舉例而言,在圖19A中,存在8個穿過彼區之子讀段。『.』表示與沃森股中之參考鹼基相同。『,』表示與克里克股中之參考鹼基相同。『字母』表示替代性等位基因。『*』表示插入及/或缺失。吾人可看到,圖19F中所示之不一致位點主鹼基在共同序列中稱為『T』。然而,在9個於彼位點中之子讀段當中(圖19F),9個子讀段中僅有5個(亦即56%主等位基因分率(MAF))經確定為『T』,而其他子讀段經確定為『C』。此位點之主等位基因分率(圖19F)低於其他位點之主等位基因分率(圖19A-E及圖19G)(MAF範圍:67%-89%)。因此,若吾人例如使用至少60%之MAF設定用於確定共同序列中之各位點之鹼基組成的嚴格準則,則此誤差位點將經排除在下游解譯之外。另一方面,此類錯誤位點碰巧落入同聚物(亦即一系列連續相同鹼基『TTTTTTT』)內。在實施例中,吾人可設定使得同聚物內之變異體經旗標為QC失敗且暫時不用於下游分析的準則。在實施例中,吾人可應用不同定位品質及鹼基品質以校正或過濾低品質鹼基或子讀段來改善鹼基組成分析。
在奈米孔定序之定序準確度經進一步改善之情況下,本發明之實施例亦可與此類經改善之定序平台一起使用且藉此產生經改善之準確度。
H. 實例方法
來自獲自孕婦之具有游離DNA片段之生物樣本的長游離DNA片段可經定序。此等長游離DNA片段可用於確定胎兒之單倍型遺傳。
1. 定序長游離DNA片段
圖 20顯示分析懷孕生物之生物樣本之方法2000。生物樣本可包含複數個游離核酸分子。生物樣本可為本文所描述之任何生物樣本。大於20%之生物樣本中之游離核酸分子的尺寸大於200 nt(核苷酸)。
在區塊2010處,定序複數個游離核酸分子。定序可藉由單分子即時技術進行。在一些實施例中,定序可藉由使用奈米孔進行。
大於20%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於200 nt的長度。在一些實施例中,15%-20%、20%-25%、25%-30%、30%-35%或超過35%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於200 nt的長度。
在一些實施例中,大於11%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於400 nt的長度。在實施例中,5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於400 nt的長度。
在一些實施例中,大於10%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於500 nt的長度。在實施例中,5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於500 nt的長度。
在實施例中,大於8%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於600 nt的長度。在實施例中,5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於600 nt的長度。
在一些實施例中,大於6%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於1 knt的長度。在實施例中,3%-5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於1 knt的長度。
在實施例中,大於3%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於2 knt的長度。在實施例中,1%-5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於2 knt的長度。
在實施例中,大於1%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於3 knt的長度。在實施例中,1%-5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%、20%-25%或超過25%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於3 knt的長度。
在一些實施例中,至少0.9%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於4 knt的長度。在實施例中,0.5%-1%、1%-5%、5%-10%、10%-15%、15%-20%或超過20%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於4 knt的長度。
在一些實施例中,至少0.04%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於10 knt的長度。在實施例中,0.01%至0.1%、0.1%至0.5%、0.5%-1%、1%-5%、5%-10%、10%-15%或超過15%之經定序之複數個游離核酸分子可具有大於4 knt的長度。
複數個游離核酸分子可包含至少10、50、100、150或200個游離核酸分子。複數個游離核酸分子可來自複數個不同基因體區。舉例而言,複數個染色體臂或染色體可由游離核酸分子涵蓋。複數個游離核酸分子中之至少兩個可對應於非重疊區。
定序長游離DNA片段之方法可藉由本文所描述之任何方法使用。來自定序之讀段可用於確定胎兒非整倍體、畸變(例如複本數畸變)、遺傳(genetic)突變或變異或親本單倍型遺傳(inheritance)。序列讀段之量可表示游離DNA片段之量。
2. 單倍型遺傳
圖 21顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法2100。女性可在第一染色體區中具有第一單倍型及第二單倍型。生物樣本可包含來自胎兒及女性之複數個游離DNA分子。生物樣本可為本文所描述之任何生物樣本。
在區塊2105處,可接收對應於複數個游離DNA分子之讀段。讀段可為序列讀段。在一些實施例中,該方法可包含執行定序。
在區塊2110處,可量測複數個游離DNA分子之尺寸。尺寸可藉由將對應於DNA分子之末端之一或多個序列讀段與參考基因體進行排比來量測。尺寸可藉由對DNA分子進行全長定序且隨後計數全長序列中之核苷酸數目來量測。最外面核苷酸處之基因體座標可用於測定DNA分子之長度。
在區塊2115處,可識別來自複數個游離DNA分子之第一組游離DNA分子為具有大於或等於截止值之尺寸。截止值可為與長DNA相關之任何截止值。舉例而言,截止值可包含150 bp、180 bp、200 bp、250 bp、300 bp、350 bp、400 bp、450 bp、500 bp、550 bp、600 bp、650 bp、700 bp、750 bp、800 bp、850 bp、900 bp、950 bp、1 kb、1.5 kb、2 kb、2.5 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb、7 kb、8 kb、9 kb、10 kb、15 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、60 kb、70 kb、80 kb、90 kb、100 kb、200 kb、300 kb、400 kb、500 kb或1 Mb。
在區塊2120處,可自對應於第一組游離DNA分子之讀段確定第一單倍型之序列及第二單倍型之序列。確定第一單倍型之序列及第二單倍型之序列可包含將對應於第一組游離DNA分子之讀段與參考基因體進行排比。
在一些實施例中,確定第一單倍型之序列及第二單倍型之序列可不包含參考基因體。確定序列可包含將讀段之第一子組與讀段之第二子組進行排比以識別讀段中之基因座處的不同等位基因。該方法可包含確定讀段之第一子組在基因座處具有第一等位基因。該方法亦可包含確定讀段之第二子組在基因座處具有第二等位基因。該方法可進一步包含確定讀段之第一子組對應於第一單倍型。另外,該方法可包含確定讀段之第二子組對應於第二單倍型。該排比可與用圖16描述之排比類似。
在區塊2125處,可將來自複數個游離DNA分子之第二組游離DNA分子與第一單倍型之序列進行排比。第二組游離DNA分子可具有小於截止值之尺寸。第二組游離DNA分子可為第一單倍型之短DNA分子。
在區塊2130處,可將來自複數個游離DNA分子之第三組游離DNA分子與第二單倍型之序列進行排比。第三組游離DNA分子可具有小於截止值之尺寸。第三組游離DNA分子可為第二單倍型之短DNA分子。
在區塊2135處,可使用第二組游離DNA分子量測參數之第一值。參數可為游離DNA分子之計數、游離DNA分子之尺寸概況或游離DNA分子之甲基化程度。值可為原始值或統計值(例如平均值、中值、眾數、百分位數、最小值、最大值)。在一些實施例中,值可經標準化至參考樣本、另一區、兩個單倍型或其他尺寸範圍之參數之值。
在區塊2140處,可使用第三組游離DNA分子量測參數之第二值。該參數為與第二組游離DNA分子之參數相同之參數。
在區塊2145處,可將第一值與第二值進行比較。比較可使用分離值。可使用第一值及第二值計算分離值。可將分離值與截止值進行比較。分離值可為本文所描述之任何分離值。截止值可自來自懷有整倍體胎兒之懷孕女性之參考樣本確定。在其他實施例中,截止值可自來自懷有非整倍體胎兒之懷孕女性之參考樣本確定。在一些實施例中,假定為非整倍體胎兒,可確定截止值。舉例而言,來自懷有整倍體胎兒之懷孕女性之參考樣本之數據可經調整以解釋非整倍體之染色體區的複本數增加或減少。截止值可由調整數據來確定。
在2150處,可基於第一值與第二值之比較確定胎兒遺傳第一單倍型之可能性。可基於分離值與截止值之比較確定該可能性。當參數為游離DNA分子之尺寸概況時,該方法可包含當第一值小於第二值時,確定胎兒具有比遺傳第二單倍型高之遺傳第一單倍型之可能性,指示第二組游離DNA分子之特徵在於比第三組游離DNA分子小的尺寸概況。當參數為游離DNA分子之甲基化程度時,該方法可包含當第一值小於第二值時,確定胎兒具有比遺傳第二單倍型高之遺傳第一單倍型之可能性。
在一些實施例中,方法可包含識別對應於第一組游離DNA分子之該等讀段中之一讀段中的子序列的重複序列的數目。確定第一單倍型之序列可包含確定序列包含子序列之重複序列的數目。第一單倍型可包含重複序列相關疾病,該重複序列相關疾病可為本文所描述之任何重複序列相關疾病。胎兒遺傳重複序列相關疾病之可能性可經確定。胎兒遺傳重複序列相關疾病之可能性可與胎兒遺傳第一單倍型之可能性相當或類似。識別序列之重複序列之後描述於本揭示案中,包含用圖16加以描述。
II. 使用甲基化分析起源組織
長游離DNA分子可具有數個甲基化位點。如本揭示案中所論述,孕婦體內之長游離DNA分子之甲基化程度可用於確定起源組織。另外,存在於長游離DNA分子上之甲基化模式可用於確定起源組織。
與白血球及來自例如但不限於肝、肺、食道、心臟、胰臟、結腸、小腸、脂肪組織、腎上腺、腦等之組織的細胞相比,來自胎盤組織之細胞具有獨特甲基化體學模式(methylomic pattern)(Sun等人《美國國家科學院院刊》2015;112:E5503-12)。懷孕母親血液中之循環胎兒DNA之甲基化概況可相似於胎盤中之循環胎兒DNA之甲基化概況,因此提供探索用於產生不視胎兒性別或基因型而定之非侵入性胎兒特異性生物標記物之手段的可能性。然而,孕婦之母體血漿DNA之亞硫酸氫鹽定序(例如使用Illumina定序平台)可能由於以下多個限制而缺乏區分胎兒起源之分子與母體起源之分子的能力:(1)血漿DNA可在亞硫酸氫鹽處理期間經降解,且長DNA分子通常將斷裂成較短分子;(2)大於500 bp之DNA分子可能不會經Illumina定序平台有效地定序用於下游分析(Tan等人《科學報告(Sci Rep.)》2019;9:2856)。
對於基於甲基化之關於起源組織之分析,吾人可聚焦於幾個差異甲基化區(DMR)且使用來自與DMR相關之多個分子之集合甲基化信號(Sun等人《美國國家科學院院刊》2015;112:E5503-12)代替單分子甲基化模式。多項研究嘗試使用基於甲基化敏感限制酶之途徑(Chan等人《臨床化學》2006;52:2211-8)或基於甲基化特異性PCR之途徑(Lo等人《美國人類遺傳學期刊(Am J Hum Genet.)》1998;62:768-75)以評估胎盤對血漿DNA池之貢獻。然而,彼等研究僅適合於分析一個或幾個標記物且可能對用於在全基因體尺度上分析分子具挑戰性。然而,彼等讀段係自經擴增信號(亦即於流量槽中之在DNA文庫製備期間的基於PCR之擴增及在定序集群生成期間的橋式擴增)推斷而來。該等擴增步驟可潛在地引起偏好短DNA分子,導致與長DNA分子相關之資訊損失。此外,Li等人僅分析與先前經開發之DMR相關之彼等讀段(Li等人, 《核酸研究(Nuclei Acids Res.)》2018;46:e89)。
在本揭示案中,吾等描述用於基於單個DNA分子之甲基化模式在無亞硫酸氫鹽處理及DNA擴增之情況下區分孕婦血漿中之胎兒DNA分子與母體DNA分子的新途徑。在實施例中,一或多個長血漿DNA分子將用於分析(例如使用生物資訊學及/或針對尺寸選擇之實驗分析進行)。長DNA分子可定義為尺寸為至少但不限於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、100 kb、200 kb等之DNA分子。存在少量關於母體血漿中之較長游離DNA分子之存在及甲基化狀態的數據。舉例而言,尚不知曉該等較長游離DNA分子之甲基化狀態是否將反映起源組織之細胞DNA之甲基化狀態,例如因此長片段具有更多在於身體中發生片段化之後甲基化狀態可能會改變的位點;當片段在血漿中循環時,此類改變可能會發生。舉例而言,研究已顯示,循環DNA之甲基化狀態與DNA片段之尺寸相關(Lun等人《臨床化學》2013;59:1583-94)。因此,自該等較長游離DNA分子推斷起源組織之可行性為未知的。因此,為了識別組織相關甲基化記號所採取之途徑及為了確定且解釋該等組織特異性較長游離DNA分子之存在所採取之方法實質上與應用於短游離DNA分析之途徑及方法不同。
根據本揭示案之實施例,吾人可識別短DNA分子及長DNA分子且確定其包含但不限於甲基化模式、片段末端、尺寸及鹼基組成之生物學特徵。短DNA分子可定義為尺寸小於但不限於50 bp、60 bp、70 bp、80 bp、90 bp、100 bp、200 bp、300 bp等之DNA分子。短DNA分子可為不在視為長之範圍內的DNA分子。吾等描述用於推斷孕婦血漿中之循環DNA分子之起源組織的新途徑。此新途徑在血漿中之一或多個長DNA分子上利用甲基化模式。DNA分子愈長,其可能含有之CpG位點數目愈多。多個CpG位點在血漿DNA分子上之存在將提供起源組織資訊,即使任何單個CpG位點之甲基化狀態可能不會為確定起源組織提供資訊。長DNA分子中之該等甲基化模式可包含各CpG位點之甲基化狀態、甲基化狀態之次序及任何兩個CpG位點之間的距離。兩個CpG位點之間的甲基化狀態可視兩個CpG位點之間的距離而定。當分子中之特定距離內之CpG位點(例如CpG島)展現組織特異性模式時,統計模型可在起源組織分析期間向彼等信號指派更多權重。
圖 22示意性繪示此原理。圖22顯示DNA分子之甲基化模式。顯示用於不同組織(胎盤、肝、血球、結腸)之七個CpG位點及六個血漿DNA片段A-E。甲基化CpG位點以紅色示出,且未甲基化CpG位點以綠色示出。作為一實例,吾等考慮跨胎盤、肝、血球及結腸組織之7個具有各種甲基化狀態之CpG位點。吾等考慮以下情境:單個CpG位點不展現相較於其他組織而言對胎盤具有特異性之甲基化狀態。因此,具有可變尺寸之彼等血漿DNA分子A、B、C、D及E之起源組織可不僅基於單個CpG位點處之甲基化狀態來確定。對於血漿DNA分子A及B,因為彼兩個分子之尺寸相對地短,故分別僅含有3個及4個CpG位點。在實施例中,含有超過一個CpG位點之DNA分子中之甲基化模式可定義為甲基化單倍型。如圖22中所示,血漿DNA分子A及B可基於其甲基化單倍型由胎盤或肝貢獻,此係因為胎盤及肝在對應於分子A之彼等基因體位置(位置1、2及3)及對應於分子B之彼等基因體位置(位置1、2、3及4)中共有相同甲基化單倍型。然而,當吾人可在血漿中獲得諸如分子C、D及E之長DNA分子時,可基於甲基化單倍型明確地確定彼等分子C、D及E來源於胎盤。
組織之參考模式可基於參考組織之甲基化模式。在一些實施例中,甲基化模式可基於數個讀段及/或樣本。各CpG位點之甲基化程度(亦稱為甲基化指數MI且描述於下文中)可用於判定位點是否為甲基化的。
A. 用於甲基化模式之統計模型
在實施例中,血漿DNA分子來源於胎盤之可能性可藉由比較單個DNA分子之甲基化單倍型與多個參考組織中之甲基化模式來確定。長血漿DNA分子可對該分析有利。長DNA分子可定義為尺寸為至少但不限於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、100 kb、200 kb等之DNA分子。參考組織可包含但不限於胎盤、肝、肺、食道、心臟、胰臟、結腸、小腸、脂肪組織、腎上腺、腦、嗜中性白血球、淋巴球、嗜鹼性球、嗜酸性球等。在實施例中,吾人可藉由協同分析利用單分子即時定序確定之血漿DNA之甲基化單倍型及基於參考組織之全基因體亞硫酸氫鹽定序的甲基化體數據來確定血漿DNA分子來源於胎盤之可能性。作為一實例,使用全基因體亞硫酸氫鹽定序分別將胎盤及膚色血球層樣本定序至單倍體基因體之平均94倍及75倍基因體涵蓋度。基於經定序胞嘧啶數目(亦即甲基化,由
C 表示)及經定序胸嘧啶數目(亦即未甲基化,由
T 表示)使用下式計算各CpG位點之甲基化程度(亦稱為甲基化指數MI):
.
基於自胎盤DNA推斷之MI值將CpG位點分級成三個類別:
1. 類別
A MI值≥ 70之CpG位點。
2. 類別
B MI值在30與70之間的CpG位點。
3. 類別
C MI值為≤30之CpG位點。
類似地,使用自膚色血球層DNA推斷之CpG位點處之MI值將CpG位點分類成三個類別:
1. 類別
A MI值≥ 70之CpG位點。
2. 類別
B MI值在30與70之間的CpG位點。
3. 類別
C MI值為≤30之CpG位點。
類別使用30及70之MI截止值。截止值可包含其他數值,包含10、20、40、50、60、80或90。在一些實施例中,此等類別可用於確定參考組織之參考甲基化模式(例如用圖22加以描述供使用)。類別A位點可視為甲基化的。類別C位點可視為未甲基化的。類別B位點可視為非資訊性的且不包含於參考模式中。
對於具有
n 個CpG位點之血漿DNA分子,各CpG位點之甲基化狀態係藉由吾等先前揭示案(美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑來確定。在一些實施例中,甲基化狀態可藉由亞硫酸氫鹽定序或用奈米孔定序來確定。為了確定血漿DNA分子來源於胎盤或母體背景之可能性,結合先前胎盤及母體膚色血球層DNA中之甲基化資訊分析彼分子之甲基化模式。在實施例中,吾等利用以下原理:若血漿DNA片段中經確定為甲基化(M)之CpG位點與胎盤中之較高甲基化指數一致,則此類觀測結果將指示此分子更可能來源於胎盤。若血漿DNA分子中經確定為甲基化(M)之CpG位點與胎盤中之較低甲基化指數一致,則此類觀測結果將指示此分子不大可能來源於胎盤;若血漿DNA中經確定為未甲基化(U)之CpG位點與胎盤中之較低甲基化指數一致。則此類觀測結果將指示此分子更可能來源於胎盤。若血漿DNA中經確定為未甲基化(U)之CpG位點與胎盤中之較高甲基化指數一致,則此類觀測結果將指示此分子不大可能來源於胎盤。
吾等實施以下評分流程。反映血漿DNA片段之胎兒起源之可能性之初始分數(
S )設定為0。當比較血漿DNA分子之甲基化狀態與先前胎盤DNA之甲基化資訊時,
a 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『M』且其於胎盤中之對應物屬於類別
A ,則給
S 新增1分(亦即給分數單位增加1)。
b 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『U』且其於胎盤中之對應物屬於類別
A ,則給S扣除1分(亦即給分數單位減少1)。
c 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『M』且其於胎盤中之對應物屬於類別
B ,則給S新增0.5分。
d 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『U』且其於胎盤中之對應物屬於類別
B ,則給S新增0.5分。
e 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『M』且其於胎盤中之對應物屬於類別
C ,則給S扣除1分。
f 若血漿DNA分子上之CpG位點經確定為『U』且其於胎盤中之對應物屬於類別
C ,則給S新增1分。
吾等稱以上過程為『甲基化狀態匹配』。
在血漿DNA分子中之所有CpG位點皆經處理之後,獲得彼血漿DNA分子之最終集合分數
S (胎盤) 。在實施例中,要求CpG位點數目為至少30個且要求血漿DNA分子長度為至少3 kb。可使用CpG位點之其他數目及長度,包含但不限於本文所描述之任何數目及長度。
當比較血漿DNA分子之甲基化狀態與對應位點處之膚色血球層DNA之甲基化程度時,將應用類似評分流程。在血漿DNA分子中之所有CpG位點皆經處理之後,獲得彼血漿DNA分子之最終集合分數
S (膚色血球層) 。
若
S (胎盤) >
S (膚色血球層) ,則確定血漿DNA分子係胎兒起源;否則,確定血漿DNA分子係母體起源。
存在用於評估推斷血漿DNA分子之胎兒-母體起源之效能的17個胎兒特異性DNA分子及405個母體特異性DNA分子。胎兒特異性分子為攜載胎兒特異性SNP等位基因之血漿DNA分子,而母體特異性DNA分子為攜載母體特異性SNP等位基因之血漿DNA分子。
圖 23顯示用於確定胎兒起源及母體起源之接收者操作特徵曲線(ROC)。y軸顯示靈敏度,且x軸顯示特異性。紅線表示使用存在於本揭示案中之基於甲基化狀態匹配之方法區分胎兒起源與母體起源之分子的效能。藍線表示使用單分子甲基化程度(亦即DNA分子中經確定為甲基化之CpG位點的比例)區分胎兒起源與母體起源之分子的效能。圖23顯示用於甲基化狀態匹配過程之接收者操作特徵曲線下面積(AUC)(0.94)顯著地高於基於單分子甲基化程度之AUC(0.86)(
P值< 0.0001;DeLong測試)。表明長DNA分子之甲基化模式分析將可用於確定胎兒/母體起源。
在實施例中,當判定血漿DNA係胎兒起源抑或母體起源時,可考慮
S (胎盤) 與
S (膚色血球層) 之間的差幅(∆
S )。可要求
∆S 之絕對值超過例如但不限於5、10、20、30、40、50等之特定臨限值。作為說明,當吾等使用10作為
∆S 之臨限值時,胎兒DNA分子偵測中之正預測值(PPV)自14.95%提高至91.67%。
在實施例中,CpG位點之甲基化狀態將受其鄰近CpG位點之甲基化狀態影響。DNA分子上之任何兩個CpG位點之間的核苷酸距離愈接近,兩個CpG位點將愈可能共有相同甲基化狀態。此現象已稱為共甲基化。多個組織特異性CpG島甲基化已經報導;因此,在一些用於起源組織分析之統計模型中,更多權重將經指派至共有相同甲基化狀態之密集集群之CpG位點(例如CpG島)。對於情境『a』及『f』,若現行經受探尋之CpG位點相對於先前CpG位點在不超過100 bp之基因體距離內定位且此兩個連續CpG位點之甲基化狀態匹配過程的結果相同,則將給現行CpG位點之分數
S 額外新增1分。對於情境『b』及『e』,若現行經受探尋之CpG位點相對於先前CpG位點在不超過100 bp之基因體距離內定位且此兩個連續CpG位點之甲基化狀態匹配過程的結果相同,則將給現行CpG位點之分數S額外扣除1分。然而,若現行經受探尋之CpG位點相對於先前CpG位點在不超過100 bp之基因體距離內定位、但此兩個連續CpG位點之甲基化狀態匹配過程的結果不一致,則將使用前述預設評分流程。另一方面,若現行經受探尋之CpG位點相對於先前CpG位點在大於100 bp之基因體距離內定位,則將使用前述具有預設參數之評分流程。可使用除1以外之得分及除100 bp以外之距離,包含本文所描述之任何得分及距離。
在其他實施例中,基於自胎盤及膚色血球層DNA推斷之MI值將CpG位點分級成超過三個類別。先前參考組織之甲基化資訊可自單分子即時定序(亦即奈米孔定序及/或PacBio SMRT定序)推斷。可要求血漿DNA分子長度為至少但不限於100 bp、200 bp、300 bp、400 bp、500 bp、600 bp、700 bp、800 bp、900 bp、1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、10 kb、20 kb、30 kb、40 kb、50 kb、100 kb、200 kb等。可要求CpG位點數目為至少但不限於3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100等。
在實施例中,吾人可使用用於表徵血漿DNA分子之甲基化模式之機率模型。血漿DNA分子上之
k 個CpG位點(
k ≥ 1)之甲基化狀態表示為
M=(
m
1 、
m
2 、…、
m
k ),其中血漿DNA分子上之CpG位點
i 處之
m
i 為0(對於未甲基化狀態而言)或1(對於甲基化狀態而言)。在實施例中,與來源於胎盤之血漿DNA分子相關之
M 機率可視胎盤組織中之參考甲基化模式而定。用於彼等對應之
1 、 2 、 … 、 k 個CpG位點之胎盤組織中之參考甲基化模式將遵循貝他(β)分佈(beta distribution)。貝他(β)分佈係藉由以貝他(α、β)表示之兩個正參數α及β參數化。衍生自貝他(β)分佈之值的範圍將為0至1。基於所關注之組織之深度亞硫酸氫鹽定序數據,參數α及β係分別藉由彼特定組織之各CpG位點處之經定序胞嘧啶(甲基化)及胸嘧啶(未甲基化)數目確定。對於胎盤,此類貝他(β)分佈表示為貝他(α
P、β
p)。來源於胎盤之血漿DNA分子之機率P(M |胎盤)將藉由以下模型化:
其中『
i』表示第
i個CpG位點;
指示與胎盤中之第i個CpG位點處之甲基化模式相關之貝他(β)分佈;
P 為在
k 個CpG位點中具有既定甲基化模式之所觀測血漿DNA分子的聯合機率。
來源於膚色血球層(亦即白血球)之血漿DNA分子之機率P(M |膚色血球層)將藉由以下模型化:
其中『
i』表示第i個CpG位點;
指示與膚色血球層DNA中之第i個CpG位點處之甲基化模式相關之貝他(β)分佈。
P 為在
k 個CpG位點中具有既定甲基化模式之所觀測血漿DNA分子之聯合機率。
及
可分別自胎盤及膚色血球層DNA之全基因體亞硫酸氫鹽定序結果確定。
對於血漿DNA分子,若吾人觀測到P(M |胎盤)> P(M |膚色血球層),則此類血漿DNA分子將可能來源於胎盤;否則,其將可能來源於膚色血球層。吾等使用此模型達成0.79之AUC。
B. 機器學習模型
在又其他實施例中,吾人可使用用於確定特定血漿DNA分子之胎兒/母體起源之機器學習演算法。為了測試使用基於機器學習之途徑對孕婦體內之胎兒DNA分子及母體DNA分子進行分類之可行性,吾等研發血漿DNA分子之甲基化模式圖法。
圖 24顯示成對甲基化模式之界定。血漿DNA分子上顯示九個CpG位點。甲基化CpG位點以紅色示出,且未甲基化CpG位點以綠色示出。當一對中之兩個CpG位點共有相同甲基化狀態(例如第1個CpG及第5個CpG)時,該對將經編碼為1,如藉由箭頭指示之位置『a』中所示。當一對中之兩個CpG位點具有不同甲基化狀態(例如第1個CpG及第2個CpG)時,該對將經編碼為0,如藉由箭頭指示之位置『b』中所示。編碼規則同樣適用於DNA分子上之所有具有任何2個CpG位點之對。
吾等使用含有9個CpG位點之血漿DNA分子作為一實例。此血漿DNA分子之甲基化模式係藉由吾等先前揭示案(美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑來確定,亦即U-M-M-M-U-U-U-M-M(U及M分別表示未甲基化CpG及甲基化CpG)。任何兩個CpG位點之間的甲基化狀態之成對比較均可適用於基於機器學習或深度學習之分析。在此實例中,規則同樣適用於總計36對。若血漿DNA分子上存在總計
n 個CpG位點,則將存在n×(n-1)/2個比較對。可使用不同數目個,包含5、6、7、8、10、11、12、13個CpG位點等。若分子包含多於機器學習模型中所使用之位點數目,則滑動窗口可用於將位點劃分成適當數目個位點。
吾等獲得一或多個分別來自胎盤及膚色血球層DNA樣本之分子。彼等DNA分子之甲基化模式係根據吾等先前揭示案(美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑藉由Pacific Bioscience(PacBio)單分子即時(SMRT)定序來確定。彼等甲基化模式經轉譯成成對甲基化模式。
與胎盤DNA相關之成對甲基化模式及與膚色血球層DNA相關之成對甲基化模式係用於訓練卷積類神經網路(CNN)以區分潛在地胎兒起源與母體起源之分子。來自胎盤之DNA片段之各目標輸出(亦即類似於因變數值)經指派為『1』,而來自膚色血球層之DNA片段之各目標輸出經指派為『0』。成對甲基化模式係用於訓練以確定用於CNN模型之參數(常常稱為權重)。當藉由S函數(sigmoid function)及期望目標輸出(二進制值:0或1)計算之輸出分數之間的總預測誤差藉由反覆地調整模型參數而達到最小值時,獲得用於區分DNA片段之胎兒-母體起源之CNN的最佳參數。總預測誤差係藉由深度學習演算法中之S交叉熵損失函數量測(https://keras.io/)。自訓練數據集學習之模型參數係用於分析DNA分子(諸如血漿DNA分子)以輸出指示DNA分子來源於胎盤或膚色血球層之可能性的機率性分數。若血漿DNA片段之機率性分數超過特定臨限值,則此類血漿DNA分子視為係胎兒起源。否則,其將視為係母體起源。臨限值將包含但不限於0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.99等。在一個實例中,吾等使用此CNN模型達成0.63之AUC以判定血漿DNA分子係胎兒起源抑或母體起源,指示使用深度學習演算法推斷來自母體血漿之DNA分子之起源組織為可能的。藉由獲得更多單分子即時定序結果進一步改善深度學習演算法之效能。
在一些其他實施例中,統計模型可包含但不限於線性回歸、邏輯回歸、深度遞回類神經網路(例如長短期記憶體LSTM)、貝氏分類器(Bayes's classifier)、隱藏馬可夫模型(HMM)、線性鑑別分析(LDA)、k平均集群、具有噪音之應用之基於密度之空間集群(DBSCAN)、隨機森林演算法及支持向量機(SVM)等。將涉及包含但不限於二項分佈、柏努利分佈(Bernoulli distribution)、伽馬分佈(gamma distribution)、常態分佈、帕松分佈(Poisson distribution)等之不同統計分佈。
C. 對胎盤具有特異性之甲基化單倍型
單個DNA分子上之各CpG位點之甲基化狀態可使用吾等先前揭示案(美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑或本文所描述之任何技術來確定。除單分子雙股DNA甲基化程度之外,吾人可確定可為沿單個DNA分子之鄰接CpG位點之甲基化狀態之序列的各DNA分子的單分子甲基化模式。
不同DNA甲基化記號可見於不同組織及細胞類型中。在實施例中,吾人可基於個別血漿DNA分子之單分子甲基化模式推斷其之起源組織。
來自十個膚色血球層樣本及六個胎盤組織樣本之基因體DNA係使用SMRT定序(PacBio)加以定序。吾等能夠藉由將來自各樣本類型之經定位高品質環形共同定序(CCS)讀段綜合在一起來分別達成膚色血球層DNA及胎盤DNA之58.7倍及28.7倍涵蓋度。
藉由使用滑動窗口途徑將基因體劃分成5個CpG位點之約2820萬個重疊窗口。在其他實施例中,可使用諸如但不限於2、3、4、5、6、7及8個CpG位點之不同窗口尺寸。吾人亦可使用非重疊窗口途徑。各窗口視為潛在標記區。對於各潛在標記區,吾等在涵蓋彼標記區內之所有5個CpG位點之所有經定序胎盤DNA分子當中識別出主要單分子甲基化模式。將在血漿DNA分子之CpG位點與參考組織之個別DNA分子之對應CpG位點之間作出比較。隨後,吾等計算涵蓋同一標記區內之所有CpG位點之各膚色血球層DNA分子之錯配分數,此係藉由比較其單分子甲基化模式與胎盤中之主要單分子甲基化模式來進行。
其中錯配CpG位點數目係指顯示相較於胎盤中之主要單分子甲基化模式而言不同之膚色血球層DNA分子中之甲基化狀態的CpG位點數目。
較高錯配分數指示膚色血球層DNA分子之甲基化模式與胎盤中之主要單分子甲基化模式更加不同。吾等使用以下準則自2820萬個潛在標記區選擇顯示來自胎盤與膚色血球層之DNA分子池之間的實質性單分子甲基化模式差異的標記區:a)超過50%之胎盤DNA分子具有主要單分子甲基化模式;及b)超過80%之膚色血球層DNA分子具有大於0.3之錯配分數。吾等基於此等準則選擇281,566個標記區以用於下游分析。
圖 25為不同染色體當中之經選擇標記區之分佈表。第一欄顯示染色體數目。第二欄顯示染色體中之標記區數目。
吾等特此說明吾等基於單分子甲基化模式使用經SMRT定序加以定序之涵蓋如先前在本揭示案中所描述之胎兒特異性等位基因或母體特異性等位基因之血漿DNA分子進行的個別血漿DNA分子的起源組織分類概念。涵蓋經選擇標記區之具有與胎盤中之主要單分子甲基化模式相同之甲基化模式的任何血漿DNA分子將歸類為胎盤特異性(亦即胎兒特異性)DNA分子。相反地,若血漿DNA分子之單分子甲基化模式與胎盤中之主要單分子甲基化模式不同,則吾等將此分子歸類為非胎盤特異性的。此分析中之正確分類係以胎兒特異性DNA分子經識別為胎兒源性(亦即對胎盤具有特異性)且母體DNA分子經識別為非胎兒源性(亦即對胎盤不具有特異性)之方式根據胎盤特異性甲基化單倍型是否存在於彼分子中加以界定。先前用於起源組織分析之基於甲基化之方法通常涉及對生物樣本內之游離DNA之一定範圍之組織貢獻者的百分比或貢獻比例進行去卷積。本發明方法優於先前方法之優勢在於,組織向生物樣本貢獻游離DNA(例如母體血漿中之胎盤源性DNA)的證據可在不考慮來自其他組織之貢獻存在或不存在之情況下確定。此外,任一個游離DNA分子之胎盤起源可在不考慮彼組織對游離DNA分子之貢獻分率之情況下用本發明方法確定。
在28個涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子當中,17個(61%)歸類為胎盤特異性的,且11個(39%)歸類為非胎盤特異性的。另一方面,在467個涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子當中,433個(93%)歸類為非胎盤特異性的,且34個(7%)歸類為胎盤特異性的。
在實施例中,吾人可使用錯配分數大於0.3之膚色血球層DNA分子之不同百分比作為臨限值,該等百分比包含但不限於大於60%、70%、75%、80%、85%及90%等。吾人可藉由調整標記區選擇中所使用之準則改善懷孕個體中之血漿DNA之胎盤或非胎盤起源的總分類準確度。當吾人嘗試判定致病突變或複本數畸變是否存在於胎兒中時,以上舉動在非侵入性產前測試環境中尤其至關重要。
圖 26為基於血漿DNA分子之單分子甲基化模式使用錯配分數大於0.3之膚色血球層DNA分子之不同百分比作為標記區之選擇準則進行的血漿DNA分子的分類表。第一欄顯示錯配分數大於0.3%之膚色血球層DNA分子之百分比。第二欄將DNA分子劃分成涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子及涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子。第三欄及第四欄顯示基於單分子甲基化模式之DNA分子為胎盤特異性或非胎盤特異性之分類。第五欄顯示與第二欄中之特異性等位基因相同地經分類之DNA分子之百分比。
圖 27顯示以非侵入性方式使用胎盤特異性甲基化單倍型確定胎兒遺傳的方法流程。如圖27中所示,來自孕婦血漿之游離DNA經提取用於單分子即時定序。長血漿DNA分子係根據本揭示案中之實施例加以識別。各長血漿DNA分子之各CpG位點處之甲基化狀態係根據本揭示案中之實施例加以確定。各長血漿DNA分子之甲基化單倍型係根據本揭示案中之實施例加以確定。若長血漿DNA分子經識別為攜載胎盤特異性甲基化單倍型,則與彼分子相關之遺傳及表觀遺傳資訊將視為經胎兒遺傳。在實施例中,若根據本揭示案中之實施例基於甲基化單倍型資訊確定一或多個含有與孕婦所攜載之致病突變相同之致病突變的長血漿DNA分子係胎兒起源,則表明胎兒已自母親遺傳突變。
實施例可適用於包含但不限於以下之遺傳疾病:β-地中海型貧血、鐮狀細胞性貧血、α-地中海型貧血、囊腫纖維化、A型血友病、B型血友病、先天性腎上腺增生、杜興氏肌肉萎縮症、貝氏肌肉萎縮症(Becker muscular dystrophy)、軟骨發育不全、致死性發育不良、馮威里氏病(von Willebrand disease)、努南症候群(Noonan syndrome)、遺傳性聽覺損失及失聰、各種先天性代謝缺陷(例如I型瓜胺酸血症、丙酸酸血症、Ia型肝糖貯積病(馮吉爾克病(von Gierke disease))、Ib/c型肝糖貯積病(馮吉爾克病)、II型肝糖貯積病(龐培病(Pompe disease))、I型黏多醣貯積症(MPS)(賀氏(Hurler)/賀氏-謝氏(Hurler-Scheie)/謝氏(Scheie))、II型MPS(亨特症候群(Hunter syndrome))、IIIA型MPS(聖菲利波症候群(Sanfilippo syndrome)A)、IIIB型MPS(聖菲利波症候群B)、IIIC型MPS(聖菲利波症候群C)、IIID型MPS(聖菲利波症候群D)、IVA型MPS(莫奎症候群(Morquio syndrome)A)、IVB型MPS(莫奎症候群B)、VI型MPS(馬-拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy syndrome))、VII型MPS(斯利症候群(Sly syndrome))、黏脂貯積症II(I-細胞疾病)、異染性腦白質失養症、GM1神經節苷脂貯積症、OTC缺乏症(X性聯鳥胺酸胺基甲醯轉移酶缺乏症)、腎上腺腦白質失養症(X性聯ALD)、克拉培病(Krabbe disease)(球狀細胞腦白質失養症)等。
在其他實施例中,胎兒之遺傳疾病可能與不存在於親本基因體中之胎兒基因體中的重新DNA甲基化相關。實例將為患有X染色體脆裂症之胎兒中之
FMRP 轉譯調節子 1(
FMR1)基因的高甲基化。X染色體脆裂症係由
FMR1基因之5'未轉譯區中之CGG三核苷酸重複序列擴展造成。正常等位基因將含有約5至44個CGG重複序列複本。準突變等位基因將含有55至200個CGG重複序列複本。完全突變等位基因將含有超過200個CGG重複序列複本。
圖 28繪示攜載正常或準突變等位基因之未受影響孕婦之男性胎兒之X染色體脆裂症的非侵入性產前偵測原理。在圖28中,『n』表示母體基因體中之CGG複本數目;『m』表示胎兒基因體中之CGG複本數目。未受影響孕婦之基因體將具有
FMR1基因,該等
FMR1基因具備具有不超過200個複本(亦即n ≤ 200)之CGG重複序列且為未甲基化的。相比之下,受X染色體脆裂症影響之男性胎兒之基因體將具備具有超過200個CGG重複序列複本(m > 200)且為甲基化之
FMR1基因。吾人可藉由執行母體血漿DNA之單分子定序來自重複序列數目及甲基化狀態可經同時確定之所關注之基因體區(例如
FMR1基因)識別多個長DNA分子。若吾人在未受影響婦女之血漿中識別出一或多個涵蓋
FMR1基因、含有超過200個CGG重複序列複本且為甲基化之DNA分子,則將指示胎兒將可能患有X染色體脆裂症。在又另一實施例中,吾人可根據本揭示案中之實施例使用胎盤特異性甲基化單倍型進一步確定該等血漿DNA分子之胎兒起源。若吾人識別出一或多個含有攜載胎盤特異性甲基化單倍型之分子內之一或多個區的分子且該等分子涵蓋
FMR1基因、含有超過200個CGG重複序列複本且為甲基化的,則吾人可更確信地得出結論:胎兒患有X染色體脆裂症。相反地,若吾人識別出一或多個具有胎盤特異性甲基化單倍型之分子且該等分子涵蓋
FMR1基因、含有少於200個CGG重複序列複本且不為甲基化的,則將指示胎兒將可能未受影響。在X染色體脆裂症之情況下,完全突變(> 200個重複序列)實際上使得整個基因甲基化且關閉基因功能。因此,尤其對於X染色體脆裂而言,甲基化(而非顯示胎盤甲基化概況)之長等位基因之偵測將高度表明胎兒患有該疾病。
偵測遺傳病症可在知曉或不知曉母親先前狀態之情況下執行。具有準突變的婦女可能不具有任何症狀,但一些具有準突變的婦女可能具有輕度症狀且常常僅在事後知曉。若吾等不知曉母體突變狀態,則一種途徑為偵測來自似乎不患有疾病之婦女血漿中之長等位基因或分析母體膚色血球層且確定其不顯示此類長等位基因。作為另一途徑,吾等可組合cfDNA分子之重複序列長度與甲基化狀態。若甲基化狀態表明胎兒模式(甲基化單倍型)且顯示長等位基因,則胎兒可能受影響。此途徑適用於例如亨汀頓氏舞蹈症之許多三核苷酸病症。
D. 用長血漿DNA分子非侵入性構築胎兒基因體
甲基化模式可用於確定單倍型遺傳。使用用甲基化模式進行之定性途徑確定單倍型遺傳可比表徵特定片段之量之定量方法更高效。甲基化模式可用於確定單倍型之母體及父體遺傳。
1. 胎兒之母體遺傳
Lo等人證實在使用親本單倍型資訊之情況下構建全基因體遺傳圖譜且自母體血漿DNA序列確定胎兒之突變狀態的可行性(Lo等人《科學轉化醫學》2010;2:61ra91)。此技術已稱為相對單倍型劑量(RHDO)分析,且為一種解析胎兒之母體遺傳之途徑。該原理係基於以下事實:當與未經傳遞至胎兒中之另一母體單倍型相比時,胎兒所遺傳之母體單倍型將在孕婦血漿DNA中相對地經過度呈現。因此,RHDO為定量分析方法。
存在於本揭示案中之實施例利用長血漿DNA分子中之甲基化模式以確定彼血漿DNA分子之起源組織。在一個實施例中,本文中之揭示內容將允許對胎兒之母體遺傳進行定性分析。
圖 29顯示確定胎兒之母體遺傳之實例。母體基因體(A/G)中之基因體位置
P 為異型接合的。經填充之圓圈指示甲基化位點,且空心圓圈指示未甲基化位點。胎盤中之甲基化模式為「-M-U-M-M-」,其中「M」表示CpG位點處之甲基化胞嘧啶且「U」表示CpG位點處之未甲基化胞嘧啶。在一個實施例中,胎盤及相關參考組織中之甲基化模式可獲自先前由定序(例如單分子即時定序及/或亞硫酸氫鹽定序)生成之數據。在血漿DNA中,發現一種在彼特定基因體基因座處攜載等位基因A之非父體血漿DNA(由Z表示)展示相對於其他組織之甲基化模式而言與胎盤中之甲基化模式相容的甲基化模式(「-M-U-M-M-」)。未發現展示與胎盤中之甲基化模式相容的甲基化模式之攜載等位基因G之分子。因此,基於等位基因A及「-M-U-M-M-」甲基化模式之存在可確定胎兒遺傳母體等位基因A。
圖 30顯示使用血漿DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊進行之胎兒之母體遺傳的定性分析。如圖30之頂部分支中所示,根據本揭示案中之實施例,血漿DNA經提取,接著為針對長DNA之尺寸選擇。經尺寸選擇之血漿DNA分子經受單分子即時定序(例如使用由太平洋生物科學製造之系統)。遺傳及表觀遺傳資訊係根據本揭示案中之實施例加以確定。出於說明之目的,將分子(X)與在染色體位置a(chr1:a)處含有等位基因
G且在染色體位置e(chr1:e)處含有等位基因
A之人類染色體1進行排比。分子X在染色體位置d處具有等位基因
C 。
此分子X之CpG甲基化狀態經確定為「-M-U-M-M-」,其中「M」表示CpG位點處之甲基化胞嘧啶且「U」表示CpG位點處之未甲基化胞嘧啶。經填充之圓圈指示甲基化位點,且空心圓圈指示未甲基化位點。作為參考樣本分析之結果,已知胎盤DNA在位置a與e之間的區中具有「-M-U-M-M-」之甲基化模式。根據本揭示案中之實施例,基於匹配胎盤DNA之甲基化模式的分子X之甲基化模式,分子X經確定係胎盤起源。
如圖30之下部分支中所示,來自母體白血球之DNA經受單分子即時定序。母體白血球之表觀遺傳及遺傳資訊係根據本揭示案中之實施例獲得。使用包含但不限於WhatsHap(Patterson等人《計算生物學期刊(J Comput Biol.)》2015;22:498-509)、HapCUT(Bansal等人《生物資訊學(Bioinformatics.)》2008;24:i153-9)、HapCHAT(Beretta等人《BMC生物資訊學(BMC bioinformatics.)》2018;19:252)等之方法將遺傳等位基因定相成兩個單倍型,亦即母體單倍型I(Hap I)及母體單倍型II(Hap II)。此處,吾等在母體基因體中獲得兩個單倍型,亦即「-A-C-G-T-」(Hap I)及「-G-T-A-C-」(Hap II)。Hap I與一或多種野生型變異體相關,而Hap II與一或多種疾病相關變異體有關。一或多種疾病相關變異體可包含但不限於單核苷酸變異體、插入、缺失、易位、反轉、重複序列擴展及/或其他遺傳結構變異。
對於基因體位置e,母體基因型經確定為AA且父體基因型經確定為GG。由於甲基化模式,故血漿DNA分子X經確定係胎盤起源。由於存在母體特異性等位基因A、但不存在父體特異性等位基因G,因此分子X經推斷為自母體單倍型中之一者遺傳。
為了進一步確定哪個母體單倍型經傳遞至胎兒,吾等比較此胎盤源性分子X之除位置chr1:e以外之基因體位置處的等位基因資訊與母體單倍型。作為一實例,分子X在位置a處具有等位基因G且在位置d處具有等位基因C。此等等位基因中之任一者在分子X中之存在指示分子X應經指派至母體Hap II,該母體Hap II包含相同等位基因。
因此,吾人可得出結論:與一或多種疾病相關變異體有關之母體單倍型II經傳遞至胎兒。未出生胎兒經確定為處於受疾病影響之風險下。
與作為基於定量分析之途徑之RHDO相比,針對胎兒之母體遺傳之基於甲基化模式之定性分析可能需要較少血漿DNA分子來得出關於胎兒遺傳哪個母體單倍型的結論。吾等以全基因體方式用不同數目個用於分析之血漿DNA分子執行電腦模擬分析以評估胎兒之母體遺傳的偵測率。
對於RHDO模擬分析,在母體基因體之單倍型區塊中將
N個血漿DNA分子集體地與
M個異型接合SNP進行排比。胎兒DNA分率為
f。彼等對應SNP之父體基因型為同型接合的且與經傳遞至胎兒之母體Hap I相同。在
N個血漿DNA分子當中,與母體Hap I進行排比之血漿DNA分子之平均值為N×(0.5 +
f/2),而與母體Hap II進行排比之血漿DNA分子之平均值為N×(0.5 -
f/2)。吾等假定自單倍型取樣之血漿DNA分子遵循二項分佈。
該數目個血漿DNA分子經指派至Hap I(亦即X),遵循以下分佈:
X ~ Bin(N, 0.5 +
f/2)(1),
其中「Bin」表示二項分佈。
該數目個血漿DNA分子經指派至Hap II(亦即Y),遵循以下分佈:
Y ~ Bin(N, 0.5 -
f/2)(2)。
因此,與母體Hap II相比,經指派至母體Hap I之血漿DNA分子將在母體血漿中相對地經過度呈現。為了判定過度呈現是否為統計學上顯著的,吾等在其中兩個單倍型(由X'及Y'表示)同樣在血漿中經呈現之虛無假設情況下比較兩個母體單倍型之間的血漿DNA計數差異。
X' ~ Bin(N, 0.5)(3),
Y' ~ Bin(N, 0.5)(4)。
吾等如下進一步定義兩個單倍型之間的相對劑量差異:
D=(X-Y)/N(5),
D'=(X'-Y')/N(6)。
在一個實例中,將反映相對單倍型劑量之統計D與D'平均值(M)進行比較,藉由D'標準差(SD)標準化為以下(亦即z-分數):
z-分數=(D – M)/SD(7)。
> 3之z-分數指示Hap I經傳遞至胎兒。
對於RHDO分析,基於公式(1)至(7),吾等在其中Hap I經傳遞至胎兒之整個全基因體中模擬30,000個單倍型區塊。單倍型區塊之平均長度為100 kb。各單倍型區塊含有平均100個SNP,其中10個SNP將在促成單倍型不平衡方面提供資訊。在一個實例中,胎兒DNA分率為10%且片段尺寸中值為150 bp。吾等藉由改變在1百萬至3億範圍內之用於RHDO分析之血漿DNA分子數目用> 3之z-分數計算單倍型區塊百分比,該百分比在本文中稱為偵測率。本文中之血漿DNA分子數目係根據帕松分佈藉由涵蓋資訊性SNP位點之血漿DNA的機率加以調整。
對於與針對胎兒之母體遺傳之基於甲基化模式之定性分析相關的電腦模擬,吾等出於說明之目的作出如下假定:
1) 用於分析之母體基因體中存在
N 個涵蓋單倍型區塊之血漿DNA分子。
2) 用於起源組織分析之長度為至少3 kb之血漿DNA片段之機率係由
a 表示。
3) 攜載超過10個CpG位點之血漿DNA分子之機率係由
b 表示。
4) 彼等> 3 kb之片段之胎兒DNA分率係由
f表示。
如本揭示案之一個實施例中所繪示,吾人可達成彼等具有至少10個CpG位點之大於3 kb之血漿DNA分子之起源組織的準確推斷。假定滿足以上準則之血漿DNA分子數目(Z)遵循帕松分佈,其中平均值為λ(亦即
N ×
a ×
b × f )。
Z ~帕松(λ)(8)。
在一個實例中,基於公式(8),吾等模擬30,000個其中Hap I經傳遞至胎兒之單倍型區塊。各單倍型區塊之平均長度為100 kb。各單倍型區塊含有平均100個SNP,其中20個異型接合SNP將經定相成兩個母體單倍型。胎兒DNA分率為1%。在尺寸選擇之後存在40%之尺寸> 3 kb之血漿DNA分子。存在87.1%之具有至少10個CpG位點之尺寸> 3 kb之血漿DNA分子。Z值≥ 1之單倍型區塊百分比指示偵測率。吾等藉由利用甲基化模式改變在1百萬至3億範圍內之用於起源組織分析之血漿DNA分子數目(N)來重複多次電腦模擬運作。本文中之血漿DNA分子數目係根據帕松分佈藉由涵蓋異型接合SNP之血漿DNA的機率加以進一步調整。
圖 31顯示相較於相對單倍型劑量(RHDO)分析而言以全基因體方式使用血漿DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊進行之針對胎兒之母體遺傳的定性分析的偵測率。用於分析之分子數目示於x軸上。呈百分比形式之胎兒之母體遺傳之偵測率示於y軸上。與RHDO相比,使用基於甲基化模式之途徑,胎兒之母體遺傳之偵測率較高。舉例而言,使用1億個片段,基於甲基化模式之偵測率為100%,而基於RHDO之偵測率僅為55%。此等結果表明,使用基於甲基化模式之方法進行之胎兒之母體遺傳的推斷將優於使用基於RHDO之方法進行之胎兒之母體遺傳的推斷。
2. 胎兒之父體遺傳
獲得用於分析之長血漿DNA分子之能力可適用於改善孕婦血漿DNA中之父體特異性變異體的偵測率,此係因為與短DNA分子之使用相比,相同數目個長DNA分子之使用將增加總基因體涵蓋度。吾等基於以下假定進一步執行電腦模擬:
1) 視血漿DNA長度L而定,胎兒DNA分率為
f 。其經重寫為
f
L ,其中下標
L 指示具有bp長度
L 之血漿DNA分子係用於分析。
2) 需要在母體血漿DNA中經識別之父體特異性變異體數目為
V 。
3) 用於分析之血漿DNA分子數目為
N 。
4) 源自特定基因體基因座或區之血漿DNA分子數目遵循帕松分佈。
在一個實例中,彼等尺寸為150 bp、1 kb及3 kb之血漿DNA分子之胎兒DNA分率分別為10%(
f
150bp=
0.1)、2%(
f
1kb = 0.02)及1%(
f
3kb = 0.01)。基因體中之父體特異性變異體數目為250,000(
V = 250,000)。用於分析之血漿DNA分子數目(
N )範圍為5000萬至5億。
圖 32顯示以全基因體方式進行之父體特異性變異體之偵測率與用於分析之具有不同尺寸之經定序血漿DNA分子數目之間的關係。以百萬為單位之用於分析之經定序分子數目示於x軸上。所偵測之父體特異性變異體百分比示於y軸上。不同曲線顯示用於分析之不同尺寸DNA片段,其中頂部為3 kb,中間為1 kb且底部為150 bp。用於分析之血漿DNA分子愈長,可達成之父體特異性變異體之偵測率愈高。舉例而言,使用4億個血漿DNA分子,當聚焦於尺寸為150 bp、1 kb及3 kb之分子時,偵測率分別為86%、93%及98%。
在其他實施例中,可使用包含但不限於柏努利分佈、貝他(β)常態分佈、常態分佈、康韋-馬克士威-帕松分佈(Conway-Maxwell-Poisson distribution)、幾何分佈等之其他分佈。在一些實施例中,吉布斯取樣(Gibbs sampling)及貝氏定理將用於母體及父體遺傳分析。
3. X染色體脆裂遺傳分析
在實施例中,胎兒之母體遺傳的基於甲基化模式之確定可促進使用母體血漿DNA之單分子即時定序進行的X染色體脆裂症非侵入性偵測。X染色體脆裂症為通常由X染色體上之
FMR1(X染色體脆裂智能障礙1)基因內之CGG三核苷酸重複序列擴展造成的遺傳病症。由重複序列擴展造成之X染色體脆裂症及其他病症係描述在本申請案其他地方。用於偵測胎兒之X染色體脆裂症之方法亦可適用於本文所揭示之任何其他重複序列擴展。
具有準突變之女性個體處於懷有患有X染色體脆裂症之兒童的風險下,該準突變定義為在
FMR1基因中具有55至200個CGG重複序列複本。懷有患有X染色體脆裂症之胎兒之可能性係視存在於
FMR1基因中之CGG重複序列數目而定。母親體內之重複序列數目愈大,當傳遞至胎兒時自準突變擴展至完全突變之風險愈高。在12週胎齡時自先前經確認攜載115 ± 2個CGG重複序列之X染色體脆裂準突變等位基因且具有經診斷患有X染色體脆裂症之兒子(原發病患)的婦女收集母體血漿樣本。隨後,母體血漿經受單分子即時定序。在一個實例中,吾等使用單分子即時定序獲得330萬個與人類參考基因體排比之環形共同序列(CCS),其中中值子讀段深度為75倍/CCS(四分位數範圍:14-237倍)。各經定序血漿DNA之遺傳及表觀遺傳資訊可根據本揭示案之實施例加以確定。為了獲得染色體X之兩個母體單倍型,吾等使用於iScan系統(Illumina)上之作為微陣列技術之Infinium Omni2.5Exome-8 Beadchip以在染色體X上對2,000個SNP進行基因分型用於自母體膚色血球層及原發病患口頰拭子提取的兩個DNA。兩個母體單倍型,亦即Hap I及Hap II可基於母體及原發病患基因體之基因型資訊加以推斷。
圖 33顯示用於非侵入性偵測X染色體脆裂症之工作流。在母體膚色血球層DNA之異型接合SNP位點中,與原發病患基因型相同之等位基因係用於界定與準突變等位基因有關之單倍型(亦即Hap I),該準突變等位基因為後代中之完全突變之潛在前驅體。另一方面,與原發病患基因型不同之等位基因係用於界定與對應野生型等位基因有關之單倍型(Hap II)。來自原發病患之懷有胎兒之母親之母體血漿DNA經受單分子即時定序。視所獲得之遺傳資訊是否與所研究之彼等基因體基因座中之Hap I或Hap II之等位基因相同而定,定序讀段經指派至母體Hap I及Hap II。根據本揭示案中之實施例,血漿DNA分子之甲基化模式係用於確定含有特定數目個CpG位點之彼等血漿DNA分子的起源組織(亦即基於甲基化模式分析經識別係胎盤起源之DNA分子將經確定為源自胎兒)。
在情境A下,若胎兒(亦即胎盤)DNA分子可自經指派至母體Hap I之彼等血漿DNA分子偵測、但不可在經指派至母體Hap II之彼等血漿DNA分子中偵測,則Hap I將經確定為傳遞至未出生胎兒。胎兒將經確定為處於受X染色體脆裂症影響之高風險下。血漿DNA分子之胎盤起源將基於如下文所論述之分子之甲基化狀態。
在情境B下,若胎兒DNA分子可自經指派至母體Hap II之彼等血漿DNA分子偵測、但不可在經指派至母體Hap I之彼等血漿DNA分子中偵測,則Hap II將經確定為傳遞至未出生胎兒。胎兒將經確定為未受X染色體脆裂症影響。
在實施例中,胎兒DNA分子之「可偵測」及「不可偵測」定義可視經識別係胎兒(亦即胎盤)起源之血漿DNA分子百分比之截止值而定。用於「可偵測」之截止值可包含但不限於大於1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%等。用於「不可偵測」之截止值可包含但不限於小於1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%等。在一些實施例中,可要求Hap I與Hap II之間的經確定係胎兒起源之血漿DNA分子百分比差異大於但不限於1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%等。在一些其他實施例中,單倍型資訊可獲自長讀段定序技術(例如PacBio或奈米孔定序)(Edge等人《自然-通訊(Nat Commun.)》2019;10:4660)、合成長讀段(例如使用來自10X Genomics之平台)(Hui等人《臨床化學》 2017;63:513-14)、基於經靶向基因座擴增(TLA)之定相(Vermeulen等人《美國人類遺傳學期刊》2017; 101: 326-39)及統計定相(例如Shape-IT)(Delaneau等人《自然-方法》2011;9:179-81)。
在實施例中,吾人可根據本申請案中所揭示之甲基化狀態匹配途徑來確定至少200 bp且含有至少5個CpG位點(或用於長DNA分子之任何其他截止值)之彼等血漿DNA分子的母體及胎兒起源。吾等識別出一個位於基因體位置chrX:143、782、245-143、782、786處(離
FMR1基因3.2 Mb)之血漿DNA分子,其中等位基因(位置:chrX:143782434;SNP寄存編號:rs6626483;等位基因基因型:C)與母體Hap II上之對應等位基因相同,但與母體Hap I上之對應等位基因不同。
圖 34顯示相較於胎盤及膚色血球層DNA之甲基化概況而言血漿DNA之甲基化模式。血漿DNA分子含有5個CpG位點。甲基化模式經確定為「M-U-U-U-U」。根據本揭示案中所描述之甲基化狀態匹配途徑,將獲自單分子即時定序之此甲基化模式與獲自亞硫酸氫鹽定序之胎盤組織及膚色血球層DNA樣本之參考甲基化概況進行比較。源自胎盤之此分子之分數[亦即
S (胎盤) ]為2,大於源自膚色血球層之分子之分數[亦即
S (膚色血球層 )] -3。因此,此類血漿DNA分子(chrX:143、782、245-143、782、786)經確定係胎兒起源。然而,吾等並未觀測到攜載來自胎兒起源之母體Hap I之等位基因的任何血漿DNA分子。因此,吾等得出結論:胎兒遺傳母體Hap II且未受X染色體脆裂症影響。
吾等設想:本文所描述之途徑之效能可由於以下因素而未顯著地受X染色體失活影響:
1) X失活在人類中未完成。X染色體上多達1/3之基因顯示自X失活之可變逃避(Cotton等人《人類分子遺傳學(Hum Mol Genet.)》2015;25:1528-1539)。CpG島外部之CpG位點(亦即大部分CpG位點)在兩個性別中經類似程度地甲基化,表明X染色體中大部分CpG位點之甲基化狀態可不受X失活影響(Yasukochi等人《美國國家科學院院刊》2010;107:3704-9)。
2) 吾等使用關於未出生胎兒之性別匹配之胎盤組織的甲基化概況。此策略將可用於使用懷有男性胎兒之婦女之血漿DNA甲基化模式偵測胎兒之母體遺傳,此係因為經推測不受X失活影響之涉及男性胎兒之胎盤組織將具有與或多或少涉及特定區之X失活之其他母體組織不同的獨特甲基化模式。
吾等使用單分子即時定序進一步定序自母體膚色血球層樣本提取之DNA。吾等獲得230萬個CCS,其中中值子讀段深度為5倍/CCS。結果確認母體Hap I攜載具有124個CGG重複序列之準突變等位基因且母體Hap II攜載具有43個CGG重複序列之野生型等位基因。此外,吾等用單分子即時定序進一步定序自未出生胎兒之絨毛膜取樣提取之DNA。吾等獲得110萬個CCS,其中中值子讀段深度為4倍/CCS。結果確認未出生胎兒攜載野生型等位基因。
E. 人類基因體中之CpG位點之分佈
較長之DNA片段引起較大之片段具有多個CpG位點之機率。此等多個CpG位點可用於甲基化模式或其他分析。
圖 35顯示在整個人類基因體中之500 bp區中之CpG位點的分佈。第一欄顯示CpG位點數目。第二欄顯示500 bp區數目及CpG位點數目。第三欄顯示由具有特定數目個CpG位點之區表示之所有區的比例。舉例而言,86.14% 500 bp區將具有至少1個CpG位點。另外,11.08% 500 bp區將具有至少10個CpG位點。
圖 36顯示在整個人類基因體中之1 kb區中之CpG位點的分佈。第一欄顯示CpG位點數目。第二欄顯示1 kb區數目及CpG位點數目。第三欄顯示由具有特定數目個CpG位點之區表示之所有區的比例。舉例而言,91.67% 500 bp區將具有至少1個CpG位點。此外,32.91% 500 bp區將具有至少10個CpG位點。
圖 37顯示在整個人類基因體中之3 kb區中之CpG位點的分佈。第一欄顯示CpG位點數目。第二欄顯示3 kb區數目及CpG位點數目。第三欄顯示由具有特定數目個CpG位點之區表示之所有區的比例。舉例而言,92.45% 3 kb區將具有至少1個CpG位點。另外,87.09% 3 kb區將具有至少10個CpG位點。
在一些實施例中,CpG位點之不同數目及不同尺寸截止值將用於最大化胎盤特異性標記物識別及起源組織分析之靈敏度及特異性。一般而言,CpG位點的出現頻率高於SNP。既定尺寸之DNA片段可能具有比SNP多之CpG位點。上文所示之表可顯示具有與CpG位點相同數目個SNP之區的較低比例,此係因為相同尺寸區中存在比CpG位點少之SNP。因此,使用CpG位點允許使用更多片段且提供比僅使用SNP更佳之統計。
F. 起源組織分析之實例
在實施例中,吾人可將於母體血漿中之起源組織分析延伸至超過兩個包含T細胞、B細胞、嗜中性白血球、肝及胎盤之器官/組織。吾等使用單分子即時定序來定序9個母體DNA樣本。吾等根據本揭示案中所描述之甲基化狀態匹配途徑使用血漿DNA甲基化模式推斷胎盤對母體血漿DNA之貢獻。在一個實施例中,對於此甲基化狀態匹配分析,將母體血漿DNA樣本中長度為至少500 bp且含有至少5個CpG位點之DNA分子中之各者的甲基化模式與獲自亞硫酸氫鹽定序之參考組織甲基化概況進行比較。使用包含嗜中性白血球、T細胞、B細胞、肝及胎盤之五個組織作為參考組織。血漿DNA分子將經指派至對應於彼血漿DNA分子之最大甲基化狀態匹配分數的組織。相對於其他組織而言經指派至一組織之血漿DNA分子百分比將視為彼組織對彼樣本之母體血漿DNA的貢獻比例。在實施例中,母體血漿中之嗜中性白血球、T細胞及B細胞之貢獻比例總和提供造血細胞之貢獻比例的替代表示。
圖 38顯示使用甲基化狀態匹配分析之母體血漿中之來自不同組織之DNA分子的貢獻比例。第一欄顯示樣本識別。第二欄顯示呈百分比形式之造血細胞貢獻。第三欄顯示呈百分比形式之肝貢獻。第四欄顯示呈百分比形式之胎盤貢獻。圖38顯示母體血漿DNA之主要貢獻者為造血細胞(中值:55.9%),此與先前報導一致(Sun等人《美國國家科學院院刊》2015;112:E5503-12;Zheng等人《臨床化學》 2012;58:549-58)。
圖 39A及
圖 39B顯示胎盤貢獻與藉由SNP途徑推斷之胎兒DNA分率之間的關係。X軸顯示藉由SNP途徑確定之胎兒分率。Y軸顯示藉由使用甲基化狀態匹配分析確定之呈百分比形式之母體血漿中之胎盤貢獻。圖39A顯示藉由甲基化狀態匹配分析確定之胎盤貢獻與藉由SNP推斷之胎兒DNA分率之間的良好相關性(皮爾森相關係數(Pearson's r)= 0.95;P值< 0.0001)。吾等根據二次規劃藉由比較藉由單分子即時定序確定之血漿DNA甲基化密度與獲自亞硫酸氫鹽定序之各種參考組織甲基化概況來進一步執行母體血漿DNA的組織去卷積分析(Sun等人《美國國家科學院院刊》2015;112:E5503-12)。圖39B顯示相較於使用甲基化狀態匹配分析而言使用基於甲基化密度之途徑使胎盤貢獻(Sun等人《美國國家科學院院刊》2015;112:E5503-12)與胎兒DNA分率之間的相關性降低(皮爾森相關係數= 0.65;P值= 0.059)。
此等數據表明推斷母體血漿DNA樣本中之不同組織所貢獻之DNA分子的比例為可行的。在另一實施例中,此方法亦可用於量測來自在侵入性實體組織生檢之後獲得之樣本中之不同細胞類型或組織或來自在手術之後獲得之實體組織的DNA分子。在一些實施例中,單個DNA分子位準上甲基化模式用於推斷不同組織對母體血漿DNA之貢獻比例的用途將優於基於來自整個基因體中所有經定序血漿DNA分子之集合甲基化密度的途徑的用途。
G. 實例方法
圖 40顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法4000。生物樣本可包含來自胎兒及女性之複數個游離DNA分子。
在區塊4010處,可接收對應於複數個游離DNA分子之序列讀段。在一些實施例中,方法4000可包含執行游離DNA分子之定序。
在區塊4020處,可量測複數個游離DNA分子之尺寸。量測可包含將序列讀段與參考基因體進行排比。在一些實施例中,量測可包含對全長序列中之核苷酸進行全長定序且計數其數目。在一些實施例中,量測可包含將來自生物樣本之複數個游離DNA分子與生物樣本中之其他游離DNA分子以物理方式分離,其中其他游離DNA分子具有小於截止值之尺寸。物理分離可包含本文所描述之任何技術,包含使用珠粒。
在區塊4030處,可識別來自複數個游離DNA分子之一組游離DNA分子為具有大於或等於截止值之尺寸。截止值可大於或等於200 nt。截止值可為至少500 nt,包含600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、1.1 knt、1.2 knt、1.3 knt、1.4 knt、1.5 knt、1.6 knt、1.7 knt、1.8 knt、1.9 knt或2 knt。截止值可為本文所描述之用於長游離DNA分子之任何截止值。尺寸可為CpG位點數目而非分子長度。舉例而言,截止值可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個CpG位點。
在區塊4040處,對於該組游離DNA分子中之一游離DNA分子,可確定複數個位點中之各位點處之甲基化狀態。複數個位點可包含至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個CpG位點。複數個位點中之至少一個可為甲基化的。複數個位點中之兩個位點可間隔至少160 nt、170 nt、180 nt、190 nt、200 nt、250 nt或500 nt。該方法可包含對複數個游離DNA分子進行定序以獲得序列讀段,且藉由量測對應於位點之核苷酸及鄰近位點之核苷酸的特徵來確定位點的甲基化狀態。舉例而言,甲基化可如美國申請案第16/995,607號中一般加以確定。
在區塊4050處,可確定甲基化模式。甲基化模式可指示複數個位點中之各位點處之甲基化狀態。
在區塊4060處,可將甲基化模式與一或多個參考模式進行比較。一或多個參考模式中之各者可經確定用於特定組織類型。在一些實施例中,比較可包含確定匹配參考模式之位點數目。
一或多個參考模式中之該參考模式可藉由使用來自參考組織之DNA分子量測複數個參考位點中之各參考位點處之甲基化密度來確定。可將複數個參考位點中之各參考位點處之甲基化密度與一或多個臨限甲基化密度進行比較。可基於比較甲基化密度與一或多個臨限甲基化密度來識別複數個參考位點中之各參考位點為甲基化、未甲基化或非資訊性的,其中複數個位點為經識別為甲基化或未甲基化的複數個參考位點。非資訊性位點可包含具有在兩個臨限甲基化密度之間的甲基化密度的位點。舉例而言,非資訊性位點之甲基化指數可在30與70之間或在如本文所描述之任何其他範圍內。
在步驟4070處,可使用甲基化模式確定游離DNA分子之起源組織。起源組織可為胎盤。起源組織可為胎兒或母體的。該方法可包含當甲基化模式匹配參考模式時,確定起源組織為參考組織,與用圖22進行之描述類似。匹配可指精確匹配。在一些實施例中,確定起源組織為參考組織可在甲基化模式匹配特定百分比之位點之參考模式時發生。舉例而言,甲基化模式可匹配至少60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%或更多位點之參考模式。
該方法可包含藉由利用比較甲基化模式與來自複數個參考組織中之第一參考組織之第一參考甲基化模式確定類似性分數來確定起源組織。類似性分數可用本文所描述之甲基化狀態匹配方法或貝他(β)分佈機率模型加以計算。可將類似性分數與臨限值進行比較。當類似性分數超過臨限值時可確定起源組織為第一參考組織。類似性分數可為第一類似性分數。該方法可進一步包含藉由利用比較甲基化模式與來自複數個參考組織中之第二參考組織之第二參考甲基化模式確定第二類似性分數來計算臨限值。第一參考組織與第二參考組織可為不同組織。臨限值可為第二類似性分數。與所有其他參考組織相比,第一參考組織可具有最高類似性分數。
第一參考甲基化模式可包含對於第一參考組織而言具有至少第一甲基化機率之第一子組位點。舉例而言,第一子組位點可為視為甲基化或通常視為甲基化之位點。第一參考甲基化模式可包含對於第一參考組織而言具有至多第二甲基化機率之第二子組位點。舉例而言,第二子組位點可為視為未甲基化或通常視為未甲基化之位點。確定類似性分數可包含當複數個位點中之一位點為甲基化的且複數個位點中之該位點處於第一子組位點中時增加類似性分數,且當複數個位點中之一位點為甲基化的且複數個位點中之該位點處於第二子組位點中時減少類似性分數。類似性分數可經確定為與本文所描述之甲基化狀態匹配途徑類似。
第一參考甲基化模式包括複數個位點,其中複數個位點中之各位點之特徵在於對於第一參考組織而言的甲基化機率及未甲基化機率。對於複數個位點中之各位點,類似性分數可藉由確定對應於游離DNA分子中之位點之甲基化狀態的參考組織中之機率來確定。類似性分數可藉由計算複數個機率之乘積來確定。乘積可為類似性分數。機率可藉由貝他(β)分佈確定,與本文所描述之途徑類似。
方法4000可進一步包含確定該組游離DNA分子中之各游離DNA分子之起源組織。此確定可包含確定複數個各別位點中之各位點處之甲基化狀態,其中複數個各別位點對應於游離DNA分子。確定起源組織可進一步包含確定甲基化模式。另外,確定起源組織亦可包含比較甲基化模式與一或多個參考模式中之至少一個參考模式。在一些實施例中,甲基化模式之比較可與圖22及隨附描述類似。在圖22中,胎盤、肝、血球及結腸為具有所說明之參考模式之參考組織的實例。圖38顯示作為參考組織之另一實例之造血細胞。
在一些實施例中,對應於各起源組織之游離DNA分子之量可經測定。各起源組織可包含複數個參考組織中之各參考組織。可使用對應於各起源組織之游離DNA分子之量測定起源組織的貢獻分率。舉例而言,起源組織可為胎盤。其他起源組織可包含造血細胞及肝。舉例而言,胎盤之貢獻分率可由游離DNA分子之量除以對應於所有起源組織之總游離DNA分子來測定。在一些實施例中,由游離DNA分子之量除以總游離DNA分子計算之分率可經由函數或一組校準數據點與貢獻分率相關。函數及該組校準數據點兩者均可由具有已知之起源組織之貢獻分率的複數個校準樣本確定。各校準數據點可規定對應於分率之校準值之貢獻分率。函數可表示校準數據點之線性或非線性擬合且可使貢獻分率與起源組織之分率或涉及起源組織之其他參數相關。測定貢獻分率之實施例可與已用圖39A及圖39B加以描述之實施例類似。
機器學習模型可用於確定起源組織。模型可藉由接收複數個訓練甲基化模式來訓練,各訓練甲基化模式在複數個位點中之一或多個位點處具有甲基化狀態,各訓練甲基化模式係由來自已知組織之DNA分子確定。來自已知組織之各分子可為細胞DNA。訓練可包含儲存複數個訓練樣本,各訓練樣本包含複數個訓練甲基化模式中之一者及指示對應於訓練甲基化模式之已知組織的標籤。訓練可包含使用複數個訓練樣本當將複數個訓練甲基化模式輸入模型中時基於匹配或不匹配對應標籤之模型之輸出來最佳化模型的參數。參數可包含指示複數個位點中之一個位點是否具有與複數個位點中之另一位點相同之甲基化狀態的第一參數。舉例而言,模型可與圖24之成對比較類似。參數可包含指示複數個位點中之各位點之間的距離的第二參數。在一些實施例中,機器學習模型可不需要將甲基化位點與參考基因體進行排比。模型之輸出可規定對應於輸入甲基化模式之組織。
機器學習模型可為卷積類神經網路(CNN)或本文所描述之任何模型。模型可包含但不限於線性回歸、邏輯回歸、深度遞回類神經網路(例如長短期記憶體,LSTM)、貝氏分類器、隱藏馬可夫模型(HMM)、線性鑑別分析(LDA)、k平均集群、具有噪音之應用之基於密度之空間集群(DBSCAN)、隨機森林演算法及支持向量機(SVM)。
親緣可藉由方法4000確定。起源組織可為胎兒。該方法可進一步包含將該等序列讀段中之一序列讀段與參考基因體之第一區進行排比,第一區包括對應於等位基因之複數個位點,複數個位點包含臨限數目個位點,使用複數個位點中之各位點處存在之各別等位基因確定第一單倍型,比較第一單倍型與對應於男性個體之第二單倍型,且使用比較確定男性個體為胎兒之父親之可能性的分類。若單倍型匹配,則男性個體可能視為父親,或若單倍型不匹配,則男性個體可能不視為父親。在一些實施例中,可將第一單倍型與男性個體之兩個單倍型進行比較。
在實施例中,當起源組織為胎兒時,可藉由將該等序列讀段中之一序列讀段與參考基因體之第一區進行排比來測試親緣。第一區可包含對應於等位基因之第一複數個位點。複數個位點可包含臨限數目個位點。臨限數目個位點可為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多個位點。可將複數個位點中之各位點處之等位基因與男性個體之基因體中對應位點處之等位基因進行比較。可使用比較確定男性個體為胎兒之父親之可能性的分類。若特定數目或百分比之等位基因匹配,則男性個體可能視為父親,且若少於彼數目或百分比之等位基因匹配,則男性個體可能不視為父親。截止百分比可為100%、90%、80%或70%。
在一些實施例中,單倍型可經確定。該等方法可包含對於該組游離DNA分子中之各游離DNA分子,將對應於游離DNA分子之序列讀段與參考基因體進行排比。可識別序列讀段為對應於女性中所存在之單倍型。可自對女性進行基因分型知曉女性中所存在之單倍型。在一些實施例中,可藉由分析來自女性之生物樣本中之單倍型之DNA片段濃度知曉女性的單倍型。可使用甲基化模式確定起源組織為胎兒的。可確定單倍型為母體遺傳胎兒單倍型。
單倍型之遺傳可使用參考組織之甲基化而非使用諸如與銘記基因座相關之甲基化概況的已知甲基化概況來確定。甲基化模式與參考模式之匹配或類似性分數可排除基於遺傳其之父母,既定等位基因或位點是否為甲基化的認識。
單倍型可經識別為攜載致病遺傳突變或變異。識別單倍型為攜載致病遺傳突變可包含在第一序列讀段中識別遺傳突變或變異。遺傳變異可包含單核苷酸差異、缺失或插入。可量測對應於在第一序列讀段之第一距離內之第一基因體位置的第二序列讀段中之第一甲基化程度。亦可量測對應於在第一序列讀段之第二距離內之第二基因體位置的第三序列讀段中之第二甲基化程度。第一距離可為100 nt、200 nt、300 nt、400 nt、500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、2 knt、5 knt或10 knt。第二序列讀段及第三序列讀段可與第一序列讀段處於同一染色體臂上。第一甲基化程度及第二甲基化程度可能與遺傳突變或變異相關。第一甲基化程度及第二甲基化程度可大於與遺傳突變或變異相關之一或兩個臨限程度。臨限程度可使用已知具有或不具有遺傳突變或變異之個體來確定。該方法可包含對胎兒可能患有由遺傳突變或變異造成之疾病進行分類。
胎兒特異性甲基化模式可經確定。該方法可包含對於該組游離DNA分子中之各游離DNA分子,將對應於游離DNA分子之序列讀段與參考基因體進行排比。該方法可包含識別序列讀段為對應於一區。該區可藉由接收對應於來自胎兒組織之複數個胎兒DNA分子之複數個胎兒序列讀段來確定。該方法可包含接收對應於複數個母體DNA分子之複數個母體序列讀段。該方法可包含針對複數個胎兒序列讀段中之各胎兒序列讀段確定在該區內之複數個甲基化位點中之各甲基化位點處的胎兒甲基化狀態。該方法可包含針對複數個母體序列讀段中之各母體序列讀段確定複數個甲基化位點中之各甲基化位點處的母體甲基化狀態。
用於確定胎兒特異性甲基化模式之方法可包含確定表徵其中胎兒甲基化狀態不同於母體甲基化狀態之位點之量的參數的值。該方法可包含比較參數的值與臨限值。參數可為在胎兒DNA分子與母體DNA分子之間不同之位點之比例。比例可為本文所描述之錯配分數。臨限值可指示錯配分數之最低位準且可為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或更大。在一些實施例中,臨限值可表示母體或胎兒DNA分子之平均錯配分數。該方法可包含確定參數的值超過臨限值。在一些實施例中,可要求特定百分比之母體或胎兒DNA分子之參數的值超過臨限值。舉例而言,百分比可為50%、60%、70%、80%、90%或更大。在一些實施例中,可要求特定百分比之對應於該區之胎兒DNA分子具有胎兒特異性甲基化模式。舉例而言,百分比可為40%、50%、60%、70%、80%或更大。此方法可與用圖25所描述之方法類似。
該方法可包含自起源組織富集生物樣本以獲得游離DNA分子。富集生物樣本可包含選擇且擴增該組游離DNA分子。富集可包含如本文所描述之基於尺寸之選擇。在一些實施例中,富集可包含基於甲基化模式之選擇。舉例而言,可使用基於甲基-CpG結合域(MBD)之捕獲及定序。可將游離DNA與可結合甲基化胞嘧啶之加標籤之MBD蛋白一起培育。隨後,可用抗體結合磁珠使蛋白質-DNA複合體沈澱。可優先富集具有更多甲基化CpG位點之DNA分子以用於下游分析。
III. 長游離DNA片段隨胎齡之變化
長游離DNA片段之量可隨胎齡變化。長游離DNA片段可用於確定胎齡。另外,與較短游離DNA片段相比,長游離DNA片段在特定末端模體中可更豐富,且特定末端模體之相對量可隨胎齡變化。末端模體之量亦可用於確定胎齡。使用長游離DNA片段確定之胎齡與經由其他臨床技術確定之胎齡的偏差可指示懷孕相關病症。在一些實施例中,長游離DNA片段可用於在不必確定胎齡之情況下確定懷孕相關病症之可能性。
A. 針對胎兒DNA及母體DNA之尺寸分析
使用單分子即時(SMRT)定序(PacBio)對懷孕初期(胎齡:13週)之兩個孕婦之血漿DNA、懷孕中期(胎齡:21-22週)之兩個孕婦之血漿DNA及懷孕晚期(胎齡:38週)之五個孕婦之血漿DNA進行定序。對於各案例,獲得中值1.76億(範圍:4900萬-6.85億)個子讀段,其中1.28億(範圍:3500萬-5.07億)個子讀段可與人類參考基因體(hg19)進行排比。SMRT孔中之各分子平均經定序107次。中值965,308(範圍:251,686-2,871,525)個高品質環形共同定序(CCS)讀段經定義為具有至少3個子讀段之CCS讀段,可用於下游分析。
將來自獲自各孕期之樣本之所有經定序分子綜合在一起以用於尺寸分析。懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿樣本分別存在總計194萬、509萬及445萬個游離DNA分子。
圖 41A及
圖 41B顯示來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿樣本之在0 kb至5 kb尺寸範圍內之游離DNA分子的尺寸分佈。x軸顯示尺寸。y軸顯示頻率。對於圖41A,繪製y軸之在線性尺度上在0 kb至5 kb範圍內之尺寸分佈,且對於圖41B,繪製y軸之在對數尺度上在0 kb至5 kb範圍內之尺寸分佈。來自所有三個孕期之血漿DNA如圖41A中所示展現在166 bp下之預期主峰,且如圖41B中所示展現延伸至在1 kb及2 kb範圍內之分子的以週期性模式出現的一系列主峰。
圖 42為顯示不同孕期之長血漿DNA分子比例的表。第一欄顯示與血漿樣本相關之胎齡。第二欄顯示長於500 bp之DNA分子比例。第三欄顯示長於1 kb之DNA分子比例。與懷孕初期及懷孕中期相比,懷孕晚期之500 bp或大於500 bp之血漿DNA分子頻率增加。懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之大於500 bp之長血漿DNA分子比例分別為15.8%、16.1%及32.3%。懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之大於1 kb之長血漿DNA分子比例分別為11.3%、10.6%及21.4%。當懷孕初期及懷孕中期母體血漿之長游離DNA分子顯示類似比例時,懷孕晚期母體血漿之長DNA分子比例為前述長DNA分子比例的約兩倍。
對於此揭示案之所分析之所有母體血漿DNA樣本,自其經配對母體膚色血球層及胎兒樣本提取之DNA經作為基於陣列雜交之基因分型方法的於iScan系統(Illumina)上之Infinium Omni2.5Exome-8 Beadchip基因分型。視案例來自懷孕初期、懷孕中期抑或懷孕晚期而定,分別藉由絨毛膜取樣、羊水穿刺術抑或胎盤取樣獲得胎兒樣本。對於各案例,識別中值203,647個資訊性單核苷酸多型性(SNP),其中母親為同型接合的且胎兒為異型接合的。當用於所有案例之來自各孕期之經定序之DNA分子綜合在一起時,吾等識別懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之分別總計1,362、2,984及6,082個涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子。另一方面,對於各案例,識別中值210,820個資訊性SNP,其中母親為異型接合的且胎兒為同型接合的。吾等識別懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之分別總計30,574、65,258及78,346個涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子。在所有母體血漿樣本當中,自≤ 600 bp之DNA分子之定序數據測定之中值胎兒DNA分率為15.6%(範圍為7.6%-26.7%)。
圖 43A及
圖 43B顯示來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。x軸顯示尺寸。y軸顯示頻率。對於圖43A,繪製y軸之在線性尺度上在0 kb至3 kb範圍內之尺寸分佈,且對於圖43B,繪製y軸之在對數尺度上在0 kb至3 kb範圍內之尺寸分佈。
圖 44A及
圖 44B顯示來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。x軸顯示尺寸。y軸顯示頻率。對於圖44A,繪製y軸之在線性尺度上在0 kb至3 kb範圍內之尺寸分佈,且對於圖44B,繪製y軸之在對數尺度上在0 kb至3 kb範圍內之尺寸分佈。
如圖43A至圖44B中所示,來自所有三個孕期之涵蓋胎兒特異性等位基因之血漿DNA分子及涵蓋母體特異性等位基因之血漿DNA分子展現長尾分佈,表明來源於胎兒來源及母體來源兩者之長DNA分子存在於所有三個孕期中。
圖 45為不同孕期之長胎兒及母體血漿DNA分子之比例表。第一欄顯示與血漿樣本相關之胎齡。第二欄顯示長於500 bp之胎兒DNA分子比例。第三欄顯示長於500 bp之母體DNA分子比例。第四欄顯示長於1 kb之胎兒DNA分子比例。第五欄顯示長於1 kb之母體DNA分子比例。在母體血漿中之DNA分子池當中,與涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子相比,涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子(係胎盤起源)具有較小比例之長DNA分子。懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之尺寸大於500 bp之涵蓋胎兒特異性等位基因之長血漿DNA分子比例分別為19.8%、23.2%及31.7%。懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期之尺寸大於1 kb之涵蓋胎兒特異性等位基因之長血漿DNA分子比例分別為15.2%、16.5%及19.9%。
不管懷孕初期及懷孕中期母體血漿中存在相較於懷孕晚期母體血漿而言較小比例之長血漿DNA分子且在所有三個孕期中胎兒DNA分子含有較少長DNA分子的事實如何,吾等先前揭示案及本揭示案中所描述之方法均允許吾等分析先前不可能用短讀段定序技術分析之相當大比例的長血漿DNA分子。另外,吾人可使用包含但不限於基於電泳、層析及珠粒之方法之不同尺寸選擇策略來富集血漿樣本中之長DNA片段。
圖 46A、
圖 46B及
圖 46C顯示不同孕期中特定尺寸範圍之胎兒特異性血漿DNA片段之比例圖。所評估之懷孕案例之胎齡係藉由斷定孕期之超音波(dating ultrasound)來驗證。圖46A顯示小於或等於150 bp之DNA片段之結果。圖46B顯示150至600 bp之DNA片段之結果。圖46C顯示大於或等於600 bp之DNA片段之結果。該等圖式在y軸上具有胎兒特異性片段比例且在x軸上具有胎齡。如該等圖式中所示,與在150 bp至600 bp範圍內之胎兒特異性片段比例(圖46B)相比,短於150 bp之胎兒特異性片段比例(圖46A)及長於600 bp之胎兒特異性片段比例(圖46C)兩者將達成區分懷孕晚期樣本與懷孕初期及懷孕中期樣本的特定鑑別動力。長於600 bp之胎兒特異性片段之比例可提供最佳鑑別動力。此結論係藉由以下事實證明:當使用短於150 bp之胎兒特異性片段之比例時,懷孕晚期與懷孕初期及懷孕中期之合併組之間的絕對最小距離為0.38,而當使用大於600 bp之胎兒特異性片段之比例時,對應值為3.76。此等結果表明,長DNA分子之使用反映病理生理學狀態,此將優於短DNA分子之使用。
B. 血漿DNA末端分析
除尺寸之外,吾等針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端處的第一核苷酸。此分析係由4個類型之末端,亦即A端、C端、G端及T端組成。來自獲自各孕期之母體血漿樣本之具有特定末端之血漿DNA分子百分比經計算。各片段尺寸下之A端、C端、G端及T端之百分比經進一步分析。
圖 47A、
圖 47B及
圖 47C顯示跨0 kb至3 kb之片段尺寸範圍之來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之游離DNA分子之5'端處的鹼基含量比例圖。圖47A顯示懷孕初期母體血漿。圖47B顯示懷孕中期母體血漿。圖47C顯示懷孕晚期母體血漿。呈百分比形式之鹼基含量示於y軸上。以鹼基對為單位之片段尺寸示於x軸上。如該等圖式中所見,跨許多尺寸範圍(大部分小於1 kb)之C端經過度呈現且根據用於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期樣本之不同尺寸範圍變化。懷孕晚期樣本之血漿DNA末端模式似乎與懷孕初期及懷孕中期樣本不同。舉例而言,在於105 bp至172 bp範圍內之尺寸下之T端及G端曲線混合在一起,但其在懷孕初期及懷孕中期樣本中發散。對於較長片段(例如大於約1 kb),C端片段不為最豐富片段。在約1 kb下G端片段超過C端片段,且隨後在約2 kb下A端片段變得比G端片段豐富。
圖 48為來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之短游離DNA分子及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例表。第一欄顯示分子末端處之鹼基。第二欄顯示預期比例點及物種。第三欄顯示懷孕初期母體血漿之小於或等於500 bp之片段當中的末端物種比例。第四欄顯示懷孕初期母體血漿之大於500 bp之片段當中的末端物種比例。第五欄及第六欄分別與第三欄及第四欄類似,不同之處在於懷孕中期母體血漿代替懷孕初期母體血漿。第七欄及第八欄分別與第三欄及第四欄類似,不同之處在於懷孕晚期母體血漿代替懷孕初期母體血漿。
若游離DNA片段化為完全隨機的,則末端核苷酸鹼基比例應反映人類基因體之組成,該組成為29.5% A、29.5% T、20.5% C及20.5% G,如圖48之第二欄中所示。與隨機片段化形成對比,≤ 500 bp之短游離DNA分子之5'端顯示C端之相當大過度呈現(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿分別為30.4%、30.4%及31.3%)、G端之略微過度呈現(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為27.4%、26.9%及25.3%)及A端之過低呈現(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為19.8%、19.4%及19.3%)以及T端之過低呈現(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為22.4%、23.3%及24.1%)。
然而,當與短游離DNA分子相比時,> 500 bp之長游離DNA分子顯示A端比例之相當大增加(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿分別為29.6%、26.0%及26.7%)、G端比例之略微增加(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為31.0%、29.5%及29.9%)、T端比例之相當大減少(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為13.9%、16.9%及16.4%)及C端比例之略微減少(對於懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期分別為25.5%、27.5%及27.1%)。
圖 49為來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之涵蓋胎兒特異性等位基因之短游離DNA分子及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例表。
圖 50為來自懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿之涵蓋母體特異性等位基因之短游離DNA分子及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例表。第一欄顯示分子末端處之鹼基。第二欄顯示預期比例點及物種。第三欄顯示懷孕初期母體血漿之小於或等於500 bp之片段當中的末端物種比例。第四欄顯示懷孕初期母體血漿之大於500 bp之片段當中的末端物種比例。第五欄及第六欄分別與第三欄及第四欄類似,不同之處在於懷孕中期母體血漿代替懷孕初期母體血漿。第七欄及第八欄分別與第三欄及第四欄類似,不同之處在於懷孕晚期母體血漿代替懷孕初期母體血漿。圖49及圖50顯示短游離DNA分子及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例中的該差異保持不變,即使當吾等單獨地檢查涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子及涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子時亦如此。
圖 51繪示使用256個4聚體末端模體進行之短血漿游離DNA分子及長血漿游離DNA分子的層級集群分析。各欄指示用於分別基於短片段(在第一列中由青色表示)及長片段(在第一列中由黃色表示)分析末端模體頻率之樣本。自第二列開始,各列指示末端模體之類型。根據列標準化頻率(z-分數)(亦即低於或高於整個樣本中之平均頻率之標準差數值),末端模體頻率係以一系列顏色梯度呈現。顏色愈紅,指示末端模體頻率愈高,而顏色愈藍,指示末端模體頻率愈低。
在圖51中,吾等藉由分析短游離DNA分子及長游離DNA分子之4聚體末端模體概況對其等進行表徵。吾等針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端處的第一4核苷酸序列(4聚體模體)。對於各母體血漿樣本,分別計算短血漿DNA分子(≤ 500 bp)及長血漿DNA分子(> 500 bp)之各血漿DNA末端模體頻率。基於256個4聚體末端模體頻率之層級集群分析顯示整個不同母體血漿樣本中之長DNA分子之末端模體概況形成與短DNA分子之末端模體概況不同的集群。此等結果表明長DNA及短DNA具有不同片段化特性。在實施例中,吾人將使用長DNA分子與短DNA分子之間的此等末端模體之相對擾動以指示源自諸如但不限於細胞凋亡及壞死之細胞死亡路徑的游離DNA貢獻。來自此等細胞死亡路徑之經提高之活性可能與懷孕相關病症及其他病症相關。
圖 52A及
圖 52B顯示使用用於分類分析之4聚體末端模體概況進行之主成分分析(PCA)。圖52A顯示來自不同孕期之短游離DNA分子(≤ 500 bp)。圖52B顯示來自不同孕期之母體血漿樣本之長游離DNA分子(> 500 bp)。X軸及y軸上之括號內之百分比表示藉由對應成分闡述之可變性之量。各藍點表示懷孕初期母體血漿樣本。各黃點表示懷孕中期母體血漿樣本。各紅點表示懷孕晚期母體血漿樣本。橢圓形表示用於分組來自特定孕期之數據點之95%信賴位準。與短游離DNA分子(圖52A)(亦描述於美國申請案第15/787,050號中)相比,長游離DNA分子(圖52B)之4聚體末端模體概況在懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿樣本之間產生更清晰之間距。在實施例中,吾人可利用單獨長血漿DNA分子之末端模體概況或與包含但不限於甲基化程度及尺寸之其他母體血漿DNA特徵的組合以用於分子胎齡評估。
舉例而言,吾等使用神經網路來訓練用於基於256個末端模體、總甲基化程度及尺寸≥ 600 bp之片段比例預測胎齡的模型。輸出變數為1、2及3,表示懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期。輸入變數包含256個末端模體、總甲基化程度及尺寸≥ 600 bp之片段比例。吾等使用留一法來評估預測胎齡之效能。對於包括9個樣本之數據集,以一個樣本經選擇為測試樣本且剩餘8個樣本用於基於神經網路訓練模型之方式進行留一法。基於已建立模型,此類測試樣本經確定為1、2或3。隨後,吾等對尚未經測試之其他樣本重複此方法。對於此類訓練及測試過程,吾等總計重複9次。藉由比較彼等測試結果與關於胎齡之臨床資訊,9個樣本中有8個(89%)就胎齡而言經恰當地預測。在另一實施例中,該分析可例如但不限於使用貝氏定理、邏輯回歸、多元回歸及支持向量機、隨機森林分析、分類及回歸樹(CART)、K最近相鄰演算法來執行。
接著,將來自獲自各孕期之樣本之所有經定序分子綜合在一起以用於下游末端模體分析。根據短血漿DNA分子及長血漿DNA分子當中的256個末端模體之頻率對其進行分等級。
圖 53至
圖 58為特定長度之DNA片段(短於或長於500 bp)及不同孕期之具有最高頻率之25個末端模體的表。圖53、圖54及圖55為短片段(< 500 bp)中之藉由末端模體等級分選之末端模體表。在圖53至圖55中,第一欄顯示末端模體。第二欄顯示短片段中之模體頻率等級。第三欄顯示長片段中之模體頻率等級。第四欄顯示短片段中之模體頻率。第五欄顯示長片段中之模體頻率。第六欄顯示變化倍數(短片段中之模體頻率除以長片段中之模體頻率)。
圖56、圖57及圖58為長片段(> 500 bp)中之藉由末端模體等級分選之末端模體表。在圖56至圖58中,第一欄顯示末端模體。第二欄顯示長片段中之模體頻率等級。第三欄顯示短片段中之模體頻率等級。第四欄顯示長片段中之模體頻率。第五欄顯示短片段中之模體頻率。第六欄顯示變化倍數(長片段中之模體頻率除以短片段中之模體頻率)。
圖53及圖56係來自懷孕初期樣本。圖54及圖57係來自懷孕中期樣本。圖55及圖58係來自懷孕晚期樣本。
在短血漿DNA分子當中的前25個具有最高頻率之末端模體當中,其中11個係以CC二核苷酸起始。在懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿中,以CC起始之末端模體分別一起佔短血漿DNA末端模體之14.66%、14.66%及15.13%。在長血漿DNA分子當中的前25個具有最高頻率之末端模體當中,以TT二核苷酸結束之4聚體模體在懷孕中期及懷孕晚期母體血漿中佔其中的9個且在懷孕初期母體血漿中佔其中的10個。
吾等針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端之第三核苷酸(X)及第四核苷酸(Y)的二核苷酸序列。X及Y可為DNA中之四個核苷酸鹼基中的一個。存在16個可能性NNXY模體,亦即NNAA、NNAT、NNAG、NNAC、NNTA、NNTT、NNTG、NNTC、NNGA、NNGT、NNGG、NNGC、NNCA、NNCT、NNCG及NNCC。
圖 59A、
圖 59B及
圖 59C顯示短血漿DNA分子及長血漿DNA分子當中的16個NNXY模體的模體頻率散佈圖。圖59A顯示懷孕初期結果。圖59B顯示懷孕中期結果。圖59C顯示懷孕晚期結果。長片段之模體頻率示於y軸上。短片段之模體頻率示於x軸上。各圓圈表示16個NNXY模體中的一個。各散佈圖中之點線對指代相較於短血漿DNA分子(≤ 500 bp)而言長血漿DNA分子(> 500 bp)中之模體頻率的1.5倍增加(上線)及降低(下線)。位於陰影區域外部之圓圈表示變化倍數> 1.5之模體。
在所有三個孕期中(圖11),當短血漿DNA分子之末端顯示以CC二核苷酸(CCNN)起始之4聚體模體之高頻率(Jiang等人《癌症發現(Cancer Discov)》2020;10(5):664-673;Chan等人《美國人類遺傳學期刊》 2020;107(5):882-894)時,長血漿DNA分子之末端顯示以TT(NNTT)結束之4聚體模體之頻率的> 1.5倍增加。在懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿中,NNTT模體分別佔長血漿DNA末端模體之18.94%、15.22%及15.30%。相反地,在懷孕初期、懷孕中期及懷孕晚期母體血漿中,NNTT模體分別僅佔短血漿DNA末端模體之9.53%、9.29%及8.91%。
如先前Han等人所報導,對> 150 bp之A端片段富集自死亡細胞新釋放至血漿中之游離DNA。發現作為在細胞凋亡期間參與DNA片段化之主要胞內核酸酶之DNA片段化因子β(DFFB)負責生成該等片段(Han等人《美國人類遺傳學期刊》2020;106:202-214)。在本揭示案中,吾等已顯示,亦對A端片段富集> 500 bp之長游離DNA分子,表明DFFB可能亦負責生成此等片段。在正常懷孕中,滋胚層細胞凋亡隨妊娠發展而增多(Sharp等人《美國生殖免疫學期刊(Am J Reprod Immuno)》2010;64(3):159-69)。實際上,吾等涵蓋胎兒特異性等位基因之長DNA分子比例隨孕期發展而增加之發現可能反映滋胚層細胞凋亡隨孕期發展而增多。
在實施例中,吾人可使用本文所描述之方法來針對胎盤相關懷孕併發症之預測、篩檢及發展監測分析母體血漿中之長游離DNA分子,該等胎盤相關懷孕併發症包含但不限於子癇前症、子宮內生長受限(IUGR)、早產及妊娠期滋胚層疾病。已報導胎盤相關懷孕併發症中之滋胚層細胞凋亡位準增加,該等胎盤相關懷孕併發症諸如為子癇前症(Leung等人《美國婦產科期刊(Am J Obstet Gynecol)》 2001;184:1249-1250)、IUGR(Smith等人《美國婦產科期刊》 1997;177:1395-1401;Levy等人《美國婦產科期刊》 2002;186:1056-1061)及妊娠期滋胚層疾病。此外,已報導以下中之母體血漿中之胎兒DNA含量升高:子癇前症(Lo等人《臨床化學》 1999;45(2):184-8;Smid等人《紐約科學院年報(Ann N Y Acad Sci)》 2001;945:132-7)、IUGR(Sekizawa等人《美國婦產科期刊》 2003;188:480-4)及早產(Leung等人《刺胳針(Lancet)》 1998;352(9144):1904-5)。吾等假設在胎盤相關懷孕併發症中,由於胎盤細胞凋亡增多,故母體血漿樣本中之胎盤起源之長游離DNA分子比例增加。因此,胎盤起源之長游離DNA分子自身以及包含但不限於A端片段及NNTT模體之長DNA記號可能充當胎盤細胞凋亡之生物標記。
儘管上文分析中使用單核苷酸模體及4核苷酸模體,但在其他實施例中可使用例如2、3、5、6、7、8、9、10或更長之其他長度之模體。
C. 實例方法
長游離DNA片段可用於確定懷有胎兒之女性之胎齡。長游離DNA片段之量隨胎齡而變化且可用於確定胎齡。游離DNA片段之末端模體亦隨胎齡而變化且可用於確定胎齡。當使用長游離DNA片段確定之胎齡顯著地偏離經由其他臨床技術確定之胎齡時,則懷孕女性及/或胎兒可視為患有懷孕相關病症。在一些實施例中,可不需要確定胎齡以確定懷孕相關病症之可能性。
1. 胎齡
圖 60顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法6000。胎齡可經確定且可用於分類懷孕相關病症之可能性。生物樣本可包含來自胎兒及女性之複數個游離DNA分子。
對應於複數個游離DNA分子之序列讀段可經接受。在一些實施例中,用於獲得序列讀段之定序可經執行。
在區塊6020處,可量測複數個游離DNA分子之尺寸。尺寸可以與用圖21加以描述之方式類似之方式來量測。尺寸可使用序列讀段來量測。
在區塊6030處,可量測具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子的第一量。量可為游離DNA分子之數目、總長度或質量。
在區塊6040處,可使用第一量生成經標準化參數之值。經標準化參數之值可為藉由游離DNA分子總數目、藉由來自胎兒或母親之游離DNA分子數目或藉由來自特定區之DNA分子數目標準化之第一量。舉例而言,如用圖46A-C所描述,經標準化參數可為胎兒特異性片段比例。
在區塊6050處,可將經標準化參數之值與一或多個校準數據點進行比較。各校準數據點可規定對應於經標準化參數之校準值之胎齡。舉例而言,特定孕期或特定週數之胎齡可對應於經標準化參數之校準值。一或多個校準數據點可自具有已知胎齡且包含具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子的複數個校準樣本確定。在一些實施例中,校準數據點係自具有經標準化參數之值之功能相關胎齡確定。
在區塊6060處,可使用比較確定胎齡。胎齡可視為對應於最接近經標準化參數之值之校準值的年齡。在一些實施例中,胎齡可視為對應於低於經標準化參數之值之校準值的最高齡。
該方法可進一步包含使用超音波或女性最後一次月經期之日期確定胎兒之參考胎齡。該方法亦可包含比較胎齡與參考胎齡。該方法可進一步包含使用胎齡與參考胎齡之比較確定懷孕相關病症之可能性之分類。舉例而言,胎齡與參考胎齡之間的差異可指示懷孕相關病症。差異可為不同孕期或相差最小週數(例如1、2、3、4、5、6、7週或更多週)之胎齡差異。
該方法可進一步包含使用末端模體。舉例而言,該方法可包含確定對應於具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子之至少一個末端的第一子序列。第一量可屬於具有大於截止值之尺寸且在各別游離DNA分子之一或多個末端處具有第一子序列的游離DNA分子。第一子序列可為或包含1、2、3、4、5或6個核苷酸。如用圖52A及圖52B所描述,末端模體可用於經由PCA分析確定胎齡。可使用具有不同末端模體及已知胎齡且經受PCA分析之校準樣本。可在末端模體上使用諸如線性鑑別分析、邏輯回歸、支持向量機、線性回歸、非線性回歸等之其他分類及回歸演算法。分類及回歸演算法可使胎齡與特定末端模體及/或特定尺寸片段相關。
末端模體可為用圖47-59或圖94加以論述之任何模體。可將末端模體等級或頻率與來自具有已知胎齡之個體之校準樣本中之末端模體等級或頻率進行比較。隨後,末端模體等級或頻率可用於確定胎齡。以偏離自具有相同胎齡之參考樣本確定之等級或頻率的等級或頻率存在的末端模體可指示懷孕相關病症。
生成經標準化參數之值可包含(a)藉由具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子的總量標準化第一量;(b)藉由具有大於截止值之尺寸且以第二子序列結束之游離DNA分子的第二量標準化第一量,第二子序列與第一子序列不同,或(c)藉由具有小於截止值之尺寸之游離DNA分子的第三量標準化第一量。
2. 懷孕相關病症
圖 61顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法6100。實施例可包含在不必確定胎齡之情況下分類懷孕相關病症之可能性。生物樣本可包含來自胎兒及女性之複數個游離DNA分子。
對應於複數個游離DNA分子之序列讀段可經接受。在一些實施例中,用於獲得序列讀段之定序可經執行。
在區塊6120處,可量測複數個游離DNA分子之尺寸。尺寸可以與用圖21加以描述之方式類似之方式來獲得。量測尺寸可使用所接受之序列讀段。
在區塊6130處,可量測具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子的第一量。截止值可大於或等於200 nt。截止值可為至少500 nt,包含600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、1.1 knt、1.2 knt、1.3 knt、1.4 knt、1.5 knt、1.6 knt、1.7 knt、1.8 knt、1.9 knt或2 knt。截止值可為本文所描述之用於長游離DNA分子之任何截止值。第一量可為數目或頻率。
在區塊6140處,可使用第一量生成經標準化參數之第一值。生成經標準化參數之值可包含量測包含小於截止值之尺寸之游離DNA分子的第二量;及計算第一量與第二量之比。截止值可為第一截止值。第二截止值可小於第一截止值。第二量可包含具有小於第二截止值之尺寸之游離DNA分子或第二量可包含複數個游離DNA分子中之所有游離DNA分子。經標準化參數可為長游離DNA分子之頻率之量度。
在區塊6150處,可獲得對應於健康懷孕之經標準化參數之預期值的第二值。第二值可視胎兒之胎齡而定。第二值可為預期值。在一些實施例中,第二值可為與異常值有區別之截止值。
獲得第二值可包含自具有經標準化參數之校準值之關於懷孕女性量測結果之校準表獲得第二值。校準表可藉由獲得具有懷孕女性個體量測結果之關於胎齡之第一表生成。可獲得具有經標準化參數之校準值之關於胎齡之第二表。第一表及第二表中之數據可來自相同個體或不同個體。可由第一表及第二表產生具有校準值之關於量測結果之校準表。校準表可包含關於量測結果之校準值之函數。
懷孕女性個體之量測結果可為自最後一次月經期以來之時間或懷孕女性個體之影像(例如超音波)特徵。懷孕女性個體之量測結果可為懷孕女性個體之影像特徵。舉例而言,影像特徵可包含女性個體之胎兒之長度、尺寸、外貌或解剖結構。特徵可包含生物特徵量測結果,例如頂臀長度或股骨長度。可使用特定器官之外貌,包含四室心臟或脊髓上之脊椎的外貌。胎齡可由開業醫師自超音波影像確定(例如產科實踐委員會(Committee on Obstetric Practice)等人, 「用於估計到期日之方法(Methods for estimating the due date)」, 委員會觀點(Committee Opinion), 第700期, 2017年5月)。
在一些實施例中,機器學習模型可使一或多個校準數據點與影像特徵相關。模型可藉由接收複數個訓練影像來訓練。各訓練影像可來自已知無懷孕相關病症或已知不患有懷孕相關病症之女性個體。女性個體可具有一定範圍之胎齡。訓練可包含儲存來自女性個體之複數個訓練樣本。各訓練樣本可包含與訓練影像相關之經標準化參數之已知值。模型可藉由使用複數個訓練樣本基於具有經標準化參數之已知值之匹配或不匹配影像之模型的輸出最佳化模型的參數來訓練。模型之輸出可規定對應於影像之經標準化參數之值。經標準化參數之第二值可藉由將女性影像輸入機器學習模型中來生成。
在區塊6160處,可確定經標準化參數之第一值與經標準化參數之第二值之間的偏差。偏差可為分離值。
在區塊6170處,可使用偏差確定懷孕相關病症之可能性之分類。當偏差超過臨限值時,懷孕相關病症可為可能的。臨限值可指示統計學上顯著之差異。臨限值可指示10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之差異。
懷孕相關病症可包含/包括子癇前症、子宮內生長受限、侵入性胎盤形成、早產、新生兒溶血性疾病、胎盤功能不全、胎兒水腫、胎兒畸形、溶血、肝酶升高及低血小板計數(HELLP)症候群或全身性紅斑狼瘡。
IV. 針對懷孕相關病症之尺寸及末端分析
長DNA分子之尺寸及/或末端分析係用於確定子癇前症之可能性。該等方法亦可應用於其他懷孕相關病症。自四個經診斷患有子癇前症之孕婦之母體血漿樣本提取之DNA經受單分子即時(SMRT)定序(PacBio)。
圖 62為顯示四個子癇前症案例之臨床資訊的表。第一欄顯示案例編號。第二欄顯示停止血液取樣時以週為單位之胎齡。第三欄顯示胎兒性別。第四欄顯示關於子癇前症(PET)之臨床資訊。
M12804為重度子癇前症(PET)與預存在IgA腎病之案例。M12873為伴隨疊加輕度PET之慢性高血壓之案例。M12876為重度遲發型PET之案例。M12903為伴隨子宮內生長受限(IUGR)之重度遲發型PET之案例。五個血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本係用作對照以用於本揭示案中之後續分析。
對於此揭示案之四個子癇前症及所分析之五個血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本,自其經配對母體膚色血球層及胎盤樣本提取之DNA經於iScan系統(Illumina)上之Infinium Omni2.5Exome-8 Beadchip基因分型。
各樣本之血漿DNA濃度係藉由用Qubit螢光計(賽默飛世爾科技(ThermoFisher Scientific))進行之Qubit dsDNA高靈敏度分析加以定量。子癇前症案例及懷孕晚期案例之平均血漿DNA濃度分別為95.4 ng/mL(範圍為52.1-153.8 ng/mL)血漿及10.7 ng/mL(範圍為6.4-19.1 ng/mL)血漿。子癇前症案例之平均血漿DNA濃度比懷孕晚期案例之平均血漿DNA濃度高約9倍。
對於子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本,自涵蓋其中母親為同型接合的且胎兒為異型接合的資訊性單核苷酸多型性(SNP)之≤ 600 bp之DNA分子之定序數據確定的平均胎兒DNA分率分別為22.6%(範圍為16.6%-25.7%)及20.0%(範圍為15.6%-26.7%)。
A. 尺寸分析
尺寸分析係根據本揭示案中之實施例在子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本上執行。
圖 63A-63D及
圖 64A-64D顯示來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期案例之血漿DNA分子之尺寸分佈。x軸顯示尺寸。y軸顯示頻率。對於圖63A-63D,繪製x軸之在線性尺度上在0 kb至1 kb範圍內之尺寸分佈,且對於圖64A-64D,繪製x軸之在對數尺度上在0 kb至5 kb範圍內之尺寸分佈。圖63A及圖64A顯示樣本M12804。圖63B及圖64B顯示樣本M12873。圖63C及圖64C顯示樣本M12876。圖63D及圖64D顯示樣本M12903。
藍線表示來自五個血壓正常懷孕晚期案例之經綜合之所有經定序之血漿DNA分子的尺寸分佈。紅線表示來自個別子癇前症案例之經定序之血漿DNA分子的尺寸分佈。在圖63A-63D中,藍線為在200 bp下之較短峰之線及在300 bp與400 bp之間的較高峰之線。在圖64A-64D中,藍線對應於在1 kb下較高峰之線。
一般而言,子癇前症患者之血漿DNA尺寸概況短於血壓正常懷孕晚期孕婦之血漿DNA尺寸概況,其中166-bp峰之高度增加且短於166 bp之DNA分子比例增加(圖63A-63D)。此等變化在兩個重度子癇前症案例M12876及M12903中更明顯。變化在伴隨子宮內生長受限(IUGR)之子癇前症案例M12903中甚至更劇烈。
四個子癇前症血漿樣本中之三個顯示經減小之尺寸為200-5000 bp之長血漿DNA分子比例(圖64B-64D)。M12873、M12876及M12903中之> 500 bp之長血漿DNA分子比例分別為11.7%、8.9%及4.5%,而來自五個血壓正常懷孕晚期案例之綜合定序數據中之長血漿DNA分子比例為32.3%。與來自五個血壓正常懷孕晚期案例之綜合定序數據相比,來自伴隨預存在IgA腎病之重度子癇前症(PET)(M12804)之案例之血漿樣本顯示經減少之小於2000 bp之較短DNA分子比例,但顯示經增加之大於2000 bp之較長DNA分子比例(圖2A)。M12804中之長血漿DNA分子比例為34.9%。
圖 65A-65D及
圖 66A-66D顯示來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。A圖至D圖中之各者顯示不同子癇前症樣本。x軸顯示尺寸。圖65A-65D中之y軸顯示頻率且圖66A-66D中之y軸顯示累積頻率。在圖66A-66D中,尺寸為0 kb至35 kb。
各圖中之藍線表示來自五個血壓正常懷孕晚期案例之經綜合之所有經定序之涵蓋胎兒特異性等位基因之血漿DNA分子的尺寸分佈。各圖中之紅線表示來自個別子癇前症案例之經定序之涵蓋胎兒特異性等位基因之血漿DNA分子的尺寸分佈。在圖65A-65D中,藍線為在200 bp下之較短峰之線及在300 bp與400 bp之間的較高峰之線。在圖66A-66D中,藍線對應於在100 bp與1000 bp之間的較低峰之線。
圖 67A-67D及
圖 68A-68D顯示來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。A圖至D圖中之各者顯示不同子癇前症樣本。x軸顯示尺寸。圖67A-67D中之y軸顯示頻率且圖68A-68D中之y軸顯示累積頻率。在圖68A-68D中,尺寸為0 kb至35 kb。
各圖中之藍線表示來自五個血壓正常懷孕晚期案例之經綜合之所有經定序之涵蓋母體特異性等位基因之血漿DNA分子的尺寸分佈。各圖中之紅線表示來自個別子癇前症案例之經定序之涵蓋母體特異性等位基因之血漿DNA分子的尺寸分佈。在圖67A中,藍線為在200 bp下之較高峰之線及在300 bp與400 bp之間的較高峰之線。在圖67B-67D中,藍線為在200 bp下之較短峰之線。在圖68A中,藍線對應於在1000 bp與10000 bp之間的較高峰之線。在圖68B-68D中,藍線對應於在100 bp與1000 bp之間的較低峰之線。
當與血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本相比時,血漿DNA縮短現象係在四個子癇前症血漿樣本中之三個中的涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子(圖65B-65D及圖66B-66D)及涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子(圖67B-67D及圖68B-68D)兩者中觀測到。例外情況為伴隨預存在IgA腎病之重度PET之案例M12804,該案例顯示在彼等涵蓋胎兒特異性等位基因之血漿DNA分子當中經增加之小於1 kb之較短DNA分子比例及經減少之大於1 kb之較長DNA分子比例(圖65A及圖66A)。實際上,案例M12804中之涵蓋母體特異性等位基因之血漿DNA分子顯示經拉長之尺寸概況(圖67A及圖68A)。
圖 69A及
圖 69B為子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中經PacBio SMRT定序加以定序之涵蓋(A)胎兒特異性等位基因之短DNA分子及涵蓋(B)母體特異性等位基因之短DNA分子的比例圖。y軸顯示< 150 bp之短DNA片段比例。x軸顯示正常樣本及PET樣本。
在實施例中,短DNA分子之比例經定義為尺寸小於150 bp之母體血漿DNA分子百分比。M12804經排除在此分析之外,此係因為此案例具有預存在IgA腎病,但其他樣本並不具有預存在IgA腎病。當與血壓正常對照血漿樣本組相比時,子癇前症血漿樣本組顯示顯著地經增加之涵蓋胎兒特異性等位基因之短DNA分子比例(P = 0.036,威爾卡森等級和檢定(Wilcoxon rank sum test))及涵蓋母體特異性等位基因之短DNA分子比例(P = 0.036,威爾卡森等級和檢定)。
圖 70A及
圖 70B為子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中經(A)PacBio SMRT定序及(B)Illumina定序加以定序之短DNA分子的比例圖。y軸顯示< 150 bp之短DNA片段比例。
在實施例中,短DNA分子之比例經定義為尺寸小於150 bp之母體血漿DNA分子百分比。M12804經移除在此分析之外,此係因為此案例可能由於此案例中之預存在IgA腎病而顯示相較於此群組中之其他子癇前症案例而言不同的尺寸概況。當與血壓正常對照血漿樣本組(中值:12.1%;範圍:8.5%-15.8%)相比時,子癇前症血漿樣本組顯示顯著地經增加之短DNA分子比例(中值:28.0%;範圍:25.8%-35.1%)(P = 0.036,威爾卡森等級和檢定)。相反地,在先前之經受亞硫酸氫鹽轉化及Illumina定序之四個子癇前症及四個胎齡匹配之血壓正常母體血漿DNA樣本群組中,子癇前症血漿及對照血漿樣本中之短DNA分子比例並非顯著地不同(P = 0.340,威爾卡森等級和檢定)(圖70B)。
在一些實施例中,吾人可使用用於經PacBio SMRT定序加以定序之母體血漿樣本中之短DNA分子比例的20%截止值以判定孕婦是否處於罹患子癇前症之高風險或低風險下。具有高於20%之比例之短DNA分子之母體血漿樣本將經確定為處於罹患子癇前症的高風險下,而具有低於20%之比例之短DNA分子之母體血漿樣本將經確定為處於罹患子癇前症的低風險下。在使用此截止值之情況下,靈敏度及特異性兩者均為100%。在一些其他實施例中,所使用之短DNA分子之比例的截止值可包含但不限於5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%等。在另一實施例中,母體血漿樣本中之短DNA分子比例將用於監測且評估懷孕期間子癇前症的嚴重程度。
在實施例中,使用以下等式計算各樣本之指示短DNA分子與長DNA分子之相對比例的尺寸比。
其中P(50-150)指示尺寸在50 bp至150 bp範圍內之經定序之血漿DNA分子比例;且P(200-1000)指示尺寸在200 bp至1000 bp範圍內之經定序之血漿DNA分子比例。
圖 71為指示經PacBio SMRT定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之短DNA分子與長DNA分子之相對比例的尺寸比圖。y軸顯示尺寸比。x軸顯示正常樣本及PET樣本。當與血壓正常對照血漿樣本組(P = 0.016,威爾卡森等級和檢定)相比時,子癇前症血漿樣本組顯示顯著地較高之尺寸比。
在實施例中,吾人可利用由包含但不限於PacBio SMRT定序及Oxford Nanopore定序之長讀段定序平台生成之尺寸概況來預測孕婦之子癇前症發展及嚴重程度。在一些實施例中,吾人可藉由分析血漿DNA分子之尺寸概況來監測子癇前症發展及包含但不限於肝及腎損傷之重度子癇前症特點發展。在一些實施例中,分析中所使用之尺寸參數可包含但不限於短DNA分子或長DNA分子比例及指示短DNA分子與長DNA分子之相對比例的尺寸比。用於確定短DNA及長DNA類別之截止值可包含但不限於150 bp、180 bp、200 bp、250 bp、300 bp、350 bp、400 bp、450 bp、500 bp、550 bp、600 bp、650 bp、700 bp、750 bp、800 bp、850 bp、900 bp、950 bp、1 kb等。用於確定短分子與長分子之尺寸比之尺寸範圍可包含但不限於50 - 150 bp、50 - 166 bp、50 - 200 bp、200 - 400 bp、200 - 1000 bp、200 - 5000 bp或其他組合。
尺寸末端分析可包含使用用圖61中之方法6100加以描述之方法。
B. 片段末端分析
片段末端分析係根據本揭示案中之實施例在子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本上執行。沃森股及克里克股兩者之5'端處之第一核苷酸經確定用於各經定序之血漿DNA分子。T端、C端、A端及G端片段之比例經確定用於各血漿DNA樣本。
圖 72A-72D顯示經PacBio SMRT定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之血漿DNA分子的不同末端比例。x軸顯示正常懷孕晚期樣本及PET樣本。y軸顯示既定末端比例。圖72A顯示T端比例。圖72B顯示C端比例。圖72C顯示A端比例。圖72D顯示G端比例。當與血壓正常對照血漿樣本組相比時,子癇前症血漿樣本組顯示顯著地經增加之T端血漿DNA分子比例(P = 0.016,威爾卡森等級和檢定)及顯著地經減小之G端血漿DNA分子比例(P = 0.016,威爾卡森等級和檢定)。
圖 73顯示使用四種類型之片段末端(各股之5'端處之第一核苷酸),亦即C端、G端、T端及A端進行之子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。各欄指示血漿DNA樣本。第一列指示各樣本屬於哪個組,其中青色指示血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本且橙色指示子癇前症血漿DNA樣本。青色涵蓋前五欄。橙色涵蓋後四欄。
自第二列開始,各列指示片段末端之類型。根據列標準化頻率(z-分數)(亦即低於或高於整個樣本中之平均頻率之標準差數值),末端模體頻率係以一系列顏色梯度呈現。顏色愈紅,指示末端模體頻率愈高,而顏色愈藍,指示末端模體頻率愈低。基於4種類型之片段末端頻率之層級集群分析顯示子癇前症血漿DNA樣本之片段末端概況形成與血壓正常懷孕晚期血漿DNA樣本的集群不同的集群。
在實施例中,吾人可針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端之第一核苷酸(X)及第二核苷酸(Y)的二核苷酸序列。X及Y可為DNA中之四個核苷酸鹼基中的一個。存在16個可能性雙核苷酸末端模體XYNN,亦即AANN、ATNN、AGNN、ACNN、TANN、TTNN、TGNN、TCNN、GANN、GTNN、GGNN、GCNN、CANN、CTNN、CGNN及CCNN。吾人可根據本揭示案中之實施例針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端之第三核苷酸(X)及第四核苷酸(Y)的二核苷酸序列。存在16個可能性雙核苷酸NNXY模體。吾人亦可針對各經定序之DNA分子分別確定沃森股及克里克股兩者之5'端處的第一四核苷酸序列(4聚體模體)。
圖 74顯示使用16個雙核苷酸模體XYNN(5'端之第一核苷酸及第二核苷酸之二核苷酸序列)進行之子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖 75顯示使用16個雙核苷酸模體NNXY(5'端之第三核苷酸及第四核苷酸之二核苷酸序列)進行之子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖 76顯示使用256個四核苷酸模體(5'端之第一核苷酸至第四核苷酸之二核苷酸序列)進行之子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
在圖74-76中,第一列指示各樣本屬於哪個組,其中青色指示血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本且橙色指示子癇前症血漿DNA樣本。青色涵蓋前五欄。橙色涵蓋後四欄。自第二列開始,各列指示片段末端之類型。根據列標準化頻率(z-分數)(亦即低於或高於整個樣本中之平均頻率之標準差數值),末端模體頻率係以一系列顏色梯度呈現。顏色愈紅,指示末端模體頻率愈高,而顏色愈藍,指示末端模體頻率愈低。
此等結果表明,子癇前症樣本及非子癇前症樣本中之血漿DNA具有不同片段化特性。在一個實施例中,吾人可利用由包含但不限於PacBio SMRT定序及Oxford Nanopore定序之長讀段定序平台生成之末端模體概況來預測孕婦之子癇前症發展。儘管上文分析中使用單核苷酸模體、雙核苷酸模體及四核苷酸模體,但在其他實施例中可使用例如3、5、6、7、8、9、10或更長之其他長度之模體。
在一些實施例中,吾人可組合片段末端分析及起源組織分析以改善包含但不限於子癇前症之懷孕相關病況之預測、偵測及監測的效能。首先,吾人可對各母體血漿樣本執行片段末端分析以將血漿DNA分子分離成四個片段末端類別,亦即T端、C端、A端及G端片段。隨後,吾人可根據本揭示案中之實施例使用甲基化狀態匹配分析,使用來自片段末端類別中之各者之血漿DNA分子單獨地對各母體血漿DNA樣本執行起源組織分析。片段末端類別中之一個當中的不同組織之貢獻比例經定義為相對於其他組織而言經指派至對應組織之對應片段末端類別中的血漿DNA分子百分比。
吾等使用單分子即時定序分析三個及五個來自患有及不患有子癇前症之孕婦之血漿DNA樣本。吾等獲得中值658,722、889,900、851,501及607,554個具有A端、C端、G端及T端之血漿片段。對於具有A端之片段,吾等根據本揭示案中所描述之甲基化狀態匹配途徑將具有至少10個CpG位點之任何片段之甲基化模式與嗜中性白血球、T細胞、B細胞、肝及胎盤之參考甲基化概況進行比較。血漿DNA片段將經指派至對應於彼等組織當中甲基化狀態匹配之最大分數的組織。在所分析之所有樣本當中使用此方法將中值2.43%(範圍:0.73%-5.50%)之A端片段指派至T細胞(亦即T細胞貢獻)。吾等以類似方式分別進一步分析彼等具有C端、G端及T端之片段。對於彼等具有C端、G端及T端之片段,分別觀測到3.20%(範圍:1.55%-5.19%)、3.52%(範圍:1.53%-6.27%)及2.22%(0%-7.79%)之中值T細胞貢獻。
圖 77A-77D顯示子癇前症及血壓正常母體血漿DNA樣本中屬於不同片段末端類別,亦即(A)T端、(B)C端、(C)A端及(D)G端之DNA分子當中的T細胞貢獻。x軸顯示正常懷孕晚期樣本及PET樣本。y軸顯示呈百分比形式之T細胞貢獻。結果顯示,在G端片段當中,與血壓正常懷孕晚期血漿樣本相比,子癇前症血漿樣本中之T細胞貢獻顯著地減小(P = 0.036,威爾卡森等級和檢定)。在實施例中,吾人可使用母體血漿DNA樣本中之所有G端片段當中的T細胞貢獻之3%截止值以判定孕婦是否處於罹患子癇前症之高風險或低風險下。
C. 實例方法
圖 78顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法7800。生物樣本可包含來自胎兒及女性之複數個游離DNA分子。該方法可生成懷孕相關病症之可能性之分類。懷孕相關病症可為子癇前症或本文所描述之任何懷孕相關病症。
對應於複數個游離DNA分子之序列讀段可經接受。
在區塊7810處,可量測複數個游離DNA分子之尺寸。尺寸可經由對核苷酸進行排比或計數核苷酸數目或包含用圖21加以描述之本文所描述之任何技術來量測。
在區塊7820處,可識別具有大於截止值之尺寸之一組游離DNA分子。截止值可為用於長游離DNA片段之任何截止值,包含500 nt、600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、1.1 knt、1.2 knt、1.3 knt、1.4 knt、1.5 knt、1.6 knt、1.7 knt、1.8 knt、1.9 knt或2 knt。截止值可為本文所描述之用於長游離DNA分子之任何截止值。
在區塊7830處,可使用第一量生成末端模體參數之值。可量測在該組中之游離DNA分子之一或多個末端處具有第一子序列的該組中之游離DNA分子的第一量。在一些實施例中,末端模體參數可為藉由於一末端處之所有子序列之總量標準化的第一量。在一些實施例中,末端可為3'端。在一些實施例中,末端可為5'端。
第一子序列之長度可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個核苷酸。第一子序列可包含在各別游離DNA分子之末端處之最後一個核苷酸。舉例而言,第一子序列可為圖74中所示之XYNN模式。在一些實施例中,第一子序列可不包含在各別游離DNA分子之末端處之最後一個核苷酸或多個核苷酸。舉例而言,第一子序列可包含圖75之NNXY模式。
可量測在游離DNA分子之一或多個末端處具有與第一子序列不同之子序列之游離DNA分子的第二量。末端模體參數之值可使用第二量與第三量之比生成。舉例而言,可使第二量除以第三量或可使第三量除以第二量。
在區塊7840處,可將末端模體參數之值與臨限值進行比較。臨限值可為表示相對於不患有懷孕相關病症之個體之相關參數之值而言的統計學上顯著之差異的值。臨限值可自一或多個正常懷孕參考個體或一或多個患有懷孕相關病症之參考個體確定。
在一些實施例中,可將末端模體參數之值與臨限值進行比較,且可將第二末端模體參數之值與第二臨限值進行比較。可量測在游離DNA分子之一或多個末端處具有與第一子序列不同之第二子序列之游離DNA分子的第二量。因此,不同末端模體之量可經測定。第二末端模體參數之值可使用第二量生成。可將第二末端模體參數之值與第二臨限值進行比較。第二臨限值可與第一臨限值相同或不同。額外子序列可以與第一子序列及第二子序列相同之方式使用。在一些實施例中,所有可能性子序列可用於與臨限值之比較。
在區塊7850處,可使用比較確定懷孕相關病症之可能性之分類。當尺寸參數之值或末端模體參數之值超過臨限值時,懷孕相關病症可為可能的。
在一些實施例中,確定懷孕相關病症之可能性之分類可使用第二末端模體參數之值與第二截止值的比較來進行。當第一末端模體參數之值超過第一臨限值且第二末端模體參數之值超過第二臨限值時,懷孕相關病症可為可能的。
該方法可包含使用除末端模體參數之外的尺寸參數。具有在第一尺寸範圍內之尺寸之第二組游離DNA分子可經識別。第一尺寸範圍可包含大於截止值之尺寸。第一尺寸範圍包含可大於截止值之尺寸。第一尺寸範圍可小於550 nt、600 nt、650 nt、700 nt、750 nt、800 nt、850 nt、900 nt、950 nt、1 nt、1.5 knt、2 knt、3 knt、5 knt或更大。尺寸參數之值可使用第二組中之游離DNA分子之第二量生成。可將尺寸參數之值與第二臨限值進行比較。確定懷孕相關病症之可能性之分類可使用尺寸參數之值與第二臨限值的比較。當超過第一臨限值及第二臨限值中之一或兩者時,分類可能具有懷孕相關病症。
尺寸參數可為經標準化參數。舉例而言,在第二尺寸範圍內之游離DNA分子之第三量可經量測。第二尺寸範圍可包含小於第一截止值之尺寸。第二尺寸範圍可包含所有尺寸。第二尺寸範圍可包含50-150 nt、50-166 nt、50-200 nt、200-400 nt。第二尺寸範圍可包含本文所描述之用於短游離DNA片段之任何尺寸。第二尺寸範圍可排除在第一尺寸範圍內之尺寸。尺寸參數之值可藉由測定第二量與第三量之比生成。舉例而言,可使第二量除以第三量或可使第三量除以第二量。
該等量之游離DNA分子中之任一者可為來自特定起源組織之游離DNA分子。舉例而言,起源組織可為T細胞或本文所描述之另一起源組織。第二量可與用圖77A-77D加以描述之T細胞貢獻類似。起源組織之貢獻可使用如本揭示案中所描述之甲基化狀態或模式來測定。
V. 重複序列擴展相關疾病
獲自孕婦之長游離DNA片段可用於識別基因中之重複序列擴展。基因中之重複序列擴展可導致神經肌肉疾病。串聯重複序列擴展已與包含但不限於諸如X染色體脆裂症之神經退化性病症、亨汀頓氏舞蹈症及脊髓小腦失調之人類疾病相關。此等串聯重複序列擴展可出現在基因之蛋白質編碼區(馬查多-約瑟夫疾病(Machado-Joseph disease)、HRS症候群(Haw River syndrome)、亨汀頓氏舞蹈症)或非編碼區(弗里德利希運動失調(Friedrich ataxia)、肌強直性營養不良、X染色體脆裂症之一些形式)中。擴展涉及小衛星、五核苷酸、四核苷酸,且諸多三核苷酸重複序列已與脆裂位點相關。與此等疾病相關之擴展可能由複製滑動或不對稱重組或表觀遺傳畸變造成。序列中之重複序列數目係指子序列總出現次數。舉例而言,「CAGCAG」包含兩個重複序列。因為重複序列包含子序列之至少兩個實例,故重複序列數目不可為1個。子序列可應理解為重複單元。
在實施例中,於孕婦中之長游離DNA分析可促進對重複序列相關疾病之偵測。舉例而言,三核苷酸重複序列表示DNA序列中之3 bp模體之重複延伸段。一個實例為序列『CAGCAGCAG』包括三個3 bp『CAG』模體。已報導通常為三核苷酸重複序列擴展之微衛星擴展在神經病症中起關鍵作用(Kovtun等人《細胞研究(Cell Res.)》 2008;18:198-213;McMurray等人《自然評論-遺傳學(Nat Rev Genet.)》2010;11:786-99)。一個實例為
ATXN3基因中之超過55個CAG重複序列(總計165 bp)為病原性的,導致特徵在於進行性運動問題之3型脊髓小腦失調(SCA3)疾病。此病況係以體染色體顯性模式遺傳。因此,經更改基因之一個複本足以造成該病症。為了測定微衛星之重複序列數目,通常使用聚合酶鏈反應(PCR)以擴增所關注之基因體區且隨後使PCR產物經受諸如以下之多個不同技術:毛細管電泳(Lyon等人《分子診斷學期刊(J Mol Diagn.)》2010;12:505-11)、南方墨點分析(Hsiao等人《臨床實驗室分析期刊(J Clin Lab Anal.)》1999;13:188-93)、熔化曲線分析(Lim等人《分子診斷學期刊》2014;17:302-14)及質譜法(Zhang等人《分析方法(Anal Methods.)》2016;8:5039-44)。然而,此等方法為勞力密集且耗時的且難以應用於諸如產前測試之真實臨床實踐中之高通量篩檢。桑格定序(Sanger sequencing)在經由手動檢查自複雜序列痕跡推理長重複序列方面具有相當大之困難。眾所周知Illumina定序技術及Ion Torrent在對具有彼等重複序列之富GC(或貧GC)區進行定序方面具有相當大之困難(Ashely等人2016;17:507-22)且包括經擴展重複序列之DNA長度易於超過序列讀段長度(Loomis等人《基因體研究(Genome Res.)》2013;23:121-8)。
另一實例為由鄰近
DMPK基因之在50至4000個CTG重複序列範圍內之CTG重複序列擴展造成之肌強直性營養不良以及體染色體顯性病症。DM之分子診斷常規地在產前診斷中藉由在胎兒基因體DNA上以侵入性方式分析CTG數目來執行。
與短讀段定序(數百個鹼基)形成對比,本揭示案中所描述之方法能夠自母體血漿DNA獲得長DNA分子(多個千鹼基)。吾人可使用本揭示案中所描述之方法以非侵入性方式判定未出生胎兒是否自受影響母親遺傳此疾病。
圖 79顯示針對重複序列相關疾病之推斷胎兒之母體遺傳之圖示。在階段7905,孕婦體內之游離DNA經受單分子即時(例如PacBio SMRT)定序。在階段7910,根據本揭示案將經定序結果劃分成長DNA及短DNA類別。在階段7915,存在於長DNA分子中之等位基因資訊可用於構築母體單倍型,亦即Hap I及Hap II。Hap I及Hap II可各自包含三核苷酸子序列(例如CTG)之經擴展重複序列。在階段7920,可分析單倍型之不平衡,與如用圖16加以描述類似。在階段7925,可推斷胎兒之母體遺傳。根據本揭示案,本文所描述之方法允許吾等不僅確定單倍型(例如Hap I及Hap II),且亦使用長DNA分子之序列資訊確定哪個單倍型具有造成病症之經擴展重複序列(例如受影響Hap I)。在此實例中,吾人可根據本文所描述之方法使用分佈在整個母體Hap I及Hap II中之短DNA分子之計數、尺寸或甲基化狀態來判定胎兒是否遺傳母體Hap I(受影響)或Hap II(未受影響)。
圖 80顯示針對重複序列相關疾病之推斷胎兒之父體遺傳之圖示。吾人可使用孕婦體內之游離DNA判定胎兒是否遺傳受影響父體單倍型。如圖80中所示,其丈夫受重複序列擴展疾病影響(例如70個CTG重複序列)之未受影響孕婦體內之游離DNA(例如對於Hap I而言5個CTG重複序列及對於Hap II而言6個CTG重複序列)經受PacBio SMRT定序,經定序之長DNA分子經識別且用於確定單倍型及重複序列數目。若具有CTG重複序列(在此實例中例如為70個CTG重複序列)之長延伸段之單倍型存在於未受影響孕婦之母體血漿中,則表明胎兒遺傳受影響父體單倍型。在一些實施例中,含有經擴展重複序列之DNA亦攜載一或多個不存在於母體基因體中之另一父體特異性等位基因。此情形將適用於確認父體遺傳。
在另一實施例中,吾人可使用孕婦體內之游離DNA判定胎兒是否遺傳受影響父體單倍型。如圖80中所示,其丈夫受重複序列擴展疾病影響(例如70個CTG重複序列)之未受影響孕婦體內之游離DNA(例如對於Hap I而言5個CTG重複序列及對於Hap II而言6個CTG重複序列)經受PacBio SMRT定序,經定序之長DNA分子經識別且用於確定單倍型及重複序列數目。若具有CTG重複序列(在此實例中例如為70個CTG重複序列)之長延伸段之單倍型存在於未受影響孕婦之母體血漿中,則表明胎兒遺傳受影響父體單倍型。在一些實施例中,含有經擴展重複序列之DNA亦攜載一或多個不存在於母體基因體中之另一父體特異性等位基因。此情形將適用於確認父體遺傳。
圖 81、
圖 82及
圖 83為顯示重複序列擴展疾病之實例之表。第一欄顯示重複序列擴展相關疾病。第二欄顯示重複子序列。第三欄顯示正常個體中之重複序列數目。第四欄顯示患病個體中之重複序列數目。第五欄顯示與重複序列相關之遺傳位置。第六欄列舉基因名稱。第七欄列舉遺傳模式。表來源於omicslab.genetics.ac.cn/dred/index.php。
A. 重複序列擴展偵測之實例
據報導,父體遺傳之經擴展CAG重複序列可在母體血漿中使用直接途徑藉由PCR加以偵測且在3130XL遺傳分析器上進行後續片段分析(Oever等人《產前診斷(Prenat Diagn.)》2015;35:945-9)。針對亨汀頓之非侵入性產前測試可藉由PCR達成,此係因為經擴展等位基因之尺寸僅自> 35個三核苷酸重複序列[亦即跨重複序列之長度為105 bp(35 × 3)或更高之DNA區]起始。尤其針對大部分三核苷酸重複序列病症之許多經擴展重複序列(Orr等人《神經科學年度評論(Annu. Rev. Neurosci.)》2007;30:575-621)將涉及超出記錄在先前報導中之短胎兒DNA分子之尺寸的長度為300 bp或更高之重複序列。具有大經擴展重複序列之DNA將造成PCR困難(Orr等人《神經科學年度評論》2007;30:575-621)。如Oever等人之研究所表明,與較小重複序列之信號強度相比,長CAG重複序列之信號強度常常低得多,且此現象係在基因體DNA及血漿DNA兩者中觀測到,產生用於偵測彼等長CAG重複序列之較低靈敏度(Oever等人《產前診斷》2015;35:945-9)。PCR之另一限制將在於在擴增期間不能夠保存甲基化信號。在一個實施例中,長DNA分子之單分子即時定序將允許確定一或多個區中之串聯重複序列多型性及其相關甲基化程度。
圖 84為顯示胎兒中之重複序列擴展偵測及重複序列相關甲基化確定之實例的表。第一欄顯示多個鹼基對中之重複序列類型。第二欄顯示重複單元。第三欄顯示基因體位置。第四欄顯示參考鹼基,亦即存在於人類參考基因體中之序列。第五欄顯示父體基因型。第六欄顯示母體基因型。第七欄顯示胎兒基因型。第八欄顯示與父體等位基因有關之胎兒DNA甲基化程度。第九欄顯示與母體等位基因有關之胎兒DNA甲基化程度。
圖84顯示1 bp、2 bp、3 bp及4 bp串聯重複序列之多個實例。舉例而言,在chr3:192384705-192384706之基因體位置處識別「GATA」串聯重複序列。此基因座處之父親之基因型為T(GATA)
3/T(GATA)
5,其中等位基因1具有3個重複單元且等位基因2具有5個重複單元。與參考等位基因T(GATA)
3相比,父體等位基因2表明涉及重複序列擴展之遺傳事件。此基因座處之母親之基因型為T/T,展現涉及重複序列收縮之遺傳事件。此基因座處之胎兒基因型為T(GATA)
5/T,表明胎兒遺傳父體等位基因2(亦即T(GATA)
5)及母體等位基因T。與父體等位基因及母體等位基因相關之甲基化程度分別為50.98%及62.8%。此等結果表明,串聯重複序列多型性之使用將允許確定胎兒之母體及父體遺傳。此技術將允許識別與兩個等位基因相關之不同甲基化模式。另一實例顯示在chr4:73237157-73237158之基因體位置處,胎兒已自母親遺傳重複序列擴展[(TAAA)
3]。與含有父體等位基因之胎兒分子之甲基化程度(62.84%)相比,含有自母親遺傳之重複序列擴展之胎兒分子顯示較高甲基化程度(95.65%)。此等數據表明,吾等可偵測重複序列、重複序列結構及相關甲基化變化。在一個實施例中,吾人可使用特定截止值以判定母體遺傳與父體遺傳之間的甲基化差異是否顯著。截止值將為大於但不限於5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%等之甲基化程度中之絕對差值。母體遺傳之確定可與用圖21之方法2100所描述之方法類似。
B. 實例方法
子序列重複序列可用於確定胎兒資訊。舉例而言,子序列重複序列之存在可用於確定分子係胎兒起源。另外,子序列重複序列可指示遺傳病症之可能性。子序列重複序列可用於確定母體及/或父體單倍型之遺傳。另外,胎兒之親緣可使用子序列重複序列來確定。
1. 使用子序列重複序列進行之胎兒起源分析
圖 85顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法8500,生物樣本包含來自胎兒及女性之游離DNA分子。胎兒之遺傳病症之可能性可經確定。
在區塊8510處,可接收對應於該等游離DNA分子中之一游離DNA分子之第一序列讀段。游離DNA分子可具有大於截止值之長度。截止值可大於或等於200 nt。截止值可為至少500 nt,包含600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、1.1 knt、1.2 knt、1.3 knt、1.4 knt、1.5 knt、1.6 knt、1.7 knt、1.8 knt、1.9 knt或2 knt。截止值可為本文所描述之用於長游離DNA分子之任何截止值。
在步驟8520處,可將第一序列讀段與參考基因體之區進行排比。已知該區可潛在地包含子序列之重複序列。該區可對應於圖81-83中之位置或基因中之任一者。子序列可為三核苷酸序列,包含本文所描述之任何三核苷酸序列。
在區塊8530處,可識別對應於游離DNA分子之第一序列讀段中之子序列之重複序列的數目。
在區塊8540處,可將子序列之重複序列之數目與臨限數目進行比較。臨限數目可為55、60、75、100、150或更多個。對於不同遺傳病症,臨限數目可為不同的。舉例而言,臨限值可反映患病個體中之重複序列之最小數目、正常個體中之重複序列之最大數目或此兩個數目之間的數目(參見圖81-83)。
在區塊8550處,可使用重複序列數目與臨限數目之比較來確定胎兒患有遺傳病症之可能性之分類。當重複序列數目超過臨限數目時,胎兒可經確定為可能患有遺傳病症。遺傳病症可為X染色體脆裂症或圖81-83中所列之任何病症。
在一些實施例中,該方法可包含重複數個不同目標基因座之分類,已知各目標基因座潛在地具有子序列之重複序列。可接收對應於游離DNA分子之複數個序列讀段。可將複數個序列讀段與參考基因體之複數個區進行排比。已知複數個區可潛在地包含子序列之重複序列。複數個區可為非重疊區。複數個區中之各區可具有不同SNP。複數個區可來自不同染色體臂或染色體。複數個區可涵蓋至少0.01%、0.1%或1%參考基因體。可識別複數個序列讀段中之子序列之重複序列的數目。可將子序列之重複序列的數目與複數個臨限數目進行比較。各臨限數目可指示不同遺傳病症之存在或可能性。對於複數種遺傳病症中之各者,可使用與該複數個臨限數目中之一臨限數目之比較來確定胎兒患有各別遺傳病症的可能性的分類。
游離DNA分子可經確定係胎兒起源。胎兒起源之確定可包含接收對應於獲自女性懷孕前之膚色血球層或樣本之母體起源之游離DNA分子的第二序列讀段。可將第二序列讀段與參考基因體之該區進行排比。可識別第二序列讀段中之子序列之第二數目個重複序列。可確定第二數目個重複序列少於第一數目個重複序列。
胎兒起源之確定可包含使用游離DNA分子之甲基化位點及未甲基化位點確定游離DNA分子之甲基化程度。可將甲基化程度與參考程度進行比較。該方法可包含確定甲基化程度超過參考程度。甲基化程度可為甲基化位點之數目或比例。
胎兒起源之確定可包含確定游離分子之複數個位點之甲基化模式。可藉由比較甲基化模式與來自母體或胎兒組織之參考模式來確定類似性分數。可將類似性分數與一或多個臨限值進行比較。類似性分數可為本文所描述之任何類似性分數,包含例如如用方法4000加以描述之類似性分數。
2. 使用子序列重複序列進行之親緣分析
圖 86顯示分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法8600,生物樣本包含來自胎兒及女性之游離DNA分子。生物樣本可經分析以確定胎兒之父親。
在區塊8610處,可接收對應於游離DNA分子中之一游離DNA分子之第一序列讀段。該方法可包含確定游離DNA分子係胎兒起源。游離DNA分子可藉由本文所描述之任何方法經確定係胎兒起源,該任何方法包含例如如用方法8500加以描述之方法。游離DNA分子可具有大於截止值之尺寸。截止值可大於或等於200 nt。截止值可為至少500 nt,包含600 nt、700 nt、800 nt、900 nt、1 knt、1.1 knt、1.2 knt、1.3 knt、1.4 knt、1.5 knt、1.6 knt、1.7 knt、1.8 knt、1.9 knt或2 knt。截止值可為本文所描述之用於長游離DNA分子之任何截止值。
在區塊8620處,可將第一序列讀段與參考基因體之第一區進行排比。已知第一區可具有子序列之重複序列。
在區塊8630處,可識別對應於游離DNA分子之第一序列讀段中之第一子序列之第一數目個重複序列。第一子序列可包含等位基因。
在區塊8640處,可分析獲自男性個體之序列數據以判定第一子序列之第二數目個重複序列是否存在於第一區中。第二數目個重複序列包含第一子序列之至少兩個實例。序列數據可藉由自男性個體提取生物樣本且在生物樣本中之DNA上執行定序來獲得。
在區塊8650處,可使用第一子序列之第二數目個重複序列是否存在之判定來確定男性個體為胎兒之父親的可能性的分類。該分類可為當判定第一子序列之第二數目個重複序列存在時男性個體可能為父親。該分類可為當判定第一子序列之第二數目個重複序列不存在時男性個體可能不為父親。
該方法可包含比較第一數目個重複序列與第二數目個重複序列。確定男性個體為父親之可能性之分類可包含使用第一數目個重複序列與第二數目個重複序列之比較。該分類可為當第一數目個重複序列係在第二數目個重複序列之臨限值內時男性個體可能為父親。臨限值可在第二數目個重複序列之10%、20%、30%或40%內。
該方法可包含使用重複序列之多個區。舉例而言,游離DNA分子為第一游離DNA分子。該方法可包含接收對應於該等游離DNA分子中之第二游離DNA分子之第二序列讀段。該方法亦可包含將第二序列讀段與參考基因體之第二區進行排比。該方法可進一步包含識別對應於第二游離DNA分子之第二序列讀段中之第二子序列之第一數目個重複序列。該方法可包含分析獲自男性個體之序列數據以判定第二子序列之第二數目個重複序列是否存在於第二區中。確定男性個體為胎兒之父親之可能性之分類可進一步包含使用第二子序列之第二數目個重複序列是否存在於第二區中的判定。可能性之分類可為在男性個體之序列數據中當重複序列存在於第一區及第二區兩者中時男性個體為胎兒之父親之可能性較高。
VI. 用於富集長血漿DNA分子之尺寸選擇
在實施例中,吾人可在分析(例如單分子即時定序)之前以物理方式選擇具有一或多個期望尺寸範圍之DNA分子。作為一實例,尺寸選擇可使用固相可逆固定技術來執行。在其他實施例中,尺寸選擇可使用電泳(例如使用Coastal Genomic系統或Pippin尺寸選擇系統)來執行。吾等途徑與主要聚焦於較短DNA之先前操作不同(Li等人《美國醫學會期刊(JAMA)》 2005; 293: 843-9),本領域中眾所周知胎兒DNA短於母體DNA(Chan等人《臨床化學》 2004; 50: 88-92)。
尺寸選擇技術可應用於本文所描述之方法中之任一種且用於本文所描述之任何尺寸。舉例而言,游離DNA分子可藉由電泳、磁珠、雜交、免疫沈澱、擴增或CRISPR來富集。所得經富集樣本可具有比富集前生物樣本大之濃度或高之比例的特定尺寸片段。
A. 用電泳進行之尺寸選擇
在實施例中,利用DNA之電泳移動率係視DNA尺寸而定,吾人可使用基於凝膠電泳之途徑來選擇目標DNA分子,該等目標DNA分子具有期望尺寸範圍,例如但不限於≥ 100 bp、≥ 200 bp、≥ 300 bp、≥ 400 bp、≥ 500 bp、≥ 600 bp、≥ 700 bp、≥ 800 bp、≥ 900 bp、≥ 1 kb、≥ 2 kb、≥ 3 kb、≥ 4 kb、≥ 5 kb、≥ 6 kb、≥ 7 kb、≥ 8 kb、≥ 9 kb、≥ 10 kb、≥ 20 kb、≥ 30 kb、≥ 40 kb、≥ 50 kb、≥ 60 kb、≥ 70 kb、≥ 80 kb、≥ 90 kb、≥ 100 kb、≥ 200 kb;或其他尺寸範圍,包含大於本文所描述之任何截止值之尺寸。舉例而言,使用LightBench(Coastal Genomics)自動化凝膠電泳系統以用於DNA尺寸選擇。原則上,在凝膠電泳期間較短DNA將比較長DNA移動地更快。吾等將此尺寸選擇技術應用於一個血漿DNA樣本(M13190),旨在選擇大於500 bp之DNA分子。吾等使用具有『通道內過濾器』(ICF)收集裝置之3%尺寸選擇卡匣及具有內部尺寸標記之負載緩衝器以用於尺寸選擇。將DNA文庫負載至凝膠中且開始電泳。當達到目標尺寸時,自ICF檢索< 500 bp之第一部分。恢復運作且允許完成電泳以獲得≥ 500 bp之第二部分。吾等使用單分子即時定序(PacBio)來對分子尺寸≥ 500 bp之第二部分進行定序。吾等獲得1,434個高品質環形共同序列(CCS)(亦即1,434個分子)。其中,97.9%經定序分子大於500 bp。大於500 bp之DNA分子之此類比例比不經尺寸選擇之對應DNA分子之比例(10.6%)高得多。彼等分子之總甲基化經確定為75.5%。
圖 87顯示在(I)分子I及(II)分子II中進行尺寸選擇之後兩個代表性血漿DNA分子之甲基化模式。分子I(chr21:40,881,731-40,882,812)長1.1 kb,具有25個CpG位點。使用吾等先前揭示案(美國申請案第16/995,607號)中所描述之途徑確定分子I之單分子甲基化程度(亦即甲基化位點數目除以位點總數)為72.0%。分子II(chr12:63,108,065-63,111,674)長3.6 kb,具有34個CpG位點。分子II之單分子甲基化程度經確定為94.1%。此表明基於尺寸選擇之甲基化分析允許吾人有效地分析長DNA分子之甲基化且比較兩個或更多個分子之間的甲基化狀態。
B. 用珠粒進行之尺寸選擇
固相可逆固定技術視DNA分子尺寸而使用順磁珠來選擇性結合核酸。此類珠粒包含聚苯乙烯核、磁鐵礦及經羧酸酯改質之聚合物塗層。DNA分子將在存在聚乙二醇(PEG)及鹽之情況下視反應中之PEG及鹽濃度而定選擇性結合至珠粒。PEG使得帶負電DNA在珠粒表面上與羧基結合,該帶負電DNA係在存在磁場之情況下經收集。具有期望尺寸之分子係使用例如10 mM Tris-HCl、pH 8緩衝劑或水之溶離緩衝劑自磁珠溶離。PEG與DNA之體積比將確定吾人可獲得之DNA分子之尺寸。PEG:DNA之比愈低,將保留在珠粒上之長分子愈多。
1.
樣本處理
來自兩個懷孕晚期孕婦之周邊血液樣本係在EDTA血液管中經收集。收集周邊血液樣本,且在4℃下在1,600 ×
g下離心10分鐘。在4℃下在16,000 ×
g下進一步離心血漿部分10分鐘以移除殘餘細胞及碎屑。在室溫下在5,000 ×
g下離心膚色血球層部分5分鐘以移除殘餘血漿。在分娩(delivery)之後立即收集胎盤組織。使用QIAamp循環核酸套組(凱傑(Qiagen))執行血漿DNA提取。使用QIAamp DNA小型套組(凱傑)執行膚色血球層及胎盤組織DNA提取。
2. 血漿DNA尺寸選擇
將提取後血漿DNA樣本劃分成兩個等分試樣。來自各患者之一個等分試樣經受用AMPure XP SPRI珠粒(貝克曼庫爾特有限公司(Beckman Coulter, Inc.))進行之尺寸選擇。使50 μL各經提取血漿DNA樣本與25 μL AMPureXP溶液充分混合且在室溫下培育5分鐘。用磁鐵將珠粒與溶液分隔開且用180 μL 80%乙醇洗滌。隨後,使珠粒再懸浮於50 μL水中且渦旋1分鐘以自珠粒溶離經尺寸選擇之DNA。隨後,移除珠粒以獲得經尺寸選擇之DNA溶液。
3. 單核苷酸多型性識別
用iScan系統(Illumina)對胎兒基因體DNA樣本及母體基因體DNA樣本進行基因分型。辨認單核苷酸多型性(SNP)。將胎盤之基因型與母親之基因型進行比較以識別胎兒特異性等位基因及母體特異性等位基因。胎兒特異性等位基因經定義為存在於胎兒基因體中但不存在於母體基因體中之等位基因。在一個實施例中,彼等胎兒特異性等位基因可藉由分析其中母親為同型接合的且胎兒為異型接合的彼等SNP位點來確定。母體特異性等位基因係由存在於母體基因體中但不存在於胎兒基因體中之等位基因定義。在一個實施例中,彼等胎兒特異性等位基因可藉由分析其中母親為異型接合的且胎兒為同型接合的彼等SNP位點來確定。
4. 單分子即時定序
使用SMRTbell模板製備套組1.0-SPv3(太平洋生物科學)使兩個經尺寸選擇之樣本以及其對應未經選擇樣本經受單分子即時(SMRT)定序模板構築。用1.8 × AMPure PB珠粒純化DNA,且使用TapeStation儀器(安捷倫(Agilent))估計文庫尺寸。用SMRT Link 5.1.0版軟體(太平洋生物科學)計算定序引子黏合及聚合酶結合條件。簡言之,使定序引子v3黏合至定序模板,且隨後使用Sequel結合及內部控制套組2.1(太平洋生物科學)使聚合酶結合至模板。在Sequel SMRT細胞1M v2上執行定序。在Sequel系統上用Sequel定序套組2.1(太平洋生物科學)收集定序影片20小時。
5. 尺寸分析
圖 88為經尺寸選擇之樣本及不經尺寸選擇之樣本的定序資訊表。第一欄為樣本識別符。第二欄列舉樣本組—無論是否存在尺寸選擇。第三欄列舉經定序分子數目。第四欄列舉平均子讀段深度。第五欄列舉中值片段尺寸。第六欄顯示大於或等於500 bp之片段比例。
吾等分析兩個經基於珠粒之尺寸選擇及不經基於珠粒之尺寸選擇的樣本(299及300)。如圖88中所示,對於不經尺寸選擇之樣本299及300,吾等使用單分子即時定序(例如PacBio SMRT定序)分別獲得250萬及310萬個經定序分子。平均子讀段深度為91×及67×。中值片段尺寸為176 bp及512 bp。
對於經旨在選擇≥ 500 bp之DNA片段之基於固相可逆固定之尺寸選擇的經配對樣本(B299及B300),吾等分別獲得410萬及200萬個經定序分子,其中平均子讀段深度為18×及19×。對於樣本B299及B300,發現中值片段尺寸分別為2.5 kb及2.2 kb。平均片段尺寸比不經尺寸選擇之對應樣本長4至14倍。在尺寸選擇之後≥ 500 bp之片段比例對於樣本B299而言自27.3%增加至97.6%且對於樣本B300而言自50.5%增加至97.4%。
圖 89A及
圖 89B顯示經基於珠粒之尺寸選擇及不經基於珠粒之尺寸選擇的來自懷孕女性之DNA樣本之尺寸分佈。圖89A顯示樣本299,且圖89B顯示樣本300。x軸顯示片段尺寸。y軸顯示在對數尺度上各片段尺寸之頻率。在基於珠粒之尺寸選擇之後,較高頻率存在於整個DNA樣本中之大於1 kb之長DNA分子中。此等數據表明,基於珠粒之尺寸選擇可富集更多長DNA分子以用於下游分析。該富集將經由最大化每個定序運作之經定序之長DNA分子數目來使分析更具成本效益。當分析各DNA分子之起源組織時,長DNA分子之該富集亦將改善資訊性,此係因為將存在更多各血漿DNA分子之可接近CpG位點以用於甲基化模式匹配分析。在一個實施例中,可使用美國申請案第16/995,607號中所描述之方法執行甲基化分析。經尺寸選擇之樣本中保存核小體模式,表明經尺寸選擇之血漿DNA分子將適合於研究核小體結構。
對於樣本299,吾等使用微陣列技術(Infinium Omni2.5)獲得用於母體膚色血球層DNA及胎盤DNA之基因型資訊。根據基因型資訊將經定序之血漿DNA分子分為母體特異性DNA分子及胎兒特異性DNA分子。
圖 90A及
圖 90B顯示胎兒特異性DNA分子與母體特異性DNA分子之間的尺寸分佈。尺寸示於x軸上。在圖90A中,頻率示於y軸上。在圖90B中,累積頻率示於y軸上。在圖90A中,與母體DNA尺寸分佈相比,胎兒DNA尺寸分佈顯示相對較小分子中之較高頻率。在圖90B中,胎兒DNA分子之該尺寸縮小示於累積頻率圖中,亦即胎兒DNA累積尺寸分佈位於母體DNA累積尺寸分佈之左側。
C. 增強經尺寸選擇之血漿DNA之資訊性.
在實施例中,資訊性SNP可由含有對胎兒或母體基因體具有特異性之等位基因之彼等SNP定義。彼等SNP提供用於區分胎兒DNA分子與母體DNA分子之手段。吾等識別419,539種資訊性SNP。在其他實施例中,資訊性SNP可由母體基因體中之彼等異型接合SNP定義。在其他實施例中,資訊性SNP可由母體基因體中之彼等異型接合且以單倍型形式分組在一起之SNP定義。
圖 91為經尺寸選擇之樣本與不經尺寸選擇之樣本之間的攜載資訊性SNP之血漿DNA分子的數目統計表。第一欄顯示樣本識別及群組。第二欄顯示所分析之血漿DNA分子總數。第三欄顯示攜載資訊性SNP之血漿DNA分子數目。第四欄顯示攜載資訊性SNP之血漿DNA分子百分比。
如圖91中所示,不經尺寸選擇之樣本中僅存在6.5%攜載資訊性SNP之血漿DNA分子,而攜載資訊性SNP之血漿DNA分子比例增加至20.6%。因此,利用尺寸選擇將極大地改善適用於本揭示案中存在之效用之長DNA分子的產量。吾等在不經尺寸選擇之樣本299中識別260個> 500 bp之胎兒DNA分子,而在經尺寸選擇之樣本B299中識別918個> 500 bp之胎兒DNA分子。藉由標準化定序通量,此等數據表明,在藉由利用基於珠粒之尺寸選擇獲得> 500 bp之胎兒特異性DNA分子中存在約3倍富集。吾等經由尺寸選擇將實質上增加用於分析之長胎兒DNA分子數目。
D. 甲基化
圖 92為經尺寸選擇之血漿DNA樣本及非經尺寸選擇之血漿DNA樣本中之甲基化程度表。第一欄顯示樣本識別。第二欄顯示群組。第三欄顯示甲基化CpG位點數目。第四欄顯示未甲基化CpG位點數目。第五欄顯示基於甲基化位點及總位點數目之甲基化程度。如圖92中所示,與對應非經尺寸選擇之樣本相比,經尺寸選擇之樣本中之總甲基化程度顯示為較高(在所有CpG位點中,對於樣本299及B299為71.5%對69.1%;對於樣本300及B300為71.4%對69.3%)。
圖 93為母體或胎兒特異性游離DNA分子中之甲基化程度表。第一欄顯示樣本識別。第二欄顯示群組。第三欄顯示甲基化CpG位點數目。第四欄顯示未甲基化CpG位點數目。第五欄顯示基於甲基化位點及總位點數目之甲基化程度。
如圖93中所示,當與不經尺寸選擇之樣本相比時,亦在經尺寸選擇之樣本中之胎兒特異性血漿DNA分子及母體特異性血漿DNA分子兩者中觀測到甲基化程度增加。在經尺寸選擇之樣本及非經尺寸選擇之樣本兩者中之血漿中,與母體特異性DNA分子相比,彼等胎兒特異性片段傾向於為低甲基化的。
E. 末端模體
圖 94為經尺寸選擇之樣本及不經尺寸選擇之樣本中之前10個末端模體的表。第一欄顯示等級。第二欄至第五欄係用於不經尺寸選擇之樣本。第六欄至第九欄係用於經尺寸選擇之樣本。第二列列舉樣本識別。第二欄、第四欄、第六欄及第八欄列舉末端模體。第三欄、第五欄、第七欄及第九欄列舉末端模體頻率。
如圖94中所示,不經尺寸選擇之藉由單分子即時定序加以定序之血漿DNA分子展現優先以C起始之末端模體,表明核酸酶DNASE1L3之裂解記號(Han等人, 《美國人類遺傳學期刊》 2020; 106: 202-214)。相比之下,對於彼等經尺寸選擇之樣本,藉由單分子即時定序加以定序之血漿DNA攜載主要以A或G起始之末端模體,表明核酸酶DFFB之裂解記號(Han等人, 《美國人類遺傳學期刊》 2020; 106: 202-214)。此等數據表明,尺寸選擇將允許吾人選擇性富集來源於游離DNA片段化中之不同酶過程之血漿DNA分子。該選擇性靶向將可用於與一或多種核酸酶之異常含量相關之病症的分析、偵測或監測中。在一個實施例中,血漿DNA之尺寸選擇將增強監測DFFB活性或DFFB介導之DNA降解動力學之效能。
在一些實施例中,結合至富集長血漿DNA之珠粒之DNA及保留在富集短血漿DNA之上清液中之DNA經定序。長DNA將可用於構築單倍型資訊。短血漿DNA將可用於監測DNASE1L3活性。在實施例中,吾人將執行長DNA分子及短DNA分子之協同合併分析。舉例而言,將短DNA血漿DNA與母體單倍型(亦即Hap I及Hap II)進行排比,一個展現更多短DNA及/或更多低甲基化及/或相對較高劑量之母體單倍型相較於另一單倍型而言將可能為胎兒所遺傳。
在一些實施例中,尺寸選擇可基於但不限於基於凝膠電泳之技術,諸如PippinHT DNA尺寸選擇、BluePippin DNA尺寸選擇、Pippin Prep DNA尺寸選擇系統、SageELF全樣本份化系統、Pippin Pulse電泳、SageHLS HMW文庫系統等。
F. 長血漿DNA分子增強起源組織分析之效能
圖 95為顯示長血漿DNA分子增強起源組織分析之效能之接收者操作特徵(ROC)圖。y軸顯示靈敏度。x軸顯示特異性。不同線顯示不同尺寸片段之結果。具有最高曲線下面積(AUC)之紅線係用於大於3,000 bp之片段。
如圖95中所示,當區分孕婦血漿中之胎兒DNA分子與母體DNA分子時,根據本揭示案中之實施例,基於長血漿DNA分子(例如> 3000 bp)之效能(AUC:0.94)比彼等基於諸如以下之相對短DNA分子之分析高得多:100-200 bp(AUC:0.66)及200-500 bp(AUC:0.67)。此等數據表明,長血漿DNA之使用將極大地增強區分胎兒DNA分子與母體DNA分子之準確度,因此在以非侵入性方式確定胎兒遺傳方面產生較高效能。
VII. 用於母體血漿DNA之長DNA分析之奈米孔定序
除使用單分子即時定序技術之外,可使用奈米孔定序以對來自母體血漿之長游離DNA片段進行定序。甲基化及SNP資訊可改善長游離DNA片段之奈米孔定序的準確度。
圖 96顯示獲自孕婦之血漿DNA之奈米孔定序的原理,其中核酸序列係當單個DNA分子穿過奈米尺寸之孔隙時自整個膜中之離子電流變化推理而來。此類孔隙可例如但不限於由蛋白質(例如α溶血素、氣單胞菌溶素(aerolysin)及包皮垢分枝桿菌孔蛋白A(
Mycobacterium smegmatisporin A,MspA))或合成材料(諸如矽或石墨烯)產生(Magi等人, 《生物資訊學簡報(Brief Bioinform.)》2018;19:1256-1272)。在實施例中,雙股血漿DNA分子經受末端修復過程。此類過程將血漿DNA轉化成鈍端DNA,接著添加A尾。如圖96中所示,各自攜載馬達蛋白(亦即馬達轉接子)之序列轉接子接合至血漿DNA分子之任一末端。定序過程係在馬達蛋白鬆解雙股DNA時開始,使得第一股能夠穿過奈米孔。當DNA股穿過奈米孔時,感測器量測視序列情形及相關鹼基修飾而定之隨時間推移之離子電流變化(pA)(稱作1D讀段)。在其他實施例中,髮夾序列轉接子將用於使第一股及互補股共價繫栓在一起。在定序期間,雙股DNA分子之一股經定序,接著互補股(稱作1D
2或2D讀段)經定序,此等舉動可潛在地改善定序準確度。原始電流信號係用於鹼基辨認及鹼基修飾分析。在其他實施例中,鹼基辨認及鹼基修飾分析係藉助於例如但不限於遞回類神經網路(RNN)或隱藏馬可夫模型(HMM)之機器學習途徑進行。在本揭示案中,吾等呈現用於使用奈米孔定序表徵血漿DNA分子之特性之方法,該等特性包含但不限於分子計數、鹼基組成、分子尺寸、末端模體及鹼基修飾。
出於說明之目的,吾等使用奈米孔定序(牛津奈米孔科技)來對38週胎齡之孕婦之三個母體血漿DNA樣本(M12970、M12985及M12969)進行定序。使用接合定序套組(牛津奈米孔)使自4 mL母體血漿提取之血漿DNA經受文庫製備。簡言之,用FFPE修復混合物(NEB)修復DNA,隨後用NEBNext末端製備模組(NEB)進行末端修復且加A尾。隨後,將轉接子混合物添加至經修復DNA中且與鈍性/TA主混合物接合。在用AMPure XP珠粒(貝克曼(Beckman))清潔之後,使經轉接子接合之文庫與定序緩衝劑及負載珠粒混合,且負載至PromethION R9流量槽上。在PromethION beta裝置(牛津奈米孔)上對流量槽進行定序64小時。
A. 排比
使用Minimap2將經定序讀段與人類參考基因體(hg19)進行排比(Li H, 《生物資訊學》2018;34(18):3094-3100)。在一些實施例中,BLASR(Mark J Chaisson等人, 《BMC生物資訊學》2012; 13: 238)、BLAST(Altschul SF等人, 《分子生物學期刊(J Mol Biol.)》 1990;215(3):403-410)、BLAT(Kent WJ, 《基因體研究》2002;12(4):656-664)、BWA (Li H等人, 《生物資訊學》2010;26(5):589-595)、NGMLR(Sedlazeck FJ等人, 《自然-方法》2018;15(6):461-468)及LAST(Kielbasa SM等人, 《基因體研究》 2011;21(3):487-493)可用於將經定序讀段與參考基因體進行排比。對於樣本M12970、M12985及M12969,吾等分別獲得1131萬、1230萬及2128萬個經定序分子。其中,經定位片段數目分別為367萬、263萬及433萬個。
B. 尺寸及甲基化
藉由奈米孔定序確定之血漿DNA分子之核苷酸數目係用於推斷彼DNA分子之尺寸。DNA分子之電流信號可用於確定鹼基修飾。在實施例中,各CpG位點之甲基化狀態係藉由開源軟體Nanopolish確定(Simpson等人, 《自然-方法》2017;14:407-410)。在另一實施例中,甲基化狀態可藉由使用包含但不限於以下之其他軟體確定:DeepMod(Liu等人, 《自然-通訊》2019;10:2449)、Tomo(Stoiber等人, BioRxiv.2017:p.094672)、DeepSignal (Ni等人, 《生物資訊學》2019;35:4586-4595)、Guppy(github.com/nanoporetech)、Megalodon(github.com/nanoporetech/megalodon)等。
圖 97為在特定尺寸範圍內之血漿DNA分子百分比及其對應甲基化程度的表。顯示三個樣本:M12970、M12985及M12969。第一欄顯示片段尺寸。第二欄顯示彼片段尺寸之片段數目。第三欄顯示該片段尺寸之頻率。第四欄顯示該片段尺寸之甲基化CpG位點數目。第五欄顯示該片段尺寸之未甲基化CpG位點數目。第六欄顯示呈百分比形式之甲基化程度。
如圖97中所示,對於樣本M12970、M12985及M12969,尺寸≥ 500 bp之DNA分子比例分別為16.6%、7.6%及12.6%。尺寸≥ 500 bp之DNA分子比例比藉由Illumina定序生成之數據(0.2%)高得多。對於樣本M12970、M12985及M12969,尺寸≥ 500 bp之DNA分子之甲基化程度分別為64.12%、65.05%及63.30%。另外,具有更多長血漿DNA之群體中之甲基化程度增加。作為一實例,對於樣本M12970,尺寸≥ 2000 bp之彼等分子中之甲基化程度為70.7%,該甲基化程度相對於尺寸≥ 500 bp之分子而言等效於10.3%甲基化程度增加。亦在樣本M12985及M12969中觀測到具有更多長DNA之群體中之類似增加趨勢。具有不同尺寸之血漿DNA分子將反映向血液循環中貢獻游離DNA之不同路徑,該等路徑諸如但不限於衰老、細胞凋亡、壞死、主動分泌等。長DNA分子之甲基化狀態將進一步允許吾人推理彼等長DNA分子之起源組織。因此,長DNA分子片段化模式及甲基化模式之合併分析將允許吾人推理特定器官之衰老、細胞凋亡、壞死及主動分泌的相對比率。藉由不同路徑進行之游離DNA生成之相對比率將反映諸如懷孕、子癇前症、早產、子宮內生長受限等之基礎病理生理學病況。
圖 98為跨不同尺寸之尺寸分佈及甲基化模式圖。尺寸示於x軸上。頻率示於y軸左側上。甲基化程度示於y軸右側上。尺寸分佈(頻率)數據顯示為黑線。所示甲基化程度顯示為黃線。
圖98顯示跨不同片段尺寸之尺寸分佈及甲基化程度。尺寸分佈具有在164 bp、313 bp及473 bp下之多個峰,其中平均間隔為154 bp。該等尺寸分佈模式暗示核酸酶裂解之核小體,表明血漿DNA片段化之非隨機過程可藉由奈米孔定序識別。與基於Illumina定序數據之具有在166 bp下之主峰之血漿DNA尺寸模式形成對比,主峰係在380 bp下。此等數據指示奈米孔定序將富集更多長DNA片段。血漿DNA之奈米孔定序之此類特徵將特別適用於偵測難以藉由短讀段定序技術解析之彼等變異體。在實施例中,奈米孔定序將可用於分析三聯體重複序列擴展。三核苷酸重複序列數目將用於預測諸如X染色體脆裂症、亨汀頓氏舞蹈症、脊髓小腦失調、肌強直性營養不良及弗里德利希氏運動失調之三核苷酸重複序列病症的發展、嚴重程度及發作年齡。圖98亦顯示根據不同尺寸變化之甲基化程度。一系列甲基化峰值與尺寸分佈中之峰一致。
C. 胎兒DNA及母體DNA
吾等藉由使用iScan平台(Illumina)對自母體膚色血球層及胎盤提取之DNA進行基因分型來識別中值204,410種資訊性SNP(範圍:199,420 – 205,597),其中母親為同型接合(AA)且胎兒為異型接合(AB)的,該等資訊性SNP係用於確定胎兒特異性等位基因(B)及共有等位基因(A)。
圖 99為使用奈米孔定序測定之胎兒DNA分率的表。第一欄顯示樣本識別符。第二欄顯示攜載共有等位基因之分子數目。第三欄顯示攜載胎兒特異性等位基因之分子數目。第四欄顯示藉由第三欄中之值乘以二且除以第二欄及第三欄之總和來計算之胎兒DNA分率。如圖99中所示,對於樣本M12970、M12985及M12969,吾等分別識別84,911、52,059及95,273個攜載共有等位基因之分子以及17,776、7,385及17,007個攜載胎兒特異性等位基因之分子。對於樣本M12970、M12985及M12969,胎兒DNA分率分別經測定為34.6%、24.9%及30.3%。另外,吾等識別中值212,330種資訊性SNP(範圍:210,411 – 214,744),其中母親為異型接合(AB)且胎兒為同型接合(AA)的,該等資訊性SNP係用於確定母體特異性等位基因(B)。對於樣本M12970、M12985及M12969,吾等分別識別65,349、34,017及65,481個攜載共有等位基因之分子以及43,594、26,704及48,337個攜載母體特異性等位基因之分子。
圖 100為胎兒特異性DNA分子與母體特異性DNA分子之間的甲基化程度表。第一欄顯示樣本識別符。第二欄、第三欄及第四欄顯示胎兒特異性DNA之結果。第五欄、第六欄及第七欄顯示母體特異性DNA之結果。第二欄及第五欄顯示甲基化CpG位點數目。第三欄及第六欄顯示未甲基化CpG位點數目。第四欄及第七欄顯示基於甲基化位點之百分比之甲基化程度。
根據本揭示案中之實施例,確定用於各胎兒特異性DNA分子之甲基化模式。如圖100中所示,對於樣本M12970、M12985及M12969,經確定為甲基化之經定序CpG位點比例(亦即總甲基化程度)分別將為62.43%、62.39%及61.48%。胎兒特異性DNA之該等總甲基化程度比母體特異性DNA之對應總甲基化程度平均低8%。此等結果表明,吾人將能夠根據本揭示案中之實施例使用奈米孔定序結果基於胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的差異甲基化模式來區分胎兒DNA分子與母體DNA分子。
圖 101為在特定尺寸範圍內之血漿DNA分子百分比及其對應之胎兒DNA分子及母體DNA分子甲基化程度的表。顯示三個樣本:M12970、M12985及M12969。第一欄顯示片段尺寸。第二欄至第六欄顯示胎兒特異性DNA之結果。第七欄至第十一欄顯示母體特異性DNA之結果。第二欄及第七欄顯示彼片段尺寸之片段數目。第三欄及第八欄顯示該片段尺寸之頻率。第四欄及第九欄顯示該片段尺寸之甲基化CpG位點數目。第五欄及第十欄顯示該片段尺寸之未甲基化CpG位點數目。第六欄及第十一欄顯示呈百分比形式之甲基化程度。
如圖101中所見,分析具有包含但不限於≥ 500 bp、≥ 600 bp、≥ 1000 bp及≥ 2000 bp之不同尺寸範圍之胎兒特異性DNA分子及母體特異性DNA分子的特性。與母體DNA分子相比,吾等獲得相對較小比例之尺寸大於1 kb之胎兒DNA分子。然而,孕婦血漿中之該等長胎兒DNA分子(例如≥ 1000 bp)之量(範圍:4.9%-9.3%)顯著地高於Illumina定序之預期值(<0.2%)。該等長胎兒DNA片段不易於在諸如Illumina定序平台(例如但不限於MiSeq、NextSeq、HiSeq、NovaSeq等)之習知短讀段定序技術中經披露,此係因為DNA文庫之插入尺寸限於小於550 bp(例如Illumina NextSeq系統,support.illumina.com/sequencing/sequencing_instruments/nextseq-550/questions.html)。在實施例中,長胎兒DNA片段及母體DNA片段之包含但不限於尺寸及甲基化概況之分析可提供用於評估不同疾病之新型工具。舉例而言,DNASE1L3缺乏症造成單基因性全身性紅斑狼瘡。該DNASE1L3缺乏症將導致更多長DNA分子之生成(Chan等人, 《美國人類遺傳學期刊》2020;107:882-894)。因此,本文所描述之實施例將尤其對在懷孕期間監測彼等患者之疾病嚴重程度且藉由分析彼等長DNA分子之特徵評估未出生胎兒是否將受同一病況影響敏感。
圖 102A及
圖 102B為藉由奈米孔定序確定之胎兒DNA分子及母體DNA分子之尺寸分佈圖。片段尺寸示於x軸上。頻率在圖102A中在線性尺度中示於y軸上且在圖102B中在對數尺度中示於y軸上。母體DNA係用藍線顯示。胎兒DNA係用紅線顯示。
如圖102A及圖102B中所示,在Illumina短讀段定序平台中,母體DNA分子及胎兒DNA分子兩者均含有比先前報導數目(Lo等人, 《科學轉化醫學》 2020;2:61ra91)多之長DNA分子。此等結果表明,藉由奈米孔定序進行之血漿DNA分析披露之前並未瞭解之游離DNA之一組新特徵。該等特徵可用於非侵入性產前測試中。
D. 用於確定胎兒DNA分子及母體DNA分子之經改善準確度
因為奈米孔定序將伴有較高定序誤差(在~5%與40%之間)(Goodwin等人, 《基因體研究》 2015;25:1750-1756),故其可能會造成基於SNP基因型資訊之胎兒DNA分子及母體DNA分子的不準確分類。在實施例中,吾人可使用兩種或更多種資訊性SNP來對片段進行評分且判定彼片段是否來源於胎盤。舉例而言,對於攜載其中母親為同型接合(AA)且胎兒為異型接合(AB)的兩種資訊性SNP之片段,僅當兩種資訊性SNP均支持此類片段源自胎兒之結論時,其將經確定係胎兒起源。類似地,對於攜載兩種資訊性SNP之片段,僅當兩種資訊性SNP均支持此類片段源自母親時,其將經確定係母體起源。
圖 103為顯示基於單種資訊性SNP及兩種資訊性SNP之胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的甲基化程度差異的圖式。y軸顯示胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的呈百分比形式之甲基化程度差異。x軸顯示針對甲基化程度差異之使用單種資訊性SNP對使用兩種資訊性SNP。
如圖103中所示,使用兩種資訊性SNP來區分胎兒DNA分子與母體DNA分子,胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的甲基化程度差異比基於一種資訊性SNP之結果大得多。胎兒特異性分子與母體特異性分子之間的平均甲基化程度差異自5.4%增加至11.3%,此等效於109%增量。此等結果表明,多種SNP之使用將極大地改善區分胎兒特異性DNA分子與母體特異性DNA分子之準確度。
圖 104為胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的甲基化程度差異表。第一欄顯示樣本識別符。第二欄、第三欄及第四欄顯示胎兒特異性DNA之結果。第五欄、第六欄及第七欄顯示母體特異性DNA之結果。第二欄及第五欄顯示甲基化CpG位點數目。第三欄及第六欄顯示未甲基化CpG位點數目。第四欄及第七欄顯示基於甲基化位點之百分比之甲基化程度。
如圖104中所見,胎兒特異性DNA之該等總甲基化程度比母體特異性DNA之對應總甲基化程度平均低16.3%。在實施例中,甲基化信號之使用繼而將增強胎兒DNA及母體DNA分類之準確度。舉例而言,對於攜載推定胎兒特異性等位基因之片段,當彼片段之甲基化程度經測定為低於臨限值時,此類片段將具有較高之來源於胎兒之可能性。此類臨限值可為但不限於60%、50%、40%、30%、20%、10%等。對於攜載推定母體特異性等位基因之片段,當彼片段之甲基化程度經測定為高於臨限值時,此類片段將具有較高之來源於母親之可能性。此類臨限值可為但不限於90%、80%、70%、60%、50%、40%等。
在一些其他實施例中,將要求資訊性SNP總數為至少例如但不限於3、4、5、6、7、8、9、10種等。將要求支持源自胎兒之片段之資訊性SNP數目為至少例如但不限於3、4、5、6、7、8、9、10種等。將要求支持源自母親之片段之資訊性SNP數目為至少例如但不限於3、4、5、6、7、8、9、10種等。在實施例中,將要求支持源自胎兒之片段之資訊性SNP百分比達到例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之特定臨限值。將要求支持源自母親之片段之資訊性SNP百分比達到例如1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%之特定臨限值。
在一些其他實施例中,吾人可環化血漿DNA分子,接著進行滾環式擴增。經擴增DNA可藉由奈米孔定序加以定序,因此模板DNA資訊可經定序多次。共同序列可自經重複定序之資訊推斷而來。
VIII. 實例系統
圖 105繪示根據本揭示案之一實施例之量測系統10500。如所示之系統在分析裝置10510內包含諸如游離DNA分子之樣本10505,其中可在樣本10505上執行分析10508。舉例而言,樣本10505可與分析10508之試劑接觸以得到物理特徵10515之信號。分析裝置之實例可為包含分析之探針及/或引子或其中移動小滴之管(其中小滴包含分析)的流量槽。藉由偵測器10520來偵測來自樣本之物理特徵10515(例如螢光強度、電壓或電流)。偵測器10520可按間隔(例如週期性間隔)進行量測以獲得構成數據信號之數據點。在一個實施例中,類比-數位轉換器在複數個時間將來自偵測器之類比信號轉換成數位形式。分析裝置10510及偵測器10520可形成分析系統,例如根據本文所描述之實施例執行定序之定序系統。將數據信號10525自偵測器10520發送至邏輯系統10530。作為一實例,數據信號10525可用於確定DNA分子之參考基因體中之序列及/或位置。數據信號10525可包含在同一時間作出之各種量測結果,例如用於樣本10505之不同分子之螢光染料的不同顏色或不同電信號,且因此數據信號10525可對應於多個信號。數據信號10525可儲存於區域記憶體10535、外部記憶體10540或儲存裝置10545中。
邏輯系統10530可為或可包含電腦系統、ASIC、微處理器、圖形處理單元(GPU)等。其亦可包含或耦接顯示器(例如監測器、LED顯示器等)及使用者輸入裝置(例如滑鼠、鍵盤、按鈕等)。邏輯系統10530及其他組件可為獨立的或網路連接之電腦系統的一部分,或其可直接連接至包含偵測器10520及/或分析裝置10510之裝置(例如定序裝置)或併入其中。邏輯系統10530亦可包含在處理器10550中實行之軟體。邏輯系統10530可包含電腦可讀媒體,該電腦可讀媒體儲存用於控制量測系統10500以執行本文所描述之方法中之任一種的指令。舉例而言,邏輯系統10530可向包含分析裝置10510之系統提供命令,使得定序或其他物理操作得以執行。該等物理操作可以特定次序執行,例如以特定次序添加及移除試劑。該等物理操作可藉由如可用於獲得樣本且執行分析之例如包含機械手臂之機器人系統執行。
量測系統10500亦可包含可向個體提供治療之治療裝置10560。治療裝置10560可確定治療且/或用於執行治療。該治療之實例可包含手術、放射線療法、化學療法、免疫療法、靶向療法、激素療法及幹細胞移植體。邏輯系統10530可連接至治療裝置10560,例如以得到本文所描述之方法之結果。治療裝置可自諸如成像裝置及使用者輸入之其他裝置接收輸入(例如以控制治療,諸如對機器人系統進行控制)。
本文所提及之電腦系統中之任一者可利用任何合適數目個子系統。該等子系統之實例示於電腦系統10之圖106中。在一些實施例中,電腦系統包含單一電腦裝置,其中子系統可為電腦裝置之組件。在其他實施例中,電腦系統可包含具有內部組件之多個電腦設備,該多個電腦設備各自為子系統。電腦系統可包含桌上型及膝上型電腦、平板電腦、移動電話及其他移動裝置。
圖 106中所示之子系統經由系統匯流排75互連。顯示額外子系統,諸如列印機74、鍵盤78、一或多個儲存裝置79、與顯示配接器82耦接之監測器76(例如顯示螢幕,諸如LED)及其他裝置。耦接至I/O控制器71之周邊設備及輸入/輸出(I/O)裝置可藉由任何數目個本領域中已知之構件,諸如輸入/輸出(I/O)埠77(例如USB,FireWire
®)連接至電腦系統。舉例而言,I/O埠77或外部介面81(例如乙太網路(Ethernet)、Wi-Fi等)可用於連接電腦系統10與諸如網際網路之廣域網路、滑鼠輸入裝置或掃描儀。經由系統匯流排75進行之互連可允許中央處理器73與各子系統通信且允許控制來自系統記憶體72或一或多個儲存裝置79(例如諸如硬驅動機之固定磁碟或光碟)之複數個指令的實行以及子系統之間的資訊交換。系統記憶體72及/或一或多個儲存裝置79可實施電腦可讀媒體。另一子系統為諸如攝影機、麥克風、加速計及其類似裝置之數據收集裝置85。本文所提及之數據中之任一者可自一個組件輸出至另一組件且可輸出至使用者。
電腦系統可包含複數個相同組件或子系統,該複數個相同組件或子系統例如藉由外部介面81、藉由內部介面或經由可自一個組件至另一組件連接且移除之可移除儲存裝置連接在一起。在一些實施例中,電腦系統、子系統或設備可經網路通信。在此等情況下,可將一個電腦視為用戶端且將另一電腦視為伺服器,其中各者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器可各自包含多個系統、子系統或組件。
實施例之態樣可以控制邏輯形式使用硬體電路(例如特殊應用積體電路或場可程式化閘陣列)且/或使用具有大體上可程式化處理器之電腦軟體以模組化或整合式方式來實施。如本文所使用,處理器可包含單核處理器、同一積體晶片上之多核處理器或單電路板上或網路化之多處理單元以及專用硬體。基於本揭示案及本文所提供之教示內容,本領域中一般熟習此項技術者應知曉且瞭解使用硬體及硬體與軟體之組合來實施本揭示案之實施例的其他方式及/或方法。
本申請案中所描述之軟體組件或功能中之任一者可以軟體代碼形式來實施,該軟體代碼待使用例如習知或物件導向技術使用任何合適之電腦語言(諸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift)或手稿語言(諸如Perl或Python)由處理器執行。軟體代碼可儲存為電腦可讀媒體上之一系列指令或命令以用於儲存及/或傳輸。合適之非暫時性電腦可讀媒體可包含隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、磁性媒體(諸如硬驅動機或軟磁碟)或光學媒體(諸如密閉磁碟(CD)或數位光碟(DVD)或藍光光碟)、快閃記憶體及其類似裝置。電腦可讀媒體可為該等儲存或傳輸裝置之任何組合。
該等程式亦可使用適於經由符合各種協定之有線、光學及/或無線網路(包含網際網路)傳輸之載波信號來加以編碼及傳輸。因此,電腦可讀媒體可使用以該等程式編碼之數據信號創建。以程式碼編碼之電腦可讀媒體可與相容裝置一起封裝或與其他裝置分開提供(例如經由網際網路下載)。任何該等電腦可讀媒體可駐存於單一電腦產品(例如硬驅動機、CD或整個電腦系統)之上或之內,且可存在於系統或網路內之不同電腦產品之上或之內。電腦系統可包含用於向使用者提供本文所提及之結果中之任一者的監測器、列印機或其他合適顯示器。
本文所描述之方法中之任一種可完全或部分地用電腦系統來執行,該電腦系統包含可經組態以執行步驟之一或多個處理器。因此,實施例可針對經組態以執行本文所描述之方法中之任一種之步驟的電腦系統,其中潛在地,不同組件執行各別步驟或各別步驟組。儘管以經編號步驟形式呈現,但本文方法之步驟可在相同時間或在不同時間或按邏輯上可能之不同次序執行。另外,此等步驟之部分可與其他方法之其他步驟之部分一起使用。此外,步驟之全部或部分可為視情況選用的。另外,該等方法中之任一種之步驟中之任一個可用用於執行此等步驟之系統的模組、單元、電路或其他構件來執行。
如本領域中熟習此項技術者在閱讀本揭示案之時將顯而易見,本文所描述且說明之個別實施例中之各者具有離散組件及特點,該等離散組件及特點可在不脫離本揭示案之範疇或精神之情況下易於與其他數個實施例中之任一個的特點分離或組合。
本揭示案之例示性實施例之上述描述已出於說明及描述之目的呈現且經闡述以便向本領域中一般熟習此項技術者提供如何製作且使用本揭示案之實施例的完整揭示內容及描述。其既不意欲為窮盡性的或將本揭示案限於所描述之精確形式,其亦不意欲表示實驗為所執行之所有或唯一實驗。儘管已出於清楚理解起見,藉助於說明及實例相當詳細地描述本揭示案,但本領域中一般熟習此項技術者依據本揭示案之教示內容容易地顯而易見,可在不脫離所附申請專利範圍之精神或範疇之情況下對其作出某些改變及修改。
因此,先前僅僅說明本發明之原理。應瞭解,本領域中熟習此項技術者將能夠設計各種配置,儘管並未在本文中明確地加以描述或顯示,但該等配置實施本發明之原理且包含於其精神及範疇內。此外,本文所敍述之所有實例及條件性語言皆主要意欲輔助讀者理解本揭示案之原理為但不限於該等經特定地敍述之實例及條件。此外,本文中敍述本發明之原理、態樣及實施例以及其具體實例之所有陳述皆意欲涵蓋其結構等效物及功能等效物兩者。另外,希望該等等效物包含當前已知之等效物及未來研發之等效物,亦即不管結構如何,執行相同功能之所研發之任何元素。因此,本發明之範疇不意欲限於本文所顯示且描述之例示性實施例。相反地,本發明之範疇及精神係藉由所附申請專利範圍體現。
除非相反地特定指示,否則「一(a/an)」或「該/該等」之敍述意欲意謂「一或多個」。除非相反地特定指示,否則「或」之使用意欲意謂「包含性地或」而非「排他性地或」。提及「第一」組件不必要求提供第二組件。此外,除非明確陳述,否則提及「第一」或「第二」組件不會將所提及組件限於特定位置。術語「基於」意欲意謂「至少部分地基於」。
申請專利範圍可經擬定以排除可為視情況選用的任何元素。因此,此陳述意欲與對所主張元素之敍述結合充當諸如「僅僅(solely)」、「僅(only)」及其類似術語之排他性術語使用或意欲充當「否定性」限制使用的前提基礎。
本文所提及之所有專利、專利申請案、公開案及描述皆出於所有目的特此以全文引用之方式併入,如同各個別公開案或專利經特定地且個別地指示為以引用之方式併入一般;且以引用之方式併入本文中以結合所引用之公開案揭示且描述方法及/或材料。不承認任一者為先前技術。
10:電腦系統
71:I/O控制器
72:系統記憶體
73:中央處理器
74:列印機
75:系統匯流排
76:監測器
77:I/O埠
78:鍵盤
79:一或多個儲存裝置
81:外部介面
82:顯示配接器
85:數據收集裝置
1605:階段
1610:階段
1615:階段
1620:階段
1625:階段
2000:方法
2010:區塊
2100:方法
2105:區塊
2110:區塊
2115:區塊
2120:區塊
2125:區塊
2130:區塊
2135:區塊
2140:區塊
2145:區塊
4000:方法
4010:區塊
4020:區塊
4030:區塊
4040:區塊
4050:區塊
4060:區塊
4070:步驟
6000:方法
6020:區塊
6030:區塊
6040:區塊
6050:區塊
6060:區塊
6100:方法
6120:區塊
6130:區塊
6140:區塊
6150:區塊
6160:區塊
6170:區塊
7800:方法
7810:區塊
7820:區塊
7830:區塊
7840:區塊
7850:區塊
7905:階段
7910:階段
7915:階段
7920:階段
7925:階段
8500:方法
8510:區塊
8520:步驟
8530:區塊
8540:區塊
8550:區塊
8600:方法
8610:區塊
8620:區塊
8630:區塊
8640:區塊
8650:區塊
10500:量測系統
10505:樣本
10508:分析
10510:分析裝置
10515:物理特徵
10520:偵測器
10525:數據信號
10530:邏輯系統
10535:區域記憶體
10540:外部記憶體
10545:儲存裝置
10550:處理器
10560:治療裝置
圖1A及圖1B顯示根據本發明實施例之經確定之游離DNA的尺寸分佈。(A)在線性尺度上之0-20 kb,(B)在對數尺度上之0-20 kb。
圖2A及圖2B顯示根據本發明實施例之經確定之游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-5 kb。(B)y軸之在對數尺度上之0-5 kb。
圖3A及圖3B顯示根據本發明實施例之經確定之游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-400 bp。(B)y軸之在對數尺度上之0-400 bp。
圖4A及圖4B顯示根據本發明實施例之經確定之於攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-20 kb bp。(B)y軸之在對數尺度上之0-20 kb。藍線指示攜載共有等位基因之片段(主要係母體起源)且紅線指示攜載胎兒特異性等位基因之片段(係胎盤起源)。
圖5A及圖5B顯示根據本發明實施例之經確定之於攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-5 kb bp。(B)y軸之在對數尺度上之0-5 kb。藍線指示攜載共有等位基因之片段(主要係母體起源)且紅線指示攜載胎兒特異性等位基因之片段(係胎盤起源)。
圖6A及圖6B顯示根據本發明實施例之經確定之於攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-1 kb。(B)y軸之在對數尺度上之0-1 kb。藍線指示攜載共有等位基因之片段(主要係母體起源)且紅線指示攜載胎兒特異性等位基因之片段(係胎盤起源)。
圖7A及圖7B顯示根據本發明實施例之經確定之於攜載共有等位基因之片段(共有)與攜載胎兒特異性等位基因之片段(胎兒特異性)之間的游離DNA的尺寸分佈。(A)y軸之在線性尺度上之0-400 bp。(B)y軸之在對數尺度上之0-400 bp。藍線指示攜載共有等位基因之片段(主要係母體起源)且紅線指示攜載胎兒特異性等位基因之片段(係胎盤起源)。
圖8顯示根據本發明實施例之於攜載母體特異性等位基因之片段與攜載胎兒特異性等位基因之片段之間的單分子雙股DNA甲基化程度。
圖9A及圖9B顯示根據本發明實施例之(A)於攜載母體特異性等位基因之片段與攜載胎兒特異性等位基因之片段之間的單分子雙股DNA甲基化程度的經擬合分佈及(B)使用單分子雙股DNA甲基化程度進行之接收者操作特徵(ROC)分析。
圖10A及圖10B顯示根據本發明實施例之單分子雙股DNA甲基化程度與血漿DNA之片段尺寸之間的相關性。(A)0-20 kb之尺寸範圍。(B)0-1 kb之尺寸範圍。
圖11A及圖11B顯示根據本發明實施例之孕婦母體血漿DNA中之經識別之長胎兒特異性DNA分子的實例。(A)黑條柱指示與人類參考基因體之染色體10中之區排比之長胎兒特異性DNA分子。(B)本揭示案之使用PacBio定序確定之遺傳及表觀遺傳之詳細圖示。以黃色突出顯示之鹼基(由箭頭標記)可能歸因於序列誤差,該序列誤差在一些實施例中可經校正。
圖12A及圖12B顯示根據本發明實施例之孕婦母體血漿DNA中之經識別之攜載共有等位基因之長母體DNA分子的實例。(A)黑條柱指示與人類參考物之染色體6中之區排比之長母體特異性DNA分子。(B)根據本發明實施例之使用PacBio定序確定之遺傳及表觀遺傳資訊之詳細圖示。
圖13顯示根據本發明實施例之根據甲基化程度在1 kb至20 kb之不同解析度下之來自胎盤之DNA(紅色)及來自母體血球之DNA(藍色)的頻率分佈。
圖14A及圖14B顯示根據本發明實施例之根據甲基化程度在16-kb及24-kb窗口內之來自胎盤之DNA(紅色)及來自母體血球之DNA(藍色)的頻率分佈。
圖15A及圖15B顯示根據本發明實施例之孕婦母體血漿DNA中之經識別之長母體特異性DNA分子的實例。(A)黑條柱指示與人類參考物之染色體8中之區排比之長母體特異性DNA分子。(B)根據本發明實施例之使用PacBio定序確定之遺傳及表觀遺傳之詳細圖示。
圖16顯示根據本發明實施例之推斷胎兒之母體遺傳圖示。
圖17繪示根據本發明實施例之用母體起源及胎兒起源資訊進行之於血漿DNA分子中之遺傳/表觀遺傳病症確定。
圖18繪示根據本發明實施例之胎兒異常片段之識別。
圖19A-19G顯示根據本發明實施例之使用PacBio定序進行之游離DNA基因分型的誤差校正圖示。『.』表示與沃森股(Watson strand)中之參考鹼基相同之鹼基。『,』表示與克里克股(Crick strand)中之參考鹼基相同之鹼基。『字母』表示與參考等位基因不同之替代性等位基因。『*』表示插入。『^』表示缺失。
圖20顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法。
圖21顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便確定單倍型遺傳的方法。
圖22顯示根據本發明實施例之用於確定血漿中之長DNA分子之起源組織的甲基化模式。
圖23顯示根據本發明實施例之用於確定胎兒起源及母體起源之接收者操作特徵(ROC)曲線。
圖24顯示根據本發明實施例之成對甲基化模式。
圖25為根據本發明實施例之不同染色體當中之經選擇標記區的分佈表。
圖26為根據本發明實施例之基於血漿DNA分子之單分子甲基化模式使用錯配分數大於0.3之膚色血球層DNA分子之不同百分比作為標記區之選擇準則進行的血漿DNA分子的分類表。
圖27顯示根據本發明實施例之以非侵入性方式使用胎盤特異性甲基化單倍型確定胎兒遺傳的方法流程。
圖28繪示根據本發明實施例之使用母體血漿中之長游離DNA進行之X染色體脆裂症(fragile X syndrome)之非侵入性產前偵測的原理。
圖29繪示根據本發明實施例之基於甲基化模式之胎兒之母體遺傳。
圖30繪示根據本發明實施例之使用血漿DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊進行之針對胎兒之母體遺傳的定性分析。
圖31繪示根據本發明實施例之相較於相對單倍型劑量(RHDO)分析而言使用血漿DNA分子之遺傳及表觀遺傳資訊以全基因體方式進行之針對胎兒之母體遺傳的定性分析的偵測率。
圖32顯示根據本發明實施例之以全基因體方式進行之父體特異性變異體之偵測率與用於分析之具有不同尺寸之經定序血漿DNA分子的數目之間的關係。
圖33顯示根據本發明實施例之X染色體脆裂症之非侵入性偵測的工作流。
圖34顯示根據本發明實施例之相較於胎盤及膚色血球層DNA之甲基化概況而言之血漿DNA的甲基化模式。
圖35為根據本發明實施例之顯示在整個人類基因體中之500-bp區中之CpG位點分佈的表。
圖36為根據本發明實施例之顯示在整個人類基因體中之1-kb區中之CpG位點分佈的表。
圖37為根據本發明實施例之顯示在整個人類基因體中之3-kb區中之CpG位點分佈的表。
圖38為根據本發明實施例之顯示使用甲基化狀態匹配分析之母體血漿中不同組織對DNA分子的貢獻比例的表。
圖39A及圖39B顯示根據本發明實施例之藉由SNP途徑推斷之胎盤貢獻與胎兒DNA分率之間的關係。
圖40顯示根據本發明實施例之使用甲基化模式分析來分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便確定起源組織的方法。
圖41A及圖41B顯示根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿樣本之游離DNA分子的尺寸分佈。
圖42為根據本發明實施例之顯示不同孕期之長血漿DNA分子之比例的表。
圖43A及圖43B顯示根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。
圖44A及圖44B顯示根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈。
圖45為根據本發明實施例之不同孕期之長胎兒及母體血漿DNA分子的比例表。
圖46A、圖46B及圖46C顯示根據本發明實施例之跨不同孕期之特定尺寸範圍之胎兒特異性血漿DNA片段的比例圖。
圖47A、圖47B及圖47C顯示根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之跨0 kb至3 kb之片段尺寸範圍之游離DNA分子之5'端處的鹼基含量比例圖。
圖48為根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之短及長游離DNA分子當中之末端核苷酸鹼基比例表。
圖49為根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之涵蓋胎兒特異性等位基因之短及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例表。
圖50為根據本發明實施例之來自懷孕初期、中期及晚期母體血漿之涵蓋母體特異性等位基因之短及長游離DNA分子當中的末端核苷酸鹼基比例表。
圖51繪示根據本發明實施例之使用256個末端模體進行之短及長血漿游離DNA分子之層級集群分析。
圖52A及圖52B顯示根據本發明實施例之4聚體末端模體概況之主成分分析。
圖53為根據本發明實施例之來自懷孕初期母體血漿之短血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖54為根據本發明實施例之來自懷孕中期母體血漿之短血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖55為根據本發明實施例之來自懷孕晚期母體血漿之短血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖56為根據本發明實施例之來自懷孕初期母體血漿之長血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖57為根據本發明實施例之來自懷孕中期母體血漿之長血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖58為根據本發明實施例之來自懷孕晚期母體血漿之長血漿DNA分子當中之具有最高頻率的25個末端模體的表。
圖59A、圖59B及圖59C顯示根據本發明實施例之(A)懷孕初期、(B)懷孕中期及(C)懷孕晚期母體血漿中之短及長血漿DNA分子當中的16個NNXY模體的模體頻率散佈圖。
圖60顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便確定胎齡的方法。
圖61顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便分類懷孕相關病症之可能性的方法。
圖62為根據本發明實施例之顯示四種子癇前症病例之臨床資訊的表。
圖63A-63D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之游離DNA分子的尺寸分佈圖。
圖64A-64D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之游離DNA分子的尺寸分佈圖。
圖65A-65D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈圖。
圖66A-66D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋胎兒特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈圖。
圖67A-67D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈圖。
圖68A-68D為根據本發明實施例之來自子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿樣本之涵蓋母體特異性等位基因之DNA分子的尺寸分佈圖。
圖69A及圖69B為根據本發明實施例之經PacBio SMRT定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之涵蓋胎兒特異性等位基因及母體特異性等位基因的短DNA分子的比例圖。
圖70A及圖70B為根據本發明實施例之經PacBio SMRT定序及Illumina定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之短DNA分子的比例圖。
圖71為根據本發明實施例之指示經PacBio SMRT定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之短及長DNA分子的相對比例的尺寸比率圖。
圖72A-72D顯示根據本發明實施例之經PacBio SMRT定序加以定序之子癇前症及血壓正常母體血漿樣本中之血漿DNA分子的不同末端的比例。
圖73顯示根據本發明實施例之使用具有四種類型之片段末端(各股之5'端處之第一核苷酸),亦即C端、G端、T端及A端中之各者的血漿DNA分子的頻率進行的子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖74顯示根據本發明實施例之使用16個雙核苷酸模體XYNN(來自5'端之第一核苷酸及第二核苷酸之二核苷酸序列)進行的子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖75顯示根據本發明實施例之使用16個雙核苷酸模體NNXY(來自5'端之第三核苷酸及第四核苷酸之二核苷酸序列)進行的子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖76顯示根據本發明實施例之使用256個四核苷酸模體(來自5'端之第一核苷酸至第四核苷酸之二核苷酸序列)進行的子癇前症及血壓正常懷孕晚期母體血漿DNA樣本的層級集群分析。
圖77A-77D顯示根據本發明實施例之子癇前症及血壓正常母體血漿DNA樣本中之四種類型之片段末端當中的T細胞貢獻。
圖78顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以確定懷孕相關病症之可能性的方法。
圖79顯示根據本發明實施例之推斷胎兒之重複序列相關疾病之母體遺傳的圖示。
圖80顯示根據本發明實施例之推斷胎兒之重複序列相關疾病之父體遺傳的圖示。
圖81、圖82及圖83為顯示重複序列擴展疾病之實例之表。
圖84為根據本發明實施例之顯示於胎兒中之重複序列擴展偵測及重複序列相關甲基化確定之實例的表。
圖85顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便確定胎兒之遺傳病症可能性的方法。
圖86顯示根據本發明實施例之分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本以便確定親緣的方法。
圖87顯示用於尺寸選擇之後的兩個代表性血漿DNA分子的甲基化模式。
圖88為根據本發明實施例之經尺寸選擇之樣本及不經尺寸選擇之樣本的定序資訊表。
圖89A及圖89B顯示根據本發明實施例之經基於珠粒之尺寸選擇之樣本及不經基於珠粒之尺寸選擇之樣本的血漿DNA尺寸概況的圖式。
圖90A及圖90B顯示根據本發明實施例之經尺寸選擇之樣本中之胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的尺寸概況。
圖91為根據本發明實施例之經尺寸選擇之樣本與不經尺寸選擇之樣本之間的攜載資訊性SNP的血漿DNA分子的數目統計表。
圖92為根據本發明實施例之經尺寸選擇之血漿DNA樣本及非經尺寸選擇之血漿DNA樣本中的甲基化程度表。
圖93為根據本發明實施例之母體或胎兒特異性游離DNA分子中之甲基化程度表。
圖94為根據本發明實施例之經尺寸選擇之樣本及不經尺寸選擇之樣本中之前10個末端模體的表。
圖95為根據本發明實施例之顯示長血漿DNA分子增強起源組織效能分析之接收者操作特徵(ROC)圖。
圖96繪示根據本發明實施例之用於血漿DNA分子之機場定序(airport sequencing)的原理。
圖97為根據本發明實施例之在特定尺寸範圍內之血漿DNA分子百分比及其對應甲基化程度的表。
圖98為根據本發明實施例之跨不同尺寸之尺寸分佈及甲基化模式的圖式。
圖99為根據本發明實施例之使用奈米孔定序確定之胎兒DNA分率的表。
圖100為根據本發明實施例之胎兒特異性DNA分子與母體特異性DNA分子之間的甲基化程度的表。
圖101為根據本發明實施例之在特定尺寸範圍內之血漿DNA分子百分比及其對應之胎兒DNA分子及母體DNA分子甲基化程度的表。
圖102A及圖102B為根據本發明實施例之藉由奈米孔定序確定之胎兒DNA分子及母體DNA分子之尺寸分佈圖。
圖103為顯示根據本發明實施例之基於單個資訊性SNP及兩個資訊性SNP之胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的甲基化程度差異的圖式。
圖104為根據本發明實施例之胎兒DNA分子與母體DNA分子之間的甲基化程度差異表。
圖105繪示根據本發明實施例之量測系統。
圖106顯示根據本發明實施例之電腦系統。
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Claims (22)
- 一種分析獲自懷有胎兒之女性之生物樣本的方法,該生物樣本包含來自該胎兒及該女性之複數個游離DNA分子,該方法包括:量測該複數個游離DNA分子之尺寸;量測具有大於截止值之尺寸之游離DNA分子之第一量,其中該截止值為至少500nt;使用該第一量生成經標準化參數之第一值;獲得對應於健康懷孕之該經標準化參數之預期值之第二值,其中該第二值係視該胎兒之胎齡而定;確定該經標準化參數之該第一值與該經標準化參數之該第二值之間的偏差;及使用該偏差確定懷孕相關病症之可能性之分類。
- 如請求項1之方法,其中獲得該第二值包括:自具有該經標準化參數之校準值之關於懷孕女性之量測結果的校準表獲得該第二值,其中該校準表係藉由以下生成:獲得具有懷孕女性個體之量測結果之關於胎齡之第一表,獲得具有該經標準化參數之校準值之關於胎齡之第二表,及由該第一表及該第二表產生具有該等校準值之關於該等量測結果之該校準表。
- 如請求項2之方法,其中該等懷孕女性個體之該等量測結果為自最後一次月經期以來之時間。
- 如請求項2之方法,其中該等懷孕女性個體之該等量測結果為該等懷孕女性個體之影像之特徵。
- 如請求項4之方法,其中該影像之特徵包括女性個體之胎兒之長度、尺寸、外貌或解剖結構。
- 如請求項1之方法,其中該懷孕相關病症包括子癇前症、子宮內生長受限、侵入性胎盤形成、早產、新生兒溶血性疾病、胎盤功能不全、胎兒水腫、胎兒畸形、溶血、肝酶升高及低血小板計數(HELLP)症候群或全身性紅斑狼瘡。
- 如請求項1之方法,其中該截止值為600nt或更大。
- 如請求項1之方法,其中該截止值為1,000nt或更大。
- 如請求項1之方法,其中該第一量為數目或頻率。
- 如請求項1之方法,其中使用該第一量生成該經標準化參數之該值包括:量測包含小於該截止值之尺寸之游離DNA分子之第二量;及計算該第一量與該第二量之比。
- 如請求項10之方法,其中:該截止值為第一截止值,第二截止值小於該第一截止值,且 該第二量包括具有小於該第二截止值之尺寸之游離DNA分子,或該第二量包括該複數個游離DNA分子中之所有游離DNA分子。
- 如請求項1之方法,其中:相對於該生物樣本而言富集該複數個游離DNA分子以獲得大於或等於該截止值之尺寸,其中該生物樣本中超過20%之該等游離DNA分子具有大於200nt之尺寸。
- 如請求項12之方法,其進一步包括:使用電泳富集該複數個游離DNA分子。
- 如請求項12之方法,其進一步包括:使用用於基於尺寸選擇性結合游離DNA分子之磁珠富集該複數個游離DNA分子。
- 如請求項12之方法,其進一步包括:使用雜交、免疫沈澱、擴增或CRISPR富集該複數個游離DNA分子。
- 如請求項12之方法,其進一步包括富集生物樣本中大於500nt尺寸者。
- 如請求項1之方法,其中相對於該生物樣本而言富集該複數個游離DNA分子以獲得甲基化概況,該方法進一步包括: 使用免疫沈澱富集該複數個游離DNA分子。
- 如請求項1之方法,其中該分類為懷孕相關病症存在之分類。
- 如請求項1之方法,其中該複數個游離DNA分子包含至少10,000個分子。
- 如請求項1之方法,其進一步包括接收對應於該複數個游離DNA分子之讀段,其中該等讀段係藉由單分子定序獲致。
- 如請求項20之方法,其中該單分子定序包括光學監測將新鹼基併入該複數個游離DNA分子之游離DNA分子之互補股中的DNA聚合酶。
- 一種電腦產品,其包括非暫時性電腦可讀媒體儲存之指令,該等指令在經實行時控制計算系統以執行如請求項1至21中任一項之方法。
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