TWI827284B - 用於治療癌症的結合 chi3l1 抗體、其醫藥組成物、其抗體藥物複合體、其核酸分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
結合非酶幾丁質酶3樣蛋白1(CHI3L1)的抗體或其抗原結合部分包括重鏈可變區和輕鏈可變區。靶向CHI3L1的抗體或其抗原結合部分不僅抑制活化的AKT和ERK訊號、癌細胞遷移、腫瘤進展、腫瘤纖維化、血管生成和癌症誘導的肌肉損失如惡病體質,而且調節腫瘤微環境朝朝向免疫刺激表型。
Description
本發明涉及一種抗體。更具體而言,本發明涉及一種用於癌症治療的抗體。
肺癌為全球癌症死亡的第一和結腸直腸癌第三最常見的原因(Johdi和Sukor,2020;Siegel等人,2021)。儘管胰腺癌的發病率不如肺癌高,但它是最具侵襲性的癌症之一,五年相對存活率非常低(Li等人,2021;Siegel等人,2021)。值得注意的是,在血清和腫瘤內表達中的非酶幾丁質酶3樣蛋白1(CHI3L1)的大量增加與肺癌、結腸直腸癌和胰腺癌患者的腫瘤轉移和不良預後相關(Yeo等人,2019;Zhao等人,2020),使其成為癌症治療之有吸引力的目標。此外,以血清或血漿中CHI3L1的水平作為非侵入性預後生物標誌物已被提出(Kzhyshkowska等人,2016;Wang等人,2020)。
CHI3L1為沒有幾丁質酶活性的碳水化合物結合
凝集素。CHI3L1調節Th1和Th2細胞之間的炎症平衡、細胞因子誘導的炎症、炎症細胞凋亡、替代活化巨噬細胞(M2)分化、AKT和細胞外訊號調節激酶(ERK)訊號傳導(Higashiyama等人,2019;Kim等人,2018);(Kim等人,2020;Letuve等人,2008)。在所有途徑中,AKT和ERK為研究最廣泛的訊號級聯反應,其涉及CHI3L1誘導的炎症反應(He等人,2013)。舉例來說,AKT和ERK途徑的活化對於抑制促炎症和M2極化至關重要(Traves等人,2012;Vergadi等人,2017)。
免疫抑制腫瘤微環境(TME)的建立涉及CHI3L1誘導的癌細胞促進。CHI3L1可由多種細胞分泌,包括巨噬細胞、T細胞、纖維母細胞、上皮細胞和腫瘤細胞(Cohen等人,2017;Park等人,2010;Xing等人,2017)。
因此,如何治療CHI3L1誘發的癌症,相關技術確實需要改進。
本揭露提供一種結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,包括:重鏈可變(VH)區包含重鏈互補決定區(CDR-H1)、CDR-H2和CDR-H3,以及輕鏈可變(VL)區包含輕鏈互補決定區1(CDR L1)、CDR-L2和CDR-L3,其中CDR-H1包含SEQ ID NO:3,CDR-H2包含SEQ ID NO:4,並且CDR-H3包含SEQ ID NO:5;並且CDR-L1包含SEQ ID NO:6,CDR-L2包含
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ID NO:55,並且CDR-L3包含SEQ ID NO:56,或其中CDR-H1包含SEQ ID NO:59,CDR-H2包含SEQ ID NO:60,並且CDR-H3包含SEQ ID NO:61;並且CDR-L1包含SEQ ID NO:62,CDR-L2包含SEQ ID NO:63,並且CDR-L3包含SEQ ID NO:64,或其中CDR-H1包含SEQ ID NO:67,CDR-H2包含SEQ ID NO:68,並且CDR-H3包含SEQ ID NO:69;並且CDR-L1包含SEQ ID NO:70,CDR-L2包含SEQ ID NO:71,並且CDR-L3包含SEQ ID NO:72,或其中CDR-H1包含SEQ ID NO:75,CDR-H2包含SEQ ID NO:76,並且CDR-H3包含SEQ ID NO:77;並且CDR-L1包含SEQ ID NO:78,CDR-L2包含SEQ ID NO:79,並且CDR-L3包含SEQ ID NO:80,或其中CDR-H1包含SEQ ID NO:83,CDR-H2包含SEQ ID NO:84,並且CDR-H3包含SEQ ID NO:85;CDR-L1包含SEQ ID NO:86,CDR-L2包含SEQ ID NO:87,CDR-L3包含SEQ ID NO:88。
在一些實施例中,結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分更包括VH區包含SEQ ID NO:1或與SEQ ID NO:1具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:9或與SEQ ID NO:9具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:10或與SEQ ID NO:10
具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:17或與SEQ ID NO:17具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:18或與SEQ ID NO:18具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:25或與SEQ ID NO:25具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:26或與SEQ ID NO:26具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:33或與SEQ ID NO:33具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:34或與SEQ ID NO:34具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:41或與SEQ ID NO:41具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:42,或與SEQ ID NO:42具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:49,或與SEQ ID NO:49具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:50或與SEQ ID NO:50具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:57或與SEQ ID NO:57具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:58或與SEQ ID NO:58具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含SEQ ID NO:65或與SEQ ID NO:65具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:66或與SEQ ID NO:66具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VH區包含
SEQ ID NO:73或與SEQ ID NO:73具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:74或與SEQ ID NO:74具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;或VH區包含SEQ ID NO:81或與SEQ ID NO:81具有至少90%胺基酸序列同一性的序列;VL區包含SEQ ID NO:82或與SEQ ID NO:82具有至少90%胺基酸序列同一性的序列。
在一些實施例中,抗體為人類抗體。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合部分為單鏈Fv(scFv)、片段-抗原結合(Fab)、(Fab')2或(scFv')2。
在一些實施例中,抗體為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗體。
在一些實施例中,IgG抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
本揭露亦提供一種醫藥組成物,包括:前述之抗體或其抗原結合部分,以及至少一種藥學上可接受載體。
在一些實施例中,醫藥組成物更包括治療劑。
在一些實施例中,治療劑包括吉西他濱。
本揭露亦提供一種抗體-藥物複合體,包括:治療劑;以及前述之抗體或其抗原結合部分,其中治療劑透過連接子與抗體或其抗原結合部分共價結合。
本揭露亦提供編碼前述之抗體或其抗原結合部分的一種核酸分子。
本揭露亦提供一種治療癌症的方法,包括向有需要的患者施用有效量之前述之抗體或其抗原結合部分。
在一些實施例中,癌症為CHI3L1表達腫瘤。
在一些實施例中,癌症為胰腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、食道癌、頭頸癌、腎癌細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合部分與治療劑合併使用。
在一些實施例中,治療劑包括吉西他濱。
在一些實施例中,抗體或其抗原結合部分抑制活化的AKT訊號、抑制活化的細胞外訊號調節激酶(ERK)訊號、抑制癌細胞遷移、抑制腫瘤進展、抑制腫瘤纖維化、抑制血管生成、抑制惡病體質、調節腫瘤微環境(TME)朝向免疫刺激表型、或其組合。
當以下詳細描述與附圖一起閱讀時,可以最佳地理解本揭露的各種態樣。值得注意的是,根據行業的標準慣例,各種特徵並未按比例繪製。事實上,為了論述的清晰性,各種特徵的尺寸可任意增大或減小。通過閱讀以下實施例的詳細描述並結合附圖,可以更充分地理解本揭露:
第1A至1D圖顯示從OmniMab中選擇的CHI3L1特異性噬菌體克隆。
第2A和2B圖顯示來自哺乳動物表達系統的CHI3L1特異性抗體先導的表達和純化。
第3A和3B圖顯示抗體先導對於CHI3L1與A549細胞結合的抑制。
第4A至4C圖顯示全人單株抗體減弱重組CHI3L1(rCHI3L1)與其在癌細胞上的受體之間的結合親和力。第4D至4G圖顯示與人rCHI3L1特異性結合的全人單株抗體克隆R4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4。
第5A至5C圖顯示全人單株抗體抑制不同癌細胞系中由rCHI3L1誘導的AKT/ERK訊號。
第6A至6D圖顯示全人單株抗體降低由rCHI3L1誘導的細胞存活率和細胞增殖。
第7A至7C圖顯示全人單株抗體降低由rCHI3L1誘導的細胞遷移能力。
第8A至8E圖顯示全人單株抗體調節NF-κB訊號和免疫反應。
第9A至9I圖顯示全人單株抗體在MiaPaCa-2原位NOD-SCID小鼠模型中表現出腫瘤限制功效。
第10A至10B圖顯示ELISA測定的結合曲線,表明R4-4(圓形)、R4-54(方形)、293R3-2(三角形)和293R3-4(倒三角形)與(第10A圖)人rCHI3L1和(第
10B圖)小鼠rCHI3L1的結合。第10C至10E圖顯示全人mAb克隆R4-4在胰腺KPPC-luc原位C57BL/6J小鼠模型中顯示出抗癌功效。
第11A至11D圖顯示全人單株抗體克隆R4-54在人胰腺癌攜帶MiaPaCa-2的hHSC-HIS小鼠模型中顯示出抗癌功效。
第12A至12D圖顯示全人單株抗體克隆R4-54在人肺癌攜帶H460的hHSC-HIS小鼠模型中顯示出抗癌功效。第12E和12F圖顯示全人單株抗體將免疫細胞調節至免疫刺激狀態。
第13A至13E圖顯示全人單株抗體克隆R4-4和R4-54在人胰腺癌MiaPaCa-2異種移植NOD-SCID小鼠模型中顯示出抗癌功效。
第14A至14F圖顯示全人mAb克隆R4-4和化療聯合治療在KPPC-luc原位C57BL/6J小鼠模型中的協同抗腫瘤功效。
第15A至15D圖顯示抗CHI3L1單株抗體在KPPC-luc原位C57BL/6J小鼠模型中潛在地發揮抗惡病體質功效。
第16A至16D圖顯示R4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4抗體的結合動力學。
為使本揭露的敘述更加詳盡與完備,下文針對本發
明的實施態樣與具體實施例提出說明性的描述,但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。以下所揭露的各實施例,在有益的情形下可相互組合或取代,也可在一實施例中附加其他的實施例,而無須進一步的記載或說明。在以下描述中,將詳細敘述許多特定細節,以使讀者能夠充分理解以下的實施例。然而,亦可在無此等特定細節之情況下實踐本發明之實施例。
本文使用的用語僅出於描述特定實施例的目的,並不旨在限制本發明。如本文所用,除非內文中對於冠詞有特別限定,否則『一』與『該』可泛指單一個或多個。將進一步理解的是,本文中所使用之『包含』、『包括』、『具有』及相似詞彙,指明其所記載的特徵、區域、整數、步驟、操作、元件和/或組件,但不排除其所述或額外的一或多個其他特徵、區域、整數、步驟、操作、元件、組件,和/或其中之群組。
在一些實施例中,本文提供的抗體具有分別包括具有與以下胺基酸序列至少約80%同一性的胺基酸序列的VH區和VL區,例如85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%,以及介於兩者之間的任何數值或範圍,胺基酸序列為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:
49和SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:65和SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:73和SEQ ID NO:74,或SEQ ID NO:81和SEQ ID NO:82。在其他實施例中,本文提供的抗體具有分別包括具有至少約80%同一性的胺基酸序列的VH區和VL區,其中具有至少約80%同一性的胺基酸序列不包括CDRs。
在一些實施例中,本文提供的抗體或其抗原結合部分包括免疫球蛋白框架區(FR)序列。這些序列優選在人類中沒有免疫原性,因此優選為人或人源化FR序列。合適的人或人源化FR序列是本領域已知的。特別優選的FR序列可以取自本文所示的實施例,其公開完整的抗原結合單位,從而公開CDR序列以及FR序列。
在一些實施例中,本文提供的抗體或其抗原結合片段更包括Fc域。用語Fc域是指至少包括鉸鏈區、CH2域和CH3域的抗體區。在一些實例中,Fc域係IgG域、IgE域、IgM域和IgD域、IgA域或IgY域。可以使用任何序列及來自任何物種的Fc域,包括人、猿、猴、小鼠、兔、山羊及其他物種。在一些實例中,Fc域係經過改造,亦即使用例如分子生物學技術所產生之非天然存在或重組的Fc域。在一些實例中,IgG域係IgG1域、IgG2域、IgG3域或IgG4域。
在一些實施例中,本文亦提供醫藥組成物,其包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段中之任一者以及藥學
上可接受載體。在一些實例中,藥學上可接受載體係與抗體或抗原結合片段之一或多個多肽的C端結合。可使用任何結合藥學上可接受載體的合適方式,例如包括共價結合及使用連接子。
在一些實施例中,本文提供的抗體-藥物複合體可包括本文所提供之抗體或其抗原結合片段。舉例來說,特異性結合CHI3L1的抗體或其抗原結合片段可被包括在抗體-藥物複合體中。在一些實例中,本文提供的抗體-藥物複合體包括治療劑,例如,治療劑包括但不限於化療劑、抑制血管生成的治療活性化合物、訊號轉導途徑抑制劑、免疫調節劑、免疫檢查點抑制劑或激素治療劑。在一些實例中,化療劑包括但不限於吉西他濱(gemcitabine)或亞伯杉(Abraxane)。
在一些實施例中,本文提供的抗體-藥物複合體用於治療癌症。舉例來說,抗體-藥物複合體的抗體靶向腫瘤細胞上抗原的抗原決定位(epitope),從而將被包含在抗體-藥物複合體中的治療劑靶向腫瘤細胞。當抗體-藥物複合體靶向腫瘤細胞時,治療劑被內化並在腫瘤細胞中釋放。
我們之前未發表的數據顯示CHI3L1誘導的腫瘤生長和細胞增殖訊號傳導在胰腺癌、結腸直腸癌和肺癌模型中被CHI3L1多克隆中和抗體抑制。為了進一步的臨床應用,我們開發並表徵了噬菌體展示衍生的全人單克隆抗體(mAb)。在這裡,我們示出靶向CHI3L1的單株抗體不
僅抑制活化的AKT和ERK訊號、癌細胞遷移、腫瘤進展、腫瘤纖維化、血管生成和癌症誘導的肌肉損失(惡病體質),而且在體外和體內調節TME朝向免疫刺激表型。
實例
以噬菌體展示技術開發針對幾丁質酶-3樣蛋白-1(CHI3L1)的全人單克隆抗體。
為了產生針對CHI3L1的抗體,使用OmniMab噬菌粒文庫進行選擇。噬菌粒文庫由圓祥生技股份有限公司(APBio Inc.)從一百多名健康供體的外周血單核細胞集合中建立。
使用巨噬細胞(M13K07△ρIII,Progen,Heidelberg,德國)進行第一輪淘選。溶液相淘選用於CHI3L1特異性結合物選擇和從OmniMab文庫中分離。使用由用於第一輪選擇的哺乳動物細胞表達系統產生的重組人CHI3L1進行溶液相淘選。接下來的三輪富集亦用於溶液相淘選。在三輪和四輪淘選之後,透過直接ELISA篩選和分離出特異性CHI3L1結合物。分離出陽性結合物並送測序以確認重鏈的序列和多樣性。噬菌體克隆在來自於OmniMab噬菌體文庫的三輪(第1A圖和第1B圖)四輪(第1C圖和第1D圖)人CHI3L1特異性富集過程之後特異性地識別人CHI3L1。預覆蓋的人CHI3L1重組蛋白與含有拯救噬菌體的上清液培養1小時,並用含0.1%的Tween-20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌3次。透過辣根過氧化物酶(HRP)結合的抗M13抗體(Roche®)檢測結
合的噬菌體,並以3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)基質用於訊號發展。記錄OD450讀數。如第1A圖、第1B圖、第1C圖和第1D圖所示,從三輪淘選中分離出的克隆,只有五個克隆對CHI3L1抗原具有特異性。從第四輪淘選中分離出幾個特異性識別人CHI3L1抗原的克隆,與陰性對照相比,一些克隆可識別人和小鼠CHI3L1抗原。
這些結果顯示在三輪或四輪CHI3L1特異性富集後獲得的噬菌體克隆特異性地識別CHI3L1。陽性CHI3L1結合物根據其為哪一輪淘選而重新命名,不包括無結合活性或非特異性結合克隆(表1)。
為了快速篩選候選者,透過ELISA鑑定的陽性CHI3L1結合物的重鏈和輕鏈被擴增、消化並亞克隆至由APBio產生並攜帶IgG1恆定區的IgG表達載體中。序列驗證之後,使用哺乳動物細胞表達系統製備質粒並產生抗體。培養6天之後,分泌到無血清培養基中的抗體透過蛋白A層析從培養上清液中親和純化。濃縮純化抗體,然後在PBS緩衝液中透析。透析蛋白的最終濃度使用NanoDrop2000分光光度計測定,純度和完整性透過有或沒有還原劑的SDS-PAGE確定。
第2A圖和第2B圖顯示純化的抗CHI3L1抗體先導的PAGE凝膠分析。在加載到凝膠(5μg/泳道)之前,在還原和非還原條件下分析純化的蛋白質。結果表明,蛋白質在非還原條件下的分子量為約145kDa,重鏈和輕鏈在還原條件下的分子量分別為約55kDa和約25kDa。
已知CHI3L1與不同受體相關,例如IL-13Rα2(He等人,2013)、CRTH2(Zhou等人,2015)、TMEM219(Lee等人,2016)和半乳凝素-3(Zhou等人,2015)。最近的研究顯示,CHI3L1與白細胞介素-13受體α2(IL-13Rα2)結合併發出訊號,其在許多人類癌症中為顯著向上調控(Barderas等人,2012;Bartolome等人,2015;Zhao等人,2015),例如A549細胞,促進腫瘤進展。因此,對於純化的抗體先導進行功
能性篩選,以了解其阻斷CHI3L1與A549細胞系上的IL-13Ra2結合的能力(第3A圖)。如第3B圖所示,若與陽性對照(僅CHI3L1)相比,22個抗體克隆顯示出顯著的CHI3L1中和活性。這裡是具有最佳中和活性的先導,例如#293R3-2、#293R3-4、#293R3-5、#R4-2、#R4-39、#R4-53、#R4-54、#R4-62、#R4-63和#R4-93,其進行另一功能驗證,如第4A至4G圖所示。同時,在第1C圖中顯示與小鼠CHI3L1交叉反應的#hu R4-4也用於驗證。這些單克隆抗體中的序列和定義的CDR區分別在序列表(SEQ ID NO:1至88)和表2中列出和總結。抗CHI3L1克隆R4-2重鏈可變區(SEQ ID NO:1)、抗CHI3L1克隆R4-2輕鏈可變區(SEQ ID NO:2)、抗CHI3L1克隆R4-4重鏈可變區(SEQ ID NO:9)、抗CHI3L1克隆R4-4輕鏈可變區(SEQ ID NO:10)、抗CHI3L1克隆R4-39重鏈可變區(SEQ ID NO:17)、抗CHI3L1克隆R4-39輕鏈可變區(SEQ ID NO:18)、抗CHI3L1克隆R4-53重鏈可變區(SEQ ID NO:25)、抗CHI3L1克隆R4-53輕鏈可變區(SEQ ID NO:26)、抗CHI3L1克隆R4-54重鏈可變區(SEQ ID NO:33)、抗CHI3L1克隆R4-54輕鏈可變區(SEQ ID NO:34)、抗CHI3L1克隆R4-62重鏈可變區(SEQ ID NO:41)、抗CHI3L1克隆R4-62輕鏈可變區(SEQ ID NO:42)、抗CHI3L1克隆R4-63重鏈可變區(SEQ ID NO:49)、抗CHI3L1克隆R4-63輕鏈可變區(SEQ ID NO:50)、
抗CHI3L1克隆R4-93重鏈可變區(SEQ ID NO:57)、抗CHI3L1克隆R4-93輕鏈可變區(SEQ ID NO:58)、抗CHI3L1克隆293R3-2重鏈可變區(SEQ ID NO:65)、抗CHI3L1克隆293R3-2輕鏈可變區(SEQ ID NO:66),抗CHI3L1克隆293R3-4重鏈可變區(SEQ ID NO:73)、抗CHI3L1克隆293R3-4輕鏈可變區(SEQ ID NO:74)、抗CHI3L1克隆293R3-5重鏈可變區(SEQ ID NO:81)和抗CHI3L1克隆293R3-5輕鏈可變區(SEQ ID NO:82)顯示於序列表中。
全人單株抗體標靶對CHI3L1的結合和中和能力
據報導,CHI3L1會與癌細胞上的幾種受體相互作用,並觸發癌細胞生長、增殖和抗細胞凋亡的下游訊號傳導(Kamba等人,2013;Lee等人,2016)。為了研究我們的噬菌體展示全人單株中和抗體(mAbs)在CHI3L1與其受體對癌細胞的阻斷作用,我們最初篩選11個單株抗體克隆,以了解CHI3L1-受體相互作用對於人肺癌細胞系(H1299和A549)的結合親和力和阻斷。添加His標記的rCHI3L1用於CHI3L1-受體相互作用。用於檢測之具有
螢光F識別CHI3L1-受體R複合物的抗His抗體AHAb(左,第4A圖)。一旦全人mAb(nCHI3L1 Ab)阻斷CHI3L1-受體相互作用,螢光F訊號減少(右,第4A圖),並且細胞訊號傳導CS被阻斷。透過流式細胞技術對結果進行量化顯示,在11個單株抗體克隆處理之後,rCHI3L1與細胞的結合均降低,表示CHI3L1與其受體之間的相互作用受阻(第4B圖)。
進一步測試包括R4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4的四種選定的單株抗體克隆對於人結腸直腸(HCT116、SW480和SW620)和胰腺癌細胞系(PANC1和MiaPaCa-2)的阻斷作用。四種選定的單株抗體顯著降低rCHI3L1與這些細胞的結合(第4C圖)。數據顯示為平均值±標準差(每組n=3)。P值由單因子變異數分析確定。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。為了檢測結合特異性,我們在96孔板上進一步覆蓋不同濃度的重組CHI3L1蛋白和幾丁質酶家族中的其他兩種主要蛋白,包括人殼三糖苷酶-1(CHIT1)和CHI3L2,從2.5μg/mL到0μg/mL。ELISA測定結果表明,我們選擇的四種單株抗體(1μg/mL)特異性識別CHI3L1,但不識別其他幾丁質酶蛋白(第4D圖、第4E圖、第4F圖、第4G圖)。
全人單株抗體抑制不同癌細胞中的細胞生長訊號途徑。
據報導,CHI3L1參與細胞內訊號途徑。舉例來
說,CHI3L1與CD44結合可活化蛋白激酶B(AKT)和細胞外訊號調節激酶(ERK)訊號傳導,以促進癌症進展(Chen、Jiang等人,2021)。因此,我們測試mAb克隆R4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4是否可減弱人胰腺(PANC1)、結腸直腸(HCT116)和肺癌(A549)癌細胞系中的AKT和ERK磷酸化。PANC1細胞僅使用rCHI3L1(100ng/mL)或使用不同劑量單株抗體的rCHI3L1處理20分鐘。免疫印跡分析顯示,在PANC1細胞中,四種mAb克隆呈劑量相關性抑制rCHI3L1誘導的p-AKT和p-ERK水平(第5A圖)。在HCT116和A549細胞中也觀察到單株抗體對p-AKT和p-ERK的抑制作用呈時間相關性(第5B圖和第5C圖)。總體而言,單株抗體在PANC1、HCT116和A549細胞中持續向下調控CHI3L1誘導的p-AKT和p-ERK水平。
全人單株抗體減弱肺、胰腺和結腸癌細胞系中的生長和遷移行為。
PI3K/AKT/mTOR訊號途徑在調節細胞增殖、存活和遷移中是很重要的(Xu等人,2020)。因此,我們研究四種選定的單株抗體對癌細胞行為的影響。人胰腺(PANC1)和大細胞肺癌(H460)細胞僅使用rCHI3L1或與單株抗體一起以兩個劑量處理,然後進行細胞計數試劑盒8(CCK-8)細胞存活率測定。兩種劑量的單株抗體處理均降低了PANC1和H460細胞的存活率(第6A圖和第6B圖)。此外,以促腫瘤蛋白作為rCHI3L1進行刺激,
導致密度相關性生長喪失,從而誘導SW480和SW620細胞的病灶形成能力。使用mAbR4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4處理,病灶的數量呈劑量相關性減少(第6C圖和第6D圖)。數據顯示為平均值±標準差(每組n=3)。P值由單因子變異數分析確定。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
由於AKT調節細胞遷移,我們進一步進行傷口癒合試驗,以檢測單株抗體對於胰腺(MiaPaCa-2)、結腸直腸(SW480)和肺(A549)細胞的抗遷移作用。我們觀察到16小時之後,與rCHI3L1治療的對照組相比,傷口閉合的面積增加。我們選擇的四種單株抗體克隆顯著降低rCHI3L1誘導的細胞遷移能力(第7A圖、第7B圖和第7C圖)。總之,我們的全人單克隆CHI3L1中和抗體克隆R4-4、R4-54、293R3-2和293R3-4阻斷了CHI3L1誘導的腫瘤細胞訊號傳導和細胞行為。數據表示為平均值±標準差(每組n=3)。P值由單因子變異數分析確定。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
全人單株抗體在體外顯示出對免疫細胞的免疫刺激作用。
各種癌症患者CHI3L1的血漿水平顯著高於健康對照(Johansen等人,2004)。除了對於腫瘤生長的直接影響之外,CHI3L1還在調節腫瘤微環境(TME)中發揮作用,例如促進M2樣(M2-like)腫瘤相關巨噬細胞(TAM)
分化和Th1/Th2炎症平衡(Kawada等人,2012)。巨噬細胞根據外部刺激迅速改變其表型。一些研究指出,NF-κB活化會觸發M2極化(Wang等人,2014)。
為了確定單株抗體對免疫細胞調節的影響,我們研究巨噬細胞的極化和T細胞功能。我們透過小鼠巨噬細胞RAW-BlueTM細胞中分泌的胚胎鹼性磷酸酶(SEAP)報告基因測量NF-κB活性。結果顯示四種選定的mAb克隆大幅度減弱rCHI3L1誘導的NF-κB活性(第8A圖)。此外,免疫螢光數據表明CHI3L1增強NF-B向細胞核的易位,然而單株抗體處理後核易位降低(第8B圖)。為了進一步證實單株抗體對巨噬細胞極化的影響,THP-1巨噬細胞是一種從急性單核細胞白血病患者的外周血中分離出的單核細胞,其用IL-4處理M2極化。流式細胞技術分析顯示,四種mAb克隆降低了由IL-4誘導的CD206(一種M2標記物)的水平(第8C圖)。接著,進行共培養試驗,以評估抗腫瘤T細胞活性。將表達螢光素酶的KPPC(KPPC-luc)細胞與從攜帶KPPC-luc的C57BL/6J小鼠的脾臟中分離出的CD8T細胞共培養。螢光素酶訊號的減少係指T細胞的細胞毒性。與對照組相比,單株抗體處理顯著增加T細胞的細胞毒性(第8D圖)。此外,我們透過KPPC-luc和脾CD4+T細胞共培養試驗確定單株抗體對調節性T細胞(Treg)分化的影響。流式細胞技術分析顯示單株抗體有效降低KPPC-luc誘導的Treg的百分比(第8E圖)。總之,這些數據表明,四種選定的
CHI3L1單株抗體克隆在體內和離體調節免疫細胞從促腫瘤到抗腫瘤表型。
全人單株抗體單一治療在體內發揮抗腫瘤功效。
為了進行體內驗證,將四種mAb克隆(5mg/kg)給予攜帶MiaPaCa-2的NOD-SCID小鼠,並與吉西他濱(50mg/kg)比較抗腫瘤功效。具體而言,是體內腫瘤生長抑制的實驗設計。在第0天,將MiaPaCa-2細胞(5x106)注射到NOD-SCID小鼠的胰腺中。在指定的時間點(第7天、第14天、第21天和第28天),透過尾靜脈注射給予mAb克隆R4-4、R4-54、293R3-2、293R3-4或對照IgG Ab(i.v.)。也在指定時間點(第7天、第14天、第21天和第28天)透過腹膜內注射(i.p.)給予吉西他濱,作為陽性藥物對照。在第34天犧牲小鼠。治療組中的所有腫瘤都小於IgG對照組(第9A圖),並且沒有顯著的體重減輕(第9B圖)。此外,僅在IgG對照組(如箭頭所示)中觀察到腸系膜轉移,但在其他治療組中並未觀察到(第9C圖)。儘管各組都有脾轉移,但R4-4治療組的腫瘤結節明顯變小(第9D圖)。除了腫瘤生長,我們還驗證腫瘤切片中浸潤的巨噬細胞。免疫螢光(IF)結果顯示,除了M2表型(CD206+標記)之外,還有更多的巨噬細胞,這很可能是M1巨噬細胞(F4/80+標記)在單株抗體治療組的腫瘤內被染色(第9E圖)。值得注意的是,在實驗結束時,治療組的瘤內區域和血漿中的CHI3L1的水平低於IgG對照組(第9F圖和第9G圖)。由於纖維化和血管生成
是腫瘤進展過程中的兩個主要問題,我們比較了每組內的纖維化和血管生成水平。與IgG對照和吉西他濱組相比,由α-SMA指示的纖維化在R4-4和R4-54處理組中明顯減少,而CD31表達指示的血管生成在每個處理組中均減少(第9H圖和第9I圖)。總之,在體內檢驗的所有抗腫瘤和TME改善參數中,四種單株抗體克隆都顯示出良好的功效。
全人mAb R4-4單一治療在免疫活性小鼠模型體內發揮抗腫瘤和TME改善作用。
R4-4 mAb是唯一可與鼠CHI3L1交叉反應的單克隆抗體(第10A圖和第10B圖)。因此,我們透過將小鼠胰腺癌KPPC-luc細胞(5x106)直接注射到免疫活性(C57BL/6J)小鼠的胰腺中來建立原位動物模型。將所有小鼠分為兩組,並在指定時間點(第3天、第7天、第10天和第14天)透過尾靜脈的靜脈(i.v.)注射,以IgG同種型抗體作為對照或以mAb克隆R4-4(5mg/kg)處理。在第28天犧牲小鼠,以驗證腫瘤訊息。值得注意的是,我們觀察到與IgG組相比,R4-4治療組的腫瘤重量顯著降低,而體重沒有明顯變化(第10C圖和第10D圖)。至於腫瘤浸潤免疫譜,流式細胞技術分析顯示,R4-4減少了Treg(CD45+、Foxp3+)群體、M2樣TAMs(CD206+),但增加了攜帶KPPC-luc的C57BL/6J小鼠的M1/M2比率(第10E圖)。數據表示為平均值±標準差。P值是指雙尾學生t檢驗。*P<0.05,**P<0.01。
全人mAb R4-54單一治療在人源化小鼠模型體內發揮抗腫瘤和TME改善作用。
在C57BL/6J免疫活性小鼠中證明有效的CHI3L1阻斷之後,我們進一步研究全人單克隆中和抗體如何調節人免疫系統。我們使用植入人CD45+造血幹細胞(HSCs)的晚期嚴重免疫缺陷(ASID)小鼠。然後將MiaPaCa-2和H460細胞皮下注射到hHSC重組ASID小鼠中,以評估CHI3L1 mAb克隆R4-54在體內對肺和胰腺細胞系的抗腫瘤作用。每5天透過尾靜脈注射給予IgG同種型或mAb克隆R4-54(5mg/kg),當腫瘤尺寸達到300mm3大小時模擬晚期腫瘤診斷的臨床情況,MiaPaCa-2從第14天開始,攜帶H460的hHSC小鼠從第6天開始,然後攜帶MiaPaCa-2的hHSC小鼠在第32天,攜帶H460的hHSC小鼠在第27天犧牲。mAb克隆R4-54顯著延遲MiaPaCa-2和H460皮下異種移植物的生長(第11A圖、第11B圖、第12A圖和第12B圖)。還收集腫瘤及外周血用於進一步的免疫細胞群檢驗。流式細胞技術分析顯示,mAb克隆R4-54增加M1巨噬細胞和CD8+T細胞(CD8+、CD3+)的百分比,而M2樣TAM和Treg群體在MiaPaCa-2和攜帶H460的hHSC-HIS小鼠模型的腫瘤浸潤免疫細胞中減少(第11C圖和第12C圖)。一致地,基於免疫組織化學染色使用附加標記CD86和CD163,在IgG組中,腫瘤內M2巨噬細胞積累,而在MiaPaCa-2/攜帶H460的hHSC-HIS
小鼠模型中,在R4-54治療後,腫瘤內M1與M2比率和CD8 T細胞均增加(第11D圖和第12D圖)。此外,收集兩種荷瘤(tumor-bearing)hHSC-HIS小鼠模型的外周血樣本,用以分析免疫細胞群。儘管M1和M2巨噬細胞的群體並未受到如此一致的影響,但在mAb克隆R4-54處理組中明顯發現增加的CD8+ T細胞和減少的Tregs(第12E圖和第12F圖)。總之,這些數據表明mAb克隆R4-54不僅可以調節TME中腫瘤浸潤免疫細胞的表型,還可以調節外周血中免疫細胞的總體數量,從而轉變為抗腫瘤免疫環境。數據表示為平均值±標準差。P值是指雙尾學生t檢驗。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
全人單株抗體在處理的小鼠中沒有顯示出明顯的毒性。
接著,我們檢驗我們的mAb克隆R4-4和R4-54是否在體內發揮任何毒性。我們透過將MiaPaCa-2細胞皮下植入NOD-SCID小鼠來進行異種移植模型。每週給小鼠靜脈注射IgG同種型、mAb克隆R4-4或克隆R4-54(5mg/kg),從第7天開始到第21天,即第7天、第14天和第21天,然後在第28天犧牲小鼠。R4-4和R4-54處理均顯著延遲MiaPaCa-2皮下異種移植物的生長(第13A圖和第13B圖)。為了評估我們開發的單株抗體的潛在安全性,我們檢查荷瘤小鼠的三個主要器官的體重、血清生化標誌物和組織學切片。在IgG對照與R4-4或R4-54組之間的小鼠體重沒有顯著變化(第13C圖)。
在IgG對照與R4-4或R4-54處理之間,天門冬胺酸轉胺酶(GOT)、血清麩胺酸丙酮酸轉胺酶(GPT)、血尿素氮(BUN)、白蛋白和肌酐水平沒有明顯差異(第13D圖)。此外,包括肝、肺和腎在內的三個主要器官的組織學檢查顯示單株抗體治療對其沒有顯著的副作用(第13E圖)。總之,這些結果表明我們開發的單克隆CHI3L1中和抗體透過直接調節腫瘤生長和調節免疫刺激性腫瘤微環境發揮抗腫瘤作用,而沒有任何明顯的副作用。比例尺為100μm。P值由單因子變異數分析確定。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。
全人單株抗體和化療聯合治療在體內發揮協同抗腫瘤和TME改善作用。
為了提出最有效的治療策略,我們試圖測試第一線化療劑吉西他濱和mAb是否聯合治療攜帶胰腺腫瘤的C57BL/6J小鼠。將小鼠KPPC-luc細胞原位注射到C57BL/6J的胰腺中,並在術後第14天開始治療。在指定時間點(第14天、第20天和第25天),透過i.p.給予單株抗體克隆R4-4(10mg/kg或15mg/kg)、吉西他濱(GEM,25mg/kg)、亞伯杉(2.5mg/kg)或對照IgG Ab,在第29天犧牲小鼠。攜帶KPPC-luc的小鼠進一步分為6組,包括IgG同種型、吉西他濱(25mg/kg)、R4-4(10或15mg/kg),吉西他濱(25mg/kg)加R4-4(10mg/kg),或吉西他濱(25mg/kg)加亞伯杉(2.5mg/kg)。最後一組,GEM加亞伯杉,是臨床上用於胰腺癌治療的聯合化療。腫
瘤細胞的螢光素酶活性和腫瘤重量測量顯示在GEM加R4-4中腫瘤生長明顯受限,其與GEM加亞伯杉治療組相當(第14A圖,IgG:2.322g,GEM:2.51g,R4-4 10mg/kg:2.61g,R4-4 15mg/kg:1.74,GEM+R4-4:0.902g,GEM+亞伯杉:0.932g)。所有治療組均未引起顯著的體重減輕(第14B圖)。此外,GEM加R4-4治療組的腸系膜和肝轉移減少(第14C圖和第14D圖),箭頭指出轉移性腫瘤結節,而(4/5)表示5個中有4個有轉移,等等。由αSMA指示的腫瘤纖維化在GEM組和GEM加亞伯杉組中增加,然而在GEM加R4-4(10mg/kg)處理組中減少(第14E圖,上圖)。在所有治療組中,由CD31指示的血管生成水平大大降低(第14E圖,下圖)。對於腫瘤浸潤免疫譜,流式細胞技術分析顯示,在R4-4單一治療或聯合治療組中,M2樣TAMs(CD206+、CD11b+)減少,M1樣TAMs(CD86+、CD11b+)和M1/M2比率增加。儘管對淋巴細胞的影響不如對巨噬細胞那麼令人印象深刻,但我們發現R4-4(15mg/kg)治療組中Treg(CD4+、CD25+、Foxp3+)顯著降低(第14F圖)。
由於胰腺患者經常患有惡病體質,即癌症相關的肌肉流失障礙(Henderson等人,2018;Yoo等人,2021),我們進一步在IgG和R4-4(10mg/kg)組中進行小鼠肌纖維面積分析。肌纖維面積測量雖然是異質的(第15A圖顯示每個相對頻率,第15B圖顯示平均頻率),但與IgG相比,R4-4中的肌纖維面積較大(第15C圖)。剖面截斷的
面積的值設為1800,代表嚴重的肌肉損失(第15D圖)。IgG對照組中平均58.3%的肌纖維低於臨界值,然而R4-4(10mg/kg)治療組的肌肉損失減少(30.4%的肌纖維低於截斷值)。R4-4治療透過保留較大的纖維(大於1800%的纖維)防止肌肉萎縮,表示抗CHI3L1單株抗體可能發揮抗惡病體質作用。
抗CHI3L1單株抗體與rCHI3L1之間的ForteBio結合分析。
除了功能性驗證之外,在抗體發現的早期階段也很重要。有一種有效和準確的方法來評估特定發現成果的成功或失敗也很重要。首先,與標靶的結合親和力是抗體成功的關鍵標準。其次,在不靶向相關抗原決定位的情況下,抗原決定位覆蓋在發現的早期階段也很重要。
在此,透過生物層干涉分析法(FortéBio,USA)進行如上所示的四種候選物用於親和力測定。將抗CHI3L1 mAb以5μg/mL載到AHC(抗人IgG Fc Capture,ForteBio,Cat#18-5060),訊號達到約0.5nm。然後將感測器暴露於人CHI3L1胞外域,該域與flag和His標籤重組蛋白hCHI3L1/flag-His融合,濃度為10nM,2次連續稀釋出7種濃度。進行如下測量:在動力學緩衝液中1分鐘基線,在7種不同濃度的hCHI3L1/flag-His中結合5分鐘,以及在動力學緩衝液中解離5分鐘。動力學參數由Octet Data Acquisition及Analysis Software計算和產生。在
該測定中,抗CHI3L1抗體對融合了flag-His標籤的重組hCHI3L1的結合親和力為約1.13E-09M至4.22E-09M(第16A圖、第16B圖、第16C圖、第16D圖和表3)。儘管所有單株抗體具有相似的親和力,但與其他單株抗體相比,R4-4具有不同的結合動力學特徵,其具有較慢的開啟率(kon)和關閉率(koff),這表示R4-4對於CHI3L1具有不同的分子相互作用機制。
四種單克隆抗體的抗原決定位的製圖/分組。
為了了解這四種抗體的抗原決定位覆蓋率以提高治療性CHI3L1抗體開發的成功率,抗原決定位分組用於表徵單株抗體與相應抗原的結合位點,並總結在表4中。在抗原決定位分組中,對同一標靶蛋白特異的單株抗體與一組中的所有單株抗體成對測試,以評估它們是否阻斷彼此與抗原的特定位點的結合。阻斷與同一抗原決定位結合的單株抗體被「分組」在一起。同一箱中的單株抗體通常功能相似,因此抗原決定位箱可將選擇範圍縮小至更少的候選者以供研究人員選擇。在Octet Red96上進行的串聯抗原決定位分組分析包括一個五步驟結合循環;1)建立緩衝基線,30秒,2)100nM hCHI3L1/flag-His被捕
獲,5分鐘,3)100nM mAb陣列被加載,以飽和被捕獲的抗原,10分鐘,4)100nM的測試mAb結合,5分鐘,以及5)捕獲表面再生,30秒。用10mM甘氨酸pH值1.7再生抗His表面。使用ForteBio的數據分析HT軟體11.1處理原始數據,並評估抗體對的競爭性結合。第二抗體的額外結合表示未佔用的抗原決定位(非競爭者,在表4中標記為*c),而沒有結合表示抗原決定位阻斷(競爭者,在表4中標記為*b),以及自我競爭抗體在表4中標記為*a。在四種抗CHI3L1單株抗體中,有兩個抗原決定位簇。R4-4被確定為專有抗原決定位。R4-54、293R3-2和293R3-4具有單向阻斷結果,其發生在具有緊密相鄰或最小重疊抗原決定位的不同親和力抗體上。
雖然已經透過實例和根據優選實施例描述了本揭露,但應當理解本揭露不限於此。相反地,其旨在涵蓋各種修改和類似的佈置和程序,因此所附請求項的範圍應給予最廣泛的解釋,以涵蓋所有這樣的修改和類似的佈置和程序。
Claims (16)
- 一種結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,包括:一重鏈可變(VH)區包含一重鏈互補決定區(CDR-H1)、一CDR-H2和一CDR-H3,以及一輕鏈可變(VL)區包含一輕鏈互補決定區1(CDR-L1)、一CDR-L2和一CDR-L3,其中該CDR-H1具有SEQ ID NO:11,該CDR-H2具有SEQ ID NO:12,並且該CDR-H3具有SEQ ID NO:13;並且該CDR-L1具有SEQ ID NO:14,該CDR-L2具有SEQ ID NO:15,並且該CDR-L3具有SEQ ID NO:16,或其中該CDR-H1具有SEQ ID NO:35,該CDR-H2具有SEQ ID NO:36,並且該CDR-H3具有SEQ ID NO:37;並且該CDR-L1具有SEQ ID NO:38,該CDR-L2具有SEQ ID NO:39,並且該CDR-L3具有SEQ ID NO:40。
- 如請求項1所述之結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,更包括:該VH區具有與SEQ ID NO:9至少90%胺基酸序列同一性的一序列;該VL區具有與SEQ ID NO:10至少90%胺基酸序列同一性的一序列;或該VH區具有與SEQ ID NO:33至少90%胺基酸序 列同一性的一序列;該VL區具有與SEQ ID NO:34至少90%胺基酸序列同一性的一序列。
- 如請求項1所述之結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,其中該抗體為人類抗體。
- 如請求項1所述之結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,其中該抗體或其抗原結合部分為單鏈Fv(scFv)、片段-抗原結合(Fab)、(Fab')2或(scFv')2。
- 如請求項1所述之結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,其中該抗體為IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗體。
- 如請求項5所述之結合CHI3L1的抗體或其抗原結合部分,其中該IgG抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。
- 一種醫藥組成物,包括:如請求項1所述之該抗體或其該抗原結合部分,以及至少一種藥學上可接受載體。
- 如請求項7所述之醫藥組成物,更包括一治 療劑。
- 如請求項8所述之醫藥組成物,其中該治療劑包括吉西他濱。
- 一種抗體-藥物複合體,包括:一治療劑;以及如請求項1所述之該抗體或其該抗原結合部分,其中該治療劑透過一連接子與該抗體或其該抗原結合部分共價結合。
- 一種核酸分子,編碼如請求項1所述之該抗體或其該抗原結合部分。
- 一種如請求項1所述之該抗體或其該抗原結合部分的用途,其係用於製備治療癌症的藥物,其中該癌症為一CHI3L1表達腫瘤。
- 如請求項12所述之用途,其中該癌症為胰腺癌、結腸癌、肺癌、前列腺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、食道癌、頭頸癌、腎癌細胞癌(RCC)、卵巢癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、甲狀腺癌、皮膚癌、腦癌、骨癌、造血癌或白血病。
- 如請求項12所述之用途,其中該抗體或其該抗原結合部分與一治療劑合併使用。
- 如請求項14所述之用途,其中該治療劑包括吉西他濱。
- 如請求項12所述之用途,其中該抗體或其該抗原結合部分抑制活化的AKT訊號、抑制活化的細胞外訊號調節激酶(ERK)訊號、抑制癌細胞遷移、抑制腫瘤進展、抑制腫瘤纖維化、抑制血管生成、抑制惡病體質、調節腫瘤微環境(TME)朝向免疫刺激表型、或其組合。
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