TWI817178B - 同源重組缺失檢測方法及其試劑組 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種評估個體的同源重組缺失(homologous recombination deficiency ，HRD)狀態的方法、系統及試劑組。本發明進一步提供一種依據人類個體的HRD狀態而決定療法的方法、系統及試劑組。
Description
本申請案主張2021年1月10日提出的美國臨時申請案第63/135,622號的優先權，其全部內容通過引用併入本文。
本發明係關於一種評估同源重組缺失(homologous recombination deficiency，HRD)狀態的方法及試劑組。
聚(二磷酸腺苷核糖)聚合酶(poly(ADP-ribose)polymerases，PARPs)途徑及同源重組修復(homologous recombination repair，HRR)途徑皆參與DNA損傷之修復。抑制PARP可能導致未修復的DNA單股斷裂(single-strand breaks，SSBs)以及暫停複製叉(replication forks)的累積，造成DNA複製過程中複製叉崩解以及產生雙股DNA斷裂(double-strand DNA breaks，DSBs)。在正常細胞中，雙股DNA斷裂是透過HRR途徑予以修復。當HRR有缺失時，抑制PARP會導致合成致死(synthetic lethality)發生。現今，PARP抑制劑已被開發為帶有同源重組缺失癌症患者的治療藥物。
關於PARP抑制劑療法，在該療法開始前大多需要進行生物標誌物(biomarker)檢測(即BRCA1/2突變狀態)，以識別最能從該療法中獲益的患者。到目前為止，已經獲得食品藥物管理局批准的PARP抑制劑療法的伴隨式診斷檢測(companion diagnostic test)僅有兩種，即Myriad myChoice和FoundationFocus。目前仍然需要開發更多的伴隨式診斷檢測法以測定患者的HRD狀態。
總括而言，本發明係關於一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的方法，包含：(1)對來自一個體的一樣本中的複數個單核苷酸多型性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(loci)進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間(interval)，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；(2)依據該定序的結果確定異型合子喪失(loss of heterozygosity，LOH)SNP位點的數量及非同型合子(non-homozygous)SNP位點的數量；(3)計算LOH分數，其中該LOH分數是該LOH SNP位點的數量與該非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(4)依據該LOH分數識別HRD狀態。
在一些實施例中，該複數個SNP位點的數量為至少1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000。60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、或300000個。在一些實施例中，該複數個SNP位點的數量為1000至260000個、2000至200000個、3000至100000個、3000至60000個、6000至11000個、7000至10000個、或7500至9500個。在一些實施例中，該複數個SNP位點係位於至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22對人類染色體。在一些實施例中，該複數個SNP位點係位於體染色體(autosomal chromosome)。在一些實施例中，該SNP位點係位於人類染色體臂1p、2p、3p、4p、5p、6p、7p、8p、9p、10p、11p、12p、16p、17p、18p、19p、20p、21p、22p、1q、2q、3q、4q、5q、6q、7q、8q、9q、10q、11q、12q、13q、14q、15q、16q、17q、18q、19q、20q、21q及/或22q。在一些實施例中，該複數個SNP位點之間的複數個區間中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的區間的長度為介於0.01Mb至3Mb、0.02Mb至2Mb、0.03Mb至1Mb、0.06Mb至1Mb、0.1Mb至1Mb、0.1Mb至0.5Mb、或0.06Mb至0.6Mb。在一些實施例中，該複數個SNP位點之間的區間的平均長度為介於0.01Mb至3Mb、0.02Mb至2Mb、0.03Mb至1Mb、0.06Mb至1Mb、0.1Mb至1Mb、0.06Mb至0.6Mb、0.1Mb至0.5Mb、或0.2Mb至0.4Mb。
在一些實施例中，染色體異常(chromosomal aberration)是異型合子喪失(LOH)。在一些實施例中，該HRD分數是LOH分數。在一些實施例中，該LOH分數是帶有染色體異常的非同型合子SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值。在一些實施例中，該LOH分數是LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值。在一些實施例中，非同型合子SNP位點包含異型合子(heterozygous)SNP位點及LOH SNP位點。在一些實施例中，該異型合子SNP位點是從SNP位點中確定。
在一些實施例中，該LOH分數是透過排除不平衡染色體臂(imbalanced chromosome arm)來調整。在一些實施例中，該LOH分數是該LOH SNP位點在非不平衡染色體臂上的數量與該非同型合子SNP位點在非不平衡染色體臂上的數量之比值。在一些實施例中，該不平衡染色體臂的特徵是一染色體臂中該LOH SNP位點的數量相對於該非同型合子SNP位點的數量為一預定比值，且該預定比值為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
在一些實施例中，用於表徵不平衡染色體臂的帶有LOH的非同型合子SNP位點的比值是依據樣本的腫瘤含量(tumor purity)值進行調整。在一些實施例中，用於識別不平衡染色體臂的帶有LOH的非同型合子SNP位點的比值為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。在一些實施例中，該腫瘤含量值是介於30%至95%之間或介於30%至70%之間。在一些實施例中，該腫瘤含量值為30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
在一些實施例中，該HRD狀態被識別為HRD陽性或HRD陰性。在一些實施例中，用於識別HRD狀態的LOH分數的閾值(cutoff value)為0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55或0.6。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估個體的HRD狀態的方法，包含：(1)對來自一個體的一樣本中的複數個SNP位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；(2)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估個體的HRD狀態的方法，包含：(1)對來自一個體的一樣本中的至少一同源重組修復(HRR)相關基因進行定序；(2)確定該HRR相關基因之任一者是否帶有變異(alteration)；以及(3)識別該個體的HRD狀態。
在一些實施例中，當該基因至少一者帶有變異時，HRD狀態被識別為HRD陽性。在一些實施例中，當沒有任何基因帶有變異時，HRD狀態被識別為HRD陰性。
在一些實施例中，該變異是選自由單核苷酸變異(single nucleotide variant，SNV)、插入(insertion)、缺失(deletion)、擴增(amplification)、基因融合(gene fusion)及重組(rearrangement)所組成的群組。在一些實施例中，該變異是選自由SNV、小片段插入和缺失(small insertions and deletion，INDEL)、大片段基因重組(large genomic rearrangement，LGR)及拷貝數變異(copy number variation，CNV)所組成的群組。在一些實施例中，該變異是生殖細胞變異(germline alteration)或體細胞變異(somatic alteration)。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估個體的HRD狀態的方法，包含：(1)對包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合之基因進行定序；(2)確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D及RAD54L之任一基因是否帶有變異；以及(3)識別HRD狀態。
在一些實施例中，該方法進一步包含依據該個體的該HRD狀態決定一療法的步驟及/或向該個體施用治療有效量的一療法的步驟。
在一些實施例中，該療法包含給予一藥物，其包括但不限於DNA損傷劑(DNA damaging agent)、蒽環類化合物(anthracycline)、拓樸異構酶I抑制劑
(topoisomerase I inhibitor)、放射線、及/或PARP抑制劑或其任意組合。在一些實施例中，該PARP抑制劑包括但不限於奧拉帕利(olaparib)、尼拉帕利(niraparib)、魯卡帕利(rucaparib)及他拉唑帕利(talazoparib)。
在一些實施例中，評估樣本的HRD狀態的方法是在次世代定序(NGS)計算平臺上執行。在一些實施例中，該樣本是藉由NGS檢測進行定序。在一些實施例中，用於NGS檢測的次世代定序系統包括但不限於Illumina公司製造的MiSeq、HiSeq、MiniSeq、iSeq、NextSeq、及NovaSeq定序儀，Life Technologies公司製造的Ion Personal Genome Machine(PGM)、Ion Proton、Ion S5系列、及Ion GeneStudio S5系列，以及BGI公司製造的BGIseq系列、DNBseq系列及MGIseq系列，以及由Oxford Nanopore Technologies公司製造的MinION/PromethION定序儀。
在一些實施例中，定序片段(sequencing reads)是由初始樣本擴增後的核酸或用誘餌(bait)捕獲的核酸而產生。在一些實施例中，該定序片段是從需要添加一轉接子序列(adapter sequence)的定序儀所產生。在一些實施例中，該定序片段是從包括但不限於下列的方法所產生：雜交捕獲(hybrid capture)、引子延伸目標擴增(primer extension target enrichment)、基於分子倒位探針(molecular inversion probe)的方法、或多重目標特異性聚合酶連鎖反應(multiplex target-specific PCR)。
在一些實施例中，該樣本是來自細胞株(cell line)、活體組織檢體(biopsy)、原發組織(primary tissue)、冷凍組織、福馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)組織、液態活體組織檢體(liquid biopsy)、血液、血清、血漿、白血球層(buffy coat)、體液、內臟液、腹水、腔液穿刺(paracentesis)、腦脊髓液、唾液、尿液、淚液、精液、陰道分泌物、抽出物(aspirate)、灌洗液(lavage)、口腔抹片(buccal swab)、外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)、循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)、游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)、循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、DNA、RNA、核酸、純化之核酸、純化之DNA、或純化之RNA。
在一些實施例中，該樣本來自一人類個體。在一些實施例中，該樣本是一臨床樣本。在一些實施例中，該樣本來自一患者。在一些實施例中，該樣本來自一患者，其患有癌症、實體瘤、或血液惡性腫瘤。在一些實施例中，該
樣本來自一患者，其患有卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、乳癌(breast cancer)、胰臟癌(pancreatic cancer)。在一些實施例中，該樣本來自一患者，其患有腦癌(brain cancer)、乳癌(breast cancer)、結腸癌(colon cancer)、內分泌腺癌(endocrine gland cancer)、食道癌(esophageal cancer)、女性生殖器官癌、頭頸癌(head and neck cancers)、肝膽系統癌症(hepatobiliary system cancer)、腎癌(kidney cancer)、肺癌(lung cancer)、間質細胞瘤(mesenchymal cell neoplasm)、前列腺癌(prostate cancer)、皮膚癌(skin cancer)、胃癌(stomach cancer)、外分泌胰腺瘤(tumor of exocrine pancreas)、或泌尿系統癌(urinary system cancer)。在一些實施例中，該樣本來自孕婦、兒童、青少年、老年人或成年人。在一些實施例中，該樣本是一研究樣本。
在一些實施例中，該方法進一步包含將HRD狀態輸出至一電子儲存媒體或一顯示器的步驟。
另一方面，本發明大體上係關於一種在NGS計算平臺上執行的評估個體的HRD狀態的方法，包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的一基因的變異，包含：(1a)對該樣本的包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合的基因進行定序；及(1b)確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D及RAD54L之任一基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的HRD分數，包含：(2a)對該樣本的複數個SNP位點進行定序；及(2b)計算一染色體異常的HRD分數；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種在NGS計算平臺上執行的評估個體的HRD狀態的方法，包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的複數個基因的變異，包含：
(1a)對至少一HRR相關基因進行定序；及(1b)確定該HRR相關基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的LOH分數，包含：(2a)對該樣本的複數個SNP位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)識別HRD狀態。
在一些實施例中，當該基因至少一者帶有變異或該分數(即LOH分數或HRD分數)大於一閾值時，該HRD狀態為HRD陽性。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估HRD狀態的系統。該系統包含一資料儲存裝置，其儲存用於測定HRD狀態特徵的指令，以及一處理器，其被設置成執行該指令以運行一包含下列步驟的方法：(1)對一樣本中的複數個SNP位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；(2)計算LOH分數，其中該LOH分數是該LOH SNP位點的數量與該非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估HRD狀態的系統。該系統包含一資料儲存裝置，其儲存用於測定HRD狀態特徵的指令，以及一處理器，其被設置成執行該指令以運行一包含下列步驟的方法：(1)對包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合之基因進行定序；(2)確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D及RAD54L之任一基因是否帶有變異；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估HRD狀態的系統。該系統包含一資料儲存裝置，其儲存用於測定HRD狀態特徵的指令，以及一處理器，其被設置成執行該指令以運行一包含下列步驟的方法：(1)檢測一樣本中的複數個基因的變異，包含：(1a)對包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合的基因進行定序；及(1b)確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L之任一基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的HRD分數，包含：(2a)對該樣本的複數個SNP位點進行定序；及(2b)計算一染色體異常的HRD分數；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估HRD狀態的系統。該系統包含一資料儲存裝置，其儲存用於測定HRD狀態特徵的指令，以及一處理器，其被設置成執行該指令以運行一包含下列步驟的方法：(1)檢測一樣本中的複數個基因的變異，包含：(1a)對至少一HRR相關基因進行定序；及(1b)確定該HRR相關基因之任一者是否帶有變異；(2)計算該樣本的LOH分數，包含：(2a)對該樣本的複數個SNP位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)識別HRD狀態。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估一樣本的HRD狀態的試劑組，包含：(1)一組靶向複數個SNP位點的寡核苷酸(oligonucleotides)；
(2)一组靶向複數個HRR相關基因的寡核苷酸；以及(3)一電腦程式，包含用於執行一識別HRD狀態的方法的指令。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估一樣本的HRD狀態的試劑組，包含：(1)一試劑，包含：一組靶向複數個SNP位點的寡核苷酸，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；以及(2)一電腦程式，包含：計算LOH分數的指令，其中該LOH分數是LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；及用於識別HRD狀態的指令。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估一樣本的HRD狀態的試劑組，包含：(1)一試劑，包含：一組靶向一基因的寡核苷酸，該基因包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合；以及(2)一電腦程式，包含：確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L之任一基因是否帶有變異的指令；及用於識別HRD狀態的指令。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估一樣本的HRD狀態的試劑組，包含：(1)一試劑，包含：一組靶向複數個SNP位點的寡核苷酸，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及一组靶向至少一HRR相關基因的寡核苷酸；以及
(2)一電腦程式，包含：計算LOH分數的指令，其中該LOH分數是LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；確定該HRR相關基因之任一者是否帶有變異的指令；及識別HRD狀態的指令。
另一方面，本發明大體上係關於一種評估一樣本的HRD狀態的試劑組，包含：(1)一試劑，包含：一組靶向複數個SNP位點的寡核苷酸，及一組靶向一基因的寡核苷酸，該基因包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合；以及(2)一電腦程式，包含：計算一染色體異常的HRD分數的指令；確定前述BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L之任一基因是否帶有變異的指令；及識別HRD狀態的指令。
在一些實施例中，該電腦程式進一步包含依據個體的HRD狀態確定一療法的指令。
圖1A-1D顯示兩個腫瘤樣本(GSM956523和GSM956527)及兩個正常樣本(GSM956582和GSM956597)的LOH分數的穩定性，該LOH分數係以採計不同數量SNP位點的不同演算法計算而得。
圖2A顯示不同腫瘤組別及正常樣本組的LOH分數，其係以採計不同數量SNP位點的公式1計算而得。
圖2B顯示不同腫瘤組別及正常樣本組的LOH分數，其係以採計不同數量SNP位點的公式2計算而得。
圖3顯示在考慮或忽略染色體臂不平衡因素的情況下，不同腫瘤含量的LOH分數。
圖4係顯示SNP位點之間區間長度的盒形圖。
圖5係顯示不同組別LOH分布的盒形圖。
除非另有定義，本文中使用的所有技術及科學術語具有與本揭露所屬技術領域中熟習技藝者通常理解的相同含義。除非上下文另有明確指示，本文中所使用的單數形式「一」、「一個」及「該」包含複數指稱。
本文中所用的「HRR相關基因(HRR-associated gene)」係指一HRR基因或其調節因子(regulator)或其調控因子(modulator)。HRR相關基因的變異可能造成HRD。在一些實施例中，HRR相關基因是選自於由BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、ABL1、BAP1、BARD1、BLM、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、ERCC1、ERCC3、ERCC4、FANCA、FANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCL、LIG3、MRE11、MSH2、MSH6、MLH1、NBN、PALB2、PTEN、PARP1、POLB、RAD50、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54L、UBE2A、XRCC2、DNMT3A、IDH1、IDH2、STAG2及TP53基因所組成的群組。在一些實施例中，HRR相關基因是選自於由BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、及RAD54L基因所組成的群組。
本文中所用「閾值(cutoff value)」係指用於區分一生物樣本的兩個或多個分類狀態的一數值或其他表示方式。在本發明的一些實施例中，閾值被用於區分HRD陽性和HRD陰性。如果HRD分數大於閾值，則HRD狀態被判定為HRD陽性；或者如果HRD分數小於閾值，則HRD狀態被判定為HRD陰性。
本文中所用「不平衡染色體臂(imbalanced chromosome arm)」係指染色體臂的拷貝數缺失或增加。在一些實施例中，不平衡染色體臂是指一染色體
臂具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的帶有LOH的非同型合子SNP位點。
本文中所用「腫瘤含量(tumor purity)」是一腫瘤樣本中的癌細胞占比。腫瘤含量會影響使用NGS方法所測定的分子與基因體學特徵的準確評估。在本發明的一些實施例中，樣本的腫瘤含量為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或100%。
本文中所用「深度(depth)」係指每一位置的定序片段數。「平均深度」係指整個定序區域的平均片段數。一般而言，平均深度對NGS檢測的效能有影響。平均深度越高，突變的變異頻率(variant frequency)的變異性(variability)越低。在本發明的一些實施例中，樣本整個定序區域的平均深度為至少200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍、2000倍、3000倍、4000倍、5000倍、6000倍、8000倍、10000倍、或20000倍。
本文中所用「定序覆蓋度(coverage)」係指在某一位點的深度。「目標鹼基定序覆蓋度(target base coverage)」係指以高於一預定值的深度進行定序的區域所占的百分比。目標鹼基定序覆蓋度需要指出進行評估時的深度。在一些實施例中，100倍時的目標鹼基定序覆蓋度是85%，此表示85%的定序目標鹼基被深度為至少100倍的定序片段所覆蓋。在一些實施例中，30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、125倍、150倍、175倍、200倍、300倍、400倍、500倍、750倍、1000倍時的目標鹼基定序覆蓋度是高於70%、75%、80%、85%、90%或95%。
本文中所用「個體(subject)」或「人類個體(human subject)」係指被正式診斷出疾病的人、未被正式確認疾病的人、接受醫療關注的人、有罹病風險的人等。
本文中所用「治療(treat)」、「療法(treatment)」及「治療(treating)」包括治療性治療、預防性治療、以及減少個體罹病風險或降低其他風險因子的處置。治療不要求完全治癒疾病，而是涵蓋減輕症狀或潛在風險因子的實施例。
本文中所用「治療有效量(therapeutically effective amount)」係指引起所期望的生物或臨床效果所需的治療活性分子的量。在本發明的較佳實施例中，「治療有效量」是治療具備HRD陽性的癌症患者所需的藥物量。
本揭露將藉由以下實施例進一步說明，該些實施例的目的是示範而非限制。
實施例1 LOH計分演算法的穩定性試驗
本研究旨在評估由不同演算法得出的LOH分數的穩定性。
對從人類基因表現圖譜晶片Affymetrix GeneChip Human Mapping 250K Nspl陣列資料中隨機選擇的26萬(260K)、15萬(150K)、10萬(100K)、5萬(50K)、4萬(40K)、3萬(30K)、2萬(20K)、1萬(10K)、9千(9K)、8千(8K)、7千(7K)、6千(6K)、5千(5K)、4千(4K)、3千(3K)、2千(2K)或1千(1K)個SNP位點進行了電腦降採樣(in silico downsampling)。前述資料發表在高通量基因表現數據庫GEO(Gene Expression Omnibus)，其GEO編號為GSE39130(Wang,Birkbak,et al.,2012)。我們首先為該陣列資料中的每個SNP位點歸屬染色體臂資訊，並且對同型合子、異型合子、及異型合子喪失(LOH)之SNP位點的等位基因頻率範圍加以定義。該電腦降採樣是透過在染色體臂層次進行分層抽樣，以獲得指定數量的SNP。我們對每個染色體臂的SNP位點進行獨立採樣，以確保降採樣後的每個染色體臂的SNP位點數量與原始資料集成正比。經由使用100個靴拔重複抽樣(bootstrap)試樣，評估不同演算法在SNP位點的數量不同時，其LOH分數的變異情形。公式1將LOH SNP的數量列入考量，藉由異型合子喪失SNP的數量與非同型合子SNP的數量之比值來計算LOH分數。相對地，公式2考慮LOH SNP的總長度，藉由異型合子喪失SNP區域的總長度與基因體長度(genome size)的比值來決定LOH分數。該分析是利用統計軟體R(4.0.0版)進行。
圖1A-1D顯示使用兩種不同演算法對兩個腫瘤樣本(GSM956523和GSM956527)及兩個正常樣本(GSM956582和GSM956597)進行LOH計分的結果。使用公式1的計算結果顯示，當SNP位點數量不同時，LOH分數的中位數是穩定的，而由公式2得出的LOH分數隨著SNP位點數量的減少而下降。
實施例2 LOH計分演算法的驗證
本研究選擇了一種估計LOH分數的演算法，該演算法在SNP位點的數量不同時，LOH分數在腫瘤組與正常組之間皆具有顯著差異。
前述研究中使用的所有樣本都被納入分析(Wang,Birkbak,et al.,2012)。具有BRCA2LOH的腫瘤樣本被歸類到基因體高不穩定性組(GI-H)，與此相對，基因體低不穩定性組(GI-L)是沒有BRCA2 LOH的腫瘤樣本。由於具有BRCA2 LOH的細胞表現出基因體不穩定性，並且表現出對DNA損傷劑的高度敏感性，因此本研究中的GI-H組可以代表藥物敏感組，而GI-L組可以代表抗藥性組。GI-H組、GI-L組和正常組中分別有12、11及18個樣本。在SNP位點數量為26萬(260K)、5萬(50K)、1萬(10K)、7千(7K)、5千(5K)、3千(3K)、2千(2K)及1千(1K)的情況下，以實施例1中描述的公式1和公式2估算每個樣本的LOH分數。利用威爾卡森符號檢定(Wilcoxon signed-rank test)估算GI-H組、GI-L組及正常組樣本的LOH分數之間的P值。
當使用公式1時，我們發現GI-H和GI-L二個腫瘤組在所有不同數量SNP位點下的LOH分數之間存在顯著差異(P值<0.05)。然而，使用公式2時，只有在SNP位點的數量等於或高於7千時，二個腫瘤組的LOH分數間才有顯著差異。
實施例3 在考慮或不考慮染色體臂不平衡因素的情況下，對不同腫瘤含量的樣本進行LOH計分
本研究的目的是評估染色體臂不平衡對LOH分數計算的影響。
將帶有拷貝數變異的癌細胞株樣本(NCL-H1395)和與其相匹配的正常樣本(match-normal sample)混合，以模擬不同的腫瘤含量。實驗流程包括DNA萃取、構建序列庫及NGS定序，皆與實施例5一致。不同腫瘤含量的混合樣本的LOH分數由三種不同演算法來估計。第一種演算法在不考慮染色體臂不平衡的影響下計算LOH分數(公式1)。第二及第三種演算法考慮了染色體臂不平衡的因素，其排除了位於不平衡染色體臂上的SNP(公式3)。不平衡染色體臂以一染色體臂上LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值為特徵。在本實施例中的該比值為85%。第三種演算法進一步調整了帶有LOH的非同型合子SNP位點的比值，以便基於不同腫瘤含量去表徵不平衡染色體臂。
圖3顯示在不同腫瘤含量下使用三種不同演算法的LOH計分結果。第一種演算法計算得到的LOH分數隨著腫瘤含量上升而急劇增加。相對地，當腫瘤含量大於30%，由第二及第三種演算法計算得的LOH分數是穩定的。
實施例4 測定癌症樣本的HRD狀態
設計一基於擴增子(amplicon)的次世代基因定序套組(NGS panel)，使其靶向Panel A的編碼區(coding regions)，Panel A包括ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D及RAD54L，以及橫跨整個人類基因體的約9000個SNP位點。SNP位點之間的區間的長度平均為約0.3Mb(圖4)。
收集來自癌症患者的福馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣本及外周血單核細胞(PBMC)樣本，並且利用NGS基因定序套組進行檢測。使用RecoverAllTM總核酸分離試劑組(RecoverAllTM Total Nucleic Acid Isolation Kit；Thermo Fisher Scientific)萃取基因體DNA。依據CleanPlex NGS基因定序套組(CleanPlex NGS panel；Paragon Genomics，美國)的使用說明書構建NGS序列庫(NGS library)。簡言之，使用靶向前述設計區的引子，藉由多重PCR反應擴增60ng DNA。在使用
磁珠進行純化、CP消化(CP digestion)及第二次純化後，依據使用說明書，使用Illumina i5和i7標籤引子(indexing primers)進行第二次PCR反應。再次純化後，對樣本進行毛細管電泳(FragmentAnalyzer，AATI)。將通過序列庫品質控管(QC)的樣本混合以便在NextSeq550定序儀(Illumina，美國)上進行定序，前述流程是依據製造商的系統說明書以及Illumina次世代定序系統變性與稀釋序列庫說明書(Illumina NextSeq System Denature and Dilute Libraries Guide)。
使用BWA(0.7.17版)將由定序儀產生的原始讀序回貼至hg19參考基因體。使用Pisces(5.2.5.20版)識別單核甘酸變異(SNVs)及小片段插入和缺失(INDELs)。使用變異影響預測軟體VEP(Variant Effect Predictor)(88版)並利用Clinvar資料庫(20180729版)與Genome Aggregation資料庫r2.1.1註解每個變異。藉由bedtools及samtools工具進行定序覆蓋度分析，以計算套組中每個目標鹼基和目標擴增子的深度。
對樣本進行品質控管以確保每個樣本的平均定序深度達到1000倍。
為了判定大片段基因重組(LGR)及拷貝數變異(CNV)，自所有可檢測到的擴增子中，刪除讀序數(read counts)屬最低的百分之一和最高的百分之0.5的擴增子，以及刪除變異係數
0.35的擴增子。其餘的擴增子經過標準化處理以校正序列庫的設計偏差。使用ONCOCNV(Boeva等人在2014年提出的計算擴增子定序資料中拷貝數變異的方法)進行擴增子總數、擴增子GC含量、擴增子長度及技術相關偏差的標準化，隨後以基因感知模型(gene-aware model)將樣本分段。每個基因和外顯子(exon)的觀察拷貝數(observed copy number)是以ONCOCNV來計算。腫瘤外顯子組異常檢測(Aberration Detection in Tumour Exome，ADTEx)軟體(Amarasinghe等人，2014)被用來計算每個FFPE樣本的腫瘤含量。透過FFPE樣本的腫瘤含量校正計算出每個基因的校正拷貝數。
依據SNP的變異等位基因頻率(variant allele frequency)認定該SNP為LOH SNP或異型合子SNP。一個樣本的LOH分數是依據公式3計算處於LOH狀態的SNP的比例。
當檢測到染色體臂不平衡時，該染色體臂上的所有SNP被排除而不納入分析。這裡所謂的染色體臂不平衡被是指檢測到整個染色體臂的拷貝數增加或缺失。
受測樣本的LOH分數列於表2。
實施例5 不同基因型組別樣本的LOH分布
本研究旨在評估Panel A中不同基因型樣本的LOH分數的分布。該Panel A包括ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、及RAD54L。
依實施例4中的檢測方法對總計92個卵巢癌樣本及4個正常樣本進行定序，並且以公式3計算每個樣本的LOH分數。樣本的Panel A之基因具有致病性突變(pathogenic mutation)或可能致病性突變(likely pathogenic mutation)者，該樣本被歸類為Panel A基因缺失(deleterious)。相對地，所有Panel A基因沒有致病性突變或可能致病性突變的其他樣本被認為是Panel A基因野生型(WT)。圖5顯示了各組樣本LOH分數的分布。
不同組別樣本的LOH分數的分布顯示，Panel A基因缺失組相比其他組別有較高的LOH分數。
Claims (43)
- 一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的方法，包含：(1)對來自一個體的一樣本中的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；(2)依據該定序的結果確定異型合子喪失(LOH)SNP位點的數量及非同型合子(non-homozygous)SNP位點的數量；(3)計算LOH分數，其中該LOH分數是該LOH SNP位點的數量與該非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(4)依據該LOH分數識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點的數量為至少1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、20000、30000、40000、50000。 60000、70000、80000、90000、100000、110000、120000、130000、140000、150000、160000、170000、180000、190000、200000、210000、220000、230000、240000、250000、260000、270000、280000、290000、或300000個。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點的數量為2500至250000個。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點的數量為3000至60000個。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點的數量為6000至11000個。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點係位於至少2對染色體。
- 如請求項1所述之方法，其中該複數個SNP位點係位於22對染色體。
- 如請求項1所述之方法，其中該區間的平均長度為介於0.01Mb至3Mb。
- 如請求項1所述之方法，其中步驟(3)進一步包含透過排除不平衡染色體臂(imbalanced chromosome arm)來調整該LOH分數。
- 如請求項9所述之方法，其中該LOH分數是該LOH SNP位點在非不平衡染色體臂上的數量與該非同型合子SNP位點在非不平衡染色體臂上的數量之比值。
- 如請求項9所述之方法，其中該不平衡染色體臂的特徵是一染色體臂中該LOH SNP位點的數量相對於該非同型合子SNP位點的數量為一預定比值，其中該預定比值為至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。
- 如請求項11所述之方法，其中該預定比值係依據該樣本的腫瘤含量(tumor purity)進一步調整。
- 如請求項12所述之方法，其中該腫瘤含量為30%至95%。
- 如請求項12所述之方法，其中該腫瘤含量為30%至70%。
- 一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的方法，包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的一基因的變異，包含：(1a)對該樣本的包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合的基因進行定序；及(1b)確定該基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的一異型合子喪失(LOH)分數，包含：(2a)對該樣本的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)依據步驟(1b)及步驟(2b)的結果識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 如請求項15所述之方法，其中當該基因帶有變異，該HRD狀態為HRD陽性。
- 如請求項15所述之方法，其中當該基因未帶有變異，該HRD狀態為HRD陰性。
- 如請求項15所述之方法，其中該變異是生殖細胞變異(germline alteration)或體細胞變異(somatic alteration)。
- 如請求項15所述之方法，其中該變異是選自由單核苷酸變異(SNV)、插入、缺失、擴增、基因融合及重組所組成的群組。
- 如請求項15所述之方法，其中該變異是選自由SNV、小片段插入和缺失(INDEL)、大片段基因重組(LGR)及拷貝數變異(CNV)所組成的群組。
- 一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的方法，包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的一基因的變異，包含：(1a)對一同源重組修復(HRR)相關基因進行定序；及(1b)確定該HRR相關基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的一異型合子喪失(LOH)分數，包含：(2a)對該樣本的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)依據步驟(1b)及步驟(2b)的結果識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中當該LOH分數大於一閾值，該HRD狀態為HRD陽性。
- 如請求項1、15或21所述之方法，進一步包含依據該個體的該HRD狀態決定一療法的步驟。
- 如請求項23所述之方法，其中該療法是選自由DNA損傷劑、蒽環類化合物(anthracycline)、拓樸異構酶I抑制劑(topoisomerase I inhibitor)、放射線、PARP抑制劑及其任意組合所組成的群組。
- 如請求項24所述之方法，其中該PARP抑制劑是選自由奧拉帕利(olaparib)、尼拉帕利(niraparib)、魯卡帕利(rucaparib)及他拉唑帕利(talazoparib)所組成的群組。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該評估樣本的HRD狀態的方法是在一次世代定序(NGS)計算平臺上執行。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該樣本是藉由NGS檢測進行定序。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該樣本來自細胞株、活體組織檢體、原發組織、冷凍組織、福馬林固定石蠟包埋組織、液態活體組織檢體、血液、血清、血漿、白血球層、體液、內臟液、腹水、腔液穿刺、腦脊髓液、唾液、尿液、淚液、精液、陰道分泌物、抽出物、灌洗液、口腔抹片、循環腫瘤細胞、游離DNA、循環腫瘤DNA、DNA、RNA、核酸、純化之核酸、純化之DNA、或純化之RNA。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該個體是人類。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該個體是一癌症患者。
- 如請求項1、15或21所述之方法，其中該樣本的腫瘤含量為至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。
- 如請求項1、15或21所述之方法，進一步包含將該HRD狀態輸出至一電子儲存媒體或一顯示器的步驟。
- 一種評估同源重組缺失(HRD)狀態的系統，包含：一資料儲存裝置，儲存用於測定HRD狀態特徵的指令；以及一處理器，被設置成執行該指令以運行一方法，該方法包含：(1)對來自一個體的一樣本中的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；(2)依據該定序的結果確定異型合子喪失(LOH)SNP位點的數量及非同型合子SNP位點的數量；(3)計算LOH分數，其中該LOH分數是該LOH SNP位點的數量與該非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(4)依據該LOH分數識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 一種評估同源重組缺失(HRD)狀態的系統，包含：一資料儲存裝置，儲存用於測定HRD狀態特徵的指令；以及一處理器，被設置成執行該指令以運行一方法，該方法包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的一基因的變異，包含：(1a)對該樣本的包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、RRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、 NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合的基因進行定序；及(1b)確定該基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的一異型合子喪失(LOH)分數，包含：(2a)對該樣本的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)依據步驟(1b)及步驟(2b)的結果識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 一種評估同源重組缺失(HRD)狀態的系統，包含：一資料儲存裝置，儲存用於測定HRD狀態特徵的指令；以及一處理器，被設置成執行該指令以運行一方法，該方法包含：(1)檢測來自一個體的一樣本中的一基因的變異，包含：(1a)對一同源重組修復(HRR)相關基因進行定序；及(1b)確定該HRR相關基因是否帶有變異；(2)計算該樣本的一異型合子喪失(LOH)分數，包含：(2a)對該樣本的複數個單核苷酸多型性(SNP)位點進行定序，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及(2b)計算LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；以及(3)依據步驟(1b)及步驟(2b)的結果識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性。
- 如請求項33至35中任一項所述之系統，其中該方法進一步包含依據該個體的該HRD狀態來決定一療法的步驟。
- 一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的試劑組，包含：一試劑，包含：一組靶向複數個單核苷酸多型性(SNP)位點的寡核苷酸，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；以及一電腦程式，包含： 計算一異型合子喪失(LOH)分數的指令，其中該LOH分數是LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；及依據該LOH分數識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性的指令。
- 一種評估個體的同源重組缺失(HRD)狀態的試劑組，包含：一試劑，包含：一組靶向複數個單核苷酸多型性(SNP)位點的寡核苷酸，其中每二個相鄰的SNP位點之間有一區間，並且至少50%的該區間的長度為介於0.01Mb至1Mb；及一组靶向一同源重組修復(HRR)相關基因的寡核苷酸；以及一電腦程式，包含：計算一異型合子喪失(LOH)分數的指令，其中該LOH分數是LOH SNP位點的數量與非同型合子SNP位點的數量之比值；確定該HRR相關基因是否帶有變異的指令；及依據該LOH分數及該HRR相關基因是否帶有變異識別HRD狀態為HRD陽性或HRD陰性的指令。
- 如請求項38所述之試劑組，其中該HRR相關基因包含BRCA1、BRCA2、ARID1A、ATM、ATR、ATRX、BARD1、BRIP1、CDK12、CHEK1、CHEK2、FANCA、FANCL、FANCM、HDAC2、NBN、PALB2、PPP2R2A、PTEN、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD54L或其任意組合。
- 如請求項37或38所述之試劑組，其中當該LOH分數大於一閾值，該HRD狀態為HRD陽性。
- 如請求項38所述之試劑組，其中當該HRR相關基因帶有變異，該HRD狀態為HRD陽性。
- 如請求項38所述之試劑組，其中當該LOH分數大於該閾值或該HRR相關基因帶有變異，該HRD狀態為HRD陽性。
- 如請求項37或38所述的試劑組，其中該電腦程式進一步包含依據該個體的該HRD狀態確定一療法的指令。
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| 期刊 Huang et al., "LOH analysis of genes around D4S2964 identifies ARD1B as a prognostic predictor of hepatocellular carcinoma", World J Gastroenterol. Vol. 16, Issue 16, 2010 Apr 28 pages: 2046–2054. * |
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