TWI812214B - 水凝膠之製備方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種水凝膠之製備方法及其用途，具體來說，該水凝膠之製備方法係能夠透過一交聯反應將一膠質、一纖維物質及一溶劑聚合成為一水凝膠；透過本發明所揭製備方法得到之水凝膠，係具有根據環境因子變化而改變相態或/及結構之特性，因而得應用於不同用途上，例如細胞培養、細胞分離、藥物載體、美容敷料等。
Description
本發明係有關於一種生物相容性材料之製備方法及其用途，特別係指一種水凝膠之製備方法及其用途。
按，水膠（hydrogel）是由一種或多種單體的物化反應生成之聚合材料，具有柔軟度高、含水量高但不會溶於水之特性，因而近十年來，水膠被廣泛地應用於各醫療領域中，例如敷料、器官模型、眼科材料等。一般來說，水膠之製備方式可分為三種，第一種為使用單體聚合成的水膠；第二種為用外力讓聚合物產生交聯反應；第三種係將水膠連接（接枝）到具有一定強度之基材上，利用電將使基材表面產生自由基，即可把水膠以共價的方式接上。
更進一步來說，目前技術能將水膠加入聚異丙基丙烯醯胺，利用聚異丙基丙烯醯胺之特性使水膠具有能夠依據外在溫度變化化而改變型態之特性，成為溫度敏感性水膠，意即溫度敏感性水膠係能於32-37℃間由液態轉為膠態，因而能夠更廣泛地應用於生物醫學領域，惟，習知溫度敏感性水膠係具有降解太快、並且降解導致水膠穩定性不足等缺失。
本發明之主要目的係在於提供一種水凝膠之製備方法，其係提供一種多用途且具生物相容性之水凝膠，具體來說，該水凝膠係具有多孔隙、高吸水度、高柔軟性等特性，並能夠隨著環境溫度而變換相態，可能夠輕易添加功效性成分，因此，該水凝膠能夠依據其組成成分之不同並結合其獨特特性而被廣泛地被各個領域應用之功效，尤其是醫療、美容、細胞培養、細胞分離、生物技術之領域。
緣是，為能達成上述目的，本發明係揭露一種水凝膠之製備方法，其主要係透過交聯反應使高分子物質與纖維物質間能聚合形成一水凝膠，其中，該水凝膠係於一低溫環境下呈現液相，並於一高溫環境下呈現固相，具有多孔及多層之結構特徵。
於本發明之一實施例中，該水凝膠之製備方法係包含有下列步驟：
步驟a：製備一水膠，其係由F127、黃原膠、羧甲基纖維素和透明質酸混合並膠化所得者。
步驟b：取一由水組成之成膠液。
步驟c：將該水膠與該成膠液以5：1（v/v）% 之比例混合，並於25-27℃之環境進行成膠反應而得到該水凝膠。
於本發明另一實施例中，該水凝膠之製備方法係包含有下列步驟：
步驟a：製備一水膠，其係由F127、黃原膠、羧甲基纖維素和透明質酸混合並膠化所得者。
步驟b：取一成膠液，其係由一草本植物萃取物與一水所製備而成者。
步驟c：將該水膠與該成膠液以10：0.3（v/v）% 之比例混合，並於25-27℃之環境進行成膠反應而得到該水凝膠。
於本發明之實施例中，該水凝膠之製備方法係包含有下列步驟：
步驟a：製備一第一水膠
步驟b：製備一第二水膠；
該步驟c：將該第一水膠與該第二水膠以一預定比例混合並進行成膠反應，得到該水凝膠。
於其中一實施例中，該第一水膠係為一明膠/水溶液，該第二水膠係為一羧甲基纖維素/酒精溶液；而該該第一水膠與該第二水膠之比例（v/v）係為1：1-1：10。
於另一實施例中，該第一水膠係由F-127、殼聚醣及乙二醛所進行交聯反應所得者；該第二水膠係由氫氧化鈉溶液、透明質酸、聚乙二醇和1,4-丁二醇二縮水甘油醚進行交聯反應所得者；並於該步驟c中，該第一水膠之含量係大於該第二水膠之含量。
其中，該第一水膠與該第二水膠之比例（v/v）係為6：4-8：2。
由於以本發明所揭水凝膠之製備方法所製得之水凝膠具有生物相容性、多孔隙、高柔軟度等特性，因而能夠被用於作為藥物載體使用。
又，以本發明所揭水凝膠之製備方法所製得之水凝膠於添加一預定濃度之SDF1（stromal cell-derived factor 1）後，係能夠形成一SDF1水凝膠，其係能夠使具有分化能力之細胞自動遷移至其內生長，並且不影響該分化能力之細胞的活性，因而本發明所揭水凝膠係能夠用於作為細胞培養、細胞分離或細胞純化之材料，且不限於體外或體內使用。
本發明係揭露一種水凝膠之製備方法及其用途，具體來說，該水凝膠之製備方法係能夠透過一交聯反應將一膠質、一纖維物質及一溶劑聚合成為一水凝膠，其中，該水凝膠係具有根據環境因子變化而改變相態或/及結構之特性，而使該水凝膠得應用於不同用途上，例如細胞培養、細胞分離、藥物載體、美容敷料等。
具體來說，本發明所揭水凝膠係具有下列特性：
1. 具有多層及多孔隙之結構特徵。
2. 具有高柔軟度及高吸水度之特性。
3. 於低溫環境下呈現液態，於高溫環境下呈現固態。
4. 不具有生物毒性。
於本發明之第一實施例中所揭水凝膠之製備方法，係先於一低溫環境下將海藻酸鈉、黃原膠、羧甲基纖維素鈉和玻尿酸均勻地與F-127水溶液混合，再於一高溫環境下形成一水膠；將該水膠與一水混合而形成該水凝膠。
本發明第二實施例中所揭水凝膠之製備方法，係步驟係與第一實施例大致相同，惟不同者在於，該水膠係與一含有植物萃取物之水溶液進行混合而形成該水凝膠，使該水凝膠除能夠透過溫度變化而改變其態相外，更得釋放出該植物萃取物至該水凝膠所接觸之部位，例如皮膚。
本發明第三實施例中所揭水凝膠之製備方法，係將兩不同組成之水膠彼此混合後而得者，其中一水膠係為一明膠/水溶液，另一水膠係為羧甲基纖維素/酒精溶液。
其中，該第一水膠及/或該第二水膠係得加入任一具生理活性之組成份，用以增加該水凝膠之效用，例如該第一水膠或該第二水膠係更包含有一植物萃取物。
其中，由於水凝膠中所含有之草本萃取物具有抗氧化、促進傷口修復等特性，因此，當水凝膠貼附或接觸傷口處時，會逐漸地將草本萃取物或其內之活性成分釋放至該傷口，以有效地達到治療傷口、促進傷口復原、修復患處等功效。
本發明第四實施例中所揭水凝膠之製備方法，係將兩不同組成且具不同環境敏感性之水膠彼此混合後而得者，具體來說，該第一水膠係具有溫度敏感性，能於低溫環境下呈現液態並於高溫環境下呈現固態，而由F-127、殼聚醣及乙二醛進行交聯反應所得者；該第二水膠係具有酸鹼值敏感性，而由氫氧化鈉溶液、透明質酸、聚乙二醇和1,4-丁二醇二縮水甘油醚進行交聯反應所得者。
更進一步來說，由於藉由本發明所揭水凝膠之製備方法所揭之水凝膠係能於低溫環境下呈現液態，故能夠使其他物質於低溫環境下添加至液態之水凝膠中，可輕易地達到均勻混合之功效；並且，透過添加物質之不同，可以增加水凝膠之活性或是應用範圍。
當添加SDF1（stromal cell-derived factor 1）至水凝膠時，可以獲得SDF1水凝膠，其係能夠用於培養且分離具有分化能力之細胞，例如生殖細胞、造血幹細胞，其中，該SDF1水凝膠中SDF1濃度以1-4μg/ml為佳。
舉例來說，將SDF1水凝膠放置於胚胎上含始基生殖細胞的區域(germinal crescent或胚胎生殖腺)，孵育12~48小時後，將SDF1水凝膠放入低溫環境中，SDF1水凝膠會呈現液態，此時即可分離出純化之胚胎生殖細胞。又，將含有將SDF1水凝膠之多孔性材料放入一個體體內有血液流經之處，使個體體內之造血幹細胞會因為感受到SDF1水凝膠之SDF1濃度大於體內環境之SDF1濃度而自動遷移至SDF1水凝膠內，而後再自個體體內取出SDF1水凝膠，並將SDF1水凝膠置於低溫環境中，即可輕易地分離出純化之造血幹細胞。
本發明所指「低溫環境」，係指不會使本發明所揭水凝膠或水膠可達到成膠狀固體之溫度，而該溫度會隨著所在地區之緯度、濕度、高度等因子而變動；一般來說，該低溫環境之溫度係低於10℃，例如4℃。
本發明所指「高溫環境」，係指使本發明所揭水凝膠、水膠或其組成份間可達到成膠狀固體，一般來說，該高溫環境之溫度係高於20℃，例如26℃、30℃、36℃、38℃等。
以下，為能說明本發明之技術特徵及其功效，將茲舉若干實例並搭配圖式進行詳細說明如後。
以下各實例中所揭製程條件，如溫度、時間等，乃為例示，會根據實際操作環境而有些微之變動，該些製程條件之些微變動若為本發明所屬技術領域且具通常知識者所認可之誤差範圍內，皆為本發明保護所及之範圍。
以下實例中所使用之B16F10細胞，係為本發明所屬技術領域且具通常知識者可易於取得之生物材料，故不需要進行寄存。
實例一：製備溫感水凝膠
將Pluronic F-127（以下簡稱F-127）溶解在蒸餾水中，攪拌後，將海藻酸鈉加入到F-127溶液中，在4℃下攪拌20分鐘，而後再加入黃原膠、羧甲基纖維素（Carboxymethyl cellulose，簡稱CMC）和透明質酸，並在4℃下混合10分鐘，於約26℃之溫度下形成一水膠。
將該水膠與蒸餾水以不同比例（0.5：0.5、0.5：0.4、0.5：0.3、0.5：0.2、0.5：0.1）進行混合，分別檢測混合後之成膠反應（Sol-gel transition）、成膠溫度（Gelation temperature）、成膠時間（Gelation time），結果如下表1所示。
表1：檢測水膠與蒸餾水以不同比例混合後之成膠反應的結果
| 成分比例 | 成膠反應 | 成膠溫度（℃） | 成膠時間（分） |
| 水膠：蒸餾水 (v/v) | |||
| 0.5:0.5 | 無 | - | - |
| 0.5:0.4 | 無 | - | - |
| 0.5:0.3 | 無 | - | - |
| 0.5:0.2 | 無 | - | - |
| 0.5:0.1 | 有 | 26 | 2-3 |
由表1之內容可知，於水膠與蒸餾水以5：1（v/v）之比例混合時，混合物係能於26℃之溫度下，於2-3分鐘內，使水膠固化而形成水凝膠，並且，於4℃時，該水凝膠係會因溫度變化而產生相變，呈現為液態之形式。
由此可知，本發明所揭水凝膠之製備方法確實後能夠於短時間內產製出可因環境溫度變化而改變型態之溫感水凝膠，意即藉由本發明所揭水凝膠之製備方法得到之水凝膠係為具有熱可逆性及溫度敏感性等特性之膠體。
實例二：製備草本溫感水凝膠（一）
取草本萃取物與水楊酸混合，並加入水及酒精，於95℃下攪拌後靜置，分離出上清液，作為後續使用之草本萃取液，其中，該草本萃取物包含有綠茶萃取物、生薑萃取物及餘甘子萃取物，並上述植物萃取物係得依據本發明所屬技術領域且具通常知識者周知萃取方法製備而成或是直接於市面上購買。
將實例一中所製得之水膠與上述草本萃取液依據不同比例進行混合（10：1、10；0.5、10：0.3），分別檢測混合後之成膠反應、成膠溫度、成膠時間，結果如下表2所示。
表2：檢測水膠與草本萃取液以不同比例混合後之成膠反應的結果
| 成分比例 | 成膠反應 | 成膠溫度（℃） | 成膠時間（分） |
| 水膠：草本萃取液 (v/v) | |||
| 10：1 | 無 | - | - |
| 10：0.5 | 無 | - | - |
| 10：0.3 | 有 | 26 | 1-2 |
由表2之內容可知，本發明所揭水膠與草本萃取液以10：0.3（v/v）之比例混合時，於4℃時會呈現液態，並且於26℃之溫度下，於1-2分鐘內而形成水凝膠。
由上述內容可知，本發明所揭水膠與其他水溶液以一定比例下混合後，能夠於低溫環境，如4℃時下呈現液態；並於溫度升高至約26℃時固化而形成膠體；換言之，本發明所揭水凝膠之製備方法不僅能夠產製出可因環境溫度變化而改變型態之溫感水凝膠，更得使水溶液中成分之不同而使水凝膠中帶有不同活性成分，如於上述實例中，該水凝膠中含有草本萃取物、水楊酸等活性成分。
實例三：製備草本溫感水凝膠（二）
取羧甲基纖維素，製備為10％CMC溶液；取明膠，製備為9％（w/w）明膠溶液；將9％（w/w）明膠溶液與10％CMC溶液以10：1之比例混合形成無草本萃取物水膠。
將無草本萃取物水膠與水及95％酒精進行混合，形成水凝膠（不含草本萃取物）水及95％酒精進行混合，形成無草本水凝膠。
將明膠溶解於草本水萃物，形成9％（w/w）明膠草本溶液；將CMC溶解於草本酒萃物，形成10％（w/w）CMC草本溶液；將明膠草本溶液與CMC草本溶液以不同比例：1：1、1：10、10：1製備為不同草本水凝膠，分別為草本水凝膠（1：1）、草本水凝膠（1：10）、草本水凝膠（10：1）；其中，草本水萃物與草本酒萃物分別為草本原料（綠茶、生薑及餘甘子）以水或是酒精作為萃取溶劑依據習知萃取方法所得者。
觀察上述製備過程可知，當明膠或含有明膠之溶液的添加量越高時，所得到之水凝膠會越多，反之，若添加之明膠或含有明膠之溶液的添加量較少時，會使成膠反應不完全，導致水凝膠量變少或是無法順利成型。
實例四：草本溫感水凝膠之FITR分析
將實例三中所得之純CMC、明膠粉、各草本水凝膠及無草本水凝膠等樣品分別進行FITR光譜檢測及分析，結果如圖1及圖2所示。
由圖1及圖2之結果可知，純明膠粉含有–OH、–NH及–CO等官能基團，故特徵波鋒出現在3035、1694、1209cm-1；草本水凝膠（1：1）之吸收帶出現於2769、1590、1454、1332、1210、1052 cm-1，乃係因為其包含有羧酸峰（-OH 拉伸）、酰胺峰（-NH 彎曲）、烷烴甲基（-CH 彎曲）和剪刀狀-CH2、-CO和-CO官能基團；草本水凝膠（1：10）之吸收帶出現於3209、1590、1455、1383、1271、1031 cm-1係分別對應–OH、–NH、–CH、 -CH2、–CO、–CO等官能基團；草本水凝膠（10：1）之吸收帶出現於3061、2780、1618、1454、1334、1209、1046cm-1係分別對應-OH、-OH、-NH、-CH、-CH2、-CO和-CO官能基團；而無草本水凝膠之吸收帶出現於3285、1627、1453、1402、1337、1237、1053cm-1係分別對應-OH、-NH、-CH、-OH、-CH2、-CO、-CO等官能基團。由上述結果可知，各草本水凝膠係因其組成成分間產生交互作用而新的鍵結，因此各草本水凝膠之構型與純CMC粉或純明膠粉間具有極大差異。
實例五：草本溫感水凝膠之熱重分析（TGA）
取實例三中所得之無草本水凝膠及各草本水凝膠作為樣品，以動態力學分析儀（PerkinElmer DMA 7e）進行熱重分析，結果如圖3A至圖3D所示。
由圖3A至圖3D之結果可知，所有作為測試樣品之水凝膠係經歷2個或3個主樣的降解步驟，但過程中沒有額外的熱事件（thermal event）發生，故所有測試樣品中都沒有被觀察有雜質或副產物。無草本水凝膠、草本水凝膠（10：1）、草本水凝膠（1：1）及草本水凝膠（1：10）初始至240℃之重量損失率分別為14.78％、12.11％、15.98％及19.44％，其中，於200℃時發現，各草本水凝膠之重量損失率小於20％，顯示藉由本發明所揭方法製備所得之草本水凝膠之結構十分穩定，意即添加明膠及CMC乃有助於提升結構穩定性。無草本水凝膠、草本水凝膠（10：1）及草本水凝膠（1：1）於240-380℃間發生較高的重量損失，損失率分別為49.79%、45.45%及53.90%，主要原因在碳水化合物之降解。而無草本水凝膠、草本水凝膠（10：1）、草本水凝膠（1：1）及草本水凝膠（1：10）於低於700℃之溫度下之重量損失率較少，分別為9.12%、13.86%、10.20%及20.78%，顯示如CMC或/及明膠等有機成分仍存在於草本水凝膠中。
又，由圖3A至圖3D中發現，無草本水凝膠、草本水凝膠（10：1）及草本水凝膠（1：1）係有明顯兩階段重量減輕之現象，意即，於初始至240℃之第一階段中，含有明膠量高之水凝膠的重量損失較慢，故草本水凝膠（1：10）之重量損失情形較為明顯；由240-600℃之第二階段中，草本水凝膠（1：10）重量損失之變化亦與其他測試樣品不同，推測乃是基於草本水凝膠（1：10）之結構不完整。
實例六：草本溫感水凝膠之流變分析
取實例三中所得之無草本水凝膠及草本水凝膠（10：1）作為樣品，分別以流變儀（Brookfield DV-III Ultra rheomete）進行流變測量，其中，包含下列三種方式進行：
(1)以應變掃描試驗獲得臨界應變（critical strain），結果如圖4A所示；
(2)以溫度掃描測試來確定水凝膠之儲存模量（storage modulus），結果如圖4B所示；
(3)以剪切速率掃描測試檢測各草本水明膠之黏度，結果如圖4C所示。
由圖4A之結果可知，當角頻率為由0.1至100 strain（％）時，各測試樣品之儲存模量於0.1至10 strain（％）沒有明顯變化，顯示各測試樣品為穩定的；由圖4B之結果可知，草本水凝膠（10：1）之儲存模量隨著溫度增加而降低；由圖4B之結果可知，各測試樣品之黏度隨著剪切速率之增加而降低。
由圖4A至圖4C之結果顯示，藉由本發明所揭製備方法得到之草本水凝膠不僅具有溫度敏感性，並且具有剪切稀化（shear-thinning）之特性，意即本發明所揭草本水凝膠至於個體皮膚上，係能夠十分容易被皮膚吸收及利用，而能夠達到作為藥物載體、敷料或是醫療相關物品之功效。
實例七：草本溫感水凝膠之結構分析
以一般顯微鏡及電子顯微鏡觀察草本水凝膠（10：1）及凍乾草本水凝膠（10：1），結果如圖5A至圖5D所示。
由圖5A至圖5D之結果可知，草本水凝膠（10：1）係具有交錯且彼此連接之多孔結構，並且，具有多層結構。換言之，藉由本發明所揭製備方法得到之水凝膠係具有多孔之多層結構，且各孔間彼此相互連通，形成密集連結之網絡，因而，該水凝膠各層孔隙間係能用於存放或攜帶活細胞或其他成分，以達到本發明所揭水凝膠得用於作為藥物載體或是臨床醫療、生物實驗之功效。
實例八：草本溫感水凝膠之抗氧化分析
以DPPH試劑（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl）進行草本水凝膠之抗氧化能力及金屬螯合能力分析，結果如圖6所示，其中，DPPH分析方法乃為本發明所屬技術領域之周知技術，故於此不加以贅言；而本實例中所使用之草本水凝膠係由明膠草本溶液與CMC草本溶液以比例10：1～10：3所製成者。
由圖6之結果可知，本發明所揭草本水凝膠係具有良好之DPPH清除活性及金屬螯合能力，意即能夠提升DPPH清除活性為61.25 ± 7.07%及提升金屬螯合能力為83.93 ± 9.68%。
實例九：草本溫感水凝膠之傷口癒合分析
24個受試者，其臉上分別具有痤瘡傷口，分別以草本水凝膠對受試者之患處進行治療，為期2週，每天3次，並且試驗前後會以ImageJ 軟體對痤瘡傷口進行量化分析，結果如圖7所示，其中，本實例中所使用之草本水凝膠係由明膠草本溶液與CMC草本溶液以比例10：1～10：3所製成者。
由圖7之結果可知，有16.7％受試者的痤瘡傷口癒合率為80％以上；34.28％受試者的痤瘡傷口癒合率達75％以上；約75％受試者之傷口癒合率大於30％；約54％受試者之傷口癒合率大於40％。
由圖7之結果顯示，由本發明所揭製備方法所得之水凝膠確實能夠作為藥物或是活性成分之載體，當該水凝膠接觸個體皮膚時，係能將其所呈載物質釋放而被皮膚吸收，以達到其所呈載物質所能達到之療效或是功效。
實例十：製備雙反應水凝膠
將殼聚醣溶解在去離子水中，得到殼聚糖溶液；將 F-127加入殼聚醣溶液中，在4°C下再攪拌30分鐘；而後加入乙二醛，於4°C下混合10分鐘；於37°C下形成一第一水膠，其中，該第一水膠係具有溫度敏感性。
將氫氧化鈉製備成鹼性氫氧化鈉溶液，加入透明質酸、聚乙二醇和1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE) 作為交聯劑，於室溫下均勻混合4-6小時，並使pH值維持於7.0，得到一第二水膠，其中，該第二水膠係具有酸鹼敏感性。
將第一水膠與第二水膠以不同比例（10：0、8：2、6：4、5：5）進行混合，分別檢測混合後之成膠反應、成膠溫度、成膠時間，結果如下表3所示。
表3：檢測第一水膠與第二水膠以不同比例混合後之成膠反應的結果
| 成分比例 | 成膠反應 | 成膠溫度（℃） | 成膠時間（分） |
| 第一水膠：第二水膠 (v/v) | |||
| 10：0 | 有 | 37 | 2-3 |
| 8：2 | 有 | 30 | ＜2 |
| 6：4 | 有 | 25 | 2-3 |
| 5：5 | 無 | - | - |
由上表3之內容可知，第一水膠與第二水膠係能於係能於不同配比：10：0、8：2、6：4（v/v）下被製備為水凝膠，並且基於第一水膠具有溫度敏感性之特性及第二水膠具有酸鹼敏感性之特性，使得包含有第一水膠及第二水膠之水凝膠係同時會受到溫度及酸鹼值兩個環境因子變化而影響其結構或/及相態，亦因此能夠更被廣泛地利用於各種生物醫藥或生物技術之領域中。更進一步來說，由表3之結果係能合理推知，本發明所揭水凝膠之製備方法中，為能製備出雙反應水凝膠，第一水膠之含量需大於第二水膠之含量，始能順利成膠，並且，當第一水膠之含量越高，成膠時間越短，相變溫度越高。
實例十一：雙反應水凝膠之吸水率測試
分別製備 pH 值為 2.0、4.0、6.0、7.4、8.0、10.0和12.0之緩衝溶液。將實例十中之雙反應水凝膠0.2g，分別放入不同pH值之緩衝溶液（50 mL）中浸泡80分鐘，吸水後過濾稱重，根據下列公式，計算浸泡於不同pH值之緩衝溶液中，雙反應水凝膠之吸水率，結果如圖8所示。又為能量化雙反應水凝膠之吸水能力，故將雙反應水凝膠置於7.4 pH 值的緩衝溶液，監測其溶漲比，用以評估溶漲性能，結果如圖9所示。
溶脹比（SR）=（吸水後秤重-吸水前秤重）/吸水前秤重X 100％
由圖8之結果可知，本發明所揭雙反應水凝膠於高pH值之緩衝溶液中的吸水率較佳；並且，由圖9之結果可知，於雙反應水凝膠膨脹初始階段，水很容易擴散到水凝膠網絡中，但隨著水合過程的進行，雙反應水凝膠逐漸達到溶脹平衡狀態，意即溶漲比會趨於平衡而幾乎不變動。
實例十二：水凝膠之FITR分析
將實例十中之第一水膠及第二水膠分別製備為熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠。將實例十中所製備之雙反應水凝膠（8：2）、上述熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠分別進行FTIR 光譜，結果如圖10所示。
由圖10之結果可知，雙反應水凝膠之 FTIR 光譜在1466.95 cm-1處顯示 O-H 拉伸振動，在841.96 cm-1 處顯示C-H彎曲，表示雙反應水凝膠具有溫度敏感的特性；並且，雙反應水凝膠在2883.27 cm-1處顯示 O-H 拉伸振動，在962.71 cm--1處顯示 C-H彎曲，表示雙反應水凝膠具有酸鹼敏感特性。換言之，由圖10中各水凝膠之特徵吸收信號係能夠證實，本發明所揭雙反應水凝膠包含有熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠，意即藉由本發明所揭製備方法得到之雙反應水凝膠係同時能夠受到兩個環境因子之變動而改變其結構或相態，以擴增其未來應用領域。
實例十三：雙反應水凝膠之熱重分析
將實例十二所揭雙反應水凝膠（8：2）、上述熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠進行熱重分析，結果如圖11所示。
由圖11之結果可知，雙反應水凝膠（8：2）與熱感性水凝膠之熱重分析曲線未有大幅度變化或是幾乎沒有振幅，表示雙反應水凝膠（8：2）與熱感性水凝膠之重量幾乎是維持不變的；但酸鹼水凝膠於35℃時下降幅度較大，並於70℃後重量趨於平穩。
由圖11之結果再次證實本發明所揭雙反應水凝膠是由熱感性水凝膠和酸鹼水凝膠所組成者，但基於製備過程中，使用第一水膠的比例較大，因此，於熱重分析圖中，雙反應水凝膠與熱感性水凝膠的曲線較為接近。
實例十四：雙反應水凝膠之結構分析
將實例十二所揭雙反應水凝膠（8：2）、上述熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠分別以電子顯微鏡進行型態觀察，結果如圖12所示。
如圖12所示，各水凝膠樣品都具有多孔結構，其中，雙反應水凝膠之結構更緻密，並且，各水凝膠中之孔徑係隨著透明質酸含量之增加而減小。
實例十五：：雙反應水凝膠之流變分析
以流變儀分析實例十二所揭雙反應水凝膠（8：2）、上述熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠，測量各水凝膠之儲能模量（G'）和損耗模量（G"），結果如圖13A至圖13C所示。
由圖13A之結果可知，所有G'等於G"之溫度為係為膠凝溫度，即為膠凝體系之熱敏感性；當各水凝膠之凝膠溫度為31.2℃～37.2℃溫度時，G'小於G"，在此溫度附近，G' 急劇增加，表示高於上述溫度之正常人體溫都可能導致各水凝膠之相態變化。由圖13B之結果可知，雙反應水凝膠之溫度隨著透明質酸含量的增加而升高，且透過剪切應變（γ）掃描試驗表明，當應變小於0.3%時，水凝膠具有黏彈性反應。由圖13C之結果可知，於測量的應變範圍內，儲能模量（G'）始終大於凝膠損耗（Greater G"），損耗因子（tan δ）小於0.06時，表示水凝膠具有彈性。
由圖13A至圖13C之結果顯示，藉由本發明所揭製備方法得到之雙反應水凝膠係具有良好的穩定性和彈性。
實例十六：雙反應水凝膠之細胞毒性分析
將不同量之雙反應水凝膠（8：2）添加至細胞培養基，使各細胞培養基中含有不同比例（0、10、30、50、70、90％之雙反應水凝膠（8：2），並分別用以培養 B16F10細胞（1*10
4cell/mL），並於培養12及24小時，分別以以市售MTT細胞增殖測定試劑盒（Roche Diagnostics）檢測分析各組B16F10細胞之細胞存活率，結果如圖14所示，其中，所使用之細胞培養基係會依據所培養之細胞而調整，以本實例來說，所使用之培養基係用於培養B16F10細胞之培養基，並且該細胞培養基中含有100 μg/ mL的鏈黴素的DMEM、100 U/ mL的青黴素、10%的胎牛血清；培養條件為37℃、5％二氧化碳；又，分別檢測於含有不同比例（10、30、50、70、90％）雙反應水凝膠（8：2）之細胞培養基中培養之B16F10細胞於培養1、3、5、7天的細胞活性，結果如圖15所示。
由圖14及圖15之結果可知，本發明所揭雙反應水凝膠對於細胞存活率及細胞活性都無不良影響，意即本發明所揭雙反應水凝膠係不具有細胞毒性。
實例十七：以水凝膠純化細胞試驗
製備SDF1（stromal cell-derived factor 1）水凝膠，其中所添加之SDF1 濃度分別為1、1.3、2、4μg/ml，故所製備出含有不同濃度（1、1.3、2、4μg/ml）SDF1之SDF1水凝膠。以各SDF1水凝膠接觸雞胚胎上含有始基生殖細胞（primordial germ cell，簡稱PGC）之區域，如germinal crescent或胚胎之生殖腺進行細胞吸附，各SDF1水凝膠於胚胎組織吸附 12-48 小時後，取出各SDF1水凝膠降溫，使各SDF1水凝膠液化取出純化之細胞，並進行細胞純度之檢測。再將所獲得之細胞進行DDX4(chicken vasa homolog，cvh)、PCNA等標記蛋白之染色分析，結果如圖16所示。
由圖16之結果可知，以SDF1水凝膠進行細胞吸附/抓取，僅需吸附至少24小時，及能夠培養出始基生殖細胞（DDX4+），並且都能有持續維持始基生殖細胞之特性，意即維持DDX4表現，並持續增生（PCNA）。，
另以習知抽血培養雞原始生殖細胞之方法，自雞胚血管中抽取始基生殖細胞進行培養。由於機械式細胞抽取，無法區分血球細胞與始基生殖細胞，故在細胞抽取後需再行培養 14 天，讓已分化之血球細胞老化凋亡，始能取得純化之始基生殖細胞。並分別於培養第0、7、14天自培養基中檢測純化原始生殖細胞之數量；比較原始生殖細胞以不同培養方法進行培養且純化後之比例，結果如圖17所示。
由圖17之結果可知，以SDF1水凝膠進行培養至少24小時後，係能夠由水凝膠分離出90％以上之原始生殖細胞；反觀習知抽血培養方法，必須要於培養14天以上，才能使原始生殖細胞比例由小於5％提高至約82％。
由圖16及圖17之結果顯示，本發明所揭水凝膠中添加SDF1時，確實能夠作為細胞培養純化或細胞分離之生物材料，並且除能能夠有效地縮短幹細胞或是具有幹細胞特性之細胞的培養分離時間，亦能確保所培養出之細胞仍保有分化及增生之特性。
又，根據檢測各SDF1水凝膠（不同濃度SDF1：1、1.3、2、4μg/ml）吸附細胞之純度的結果可知，不論SDF1水凝膠中含有之SDF1濃度高低，於培養24小時後，都含有純度大於90％之始基生殖細胞，並且，當SDF1水凝膠中含有之SDF1濃度大於4μg/ml時，不會增加所分離培養出之原始生殖細胞數量，但當SDF1水凝膠中含有之SDF1濃度為1-4μg/ml時，SDF1濃度對於原始生殖細胞純化間有濃度依賴性之關係。
無
圖1係為實例三中各樣品之FITR光譜圖。
圖2係為實例三中各樣品之特徵波鋒。
圖3A係為實例三中無草本水凝膠之熱重分析的結果。
圖3B係為實例三中草本水凝膠（10：1）之熱重分析的結果。
圖3C係為實例三中草本水凝膠（1：1）之熱重分析的結果。
圖3D係為實例三中草本水凝膠（1：10）之熱重分析的結果。
圖4A係為實例三中之無草本水凝膠及草本水凝膠（10：1）進行應變掃描試驗之結果。
圖4B係為實例三中之無草本水凝膠及草本水凝膠（10：1）進行溫度掃描測試之結果。
圖4C係為實例三中之無草本水凝膠及草本水凝膠（10：1）進行剪切速率掃描測試之結果。
圖5A係以一般顯微鏡觀察草本水凝膠（10：1）之結果。
圖5B係以一般顯微鏡觀察凍乾草本水凝膠（10：1）之結果。
圖5C係以電子顯微鏡觀察草本水凝膠（10：1）之結果。
圖5D係以電子顯微鏡觀察凍乾草本水凝膠（10：1）之結果。
圖6係為分析草本水凝膠抗氧化能力之結果。
圖7係為分析草本水凝膠之傷口癒合/修復能力。
圖8係為分析雙反應水凝膠於不同pH值之緩衝溶液中之吸水率的結果。
圖9係為分析雙反應水凝膠經過不同時間之溶漲比變化的結果。
圖10係為雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）進行FTIR 光譜分析之結果。
圖11係為雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）進行熱重分析之結果。
圖12係以電子顯微鏡觀察雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）之結果。
圖13A係為雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）進行溫度掃描測試之結果。
圖13B係為雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）進行剪切速率掃描測試之結果。
圖13C係為雙反應水凝膠（8：2）、熱感性水凝膠及酸鹼水凝膠（請確認）進行應變掃描試驗之結果。
圖14係為檢測分析B16F10細胞於含有不同比例之雙反應水凝膠（8：2）的細胞培養基進行培養後之細胞存活率的結果。
圖15係為檢測分析B16F10細胞之細胞活性的結果。
圖16係為係為檢測以SDF1水凝膠培養且分離出之細胞中DDX4之染色結果。
圖17係為比較SDF1水凝膠培養及習知抽血培養所得之原始生殖細胞數量之結果。
無
Claims (4)
- 一種水凝膠之製備方法，其包含有下列步驟：步驟a：製備一第一水膠，其中，該第一水膠係由F-127、殼聚醣及乙二醛所進行交聯反應所得者；步驟b：製備一第二水膠，其中，該第二水膠係由氫氧化鈉溶液、透明質酸、聚乙二醇和1,4-丁二醇二縮水甘油醚進行交聯反應所得者；該步驟c：將該第一水膠與該第二水膠以一預定比例混合並進行成膠反應，得到一水凝膠，其中，該第一水膠之含量係大於該第二水膠之含量，並該水凝膠於一低溫環境下呈現液相，並於一高溫環境下呈現固相。
- 如請求項1所述水凝膠之製備方法，其中，於該步驟c中之該第一水膠與該第二水膠之比例(v/v)係為6：4-8：2。
- 一種以請求項1或2所述水凝膠之製備方法所製得的水凝膠，其係具有一膠體，複數孔，彼此交錯連接地設於該膠體內。
- 一種培養分離細胞之方法，其包含有下列步驟：步驟a：取一SDF1(stromal cell-derived factor 1)水凝膠，其中，該SDF1水凝膠係為一含有濃度為1-4μg/ml SDF1之水凝膠，而該水凝膠係由如請求項1或2所述水凝膠之製備方法所製得；步驟b：以該SDF1水凝膠接觸一具有分化能力之細胞，進行一預定時間之培養；步驟c：培養完成後，移出該SDF1水凝膠，並將該SDF1水凝膠置於一低溫環境下，使該SDF1水凝膠呈現液態，以分離純化出該具有分化能力之細胞。
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| TWI279416B (en) * | 2000-01-11 | 2007-04-21 | Shiseido Co Ltd | Microgel and external composition containing the same |
| CN103601898A (zh) * | 2013-11-07 | 2014-02-26 | 浙江科技学院 | 一种温敏型壳聚糖-羧甲基纤维素凝胶及其制备方法 |
| TWI526488B (zh) * | 2014-12-24 | 2016-03-21 | 財團法人工業技術研究院 | 化學交聯組成物、含其之生物醫學材料以及其用途 |
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