TWI811688B - 單核球專一性之適體及其增強藥物輸送至癌症之用途 - Google Patents

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Abstract

單核球專一性核酸適體及包含該適體以用於使治療藥劑或診斷藥劑輸送到癌症部位的脂質奈米粒子。本文也揭示基於適體的脂質奈米粒子藥物輸送系統用於治療或檢測癌症的用途。

Description

單核球專一性之適體及其增強藥物輸送至癌症之用途
本發明提供一種單核球專一性核酸適體及包含該等適體用於增強藥物輸送至癌症的脂質奈米粒子。本文也揭示基於適體的脂質奈米粒子藥物輸送系統用於治療癌症的用途。
長期以來，依賴循環系統來輸送治療藥劑一直是許多疾病治療的首選方法，這是因為此方法與外科手術等更具侵入性的方法相比對患者來說是最不困難的方法。然而，此方法在許多情況下並不實際，原因在於具有低血管密度或低血管滲透性的疾病可降低藥物輸送能力。免疫細胞（諸如單核球）的召集是對生理環境變化的自然反應。藉由利用免疫細胞滲透到患病部位的能力，本文揭示的藥物輸送平台能夠充當載體以將靶向藥物輸送到具有召集的單核球的疾病損傷部位，而不單獨依賴循環系統。
在一些癌症中，特別是在胰管腺癌（PDAC）中，供血不足使得僅透過循環系統的藥物輸送無效，因此需要幫助以使藥物更好輸送到預期位置。Provenzano等人， Cancer Cell21，418–429（2012）。免疫細胞（諸如單核球）的召集是對生理環境變化的自然反應。在腫瘤微環境中，單核球不斷被召集作為對抗腫瘤細胞的一種反應。Nahrendorf等人， J. Exp. Med， 204，3037–3047（2007）及Swirski等人， Science325，612–616（2009）。在轉移形成之前，單核球被召集到肝，以支持侵入的腫瘤細胞的生長與增殖，從而導致轉移。Condeelis等人，Cell 124，263–266（2006）及Gil-Bernabé等人， Blood119，3164–3175（2012）。本文揭示一種能夠選擇性地附接到血流中循環單核球的表面的藥物輸送平台，其可充當載體以靶向藥物輸送到具有召集的單核球的腫瘤部位，從而治療腫瘤及其轉移。
本揭示至少部分基於鑑定對單核球具有高結合親和力及專一性的核酸適體以及開發基於適體的脂質奈米粒子藥物輸送系統。此藥物輸送系統已成功用於輸送治療藥劑或診斷藥劑到固態腫瘤以治療癌症或檢測癌症。
因此，本揭示的一個方面提供一種單核球靶向核酸適體，其包含與5’-GGA TGG GAG GGA GGG GGC TCG TGG CGG CTA GGG GGT ATA A-3’（SEQ ID No:1）至少85%（例如至少90%、至少95%、至少98%或更高）一致的核心核苷酸序列。在一些例子中，本文揭示的單核球靶向核酸適體包含SEQ ID NO:1的核心核苷酸序列。
本文揭示的任何單核球靶向核酸適體可進一步包含側接核心核苷酸序列的5’引子位點及3’引子位點。在一些實例中，5’引子位點包含5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG-3’的核苷酸序列，及/或3’引子位點包含5’-CT CAT GGA CGT GCT GGT GAC-3’的核苷酸序列。舉例來說，單核球靶向核酸適體可包含5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG GGA TGG GAG GGA GGG GGC TCG TGG CGG CTA GGG GGT ATA ACT CAT GGA CGT GCT GGT GAC-3’的核苷酸序列。
在一些具體實施例中，本文揭示的單核球靶向核酸適體可共軛到錨定核酸片段，其用於使核酸片段附接到包含與錨定核酸片段或其部分互補的對接核酸片段的支撐構件。在一些實例中，錨定核酸片段可包含5’-CAA TAG AGT CGT ACA GGT CG-3’的核苷酸序列，其任選地位於適體的5’端。
在另一方面，本文提供一種單核球靶向脂質奈米粒子，其包含脂質奈米粒子，在該脂質奈米粒子上附接有本文所述的單核球專一性核酸適體。在一些具體實施例中，脂質奈米粒子可包含共軛物，該共軛物包含附接到脂質的對接核酸片段。對接核酸片段包含與共軛到單核球專一性核酸適體的錨定核酸片段或其部分互補的核苷酸序列。因此，錨定核酸片段與對接核酸片段形成鹼基對，從而使單核球專一性核酸適體固定在脂質奈米粒子上。
在一些具體實施例中，對接核酸片段可直接附接到脂質。或者，對接核酸片段可經由聚乙二醇（PEG）連接子附接到脂質。在具體實例中，脂質可為1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DSPE）。
本文揭示的任何單核球靶向脂質奈米粒子可進一步包含治療藥劑或診斷藥劑。在一些具體實施例中，本文揭示的單核球靶向脂質奈米粒子可進一步包含抗癌劑，例如用於治療癌症的治療劑。或者，抗癌劑可為用於檢測癌症的診斷藥劑。
在其他方面，本文提供一種醫藥組合物，其包含本文揭示的任何單核球靶向脂質奈米粒子及醫藥上可接受的載體，以及用於使抗癌劑輸送到腫瘤部位的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的本文揭示的醫藥組合物。在一些具體實施例中，個體可為患有癌症或處於癌症風險中的人類患者，該癌症例如為胰腺癌或黑色素瘤（例如轉移性黑色素瘤）。
在本揭示的範圍內也有包含本文揭示的用於輸送治療藥劑或診斷藥劑到腫瘤部位的任何單核球專一性脂質奈米粒子的醫藥組合物，以及此類單核球專一性脂質奈米粒子用於製造可用於如本文揭示的預期醫療目的藥物的用途。
在下方描述中闡述本發明一或多個具體實施例的細節。本發明的其他特徵或優點將藉由以下圖式及若干具體實施例的詳細描述以及所附申請專利範圍而變得顯而易見。
巨噬細胞向疾病部位的召集是在急性或慢性疾病患者發病期間發生的關鍵事件。Pawelec等人， Current Opinion in Immunology，2014；29:23-28。這些巨噬細胞首先表現為血管中的單核球。Gordon等人， Nature Reviews Immunology，2005；5:953-964。接著，循環單核球將移動到最靠近疾病部位的血管，並接著藉由穿透內皮細胞層到達該部位，這一過程被稱作外滲（extravasation）。Hume， Current Opinion in Immunology，2006；18:49-53。
本揭示至少部分基於開發選擇性靶向並結合單核球的核酸適體（例如J10），以及開發在脂質奈米粒子表面上包含此類單核球專一性核酸適體（諸如J10）的基於適體的脂質奈米粒子靶向系統。此類適體標記的脂質奈米粒子可作為有利的藥物輸送載體，其能夠使用諸如單核球的循環血細胞來作為「梭（shuttle）」，以使得被適體標記的被脂質奈米粒子包覆的治療藥劑或診斷藥劑到達感興趣的目標部位，諸如腫瘤部位。一旦攜帶適體標記的脂質奈米粒子的循環單核球穿過內皮細胞層，其就會被活化形成巨噬細胞。隨後，這些自活化的巨噬細胞會吞噬適體標記的脂質奈米粒子，使得包覆的抗癌劑（例如化學治療藥劑，諸如吉西他濱或癌症診斷藥劑）在巨噬細胞內釋放或發揮功能，從而發揮其治療或診斷作用。
因此，本文描述單核球靶向核酸適體（諸如J10）、基於適體的脂質奈米粒子單核球靶向系統、包含其的醫藥組合物、以及用於使治療藥劑或診斷藥劑輸送到腫瘤部位，諸如胰腺腫瘤位點（例如胰腺導管腺癌（PDAC）位點），以治療或檢測腫瘤的方法。
單核球靶向核酸適體
本文描述靶向並結合單核球（例如J10）的核酸適體。本文所用的核酸適體涉及對特定免疫細胞（例如單核球）具有結合活性的核酸分子（DNA或RNA）。線性或環狀形式的本揭示的單核球靶向適體可為RNA、DNA（例如單股DNA）、修飾的核酸、或其混合物。單核球靶向適體可為非天然分子（例如含有天然基因中不存在的核苷酸序列，或含有自然中不存在的修飾的核苷酸）。替代的或附加的，單核球靶向適體可不含編碼功能性胜肽的核苷酸序列。
在一些具體實施例中，本文揭示的單核球靶向適體可包含與5’-GGATGGGAGGGAGGGGGCTCGTGGCGGCTAGGGGGTATAA -3’（SEQ ID NO: 1）至少70%（例如80%、85%、90%、95%或98%）一致的核心核苷酸序列。在一些實例中，本文揭示的單核球靶向核酸適體可包含SEQ ID NO:1的核心核酸序列的核苷酸序列。
除了本文揭示的核心核苷酸序列之外，單核球靶向適體可進一步在核心序列的5’端（5’引子位點）、在核心序列的3’端（3’引子位點）、或在兩者處包含引子位點。在一些實例中，本文揭示的單核球靶向適體可包含5’引子位點，其可包含與5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG-3’至少70%（例如80%、85%、90%、95%、98%或100%）一致的核苷酸序列。替代的或附加的，本文揭示的單核球靶向適體可包含3’引子位點，其可包含與5’- CT CAT GGA CGT GCT GGT GAC -3’至少70%（例如80%、85%、90%、95%、98%或100%）一致的核苷酸序列。在一些實例中，本文揭示的單核球靶向適體可包含含有5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG-3’的核苷酸序列的5’引子位點，以及含有5’-CT CAT GGA CGT GCT GGT GAC-3’的核苷酸序列的3’引子位點，其側接含有SEQ ID NO:1的核酸序列的核心核苷酸序列。在一些實例中，本文揭示的單核球靶向適體可包含5’-ACGCTCGGATGCCACTACAGGGATGGGAGGGAGGGGGCTCGTGGCGGCTAGGGGGTATAACTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’（SEQ ID NO:2）的核苷酸序列，或與SEQ ID NO:2至少70%（例如80%、85%、90%、95%或98%）一致的核苷酸序列。
在一些具體實施例中，本文揭示的單核球靶向適體可與錨定核酸片段共軛，這可促進適體附接到脂質奈米粒子。在一些實例中，錨定核酸片段可與本文揭示的單核球靶向適體的3’端共軛。在一些實例中，錨定核酸片段可與本文揭示的單核球靶向適體的5’端共軛。在一些實例中，錨定核酸片段可包含5’- CAATAGAGTCGTACAGGTCG -3’的核苷酸序列。
在具體實例中，單核球靶向適體可包含5’- CAATAGAGTCGTACAGGTCG ACGCTCGGATGCCACTACAG GGATGGGAGGGAGGGGGCTCGTGGCGGCTAGGGGGTATAA CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’的核苷酸序列，其中5’下劃線片段為錨定核酸片段，斜體區域為5’引子位點及3’引子位點，而粗體部分為單核球結合的核心核苷酸序列。
兩個核酸的「一致性百分比」是使用Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87:2264-68，1990的算法，如Karlin及Altschul Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90:5873-77，1993中所述進行修飾來測定。這種算法被併入Altschul等人， J. Mol. Biol，215:403-10，1990的NBLAST及XBLAST程序（2.0版）中。BLAST核苷酸搜索可使用NBLAST程序（分數=100，字長度-12）進行，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。當兩個序列之間存在間隙時，可如Altschul等人， Nucleic Acids Res，25（17）:3389-3402，1997所述利用Gapped BLAST。當使用BLAST及Gapped BLAST程序時，可使用各個程序的預設參數（例如XBLAST及NBLAST）。
在其他具體實施例中，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列相比，本文所述的單核球靶向適體可含最多8個（例如最多7、6、5、4、3、2或1個）核苷酸變異。可引入此類變異的位置可基於例如靶向的單核球的參考核苷酸序列來決定。
本文揭示的任何單核球靶向適體可含最多200個核苷酸（nt），例如150 nt、100 nt、80 nt、70 nt、60 nt、50 nt、40 nt、或30 nt。在一些實例中，單核球靶向適體可含範圍從30至150 nt、30至100 nt、30至80 nt、30至70 nt、30至60 nt、30至50 nt、或30至40 nt的核苷酸。
單核球靶向適體可專一性結合人類單核球。或者，適體可結合來自不同物種（例如人類及小鼠）的單核球。
在一些具體實施例中，本文所述的單核球靶向適體可含非天然存在的核鹼基、糖、或共價核苷酸間鍵聯（骨幹）。此類修飾的寡核苷酸賦予所需的性質，諸如增強的細胞攝取、對靶核酸提高的親和力、及增加的體內穩定性。
在一個實例中，本文所述的適體具有修飾的骨幹，包括保留磷原子者（請參見，例如美國專利號第3,687,808號、第4,469,863號、第5,321,131號、第5,399,676號、及第5,625,050號），及不具有磷原子者（請參見，例如美國專利號第5,034,506號、第5,166,315號、及第5,792,608號）。含磷修飾骨幹的實例包括但不限於硫代磷酸酯、掌性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺烷基磷酸三酯、膦酸甲酯及其它膦酸烷基酯（包括膦酸-3’-伸烷酯、膦酸-5’-伸烷酯及掌性膦酸酯）、次膦酸酯、胺基磷酸酯（包括3’-胺基胺基磷酸酯及胺烷基胺基磷酸酯）、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯、以及具有3’-5’鍵聯或2’-5’鍵聯的硼烷磷酸酯。此類骨幹也包括具有反極性，即3’-3’、5’-5’或2’-2’連接者。不包括磷原子的修飾骨幹由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成。此類骨幹包括具有𠰌啉基鍵聯者（部分由核苷的糖部分形成）；矽氧烷骨幹；硫化物、亞碸及碸骨幹；甲醯基及硫代甲醯基骨幹；亞甲基甲醯基及硫代甲醯基骨幹；核糖乙醯基骨幹；含烯骨幹；胺基磺酸酯骨幹；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基骨幹；磺酸酯及磺醯胺骨幹；醯胺骨幹；以及其它具有混合的N、O、S及CH2組成部分的骨幹。
在另一個實例中，本文所述的單核球靶向適體包括一或多個取代的糖部分。此類取代的糖部分可在其2’位置包括下列基團之一：OH；F；O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基；O-炔基、S-炔基、N-炔基、及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基及炔基可為經取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。其也可在其2’位置包括雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷胺基、取代的矽烷基、RNA切割基團、報導基團（reporter group）、嵌入劑、用於改善寡核苷酸藥物動力學性質的基團、或用於改善寡核苷酸的藥效學性質的基團。較佳取代的糖部分包括具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基乙氧基、及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基者。請參見Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995，78，486-504。
替代的或附加的，本文所述的單核球靶向適體可包括一或多個修飾的天然核鹼基（即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶及脲嘧啶）。修飾的核鹼基包括在以下描述者：美國專利號第3,687,808號；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，pages 858-859，Kroschwitz, J. I.，ed，John Wiley & Sons，1990；Englisch等人，Angewandte Chemie，International Edition，1991，30，613；及Sanghvi, Y. S.，Chapter 15，Antisense Research and Applications，pages 289-302，CRC Press，1993。這些核鹼基中的某些特別適用於增加適體分子與其靶向位點的結合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6與O-6取代的嘌呤（例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基脲嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶）。請參見Sanghvi等人，eds.，Antisense Research and Applications，CRC Press, Boca Raton，1993，pp. 276-278）。
本文所述的任何單核球靶向適體可藉由傳統方法製備，例如化學合成或體外轉錄。其如本文所述的預期生物活性可藉由例如以下實施例中所述者來驗證。用於表現任何單核球靶向適體的載體也在本揭示的範圍內。
本文所述的任何單核球靶向適體可經由共價鍵聯、非共價鍵聯、或兩者而共軛到一或多個聚醚部分，諸如聚乙二醇（PEG）部分。因此，在一些具體實施例中，本文所述的單核球靶向適體可被聚乙二醇化。本揭示並不意味著對特定分子量的PEG部分的限制。在一些具體實施例中，聚乙二醇部分具有範圍從5 kDa至100 kDa、10 kDa至80 kDa、20 kDa至70 kDa、20 kDa至60 kDa、20 kDa至50 kDa、或30 kDa至50 kDa的分子量。在一些實例中，PEG部分具有40 kDa的分子量。與本文所述的單核球靶向適體共軛的PEG部分可為線性或分支的。其可與核酸適體的5’端、適體的3’端、或兩者共軛。當需要時，PEG部分可共價共軛到核酸適體的3’端。
使PEG部分與核酸共軛的方法為本領域已知且已在例如PCT公開號WO 2009/073820中描述，其相關教示藉由引用併入本文。應當理解到，PEG共軛的核酸適體及用於使PEG與本文所述的核酸適體共軛的方法為示例性而非限制性的。
基於適體的脂質奈米粒子單核球靶向系統
本揭示也提供具有在其表面上附接有任何單核球專一性核酸適體的脂質奈米粒子。脂質奈米粒子可包含一或多個適合的藥劑，諸如診斷藥劑或治療藥劑。由於核酸適體具有單核球靶向活性的緣故，本文揭示的脂質奈米粒子可作為基於適體的脂質奈米粒子單核球靶向系統，從而使用單核球作為囊泡以使與脂質奈米粒子締合的藥劑輸送到感興趣的地方，例如患病或損傷部位。
（ i ） 攜帶單核球專一性核酸適體的脂質奈米粒子
本文所述的基於適體的脂質奈米粒子單核球靶向系統可包含適合的任何脂質奈米粒子及一或多個本文揭示的單核球靶向適體（例如J10），其可顯示在奈米粒子的表面上。單核球靶向適體的至少一部分可暴露在脂質奈米粒子的表面上，使得適體可與結合配偶體相互作用，例如諸如單核球的循環血細胞的表面。在一些具體實施例中，脂質體中的脂質與單核球靶向適體之間的比率在1,000,000:1至30:1（w/w）的範圍內。在一些實例中，比率為1,000:1、30:1至50:1（w/w），例如30:1至40:1或40:1至50:1。
本文所述的單核球靶向適體共軛的脂質奈米粒子（LNP）能夠結合單核球、嗜中性球及/或其他可遷移到損傷部位的循環血細胞。在一些具體實施例中，相對於其他類型的細胞（諸如內皮細胞），LNP專一性結合單核球。與諸如單核球的靶細胞「專一性結合」的LNP為本領域熟知用語，且測定此類專一性結合的方法也為本領域熟知。若LNP與其他靶細胞（例如內皮細胞）相比，其與一靶細胞的反應或結合更頻繁、更迅速、更持久及/或具更大親和力，則稱LNP對該靶細胞(例如單核球)表現出「專一性結合」活性。若LNP對單核球比對其他類型的細胞（諸如內皮細胞）的結合親和力、總親和力更大、更容易及/或更持久，則LNP「專一性結合」該等單核球。藉由閱讀此定義也應理解到，例如，專一性結合第一標靶細胞的LNP可專一性或不以專一性或優先結合第二標靶細胞。因此，「專一性結合」或「優先結合」不必然需要（儘管其可包括）排他性結合。一般來說，但非必然，提到結合意味著優先結合。在一些具體實例中，因本文所述的LNP不與內皮細胞結合，因此不誘導血栓形成，即LNP沒有或基本上低程度來結合內皮細胞，以致於該結合（若有的話）不足以誘導顯著的血栓形成（例如可藉由常規醫學檢測測定的具有臨床意義的血栓形成）。
在一些例子中，本文揭示的脂質奈米粒子可為脂質體，在其上可表面展示一或多個單核球靶向適體。如本文所用，「脂質體」乙詞涉及包含圍繞內部水性空間的外脂質層膜（例如稱作單層脂質體的單個脂質雙層或稱作多層脂質體的多個脂質雙層）的組合物。請參見，例如，Cullis等人， Biochim. Biophys Acta，559: 399-420（1987）。單層脂質體大體上具有在約20至約400奈米（nm）、約50至約300 nm、約300至約400 nm、或約100至約200 nm範圍內的直徑。多層脂質體通常具有約一至約十微米範圍內的直徑，且可包含與水相層交替的二至數百個同心脂質雙層。
每個脂質雙層可包括兩個含有相反取向的兩親性脂質分子的單層。兩親性脂質通常包含可共價連接至一或多個非極性（疏水性）醯基或烷基鏈的極性（親水性）頭部。疏水性醯基鏈與周圍水性介質之間能量上不利的接觸誘導兩親性脂質分子自行排列，使得極性頭基朝向雙層的表面，且醯基鏈朝向雙層的內部，從而有效地保護醯基鏈不與水性環境接觸。
可利用一或多種天然存在的及/或合成的脂質化合物製備本文所述的脂質體。脂質體可含有帶負電荷的脂質、帶正電荷的脂質、或其組合。適合的帶負電荷的脂質的實例包括但不限於二荳蒄（dimyrystoyl）、-二軟脂醯-（-dipalmitoyl-）及二硬脂醯磷脂醯甘油（distearoylphasphatidylglycerol），二荳蒄、-二軟脂醯-及二硬脂醯磷脂酸（dipalmitoylphosphatidic acid），二荳蒄、-二軟脂醯-及二硬脂醯磷脂醯乙醇胺（dipalmitoylphosphatidylethanolamine）、其不飽和二醯基及經混合之醯基鏈部分、以及心磷脂（cardiolipin）。帶正電荷的脂質的實例包括但不限於N,N’-二甲基-N,N’-雙十八烷基溴化銨（N,N’-dimethyl-N,N’-dioctacyl ammonium bromide，DDAB）及N,N’-二甲基-N,N’-雙十八烷基氯化銨（N,N’-dimethyl-N,N’-dioctacyl ammonium chloride，DDAC）、N-（1-（2,3-二脫氧）丙基）-N,N,N-三甲基氯化銨（N-(1-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride，DOTMA）、3.beta.-[N-（N’,N’-二甲基胺基乙基）胺基甲醯基）膽固醇（3.beta.-[N--(N’,N’-dimethylaminoethyl)carbamoyl] cholesterol，DC-chol）、1,2-二油醯基-3-[三甲基銨]-丙烷（1,2-dioleoyloxy-3-[trimethylammonio]-propane，DOTAP）、1,2-十八烷氧基-3-[三甲基銨]-丙烷（1,2-dioctadecyloxy-3-[trimethylammonio]-propane，DSTAP）、1,2-二油醯丙基-3-二甲基-羥乙基氯化銨（1,2-dioleoyloxypropyl-3-dimethyl-hydroxyethyl ammonium chloride，DORI）及如Martin等人在Current Pharmaceutical Design 2005，11，375-394中所述的陽離子脂質。適合的中性帶電脂質的實例包括但不限於DLPC（1,2-二月桂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼）、DMPC（1,2-二肉荳蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼）、DPPC（1,2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼）、DSPC（1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼）、DOPC（1,2-二烯醯-1-sn-甘油-3-磷酸膽鹼）、DMPA（1,2- 二肉荳蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸（鈉鹽））、DPPE（1,2-二棕櫚醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）、及DOPE（1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺）。
在一些具體實施例中，本文所述的脂質體可使用一或多種磷脂及任選的一或多種具有類似分子形狀及尺寸的具有疏水部分及親水部分兩者的另外的分子（例如膽固醇）來製備。用於製備本文所述的脂質體的適合的磷脂包括但不限於磷脂醯膽鹼（phosphatidylcholine，卵磷脂(lecithin)）、溶血卵磷脂（lysolecithin）、溶血磷脂醯乙醇胺（lysophosphatidylethanol-amine）、磷脂醯絲胺酸（phosphatidylserine）、磷脂醯肌醇（phosphatidylinositol）、鞘磷脂（sphingomyelin）、磷脂醯乙醇胺（phosphatidylethanolamine，腦磷脂質(cephalin)）、心磷脂（cardiolipin）、磷脂酸（phosphatidic acid）、腦苷脂（cerebrosides）、雙十六烷基磷酸（dicetylphosphate）、磷脂醯膽鹼、及二軟脂醯-磷脂醯甘油（dipalmitoyl-phosphatidylglycerol）。其他不含磷的脂質包括但不限於硬脂胺（stearylamine）、十二胺（dodecylamine）、十六胺（hexadecyl-amine）、乙醯基棕櫚酸酯（acetyl palmitate）、蓖麻油酸甘油酯（glycerol ricinoleate）、十六硬脂酸（hexadecyl sterate）、肉荳蔻酸異丙酯（isopropyl myristate）、雙性丙烯酸聚合物（amphoteric acrylic polymer）、脂肪酸（fatty acid）、脂肪醯胺（fatty acid amide）、膽固醇（cholesterol）、膽固醇酯（cholesterol ester）、二醯基甘油（diacylglycerol）、及琥珀酸甘油二酯（diacylglycerolsuccinate）、及其類似物。
在一些具體實施例中，本文所述的脂質體的主要脂質成分可為磷脂醯膽鹼，其可具有各種鏈長及飽和度的各種醯基鏈基團。在一些實例中，磷脂醯膽鹼包含碳鏈長度在例如C 14至C 22範圍內的飽和脂肪酸。飽和長鏈磷脂醯膽鹼與其不飽和對應物相比滲透性更小且在體內更穩定。也可使用具有單或雙不飽和脂肪酸以及飽和及不飽和脂肪酸的混合物的磷脂醯膽鹼。
本文所述的任何脂質體可進一步包含約0.1至1.0範圍內的莫耳比（膽固醇:磷脂）的固醇，較佳地為膽固醇。在一些實例中，脂質體可包含二硬脂醯磷脂醯膽鹼/膽固醇、二軟脂醯磷脂醯膽鹼/膽固醇、二荳蒄磷脂醯膽鹼/膽固醇、1,2-二烯醯-1-sn-甘油-3-磷酸膽鹼（DOPC）/膽固醇、或卵鞘磷脂/膽固醇的組合。
當需要時，本文所述的脂質體可用聚合物層包覆以增強脂質體在體內的穩定性（例如空間穩定的脂質體）。適合的聚合物的實例包括但不限於聚（乙二醇），其可形成改善脂質體的循環半衰期並提高到達治療標靶的脂質體的量的親水性表面層。請參見，例如，Working等人，J Pharmacol Exp Ther，289: 1128-1133（1999）；Gabizon等人，J Controlled Release 53: 275-279（1998）；AdlakhaHutcheon等人，Nat Biotechnol 17: 775-779（1999）；及Koning等人，Biochim Biophys Acta 1420: 153-167（1999）。用於製備本文所述的脂質體的有用PEG-脂質的實例包括但不限於1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-350]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-350]，mPEG 350 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-550]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-550]，mPEG 550 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-750]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-750]，mPEG 750 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-1000]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-1000]，mPEG 1000 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-2000]，mPEG 2000 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-3000]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-3000]，mPEG 3000 PE）；1,2-二醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（1,2-Diacyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N-[Methoxy（Polyethylene glycol）-5000]，mPEG 5000 PE）；N-醯基-神經胺醇-1-[琥珀醯基（甲氧基聚乙二醇）750]（N-Acyl-Sphingosine-1-[Succinyl（Methoxy Polyethylene Glycol）750]，mPEG 750 Ceramide）；N-醯基-神經胺醇-1-[琥珀醯基（甲氧基聚乙二醇）2000]（N-Acyl-Sphingosine-1-[Succinyl（Methoxy Polyethylene Glycol）2000]，mPEG 2000 Ceramide）；及N-醯基-神經胺醇-1-[琥珀醯基（甲氧基聚乙二醇）5000]（N-Acyl-Sphingosine-1-[Succinyl（Methoxy Polyethylene Glycol）5000]，mPEG 5000 Ceramide）。
多種方法可用於製備本文所述的脂質體。此類方法為本領域已知或於本文揭示，例如，在Lichtenberg及Barenholz，Methods of Biochemical Analysis，Volume 33，337-462（1988）中描述的方法。也請參見Szoka等人，Ann. Rev. Biophys. Bioeng，9:467（1980）；美國專利號第4,235,871、4,501,728及4,837,028號；Liposomes，Marc J. Ostro，ed.，Marcel Dekker, Inc.，New York，1983，Chapter 1；及Hope等人，Chem. Phys. Lip，40:89（1986），其各自的相關揭示藉由引用併入本文。小單層囊泡（SUV，尺寸＜100 nm）可如前述（Tseng等人，1999）藉由薄膜水合的標準方法及如前述的重複擠壓的組合來製備。
傳統技術可用於使脂質體尺寸調整到所需尺寸。請參見，例如，美國專利號第4,737,323號，及Hope等人，Biochim. Biophys. Acta，812: 55-65(1985)，其各自的相關揭示藉由引用併入本文。藉由水浴或探針超音波震盪對脂質體懸浮液進行超音波震盪，產生逐漸尺寸減小，直到尺寸小於約50nm的小單層囊泡。均質化或微流化為其他依靠剪切能使大脂質體破碎成較小脂質體的方法。在典型的均質化程序中，多層囊泡藉由標準乳液均質機再循環，直到觀察到選定的脂質體尺寸為止，通常在約100與500nm之間。在兩種方法中，粒度分布均可藉由傳統的雷射束粒度鑑別來監測。
藉由小孔聚碳酸酯膜或不對稱陶瓷膜擠壓脂質體為一種非常有效的方法使脂質體尺寸減小到相對良好界定的尺寸分布。通常，懸浮液通過膜循環一或多次，直到獲得所需的脂質體尺寸分布為止。脂質體可被擠壓通過連續的更小孔隙膜，以實現脂質體尺寸的逐漸減小。
本文所述的任何脂質體可藉由傳統方法分析以測定其物理及/或化學特徵。舉例來說，磷酸鹽測定可用於測定脂質體濃度。一種磷酸鹽測定為基於鉬酸鹽與孔雀石綠染料之間的相互作用。主要原理涉及無機磷酸鹽與鉬酸鹽反應形成無色未還原的磷鉬酸鹽錯合物，當在酸性條件下還原時，該錯合物轉化為藍色錯合物。磷鉬酸鹽在與孔雀石綠錯合時顏色會增加20或30倍。最終產物(還原的綠色可溶性錯合物)藉由其在620nm處的吸光度來測量，且為溶液中無機磷酸鹽的直接測量。
在其他具體實施例中，如本文所述的用於藥物輸送的粒子可為由一或多種聚合物或共聚物製成的奈米粒子。舉例來說，奈米粒子可為聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)奈米粒子，其可藉由常規技術製備。
本文揭示的任何單核球專一性核酸適體可藉由傳統方法與脂質奈米粒子共軛。舉例來說，對接核酸片段可附接到脂質奈米粒子。對接核酸片段包含與單核球專一性核酸適體的一部分（例如錨定核酸片段或其一部分）互補的核苷酸序列。適體可經由鹼基配對附接到脂質奈米粒子。
為了與對接核酸片段共軛，用於製備本文所述的脂質體的一或多種天然存在的及/或合成的脂質化合物可具有至少一個可與對接核酸片段反應的活化末端基。脂質化合物衍生物的末端基形式的實例包括甲基化、羧化、胺化及馬來醯化。在一些實例中，用於製備本文所述的脂質體的脂質化合物可為羧基封端、胺基封端、醯肼封端或馬來醯亞胺封端的脂質。在一些實例中，用於製備本文所述的脂質體的脂質化合物可為N-（5’-羥基-3’-氧戊基）-10-12-二十五碳二炔醯胺（h-PEG1-PCDA）、N-（5’-磺基-3’-氧戊基1）-10-12-二十五碳二炔醯胺（磺基-PEG1-PCDA）、N-[甲氧基（聚乙二醇）-750]-10-12-二十五碳二炔醯胺（m-PEG750-PCDA）、N-[馬來醯亞胺（聚乙二醇）-1500]-10-12-二十五碳二炔醯胺（mal-PEG1500-PCDA），1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[馬來醯亞胺（聚乙二醇）-2000]（Mal-PEG-DSPE）、L-a-磷脂醯膽鹼氫化大豆（氫化大豆PC）、二硬脂醯磷脂醯膽鹼（DSPC）、膽固醇、1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（m-Peg2000-DSPE）、及其組合。
對接核酸可經由與上述活化末端基反應而附接到脂質奈米粒子。在一些實例中，對接核酸可被修飾以添加反應性基團，例如硫醇基。此類對接核酸可與脂質上的活化末端基反應以形成共價鍵。
在一些實例中，本文揭示的對接核酸片段可經由共軛技術附接到本文所述的脂質化合物衍生物的活化末端基團。適合的共軛技術的實例包括羰基加成消除/還原胺化、醯胺化、馬來醯亞胺-硫醇偶聯、戊二醛交聯、異硫氰酸酯-胺偶聯、腙偶聯、肟偶聯、希夫鹼形成/還原、水性狄-阿反應及「鍵擊」化學。在一些實例中，藉由在還原劑存在下培養本文所述的對接核酸片段及本文所述的脂質化合物衍生物，使兩者共軛。在一些實例中，當對接核酸片段對還原劑對脂質化合物衍生物的莫耳比為約1:10:20時，會發生本文所述的對接核酸片段與本文所述的脂質化合物衍生物的共軛。在一些實例中，本文所述的對接核酸片段與本文所述的脂質化合物衍生物的共軛的效率為約70%至約100%。
在一些具體實施例中，本文揭示的單核球靶向適體可經由與包含LNP的脂質共軛的對接核酸片段來與本文揭示的LNP雜交。在一些實例中，對接核酸片段與本文揭示的單核球靶向適體相互作用，該單核球靶向適體包含對應於對接核酸片段的錨定核酸片段。在一些實例中，單核球靶向適體藉由培養約8小時至約18小時來與包含共軛對接核酸片段的脂質的LNP雜交。在一些實例中，在培養期間包含對接核酸片段的LNP與單核球靶向適體的比率可為約1:0.25、1:0.5、1:1.25、1:1.50、1:1.75、1:2、1:2.5、1:3、1:4、或1:5。在一些實例中，對接核酸片段與本文揭示的單核球靶向適體的雜交的效率可為約8%至約85%。
（ ii ） 治療藥劑及診斷藥劑
本文描述的任何單核球靶向適體標記的脂質奈米粒子（LNP）可包覆治療藥劑，例如抗癌劑，包括用於癌症治療的治療藥劑（例如化學治療劑、基於蛋白的癌症藥物、基於核酸的癌症藥物、或輻射劑）或用於癌症檢測的診斷藥劑。
化學治療劑的實例包括但不限於多西他賽（docetaxel）、米托蒽醌（mitoxantrone）、多柔比星（doxorubicin）、吉西他濱（gemcitabine）、嘧啶類似物（5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他濱（capecitabine）、吉西他濱及阿糖胞苷（cytarabine））、嘌呤類似物、葉酸拮抗劑及相關抑制劑（巰嘌呤、硫鳥嘌呤、噴司他丁（pentostatin）及2-氯去氧腺苷（克拉屈濱（cladribine）））；抗增殖劑/抗有絲分裂劑，包括天然產物，諸如長春花生物鹼（vinca alkaloid）（長春鹼（vinblastine）、長春新鹼（vincristine）及長春瑞濱（vinorelbine）、微管破壞劑，諸如紫杉烷（taxane）（太平洋紫杉醇（paclitaxel）、奈米粒子白蛋白結合太平洋紫杉醇（Abraxane ®）、多西他賽）、艾日布林（eribulin）、長春新鹼、長春鹼、諾考達唑（nocodazole）、埃博黴素（epothilone）、及維瑞濱（navelbine）、表鬼臼毒素（epidipodophyllotoxin）（依託泊苷（etoposide）及替尼泊苷（teniposide））、DNA損傷劑（放線菌素（actinomycin）、安吖啶（amsacrine）、蒽環黴素（anthracycline）、博萊黴素（bleomycin）、白消安（busulfan）、喜樹鹼（camptothecin）、卡鉑（carboplatin）、氮芥苯丁酸（chlorambucil）、順鉑（cisplatin）、環磷醯胺、環磷醯胺（Cytoxan）、更生黴素（dactinomycin）、道諾黴素（daunorubicin）、多柔比星（doxorubicin）、表柔比星（epirubicin）、六甲基三聚氰胺、異磷醯胺（iphosphamide）、美法侖（melphalan）、墨羅他敏（merchlorehtamine）、絲裂黴素（mitomycin）、米托蒽醌、亞硝基脲（nitrosourea）、普卡黴素（plicamycin）、丙卡巴胼（procarbazine）、紫杉醇（taxol）、泰索帝（taxotere）、替尼泊苷、三亞乙基硫代磷醯胺（triethylenethiophosphoramide）及依託泊苷（VP16））；抗生素，諸如更生黴素（dactinomycin）（放線菌素D（actinomycin D））、道諾黴素、多柔比星（亞得里亞黴素（adriamycin））、伊達比星（idarubicin）、蒽環類、米托蒽醌、博萊黴素、普卡黴素（光輝黴素（mithramycin）及絲裂黴素；酶（L-天門冬醯胺酶，其系統性代謝L-天冬醯胺並剝奪不具有合成其自身天門冬醯胺的能力的細胞）；抗血小板劑；抗增殖/抗有絲分裂烷化劑，諸如氮芥類（氮芥、環磷醯胺及類似物、美法侖、苯丁酸氮芥）、伸乙亞胺類及甲基三聚氰胺類（六甲基三聚氰胺及噻替派（thiotepa））、烷基磺酸鹽-白消安、亞硝基脲（nitrosoureas）（卡莫司汀（carmustine）（BCNU）及類似物、鏈脲黴素（streptozocin））、達卡巴嗪（trazenes-dacarbazinine）（DTIC）；抗增殖/抗有絲分裂抗代謝藥，諸如葉酸類似物（甲胺喋呤（methotrexate））；鉑配位錯合物（順鉑、卡鉑）、丙卡巴胼、羥基脲、米托坦（mitotane）、胺魯米特（aminoglutethimide）；激素、激素類似物（雌激素、他莫昔芬（tamoxifen）、戈舍瑞林（goserelin）、比卡魯胺（bicalutamide）、尼魯胺（nilutamide））及芳香酶抑制劑（來曲唑（letrozole）、阿那曲唑（anastrozole））；抗凝血劑（肝素、合成肝素鹽及凝血酶的其它抑制劑）；纖維蛋白溶解劑（諸如組織纖維蛋白溶酶原活化劑、鏈激酶（streptokinase）及尿激酶（urokinase））、阿司匹靈、雙嘧達莫（dipyridamole）、噻氯匹定（ticlopidine）、克羅匹多（clopidogrel）、阿昔單抗（abciximab）；抗遷移劑；抗分泌劑（布瑞汀（breveldin））；免疫抑制劑（環孢菌素、他克莫司（tacrolimus）（FK-506）、吉西他濱（Gemzar ®）、甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate）（GLEEVEC™）、鹽酸厄洛替尼（erlotinib hydrochloride）（TARCEVA™）、蘋果酸舒尼替尼（sunitinib malate）（SU11248、SUTENT™）、吉非替尼（gefitinib）(IRESSA™)、西羅莫司（sirolimus ）（雷帕黴素（rapamycin））、硫唑嘌呤（azathioprine）、黴酚酸嗎啉乙酯（mycophenolate mofetil））；抗血管生成化合物（例如TNP-470、金雀異黃酮（genistein）、貝伐珠單抗（bevacizumab））及生長因子抑制劑（例如纖維母細胞生長因子（FGF）抑制劑）；血管收縮素受體阻斷劑；一氧化氮供體；反義寡核苷酸；抗體（曲妥珠單抗（trastuzumab））；細胞週期抑制劑及分化誘導劑（維甲酸（tretinoin））；mTOR抑制劑、拓樸異構酶抑制劑（多柔比星（亞得里亞黴素）、安吖啶、喜樹鹼、道諾黴素、更生黴素、替尼泊苷、表柔比星、依託泊苷、伊達比星、米托蒽醌、拓撲替康（topotecan）、伊立替康（irinotecan）（例如伊立替康脂質體注射劑，諸如Onivyde ®）、皮質類固醇（可的松（cortisone）、地塞米松（dexamethasone）、氫化可的松（hydrocortisone）、甲基普賴蘇濃（methylprednisolone）、普賴松（prednisone）及普賴蘇濃（prednisolone））；生長因子訊號轉導激酶抑制劑；核苷酸類似物及胸苷磷酸化酶抑制劑（例如曲氟尿苷-替普瑞新（trifluridine-tipiracil）或Lonsurf ®）；粒線體功能障礙誘導劑及胱天蛋白酶活化劑；染色質破壞劑、或檢查點抑制劑（例如PD-1、PD- L1、PD-L2、CTLA-4、LAG3、TIM-3、A2aR、TIGIT及VISTA的抑制劑）。
基於核酸的治療劑（包括腫瘤抑制基因、反義寡核苷酸、siRNA、miRNA或shRNA）的實例包括美國公開專利申請號第2007/0065499號及美國專利號第7,780,882號中揭示者，其各自的揭示內容藉由引用整體併入本文。基於抗體的治療藥劑的實例包括但不限於貝伐珠單抗（Bevacizumab）、西妥昔單抗（Cetuximab）、帕尼單抗（Paniturnumab）、阿侖單抗（Alemtuzumab）、利妥昔單抗（Rituximab）、曲妥珠單抗（Trastuzumab）。
或者，本文所述的任何單核球靶向適體標記的脂質奈米粒子（LNP）可包覆診斷藥劑。示例性診斷藥劑可為醫學顯像劑，例如顯影劑、放射性試劑、放射性藥物、氧化鐵粒子等。適用於體內成像的放射性分子包括但不限於 122I、 123I、 124I、 125I、 131I、 18F、 75Br、 76Br、 77Br、 211At、 225Ac、 177Lu、 153Sm、 186Re、 188Re、 67Cu、 213Bi、 212Bi、 212Pb、及 67Ga。適合於體內成像的示例性放射性藥物包括 111In氧喹啉、 131I碘化鈉、 99mTc苯溴胺乙酸（mebrofenin）、及 99mTc紅血球、 123I碘化鈉、 99mTc依沙美肟（exametazime）、 99mTc巨聚合白蛋白、 99mTc亞甲基二磷酸（medronate）、 99mTc巰替肽（mertiatide）、 99mTc亞希卓（oxidronate）、 99mTc三胺五乙酸（pentetate）、 99mTc過鎝酸鹽（pertechnetate）、 99mTc西斯坦密必（sestamibi）、 99mTc硫磺膠體、 99mTc替弗思明（tetrofosmin）、鉈-201、及氙-133。診斷藥劑也可為染料，例如螢光團，其可用於檢測個體的疾病部位，諸如腫瘤部位。本文所述的任何治療藥劑或診斷藥劑可藉由傳統方法或本文所述的方法摻入本文所述的適合的脂質體中。在一些具體實施例中，可藉由施加穿過脂質體膜的pH梯度（其中脂質體內部為酸性的）並使脂質體與待包覆的治療藥劑或診斷藥劑一起培養來裝載脂質體，如Maurer等人，Expert Opinion in Biological Therapy 1，923-47；NBoman等人，Cancer Res. 54, 2830-2833；Waterhouse等人，Methods Enzymol. 391（2005）40-57所述，其在此引入作為參考。此方法被理解為表示本領域中使用的「活性裝載」。在一些實例中，pH梯度可為硫酸銨梯度，如Haran等人，Biochim. Biophys. Acta 1115（1993）201-215及美國專利號第5,316,771號中一般性描述的，在此藉由引用併入用於預期目的。一旦使治療藥劑或診斷藥劑裝載到脂質體中，即可直接使用組合物，或可進一步處理組合物以去除任何未裝載的藥物。
pH裝載技術大體上涉及兩個步驟：產生具有低的脂質體內pH的pH梯度、以及隨後裝載治療藥劑或診斷藥劑。跨膜質子梯度可藉由多種方式產生。舉例來說，脂質體可在低pH緩衝液（諸如pH4檸檬酸鹽緩衝液）中製備，接著以pH7.5緩衝液交換外部緩衝溶液（例如Madden等人，Chem. Phys. Lipids，53:37-46（1990））。或者，離子載體可與陽離子梯度（高內部陽離子濃度）結合使用（例如，Fenske等人，Biochim Biophy. Acta，1414:188-204（1998））。諸如尼日利亞菌素及A23187的離子載體分別使單價或二價陽離子的向外運動與質子的向內運動偶聯，從而酸化脂質體的內部。另外，脂質體可在諸如硫酸銨的高濃度弱鹼的存在下製備（Haran等人，Biochim. Biophys. Acta，1151:201-215（1993））。根據相同的原理，外部銨鹽溶液的去除會導致pH梯度的產生，這也是隨後藥物裝載過程的原因。
除了pH梯度之外，金屬離子梯度也可用於治療藥劑或診斷藥劑的活性裝載。請參見，例如，Cheung等人，Biochim Biophys Acta，1414:205-216（1998）。中性形式的弱鹼治療藥劑或診斷藥劑可滲透通過膜，並藉由形成藥物-金屬離子錯合物而保留在脂質體的水性內部中。
若治療藥劑或診斷藥劑為水溶性弱鹼性藥物，則其可溶解在水溶液（例如300 mM蔗糖，或具有適當pH值的等張緩衝溶液）中、與脂質體懸浮液合併、接著在適合的溫度下培養。藥物溶液可含有少量與水混溶性的有機溶劑以增加藥物的溶解度（例如＜10%的乙醇）。培養溫度及時間取決於脂質組成及藥物的性質。通常，由膽固醇及長鏈飽和脂肪酸（諸如DSPC/膽固醇）組成的脂質體的滲透性低於由短鏈飽和脂質（諸如DMPC/膽固醇）或不飽和脂質形成的脂質體，且需要更高的溫度才能實現快速與有效的裝載。舉例來說，DSPC/膽固醇脂質體通常需要等於或高於60℃的溫度；通常在5至15分鐘後完成裝載，但可能需要長達2小時。
若治療藥劑或診斷藥劑為親脂性的，則可在允許藥劑在脂質體雙層的兩個單層之間分布的條件下使藥劑與脂質混合以製備脂質體。接著可使用本文所述的方法，因應跨膜pH或其他離子梯度，使外部單層中的試劑裝載到脂質體內部（翻轉到LN雙層的內部單層）。
化合物向脂質體中的遠程裝載採用跨膜梯度的形成，如Ceh等人，Biochim Biophys Acta，1995 Nov 1;1239（2）:145-56中所述。此方法包括使待裝載到脂質體中的治療藥劑或診斷藥劑及硼酸化合物與懸浮的脂質體一起培養，從而實現治療藥劑在脂質體內的累積（Ceh等人，1995及美國專利號第6,051,251號）。
醫藥組合物及其用途
本文揭示的任何單核球靶向脂質奈米粒子，包含一或多種治療藥劑或診斷藥劑，可與醫藥上可接受的載體混合以形成用於例如治療靶疾病的醫藥組合物。「可接受的」是指載體必須與組合物的活性成分相容（且較佳能夠穩定活性成分）且對要治療的個體無害。醫藥上可接受的賦形劑（載體）包括本領域眾所周知的緩衝劑。請參見，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed，（2000）Lippincott Williams and Wilkins，Ed. K. E. Hoover。
用於本方法的醫藥組合物可包含呈凍乾製劑或水溶液形式的醫藥上可接受的載體、賦形劑或穩定劑。請參見，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed，（2000）Lippincott Williams and Wilkins，Ed. K. E. Hoover）。可接受的載體、賦形劑或穩定劑在所使用的劑量及濃度下對接受者是無毒的，且可包含緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑（如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚）；低分子量（少於約10個殘基）多肽；蛋白，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、組胺酸、精胺酸、或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或聚葡萄糖；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖、或山梨糖醇；形成鹽的反離子，諸如鈉；金屬錯合物（例如鋅-蛋白錯合物）；及/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN TM、PLURONICS TM或聚乙二醇（PEG）。
本揭示還提供醫藥組合物，其包含本文所述的任何單核球靶向適體共軛的脂質奈米粒子（LNP）及醫藥上可接受的載體或賦形劑，該等LNP可包覆一或多種也在本文所述的治療藥劑或診斷藥劑。醫藥組合物中的載體必須是「可接受的」，意思為其與組合物的活性成分相容，且較佳能夠穩定活性成分且對要治療的個體無害。
用於本文揭示的醫藥組合物的適合的載體或賦形劑可為增強個體身體吸收LNP的能力、促進LNP與單核球結合、及/或增強由單核球產生的巨噬細胞對LNP的胞吞作用的物質。適合的載體及/或賦形劑也包括可用於使具有本文所述的修飾的LNP的製劑填充以允許方便及準確的劑量的任何物質。另外，在製造期間可使用載體及/或賦形劑以幫助處理本文所述的LNP。根據給藥途徑及藥物形式，可使用不同的載體及/或賦形劑。示例性賦形劑包括但不限於抗黏附劑、黏合劑、包衣崩解劑、填充劑、調味劑（諸如甜味劑）及著色劑、助流劑、潤滑劑、防腐劑、吸附劑。本文所述的載體及/或賦形劑也可包括賦形劑及/或稀釋劑，其中：「載體」表示通常充當溶劑或載體的各種介質中的任何一種；「稀釋劑」表示用於稀釋組合物的活性成分的稀釋劑；適合的稀釋劑包括任何可降低藥物製劑黏度的物質。
載體及/或賦形劑的類型及量根據所選醫藥形式進行選擇；適合的醫藥形式為液體系統，如溶液、輸注、懸浮液；半固體系統，如膠體、凝膠、糊劑或霜劑；固體系統，如粉末、顆粒、片劑、膠囊、小丸、微顆粒、小片、微膠囊、微丸、栓劑；等等。上述各系統可使用本領域眾所周知的技術適當地配製，以用於正常、延遲或加速釋放。
包含本文所述的單核球靶向的LNP、包含一或多種治療藥劑或診斷藥劑的醫藥組合物可根據標準技術以及本文所述的那些技術來製備。在一些實例中，醫藥組合物被配製用於腸胃外給藥，包括小管內給藥、靜脈內給藥、皮下給藥或肌內給藥。在一些實例中，醫藥組合物藉由單次大劑量注射（bolus injection）或輸注靜脈內給藥。適用於本發明的製劑可在Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，17th ed.（1985）中找到。
在一些實例中，醫藥組合物被配製用於注射，諸如靜脈輸注。無菌可注射組合物，例如無菌可注射水性或油性懸浮液，可根據本領域已知的技術使用適合的分散劑或潤濕劑（諸如Tween 80）或懸浮劑來配製。無菌可注射製劑也可為在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如作為在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的載體及溶劑包括甘露醇、水、林格氏溶液及等張氯化鈉溶液。另外，無菌的非揮發性油傳統用作溶劑或懸浮介質（例如合成的甘油單酯或甘油二酯）。脂肪酸，諸如油酸及其甘油酯衍生物，以及天然醫藥上可接受的油，諸如橄欖油或蓖麻油，特別是其聚氧乙烯化形式，可用於製備注射劑。這些油溶液或懸浮液也可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，或羧甲基纖維素或類似的分散劑。其他常用的表面活性劑，如Tween或Span或其他類似的乳化劑或生物利用度增強劑，其通常用於醫藥製備。
任何醫藥組合物均可用於使用循環單核球作為載體使治療藥劑或診斷藥劑輸送到期望的靶位點。為了實踐此用途，可經由適合的途徑，諸如本文所述的那些途徑，使有效量的包含任何單核球靶向適體或其連接子共軛物以及治療藥劑的醫藥組合物施打於需要治療的個體（例如人類個體）。同樣為了實踐此用途，可經由適合的途徑，諸如本文所述的那些途徑，使有效量的包含本文所述的任何包覆治療藥劑（例如抗炎劑）的LNP的醫藥組合物施打於需要治療的個體（例如人類個體）。經由與單核球的結合活性，LNP將與個體的循環單核球締合並被輸送到單核球累積的部位（例如發炎發生的部位）。一旦單核球穿過內皮細胞層，其就會分化成巨噬細胞，巨噬細胞經由胞吞作用吸收締合的LNP，從而釋放所捕捉的治療藥劑以發揮其治療作用。
如本文所用，「有效量」涉及單獨或與一或多種其他活性劑組合賦予個體治療效果所需的每個活性劑的量。如本領域技術人員認可的，有效量根據給藥途徑、賦形劑的使用以及與其他活性劑的共同使用而變化。
當然，此類量將取決於所治療的特定病況、病況的嚴重程度、個別患者參數（包括年齡、身體疾病、體型、性別及體重）、治療持續時間、同步治療的性質（若存在）、具體的給藥途徑以及衛生從業人員的知識及專門知識內的類似因素。這些因素對於本領域普通技術人員來說是眾所周知的，且可僅藉由常規實驗解決。一般來說較佳使用最大劑量的單個組分或其組合，即根據合理醫學判斷的最高安全劑量。然而，本領域普通技術人員將理解到，患者可能出於醫學原因、心理原因或實際上任何其他原因而堅持使用較低劑量或可耐受劑量。
在一些具體實施例中，包含如本文所述的抗癌劑的醫藥組合物用於治療癌症。本文所用的「治療」乙詞涉及向患有過敏性疾病、過敏性疾病的症狀或過敏性疾病的傾向的個體施加或施打包括一或多種活性劑的組合物，目的為治癒、緩和、緩解、改變、補救、減輕、改善或影響疾病、疾病的症狀或疾病的傾向。
在一些具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的固態腫瘤的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的本文所述的醫藥組合物。在施打到患有、懷疑患有固態腫瘤或處於存在固態腫瘤風險中的個體中之後，本文所述的LNP可經由附接到單核球而被輸送到固態腫瘤部位，並在靶位點發揮期望的治療作用。示例性固態腫瘤包括但不限於胰管腺癌（PDA）、大腸直腸癌（CRC）、黑色素瘤、膽管癌、乳腺癌、小細胞和非小細胞肺癌、上胃腸道及下胃腸道惡性腫瘤、胃癌、鱗狀細胞頭頸癌、泌尿生殖系統癌、肝細胞癌、卵巢癌、肉瘤、間皮瘤、神經膠質母細胞瘤、食道癌、膀胱癌、尿道上皮癌、腎癌、子宮頸癌、及子宮內膜癌。在一些其他具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的腫瘤轉移的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的本文所述的醫藥組合物。在施打到患有、懷疑患有腫瘤轉移或處於腫瘤轉移風險中的個體之後，本文所述的LNP可經由附接到單核球而被輸送到轉移的腫瘤區域，並在靶位點發揮期望的治療作用。
在一些具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的胰腺癌的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的含有本文所述的單核球標記的LNP的醫藥組合物。在一些方面，用於治療胰腺癌的單核球標記的LNP包覆以下中的一或多種：鹽酸厄洛替尼（Erlotinib Hydrochloride）、癌伏妥（Everolimus）、5-FU（氟尿嘧啶注射液）、鹽酸吉西他濱（Gemcitabine Hydrochloride）、Gemzar（鹽酸吉西他濱）、鹽酸伊立替康脂質體（Irinotecan Hydrochloride Liposome）、絲裂黴素C、太平洋紫杉醇白蛋白穩定的奈米粒子製劑、蘋果酸舒尼替尼（Sunitinib Malate）、奧賽力鉑（Folfirnox）。
在一些具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的卵巢癌的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的含有本文所述的單核球標記的LNP的醫藥組合物。在一些方面，用於治療卵巢癌的單核球標記的LNP包覆以下中的一或多種：貝伐珠單抗（Bevacizumab）、卡鉑、順鉑、環磷醯胺、鹽酸多柔比星、鹽酸多柔比星脂質體、鹽酸吉西他濱、美法侖、甲苯磺酸尼拉帕尼單水合物（Niraparib Tosylate Monohydrate）、拉帕尼（Olaparib）、太平洋紫杉醇、樟腦磺酸蘆卡帕尼（Rucaparib Camsylate）噻替派（Thiotepa）、及鹽酸拓朴替康（Topotecan Hydrochloride）。
在一些具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的乳癌的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的含有本文所述的單核球標記的LNP的醫藥組合物。在一些方面，用於治療乳癌的單核球標記的LNP包覆以下中的一或多種：鹽酸雷洛昔芬（Raloxifene Hydrochloride）、檸檬酸他莫昔芬（Tamoxifen Citrate）、貝馬希克力布（bemaciclib）、阿多曲妥珠單抗恩他新（Ado-Trastuzumab Emtansine）、艾培昔布（Alpelisib）、阿那曲唑（Anastrozole）、阿特珠單抗（Atezolizumab）、卡培他濱（Capecitabine）、環磷醯胺、多西他賽（Docetaxel）、鹽酸阿黴素（Doxorubicin Hydrochloride）、鹽酸表柔比星（Epirubicin Hydrochloride）、甲磺酸艾日布林（Eribulin Mesylate）、依維莫司（Everolimus）、依西美坦（Exemestane）、5-FU（氟尿嘧啶注射劑）、氟維司群（Fulvestrant）、鹽酸吉西他濱（Gemcitabine Hydrochloride）、乙酸戈舍瑞林（Goserelin Acetate）、伊沙匹隆（Ixabepilone）、來曲唑（Letrozole）、乙酸甲地孕酮（Megestrol Acetate）、甲胺喋呤（Methotrexate）、順丁烯二酸來那替尼（Neratinib Maleate）、奧拉帕尼（Olaparib）、太平洋紫杉醇白蛋白穩定的奈米粒子製劑、帕泊昔布（Palbociclib）、帕米膦酸二鈉（Pamidronate Disodium）、帕妥珠單抗（Pertuzumab）、瑞博昔布（Ribociclib）、甲苯磺酸他拉唑帕尼（Talazoparib Tosylate）、檸檬酸他莫昔芬（Tamoxifen Citrate）、噻替派（Thiotepa）、托瑞米芬（Toremifene）、曲妥珠單抗（Trastuzumab）、曲妥珠單抗與透明質酸酶-oysk（Hyaluronidase-oysk）、及硫酸長春鹼（Vinblastine Sulfate）。
在一些具體實施例中，本揭示提供一種用於治療個體中的肺癌的方法，該方法包含向有需要其的個體施打有效量的含有本文所述的單核球標記的LNP的醫藥組合物。在一些方面，用於治療肺癌的單核球標記的LNP包覆以下中的一或多種：二順丁烯二酸阿法替尼（Afatinib Dimaleate）、阿來替尼（Alectinib）、阿替珠單抗（Atezolizumab）、貝伐珠單抗（Bevacizumab）、布加替尼（Brigatinib）、卡鉑（Carboplatin）、色瑞替尼（Ceritinib）、克卓替尼（Crizotinib）、甲磺酸達拉菲尼（Dabrafenib Mesylate）、達可替尼（Dacomitinib）、多西他賽（Docetaxel）、鹽酸阿黴素（Doxorubicin Hydrochloride）、德瓦魯單抗（Durvalumab）、恩曲替尼（Entrectinib）、鹽酸厄洛替尼（Erlotinib Hydrochloride）、依維莫司（Everolimus）、吉非替尼（Gefitinib）、鹽酸吉西他濱（Gemcitabine Hydrochloride）、勞拉替尼（Lorlatinib）、鹽酸氮芥（Mechlorethamine Hydrochloride）、甲胺喋呤（Methotrexate）、奈昔木單抗（Necitumumab）、尼沃魯單抗（Nivolumab）、甲磺酸奧希替尼（Osimertinib Mesylate）、太平洋紫杉醇（Paclitaxel）、太平洋紫杉醇白蛋白穩定的奈米粒子製劑、派姆單抗（Pembrolizumab）、培美曲塞二鈉（Pemetrexed Disodium）、雷莫蘆單抗（Ramucirumab）、曲美替尼（Trametinib）、及酒石酸長春瑞濱（Vinorelbine Tartrate）。
套組
本揭示也提供用於使治療藥劑輸送到靶位點或用於藉由使抗癌劑（諸如化學治療劑）輸送到腫瘤區域來治療癌症的套組。此類套組可包括一或多個容器，該等容器包含本文所述的任何醫藥組合物，該等醫藥組合物包含本文所述的單核球靶向適體共軛的脂質奈米粒子（LNP）或類似地包覆治療藥劑的奈米粒子及醫藥上可接受的載體。
在一些具體實施例中，套組可包含根據本文所述的任何方法使用的操作說明。所包括的操作說明可包含醫藥組合物的給藥說明，以輸送包覆在其中的治療藥劑，或用於根據本文所述的任何方法治療癌症。套組可進一步包含基於鑑定個體是否患有、是否懷疑患有癌症或是否處於癌症的風險中來選擇適合治療的個體的說明。
與本文所述的醫藥組合物的使用相關的操作說明大體上包括關於劑量、劑量方案及用於預期治療的給藥途徑的訊息，該醫藥組合包含包覆治療藥劑或診斷藥劑的LNP。容器可為單位劑量、散裝包裝（例如多劑量包裝）或次單位劑量。本發明的套組中提供的操作說明通常為標籤上的書面說明或包裝插頁（例如套組中包括的紙張），但機器可讀操作說明（例如磁性或光學儲存碟片上攜帶的操作說明）也是可接受的。
標籤或包裝插頁表明組合物為用於使治療藥劑輸送到靶位點或用於治療癌症。可提供操作說明用於實施本文所述的任何方法。
本文所述的套組裝在適合的包裝中。適合的包裝包括但不限於小瓶、瓶子、廣口瓶、柔性包裝（例如密封的Mylar或塑膠袋）等。也考慮與特定裝置組合使用的包裝，該裝置例如為吸入器、鼻腔給藥裝置（例如霧化器）、或諸如微型泵的輸注裝置。套組可具有無菌入口（例如容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。容器也可具有無菌入口（例如容器可為靜脈注射溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶）。
本文所述的套組可任選擇地提供額外組分，諸如緩衝液及解釋訊息。按慣例，套組包含容器及在容器上或與容器相關的標籤或包裝插頁。在一些具體實施例中，本揭示提供包含上述套組內容物的製品。
通用技術
除非另有說明，否則本文揭示的實施將採用分子生物學（包括重組技術）、微生物學、細胞生物學、生物化學及、及免疫學的傳統技術，這些技術在本領域技術範圍內。此類技術在文獻中有充分解釋，諸如Molecular Cloning: A Laboratory Manual，second edition（Sambrook等人，1989）Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis（M. J. Gait，ed. 1984）；Methods in Molecular Biology， Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook（J. E. Cellis，ed.，1998）Academic Press；Animal Cell Culture（R. I. Freshney，ed. 1987）；Introduction to Cell and Tissue Culture（J. P. Mather及P. E. Roberts, 1998）Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures（A. Doyle, J. B. Griffiths及D. G. Newell，eds.，1993-8）J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology（Academic Press，Inc.）；Handbook of Experimental Immunology（D. M. Weir 及C. C. Blackwell，eds.）；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells（J. M. Miller及M. P. Calos，eds.，1987）；Current Protocols in Molecular Biology（F. M. Ausubel等人，eds.，1987）；PCR: The Polymerase Chain Reaction，（Mullis等人，eds.，1994）；Current Protocols in Immunology（J. E. Coligan等人，eds.，1991）；Short Protocols in Molecular Biology（Wiley and Sons，1999）；Immunobiology（C. A. Janeway 及P. Travers，1997）；Antibodies（P. Finch，1997）；Antibodies: a practicalapproach（D. Catty.，ed., IRL Press，1988-1989）；Monoclonal antibodies: a practical approach（P. Shepherd及C. Dean，eds., Oxford University Press，000）；Using antibodies: a laboratory manual（E. Harlow及D. Lane（Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999）；The Antibodies（M. Zanetti 及J. D. Capra，eds.，Harwood Academic Publishers，1995）。
在無進一步詳細闡述情況下，相信本領域技術人員可基於以上描述最大程度地利用本發明。因此，下方特定具體實施例應被解釋為僅是說明性的，而不以任何方式限制本公開的其餘部分。本文引用的所有出版物均藉由引用併入本文以用於本文所參考的目的或主題。
實施例
儘管已參考本揭示的特定具體實施例來描述本揭示，但本領域技術人員應當理解到，在不脫離本揭示真實精神及範圍的情況下，可進行各種改變且可用同等物取代。另外，可進行許多修飾以使特定情況、材料、物質組成、方法、方法步驟、或步驟適應本揭示的目的、精神及範圍。所有此類修飾旨在落入本揭示的範圍內。
實施例 1 ：單核球專一性適體的開發。
使用細胞SELEX（藉由指數富集系統進化配體）方法產生可與單核球專一性結合的DNA適體。簡而言之，使含有10 15序列的ssDNA基因庫與10 6個鼠單核球細胞株RAW264.7或J774A.1陽性細胞在補充有0.1%（w/v）BSA及1 mg/mL鮭魚精子DNA的SELEX緩衝液（150 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2及40 mM HEPES pH 7.4）中在37℃下培養30分鐘。藉由以SELEX緩衝液洗滌去除未結合的ssDNA。單核球靶向ssDNA在95℃下洗滌10分鐘，並藉由PCR擴增。在六輪陽性選擇以建立基礎結合能力後，在SELEX後加入鼠內皮細胞株SVEC用於陰性選擇。在16及17個循環後，經由Illumina MiSeq系統進行下一代定序（NGS）來分析單核球靶向ssDNA。最終，藉由進行SELEX方法大約20個重複循環來選擇單核球專一性適體。以PCR擴增所得到的對RAW264.7（ 圖 1A）及J774A.1（ 圖 1B）具有專一性的適體。藉由流式細胞儀測量所得對RAW264.7及J774A.1具有專一性的適體的結合親和力。簡而言之，使5 x 10 5的RAW264.7或J774A.1細胞在阻斷緩衝液（20% PBS及10%鮭魚精子DNA的PBS溶液）中在4℃下預混合30分鐘。其後，使細胞與在阻斷緩衝液中遞增連續稀釋的Cy5標記的適體（0 nM至300 nM）在4℃下反應30分鐘。藉由以包含2% FBS的PBS洗滌並在4℃下以300 g離心3分鐘來去除未結合的Cy5標記。最終，對樣品進行流式細胞儀檢測。 圖 1C顯示所得對RAW264.7具有專一性的適體（AptR）的結合親和力，且 圖 1D顯示所得對J774A.1具有專一性的適體（AptR）的結合親和力。 圖 1E顯示使用定量PCR的體外單核球專一性適體篩選。
上述細胞SELEX方法產生J10適體作為最佳候選物。接著打亂J10的序列，得到對照組適體S2。所得的S2適體具有與J10適體相同的核苷酸組成，但以不同的順序排列。J10及S2的序列提供在下 表 1中。 表 1 ：適體序列
SEQ. ID NO. 適體 序列
SEQ. ID NO.4 J10 5’­ CAATAGAGTCGTACAGGTCG ACGCTCGGATGCCACTACAG GGATGGGAGGGAGGGGGCTCGTGGCGGCTAGGGGGTATAA CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3’
SEQ. ID NO.5 S2 5’­ CAATAGAGTCGTACAGGTCGTGAGAAGGCGTTGGTCTATCGGGGTCGTGGACTGTCCAAGGGCATGACCGGTCTGACGGTGGCCAGAGACGCAGGAGGGG-3’
下劃線序列表示與脂質體雜交的連接子序列；斜體序列表示用於擴增的適體基因庫中的共同（引子）序列；粗體序列表示可與單核球結合的結合序列；標準字體中的序列表示打亂的J10序列。
為了證實J10能夠在體外選擇性地結合單核球而非S2，首先以螢光標記試劑Cy5（（2Z）-2-[（2E,4E）-5-[1-（5-羧基戊基）-3,3-二甲基-5-磺基吲哚-1-鎓-2-基]戊-2,4-二烯亞基]-1-乙基-3,3-二甲基吲哚-5-磺酸鹽）來標記J10及S2適體，接著與單核球細胞株RAW264.7及J774A.1一起培養。Cy5標記的J10及S2也與用作陰性選擇的小鼠內皮細胞株SVEC一起培養。簡而言之，使5 x 10 5個的每個選定細胞株在阻斷緩衝液（20% FBS及10%鮭魚精子DNA的PBS溶液）中在4℃下預混合30分鐘。其後，細胞與200 nM Cy5-J10或Cy5-S2在阻斷緩衝液中在4℃下反應30分鐘。最終，使用本領域已知的標準方案對樣品進行流式細胞儀檢測。如 圖 2A所示，Cy5標記的J10單核球（RAW264.7及J774A.1細胞）的百分比顯著高於Cy5標記的S2單核球的百分比，且在內皮小鼠細胞株SVEC中並無檢測到Cy5標記的J10或Cy5標記的S2。另外，PCR分析證實在小鼠心臟缺血再灌注（I/R）模型中靜脈注射Cy5標記的J10或S2後，J10適體體內靶向損傷部位的能力（ 圖 2B）。 圖 2A 及 2B中的數據一起證實J10能夠在體外選擇性地與單核球結合而非S2，並在體內被攜帶到損傷部位。
為了證實J10也能夠在體內選擇性地與單核球結合而非S2，首先藉由以J10或S2適體修飾在655 nm處發螢光的量子點（QD）奈米粒子（QD655，Invitrogen）來形成適體-量子點共軛物。接著，以S2或J10修飾的QD655經由多光子活體成像使體內通過小鼠血管的J10-QD655標記的單核球可被肉眼觀察。多光子活體成像以類似於Vinegoni等人， Nat. Protoc. 10，1802–1819（2015）中描述的方法進行。簡而言之，使獲自Jackson Laboratory，USA的雄性10-12周齡雜合轉基因小鼠B6.129P2（Cg）-Cx3cr1 tm1Litt/J（CX3CR1 GFP/WT）用於活體成像。所有動物在實驗期間均以1.5%異氟醚（Minrad）麻醉。接著使以J10或S2適體修飾的20μL的QD655注射到CX3CR1 GFP/WT小鼠中1小時，在激發注射的QD655探針後，藉由多光子顯微鏡（FVMPE-RS，Olympus）肉眼觀察目標區域。如 圖 2C所示，體內活體成像檢測到J10適體-QD655對循環CX3CR1-GFP +單核球的體內靶向而非S2適體-QD655。 圖 2C中的數據證實J10能夠在體內選擇性地與單核球結合而非S2。
為了證實J10結合結合在體外對人類單核球具有選擇性而非S2，使Cy5標記的J10及S2也與人類單核球細胞株、THP-1及U937、以及人類臍帶內皮細胞（HUVEC）一起培養，其被用作陰性對照組。簡而言之，使5 x 10 5個的每個選定細胞株在阻斷緩衝液（20% FBS及10%鮭魚精子DNA的PBS溶液）中在4℃下預混合30分鐘。其後，細胞與200 nM Cy5-J10或Cy5-S2在阻斷緩衝液中在4℃下反應30分鐘。最終，使用本領域已知的標準方案對樣品進行流式細胞儀檢測。如 圖 3所示，J10適體也顯示對人類單核球細胞株THP-1及U937具有高結合親和力，但對人類內皮細胞株HUVEC不具有結合親和力，而S2在任何測試的細胞株中皆不具結合親和力。
為了測試離體結合專一性及親和力，經由頜下靜脈抽取健康小鼠100 μL的周邊血液，收集在含有EDTA的抗凝血試管（BD Vacutainer）中，並與2 mL的ACK裂解緩衝液一起培養10分鐘以分解紅血球。其後，加入含有2% FBS的PBS以終止反應。離心（300 g，4℃，3分鐘）後，去除上清液。在培養20分鐘後，藉由CD16/CD32 Fc阻斷抗體（1:100）阻斷100萬個細胞。接著使細胞以CD45（PE-Cy7；1:100；Biolegend）、CD11b（PE；1:200；Biolegend）及2 μM Cy5-Apt在4℃下染色30分鐘。最終，以含有2% FBS的PBS洗滌細胞，並使用本領域已知的標準方案進行流式細胞儀檢測。如 圖 2D所示，J10適體對循環骨髓細胞（CD45 +CD11b +細胞）具有高親和力。
總之，實施例1中提供的數據證明，藉由細胞SELEX方法鑑定的J10適體可以良好的親和力選擇性結合鼠及人循環單核球。
實施例 2 ：基於適體的脂質奈米粒子靶向系統的形成。
連接子 -PEG-DSPE 共軛物的合成及純化。使TCEP（三（2-羧乙基）膦）（1.5 mM，pH = 7.0）與二硫化物標記的DNA（莫耳比率= 100:1）在4℃下隔夜培養。使用3倍冷乙醇及0.1倍冷乙酸鈉（3 M）在-80℃下來沉澱連接子-DNA30分鐘，接著以17,000 rpm離心。接著藉由與TCEP（連接子-DNA:TCEP:Mal-PEG-DSPE的莫耳比率=1:10:20）一起培養，在4℃下隔夜，使連接子-DNA與1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[馬來醯亞胺（聚乙二醇）-2000]（Mal-PEG-DSPE，Avanti）共軛，並藉由凍乾乾燥。最終，使用高效能液相層析儀（HPLC）純化連接子-脂質，並去除乙腈（ACN）及醋酸三乙銨（TEAA）系統中游離的連接子-SH及游離的Mal-脂質。使用C5管柱（Sigma）以1 mL/min的流速使移動相在40分鐘內從20% ACN開始至100% ACN。在每個步驟之後進行質譜測定，以證實使用本領域已知的標準方案成功合成（ 圖 4A 至 4C）。
脂質奈米粒子的製造及其裝載。藉由使用容易附接到含馬來醯亞胺的DSPE-PEG的硫醇化連接子來合成脂質奈米粒子（LNP）。具體地，藉由使DSPC、膽固醇及DSPE-PEG溶解在氯仿中，使DSPE-PEG-連接子及DiD溶解在甲醇中（莫耳比率=45:50:0.047:0.003:0.005），在圓底瓶中製備脂質膜（總質量=35 mg）。在室溫下減壓去除溶劑，並隔夜凍乾脂質膜。
添加感興趣的治療藥劑以裝載到LNP中。在示例性方法中，吉西他濱（「Gem」；也稱作Gemzar®），一種用於治療膀胱癌、胰腺癌、卵巢癌及乳癌、以及非小細胞肺癌的化學治療藥物，被用作感興趣的治療劑。為了製造Gem-LNP，將乾膜以1 ml吉西他濱的PBS 溶液（75 mg/ml）水合，形成多層載體（MLV）連接子-Gem-LNP。在乾膜完全溶解後，使用液氮及65℃水浴，在真空下藉由10次凍融循環來減小MLV的尺寸。藉由連續2秒的超音波震盪及10秒的暫停，使用探針超音波震盪儀對連接子-Gem-LNP進行總共2分鐘的超音波震盪。接著使連接子-Gem-LNP在65℃下擠壓通過0.1 µm聚碳酸酯膜21次，並在4℃下隔夜儲存。藉由使用瓊脂糖CL-4B尺寸排阻管柱，以PBS作為流動相，純化連接子-Gem-LNP。
脂質奈米粒子與適體的共軛。在示例性方法中，連接子-Gem-LNP藉由隔夜4℃培養（適體:連接子＝2.5:1）分別與J10及S2適體共軛，接著使用瓊脂糖CL-4B尺寸排阻管柱，以PBS作為流動相純化。使用以下等式使連接子及適體對於適體-脂質體製造的有效比率測量為雜交效率的百分比： 。
測試若干連接子對適體的比率以鑑定表2中所示的最佳量。 表 2 ：用於適體 - 脂質體製造的連接子及適體的有效比率。
適體 連接子對適體比率 添加的適體（pmol ） 未反應的適體（pmol ） 反應的適體（pmol ） 雜交效率（% ）
J10 1:0.25 100 37 63 9.2
J10 1:0.5 200 79 121 19.9
J10 1:1.25 500 190 310 47.6
J10 1:2.5 1000 328 672 82.0
J10 1:5 2000 331 1669 82.7
S2 1:2.5 1000 316 684 78.9
進行低溫電子顯微鏡檢查以肉眼觀察脂質奈米粒子。簡而言之，使覆蓋有多孔碳膜的200目銅網（Electron Microscopy Sciences）在碳側進行15秒的輝光放電。使含有15 μM脂質濃度的樣品（4 μL）吸移到網格上，接著在100%濕度、4℃下印漬3秒，並使用Vitrobot（Thermo Fisher Scientific）投入以液氮冷卻的液態乙烷中快速冷凍。網格儲存在液氮下，並使用冷凍台轉移到電子顯微鏡。碳膜中的孔內的脂質體的影像藉由使用Tecnai F20電子顯微鏡（Thermo Fisher Scientific）在200 keV下以70 μm物鏡孔徑獲得。每次暴露的低劑量條件為~25 e -/Å 2。影像以2 m散焦時拍攝，並記錄在4k × 4k CCD相機（Gatan，USA）上。低溫電子顯微鏡證實吉西他濱的成功包覆（ 圖 5A）。
藉由觀察不存在於活體內並因此僅可能來源於吉西他濱的NMR-活性 19F核，使用核磁共振（NMR）作為吉西他濱定量的選擇方法。Olive等人，Science. 324，1457–1461（2009）及Bapiro等人， Cancer Chemother. Pharmacol.68，1243–1253（2011）。為了製備用於藉由NMR定量包覆有吉西他濱的樣品，首先使脂質奈米粒子（1 μM 脂質濃度）溶解在乙腈/D 2O（30:70）中，摻入1 mg/mL內部標準 2-氟-2’-去氧腺苷（ 2F2dA, Sigma），以1 N HCl調節至pH 5，接著轉移到5 mm NMR 管中用於測量。所有 19F-NMR測量均在Bruker Avance 500 AV（500 MHz，11.7 T）NMR光譜儀上進行，且使用QNP冷凍探針來獲得所有光譜。以160 ppm的光譜掃描寬度、32,768個點、2,048次掃描、0.2秒的獲得時間、及3秒的弛豫延遲來獲得1D 19F NMR（470 MHz）光譜。內部參考化合物2F2dA，指定為-52.06 ppm的化學位移，從而在-116.33 ppm處得到吉西他濱（dFdC）峰。使獲得的場感應衰減（FID）補零到65,536點、使用指數窗函數處理、定相、及基線校正。對標準品和吉西他濱峰進行仔細積分以進行定量。 19F-NMR光譜證實成功包覆吉西他濱（ 圖 5B）。
也對脂質奈米粒子進行HPLC分析。簡言之，使脂質奈米粒子溶解在ACN/H 2O（30:70）中以進行測量。在35℃下，在X-Bridge C18管柱中，以1 mL/min的流速，使用ACN/H 2O（30:70），以Waters e2695分離模組進行分離。使用Waters 2489 UV/Vis檢測器在272 nm處進行檢測。HPLC分析證實吉西他濱的成功包覆（ 圖 5C）。
接著使具有及不具有適體的LNP進行尺寸及zeta電位測量特性化。所有尺寸及zeta電位測量均在Zetasizer Nano ZS上在25℃下進行，尺寸測量在純脂質體樣品上進行，而樣品用PBS以1:10稀釋用於zeta電位測量。在示例性實例中，收集如 表 3中提供的攜帶吉西他濱的LNP在有與沒有J10適體的情況下的尺寸及zeta電位測量值。 表 3 ：包覆有吉西他濱的適體 - 脂質體的尺寸及 zeta 電位。
尺寸（Z-平均值（d.nm）） 多分散性指數（PDI） Zeta電位（mV）
S2-Gem-LNP 114.7±1.1 0.253±0.011 -21.90±0.707
J10-Gem-LNP 105.9±1.7 0.394±0.052 -22.63±1.29
具有適體的專一性脂質奈米粒子的特性化。為了證實包覆的吉西他濱的殺死腫瘤細胞的能力，進行細胞毒性測定。簡而言之，以 19F-NMR定量吉西他濱後，使指定吉西他濱濃度的J10-Gem-LNP、S2-Gem-LNP、Gem-LNP、吉西他濱與來自小鼠胰腺癌細胞株KPC的細胞一起培養48小時。使用細胞計數套組-8按照製造商的說明（Sigma）進行生存力測定。如 圖 5D所示，在KPC細胞中，包覆在適體標記的LNP中的吉西他濱的細胞毒性低於未包覆的吉西他濱。
測量適體-Gem-LNP對小鼠單核球細胞株J774A.1及RAW264.7以及小鼠內皮細胞株SVEC的體外結合親和力。簡言之，使5 x 10 5個的每個選定細胞株在阻斷緩衝液（20% FBS及10%鮭魚精子DNA的PBS溶液）中在4℃下預混合30分鐘。其後，使細胞與5M DiD標記的J10-Gem-LNP、DiD標記的S2-Gem-LNP或DiD標記的Gem-LNP在阻斷緩衝液中在4℃下反應30分鐘。藉由以PBS中的2% FBS洗滌並在4℃下以300 g離心3分鐘來去除未結合的適-Gem-LNP。最終，對樣品進行流式細胞儀檢測。 圖 5E顯示，與S2-及未修飾的LNP相比，J10修飾的LNP能夠以更高的效率與單核球結合。
實施例 3 ：循環單核球增加並召集到腫瘤部位。
為了測定輸送治療胰管腺癌（PDAC）的治療藥劑的最有效時間點，使用獲自Jackson Laboratory，USA的雄性6至8周齡雜合轉基因小鼠B6.129（Cg）-Ccr2 tm2.1Ifc/J（CCR2 RFP/WT）的PDAC模型來構築單核球召集模式。
為了產生鼠PDAC模型，使用原位腫瘤植入法。簡言之，以與Kim等人 Nat. Protoc.4，1670–1680（2009）及Chai等人， J. Vis. Exp.（2013）揭示的方法相似的方式，藉由胰內注射距離胰尾約2至3 mm，使5 × 10 5個懸浮於20 μL無菌PBS中的活KPC細胞施打到6至8周齡的CCR2 RFP/WT小鼠。
在建立PDAC後，在5小時（5h）及第1、4、7、14、21、35及42天以全血細胞計數（CBC）測定循環單核球的數量。數據顯示KPC腫瘤細胞移植後循環RFP +單核球的數量增加，其在KPC腫瘤細胞移植後第7天達到最大量（ 圖 6）。
移植成功及單核球召集藉由體內成像系統（IVIS）成像證實。CCR2-RFP +單核球召集到腫瘤的分析是藉由在以小鼠KPC胰腺癌細胞株原位移植的CCR2-RFP轉基因小鼠中的體內成像系統（IVIS）成像來進行。改造小鼠KPC胰腺癌細胞株來表現螢光素酶，以便於檢測。簡而言之，以腹膜內注射螢光素基質120 µg/g（BioSynth Cat: L-8820）。藉由吸入異氟醚來麻醉小鼠，並使用Perkin Elmer IVIS光譜以一分鐘的間隔獲取重複的IVIS影像。選擇具有最強發光訊號的時間點用於分析。IVIS成像顯示腫瘤移植成功且單核球召集到腫瘤部位（ 圖 7A 及 7B），由此在注射部位清楚地觀察到CCR2-RFP +單核球（ 圖 7C）。
藉由流式細胞儀評估適體-Gem-LNP對單核球、淋巴細胞及顆粒性白血球的體內結合專一性。簡言之，在第10天施打J10-Gem-LNP、S2-Gem-LNP、Gem-LNP中的任一種後，經由頜下靜脈使50 μL周邊血液收集在含有EDTA的抗凝血試管（BD Vacutainer）中。每10 μL全血中加入0.1 μg CD16/CD32（Invitrogen）來阻斷Fc受體20分鐘。製備在PBS中含有CD11b PE（1:50；Biolegend）及CD45 PE-Cy7（1:50；Biolegend）的染色溶液（共45 μL），並向其中加入5 μL Fc受體阻斷的全血。培養懸浮液並避光保護30分鐘。接著在熱協調聲®聚焦細胞計數器上進行流式細胞儀檢測之前，立即將PBS（2 mL）加入到試管中。數據顯示，與S2-及未修飾的LNP相比，J10修飾的LNP能夠以更高的效率與單核球結合（ 圖 8A 及 8D）。另外，J10修飾的LNP不優先結合淋巴細胞（ 圖 8B 及 8E）或顆粒性白血球（ 圖 8C 及 8F）。
使用體內成像系統（IVIS）成像來量化腫瘤組織內的總吉西他濱。簡而言之，在以DiD標記的Gem-LNP、DiD標記的S2標記的Gem-LNP、或DiD標記的J10標記的Gem-LNP治療PDAC模型小鼠24小時後收集組織，其中DiD為親脂性花青染料。接著以IVIS肉眼觀察收集的組織DiD強度。採集的腫瘤組織的IVIS分析（LNP施打後24小時）顯示顯著更高的J10奈米粒子累積（ 圖 9A 及 9B）。
也使用 19F NMR對腫瘤組織內的總吉西他濱定量。首先，在PDAC模型小鼠以單獨的Gem、Gem-LNP、S2標記的Gem-LNP、或J10標記的Gem-LNP治療後24小時，收集組織、速凍，並在屍體剖檢時稱重。接著，加入四單位體積的冰冷乙腈以使樣品均質化。使等體積的冰冷水（對乙腈）加入樣品中，接著使其在冰上培養10分鐘。使樣品在4℃下以14,000 rpm離心10分鐘。使上清液轉移到耐寒小瓶中並在液氮中速凍。使樣品轉移到凍乾機中並乾燥至少24小時。使凍乾的腫瘤組織萃取物（來自至少濕重為100 mg的組織）重新懸浮在200 μL的D 2O中，摻入0.1 mg的內部標準2F2dA，以1 N HCl調節到pH5，接著轉移到5 mm Shigemi NMR管中進行測量。所有 19F-NMR測量均在Bruker Avance 500 AV（500 MHz，11.7 T）NMR光譜儀上進行，且使用冷凍探針來獲得所有光譜。以160 ppm的光譜掃描寬度、32,768個點、2,048次掃描、0.2秒的獲得時間、及3秒的弛豫延遲來獲得1D 19F NMR（470 MHz）光譜。內部參考化合物2F2dA，指定為-52.06 ppm的化學位移為，從而在-116.33 ppm處得到吉西他濱（dFdC）峰。使獲得的場感應衰減（FID）補零到到65,536點、使用指數窗函數處理、定相、及基線校正。對標準品和吉西他濱峰進行仔細積分以進行定量。以 19F NMR定量腫瘤組織中的總吉西他濱，顯示在24小時後，J10組吉西他濱的累積最高（ 圖 10）。
總之，這些數據表明裝載有吉西他濱的奈米粒子能夠靶向腫瘤，其中J10修飾的奈米粒子具有最高的效力。
實施例 4 ：藥物裝載的脂質奈米粒子在癌症治療中的治療用途
在鼠胰腺癌模型中評估裝載有吉西他濱的奈米粒子的治療效果（ 圖 11A）。簡而言之，如上述實施例中所述，使具有螢光素酶的KPC細胞注射到小鼠中。細胞注射後，每週以IVIS監測腫瘤生長。一旦腫瘤達到100 mm 2，即在辨識出100 mm 2腫瘤後第0、3及6天，以5 mM 100 μL em-LNP、S2-gem-LNP、J10-Gem-LNP、PBS或Gem注射小鼠。
為了評估適體標記的Gem-LNP治療對PDAC小鼠模型中的細胞凋亡的影響，進行TUNEL（末端去氧核苷酸轉移酶dUTP缺口末端標記）染色。簡而言之，在第0天施打脂質奈米粒子後的第10天收集小鼠的腫瘤。使樣品在4% w/v PFA中隔夜固定，並包埋在石蠟中且切片。根據製造商的操作說明，使用ApopTag Red原位細胞凋亡檢測套組（Millipore）對載玻片進行TUNEL染色。以Pannoramic 250 FLASH II對雙染色細胞成像，並以CaseViwer 2.0定量。如 圖 11B所示，與S2-Gem-LNP相比，以J10-Gem-LNP治療顯著增加腫瘤細胞凋亡。
為了評估適體標記的Gem-LNP治療對PDAC小鼠模型增殖的影響，藉由收集腫瘤中Ki67 +細胞的比值測定增殖指數。簡而言之，在第0天施打脂質奈米粒子後的第10天收集小鼠的腫瘤。使樣品在4% w/v PFA中隔夜固定，並包埋在石蠟中且切片。以二甲苯處理載玻片，經由梯度醇到水進行再水合，並根據製造商的操作說明進行抗原修復及阻斷。使用抗-Ki67（1:500，GeneTex GTX16667）抗體進行增殖測定。在4℃下使稀釋在阻斷緩衝液中的一次抗體隔夜施用。以PBS洗滌載玻片3次。使二次抗體山羊抗兔IgG-AlexaFluor 568（Invitrogen A-11011）施用於樣本，在室溫下持續1小時。檢查至少三個分開的切片，且每個切片捕捉至少三個影像。以Pannoramic 250 FLASH II對雙染色細胞成像，並以CaseViwer 2.0定量。如 圖 11C所示，與S2-Gem-LNP相比，以J10-Gem-LNP治療顯著降低腫瘤細胞增殖。
在第6天LNP的第三次治療後，每周使用IVIS監測腫瘤生長的進展。簡而言之，以腹膜內注射螢光素基質120 µg/g（BioSynth Cat: L-8820）。藉由吸入異氟醚來麻醉小鼠，並使用Perkin Elmer IVIS光譜以一分鐘的間隔獲取重複的IVIS影像。選擇具有最強發光訊號的時間點用於分析。如 圖 11D所示，J10-Gem-LNP治療的PDAC小鼠組具有最小的腫瘤尺寸，其表明腫瘤生長受到抑制。類似地，也藉由fMRI監測腫瘤生長。簡言之，以水平7.0T光譜儀（PharmaScan 70/16，Bruker，Germany）對動物進行MRI檢查，該光譜儀具有在80 μs中300 mT/m的有效屏蔽梯度。具有38 mm內徑的體積線圈用於射頻激發及訊號檢測。使用快速自旋迴波序列分別獲得T2WI軸向及冠狀視圖，其中FOV = 4.0 cm，切片厚度 = 1.0 mm，20個切片，TR = 5,500 msec，TE = 60 msec，迴波鏈長度= 8，NEX = 5，且矩陣大小 = 256x256。如 圖 11E所示，J10-Gem-LNP治療的PDAC小鼠組具有最小的腫瘤尺寸，其表明腫瘤生長受到抑制。也測量死亡當天（第48天）的腫瘤組織重量，且結果（ 圖 11F）與IVIS及fMRI結果一致。
裝載有吉西他濱的奈米粒子的體重測量（ 圖 11G）顯示治療不會影響體重。也評估裝載有吉西他濱的奈米粒子對肝及腎功能的影響。簡言之，在7天處理（對於PDAC模型，J10-Gem-LNP、S2-Gem-LNP、Gem-LNP或吉西他濱）後，藉由頜下靜脈收集周邊血液並使其凝固15分鐘。收集血清用於藉由生化試驗進行腎毒性及肝毒性評估。測量AST（天門冬胺酸轉胺酶）、ALT（丙胺酸轉胺酶）及ALP（鹼性磷酸酶）用於肝功能評估，且測量BUN（血尿素氮）及CREA（肌酸酐）用於腎功能評估。如 圖 12A-12E所示，裝載有吉西他濱的奈米粒子不會損害肝或腎功能。
所有這些結果組合表明，在PDAC的鼠模型中，吾人的奈米粒子成功靶向腫瘤部位、增加腫瘤細胞凋亡、減少腫瘤細胞增殖及生長，且總體上延長小鼠存活（ 圖 11H）。
由於胰腺癌最常見的轉移部位之一為肝，吾人使用具有肝轉移的鼠模型胰腺癌進一步檢查吾人的奈米粒子的功效。為了製備這些研究的動物模型，藉由胰內注射距離胰尾約2至3 mm，使5 × 10 5個懸浮於20 μL無菌PBS中的活KPC細胞施打到6至8周齡的C57BL/6J小鼠。對於PDAC肝轉移模型，在原位移植後第10天，藉由Hamilton注射器使5 × 10 5個懸浮於10 μL無菌PBS中的活KPC細胞注射到門靜脈，進行KPC細胞的注射。J10組中腫瘤生長的進展類似地被抑制，如使用fMRI的腫瘤體積測量（ 圖 11I）及使用IVIS的腫瘤尺寸（ 圖 11J）所示。與吾人獲自PDAC模型的結果類似，裝載有J10-gem的LNP的治療方法也能夠靶向肝轉移並提高小鼠的存活（ 圖 11K）。
實施例 5 ：小鼠肺轉移模型中靶向黑色素瘤的適體 -Gem-LNP
在鼠肺轉移模型中評估裝載有吉西他濱的奈米粒子的治療效果。簡言之，使表現螢光素酶及GFP的2 x 10 5的B16F10細胞（黑色素瘤鼠腫瘤細胞株）靜脈注射到8周雄性C57BL/6小鼠中14天以建立肺轉移。在14天後，使Gem、Gem-LNP或一種適體標記的Gem-LNP（J10-Gem-LNP及S2-Gem-LNP）靜脈注射到小鼠體內6小時，接著收集肺用於免疫組織學及NMR分析。如 圖 13A所示，對與肺中GFP表現B16F10細胞共定位的單核球標記物進行免疫染色，由此證明在小鼠模型中單核球召集到肺中的轉移性黑色素瘤。以本文所述的方式使用 19F NMR對從小鼠收集的腫瘤組織中的總吉西他濱進行定量，顯示在6小時後J10組中吉西他濱在轉移性黑色素瘤中的累積最高（ 圖 13B）。
其他具體實施例
此說明書中揭示的所有特徵可用任何組合方式組合。此說明書中揭示的每個特徵可由具有相同、等同或相似目的的替代特徵代替。因此，除非另有明確說明，否則所揭示的每個特徵僅是一系列等同或相似特徵的實例。
根據以上描述，本領域熟練人員可容易地決定本發明的基本特徵，且在不脫離其精神及範圍的情況下，可對發明進行各種改變及修改以使其適應各種用途及條件。因此，其他具體實施例也在申請專利範圍內。
均等
雖然本文已描述及示出若干發明性具體實施例，然而本領域的普通技術人員將容易地設想用於實施本文所述功能及/或獲得本文所述結果及/或一或多個優點的多種其他手段及/或結構，且此類變化及/或修飾中的每一個被認為在本文所述的發明性具體實施例的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易地理解到，本文所述的所有參數、尺寸、材料及配置旨在示例性，且實際的參數、尺寸、材料及/或配置將取決於使用本發明教示的一或多個具體應用。本領域技術人員將認識到或能夠僅使用常規實驗就能確定本文所述的發明性具體實施例的均等方案。因此，應當理解到，前述具體實施例僅以示例的方式呈現，且在所附申請專利範圍及其均等範圍內，可以不同於具體描述及所請方式來實踐發明性具體實施例。本文揭示的發明性具體實施例涉及本文所述的每個單獨的特徵、系統、物品、材料、套組、及/或方法。另外，若此類特徵、系統、物品、材料、套組、及/或方法非相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、物品、材料、套組、及/或方法的任何組合均包括在本文揭示的發明範圍內。
如本文中定義及使用的所有定義應被理解為控制字典定義、藉由引用併入的文獻中的定義、及/或所定義用語的普通含義。
除非明確相反地指出，否則如說明書及申請專利範圍中使用的不定冠詞「一（a）」及「一個（an）」應理解為表示「至少一個（at least one）」。
在說明書及申請專利範圍中使用的用語「及/或（and/or）」應理解為表示這樣結合的元件中的「任一個或兩個（either or both）」，即在一些例子中結合存在而在其他情況下分開存在的元件。以「及/或（an/or）」列出的多個元件應以相同的方式解釋，即如此結合的元件中的「一或多個（one or more）」。除了「及/或（an/or）」子句具體指出的元件之外，也可任選地存在其他元件，無論與具體指出的那些元件相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，在一個具體實施例中，當與諸如「包含（comprising）」之類的開放式語言結合使用時，對「A及/或B（A and/or B）」的引用可僅指A（任選地包括除B以外的元件）；在另一個具體實施例中，僅指B（任選地包括除A以外的元件）；在又一個具體實施例中，指A及B（任選地包括其他元件）；等等。
如在本說明書及申請專利範圍中所使用的，「或（or）」應被理解為具有與如上所定義的「及/或（and/or）」相同的含義。舉例來說，當分開列表中的項目時，「或（or）」或「及/或（and/or）」應解釋為包括性的，即包括多個或一系列元件中的至少一個，但也包括多於一個，以及任選地其他未列出的項目。僅有明確表示相反的用語，諸如「僅一個（only one of）」或「恰好一個（exactly one of）」，或當在申請專利範圍中使用時，「由…組成（consisting of）」將涉及多個元件或元件列表中的恰好一個元件。一般而言，當在「或（or）」乙詞之前有排他性的用語時，諸如「任一個（either）」、「其中一個（one of）」、「僅其中一個（only one of）」或「正好其中一個（exactly one of）」，如本文所用的「或（or）」乙詞應僅解釋為指示排他性的替代（即「一個或另一個，但並非兩者（one or the other but not both）」）。當在申請專利範圍中使用時，「基本上由…組成（consisting essentially of）」其應具有在專利法領域中所使用的普通含義。
如在說明書及申請專利範圍中所使用的，關於一列一個或多個元件的用語「至少一個（at least one）」應理解為表示選自元件列表中的任何一個或多個元件的至少一個元件，但不一定包括在元件列表中具體列出的每個及所有元件中的至少一個，且不排除元件清單中的元件的任何組合。此定義也允許除了用語「至少一個（at least one）」所指的元件列表中具體指出的元件之外的元件任選地存在，無論與具體指出的那些元件相關抑或不相關。因此，作為非限制性實例，「A及B中的至少一個（at least one of A and B）」（或等效地「A或B中的至少一個（at least one of A or B）」、或等效地「A及/或B中的至少一個（at least one of A and/or B）」）在一個具體實施例中可指至少一個，任選地包括多於一個A，不存在B（且任選地包括除了B之外的元件）；在另一個具體實施例中，指至少一個，任選地包括多於一個B、不存在A（及任選地包括除A以外的元件）；在又一個具體實施例中，指至少一個A，任選地包括多於一個A及至少一個B，任選地包括多於一個B（及任選地包括其它元件）；等等。
也應當理解到，除非明確相反地指出，否則在本文所請包括多於一個步驟或動作的任何方法中，方法的步驟或動作的順序不一定限於敘述方法的步驟或動作的順序。
在申請專利範圍以及上述說明書中，所有過渡用語，諸如「包含(comprising)」、「包括(including)」、「攜帶(carrying)」、「具有(having)」、「含有(containing)」、「涉及(involving)」、「持有(holding)」、「由……組成(composed of)」等，應理解為是開放式的，即意味著包括但不限於。如美國專利局專利審查程序手冊第2111.03節所述，僅有過渡用語「由……組成」及「基本上由……組成」分別應當是封閉或半封閉的過渡用語。
無。
以下圖式構成本說明書的一部分，且被包括在內以進一步說明本揭示的特定態樣，藉由參考圖式並結合本文呈現的特定具體實施例的特定描述，可更好地理解本揭示的某些態樣。 圖 1A–1E包括描繪藉由指數富集（SELEX）篩選對單核球具有高結合親和力的適體進行配體的基於細胞的系統進化的圖。 圖 1A 及 1B：分別描繪單核球專一性適體與RAW264.7（鼠單核球細胞株）及J774A.1（鼠單核球細胞株）的結合的圖。在大約20輪篩選循環後使用SELEX方法鑑定核酸適體，並以PCR擴增。上圖為顯示單核球和內皮細胞針對適體的結合能力比較的照片。下圖為顯示在若干輪階段後適體（與螢光染料共軛）與單核球細胞的結合活性逐漸增加的圖表。 圖 1C：顯示適體（AptR）針對RAW264.7的結合親和力的圖表。 圖 1D：顯示適體（AptJ）針對J774A.1的結合親和力的圖表。 圖 1E：顯示使用定量PCR體外單核球專一性適體篩選的圖表。測試每個適體候選物對小鼠單核球細胞株RAW264.7及J774A.1的專一性。 圖 2A–2D包括描繪J10適體對單核球的專一性的圖表。 圖 2A：描繪顯示流式細胞儀測量的單核球細胞株RAW264.7及J774A.1以及小鼠內皮細胞株SVEC中Cy5標記的J10適體及Cy5標記的S2適體的量的圖。小鼠內皮細胞株SVEC用作負向篩選。S2適體與J10適體具有相同的核苷酸組成，但序列隨機化。使用Tukey法的二因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001是顯著的。 圖 2B：上圖描繪顯示藉由PCR測量的J10及S2適體在損傷心臟梗塞區累積量的影像。下圖描繪PCR結果的定量。使用未成對學生t檢定分析數據，其中*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001是顯著的。 圖 2C：經由活體成像，描繪顯示S2適體-QD655（上圖）及J10適體-QD655（下圖）對循環CX3CR1-GFP +單核球的體內靶向的影像。適體與量子點QD655共軛。顯示的比例尺代表100 µm。 圖 2D：描繪顯示J10適體針對循環單核球的離體靶向的圖，藉由流式細胞儀檢驗以分析與從周邊血分離的CD45 +及CD11b +細胞相關的Cy5-J10的量。使用未成對學生t檢定分析數據，其中*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001是顯著的。 圖 3描繪顯示藉由流式細胞儀測量的J10適體針對人類單核球細胞株THP-1及U937的親和力的圖。適體以Cy5染料標記。S2適體與J10適體具有相同的核苷酸組成，但為隨機序列。S2適體用作對照組。人類臍帶內皮細胞（HUVEC）用作負對照組。使用Tukey法的二因子ANOVA分析數據。***P＞0.001。 圖 4A–4C描繪脂質奈米粒子（LNP）的質譜影像。 圖 4A：用於適體共軛的連接子的質譜。 圖 4B：Mal-PEG2000-DSPE脂質的質譜。 圖 4C：連接子-PEG2000-DSPE脂質的質譜。 圖 5A–5E包括描繪經由循環單核球靶向腫瘤的J10適體-吉西他濱（gemcitabine）-脂質奈米粒子的圖。 圖 5A：描繪裝載有脂質奈米粒子（LNP）、吉西他濱（Gem）的LNP、以S2適體修飾的裝載有Gem的LNP、及以J10適體修飾的裝載有Gem的LNP在冷凍電子顯微鏡下的影像。顯示的比例尺代表100 nm。 圖 5B：描繪游離的（gem標準）及被脂質體包覆的吉西他濱（S2-Gem-LNP及J10-Gem-LNP）的代表性氟（ 19F）NMR光譜影像。 圖 5C：描繪裝載有吉西他濱（Gem）的脂質奈米粒子（LNP）、以S2適體修飾的裝載有Gem的LNP、及以J10適體修飾的裝載有Gem的LNP的高效能液相層析術（HPLC）光譜影像。 圖 5D：描繪顯示游離的及被脂質體包覆的吉西他濱對培養的小鼠胰腺癌（KPC）細胞株的細胞毒性的圖。 圖 5E：描繪顯示在小鼠單核球細胞株J774A.1及RAW264.7以及小鼠內皮細胞株SVEC中，以DiD親脂性花青染料標記的Gem-LNP及適體-Gem-LNP的體外結合親和力分析的圖。使用Tukey法的二因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的，且「ns」為不顯著的。 圖 6描繪顯示在5小時（5h）及第1、4、7、14、21、35及42天以全血細胞計數（CBC）測定原位移植胰腺癌後，小鼠中循環單核球數量的圖。使用Tukey法的二因子ANOVA進行數據分析，其中***P＜0.001是顯著的，且「ns」為不顯著的。 圖 7A-7C描繪在CCR2-RFP轉基因小鼠被小鼠KPC胰腺癌細胞原位移植後，CCR2-RFP +單核球召集到腫瘤部位的影像。 圖 7A：經由IVIS成像收集的影像，其中使小鼠KPC胰腺癌細胞株被改造來表現螢光素酶以便於檢測。顯示的比例尺為100 µm。 圖 7B：使用IVIS定量分析腫瘤部位中的CCR2-RFP +單核球。使用Tukey法的二因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05；**P＜0.01； ***P＜0.001；****P＜0.0001是顯著的。 圖 7C：在原位移植後經由活體顯微鏡捕捉CCR2-RFP +單核球在腫瘤部位的召集。顯示的比例尺為100 µm。 圖 8A-8F描繪適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的單核球、淋巴細胞及顆粒性白血球(granulocytes)的體內結合專一性的影像。 圖 8A：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的單核球的體內結合專一性。 圖 8B：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的淋巴細胞的體內結合專一性。 圖 8C：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的顆粒性白血球的體內結合專一性。 圖 8D：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的單核球的體內結合專一性的定量。 圖 8E：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的淋巴細胞的體內結合專一性的定量。 圖 8F：適體-Gem-LNP對來自以Gem-LNP、S2-Gem-LNP或J10-Gem-LNP治療的小鼠的顆粒性白血球的體內結合專一性的定量。 圖 9A 及 9B描繪顯示適體-Gem-LNP在小鼠原位胰腺腫瘤中累積的影像，該等腫瘤是在原位腫瘤植入後48天從PDAC小鼠中收集的。 圖 9A：描繪在收集的腫瘤中DiD標記的Gem-LNP、DiD標記的S2-Gem-LNP及DiD標記的J10-Gem-LNP累積的圖像。 圖 9B：顯示在收集的腫瘤中DiD染料強度定量為DiD標記的Gem-LNP、DiD標記的S2-Gem-LNP及DiD標記的J10-Gem-LNP累積的圖。 圖 10描繪使用 19F NMR顯示在小鼠原位胰腺癌中以吉西他濱、gem-LNP、S2-Gem-LNP及J10-Gem-LNP治療後吉西他濱累積的定量的圖。 圖 11A-11K包括描繪施打J10-Gem-LNP後吉西他濱在小鼠胰腺癌模型中增強的治療效果的圖。 圖 11A：描繪適體-Gem-LNP在小鼠PDAC模型中體內功能評估的實驗設計示意圖。 圖 11B：描繪在適體-Gem-LNP治療後，用於檢測胰腺腫瘤中細胞凋亡的末端去氧核苷酸轉移酶（TdT）dUTP缺口末端標記（TUNEL）分析的影像。細胞凋亡指數定義為在所檢驗的區域中TUNEL +細胞的百分比。所示的比例尺表示20 µm。 圖 11C：描繪適體-Gem-LNP治療後10天的小鼠PDAC模型的胰腺腫瘤中Ki67 +細胞的影像。所示的比例尺表示20 µm。 圖 11D：描繪以IVIS測定的胰腺腫瘤尺寸的影像，以檢測在適體-Gem-LNP治療後增加的時間的小鼠PDAC模型中小鼠KPC細胞株的螢光素酶活性。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的。 圖 11E：描繪在適體-Gem-LNP治療後，以遞增次數進行的磁振造影（MRI）測定的胰腺腫瘤尺寸的影像。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的。 圖 11F：描繪顯示定量從以PBS、Gem、Gem-LNP、S2-Gem-LNP及J10-Gem-LNP治療的PDAC小鼠收集的原位胰腺腫瘤重量的圖。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的。 圖 11G：描繪顯示在腫瘤移植後以PBS、Gem、Gem-LNP、S2-Gem-LNP及J10-Gem-LNP治療達48天的PDAC小鼠體重變化的圖。使用Tukey法的二因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的。 圖 11H：描繪顯示適體-Gem-LNP對小鼠PDAC模型中存活率的影響的圖。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，且使用Kaplan–Meier方法及對數秩（Mantel-Cox）檢定構築及分析q中的存活曲線。*P＜0.05，**P＜0.01及***P＜0.001。 圖 11I：描繪顯示在適體-Gem-LNP治療後36天以磁振造影（MRI）測定的肝轉移性腫瘤體積的圖。 圖 11J：描繪顯示在適體-Gem-LNP治療後32天以IVIS測定的肝轉移性腫瘤體積的圖。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，其中*P＜0.05、**P＜0.01及***P＜0.001是顯著的。 圖 11K：描繪顯示適體-Gem-LNP對具有肝轉移腫瘤的小鼠的存活率的影響的圖。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據，且使用Kaplan–Meier方法及對數秩（Mantel-Cox）檢定構築及分析q中的存活曲線。*P＜0.05，**P＜0.01及***P＜0.001。 圖 12A–12E描繪顯示在小鼠中粒子注射後一周，藉由血液測試檢驗適體-Gem-LNP對肝及腎功能的影響的圖。使用Tukey法的單因子ANOVA分析數據。 圖 12A：適體-Gem-LNP對天門冬胺酸轉胺酶（AST）的影響。 圖 12B：適體-Gem-LNP對丙胺酸轉胺酶（ALT）的影響。 圖 12C：適體-Gem-LNP對血尿素氮（BUN）的影響。 圖 12D：適體-Gem-LNP對肌酸酐（CREA）的影響。 圖 12E：適體-Gem-LNP對鹼性磷酸酶（ALP）的影響。 圖 13A 及 13B描繪顯示在小鼠肺轉移模型中靶向黑色素瘤的適體-Gem-LNP的影像。 圖 13A：顯示從小鼠肺轉移模型的肺收集的轉移性黑色素瘤的螢光影像，其中DAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）檢測DNA、抗GFP檢測B16F10細胞腫瘤、以及抗F4/80檢測單核球。 圖 13B：顯示以 19F NMR定量從小鼠模型肺中收集的轉移性黑素瘤中，以吉西他濱、gem-LNP、S2-Gem-LNP及J10-Gem-LNP治療後吉西他濱累積的圖。
無。
<110> 中央研究院
<120> 單核球專一性之適體及其增強藥物輸送至癌症之用途
<130> 21P0294(21Q0281)
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 本發明的單核球靶向適體的核心核苷酸序列的具體實施例
<400> 1
Figure 110118992-A0305-02-0058-1
<210> 2
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<220>
<223> 側接有引子位點的單核球靶向適體的具體實施例
<400> 2
Figure 110118992-A0305-02-0058-2
<210> 3
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 本發明適體的5'引子位點的核心核苷酸序列的具體實施例
<400> 3
Figure 110118992-A0305-02-0059-3
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<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 核苷酸序列J10，為本發明適體的具體實施例，包含兩個引子片段及一個錨定核酸片段
<400> 4
Figure 110118992-A0305-02-0059-4
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<211> 100
<212> DNA
<213> unknown
<220>
<223> 實驗中使用被打亂的核苷酸序列S2作為對照
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<223> 本發明適體的3'引子位點的核心核苷酸序列的具體實施例
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<213> Unknown
<220>
<223> 本發明的單核球靶向適體的錨定核酸片段的具體實施例
<400> 7
Figure 110118992-A0305-02-0060-7
無。

Claims (17)

  1. 一種單核球靶向核酸適體，其包含與5’-GGA TGG GAG GGA GGG GGC TCG TGG CGG CTA GGG GGT ATA A-3’(SEQ ID NO：1)至少85%一致的核心核苷酸序列。
  2. 如請求項1所述的單核球靶向核酸適體，其中該適體包含SEQ ID NO：1的核心核苷酸序列。
  3. 如請求項2所述的單核球靶向核酸適體，其中該適體包含側接該核心核苷酸序列的5’引子位點及3’引子位點。
  4. 如請求項3所述的單核球靶向核酸適體，其中該5’引子位點包含5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG-3’(SEQ ID NO：3)的核苷酸序列，及/或其中該3’引子位點包含5’-CT CAT GGA CGT GCT GGT GAC-3’(SEQ ID NO：6)的核苷酸序列。
  5. 如請求項4所述的單核球靶向核酸適體，其中該適體包含5’-AC GCT CGG ATG CCA CTA CAG GGA TGG GAG GGA GGG GGC TCG TGG CGG CTA GGG GGT ATA ACT CAT GGA CGT GCT GGT GAC-3’(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列。
  6. 如請求項1至5項中任一項所述的單核球靶向核酸適體，其中該適體與錨定核酸片段共軛。
  7. 如請求項6所述的單核球靶向核酸適體，其中該錨定核酸片段包含5’-CAA TAG AGT CGT ACA GGT CG-3’(SEQ ID NO：7)的核苷酸序列，其位於該適體的5’端。
  8. 一種單核球靶向脂質奈米粒子，其包含脂質奈米粒子，在該脂質奈米粒子上附接有請求項1至7中任一項所述的單核球專一性核酸適體。
  9. 如請求項8所述的單核球靶向脂質奈米粒子，其中該脂質奈米粒子包含共軛物，該共軛物包含附接到脂質的對接核酸片段，其中該對接核酸片段包含與共軛到該單核球專一性核酸適體的該錨定核酸片段或其部分互補的核苷酸序列，且其中該錨定核酸片段與該對接核酸片段形成鹼基對，從而使該單核球專一性核酸適體固定在該脂質奈米粒子上。
  10. 如請求項9所述的單核球靶向脂質奈米粒子，其中該對接核酸片段經由聚乙二醇(PEG)連接子附接到該脂質。
  11. 如請求項9或請求項10所述的單核球靶向脂質奈米粒子，其中該脂質為1,2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)。
  12. 如請求項8所述的單核球靶向脂質奈米粒子，其中該單核球靶向脂質奈米粒子進一步包含治療藥劑或診斷藥劑。
  13. 如請求項12所述的單核球靶向脂質奈米粒子，其中該治療藥劑或該診斷藥劑用於癌症治療或癌症診斷。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項8至13中任一項所述的單核球靶向脂質奈米粒子及醫藥上可接受的載體。
  15. 一種將請求項1至7中任一項所述之單核球靶向核酸適體用於製備輸送抗癌劑到腫瘤部位之醫藥組合物的用途。
  16. 如請求項15所述的用途，其中該個體為患有癌症或處於癌症風險中的人類患者。
  17. 如請求項16所述的用途，其中該癌症為胰臟癌或黑色素瘤。
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