TWI809845B

TWI809845B - 用於協同長春花生物鹼以增強治療癌症效果之中藥組成物及其作用機制

Info

Publication number: TWI809845B
Application number: TW111115962A
Authority: TW
Inventors: 顧記華; 林麗純
Original assignee: 國立臺灣大學
Priority date: 2022-04-27
Filing date: 2022-04-27
Publication date: 2023-07-21
Also published as: TW202342080A

Abstract

本發明係關於一種用於協同長春花生物鹼以增強治療癌症效果之中藥組成物及其作用機制，中藥組成物係為中藥方劑酸棗仁湯的簡方，即酸棗仁、茯苓以及川芎之萃取物所組成；當該中藥組成物與長春花生物鹼協同使用時，可增強長春花生物鹼的抗癌活性。

Description

用於協同長春花生物鹼以增強治療癌症效果之中藥組成物及其作用機制

本發明係關於一種用於協同長春花生物鹼以增強治療癌症效果之中藥組成物及其作用機制，特別係關於一種用於協同長春花生物鹼以增強治療非小細胞肺癌或人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌的效果之酸棗仁湯簡方及其作用機制。

所述酸棗仁湯簡方係由酸棗仁、茯苓以及川芎之萃取物所組成。

肺癌為全球最常見的癌症之一，在2020年全球確診病例約達221萬例，而肺癌導致約180萬例患者死亡，是癌症死亡最常見癌症種類之一，約佔癌症死亡總數的18%。

根據腫瘤細胞的顯微鏡檢測，肺癌主要有兩種類型，包括非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)以及小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)。非小細胞肺癌約佔所有肺癌的80~85%，是除了小細胞肺癌之外的任何類型的上皮性肺癌(epithelial lung cancer)。主要的非小細胞肺癌亞型(subtype)包括腺癌(adenocarcinoma)、鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma)以及大細胞癌(large cell carcinoma)。儘管近年來於臨床治療以及個人化治療選擇方面取得了進展，但非小細胞肺癌的治療仍然被認為是一種高度未滿足的醫療需求。

此外，由世界衛生組織、美國癌症協會和台灣衛生福利部提供的統計數據顯示，前列腺癌也為常見的癌症之一，亦是男性癌症死亡的主要原因。目前已開發了多種治療前列腺癌的方法，當腫瘤發生轉移時，激素治療尤其必要；然而，如果腫瘤繼續生長並對激素治療產生耐藥性，則無法控制的腫瘤生長會導致向人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌(metastatic castration-resistant prostate cancer,MCRPC)轉變。儘管已開發出多西他賽(docetaxel)和卡巴他賽(cabazitaxel)等幾種化療藥物並將其應用於MCRPC患者，但仍有一些患者對該治療產生耐藥性，且化療藥物的效力通常僅限於細胞毒性和副作用。因此，需進一步藉由識別潛力藥物和研究潛力藥物治療在MCRPC中引起的藥理作用來最大化治療選擇。

中藥主要係藉由與抗癌藥物的聯合使用或標準治療後的輔助治療，其已被廣泛認為具有增加抗癌活性、減少副作用、改善生活品質以及提升患者生存率之功效。與西藥相比，中藥雖然非主要的治療手段，但由於其對腫瘤的殺傷作用以及強身健體的綜合考量，越來越受到人們的關注。

目前已有許多中藥及改良配方的抗癌細胞活性的研究，據報導指出，澤漆湯(Ze Qi Decoction)可藉由阻斷PI3K/Akt訊號路徑以抑制癌細胞生長，下調細胞程式死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)的表達。另也有研究多種中藥及其成分係藉由誘導促凋亡訊號(proapoptotic signals)如p53、Bax、NOXA、PUMA、PTEN以及死亡受體(death receptors)，或者阻斷促生存介質 (prosurvival mediators)如EGFR、PI3K/Akt、JAK/STAT3、Bcl-2以及Mcl-1，可促使癌細胞凋亡；而脫嘌呤/脫嘧啶核酸內切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1)所介導的DNA鹼基切除修復與同源重組DNA修復在內的DNA修復途徑之抑制，也可抑制癌細胞的活性。此外，中藥已被證實與癌症化療藥物或靶向藥物如順鉑(cisplatin)、吉非替尼(gefitinib)以及吉西他濱(gemcitabine)等聯合使用時，可提高抑制癌細胞的活性。

近十年來，各種中藥的再利用獲得了新的關注，因其可減少藥物開發的時間，為更具成本效益的策略；因此，在基礎科學以及臨床研究中，中藥於癌症治療上的再利用，不失為一種癌症治療的新方向。

有鑑於此，本發明之目的在於重新利用可作為提高非小細胞肺癌以及人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌的治療效果之中藥，特別是無毒中藥作為首選。

根據上述本發明之目的，許多研究都集中在使用國民健康保險計劃的國民健康保險研究數據庫，其數據庫涵蓋了近100%的台灣人口，提供包括中醫使用在內的綜合醫療服務；而由其數據庫中所使用之中藥種類，本案發明人選擇了一種具有潛力的中藥配方「酸棗仁湯」，在健保資料庫的資料分析中，酸棗仁湯是最常用來治療失眠的中藥方劑之一。失眠的原因很多，其中也包括身體疾病因素，如：精神官能症、神經系統疾病、心臟病、呼吸系疾病、腸胃疾病、癌症等等，酸棗仁湯則被用於這些有慢性病、身體虛弱的患者無法安眠時使用。

酸棗仁湯長期以來一直被廣泛用於緩解睡眠困難(例如失眠)，而近來的研究對酸棗仁湯進行了系統性以及科學性的評價，驗證了其對於治療睡眠困難的有效性及安全性。

在目前的研究中，發明人對酸棗仁湯的全配方(即酸棗仁、茯苓、川芎、知母、甘草)或部分減方配方中的水溶性、醇微溶性以及醇溶性等數十種萃取物進行了生物活性評估，並檢驗了各該萃取物與各種化療藥物如順鉑(cisplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)、吉非替尼(gefitinib)、長春花生物鹼(如長春新鹼(vincristine)或長春瑞濱(vinorelbine)等)之間的協同凋亡作用(synergistic apoptosis effects)，並獲得了一最佳配方純化萃取物及其與長春瑞濱的組合，該最佳配方組分為酸棗仁、茯苓、川芎所組成的酸棗仁湯簡方。

上述最佳配方純化組分與長春瑞濱之組合，將其用於非小細胞肺癌細胞以及人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞上，以找出其抑制癌細胞之作用機制，並基於化學指紋以及生物活性，以確定不同批次的配方純化組分與長春瑞濱或長春新鹼之組合，皆有抑制癌細胞的功效。

為使本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效更為顯而易見，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下：第1圖係為使用高效能液相層析法(HPLC)分析酸棗仁湯簡方部分純化萃取物(B7E2)的化學指紋圖譜示意圖；第2圖以及第3圖係為將酸棗仁湯簡方純化萃取物與各類化療藥物組合對細胞凋亡之影響示意圖；第4圖係為藉由DNA片段的定量檢測酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合治療之功效示意圖；第5圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用於NCI-H460細胞之功效示意圖；第6圖以及第7圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合誘導細胞凋亡相關蛋白表達之示意圖；第8圖以及第9圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞週期進程以及相關蛋白表達之影響示意圖；第10圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂以及染色體與微管之影響示意圖；第11圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂檢查點相關調控蛋白之影響示意圖；第12圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂檢查點複合物形成之影響示意圖；第13圖係為不同批次酸棗仁湯簡方純化萃取物的生物活性檢測示意圖；第14圖以及第15圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春新鹼組合對於有絲分裂以及細胞凋亡之影響示意圖。

為利貴審查委員瞭解本發明之技術特徵、內容與優點及其所能達成之功效，茲將本發明配合附圖，並以實施例之表達形式詳細說明如下，而其中所使用之圖式，其主旨僅為示意及輔助說明書之用，未必為本發明實施後之真實比例與精準配置，故不應就所附之圖式的比例與配置關係解讀、侷限本發明於實際實施上的權利範圍，合先敘明。

除非另有定義，本文所使用的所有術語(包括技術和科學術語)具有與本發明所屬技術領域的通常知識者通常理解的含義。將進一步理解的是，諸如在通常使用的字典中定義的那些術語應當被解釋為具有與它們在相關技術和本發明的上下文中的含義一致的含義，並且將不被解釋為理想化的或過度正式的意義，除非本文中明確地如此定義。

材料與方法

材料

人類非小細胞型肺癌細胞NCI-H460、A549以及人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3均購自美國標準生物品收藏中心(Rockville,MD,USA)。PRMI 1640培養基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)以及PSA溶液(Penicillin-Streptomycin-Amphotericin，由10000unit/mL青黴素、10mg/mL鏈黴素與0.025mg/mL兩性黴素B所組成)購自GIBCO/BRL Life Technologies(Grand,Island,NY)。

長春瑞濱(vinorelbine)、長春新鹼(vincristine)、碘化丙啶(propidium iodide,PI)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)以及β-微管蛋白單克隆抗體(monoclonal antibody of β-tubulin)購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。

其他使用的單克隆抗體如下：α-微管蛋白(α-tubulin)、Bak、Bcl-2、Bcl-xL、CDC20、Cdk2、Cdk4、細胞週期蛋白A(Cyclin A)、細胞週期蛋白B1(Cyclin B1)、細胞週期蛋白E(Cyclin E)、GAPDH、Mad2、PARP-1、HRP結合的抗鼠蛋白以及抗兔IgG購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA)；Bax、凋亡蛋白酶7(Caspase 7)、凋亡蛋白酶(Caspase 8)、凋亡蛋白酶(Caspase 9)、E2F、Cdk1^Tyr15、Cdk1^Thr161購自Cell signaling(Beverly,MA)；BUB1、BUB3、BUBR1、細胞週期蛋白D1(Cyclin D1)購自ABCam(Cambridge,MA)；凋亡蛋白酶3(Caspase 3)購自Imgenex(San Diego,CA)以及MPM2購自Millipore(Burlington,MA)。

Bio-Rad蛋白測定試劑盒購自Bio-Rad(Hercules,CA)，以及PVDF膜購自Pall Gelman Laboratory(Ann Arbor,MI)。

酸棗仁湯簡方由酸棗仁、茯苓、川芎所組成，該等中藥材可由GMP中藥廠購得，藥材品質規格均符合臺灣中藥典規範。

細胞培養

人類非小細胞型肺癌細胞NCI-H460以及A549，置於含有10%(v/v)熱滅活的胎牛血清(FBS)、4500mg/L葡萄糖、100unit/mL青黴素以及100μg/mL鏈黴素的RPMI 1640培養基中，並於37℃、5% CO₂的培養箱中進行培養。

人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3，置於含有5%(v/v)熱滅活的胎牛血清(FBS)以及100unit/mL青黴素的RPMI 1640培養基中，並於37℃、5% CO₂的培養箱中進行培養。

細胞群之細胞週期進展檢測

將培養後的人類非小細胞型肺癌細胞NCI-H460以及A549，使用70vol%冰酒精浸泡30分鐘，接著使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞，並在磷酸鹽-檸檬酸緩衝液(pH 7.8)中培養30分鐘後離心；離心後使用含有0.1%(v/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、100μg/mL的核糖核酸酶(RNase)以及80μg/mL的碘化丙啶(PI)的溶液懸浮細胞。

細胞週期分布係使用FACSCalibur^TM FL2 channel(Becton Dickinson,CA,USA)進行測定，並使用BD CellQuest^TM Pro Software(Becton Dickinson,CA,USA)進行分析，進而量化細胞於sub-G1、G0/G1、S以及G2/M等細胞週期的百分比。

人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3也以相似之方式進行細胞群之細胞週期進展檢測，於此不再贅述。

使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法(double thymidine block)同步G1/S週期邊界

將培養後的人類非小細胞型肺癌細胞NCI-H460以及A549，置於含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基中隔夜培養，以達到約40%的細胞密度，接著每1mL培養基加入40μL胸腺嘧啶核苷儲備原液(最終濃度為2mM)並培養12小時；其後移除培養基，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞並於新鮮的RPMI 1640培養基中再培養12小時，並於每1mL培養基加入40μL胸腺嘧啶核苷儲備原液再培養12小時後移除培養基，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞，再次於新鮮的RPMI 1640培養基中培養，並準備進行細胞週期進展評估。

西方墨點法

收集藥物處理後之細胞，離心並置於含有60μl裂解緩衝液[(20mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)、150mM的氯化鈉、1mM的EDTA、1mM的EGTA、1%(v/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、1mM的β-甘油磷酸酯、1mM的氟化鈉、1mM的苯甲基磺醯氟、1mM的二硫蘇糖醇、10μg/mL的亮抑蛋白酶肽(leupeptin)以及1mM的釩酸鈉Na₃VO₄]的溶液中使細胞裂解，並於冰上放置20分鐘，接著在4℃下以12000rpm的轉速下離心15分鐘。

離心後收集上清液中的蛋白質，將其與樣品緩衝液[0.3M的Tris-HCl(pH 6)、10%的十二烷基硫酸鈉(SDS,w/v)、50%的甘油(v/v)、10%的β-巰基乙醇(v/v)以及0.02%的溴酚藍w/v]混合，在95℃下加熱10分鐘後儲存於-20℃下備用；其後藉由Bio-Rad蛋白測定試劑盒對其進行定量分析。

使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(30μg)，將其轉移至PVDF膜上並用特異性抗體檢測；接著使用適當標記的二抗培養後免疫反應蛋白，並利用增強的化學發光檢測試劑套組(Amersham,Buckinghamshire,UK)對其進行檢測。

核小體(Nucleosome)DNA片段化檢測

藉由細胞凋亡檢測試劑套組ELISA^PLUS(Roche,Mannheim,Germany)檢測核小體DNA片段化，以量化細胞凋亡後細胞中的細胞質組蛋白相關DNA片段，該檢測方式如下：經藥物處理後之細胞，使用裂解緩衝液[(20mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)、150mM的氯化鈉、1mM的EDTA、1mM的EGTA、1%(v/v)的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、1mM的β-甘油磷酸酯、1mM的氟化鈉、1mM的苯甲基磺醯氟、1mM的二硫蘇糖醇、10μg/mL的亮抑蛋白酶肽(leupeptin)以及1mM的釩酸鈉Na₃VO₄]裂解細胞30分鐘，並於4℃下離心(離心速度為200xg)10分鐘；接著收集上清液加入HRP(辣根過氧化物酶)偶聯的抗DNA-過氧化物酶抗體後共同培養，其後洗滌並與該抗體基質共同培養，最後於波長405nm下檢測吸光值以確認核小體DNA片段之量。

免疫螢光共聚焦顯微鏡分析

將培養後的人類非小細胞型肺癌細胞A549，於37℃下在6孔板的蓋玻片上以105 cells/well的細胞密度，置於含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基中隔夜培養，接著基於胸腺嘧啶核苷雙阻斷法進行細胞週期同步，其後在不存在或存在藥物的情況下，將細胞由同步中釋放12小時。

細胞由同步中釋放12小時後，使用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞，再用100%甲醇將其固定於冰上10分鐘，並使用0.1%(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)培養30分鐘，接著使用含有1%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽緩衝鹽水再阻斷30分鐘；接著將細胞使用β-微管蛋白抗體[在PBS中以1：200(v/v)稀釋]染色1小時後使用PBS洗滌，再將與螢光異硫氰酸鹽(FITC)偶聯的二抗[在PBS中以1：200(v/v)稀釋]添加至細胞中培養1小時，其後在0.15μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)中培養5分鐘，將細胞洗滌後風乾並用ProLong® Diamond Antifade Mountant(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)將其固定於顯微鏡載玻片上，藉由共聚焦顯微鏡Zeiss LSM 880(Carl Zeiss,Jena,Germany)捕獲免疫螢光圖像。

免疫共沉澱(Co-Immunoprecipitation)

將培養後的人類非小細胞肺癌細胞A549，置於直徑6cm的培養皿中，在含有10%(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養基中，以3.5x10⁵ cells/dish的細胞密度下隔夜培養，接著基於胸腺嘧啶核苷雙阻斷法進行細胞週期同步，其後在不存在或存在藥物的情況下，將細胞由同步中釋放12小時。

接著，將細胞胰蛋白酶化(trypsinized)，在4℃下以1800rpm離心8分鐘，加入120μL細胞裂解用的裂解緩衝液(50mM的Tris-HCl(pH 7.8)、0.15M的氯化鈉、1%(v/v)的乙基苯基聚乙二醇(Nonidet P-40)以及1mM的EDTA)，在冰上裂解30分鐘後，並在4℃下以12000rpm離心20分鐘，上清液(500μg)使用1μg的抗CDC20抗體，在4℃下並加入A/G磁珠隔夜免疫沉澱；用裂解緩衝液洗滌蛋白質-抗體複合物，將吸附於磁珠的蛋白質與樣品緩衝液混合，並在90℃下加熱5分鐘，最後使用西方墨點法檢測蛋白質濃度。

數據分析

對於指定數量的獨立實驗，其數據表示為平均值±標準差(mean±SD)；藉由計算機圖像分析系統Bio-Rad Image Lab^TM Software(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)，對西方墨點法的蛋白質進行定量。各實驗使用學生t檢定(Student's t-test)比較兩組數據，P值小於0.05被認為具有統計學上的意義。

實施例1

酸棗仁湯簡方部分純化萃取物(B7E2)之製備

將酸棗仁、茯苓以及川芎依序以重量比5：1：1混合形成酸棗仁湯簡方，具體使用之量為酸棗仁500g、茯苓以及川芎各100g(後續之萃取溶劑則依比例增加或減少)，以2.5L乙醇於50~60℃萃取該酸棗仁湯簡方2次，收集該酸棗仁湯簡方萃取物並濃縮，獲得乙醇萃取物；接著將該乙醇萃取物懸浮於200mL的水中，並用200mL乙酸乙酯進行液相-液相萃取(partitioning extraction)兩次，收集乙酸乙酯層部分並濃縮，獲得乙酸乙酯層萃取物。

接著將20g的乙酸乙酯層萃取物藉由填充60g矽膠(silica gel)的層析管柱進行部分純化，先使用0.5L正己烷溶劑進行洗脫(wash)，再使用0.5L含有30%(v/v)甲醇的乙酸乙酯作為沖提液(eluent)進行沖提，收集沖提液，減壓濃縮至乾即得B7E2。

為達化學製造管理(Chemical Manufacturing Control)的目的，我們以上述的方法，製配2倍藥材量的B7E2，2批次。所使用的萃取溶劑、矽膠、洗脫液、沖提液均依比例增加。並利用高效能液相層析-紫外線偵測(HPLC-UV)的方法，比較不同批次的B7E2的化學指紋分佈情形。

請參考第1圖，第1圖係為使用高效能液相層析法(HPLC)分析酸棗仁湯簡方部分純化萃取物(B7E2)的化學指紋圖譜示意圖。由第1圖中可看出，三批B7E2的分析圖譜顯現出極高的化學指紋相似性，圖譜中有六個主要成分，即編號4之川芎內酯A(Senkyunolide A)、編號5之反式新蛇床內酯(trans-Neocnidilide)、編號6之3-亞丁烯基苯酞(3-Butylidenephthalide)、編號8之白樺脂酸(Betulinic acid)、編號9之亞麻油酸(Linoleic acid)以及編號10之油酸(Oleic acid)，六個主成分的訊號峰面積總和佔圖譜總訊號峰面積約60%(第一批次為60.15%、第二批次為59.41%、第三批次為59.96%)。由以上結果，證明了此B7E2製程具有良好的化學再現性，進而可保證其活性作用也可以再現。

實施例2

酸棗仁湯簡方部分純化萃取物(B7E2)與各類化療藥物組合對細胞凋亡之影響

請參照第2圖及第3圖，第2圖以及第3圖係為將酸棗仁湯簡方部分純化萃取物(B7E2)與各類化療藥物組合對細胞凋亡之影響示意圖。第2圖係將酸棗仁湯簡方純化萃取物(以代號B7E2表示)與順鉑(cisplatin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)、依托泊苷(etoposide)或吉非替尼(gefitinib)等化療藥物組合與A549細胞一起培養24或48小時後，使用碘化丙啶對細胞染色，使用BD CellQuest^TM Pro Software，藉由FACScan流式細胞儀分析A549細胞在sub-G1細胞週期的分佈，定量數據以3~5個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，#表示與單獨使用各該化療藥物相比其P值小於0.05；由第2圖中可看出酸棗仁湯簡方純化萃取物與該等化療藥物組合使用時，並未有顯著使A549細胞凋亡之功效。

第3圖則係使用15或30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物和5nM或10nM的長春瑞濱(vinorelbine)組合，與A549細胞一起培養24或48小時後，同上述實驗方式分析A549細胞在sub-G1細胞週期的分佈，*表示與單獨使用長春瑞濱相比其P值小於0.05，**則表示其P值小於0.01；由第3圖中可看出酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用時，具有顯著使A549細胞凋亡之功效。

另再藉由Chou-Talalay法計算酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱之組合促使A549細胞凋亡的組合指數(combination index,CI)，當CI小於1則表示藥物具有協同作用，CI等於1則表示藥物具有加成作用，而CI大於1則表示藥物之間具有拮抗作用。其CI值如下表1所示(酸棗仁湯簡方純化萃取物以B7E2作為代號表示，表中Fa為細胞凋亡(sub-G1)比例)。由表1中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱在各濃度的組合下，其CI值均小於1，代表均具有協同作用。

表1

接著，為進一步驗證酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱對於A549細胞的細胞凋亡功效，使用DNA片段的定量檢測，其結果如第4圖所示，將A549細胞在不存在或存在指定試劑的情況下處理24小時後收集裂解細胞，藉由細胞凋亡檢測試劑盒ELISA^PLUS進行核小體DNA片段化檢測細胞凋亡，定量數據以4個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示。由第4圖中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物可增強長春瑞濱的作用，造成A549細胞的DNA斷裂凋亡。

此外，再參照第5圖，第5圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用於非小細胞型肺癌細胞NCI-H460細胞之功效示意圖。使用30μg/mL的酸棗仁湯簡方純化萃取物和5nM的長春瑞濱組合，與NCI-H460細胞一起培養24或48小時後，同上述實驗方式分析A549細胞在sub-G1細胞週期的分佈，定量數據以3~4個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，而對照組則以Control表示；由第5圖中可看出，與單獨使用長春瑞濱相比，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用時，也具有顯著使NCI-H460細胞凋亡之功效。

實施例3

酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合誘導細胞凋亡相關蛋白表達之變化

請參照第6圖及第7圖，第6圖以及第7圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合誘導細胞凋亡相關蛋白表達之示意圖。第6圖係將A549細胞在不存在或存在藥物的情況下培養48小時後，收集A549細胞並裂解以檢測細胞凋亡相關蛋白，藉由Bio-Rad Image Lab^TM Software分析相對蛋白質表達量，定量數據以3~4個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，*表示與各蛋白無使用任何藥物的對照組相比其P值小於0.05，**表示其P值小於0.01，而***表示其P值小於0.001；另外，#表示與單獨使用長春瑞濱相比其P值小於0.05，而##表示其P值小於0.01。由第6圖中可看出，經酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合處理後，可誘導啟動型凋亡蛋白酶(caspase 8及caspase 9)以及下游執行型凋亡蛋白酶(caspase 3及caspase 7)活化，而下游執行型凋亡蛋白酶的基質PARP-1(聚ADP-核糖聚合酶)也明顯裂解。

Bcl-2家族的蛋白質係由抗凋亡、促凋亡以及BH3-only蛋白等組成，其對粒線體參與的凋亡訊號傳導至關重要，第7圖係藉由使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步A549細胞G1/S週期邊界，其後在不存在或存在藥物的情況下，將細胞從同步中釋放12小時後收集細胞並裂解，使用西方墨點法檢測蛋白質濃度，並以Bio-Rad Image Lab^TM Software分析相對蛋白質表達量，定量數據以3個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，##表示與單獨使用長春瑞濱相比其P值小於0.01。由第7圖中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用並未改變促凋亡蛋白Bax及Bak的表達，但顯著增加抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL的磷酸化形式；由於Bcl-2及Bcl-xL的磷酸化是微管靶向劑(microtubule-targeting agent,MTA)的凋亡標誌物，例如紫杉醇以及長春花生物鹼，故證實了酸棗仁湯簡方純化萃取物可使長春瑞濱誘導的凋亡反應更為敏感。

實施例4

酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於有絲分裂以及細胞凋亡之變化

近來有許多證據顯示，在MTA治療下，延長有絲分裂退出(delay mitotic exit)是導致癌細胞凋亡增加的原因，故針對此部分進行相關實驗。

請參照第8圖及第9圖，第8圖以及第9圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞週期進程以及相關蛋白表達之影響示意圖。第8圖係藉由使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步A549細胞G1/S週期邊界，其後於不存在或存在30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物以及10nM長春瑞濱的情況下，將細胞在指定的時間(4小時、8小時、12小時、16小時、20小時以及24小時)內從同步中釋放後，使用碘化丙啶對A549細胞染色，同上述實驗方式分析A549細胞在細胞週期的分佈狀況，定量數據以3個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，與單獨使用長春瑞濱相比，#表示其P值小於0.05、##表示其P值小於0.01，而###表示其P值小於0.001。由第8圖中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物的存在可大幅延長A549細胞中的G2/M細胞週期停滯，顯著增加細胞凋亡。

此外，再參照第9圖，第9圖係於不存在或存在藥物的情況下處理A549細胞，收集其細胞並裂解後，以Bio-Rad Image Lab^TM Software檢測多種細胞週期蛋白以及Cdk蛋白的表達量，定量數據以3~5個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示，與各蛋白無使用任何藥物的對照組相比，*表示其P值小於0.05、**表示其P值小於0.01，而***則表示其P值小於0.001；另與單獨使用長春瑞濱相比，#表示其P值小於0.05、##表示其P值小於0.01，而###表示其P值小於0.001。由第9圖中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用顯著上調了A549細胞中細胞週期蛋白B1的表達，但細胞週期蛋白D1、細胞週期蛋白E 以及細胞週期蛋白A的表達則無上調；此外，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用顯著降低了Cdk1蛋白在Tyr15(抑制磷酸化的位點)的磷酸化，但增加了Thr161(刺激磷酸化的位點)的磷酸化，表明了Cdk1活性的協同活化；再者，由於細胞週期蛋白B1/Cdk1複合物的活化是啟動有絲分裂進入及進展的關鍵，其活化伴隨A549細胞中特定磷酸表位蛋白(如MPM-2)的顯著增加，為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用時，延長有絲分裂的關鍵作用。

實施例5

酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於同步A549細胞有絲分裂紡錘體異常以及染色體組織之影響

微管動力學的破壞係由MTA介導，進而使有絲分裂延長，故檢查A549細胞中的紡錘體以及染色體排列變化。請參照第10圖，第10圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂以及染色體組織之影響示意圖。第10圖係藉由使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步A549細胞G1/S週期邊界，其後於不存在或存在30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物以及10nM長春瑞濱的情況下，將細胞從同步中釋放12小時，接著以甲醇固定後並使用β-微管蛋白抗體(綠色)對微管染色，以及使用DAPI(藍色)對細胞核染色，最後藉由共聚焦顯微鏡Zeiss LSM 880捕獲免疫螢光圖像。

由第10圖A中可看出，經酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合處理後的A549細胞具有多個有絲分裂中期的特徵(如I型、II型或III型)，並檢測到少量分裂末期的細胞，顯示經酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合處理可誘導有絲分裂紡錘體異常的細胞顯著增加。而由第10圖B中可看出，I型特徵呈現組織良好的雙極紡錘體(bipolar spindles)，染色體排列在緊湊的赤道中期板 (equatorial metaphase plate)中，II型包含帶有一些雜亂染色體的雙極紡錘體(圖中箭頭所指部分)，而III型則呈現封閉於球形染色體中的單極紡錘體；此外，酸棗仁湯簡方純化萃取物的存在改變了長春瑞濱介導的有絲分裂中期紡錘體類型(Type)的分配，請參考下表2，其為各種類型的有分裂紡錘體及染色體組織在不同處理條件下的分佈百分比，在計數75至89個細胞後對所有類別的紡錘體進行量化所得，表2中control為對照組，Basal為基礎型，Multipolar為多極型；由表2中可知，I型由21.3%減低至3.6%，II型由29.2增加至45.8%，而III型也由14.6%增加至26.5%，顯示了酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合處理所產生的協同效應。

實施例6

酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於有絲分裂檢查點相關蛋白之影響

有絲分裂檢查點(spindle assembly checkpoint,SAC)為一種保護機制，藉由響應未附著或不正確附著的著絲點(kinetochore)以確保基因組的穩定性，防止有絲分裂細胞退出有絲分裂，直至所有染色體均精確地附著於紡錘體上；SAC的效應器(effector)是有絲分裂檢查點複合體(mitotic checkpoint complex, MCC)，由BUB3、BUBR1、MAD2以及CDC20所組成，MCC靶向並抑制後期促進複合物或環體(anaphase-promoting complex or cyclosome,APC/C)泛素連接酶(ubiquitin ligase)，防止多泛素化(polyubiquitination)和兩種關鍵基質(細胞週期蛋白B以及保全蛋白(securing))的降解，並延遲有絲分裂的退出。藉由檢測MCC成分(例如BUBR1磷酸化)以及APC/C基質(例如細胞週期蛋白B1上調)，可確認長春瑞濱介導之SAC活化。

請參照第11圖，第11圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂檢查點相關成分之影響示意圖。第11圖係藉由使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步A549細胞，其後於不存在或存在30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物以及10nM長春瑞濱的情況下，將細胞從同步中釋放12或16小時後收集細胞並裂解，使用西方墨點法檢測蛋白質濃度，並以Bio-Rad Image Lab^TM Software分析相對蛋白質表達量，定量數據以3個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示。由第11圖中可看出在長春瑞濱存在下，可促使BUBR1(負責SAC形成以及訊號傳導的有絲分裂檢查點激酶)的磷酸化，而酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用下，進一步提高SAC的活化程度，可再次證明其協同作用。

再參照第12圖，第12圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合對於細胞有絲分裂檢查點複合物形成之影響示意。第12圖係藉由使用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法同步A549細胞，其後於不存在或存在30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物以及10nM長春瑞濱的情況下，將細胞從同步中釋放12小時後收集細胞並進行免疫沉澱，接著使用西方墨點法檢測MCC相關蛋白的表達。由第12圖中可看出，與無使用任何藥物的對照組相比，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用可增強A549細胞中BUBR1、MAD2以及BUB3與CDC20的關聯，依序為增強435%、556%以及159%與CDC20的關聯，表明了MCC形成的增加。

實施例7

不同批次酸棗仁湯簡方純化萃取物的生物活性檢測

藉由實施例1可知，不同批次酸棗仁湯簡方純化萃取物的組成具有極高的再現性，接著將不同批次的酸棗仁湯簡方純化萃取物進行生物活性檢測。請參照第13圖，第13圖係為不同批次酸棗仁湯簡方純化萃取物的生物活性檢測示意圖。第13圖係藉由將A549細胞在不存在或存在藥物的情況下培養24小時，接著收集細胞使用使用碘化丙啶對細胞染色，並使用FACScan流式細胞儀分析不同細胞週期階段的細胞群分佈，定量數據以3個獨立實驗的平均值±標準差(mean±SD)表示。由第13圖中可看出，三個批次的酸棗仁湯簡方純化萃取物均在增加長春瑞濱介導的G2/M細胞週期停滯及其後的細胞凋亡(sub-G1群)方面表現出相似的活性，其與G0/G1細胞週期以及S細胞週期的細胞群減少有關，驗證了不同批次酸棗仁湯簡方純化萃取物質量的一致性。

此外，也可在A549細胞中驗證酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱組合使用的效應，使用碘化丙啶DNA染色的流式細胞法分析長春瑞濱與酸棗仁湯簡方純化萃取物中的單一成分(化合物)組合使用時，其對A549細胞之細胞週期進展的sub-G1群(細胞凋亡%)的影響，如下表3所示，化合物編號1、4~10依序為阿魏酸(Ferulic acid)、川芎內酯A(Senkyunolide A)、反式新蛇床內酯(trans-Neocnidilide)、3-亞丁烯基苯酞(3-Butylidenephthalide)、Z-藳本內酯(Z-Ligustilide)、白樺脂酸(Betulinic acid)、亞麻油酸(Linoleic acid)以及油酸(Oleic acid)；另使用Chou-Talalay法計算酸棗仁湯簡方純化萃取物中的單一成分與長春瑞濱之組合促使A549細胞凋亡的組合指數(combination index,CI)。由表3中可看出，當該等化合物與長春瑞濱組合使用時，川芎內酯A、反式新蛇床內酯、3-亞丁烯基苯酞、白樺脂酸以及亞麻油酸顯示出協同凋亡活性；雖然白樺脂酸(化合物編號8)在60μM的高濃度具有中度細胞毒性，但其在A549細胞中對長春瑞濱介導的細胞凋亡方面表現出最高的活性。

實施例8

酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春新鹼組合對於有絲分裂以及細胞凋亡之變化

請參照第14圖以及第15圖，第14圖以及第15圖係為酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春新鹼組合對於有絲分裂以及細胞凋亡之影響示意圖。此試驗係將酸棗仁湯簡方純化萃取物搭配另一長春花生物鹼，即長春新鹼，測試該等組合物對於人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3之功效。

使用7.5、15或30μg/mL酸棗仁湯簡方純化萃取物，分別搭配0.78、1.56、3.13、6.25、12.5或15nM的長春新鹼(vincristine)之組合，與人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3一起培養24或48小時後，同上述實驗方式分析細胞在sub-G1細胞週期的分佈，*表示兩組相比其P值小於0.05，**則表示其P值小於0.01，***則表示其P值小於0.001；由第14圖以及第15圖中可看出，酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春新鹼組合使用時，具有顯著使人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌細胞PC-3凋亡之功效。

綜上所述，由各實施例中均可證明酸棗仁湯簡方純化萃取物與長春瑞濱或長春新鹼組合使用時，對於非小細胞型肺癌的治療效果具有協同作用，且酸棗仁湯簡方純化萃取物並不具有細胞毒性，可作為潛在的化學增敏劑，並藉由拓增及延長SAC活化以增強長春瑞濱所介導針對非小細胞型肺癌的抗癌活性。

以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims

一種用於協同長春花生物鹼以增強治療癌症效果之中藥組成物，其由酸棗仁、茯苓以及川芎之萃取物所組成，其中該中藥組成物與長春花生物鹼搭配使用時，具有增強長春花生物鹼抗非小細胞肺癌活性或抗人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌活性之協同功效，以及該萃取物係由酸棗仁、茯苓以及川芎以重量比5：1：1混合後萃取而得。
如請求項1所述之中藥組成物，其中該長春花生物鹼係為長春瑞濱或長春新鹼。
如請求項1所述之中藥組成物，其中該萃取物包含川芎內酯A、反式新蛇床內酯、3-亞丁烯基苯酞、白樺脂酸以及亞麻油酸。
一種如請求項1至請求項3所述之中藥組成物的製備方法，該製備方法包括：將酸棗仁、茯苓以及川芎以重量比5：1：1混合後以乙醇萃取，收集萃取物並濃縮以獲得一乙醇萃取物；將該乙醇萃取物懸浮於水中，添加乙酸乙酯進行液相-液相萃取，收集乙酸乙酯層萃取部分並濃縮，以獲得一乙酸乙酯層萃取物；以及將該乙酸乙酯層萃取物藉由填充矽膠至層析管柱中作為固定相，先使用正己烷作為移動相進行洗脫，再使用含有30%(v/v)甲醇的乙酸乙酯作為移動相進行洗脫，以獲得該中藥組成物。
如請求項4所述之製備方法，其中該乙醇萃取物係於溫度50~60℃進行萃取。
如請求項4所述之製備方法，其中該乙酸乙酯之添加量與水等體積。
一種如請求項1至請求項3所述之中藥組成物用於協同長春花生物鹼以增強抗非小細胞肺癌活性或抗人類轉移性去勢療法抗性前列腺癌活性之用途，其中該中藥組成物係藉由使癌細胞之DNA碎裂而凋亡，於sub-G1細胞週期的分佈增加。
如請求項7所述之用途，其中該中藥組成物可進一步誘導啟動型凋亡蛋白酶以及下游執行型凋亡蛋白酶活化，以使癌細胞凋亡。
如請求項7所述之用途，其中該中藥組成物可進一步增加抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-xL的磷酸化，以使長春花生物鹼誘導的凋亡反應更為敏感。
如請求項7所述之用途，其中該中藥組成物可進一步延長癌細胞中的G2/M細胞週期停滯，以使癌細胞凋亡。