TWI780460B - 副乾酪乳桿菌gks6用於製備預防或治療腎功能異常組合物的用途 - Google Patents

Abstract

一種副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6用於製備預防或治療腎功能異常組合物的用途，其中該副乾酪乳桿菌GKS6以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。

Description

副乾酪乳桿菌GKS6用於製備預防或治療腎功能異常組合物的用途

本揭露關於一種副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6用於製備預防或治療腎功能異常組合物的用途；更明確地說，該副乾酪乳桿菌GKS6以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心，並藉由該組合物預防或治療急性腎損傷。

順鉑（cisplatin）

順鉑在1960年代被意外發現可以抑制細胞分裂，爾後就成為世界上治療腫瘤的化學治療用藥中不可或缺的一項藥物。順鉑抑制癌細胞的機轉尚未被完全了解，但目前實驗證實該機轉是順鉑會與去氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）交叉結合，使得DNA在複製與合成時遭到阻礙而無法進行。也因此在快速分裂的細胞，例如癌症細胞，順鉑會造成DNA損傷，導致癌症細胞增生受到阻礙。直到目前為止，順鉑依然是幾種癌症的唯一藥物選擇。儘管順鉑具有化學治療的醫藥活性，但不同的研究報導指出順鉑對人體的部分重要器官有毒性，包括心臟、肝臟、腦、脾，尤其在腎的有害最為顯著。

腎功能異常

由順鉑所引起的腎功能異常依不同的方法分類為多種症狀，其中在超過30％的患者中出現急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的症狀。急性腎損傷常見的病理生理狀態為休克、缺血再灌注、敗血症等，臨床診斷上以腎功能的快速下降和廣泛的腎小管損傷來判斷，且急性腎損傷患者的死亡率相較於其他腎功能異常的症狀來說非常地高。腎損傷的症狀嚴重程度，會依據順鉑在腎組織中的濃度高低、分布範圍窄廣和積累時間長短而有所不同。由順鉑對腎的毒性所導致的腎功能異常，其病理機制主要分為幾個方面。其一是腎絲球的濾過率降低、血清中肌酐酸（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量升高。其二是腎近端小管的上皮細胞缺血而壞死。從組織病理學的分析發現，順鉑嚴重損害腎組織結構，會使腎組織出現大面積的壞死區域，導致腎細胞的排列疏鬆、刷狀緣消失、腎小球明顯萎縮與腎小管空泡變性等症狀。其三是圓柱體的產生，尿液中圓柱體的存在，是腎臟病變相當重要的指標。尿液只會偶爾出現1至2個圓柱體屬於正常現象，但圓柱體的數目增多代表腎功能異常。尤其在慢性腎臟疾病、尿道阻塞、結石發炎等患者容易出現此病症。但健康個體在從事激烈運動後也有可能會出現此症狀。

益生菌與腎功能異常

近年來研究指出，慢性腎臟病（chronic kidney disease, CKD）與腸胃道相關。當腸道菌群失衡會導致腸壁發炎與腸胃上皮細胞完整度喪失，使得腸道中尿毒素與脂多醣進入血液中循環，從而加劇腎臟炎症並加重腎臟損傷。目前已知可透過乳酸菌來改善腸道菌群，以減緩腸道發炎現象，進而緩解CKD。但目前對於乳酸菌減少急性腎損傷的關連性，則仍未被關注與探究。因此，臨床治療上或居家照護上，都期待能開發出預防或治療由順鉑引起的腎功能異常的乳桿菌、菌粉或含其之醫藥組合物，來降低血清中肌酐酸（creatinine，Cr）和尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的含量、降低腎臟指數、減緩腎組織壞死程度，以有效改善急性腎損傷。

本揭露提供一種副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6及/或其活性物質用於製備預防或治療腎功能異常組合物的用途，其中該副乾酪乳桿菌GKS6以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。

較佳地，其中該組合物以一有效量0.05至25 g/60 kg body weight/day施予受試者。

較佳地，其中該腎功能異常係指急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）。

較佳地，其中該預防或治療腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的血清中的尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度較低。

較佳地，其中該預防或治療腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的血清中的肌酸酐（Creatinine，Cr）濃度較低。

較佳地，其中該預防或治療腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的腎臟指數較低。

較佳地，其中該預防或治療腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的腎臟組織的壞死程度較低。

較佳地，其中腎臟組織的壞死係指近端腎小管的壞死跟透明圓柱體的異常出現。

較佳地，其中該腎功能異常係由癌症的治療藥物所引起。

較佳地，其中該癌症的治療藥物係指順鉑（cisplatin）。

較佳地，其中該等乳酸菌的活性物質係以下列方法製備： （a）取該乳酸菌的菌體接種於固態培養基進行固態培養以形成菌落； （b）將步驟（a）培養的菌落（colony）接種於液體培養基進行液態培養以得含菌體之液態培養基； （c）將步驟（b）含菌體之液態培養基接種於發酵槽進行液態放大以得菌液； （d）將步驟（c）的菌液離心以得菌泥； （e）將步驟（d）的該菌泥冷凍乾燥作為菌粉。

較佳地，其中該冷凍乾燥的溫度為-196至-40℃。

較佳地，其中該組合物包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。

較佳地，其中該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

較佳地，其中該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。

本文中所述「腎功能異常」係指腎臟的排泄功能不正常。在一個具體的態樣中，腎功能異常係指該腎臟功能的生化指標在一般基準範圍外，顯示腎臟功能低下。在一個可行的態樣中，腎臟功能的生化指標係指血清中的尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）濃度、血清中的肌酸酐（Creatinine，Cr）濃度、腎臟指數、腎臟組織的或壞死程度、嗜中性白血球明膠相關性脂質運載蛋白 （neutrophil gelatinase- associated lipocalin，NGAL）、第十八型細胞間素（interleukin-18，IL-18）、腎損傷分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）及血清半胱氨酸蛋白抑製劑（Cystatin C）。

在一個具體的態樣中，腎功能異常係指一種死亡率高的「急性腎損傷」。「急性腎損傷」的診斷定義是48小時內血清中肌酸酐的上升值大於或等於0.3 mg/dL、或48小時內血清中肌酸酐的百分比上升大於或等於50 %、又或是大於6小時的尿量減少小於0.5 mL/kg/hr。

癌症的治療包含外科治療、放射線治療及化學藥物治療。本文中所述「癌症的治療藥物」係指化學藥物治療當中所採用的藥物。在一個可行態樣中，對腎臟造成毒性的化學藥物包含鉑離子製劑的順鉑（cisplatin）、烴基化劑的癌德星（cyclophosphamide）、亞硝酸尿素類的格立得（Carmustine，BCNU）、抗生素如排多癌（Mitomycin-C）。在一個具體的態樣中，「癌症的治療藥物」係指順鉑（cisplatin）。

本文中所述「預防（prevention或preventing）」係指使一個體免於一疾病、不適、或有害症狀的發生。在一個可行態樣中，本文中所述「預防（prevention或preventing）」係指患者在未出現腎功能異常的症狀時，避免該患者出現腎功能異常的症狀。本文中所述「治療（treatment或treating）」係指於一個體中消除、終止、或減少一疾病、不適、或有害症狀的進程。在一個可行態樣中，本文中所述「治療（treatment或treating）」係指患者在出現腎功能異常的症狀時，減緩該患者的腎功能異常的症狀；又或是出現過腎功能異常的症狀的患者，在腎功能恢復至一定水平後維持或提升腎功能。

本文中所述「有效量」係指一使用量，其足以使預防或治療腎功能異常的效果產生。

本文中所述「菌體」係指本揭露所採用的乳酸菌在各種培養階段中乳酸菌本身的結構。在一個具體態樣中，菌體係指完整或部分的乳酸菌結構。在一個具體態樣中，菌體係指由單一個細菌分裂、繁殖所形成的乳酸菌族群的菌落。在一個具體態樣中，培養階段係指固態培養、液態培養或接種於發酵槽的液態放大。

本文中所述「活性物質」係指本揭露所採用的乳酸菌菌體經過特定實驗步驟處理後所篩選出來的物質，或是菌體與培養基或培養液的混合物。在一個具體態樣中，活性物質係指經過離心分離的菌泥、冷凍乾燥的菌粉或溶劑萃取的萃取物。在一個具體態樣中，活性物質係指含有菌體的固態培養基、含菌體的液態培養基或經發酵槽液態放大後的菌液。

由於順鉑在對特定種類癌症的化學治療中是不可或缺的藥物，但卻會對患者的多項器官造成毒性，其中對腎功能的傷害最為顯著。在腎功能傷害中，又以急性腎損傷的死亡率高、初期診斷困難而最為棘手。對此，臨床的癌症治療上，期望乳桿菌或其活性物質能顯著降低腎功能損傷的多項生化指標，以有效緩解由順鉑所引起的急性腎功能損傷。

本揭露為了預防或治療腎功能損傷，研發出一種包含副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6及/或其活性物質的組合物。在一較佳的實施態樣中，上述副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。

關於菌種培養，將乳酸菌體接種於固態培養基上，以進行固態培養來活化菌體並形成菌落（colony formation）。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的溫度為30至55 ℃，更佳為32至45 ℃。在一較佳的實施態樣中，該固態培養的時間為0.5至3天，更佳為1至2.5天。在一較佳的實施態樣中，該固態培養基為MRS agar。待固態培養基上的菌落生長完成後，將單一菌落挑起接種於含有MRS液態培養基的試管，以液態培養來活化。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的溫度為30至55 ℃，更佳為32至45 ℃。在一較佳的實施態樣中，MRS液態培養的時間為14至18小時，更佳為16小時。將MRS液態培養基中的菌體接種於含有1 L液態培養液的錐型瓶中。在一較佳的實施態樣中，液態培養的酸鹼值為pH 5.0至7.0，更佳為pH 5.5至6.5。在一較佳的實施態樣中，液態培養基的配方如下述表1所示。待液態培養基中的菌體生長完成後，將該菌體連同液態培養基接種於發酵槽中，以進行液態放大來獲得含菌液。在一較佳的實施態樣中，發酵槽培養的溫度為30至55 ℃，更佳為32至45 ℃。在一較佳的實施態樣中，發酵槽培養的時間為16至20小時，更佳為17至19小時。

表1

成分	比例（重量百分比）
碳源	0至10 %
豆漿	0.1~5 %
氮源	0.1~5 %
離子	0.01~2 %
水	剩餘部分

關於菌粉製備，待菌體於液態培養完成生長後，收集包含有菌體之液態培養基的菌液。接著，將該菌液進行離心、去除用於發酵的液態培養基以獲得菌泥。在一較佳的實施態樣中，包含有菌體之液態培養基的離心速率為1000至15000 rpm。將取得之菌泥與保護劑混合後冷凍乾燥製得到菌粉，凍乾後之菌粉置於低溫保存。在一較佳的實施態樣中，保護劑為6至30 %的脫脂奶粉。在一較佳的實施態樣中，保存溫度為-30 ℃至4 ℃，更佳為-20 ℃至-10 ℃。保存之菌粉作為於以下動物實驗的試驗物質。

本揭露包含乳酸菌菌體及/或其活性物質的組合物，進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜（Acesulfame K）、阿斯巴甜（aspartame）、糖精（saccharin）、三氯蔗糖／蔗糖素（sucralose）、紐甜（neotame）或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響組合物的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。

該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

本揭露的組合物在不影響菌體或活性物質發揮效果的前提下，組合物可根據受施予者之需要，而製為任何藥物型態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。

本揭露的組合物根據該組合物的型態，在預定的時間點以適用的途徑施予受試者適合劑量的組合物。在一較佳實施態樣中，施予途徑包含經口或非經腸，還包括靜脈內、肌內、腹膜內、皮下、經皮、呼吸道（氣霧劑）、直腸、陰道或局部（包括口腔及舌下）。在一較佳實施態樣中，預定時間點包含每餐、每天、每週。在一較佳實施態樣中，受試者為人類或動物。在一較佳實施態樣中，作為受試者的母體是透過胎盤或哺乳將免疫球蛋白提供給子體，故受試者為處於妊娠或哺乳時期的母體。

有效量於活體外細胞培養實驗，在每一個培養中所用之細胞培養液的總體積定義為「μg/ml」。於動物實驗，有效量定義為「g/60 kg body weight/day」。經下列計算公式，由活體外細胞培養實驗所得到的有效量可轉換為供動物使用的有效量，供動物使用的有效量可再根據新陳代謝率轉換為人類的有效量。 I.           一般來說（Reagan-Shawet al ., 2008），1「μg/ml」單位（基於活體外細胞培養實驗所得的有效量）可等同於1「mg/kg body weight/day」單位（基於小鼠模型實驗所得的有效量）。基於已知小鼠的新陳代謝率是人類的12.3倍，能進一步求得人類的有效劑量。 II.        若基於活體外細胞培養實驗求得有效量為500 μg/ml，則於小鼠中使用的有效量可計為500 mg/kg body weight/day（即，0.5 g/kg body weight/day）。進一步地，參酌前述新陳代謝率的差異，供人類使用的有效量則可計為約2.4 g/60 kg body weight/day。 III.     根據下述的試驗結果，基於小鼠試驗的有效量為500 mg/kg body weight/day，經上述換算公式求出人類的有效劑量為約2.4g/60 kg body weight/day。

在一較佳實施態樣中，組合物中所含的乳酸菌菌體或活性物質的有效量為0.05 至25 g/60 kg body weight/day，再佳為0.1 至12 g/60 kg body weight/day，更佳為1 至5 g/60 kg body weight/day。

實施例一：菌種來源

本揭露的實施例中用以製備試驗物質所使用的菌種，購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心。本揭露所採用的菌種是副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）中的菌株GKS6，其以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。但本揭露所述的菌種不限於由此管道取得，所屬技術領域中具有通常知識者亦可由其他微生物菌株保存單位取得該等乳酸菌的菌種。

實施例二：菌種培養

將乳酸菌體接種於作為固態培養基的MRS agar上，以37 ℃進行固態培養2天來活化菌體，並形成菌落（colony formation）。待MRS agar上的菌落生長完成後，將單一菌落挑起接種於含有MRS液態培養基之試管，以37 ℃液態培養活化16小時後，再接種於錐型瓶酸鹼值6.0的1 L液態培養基，液態培養基的配方如上述表1所示。待液態培養基中的菌體生長完成後，將該菌體連同液態培養基接種於發酵槽中，以37℃培養18小時進行液態放大，來獲得菌液。

實施例三：菌粉製備

待菌體於液態培養完成生長後，收集包含有菌體之液態培養基的菌液。該菌液以6000 rpm進行離心，去除液態培養基並獲得菌泥。將菌泥與作為保護劑的5 %脫脂奶粉混合後，冷凍乾燥來獲得菌粉，並將菌粉保存於 ~ -20 ℃。保存之菌粉作為於以下動物實驗的試驗物質。

實施例四：腎功能檢測

試驗動物

自樂斯科生物科技公司（BioLASCO Taiwan Co., Ltd., Taiwan）購入40隻體重介於32至33公克的雄性ICR（Institute of Cancer Research）小鼠。動物房的室溫維持於23至25 ℃，濕度55至65 %，定時12小時光照與黑暗，飼料及蒸餾水均任由小鼠自由取食。小鼠適應環境一周後，開始進行實驗。

試驗設計

40隻小鼠分為生理食鹽水組、順鉑組、氨磷汀（Amifostine）組與GKS6共四組，每組10隻小鼠。小鼠每日一次持續14天給藥，以口服管餵方式對生理食鹽水組、順鉑組與氨磷汀組施予生理食鹽水、對GKS6施予GKS6。於給藥的第11日對順鉑組、氨磷汀組與GKS6以腹腔注射順鉑20 mg/kg B.W.（Body Weight）以誘導急性腎損傷，其中氨磷汀組於腹腔注射順鉑30分鐘前以腹腔注射氨磷汀。試驗流程的時間軸圖顯示於圖一。組別與施予的給藥試驗樣品如下表2：

表2

組別	試驗樣品
生理食鹽水組	持續14天管餵生理食鹽水 （0.9% NaCl） 5 mL
順鉑組	持續14天管餵生理食鹽水 （0.9% NaCl） 5 mL，第11天腹腔注射順鉑(20 mg/kg BW)
氨磷汀組	持續14天管餵生理食鹽水 （0.9% NaCl） 5 mL，第11天腹腔注射氨磷汀200 mg/kg，30分鐘後腹腔注射順鉑 (20 mg/kg BW)
GKS6	持續14天管餵GKS6500mg/kg 14天，第11天腹腔注射順鉑(20 mg/kg BW)

此實驗所施予小鼠的氨磷汀（Amifostine）是一種保護劑。由於腎臟是順鉑類藥物排除的主要器官，在腎小管上皮細胞中會被高度濃縮的順鉑，而造成腎臟傷害。因此，在注射順鉑的初期，患者的近端腎小管對鈉跟水分的再吸收能力會明顯下降，使腎絲球過濾效率降低，並使遠端腎小管出現異常。而氨磷汀即由FDA所核准的用於緩解肺癌病患接受順鉑高劑量給藥所引起的腎毒性的習知保護劑。

試驗記錄與分析

連續14日給藥結束後，第15天小鼠以二氧化碳犧牲。觀察小鼠的外觀、胸腹內組織器官並做成紀錄。採集小鼠的血液作為樣本，以購自朗道實驗診斷有限公司（Randox Laboratories Ltd.）的檢測套組，進行血清中生化指標的分析。測量小鼠的體重，並從小鼠中分離出腎臟，測量腎臟重量。依下列式1計算腎臟指數。 式1： 腎臟指數=[（小鼠腎臟重量/小鼠體重）×100]

將腎臟固定在10 %福馬林緩衝液中，包埋在石蠟以製備大約5 μm的切片，並將切片安裝在載玻片上以蘇木精和曙紅染色載玻片。在光學顯微鏡下以400 X的放大率觀察載玻片的切片組織，並記錄該切片組織的病理學變化。根據切片中組織病變的嚴重程度，請獸醫師評估腎臟壞死分數。評分等級分為0至5分，1 分表示極輕微（＜1％）、 2分表示輕微（1-25％）、3 分表示中等（26-50％）、4分表示中/重度（51-75％）、5 分表示嚴重/非常嚴重（76-100％）。當分數越高，就代表腎臟壞死程度越嚴重。

試驗統計

實驗數據以平均值 （mean） 及標準差 （standard deviation, S.D.） 表示。體重的統計分析方法採用Student’s t-test，檢驗試驗物質組與對照組之間的差異，p＜0.05表示顯著差異。

試驗結果

檢測小鼠血清中尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）的濃度的結果顯示如表3與圖二。

表3

組別	生理食鹽水組	順鉑組	氨磷汀組	GKS6
BUN濃度 (mg/dL)	24.4±1.75	141.6±5.29	85.4±7.05	71.9±4.54

經比較各組血清中的尿素氮濃度，施予GKS6的GKS6組經順鉑誘導後，其小鼠血清中的尿素氮濃度，明顯低於同樣經順鉑誘導後但未攝食GKS6的順鉑組的小鼠血清中的尿素氮濃度（p＜ 0.05）。GKS6組的小鼠血清中的尿素氮濃度甚至更低於氨磷汀組。此結果說明GKS6能降低作為腎功能指標的血清尿素氮濃度，減緩順鉑所引起的急性腎損傷，達到恢復腎功能的效果。GKS6相較於目前所採用的保護劑，有更佳的恢復腎功能的效果。

檢測小鼠血清中肌酸酐（Creatinine，Cr）的濃度的結果顯示如表4與圖三。

表4

組別	生理食鹽水組	順鉑組	氨磷汀組	GKS6
肌酸酐濃度 (mg/dL)	0.47±0.04	1.59±0.10	0.88±0.04	0.73±0.03

經比較各組血清中的肌酸酐濃度，施予GKS6的GKS6組經順鉑誘導後，其小鼠血清中的肌酸酐濃度，明顯低於同樣經順鉑誘導後但未攝食GKS6的順鉑組的小鼠血清中的肌酸酐濃度（p＜ 0.05）。GKS6組的小鼠血清中的肌酸酐濃度甚至更低於氨磷汀組。此結果說明GKS6能降低作為腎功能指標的血清肌酸酐濃度，減緩順鉑所引起的急性腎損傷，達到恢復腎功能的效果。GKS6相較於目前所採用的保護劑，有更佳的恢復腎功能的效果。

測量並計算小鼠腎臟指數的結果顯示如表5與圖四。 表5

組別	生理食鹽水組	順鉑組	氨磷汀組	GKS6
起始體重(g)	33.05	33.26	32.97	32.35
最終體重(g)	35.72	28.23	31.25	30.81
體重差(g)	2.67	-5.03	-1.72	-1.54
腎重(g)	0.49	0.75	0.49	0.46
腎臟指數	1.36	2.66	1.56	1.49
SD	0.07	0.11	0.08	0.1
p-值	1.43985E-20	1	1.0773E-18	6.70233E-15

經比較各組腎臟指數，施予GKS6的GKS6組經順鉑誘導後，其小鼠腎臟指數明顯低於同樣經順鉑誘導後但未攝食GKS6的順鉑組的小鼠腎臟指數（p＜ 0.05）。GKS6組的小鼠腎臟指數跟氨磷汀組相近，且趨近施予生理實驗水組的小鼠腎臟指數。此結果說明GKS6能降低作為腎功能指標的腎臟指數，減緩順鉑所引起的急性腎損傷，達到恢復腎功能的效果。

小鼠的的腎小管壞死的組織染色結果顯示如圖五。施予生理食鹽水組中，小鼠的腎臟近端小管未有壞死，且細胞組織完整，其中深色的細胞核分布均勻、淺色的細胞未有脫落。給藥的第11天注射順鉑的順鉑組中，小鼠的腎臟近端小管積聚多灶性腎小管壞死，且細胞組織排列不齊全，甚至出現空泡與透明圓柱體，顯示腎臟有發炎情形。給藥持續14天施予GKS6並於給藥的第11天注射順鉑的GKS6組，小鼠的腎臟近端小管的腎小管壞死程度介於生理食鹽水組與順鉑組之間，細胞組織的完整度恢復，深色的細胞核數量明顯增加且分布也較順鉑組來的均勻，空泡與透明圓柱體所占的面積也遠少於順鉑組。經比較各組腎小管壞死的狀況，施予GKS6的GKS6組經順鉑誘導後，其小鼠腎小管壞死狀況明顯輕微於同樣經順鉑誘導後但未攝食GKS6的順鉑組的小鼠腎小管壞死狀況（p＜ 0.05），且也比FDA核准用於緩解肺癌病患接受順鉑給藥所引起的腎毒性的保護劑氨磷汀組效果來的好，而趨近施予生理實驗水組的小鼠腎小管壞死狀況。此結果說明GKS6能降低作為腎功能指標的腎小管壞死，減緩順鉑所引起的急性腎損傷，達到恢復腎功能的效果。

小鼠的腎臟組織壞死的分數分為近端腎小管的壞死跟透明圓柱體的異常出現來評估，結果顯示如表6與圖六。 表6

組別	生理食鹽水組	順鉑組	氨磷汀組	GKS6
近端腎小管壞死分數	0±0	5±0	2.83±1.17	1.67±0.51
透明圓柱體異常分數	0±0	4±0.89	1.67±0.81	1.5±0.83

經比較各組腎臟組織壞死的分數，施予GKS6的GKS6組經順鉑誘導後，其小鼠腎臟組織壞死的分數明顯低於同樣經順鉑誘導後但未攝食GKS6的順鉑組的小鼠腎臟組織壞死的分數（p＜ 0.05），且跟氨磷汀組相近。此結果說明GKS6能降低作為腎功能指標的腎臟組織壞死的分數，減緩順鉑所引起的急性腎損傷，達到恢復腎功能的效果。

實施例五：組合物製備

本揭露之菌種若應用於食品用途，則以下組合物1至2之態樣作為例示性實例。

組合物1：取副乾酪乳桿菌GKS6的菌粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）充分混合，並溶於純水（65 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

本揭露之菌種若以液體劑型應用於醫藥用途，則以下組合物3至4之態樣作為例示性實例。

組合物2：取副乾酪乳桿菌GKS6的菌粉（20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）、作為稀釋劑之蔗糖（10 wt%）充分混合，並溶於純水（55 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

無

圖一顯示動物實驗的流程。圖中橫軸線上端所標示的「給藥」是指依試驗動物的分組施予不同試驗物質的狀態，「d」則是指該狀態的第幾天。圖中與橫軸線平行的雙箭頭線是指施予試驗物質的期間。圖中橫軸線下端所標示的「Cisplatin 誘導」與「犧牲」分別是指對試驗動物以Cisplatin誘導形成急性腎損傷及犧牲試驗動物採集檢測樣本。

圖二顯示對照組與GKS6共4組的試驗動物犧牲後，試驗動物血清中的尿素氮濃度。

圖三顯示對照組與GKS6共4組的試驗動物犧牲後，試驗動物血清中的肌酸酐濃度。

圖四顯示對照組與GKS6共4組的試驗動物犧牲後，試驗動物的腎臟指數。

圖五顯示對照組與GKS6共4組的試驗動物犧牲後，試驗動物的腎小管壞死的組織染色圖。

圖六顯示對照組與GKS6共4組的試驗動物犧牲後，試驗動物的腎臟壞死分數。

副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）GKS6 BCRC 910788

Claims (11)

1. 一種副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GKS6用於製備預防或治療由順鉑引起的腎功能異常的組合物之用途，其中該副乾酪乳桿菌GKS6以BCRC910788寄存於財團法人食品工業發展研究所之生物資源保存及研究中心。
2. 如請求項1所述之用途，其中該組合物以一有效量施予受試者，該有效量為0.05至25g/60kg body weight/day。
3. 如請求項1所述之用途，其中該由順鉑引起的腎功能異常係指急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)。
4. 如請求項1所述之用途，其中該預防或治療由順鉑引起的腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的血清中的尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)濃度較低。
5. 如請求項1所述之用途，其中該預防或治療由順鉑引起的腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的血清中的肌酸酐(Creatinine，Cr)濃度較低。
6. 如請求項1所述之用途，其中該預防或治療由順鉑引起的腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的腎臟指數較低，其中腎臟指數係指受試者之腎臟重量佔受試者體重的百分率。
7. 如請求項1所述之用途，其中該由順鉑引起的腎功能異常係指近端腎小管的壞死跟透明圓柱體的異常出現。
8. 如請求項1所述之用途，其中該預防或治療由順鉑引起的腎功能異常係指相對於未施予該組合物前，施予該組合物後受試者的腎臟組織的壞死程度較低。
9. 如請求項1所述之用途，其中該組合物包含一種選自下列群組的添加劑：賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
10. 如請求項1中所述之用途，其中該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
11. 如請求項1所述之用途，其中該組合物的形態為粉劑、錠劑、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。

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