TWI752304B - 使用物鏡的螢光成像照明 - Google Patents

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費德瑞克 艾瑞
亞歷克斯 奈米洛斯基
Ｍ 善恩 伯恩
丹尼羅 寇迪羅
戴特里奇 戴林格
馬可 Ａ 庫漫布格爾
金銓 林
艾倫 劉
波珍 歐布雷多維奇
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Abstract

一種系統包括：物鏡；第一光源，其經由該物鏡饋入第一照射光且至待安裝於該系統中之流量槽(例如，具有相對薄膜波導)內，該第一照射光係使用該流量槽上之第一光柵饋入；及第一影像感測器，其使用該物鏡捕獲成像光，其中該第一光柵定位於該第一影像感測器之視野外。可執行雙表面成像。可使用具有由光柵界限之多個條帶的流量槽。可執行自動對準過程。

Description

使用物鏡的螢光成像照明
本發明相關於使用物鏡的螢光成像照明。
〔相關申請的交叉引用〕
本申請案主張2018年3月29日提交的美國臨時申請案第62/649,996號之優先權，該申請案之內容被以引用的方式併入本文中。
高處理量DNA定序可為用於基因組分析及其他基因研究的基礎。在此及其他類型之定序中，基因物質的樣本的特性為平坦波導。一些類型之影像偵測可對定序系統設置了特定需求以便創造全部樣本之影像。舉例而言，藉由一時間延遲與整合(TDI)感測器，一次一個窄長條地捕獲影像，涉及沿著滑塊之長度的掃描操作。為了減小來自照射光對樣本的光損傷，常常需要將照射界限至正成像之樣本區域。在一些範例中，此創造確保照射與影像偵測貫穿掃描過程同步之挑戰。
在第一態樣中，一種系統包括：物鏡；第一光源，其經由該物鏡饋入第一照射光且至待安裝於該系統中之流量槽內，該第一照射光係使用該 流量槽上之第一光柵饋入；及第一影像感測器，其使用該物鏡捕獲成像光，其中該第一光柵定位於該第一影像感測器之視野外。
實施可包括以下特徵中之任何或所有。該流量槽安裝於該系統中。該第一光柵及第二光柵定位於該流量槽上。該第一光柵與該第二光柵具有不同耦合角度。該第一光柵與該第二光柵具有不同光柵週期。該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面、耦合該第一照射光之第一部分以照射該第一樣本表面之該第一光柵及耦合該第一照射光之第二部分以照射該第二樣本表面之該第二光柵。該系統進一步包含該第一光柵將該第一照射光之該第一部分耦合至的第一平坦波導，及該第二光柵將該第一照射光之該第二部分耦合至的第二平坦波導。該第一光柵在該第一照射光之該第一部分之行進方向上相對於該第二光柵偏移。該第一光柵與該第二光柵定位於照射該流量槽的平坦波導之相對側上，該第一光柵將該第一照射光耦合至該平坦波導內，且該第二光柵耦合離開該平坦波導之該第一照射光。該系統進一步包含壁，該壁阻擋由該第二光柵耦合的離開該平坦波導之該第一照射光進入該物鏡。該第一照射光包含第一波長之第一光束，該系統進一步包含第二光源以經由該物鏡饋入第二照射光，該第二照射光包含第二波長之第二光束。該第二光源將經由該第一光柵將該第二照射光經由該物鏡饋入至該流量槽內，該第一光柵具有用於該第一波長及該第二波長之對稱耦合角度。該第一光源正在該物鏡之第一側引導該第一光束，且該第二光源正在該物鏡之與該第一側相對的第二側引導該第二光束。該系統進一步包含定位於該第一光源及該第二光源後且該物鏡前之第一鏡及管透鏡，其中在自該第一鏡至該管透鏡之傳播中的該第一光束及該第二光束之各別角度反映在該第一光柵上的該第一光束及該第二光束之對應入射角。該系統進一步包含定位於該第一光源後且在該第一鏡前之第二鏡，該第二鏡提供在該第一光柵上的該第一光束與該第二光束之空間分離。該流量槽具有由包括該第一 光柵之各別光柵界限之多個條帶，且其中該系統使用這些各別光柵中之至少一者作為進入光柵及退出光柵兩者。該流量槽之波導材料包括Ta2O5。該第一影像感測器包含時間延遲與整合感測器，該系統進一步包含固持該流量槽之可移動級。該系統進一步包含熱級以固持該流量槽，該熱級提供熱控制。該系統進一步包含第二影像感測器，其捕獲至少該第一光柵及在該流量槽中之平坦波導之影像，其中該系統使用一對準準則評估這些影像。該光具有波長以觸發來自該流量槽中之樣本的螢光回應。
在第二態樣中，一種流量槽包括：基板，其固持樣本；第一平坦波導，其導引用於該樣本之第一光；第一光柵，其耦合該第一光；第二平坦波導，其導引用於該樣本之第二光；及第二光柵，其耦合該第二光。
實施可包括以下特徵中之任何或所有。該第一光柵定位於該第一平坦波導上，且該第二光柵定位於該第二平坦波導上。該第一光柵與該第二光柵具有不同耦合角度。該第一光柵與該第二光柵具有不同光柵週期。該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面、耦合該第一光以照射該第一樣本表面之該第一光柵及耦合該第二光以照射該第二樣本表面之該第二光柵。該第一光柵在該第一光之行進方向上相對於該第二光柵偏移。該第一光柵將該第一光耦合至該第一波導內，該第二光柵將該第二光耦合至該第二波導內，該流量槽進一步包含耦合離開該第一平坦波導之該第一光的第三光柵，及耦合離開該第二平坦波導之該第二光的第四光柵。
在第三態樣中，一種方法包括：使用定位於影像感測器視野外之第一光柵饋入經由物鏡且至流量槽內之照射光；及使用該物鏡捕獲成像光。
實施可包括以下特徵中之任何或所有。該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面，該方法進一步包含將該照射光之第一分量引導至與該第一樣本表面對準之第一光柵，及將該照射光之第二分量引導至與該第二 樣本表面對準之第二光柵。該方法進一步包含結合將該照射光之該第一分量引導至該第一光柵來調整該物鏡以聚焦於該第一樣本表面，及結合將該照射光之該第二分量引導至該第二光柵來調整該物鏡以聚焦於該第二樣本表面。該照射光包含第一波長之第一光束，及第二波長之第二光束，該方法進一步包含將該第一光束導向該物鏡之第一側，及將該第二光束導向該物鏡之與該第一側相對的第二側。該方法進一步包含在該照射光退出該流量槽後阻擋該照射光進入該物鏡。熱級固持該流量槽，該方法進一步包含使用該流量槽提供該流量槽之熱控制。該流量槽具有由包括該第一光柵之各別光柵界限之多個條帶，該方法進一步包含使用這些各別光柵中之至少一者作為進入光柵及退出光柵兩者。該方法進一步包含執行評估由該第一光柵進行的耦合之品質之對準過程。
應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合(限制條件為此等概念並不相互不一致)預料為本文中所揭露之發明主題的部分。詳言之，在本揭露內容結尾處出現之所主張主題的所有組合預料為本文所揭露之本發明主題的部分。
100:光學佈局
102:雷射
104:雷射
106:鏡
108:射束成形光學器件
110:鏡
112:管透鏡
114:背焦平面
116:雷射束
118:雷射束
120:光軸
122:角度
124:角度
126:鏡
128:物鏡
130:流量槽
132:通道
134:物件平面
136:視野
138:光柵
140:光柵
142:射束
144:射束
146:射束
148:射束
150:訊號
152:影像感測器
200:物鏡
202:透鏡
204:流量槽
206:雷射
208:雷射束
210:雷射
212:雷射束
214:物鏡之側
216:物鏡之側
300:流量槽之部分/流量槽
302:波導
304:光柵
306:流量槽之區域
308:區域
310:箭頭
312:標度
400:平坦波導
402:光柵
404:光柵
406:光柵上之區域
406':光柵上之區域
408:線
408':線
410:光柵上之區域
410':光柵上之區域
500:曲線圖
600:曲線圖
700:曲線圖
800:曲線圖
900:影像
1000:影像
1100:影像
1200:影像
1300:影像
1400:影像
1500:影像
1600:系統
1602:雷射
1604:雷射
1606:鏡
1608:鏡
1610:稜鏡
1612:稜鏡
1614:鏡
1616:對準目標
1618:管透鏡
1620:組件
1622:物鏡
1624:樣本
1626:級
1628:鏡
1630:投影透鏡
1632:組件
1634:影像感測器
1636:影像感測器
1638:軌道
1700:流量槽
1702:基板
1704:基板
1706:通道
1708:圖例
1710:光柵
1712:光柵
1714:光束
1716:光柵
1718:光束
1720:光柵
1722:壁
1800:流量槽
1802:防護玻璃罩基板
1804:平坦波導
1806:樣本
1808:水緩衝劑
1810:樣本
1812:平坦波導
1814:玻璃基板
1816:光柵
1818:光柵
1820:光束
1822:光束
1924:流量槽
1926:防護玻璃罩基板
1928:平坦波導
1930:水緩衝劑
1932:平坦波導
1934:玻璃基板
1936:光柵
1938:光柵
2000:影像
2100:過程
2200:系統
2202:分光鏡
2204:投影透鏡
2206:影像感測器
2300:過程
2400:流量槽
2402:條帶
2404:條帶
2406:條帶
2408:光柵
2410:光柵
2412:光柵
2414:光柵
2416:光束
2418:光束
圖1展示用於平坦波導照射的光學佈局之範例。
圖2展示物鏡之範例。
圖3展示具有波導及光柵的流量槽之範例。
圖4展示使用光柵耦合進入及離開平坦波導之雷射束之範例。
圖5展示耦合角度對光柵週期之範例曲線圖。
圖6展示多個波長的耦合角度容限對波束直徑之範例曲線圖。
圖7展示模擬角度容限對射束腰部之範例曲線圖。
圖8展示跨一波導的強度之範例曲線圖。
圖9展示自線掃描建構之範例影像。
圖10展示螢光染料分子之範例影像。
圖11展示在波導內的雷射束形狀之範例影像。
圖12至圖15展示基因物質之叢集之範例影像。
圖16示意性地展示用於雷射照射及螢光成像的系統之範例。
圖17展示使用流量槽的雙表面成像之範例。
圖18至圖19展示使用流量槽的雙表面成像之其他範例。
圖20展示流量槽照射之範例影像。
圖21A至圖21B展示過程之範例流程圖。
圖22示意性地展示用於雷射照射及螢光成像的系統之範例。
圖23展示用於對準之過程之範例流程圖。
圖24展示具有多個條帶的流量槽之範例。
本文件描述使用物鏡對螢光成像之照射之範例。在一些實施中，光學架構可有助於針對高速掃描成像之低功率、低背景照射。此可涉及使照射與經由顯微鏡物鏡之偵測同步。在等效於傳統平坦波導照射之訊噪比(SNR)的SNR下，可使用此方法獲得高達約70倍之雷射功率減小。
在一些實施中，雷射光束可行進通過該物鏡以便使成像光學器件與照射相互同步。該波導及一或多個光柵可經設計有物鏡之數值孔徑及雷射之波長需要的耦合角度。雷射束成形光學器件可用以定義光之恰當射束尺寸及品質以確保耦合效率及容限。可選擇恰當波導、光柵、包層及/或基板材料以與定序化學性及正執行之運作相容。可設計具有低背景之螢光團激發的恰當幾何 形狀及光學效能。在一些實施中，可支援雙表面成像。在一些實施中，可支援多色彩激發(例如，雙色彩)。
經由成像物鏡傳遞諸如一或多個雷射束之照射光可提供較之現有方法之優勢。舉例而言，提供經由物鏡之雷射束意謂對流量槽之同一側執行照射及影像捕獲。流量槽之背側接著可用於有助於諸如樣本之準確或迅速溫度控制的過程之一或多個其他態樣。可提供關於大小、角度及位置對照射雷射束之精細控制。此可增大光柵上之對準容限，此又可顯著減少光學機械及光柵製造之成本。可藉由照射線與偵測裝置(例如，TDI感測器)之共對齊來有助於高速掃描。光學器件可被設計成使雷射束成形為形成於平坦波導內部之窄線。舉例而言，該平坦波導可具有約50-200奈米(nm)或更大之一厚度範圍。因而，可將該平坦波導視為一相對薄膜波導。平坦波導可提供高功率密度，伴有相對低雷射功率量。可使用與表面及定序化學性相容之材料(包含但不限於Ta2O5或SiN)在一些實施中，Ta2O5可用作芯，SiO2可用作基板，且水緩衝劑或聚合物層可用作包層。舉例而言，包層可具有約1.3-1.5之折射率。光柵耦合器可被設計成具有針對不同波長之不同受光角。舉例而言，可使用紅及綠雷射燈。作為另一範例，可在流量槽之不同表面(例如，頂表面及底表面)上設計光柵耦合器。
本文中描述之範例係關於基因物質之定序。可對一樣本執行定序以判定叫作核苷酸之哪些建構嵌段組成在樣本中之特定基因物質。可在已首先淨化基因物質後進行定序，且接著將定序重複許多次以便製備合適大小之樣本。
可執行成像，作為對基因物質定序之過程之部分。此可涉及螢光成像，其中使基因物質之樣本受到光(例如，雷射束)以藉由基因物質上一或多個標記物觸發螢光回應。基因物質之一些核苷酸可具有應用至其之螢光標 籤，此允許藉由將光照到樣本上且尋找來自樣本之特性回應來判定核苷酸之存在。螢光回應可在定序過程之過程上偵測且用以建立樣本中的核苷酸之記錄。
本文中描述之範例參考流量槽。流量槽為可在定序過程之至少一個階段中製備及載運一或多個樣本時使用之一基板。該流量槽由與其將曝露於之照射及化學反應兩者相容的材料製成。該基板可具有一或多個通道，樣本材料可沈積於所述一或多個通道中。可使一物質(例如，一液體)流過存在樣本基因物質之該通道以觸發一或多種化學反應及/或以移除不想要的材料。該流量槽可藉由有助於可使流量槽通道中之樣本經受照射光及可偵測來自樣本之任何螢光回應來實現成像。該系統之一些實施可被設計成供至少一個流量槽使用，但在一或多個階段期間(諸如，在裝運期間或當交貨給客戶時)可不包括流量槽。舉例而言，可將流量槽安裝至客戶的房屋處之一實施內以便執行分析。
本文中之範例參考由一或多個光柵耦合至及/或離開波導之光(例如，雷射束)。一光柵可藉由繞射光之至少一部分來耦合照射於光柵之光，藉此使光之該部分在一或多個其他方向上傳播。在一些實施中，該耦合可涉及一或多個相互作用，包括但不限於光之該部分之反射、折射及/或透射。
圖1展示用於平坦波導照射的一光學佈局100之一範例。光學佈局100可實施為本文中描述的一或多個系統之部分。光學佈局100可用於執行本文中描述之一或多種技術或製程。
光學佈局100可包括一或多個光源。舉例而言，光源可提供具有一或多個波長之光。在本文中描述之一個實施中，光學佈局100包括一雷射102及一雷射104。在一些實施中，雷射102及104可分別特徵界定為綠雷射及紅雷射。舉例而言，雷射102可產生具有在約400-570nm之範圍中的一或多個波長之光。舉例而言，雷射104可產生具有在約620-750nm之範圍中的一或多個波長之 光。在一些實施中，可取而代之或另外使用一或多個其他類型之光(例如，不同波長)。
來自雷射102及104中之任一者或兩者的光可由光學佈局100中之至少一個鏡引導。鏡可自提供由相關光源產生的類型之光之部分或全反射之一或多種材料製造。舉例而言，透明基板可具備一鏡塗層。此處，鏡106用於來自雷射102之光束。可使用稜鏡組合具有小角度差之兩個射束。可使用二向色鏡組合兩個/三個不同波長。鏡可安裝於經致動級上用於自動對準。
可以一或多個方式將在光學佈局100中產生之光束成形或另外調節。在一些實施中，可使用一或多個射束成形光學器件108。舉例而言，射束成形光學器件108可用以提供用於光束之一孔隙，以變換光束，及/或以一或多個方式整合光束之分量。可分別針對雷射102及104之光束提供射束成形光學器件108(相同者或不同者)中之一單獨者。
由射束成形光學器件108成形之光束可由光學佈局100中之至少一個鏡引導。此處，鏡110用於雷射102及104兩者之光束。可調整鏡106以控制光束之方向。在一些實施中，可使用鏡106調整在物件平面處的光束之耦合角度。舉例而言，物件平面可界定於定位於光學佈局100中光束下游之一組件(例如，光柵)處。可使用一或多個致動器調整鏡110。在一些實施中，鏡110可電動調整。舉例而言，可使用一或多個壓電馬達致動鏡110。
光學佈局100可包括用於聚焦來自至少一個光源之光的一或多個組件。在一些實施中，可使用管透鏡112。舉例而言，管透鏡可用以將光束聚焦成一中間影像，將該中間影像提供至在光學佈局100中之一無限校正之目標。此處，管透鏡112接收分別源於雷射102及104處之光束。
可將鏡110置放於基於光學佈局100中之一或多個其他組件選擇之一位置中。在一些實施中，鏡110之置放可至少部分取決於管透鏡112之特徵 及位置。舉例而言，可將鏡110置放於管透鏡112關於物件平面之一背焦平面114處，諸如，在流量槽處之平坦波導。
亦即，由雷射102產生之光可形成自鏡110朝向管透鏡112傳播之雷射束116。類似地，由雷射104產生之光可形成自鏡110朝向管透鏡112傳播之雷射束118。可產生雷射束116及118中之每一者，以便在相同或不同方向上傳播。在一些實施中，可關於管透鏡112之光軸120來界定方向之特徵。舉例而言，雷射束116可關於光軸120形成一角度122。舉例而言，雷射束116可關於光軸120形成一角度124。角度122及124可經選擇以便在諸如光柵之一下游組件處提供用於各別雷射束116及118之一特定耦合角度(相同或不同)。
管透鏡112可將雷射束116及118導向光學佈局100中之一或多個組件。在一些實施中，管透鏡112將光導向鏡126，該鏡朝向光學佈局100中之物鏡128反射光之至少部分。舉例而言，鏡126可為二向色鏡，其具有其將具有雷射102及104之波長的入射光之大部分反射至物鏡128內之特徵，同時亦具有透射具有一或多個其他波長的光之大部分之特徵。來自雷射102及104的光之經反射部分可為至少使得經反射光充分照射一下游組件(諸如，流量槽之平坦波導)之量。在其他實施中，光學佈局100可取而代之經配置以用於鏡126至少部分將照射光(亦即，源於雷射102及104處之光)透射至物鏡128內，且至少部分反射自物鏡128出射之其他光。
物鏡128可包括一或多個透鏡及/或其他光學組件。在一些實施中，物鏡128可包括圖2中展示之組件。物鏡128可用以將照射光導向光學佈局100之一或多個組件。物鏡128可用以捕獲成像光且將其提供至光學佈局100之一或多個組件。
光學佈局100包括一流量槽130。在一些實施中，流量槽可包括在本文中其他處描述或展示之任一流量槽。舉例而言，流量槽130可包括經組 態以固持樣本材料且有助於待關於樣本材料採取之動作(包括但不限於觸發化學反應或添加或移除材料)的一或多個通道132。此處，展示通道132在縱向方向上之橫截面。亦即，若使液體流過通道132，則液體之主要流動方向可為進入或離開在此圖示中之圖式。
可關於光學佈局100中之另一組件界定物件平面134。此處，物件平面134至少部分由物鏡128界定。在一些實施中，物件平面134延伸穿過流量槽130。舉例而言，物件平面134可經界定以便鄰近通道132。
物鏡128可界定一視野136。視野136可限定流量槽130上的影像偵測器使用物鏡128捕獲成像光所來自之區域。可使用一或多個影像偵測器。舉例而言，當雷射102與104產生具有不同波長(或不同波長範圍)之各別雷射束時，光學佈局100可包括用於各別波長(或波長範圍)之單獨影像偵測器。
可相對於物鏡128置放一或多個繞射光柵。在一些實施中，光柵138及140可置放於物件平面134處或附近。舉例而言，光柵138及140可置放於通道132之相對側上。亦即，光柵138及140可經置放以便界定跨通道132、垂直於通道132之縱向方向之一橫向方向。光柵138及140置放於感測器視野136外。
光柵138及140可引導光進入及/或離開流量槽130中之一平坦波導。此處，射束142及144入射於光柵138。在一些實施中，射束142及144可分別對應於雷射束116及118，且可界定流量槽130中(例如，流量槽130內之平坦波導中)之一照射區域。舉例而言，射束142及射束144可以不同耦合角度入射於光柵138。作為另一範例，射束142及射束144可在通道132之縱向方向上之不同位置處入射於光柵138。此處，射束146及148自光柵140出射。舉例而言，射束146可對應於在已橫越流量槽130中之平坦波導後的射束142之至少一部分。舉例而言，射束148可對應於在已橫越流量槽130中之平坦波導後的射束144之至少一部分。
光柵138與140可相互相同或類似，或可為不同類型之光柵。該(等)光柵可包括一或多個形式之週期性結構。在一些實施中，光柵138及/或140可藉由自流量槽130(例如，自流量槽130中包括之波導材料)移除或省略材料而形成。舉例而言，流量槽130可在其中具備一組狹縫及/或凹槽以形成光柵138及/或140。在一些實施中，光柵138及/或140可藉由將材料添加至流量槽130(例如，至流量槽130中包括之波導材料)而形成。舉例而言，流量槽130可具備一組脊線、帶或其他突出縱向結構以形成光柵138及/或140。可使用此等方法之組合。
在視野136內，物鏡128可捕獲來自流量槽130之成像光。舉例而言，成像光可包括發光。此成像光傳播穿過物鏡128且在其另一端處出射。光學佈局100可使用一或多個組件在不同方向上引導成像光，照射光(亦即，來自雷射102及104之光)自該不同方向到達。此處，鏡126可為二向色鏡。舉例而言，二向色鏡可反射成像光之至少部分且透射照射光之至少部分。取而代之，二向色鏡可透射成像光之至少部分且反射照射光之至少部分。訊號150此處表示成像光至一或多個影像感測器152之透射。在一些實施中，成像光包括來自流量槽130之螢光。舉例而言，影像感測器152可包括一時間延遲與整合(TDI)感測器。
可選擇物鏡128以具有允許光柵138及/或140在視野136外照射之一數值孔徑。在一些實施中，數值孔徑少於一。舉例而言，可使用0.95、0.75、0.7、0.3及/或0.2之數值孔徑。在一些實施中，較大數值孔徑可供水/油浸沒物鏡使用，例如，1.2至1.4或更大之數值孔徑。
在一些實施中，流量槽130之大小可使藉由沿著通道132之縱向方向(進入及/或離開圖式)掃描來捕獲多個影像成為必要。接著可借助於物鏡128將照射光(例如，射束142及144)與視野136共對齊，該物鏡引導來自在光 柵138及/或140處之雷射102及104之照射光且界定視野136。亦即，雷射102及/或104、物鏡128及光柵138及/或140可用於在流量槽上之連續位置共對齊流量槽130上之照射區域與流量槽130上的影像感測器之視野136。
光學佈局100為包括以下各者之一系統之一範例：物鏡(例如，物鏡128)；光源(例如，雷射102及104)，其經由物鏡饋入照射光(例如，雷射束116及118)且至待安裝於系統中之一流量槽(例如，流量槽130)內，該照射光係使用流量槽上之一光柵(例如，光柵138)饋入；及一影像感測器，其使用物鏡捕獲成像光，其中該光柵定位於影像感測器之一視野(例如，視野136)外。
光學佈局100為可供定位於流量槽(例如，流量槽130)上之第一及第二光柵(例如，光柵138及140)使用的一系統之一範例。
光學佈局100為來自第一光源(例如，雷射102)之第一照射光包含第一波長之第一光束(例如，雷射束116)的一系統之一範例，且其中該系統進一步包含一第二光源(例如，雷射104)以經由物鏡饋入第二照射光，該第二照射光包含第二波長之第二光束(例如，雷射束118)。
光學佈局100為包括定位於第一光源及第二光源(例如，雷射1102及104)後且物鏡(例如，物鏡128)前之一鏡(例如，鏡110)及一管透鏡(例如，管透鏡112)的一系統之一範例，其中在自鏡至管透鏡之傳播中的第一光束及第二光束之各別角度(例如，角度122及124)反映在光柵上的第一光束及第二光束之對應入射角(例如，射束142及144之各別耦合角度)。
光學佈局100為具有定位於光源(例如，雷射102)後且鏡(例如，鏡110)前之一鏡(例如，鏡106)的一系統之一範例，該鏡提供在光柵上的第一光束與第二光束之空間分離(例如，在通道132之縱向方向上，在射束142與射束144之光柵138上的不同入射位置)。
圖2展示一物鏡200之一範例。物鏡200可包括經配置(此處以同軸方式)以便允許光在兩個方向上透射及以一或多個方式操縱光之多個透鏡202。此處，物鏡200引導於一流量槽204處。舉例而言，流量槽204可具有一或多個光柵，其允許進入及/或離開流量槽204中之平坦波導的光之耦合。
物鏡200可供一或多個光源使用。此處，雷射206定位於物鏡200之一個端部。在一些實施中，雷射206產生至物鏡200內之一雷射束208。舉例而言，雷射束208可具有約532nm之一波長。此處，雷射210定位於物鏡200之同一端部處。在一些實施中，雷射210產生至物鏡200內之一雷射束212。舉例而言，雷射束212可具有約660nm之一波長。可引導雷射束208以便在物鏡200之一側214處或附近傳播。雷射束212可經引導以便在物鏡200之與側214相對的側216處或附近傳播。
在一些實施中，雷射束208及212入射於流量槽204上之各別光柵。在一些實施中，雷射束208進入平坦波導之光柵可為雷射束212退出平坦波導之光柵，雷射束212已在其對應光柵處進入平坦波導。對應地，雷射束212進入平坦波導之光柵可為雷射束208退出平坦波導之光柵，雷射束208已在其對應光柵處進入平坦波導。若不進行阻擋，則退出光束可傳播至物鏡200內。
以上範例說明一系統可包括：一第一光源(例如，雷射206)，其將第一光束(例如，雷射束208)導向物鏡(例如，物鏡200)之第一側(例如，側214)；及一第二光源(例如，雷射210)，其將第二光束(例如，雷射束212)導向物鏡之與第一側相對的第二側(例如，側216)。以上範例說明一系統可提供包含第一波長之第一光束(例如，雷射束208)及第二波長之第二光束(例如，雷射束212)的照射光，且該第一光束可在物鏡(例如，物鏡200)之第一側(例如，側214)處引導，且該第二光束可在物鏡之與第一側相對的第二側(例如，側216)處引導。
以上範例說明一系統(例如，包括物鏡200及雷射206及210)可供定位於照射一流量槽(例如，流量槽204)之平坦波導之相對側上的第一及第二光柵使用，該第一光柵將第一照射光(例如，雷射束208或212)耦合至平坦波導內，且第二光柵耦合離開平坦波導之第一照射光。
圖3展示流量槽之一部分300之一範例。該流量槽具有一波導302及一光柵304，其中之每一者部分展示於流量槽之部分300中。波導302之材料可包括Ta2O5，其具有約2.1之折射率。舉例而言，波導302可具有約100-200nm之厚度。在一些實施中，波導302之一指定厚度可具有約±2.5nm之一容限。流量槽300之區域306(例如，在此視圖中，定位於波導302及光柵304上方之一包層)可具有與水之折射率相當的一折射率。流量槽300之區域308(例如，在此視圖中，定位於波導302及光柵304下方之一基板)可具有與某些玻璃之折射率相當的一折射率。在一些實施中，區域308可包括具有約1.5之折射率的材料玻璃基板。舉例而言，區域308可具有約300微米(μm)之一厚度。光柵304可包括具有約10-100nm之一光柵厚度的SiO2。光柵304之指定光柵厚度可具有約±2.5nm之一容限。舉例而言，光柵304可具有約50±10%之工作循環。
該圖示展示流量槽300之一設計模型。在一些實施中，展示流量槽300之影像可使用有限差時域分析來產生。舉例而言，可使用提供物理學模型化之一軟體系統來產生影像。
在流量槽300中，入射光(例如，雷射束)進入(如由箭頭310指示)，且至少部分由光柵304折射。光之經折射部分在波導302中傳播。耦合角度取決於(雷射)波長、光柵間距/深度及折射率。光之強度由根據標度312之陰影指示。最大耦合效率可為約40%。可選擇該設計使得針對多個波長之光定義光學平台之對稱耦合角度或較佳角度。舉例而言，光柵304可具有用於紅雷射束及綠雷射束之一或多個對稱耦合角度。
在一些實施中，光柵可自SiO2製成。在一些實施中，光柵可被設計成具有以下特徵：
Figure 108109104-A0305-02-0018-1
圖4展示使用光柵402及404耦合進入及離開平坦波導400之雷射束之一範例。對於一給定光波長，光柵402及404可具有相同耦合角度，或不同耦合角度。舉例而言，光柵402與404可具有相同或不同光柵週期。光柵402及404經定位使得平坦波導400上之空間匹配在對樣本(例如，基因物質)成像時將使用的成像感測器之大小。可使用一不同相機或不同於意欲在平坦波導400及光柵402及404用於操作中時利用之影像感測器的影像感測器捕獲圖4中展示之影像。舉例而言，可藉由一2D電荷耦合器件相機捕獲影像。平坦波導400可包括任何合適之材料，包括但不限於在本文中其他範例中描述之材料。光柵402及404可包括任何合適之材料(相互相同或不同)，包括但不限於在本文中其他範例中描述之材料。
光柵402上之區域406為由在光柵402處引導之雷射束產生的反射。雷射束按一耦合角度照射於光柵402，使得雷射束至少部分由光柵402耦合且作為一條線408進入平坦波導400。在一些實施中，雷射束可具有大致橢圓形橫截面。舉例而言，雷射束可具有大約100μm之一最大尺寸，但可使用更小或更大大小。在一些實施中，較小射束大小可提供耦合角度之較大容限。舉例而言，在一些光柵上，100μm雷射束可具有約0.5度之一耦合角度容限。光柵404上之一區域410對應於退出光柵404的線408之雷射束。
舉例而言，線408可用以照射波導400及光柵402及404應用至的流量槽中之一樣本。在一些實施中，線408可為大約8-150μm寬。線408之最窄區域(有時被稱作腰部)可為大約7μm。可關於一些現有定序系統之線寬規範 來考慮此。舉例而言，一個現有系統可指定3-8μm之一線寬，另一系統可指定10-24μm之一線寬，且又一系統可指定大約40μm之一線寬。在一些實施中，在約1mm之一段距離(其可為平坦波導400在x方向上之大致寬度)上，射束傳播損失可小於10%。舉例而言，平坦波導可為約1.2mm寬且高達約100mm長。此可界定一些偵測器(例如，TDI掃描器)的約90%成直線照射之均勻性。在y方向上之一角度容限可大於在流量槽上約±3度。
在使用中，捕獲來自流量槽之成像光的影像感測器可經配置及組態使得其視野包括線408，同時不包括區域406及410，以便避免或減少雷射光在影像中之出現。在一些實施中，視野可為窄長條，其基本上僅覆蓋平坦波導400內之線408。舉例而言，視野可具有約10-24μm之寬度。舉例而言，該視野可具有約800μm、1000μm或2000μm之長度。
不同波長之射束可在流量槽上空間差異化。在一些實施中，比方說，綠雷射束應在光柵402上與比方說紅雷射束不同之一位置處照射。舉例而言，此可消除或減少來自各別雷射束之訊號之間的串擾。綠雷射束可接著在y方向上與紅雷射束間隔開。舉例而言，光柵402上之區域406'示意性示出綠雷射束之入射。舉例而言，線408'示意性地展示進入平坦波導400內的綠雷射束基本上平行於線408之耦合。舉例而言，光柵404上之區域410'示意性示出離開平坦波導400的線408'之光之耦合。
光柵402及/或404及本文中描述之其他光柵可被設計成具有一或多個對稱耦合角度。圖5展示耦合角度對光柵週期之一範例曲線圖500。對照豎直軸標記耦合角度，且對照水平軸標記光柵週期(以nm計)。示出四個射束，其中之兩個為橫向電(TE)模式射束且另兩個為橫向磁(TM)模式射束。在此非限制性工作範例中，一個TE射束及一個TM射束具有532nm波長。另一TE射束及另一TM射束具有660nm波長。波導包括110nm厚之Ta2O5，且基板包括 具有約1.5之折射率且具有低自體螢光之玻璃材料。覆蓋水緩衝劑具有約1.34之折射率用於成像。
曲線圖500展示針對耦合角度對光柵週期之模擬結果。可識別對稱耦合之多個角度。舉例而言，三個光柵週期允許對稱耦合--342nm、354nm及358nm。在彼等光柵週期下之對稱耦合角度分別為+- 13.72、+- 16.85及+- 8.79度，其指示繞射可在來自光柵之法線之任一方向上。因而，曲線圖600說明具有多於一個光源之系統及至少第一及第二波長可供具有用於第一及第二波長之對稱耦合角度的光柵使用。額外參數可影響耦合效率及耦合角度。舉例而言，此可包括波導厚度、光柵深度、形狀、波導之折射率、包層及/或基板、波長及射束偏光。
已知實體關係(包括但不限於一般波動方程)可用於進一步分析電磁波在材料中之傳播。舉例而言，可執行模擬，且模擬可用作用於設計平坦波導或另一組件之基礎。
圖6展示耦合角度容限分析之一範例曲線圖600。對照豎直軸標記一正規化之耦合效率，且對照水平軸標記以度計之一入射光束相對角度。0.57°之x傾斜角容限可藉由較小射束大小達成。可藉由進一步減小射束直徑但增大位置對準敏感性來提供較高容限。在曲線圖600中展示之耦合角度容限可為級傾斜解析度之約十倍，且可展示關於掃描成像之低風險。
圖7展示模擬角度容限對射束腰部之一範例曲線圖700。若一實施將對照射光之入射角很敏感，則隨著在掃描期間移動樣本，平坦波導中之線可變得更亮或更暗。在曲線圖700中，對照豎直軸標記耦合效率，且對照水平軸標記基板中之耦合角度。在曲線圖700中標記四個範例射束，其分別具有減小之射束腰部30μm、15μm、8μm及8μm(在波峰與波谷之間具有30nm光柵深度)。曲線圖700展示耦合角度容限隨著減小射束腰部而增大。曲線圖700亦 展示在光柵深度之最佳化後，小大小射束之耦合效率可仍然到達超過35%。為了改良角度容限，小射束模型化及用於成像之高數值孔徑物鏡可提供小射束直徑，而無顯著成本或挑戰。
圖8展示跨一波導的強度之一範例曲線圖800。對照豎直軸標記強度，且對照水平軸標記跨平坦波導之位置(例如，以行編號之形式)。曲線圖800展示在大於90%之波導處，可存在均勻性。舉例而言，此可為在波導之中心處的一600μm區。曲線圖800中之邊緣背景可歸因於染料溶液人為效應。
可測試樣本以針對線掃描成像評估平坦波導照射。此等樣本可包括但不限於螢光珠粒、染料分子毯及基因物質之叢集。圖9展示自線掃描建構之一範例影像900。影像900可自多個線掃描建構。影像900具有800μm×800μm之大小。可在多個位置及/或通道處在1.6mm上方執行掃描。出於說明之目的展示影像900，且在實際情形中，高度可為大約75mm或100mm(僅舉兩個範例)。
影像900展示均勻珠粒及背景。照射沿著自約100μm直至約5mm之長區域區係均勻的，而不調整耦合角度或位置。在影像900之一個邊緣，光柵背景目前可見。設計可具備裕度來解決此情形。舉例而言，約100μm之槽可用於無平坦波導之流量槽中的光柵耦接器，而無顯著成本或其他劣勢。
圖10展示螢光染料分子之一範例影像1000。影像1000係拍攝自在聚合物層之上的高密度螢光染料分子。歸因於照射或成像技術，影像1000中之不規則性係不必要的。相反地，影像1000可觀測界面細節。舉例而言，影像1000可展示波導缺陷、聚合物層或玻璃基板中之表面圖案及/或其他缺陷及/或光柵上之氣泡或灰塵。
圖11展示在一波導內的雷射束形狀之一範例影像1100。影像1100中之光漂白圖案可展示在波導內之一雷射束形狀。
圖12至圖15展示基因物質之叢集之範例影像1200、1300、1400及1500。在較低功率下，這些影像具有非常低之背景及高SNR。在一些實施中，功率可比現有系統設置低大約40倍。舉例而言，現有系統可涉及280mW之雷射功率，且可在3.1mW之雷射功率下拍攝影像1200。照射跨影像感測器之全視野及跨掃描係均勻的。
影像1200為800μm寬，且展示平坦波導板之出口。與影像1200相比，影像1300-1500經縮放。影像1300係在11mW、314之SNR下拍攝。影像1400係在3.1mW、154之SNR下拍攝。影像1500係在0.4mW、35之SNR下拍攝。
SNR分析展示與使用相同分析模型之現有系統相比，對於相同SNR或訊號，可涉及更低得多之功率。一個假設可為與標準成像相比，背景光在相同訊號位準下更高得多。另一假設可為，在較低訊號位準下可達成等效SNR(與標準成像相比)。
SNR分析可展示在等效於現有系統之一訊號下，平坦波導可展示背景值之八倍減小、SNR之兩倍改良及/或30倍更低功率使用。此對應於降低系統中之雷射功率之能力。SNR分析亦可展示可藉由兩倍低之訊號達成等效於現有系統之SNR的SNR、雷射功率之70倍減小及/或更低之DNA光損傷及雷射誘發之目標損壞或污染。
簡言之，可達成多達約20-70倍雷射功率減小。此可降低關於儀器之一些計費量度，諸如，出售的貨物之成本。此可將對光學器件或流量槽之雷射損傷及目標污染去風險。訊號對背景比可改良高達約八倍。此可提供改良之資料品質。舉例而言，可啟用用於啟用小叢集之電位。可將雷射曝露劑量減少約兩倍至四倍。此可提供DNA光損傷之減少。
圖16示意性地展示用於雷射照射及螢光成像之一系統1600。系 統1600可供本文中描述之任何組件、佈局或技術使用。系統1600包括雷射1602及1604。在一些實施中，雷射1602及1604可產生不同波長之光。舉例而言，在一些態樣中，可經由系統1600之一或多個光纖(圖中未示)傳播雷射光。系統1600包括鏡1606及1608。舉例而言，雷射1602可引導鏡1606處之光，且雷射1604可引導鏡1608處之光。系統1600包括稜鏡1610及1612。舉例而言，鏡1606可將光導向稜鏡1610，且鏡1608可將光導向稜鏡1612。系統1600可包括一鏡1614。在一些實施中，鏡1614具有一壓電致動器。舉例而言，稜鏡1610及1612皆可將各別光導向鏡1614。在一些實施中，一或多個對準目標1616可定位於雷射束之路徑中。舉例而言，對準目標1616可包括用於雷射光之一孔隙。鏡1614可將雷射束導向一管透鏡1618。舉例而言，各別雷射束之角度在其於鏡1614與管透鏡1618之間傳播時可界定彼雷射束在下游組件(諸如，一或多個光柵)處之耦合角度。
組件1602-18可安裝於一合適工作台或其他表面(諸如，光學器件台或等效物)上。組件1602-18可共同地被稱作激發光學器件，或替代地被稱作平坦波導板。以下為可應用於平坦波導板之特徵或參數：可使用532/660nm波長之二極體雷射(例如，雷射1602及/或1604)；可應用35/50mW雷射效應；可使用光纖單模。壓電鏡(例如，鏡1614)可具有豎直及/或水平致動；可最佳化至管透鏡(例如，管透鏡1618)及流量槽光柵內之耦合角度；且可定位於管透鏡之背焦平面上。線性平移器或鏡(例如，鏡1606及/或1608)可用於粗略對準。
系統1600可包括接收來自至少管透鏡1618之光的一組件1620。舉例而言，組件1620可特徵界定為一光學結構，或照明光學器件或兩者。舉例而言，組件1620可包括在水平方向上反射來自管透鏡1618之光的鏡，及在豎直方向(例如，在此視圖中，在圖式中向下)上反射來自管透鏡1618之光的另一 鏡。系統1600可包括一物鏡1622。舉例而言，物鏡1622可包括多個透鏡或其他光學器件。系統1600可包括一樣本1624，其為來自物鏡1622的光之目標。舉例而言，樣本可提供於一流量槽中，該流量槽具有一平坦波導及光柵用於耦合來自物鏡1622之光。樣本1624可定位於系統1600中之一或多個級1626上。舉例而言，級1626可包括一夾盤或其他組件用於在成像或掃描操作期間機械固定流量槽。
樣本1624之照射可產生來自樣本中之基因物質的螢光回應。此回應可特徵界定為系統1600中之成像光。該成像光可進入物鏡1622，可傳播至組件1620內。舉例而言，組件1620中之二向色鏡可在另一方向上(諸如，朝向鏡1628)引導成像光。鏡1628可朝向系統1600中之投影透鏡1630引導成像光，其後，成像光可入射於組件1632。組件1632可以一或多個方式改向及/或調節成像光。舉例而言，此調節可為針對成像光的感測或偵測過程之部分。此處，組件1632包括朝向各別影像感測器1634及1636中之任一者或兩者改向成像光之一鏡。在一些實施中，影像感測器1634及1636中之每一者可處置自用特定色彩之光照射產生的成像光。舉例而言，影像感測器1634及1636可為TDI傳感器。可使用用於成像光之偵測的其他技術。
系統1600可包括一或多個軌道1638。在一些實施中，軌道可有助於一方面至少樣本1624與另一方面至少物鏡1622之間的相對運動。此可有助於樣本1624之較大區域之成像，例如，藉由在流量槽中之一或多個通道之長度上掃描。舉例而言，當影像感測器1634及/或1636包括一TDI感測器時，級1626可為借助於軌道1638之可移動級，使得TDI感測器可掃描固持樣本1624的流量槽之連續區域之線影像。
在系統1600或其他實施中，可應用熱處理。因為物鏡1622傳遞照射光且亦捕獲成像光，所以至樣本1624之背側之光學通路可並非必要的。接 著可應用熱調節，至少部分藉由樣本1624之背側。在一些實施中，級1626可為經組態用於樣本1624之迅速及/或準確熱控制的熱級。舉例而言，在成像及/或掃描操作期間，級1626可將樣本維持在固定溫度。
可執行雙表面照射及成像。在一些實施中，光柵可具有在流量槽之頂表面及底表面上的不同位置。在一些實施中，可基於幾何形狀及/或材料將光柵設計成具有不同耦合角度。舉例而言，可不同地設計光柵週期以提供針對不同情形之恰當耦合角度。舉例而言，歸因於包層/基板之翻轉，頂部及/或底部耦合角度可具有天然差。可始終在玻璃基板/蓋與自頂部之照射之間提供緩衝劑。可使用以上方法中之兩者或更多者之組合。
圖17展示使用一流量槽1700的雙表面成像之一範例。流量槽可自任何合適之材料製成，包括但不限於本文中提到之材料。流量槽1700包括一基板1702(例如，在此視圖中，頂部基板)及一基板1704(例如，在此視圖中，底部基板)。一或多個通道1706可形成於基板1702與1704之間。舉例而言，通道1706可含有待曝露於照射之一或多個樣本(例如，基因物質)，諸如，在定序過程中。圖例1708指示可在y方向上執行掃描，且可接著橫向於掃描之方向跨流量槽1700界定x方向。
光柵1710及1712可提供於基板1702上。在一些實施中，光柵1710及1712提供於基板1702之面向通道1706的表面上(在此視圖中，在基板1702之底表面上)。舉例而言，光柵1710可用以將一光束1714(其已傳播穿過基板1704且穿過通道1706)耦合至由基板1702形成之平坦波導內。因而，光束1714可在基本上x方向上在基板1702內部行進，且照射在基板1702之向內(此處底部)表面上或鄰近處之樣本材料。舉例而言，光柵1712可用以耦合離開基板1702的在平坦波導中傳播之光。
可藉由基板1704作出一類似配置。此處，基板1704上(在此視 圖中，在基板1704之頂表面上)之光柵1716可耦合至由基板1704形成之平坦波導內的在基板1704內部傳播之一光束1718，以在x方向上行進且照射在基板1704之向內(此處，頂部)表面上或鄰近處的樣本材料。光柵1720(此處，亦在基板1704之頂表面上)可用以耦合離開基板1704的在平坦波導中傳播之光。
接著可按成像光之形式偵測來自樣本材料之螢光回應。影像感測器(圖中未示)可捕獲由光束1714在通道1706之頂部(在此視圖中)觸發的成像光，且可捕獲由光束1718在通道1706之底部(在此視圖中)觸發的成像光。舉例而言，可在不同時間(例如，交替地)啟動光束1714及1718以便允許各別表面之單獨成像。藉由經由用於捕獲成像光之同一物鏡傳遞光束1714及1718，可獲得在y方向上之每一位置處的照射與成像之共對齊。
光束1714及1718可由同一光源或由單獨光源產生。不同波長可供流量槽1700使用。在一些實施中，532nm及660nm兩個雷射可分別用於光束1714及1718。舉例而言，532nm雷射束可具有約15度耦合角度。藉由另一波長，諸如，460nm，可使用較小光柵間距及/或較大耦合角度。
以上範例可說明可採用之方法。在一些實施中，光柵可在頂表面及底表面中之不同位置處。光柵1710(在基板1702上)與光柵1716(在基板1704上)在x方向上相互偏移。舉例而言，光柵1710可更靠近通道1706之中心。光柵1712(在基板1702上)與光柵1720(在基板1704上)在x方向上相互偏移。舉例而言，光柵1712可距通道1706之中心更遠。在一些實施中，位置之差可為大約100μm。
光柵可具有不同耦合角度。在一些實施中，光柵1710(在基板1702上)與光柵1716(在基板1704上)可具有不同耦合角度。舉例而言，可使用約1度之耦合角度移位。
在一些實施中，可皆使用位置之差及耦合角度之差。舉例而 言，光柵1710與光柵1716可具有約50μm的在x方向上之位置差，且可具有約0.5度之耦合角度差。
以上範例說明一系統可供包括平行於第二樣本表面(例如，基板1704之面向通道1706的表面)之第一樣本表面(例如，基板1702之面向通道1706的表面)之一流量槽(例如，流量槽1700)使用。第一光柵(例如，光柵1710)可耦合第一照射光之第一部分(例如，光束1714)以照射第一樣本表面。第二光柵(例如，光柵1716)可耦合第一照射光之第二部分(例如，當光束1714與1718來自同一光源時，光束1718)以照射第二樣本表面。
以上範例說明第一光柵(例如，光柵1710)可在第一照射光之第一部分(例如，光束1714)之行進方向(例如，x方向)上相對於第二光柵(例如，光柵1716)偏移。
以上範例說明一系統可供一流量槽(例如，流量槽1700)及一影像感測器使用，且流量槽上之照射區域可與影像感測器之視野共對齊。
可阻擋退出流量槽1700之光進入物鏡或以其他方式到達影像感測器。在一些實施中，可使用壁1722或其他障壁。壁1722可被稱作射束截止器。舉例而言，壁1722可經定位以便阻擋來自離開基板1702之平坦波導的光柵1712耦合之光束1714之光。舉例而言，壁1722可經定位以便阻擋來自離開基板1704之平坦波導的光柵1720耦合之光束1718之光。在一些實施中，壁1722可置放於返回光之路徑中在物鏡後之一位置處。
圖18至圖19展示使用一流量槽的雙表面成像之其他範例。在圖18中，以橫截面展示一流量槽1800。流量槽1800包括一防護玻璃罩基板1802、一平坦波導1804、在平坦波導1804上或鄰近處之一樣本1806、水緩衝劑1808、在平坦波導1812上或鄰近處之一樣本1810及一玻璃基板1814。舉例而言，防護玻璃罩基板1802可為一件相對薄之透明材料，其允許諸如藉由顯微鏡觀測樣本 1806。在一些實施中，平坦波導1804可被視為一頂表面，且平坦波導1812可被視為一底表面。
光柵1816形成於平坦波導1804中，且光柵1818形成於平坦波導1812中。光柵1816與1818可具有相互相同或不同的光柵設計。
照射光可耦合至平坦波導1804或1812。此處，光束1820傳播穿過防護玻璃罩基板1802、平坦波導1804及水緩衝劑1808。光束1820接著由光柵1818耦合至平坦波導1812內。舉例而言，光束1820可包括具有455nm、532nm及/或660nm波長之一或多個雷射束。類似地，光束1822傳播穿過防護玻璃罩基板1802，且由光柵1816耦合至平坦波導1804內。舉例而言，光束1822可包括具有455nm、532nm及/或660nm波長之一或多個雷射束。一或多個雷射可用以產生光束1820。一或多個雷射可用以產生光束1822。
可使用流量槽1800執行一或多個過程。在一些實施中，第一過程包含頂表面(此處，平坦波導1804之面向水緩衝劑1808的表面)藉由光束1822激發及成像。第二過程可包含底表面(此處，平坦波導1812之面向水緩衝劑1808的表面)藉由光束1820激發及成像。在此等過程之間，可執行物鏡之重新聚焦及耦合角度之調整。樣本1806(例如，頂表面)或樣本1810(例如，底表面)可在另一者之前成像。
其他光柵(圖中未示)可用以耦合離開平坦波導1804及1812中之一或多者之光。在一些實施中，可將另一光柵置放於平坦波導1804中及/或平坦波導1812中。此光柵可耦合離開各別平坦波導1804或1812之光。舉例而言，光柵1816與此額外光柵可在平坦波導1804之同一表面上形成平行的一對以界定用於感測器(例如，TDI感測器)之一照射區域。舉例而言，光柵1818與此額外光柵可在平坦波導1812之同一表面上形成平行的一對以界定用於感測器(例如，TDI感測器)之一照射區域。
替代使用額外光柵耦合離開平坦波導1804或1812之光，可使用處理殘餘光之另一方式。在一些實施中，光可在流量槽正上方受到阻擋。舉例而言，可將一金屬條帶及/或一吸收條帶應用於平坦波導以在光已照射樣本後阻擋光。
以上範例說明一流量槽(例如，流量槽1800)可包括一基板(例如，玻璃基板1814)以固持一樣本(例如，樣本1806及/或1810)。該流量槽可包括一第一平坦波導(例如，平坦波導1804)以引導用於樣本之第一光(例如，光束1822)。流量槽可包括第一光柵(例如，光柵1816)以耦合第一光。該流量槽可包括一第二平坦波導(例如，平坦波導1812)以引導用於樣本之第二光(例如，光束1820)。流量槽可包括第二光柵(例如，光柵1818)以耦合第二光。
以上範例說明一系統可供第一光柵(例如，光柵1816)將第一照射光之第一部分(例如，光束1822)耦合至之一第一平坦波導(例如，平坦波導1804)及第二光柵(例如，光柵1818)將第一照射光之第二部分(例如，光束1820)耦合至之一第二平坦波導(例如，平坦波導1812)使用(當光束1820與1822由同一光源產生時)。
樣本1806及/或1810可基於照射光產生一或多個螢光回應。舉例而言，樣本1806及/或1810可包括對照射光反應且產生一回應之一或多個螢光團。
圖19展示流量槽1924之部分之橫截面。在一些實施中，流量槽1924可包括一防護玻璃罩基板1926、一平坦波導1928、一水緩衝劑1930、一平坦波導1932及一玻璃基板1934。光柵1936形成於平坦波導1928中，且光柵1938形成於平坦波導1932中。光柵1936與1938可具有不同耦合角度。耦合角度可取決於平坦波導1904或1912之光柵週期、光柵深度及/或材料。在一些實施中，光 柵1936與1938具有不同光柵週期。舉例而言，光柵1936可具有比光柵1938短之光柵週期。
圖20展示流量槽照射之一範例影像2000。在一些實施中，影像2000可表示流量槽上之照射輪廓，該輪廓藉由一設計模型判定。舉例而言，雷射功率可分佈於一線性區域中，包括但不限於，在1200μm×20μm區域中。舉例而言，可使用4mW之雷射功率。
圖21A至圖21B展示過程2100之範例流程圖。過程2100可在一或多個系統中執行，包括但不限於，在一定序裝置中。舉例而言，可在本文中描述之任一系統中執行該過程2100。
在2110，可提供至少一個樣本。舉例而言，此可包括獲得基因物質之樣本，淨化該樣本，修改該樣本，及將該樣本複製至叢集內。該樣本可提供於一流量槽中，包括但不限於，在本文中描述的流量槽中之任一者中。
在2120，含有樣本之流量槽可定位於一定序系統中。舉例而言，在系統1600(圖16)中，可使用級1626及軌道1638將樣本1624相對於物鏡1622定位。
在2130，可聚焦物鏡。舉例而言，可聚焦圖16中之物鏡1622使得影像感測器1634及/或1636獲得來自樣本1624的成像光之清晰視圖。
在2140，可經由物鏡照射樣本。照射光可由在物鏡之視野外之光柵耦合至平坦波導內。此範例說明過程2100可涉及經由定位於影像感測器視野外之一光柵，經由物鏡饋入照射光且至一流量槽內。
在2150，可使用影像感測器經由物鏡捕獲成像光。
在2160，可判定成像會話是否完成。舉例而言，若正執行掃描過程且尚未對全部樣本成像，則過程2100可繼續至2170，在2170，執行重新定位。更改樣本與物鏡之相對位置。舉例而言，圖16中之樣本1624可由軌道1638 相對於物鏡1622前推。該過程可接著返回至2130，用於聚焦(必要時)，且其後在2140照射該之另一區域等等。
若在2160完成成像，則過程2100可繼續至2180，在2180，可建構一影像。舉例而言，可自由TDI感測器採取之各別線掃描建構影像。
圖21B係關於使用流量槽中之多個表面成像。在一些實施中，可替代過程2100中之2130-2150執行圖21B中展示之操作。在2130'，可將物鏡聚焦於一第一樣本表面。舉例而言，此可為圖18中的平坦波導2004之表面。在2140'，可照射第一樣本表面。舉例而言，此可使用圖18中之光束2021來進行。在2150'，可使用物鏡捕獲第一樣本表面之一影像。
在2130"，物鏡可聚焦於第二樣本表面上。舉例而言，此可為圖18中的平坦波導1812之表面。在2140"，可照射第二樣本表面。舉例而言，此可使用圖18中之光束2020進行。在2150"，可使用物鏡捕獲第二樣本表面之影像。
本範例說明一方法可包含一流量槽，該流量槽包括平行於一第二樣本表面之一第一樣本表面，且此方法可進一步包含將照射光之第一分量(例如，光束1822)引導至與第一樣本表面對準之第一光柵(例如，光柵1816)，及將照射光之第二分量(例如，光束1820)引導至與第二樣本表面對準之第二光柵(例如，光柵1818)。
本範例說明一方法可包含結合將照射光之第一分量引導(在2140')至第一光柵，調整物鏡(在2130')以聚焦於第一樣本表面，及結合將照射光之第二分量引導(在2140")至第二光柵，調整物鏡(在2130")以聚焦於第二樣本表面。
圖22示意性地展示用於雷射照射及螢光成像的一系統2200之一範例。系統2200被配置成執行針對平坦波導照射之自動對準。系統2200之一些態樣可與系統1600(圖16)之態樣相同或類似。舉例而言，系統2200之組件 1602-1638可為與系統1600中之對應的組件基本上相同的組件，及/或執行基本上相同功能。
如上參看圖16所提到，物鏡1622將引導照射光(有時被稱作激發光)至樣本1624，且接收在基本上相對方向上朝向組件1620傳播的來自樣本1624之成像光。在穿過平坦波導後，激發光亦可進入物鏡1622且朝向組件1620傳播。舉例而言，此情形可發生於平坦波導具有耦合離開流量槽之激發光的一退出光柵且不存在可阻擋激發光重新進入物鏡1622之射束截止器等時。
在組件1620，成像光與返回激發光可相互分開。舉例而言，可使用二向色鏡。成像光可朝向鏡1628引導，最終將由影像偵測器1624-36接收。另一方面，返回激發光可經朝向分光鏡2202引導。有時被稱作截光鏡之分光鏡2202朝向定位於影像感測器2206前之一投影透鏡2204改向自組件1620到達的返回激發光之一部分。在一些實施中，分光鏡2202具有一不對稱反射性塗層。舉例而言，分光鏡2204之各別側可塗佈為介電濾波器。
影像感測器2206(例如，電荷耦合器件)可經組態用於捕獲包括在其上之光柵的樣本1624之一影像，用於在評估待由影像偵測器1634-36捕獲的影像之品質時使用。舉例而言，若樣本1624未相對於影像偵測器1634-36之相機平面恰當地定向，則所得影像可具有較差品質。此可描述為在樣本平面與相機平面之間存在殘餘物。影像感測器2206可接著在判定是否應調整雷射束及/或樣本1624之定向(包括但不限於藉由以下描述之過程)時使用。此調整或校正可被稱作將樣本去傾斜。
該投影透鏡2204可用以控制由影像感測器2206捕獲之影像。此外，分光鏡2202在此處已置放於管透鏡1618(有時被稱作投影透鏡)與組件1620之間。此置放可提供自組件1620到達之返回激發光在進入影像感測器2206前不穿過管透鏡1618之優勢。返回激發光之放大率等因此不取決於針對該管透 鏡1618選擇之放大率。
圖23展示用於對準之過程2300之一範例流程圖。舉例而言，過程2300可在一系統(例如，系統2200)中執行以執行照射光相對於流量槽之自動對準，以得到改良之影像品質。可執行比所展示多或少的操作。可按一不同次序執行兩個或更多個操作。
在2310，可定位一流量槽。舉例而言，在系統2200中，可使用級1626定位樣本1624。
在2320，可提供照射。舉例而言，在系統2200中，可穿過物鏡1622且在樣本1624處引導來自雷射1602及/或1604之一或多個雷射束。
在2330，可捕獲激發光。在系統2200中之影像感測器2206可接收穿過投影透鏡2204的來自分光鏡2202之光。在一些實施中，由影像感測器2206捕獲之影像可等效於圖4中之平坦波導400之影像，該影像具有光柵402及404可見的足夠大之視野。如參看圖4描述，區域406對應於照射於光柵402的雷射束之反射。此外，區域410對應於退出光柵404的線408之雷射束。
在區域406及/或410中可見的光之量可為對準品質之指示。若區域406相對亮，則此可為照射雷射束之大部分正由光柵402反射(亦即，不耦合)之一指示。舉例而言，此可為照射雷射束不具有正確耦合角度且應進行調整之一指示。若區域410相對暗淡或黑暗，則此指示光未耦合至在光柵402處之平坦波導400內。類似地，此可為照射雷射束不具有正確耦合角度且應進行調整之一指示。
在2340，可執行流量槽與照射光之相對定向之調整。在系統2200中，藉由調整雷射1602或1604、鏡1606或1608、稜鏡1610或1612、鏡1516、組件1620及/或物鏡1622中之一或多者，可控制雷射束之定向。在系統2200中，可使用級1626調整樣本1624之定向。在一些實施中，可在多個自由度 中調整級1626。舉例而言，三個傾斜馬達可用於樣本1624之精確(例如，按奈米精確度或較大)定位。在2340處的相對定向之調整可影響照射雷射束至平坦波導內的耦合之品質。
在2350，可捕獲激發光。在一些實施中，可進行此以評估與在進行2340處之調整前相比，光至平坦波導400(圖4)內之耦合是否已改良。在一些實施中，若區域406在於2350處捕獲之激發光中已比在於2330處捕獲之激發光中變暗(例如，具有較小強度)，則此可為改良對準之指示。在一些實施中，若區域410在於2350處捕獲之激發光中已比在於2330處捕獲之激發光中變亮(例如，具有較大強度)，則此可為改良對準之指示。舉例而言，若區域406已變暗且區域410已變亮，則此可為改良之對準的特別顯著指示。因而，可將一或多個對準準則應用於捕獲之激發光。
激發光之捕獲可發生在分開的時刻，如由操作2330及2350指示，或其可連續地進行，例如，以流量槽之影像之實況饋入之形式。
在2360，可判定是否已符合至少一個對準準則。若如此，則過程2300可繼續至2380。舉例而言，自對準可結束於2380。
若在2360處尚未符合對準準則，則過程2300可繼續一或多個反覆。舉例而言，可與在2340處進行之調整類似地在2370處執行一或多個調整。過程2300可接著繼續至2350，在2350，可捕獲激發供更新之分析，等等。過程2300可繼續反覆，直至在2360處符合對準準則或發生另一終止。
圖24展示具有多個條帶2402、2404及2406的流量槽2400之一範例。條帶2402-06對應於存在樣本(例如，基因物質之叢集)之區域，這些樣本在成像過程中應被照射。流量槽2400包括光柵2408、2410、2412及2414。此處，光柵2408及2410充當條帶2402之邊界；光柵2410及2412充當條帶2404之邊界；且光柵2412及2414充當條帶2406之邊界。舉例而言，條帶2402-06中之每一 者可具有一或多個各別平坦波導，其允許光在鄰近光柵中之一者處進入，行進穿過平坦波導，且在相對光柵處退出。因而，條帶2402-06及光柵2408-14可置放於流量槽2400上以提供與影像感測器(例如，TDI感測器)之視野相容的大成像區域。此設計可節省流量槽面積，且藉此減少可消耗性成本。
光柵可充當一輸入光柵及一退出光柵兩者。舉例而言，光束2416在此處入射於光柵2410處之流量槽2400。光束2416在此處具有用於光柵2410之恰當耦合角度，且因此耦合至條帶2404之平坦波導內。條帶2404之另一側上的光柵2412耦合離開流量槽2400之光束2416。因而，對於光束2416，光柵2410可被視為進入光柵，且光柵2412可被視為退出光柵。
作為另一範例，光束2418在此處入射於光柵2412處之流量槽2400。光束2418此處具有用於光柵2412之恰當耦合角度及且因此耦合至條帶2404之平坦波導內。在條帶2404之另一側上的光柵2410耦合離開流量槽2400之光束2418。因而，對於光束2418，光柵2412可被視為進入光柵，且光柵2410可被視為退出光柵。成像過程可包含使用光柵2408-16中之對應者照射條帶2402-06之各別部分，及因此捕獲成像光，且接著移動流量槽2400以取而代之使用光柵2408-16中之對應者照射條帶2402-06之另一部分，及因此捕獲彼成像光。
貫穿本說明書使用之術語「實質上(substantially)」及「約(about)」用以描述及說明諸如歸因於處理之變化的小的波動。舉例而言，其可指小於或等於±5%，諸如小於或等於±2%、諸如小於或等於±1%、諸如小於或等於±0.5%、諸如小於或等於±0.2%、諸如小於或等於±0.1%、諸如小於或等於±0.05%。又，當在本文中使用時，諸如「一(a或an)」之不定冠詞意謂「至少一個(at least one)」。
應瞭解，前述概念及下文更詳細地論述之額外概念的所有組合(限制條件為此等概念並不相互不一致)預料為本文中所揭露之發明主題的部 分。詳言之，在本揭露內容結尾處出現之所主張主題的所有組合預料為本文所揭露之本發明主題的部分。
已描述許多實施。儘管如此，應理解可在不脫離本說明書之精神及範圍的情況下進行各種修改。
此外，圖中所描繪之邏輯流不需要所展示特定次序或依序次序以達成合乎需要之結果。此外，可提供其他過程，或可自描述之流程消除過程，且其他組件可添加至描述之系統，或自描述之系統移除。因此，其他實施在下列申請專利範圍之範圍內。
儘管如本文中所描述，已說明所描述實施之某些特徵，但熟習此項技術者現將想到許多修改、替代、改變及等效物。因此，應理解，所附申請專利範圍意欲涵蓋如落入實施之範圍內的所有此等修改及改變。應理解，已僅作為範例而非作為限制地提出此等修改及改變，且可進行形式及細節之各種改變。本文中所描述之裝置及/或方法之任何部分可以除了相互排斥組合之外的任何組合來組合。本文中所描述之實施可包括所描述之不同實施之功能、組件及/或特徵的各種組合及/或子組合。
100:光學佈局
102:雷射
104:雷射
106:鏡
108:射束成形光學器件
110:鏡
112:管透鏡
114:背焦平面
116:雷射束
118:雷射束
120:光軸
122:角度
124:角度
126:鏡
128:物鏡
130:流量槽
132:通道
134:物件平面
136:視野
138:光柵
140:光柵
142:射束
144:射束
146:射束
148:射束
150:訊號
152:影像感測器

Claims (31)

  1. 一種用於DNA定序的系統，其包含：物鏡；第一光源，其經由該物鏡饋入第一照射光且至安裝於該系統中之流量槽內，該第一照射光係使用該流量槽上之第一光柵饋入；及第一影像感測器，其使用該物鏡捕獲成像光，其中該第一光柵定位於該第一影像感測器之視野外；其中該第一光柵及第二光柵定位於該流量槽上；以及其中該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面、耦合該第一照射光之第一部分以照射該第一樣本表面之該第一光柵及耦合該第一照射光之第二部分以照射該第二樣本表面之該第二光柵。
  2. 如請求項1所述之系統，其中該第一光柵與該第二光柵具有不同耦合角度。
  3. 如請求項2所述之系統，其中該第一光柵與該第二光柵具有不同光柵週期。
  4. 如請求項1至3項中任一項所述之系統，其進一步包含第一平坦波導和第二平坦波導，其中該第一光柵將該第一照射光之該第一部分耦合至該第一平坦波導，及該第二光柵將該第一照射光之該第二部分耦合至該第二平坦波導。
  5. 如請求項1至3項中任一項所述之系統，其中該第一光柵在該第一照射光之該第一部分之行進方向上相對於該第二光柵偏移。
  6. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其中該第一光柵與該第二光柵定位於照射該流量槽的平坦波導之相對側上，該第一光柵將該第一照射光耦合至該平坦波導內，且該第二光柵耦合離開該平坦波導之該第一照射光。
  7. 如請求項6所述之系統，其進一步包含壁，該壁阻擋由該第二光柵耦合的離開該平坦波導之該第一照射光進入該物鏡。
  8. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其中該第一照射光包含第一波長之第一光束，該系統進一步包含經由該物鏡饋入第二照射光之第二光源，該第二照射光包含第二波長之第二光束。
  9. 如請求項8所述之系統，該第二光源經由該第一光柵經該物鏡將該第二照射光饋入至該流量槽內，該第一光柵具有針對該第一波長及該第二波長之對稱耦合角度。
  10. 如請求項8所述之系統，該第一光源將該第一光束導向該物鏡之第一側，且該第二光源將該第二光束導向該物鏡之與該第一側相對的第二側。
  11. 如請求項8所述之系統，其進一步包含定位於該第一光源及該第二光源後且該物鏡前之第一鏡及管透鏡，其中在自該第一鏡至該管透鏡之傳播中的該第一光束及該第二光束之各別角度反映在該第一光柵上的該第一光束及該第二光束之對應入射角。
  12. 如請求項11所述之系統，其進一步包含定位於該第一光源後且在該第一鏡前之第二鏡，該第二鏡提供在該第一光柵上的該第一光束與該第二光束之空間分離。
  13. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其中該流量槽具有由包括該第一光柵之各別光柵界限之多個條帶，且其中該系統使用這些各別光柵中之至少一者作為進入光柵及退出光柵兩者。
  14. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其中該流量槽之波導材料包括Ta2O5。
  15. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其中該第一影像感測器包 含時間延遲與整合感測器，該系統進一步包含固持該流量槽之可移動級。
  16. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其進一步包含熱級以固持該流量槽，該熱級提供熱控制。
  17. 如請求項1至3中任一項所述之系統，其進一步包含第二影像感測器，其捕獲至少該第一光柵及在該流量槽中之平坦波導之影像，其中該系統使用對準準則評估這些影像。
  18. 如請求項1至3中任一項所述之系統，該光具有波長以觸發來自該流量槽中之樣本的螢光回應。
  19. 一種用於DNA定序的流量槽，其包含：基板，其固持樣本；第一平坦波導，其導引用於該樣本之第一光；第一光柵，其耦合該第一光；第二平坦波導，其導引用於該樣本之第二光；及第二光柵，其耦合該第二光；以及其中該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面、耦合該第一光以照射該第一樣本表面之該第一光柵及耦合該第二光以照射該第二樣本表面之該第二光柵。
  20. 如請求項19所述之流量槽，其中該第一光柵定位於該第一平坦波導上，且其中該第二光柵定位於該第二平坦波導上。
  21. 如請求項19或20所述之流量槽，其中該第一光柵與該第二光柵具有不同耦合角度。
  22. 如請求項21所述之流量槽，其中該第一光柵與該第二光柵具有不同光柵週期。
  23. 如請求項19或20所述之流量槽，其中該第一光柵在該第一光之 行進方向上相對於該第二光柵偏移。
  24. 如請求項19或20所述之流量槽，該第一光柵將該第一光耦合至該第一波導內，該第二光柵將該第二光耦合至該第二波導內，該流量槽進一步包含耦合離開該第一平坦波導之該第一光的第三光柵，及耦合離開該第二平坦波導之該第二光的第四光柵。
  25. 一種用於DNA定序的方法，其包含：使用定位於影像感測器視野外之第一光柵饋入經由物鏡且至流量槽內之照射光；及使用該物鏡捕獲成像光；其中該流量槽包括平行於第二樣本表面之第一樣本表面，該方法進一步包含將該照射光之第一分量引導至與該第一樣本表面對準之第一光柵，及將該照射光之第二分量引導至與該第二樣本表面對準之第二光柵。
  26. 如請求項25所述之方法，其進一步包含結合將該照射光之該第一分量引導至該第一光柵來調整該物鏡以聚焦於該第一樣本表面，及結合將該照射光之該第二分量引導至該第二光柵來調整該物鏡以聚焦於該第二樣本表面。
  27. 如請求項25或26所述之方法，其中該照射光包含第一波長之第一光束，及第二波長之第二光束，該方法進一步包含將該第一光束導向該物鏡之第一側，及將該第二光束導向該物鏡之與該第一側相對的第二側。
  28. 如請求項27所述之方法，其進一步包含在該照射光退出該流量槽後阻擋該照射光進入該物鏡。
  29. 如請求項25或26所述之方法，其中熱級固持該流量槽，該方法進一步包含使用該流量槽提供該流量槽之熱控制。
  30. 如請求項25或26所述之方法，其中該流量槽具有由包括該第一 光柵之各別光柵界限之多個條帶，該方法進一步包含使用這些各別光柵中之至少一者作為進入光柵及退出光柵兩者。
  31. 如請求項25或26所述之方法，其進一步包含執行評估由該第一光柵進行的耦合之品質之對準過程。
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