TWI747567B - 褐藻醣膠組合物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明是關於褐藻醣膠應用領域，特別是關於一種褐藻醣膠組合物及其應用於抑制肌肉纖維化之用途。

Description

褐藻醣膠組合物及其用途

本發明是關於褐藻醣膠應用領域，特別是關於一種褐藻醣膠組合物及其應用於抑制肌肉纖維化之用途。

化學藥物或放射治療這些癌症或其他疾病使用的治療手段，這些外在刺激有一定機率使患者產生如皮膚紅腫、破皮、潰爛、纖維化等副作用，這些副作用不僅對患者造成生理疼痛，同時也削減治療信心。

正常組織在受到外在刺激時的初期反應，從視覺上可以明顯觀察到紅腫或潰爛現象，尤其是不同程度的急性發炎或慢性發炎反應，這些複雜且交互強化的發炎反應，出現在不同種類型的細胞之間。微觀來說，巨噬細胞因外在刺激產生細胞激素IL-1、IL-6和TNF-α，而這些細胞激素又再作用於纖維母細胞上，進而促使組織纖維化 （Liu et al., 2006）。

放射治療是癌症療程其中一種使組織纖維化的原因。放射治療是將放射能量準確的送到細胞核中，藉由破壞細胞核內的DNA雙股螺旋體，而使得DNA鍵斷裂、細胞因而失去再生的功能。在癌症放射治療過程中腫瘤細胞與正常細胞均勻接受同樣放射線劑量，導致正常細胞亦受到損傷。這些外源性的放射治療引起之生理副作用包含肺臟、腎臟、肝臟、肌肉或皮膚等組織產生纖維化損傷 （Rodemann and Bamberg, 1995），通常輕者造成口腔黏膜受損、吞嚥困難、皮膚紅腫潰爛、肌肉組織纖維化無法彎曲、聲帶纖維化失去聲音等，重者則可導致病患器官功能衰竭致死 （Peeters et al., 2006）。

放射線照射誘導纖維母細胞提早分化是導致組織出現纖維化的主要原因；分裂期的纖維母細胞（Mitotic fibroblast）原本約需經過40次分裂才會轉為分裂期後的纖維母細胞（Post mitotic fibroblast），但在1~10 Gy的X射線後照射，僅經過3～4次分裂即提早轉變成具有功能性的纖維母細胞，而這些功能性纖維母細胞的細胞壽命也比正常的縮短了40~45%，膠原蛋白type I、III和V的合成也大為增加。由於放射治療破壞了分裂細胞和功能細胞的平衡關係，使得組織產生纖維化 （Fournier et al., 2001; Burger et al., 1998）。此外，放療所引起的發炎現象，也會透過一連串的細胞激素的調控，進而造成纖維化 （Maggio et al., 2015）。

早先前已有學者Jian et al. （2005）對267例鼻咽癌放療後進行了觀察，發現所有患者均表現為頸部放射纖維化，其中約24.34％的患者為重度，其放射後症狀包括頸肌纖維化，三頭肌，斜頸，頸肌無力，肌張力障礙，肩痛和肩功能障礙。Zhou et al. （2018）研究指出: 單劑量90 Gy輻射可能導致大鼠肌肉纖維化。照射後隨著時間流逝，肌肉纖維化的嚴重程度和TGF-β1的表達增加。與對照組相比，可發現線粒體明顯腫脹，肌絲紊亂和溶解，內皮細胞明顯腫脹，血管通透性增加，血細胞減少，纖維化組織沉積。

轉化生長因子 （transforming growth factor-β, TGF-β） 被認為是參與誘導纖維化的重要因子之一，當TGF-β大量表現，且與細胞膜上的TGF-β receptor接合後，會活化細胞內的Smad3磷酸化，進而與Smad4結合進入細胞核中進行下游基因調控，使膠原蛋白type I基因大量表現 （Yano et al., 2012）。

另有研究發現經放射以後，TGF-β1的表現量在鼠類的腎、肺、皮膚的纖維母細胞中，都有不同程度的提高，且TGF-β1可以誘導細胞週期因數蛋白激酶的抑制因子CDKN1A（p21）的表現，使細胞停滯於G1 phase，進而導致成纖維細胞的分化 （Anscher, 2005）。此外，結締組織生長因子 （connective tissue growth factor, CTGF）與膠原蛋白在輻射誘導的腸纖維化中有重要作用，在接受放療的腸癌病人其組織中的CTGF有明顯提高，TGF-β1及膠原蛋白含量均有所增加 （Vozenin-Brotons et al., 2003）。

有鑒於組織纖維化之初期具可逆性，如何抑制組織纖維化，為目前輔助癌症放射治療之研究要點。臨床研究雖證實一種名為Amifostine、美國藥品檢驗局通過的有效的放射中保護正常組織的藥物 （Eisbruch, 2011）可改善放射線治療所引起的中度到重度的口腔乾燥副作用（Wagneret al., 1998），但卻不能抑制放射線治療中最嚴重的副作用之一「組織纖維化」的發生，因此若能在組織纖維化之初期便可達到抑制組織纖維化的效果，對於器官組織之生理功能及外觀，甚至是涉及纖維化之相關疾病治療療程都將有極大的助益。目前實需要更有效、更安全且可於早期抑制肌肉纖維化的內用或外服藥物。

本發明提供一種組合物用於製備治療一目標部位肌肉之纖維化的藥物之用途，其中該組合物包含治療有效量之一褐藻醣膠。

根據上述構想，其中該目標部位肌肉選自由橫紋肌、平滑肌與心肌組成之群組。

根據上述構想，其中該目標部位肌肉位於一空腔部位，其中該空腔部位選自由口腔、消化管腔、胸腔、腹腔、骨盆腔與人工腔室組成之群組。

根據上述構想，其中該目標部位肌肉受放射線照射而纖維化。

根據上述構想，其中相比未治療者，該目標部位保有肌肉伸縮性。

根據上述構想，其中相比未治療者，該目標部位保有肌肉強度。

根據上述構想，其中該褐藻醣膠包含10-100%的岩藻醣。

根據上述構想，其中該褐藻醣膠包含20-50%硫酸鹽。

根據上述構想，其中該褐藻醣膠中岩藻醣與硫酸鹽之比例介於1：5至4：1。

根據上述構想，其中該組合物包含不少於0.1-10%的該褐藻醣膠。

根據上述構想，其中該組合物係調配成敷劑。

根據上述構想，其中該組合物為緩釋凝膠製劑。

根據上述構想，其中該組合物為注射式凝膠組成物。

根據上述構想，其中該組合物包含一交聯的第一聚合物與水，以及一第二聚合物，其中該第一聚合物與該第二聚合物選自由玻尿酸及褐藻酸鈉組成的群組。

根據上述構想，其中該組合物的黏度範圍介於120-500 C.P.

本發明將藉由以下圖式、實施例和描述，使所述技術領域具有通常知識者更容易理解本案所公開的前述內容、其它特性與多數優點。

本案公開了關於一種褐藻醣膠組合物及其用途。所述技術領域具有通常知識者將能夠參考下述實施例與描述據以實現本案。

褐藻醣膠的 萃取

在一實施例中，將褐藻在50℃下乾燥後研磨成粉末。每100 g乾燥褐藻加入5 L蒸餾水，並在100℃下煮沸30分鐘後將萃取物在10,000 xg下離心20分鐘。在上清液中加入4 M CaCl2反應1小時以分離出藻酸（Alginic acid），然後以10,000 xg再次離心20 分鐘。將多醣產物以去離子水透析，然後以1：5（V / V）的比例添加95%酒精使其沉澱，以10,000 xg下離心20分鐘取沉澱物凍乾後備用。將所得之凍乾物以陰離子交換樹脂(anion-exchange chromatography)分離純化，而後使用酵素進行水解，收集分子量1 KDa~10 KDa之水解產物，並在95℃下加熱20分鐘使酵素失活後凍乾，即為褐藻醣膠。

在一實施例中，褐藻醣膠1克（g）中包含100-1000微克（mg）的岩藻醣。

在一實施例中，褐藻醣膠中包含20-50%硫酸鹽。

在另一實施例中，褐藻醣膠中岩藻醣與硫酸鹽之比例介於1：5至4：1之間。

褐藻醣膠組合 物的製備

在一實施例中，將多元醇如丙二醇（Propylene Glycol）與純水均勻混合，而後加入褐藻醣膠持續攪拌至完全溶解完成製備。

在另一實施例中，將多元醇與純水均勻混合，而後加入褐藻醣膠持續攪拌至完全溶解，並添加玻尿酸及褐藻酸鈉，均勻攪拌完成製備。

在部分實施例中，褐藻醣膠組合物包含至少0.1-10%的褐藻醣膠成分。

在部分實施例中，褐藻醣膠組合物包含至少0.1-5%多元醇。

在一實施例中，褐藻醣膠組合物包含一交聯的第一聚合物與水，以及一第二聚合物，其中該第一聚合物選自多元醇及褐藻醣膠組成的群組；該第二聚合物選自由玻尿酸及褐藻酸鈉組成的群組。

在一實施例中，褐藻醣膠組合物包含至少0.1-3%玻尿酸。

在一實施例中，褐藻醣膠組合物包含至少0.1-3%褐藻酸鈉。

在一實施例中，進行黏度測定，將海帶發酵物，以轉子L1 (Viscosity range centipoise：15-2000 mPa．s)、50 rpm的條件下以黏度計測試，每次樣品之測試溫度皆介於29±2℃。黏度單位Pa·s = kg·m⁻¹·s⁻¹，1 Pa·s = 10 P = 1000 cP。

在一實施例中，褐藻醣膠組合物的黏度範圍介於120-500 cP。

在另一實施例中，褐藻醣膠組合物為緩釋水凝膠劑型，可以注射筒的方式承載，注敷於橫紋肌、平滑肌與心肌等肌肉之管壁、管腔中。

褐藻醣膠抑制 肌肉細胞纖維化的效果

在一實施例中，使用史道二氏（Sprague Dawley，SD）大鼠進行動物試驗評估褐藻醣膠治療肌肉纖維化之效果。

在一實施例中，每組5隻SD大鼠，為使肌肉纖維化，放射線照射劑量為40 Gy/mouse，照射後肢（大腿）部位1.0 x 1.0 cm ²的面積，於照射後30天（30 Day）每日於照射部位塗抹0.5 mL之5 %小分子褐藻醣膠（Low molecular weight fucoidan, LMF）。

在一實施例中，放射線照射引發腿部肌肉纖維化並於一側給予褐藻醣膠治療之試驗動物如圖1所示，左側腿部肌肉經放射線照射其腿部拉伸長度較小；右側塗抹褐藻醣膠治療後可增加其拉伸長度，顯示褐藻醣膠改善肌肉纖維化的情形。

在另一實施例中，參考Stone （1984）及Horton et al. （2013）方法修飾後進行，將待試驗動物麻醉後以俯臥方式置於測量儀上，以固定重量將後肢往後拉伸，測量後肢可拉伸長度。照射前之拉伸距離為L0，而後每10天測量一次其後肢拉伸距離為L1。後肢拉伸百分比（Hind limb contraction%）=（L1/L0）*100%。

在另一實施例中，結果顯示褐藻醣膠改善了大鼠後肢肌肉收縮和肌肉纖維化的情形。 分別在第0、10、20和30天，統計纖維化並給予褐藻醣膠治療組以及纖維化組其後肢收縮率％，結果如圖2。數據顯示平均值±SD（n = 5）。 字母表示在每個實驗中比較時p ＜0.05的顯著差異。

在一實施例中，取得肌肉組織樣本，保存於10％福馬林液，以石臘包埋固定。組織病理染色：將5μm石臘切片以蘇木素及伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin，H&E）染色，在顯微鏡下觀察，結果如圖3所示。

在一實施例中，組織切片結果顯示，褐藻醣膠可抑制放射線所誘導大鼠肌肉纖維化的情形。 左側為放射線照射引發肌肉組織纖維化，肌肉結締組織增加，呈現很淺的粉紅色或白色；右側給予褐藻醣膠後可觀察到肌肉纖維化減少，纖維結締組織相較照射組少的情形。

在一實施例中，褐藻醣膠組合物可以為緩釋水凝膠劑型，以注射筒的方式承載，注入敷於纖維化之口腔壁、腸壁以及子宮壁肌肉上，可改善空腔內肌肉纖維化的情形。

在一實施例中，以細胞實驗觀察褐藻醣膠抑制肌肉細胞纖維化之效果，採用骨骼肌細胞株為C2C12 Muscle Cell，購自食品工業研究所生物資源保存及研究中心，皆屬於貼附型細胞（Adherent-type cell）。培養條件為37℃及5%CO2，細胞繼代為兩天一次。

在一實施例中，將4x10 ⁴細胞培養於6 cm培養皿用於逆轉錄聚合酶鏈鎖反應；將10 ⁶細胞培養於10 cm培養皿用於西方轉漬法。細胞培養經過24小時後確定細胞已貼附盤面，移除培養基並以1X PBS清洗，更換含有TGF-β （誘導纖維化）之培養基，再經過24小時的培養，比照先前步驟清洗後更換含有褐藻醣膠之培養基，並經過24小時培養後收穫細胞。

在一實施例中，實驗組別為三組如下：

Groups 組別	TGF-β1 （5 ng/mL）纖維化	LMF（75 μg/mL） 褐藻醣膠治療
控制組（Control, C）	-	-
TGF-β1組（TGF-β1, T）	+	-
TGF-β1 +小分子褐藻醣膠組 （TGF-β1 + LMF, F）	+	+

在一實施例中，以西方墨點法Western blot進行分析。將肌肉細胞以PBS清洗，而後在冰上以RIPA buffer裂解液 （內含磷酸酶和蛋白酶抑制劑），進行組織均質及蛋白質萃取，在4℃下以12000 rpm離心10 min除去不溶性碎屑，收集上清液並用Bradford試劑測定蛋白質含量，使用10% SDS PAGE gels分離樣品，並轉移硝酸纖維素膜上，隨後用含有5%脫脂乳的TBST在室溫下封閉膜1 hr，並與膠原蛋白-I（Collagen-I）、纖維接合素（Fibronectin）一級抗體隔夜培養，然後再與二級抗體IgG培養1小時，最後用光化學顯影。

實驗數據使用Student’s t-test進行統計分析，顯著差異以*p ＜ 0.05 ; **p＜0.01 ; ***p＜0.001進行標示。

在一實施例中，細胞試驗結果顯示褐藻醣膠可抑制肌肉細胞因TGF-β誘導所堆積之纖維化產物 （Collagen I及Fibronectin），如圖4所示。

此外，本發明涉及放射線誘發纖維化的一種方法；肌肉組織反應的測定方法；褐藻醣膠治療器官組織纖維化的方法及機制等內容在Radiation-induced neck fibrosis in patients with nasopharyngeal carcinoma. Chin J Radiat Mediation Prot. 2005;03:253–55.；Radiation-induced muscle fibrosis rat model: establishment and valuation. Radiation Oncology, 13（1）, 160.；Leg contracture in mice: An assay of normal tissue response. International Journal of Radiation Oncology, Biology and Physics 10: 1053–1061.；Oligo-fucoidan prevents renal tubulointerstitial fibrosis by inhibiting the CD44 signal pathway. Sci Rep, 7, 40183.；Therapies from fucoidan; multifunctional marine polymers. Mar Drugs, 9（10）, 1731-1760.；Protective effect of fucoidan from Fucus vesiculosus on liver fibrosis via the TGF-beta1/Smad pathway-mediated inhibition of extracellular matrix and autophagy. Drug Des Devel Ther, 10, 619-630.；Late side effects of short-course preoperative radiotherapy combined with total mesorectal excision for rectal cancer: increased bowel dysfunction in irradiated patients--a Dutch colorectal cancer group study. J Clin Oncol, 23（25）, 6199-6206.文獻中進行了披露，考慮到本發明的目的，文中引用的所有參考文獻透過引用的方式併入在本文中。

本發明所屬技術領域中具有通常知識者將可藉由有限的試驗，而能實施本發明內容。本發明所包含的一個或多個實施例，其係包含其一或多個或所有組員表現於與其相關的產品或用途上。本發明保護的範圍不限於所公開之特定實施例，而是包括所有落入申請專利範圍內的所有實施例。

圖1顯示給予褐藻醣膠治療與否，小鼠後腿肌肉外觀上的變化。

圖2為隨著時間變化小鼠後腿肌肉拉伸百分比統計圖。

圖3顯示給予褐藻醣膠治療與否，小鼠肌肉組織上的變化。

圖4顯示褐藻醣膠可抑制肌肉細胞纖維化相關蛋白質之表現。

Claims (14)

1. 一種組合物用於製備治療一目標部位肌肉之纖維化的藥物之用途，其中，該組合物包含一交聯的第一聚合物與水，以及一第二聚合物，以及其中，該第一聚合物係由多元醇及褐藻醣膠所組成，且該第二聚合物選自由玻尿酸及褐藻酸鈉所組成的群組。
2. 如請求項1所述之用途，其中該目標部位肌肉選自由橫紋肌、平滑肌與心肌組成之群組。
3. 如請求項1所述之用途，其中該目標部位肌肉位於一空腔部位，其中該空腔部位選自由口腔、消化管腔、胸腔、腹腔、骨盆腔與人工腔室組成之群組。
4. 如請求項1所述之用途，其中該目標部位肌肉受放射線照射而纖維化。
5. 如請求項1所述之用途，其中相比未治療者，該目標部位保有肌肉伸縮性。
6. 如請求項1所述之用途，其中相比未治療者，該目標部位保有肌肉強度。
7. 如請求項1-6任一項所述之用途，其中該褐藻醣膠包含10-100%的岩藻醣。
8. 如請求項1-6任一項所述之用途，其中該褐藻醣膠包含20-50%硫酸鹽。
9. 如請求項1-6任一項所述之用途，其中該褐藻醣膠中岩藻醣與硫酸鹽之比例介於1：5至4：1。
10. 如請求項1-6任一項所述之用途，其中該組合物包含0.1-10%的該褐藻醣膠。
11. 如請求項1所述之用途，其中該組合物係調配成敷劑。
12. 如請求項1所述之用途，其中該組合物為緩釋凝膠製劑。
13. 如請求項1所述之用途，其中該組合物為注射式凝膠組成物。
14. 如請求項1所述之用途，其中該組合物的黏度範圍介於120-500cP。

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