TWI746069B - 3d細胞培養膠體的套組及其用於3d細胞培養的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,3D細胞培養膠體的套組包含A凝膠材料、C緩衝液與D緩衝液;進行3D細胞培養的方法包含,將細胞加入含有A凝膠材料的混合液中,於低溫作用後獲得一含細胞的膠體,於膠體上加入C緩衝液以進行交聯,移除C緩衝液並加入生長培養液,靜置培養直到細胞於膠體內形成細胞球狀體;又,本發明進一步以D緩衝液溶解膠體,以將培養後的細胞取出進行分析;藉此,本發明之3D細胞培養膠體的套組,使用方便且適用於進行多種細胞株的3D細胞培養。
Description
本發明關於一種3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,本發明的套組使用方便且適用於進行多種細胞株的3D細胞培養。
於體外培養細胞的技術已經相當成熟,因此目前生物研究中常使用細胞株作為研究的模式,且目前細胞株的培養方法大多為2D的細胞培養法,亦即將細胞株平面培養於培養盤的底部;然而,於生物體內,大多數的細胞生長環境為立體的環境,因此2D的細胞培養狀態與細胞在生物體內生長的狀態仍然具有相當大的差距;為了模擬細胞於生物體內生長的狀況,目前已開發出將細胞培養於立體培養基中的3D細胞培養研究模式,例如中國專利第CN 105695413(B)號專利,為一種用於腫瘤個體化醫療的三維細胞培養材料及其製備方法,其係使用基質膠、低黏度藻朊酸鈉溶液、透明質酸鈉溶液與中粘度藻朊酸鈉溶液等材料作為細胞培養基的基質,進行三維細胞培養。但是,現有3D細胞培養所使用的立體培養基大多使用基質膠(Matrigel)作為材料,其配置方法繁複、成分複雜且不易控制其膠體形成的狀況及濃度,且其成膠溫度低,室溫操作時容易凝固而操作失敗,再者以基質膠配置的立體培養基的成本也相當高昂,因此目前進行3D細胞培養仍相當不容易。
今,發明人有鑑於現有目前進行3D細胞培養的材料與方法於實際使用仍有不足之處,於是乃一本孜孜不倦之精神,並藉由其豐富專業知識及多年之實務經驗所輔佐,而加以改善,並據此研創出本發明。
本發明關於一種3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,其中3D細胞培養膠體的套組包含一A凝膠材料、一C緩衝液與一D緩衝液;A凝膠材料包含0.5~3 wt%之海藻酸鈉(Sodium Alginate),2.5~15 wt%之明膠(Gelatin)、0.5~2 wt%之一HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid)緩衝液以及剩餘百分比之純水;C緩衝液包含0.2~10 wt%之二價陽離子鹽類,0.01~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水;以及D緩衝液包含1~10 wt%之乙二胺四乙酸二鈉(Disodium ethylenediaminetetraacetate•2H
2O),0.1~1 wt%之氫氧化鈉(NaOH),0.05~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水。
本發明以3D細胞培養膠體的套組進行3D細胞培養的方法,包含:(a)將一細胞懸浮於一生長培養液中,以獲得一細胞懸浮液,再將該細胞懸浮液與一A凝膠材料以體積比1:1之比例混合,以獲得一混合溶液;(b)將一培養盤放置於一低溫元件上,並於該培養盤的培養孔洞中加入該混合溶液,靜置1~7分鐘以形成一膠體;(c)於該膠體上加入一C緩衝液,並靜置10-20分鐘以進行交聯;(d)將C緩衝液置換為細胞的生長培養液;以及(e)將培養盤放置於一所需溫度培養,直至該細胞於膠體內形成細胞球狀體(spheroid),其中培養盤係每日更換一次生長培養液。
於本發明之一實施例中,C緩衝液之二價陽離子鹽類為氯化鍶、磷酸鈣、氯化鈣、與硫酸鈣其中至少之一。
於本發明之一實施例中,HEPES緩衝液為0.5~3 M之HEPES緩衝液。
於本發明之一實施例中,本發明之3D細胞培養膠體的套組進一步包括一導溫片(thermal conductive sheet)。
於本發明之一實施例中,於步驟(e)之後再進行一步驟(f),步驟(f)係使用一磷酸鹽緩衝液(1 X PBS buffer)清洗該細胞球狀體,移除磷酸鹽緩衝液後,再加入一D緩衝液與該細胞球狀體混合均勻,並於室溫作用5分鐘以使膠體溶解,其中D緩衝液包含1~10 wt%之乙二胺四乙酸二鈉(Disodium ethylenediaminetetraacetate•2H
2O),0.1~1 wt%之氫氧化鈉,0.05~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水。
於本發明之一實施例中,進一步於步驟(f)之後進行一步驟(g),步驟(g)係使用該磷酸鹽緩衝液清洗該溶解後的膠體溶液,離心後移除上清液並收集細胞沉澱物並分析該細胞沉澱物中的細胞。
於本發明之一實施例中,步驟(b)所述之低溫元件,為一導溫片,且將該導溫片放置於一低溫裝置上進行降溫所獲得。
於本發明之一實施例中,該培養細胞的所需溫度介於30~37℃。
於本發明之一實施例中,混合溶液的細胞密度介於10
4~10
7cells/mL。
藉此,本發明之3D細胞培養膠體的套組,使用上相當方便,且適用於進行多種的細胞株3D細胞培養;此外本發明亦包含可將細胞膠體溶解的D緩衝液,因此於培養後欲進行後續的細胞分析也十分便利。
為令本發明之技術手段其所能達成之效果,能夠有更完整且清楚的揭露,茲藉由下述具體實施例,詳細說明本發明可實際應用之範圍,但不意欲以任何形式限制本發明之範圍,請一併參閱揭露之圖式。
本發明關於一種3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,使用方便且可以適用於多種細胞株的3D細胞培養;此外,本發明亦包含將膠體溶解的緩衝液,故於進行後續細胞分析時也相當方便。
本發明之3D細胞培養膠體的套組主要包含A凝膠材料、C緩衝液與D緩衝液;進一步的,本發明之套組可進一步包含一低溫元件,例如一導溫片(thermal conductive sheet),以於進行3D細胞培養的過程中,協助膠體形成。
本發明3D細胞培養膠體的套組的A凝膠材料包含海藻酸鈉(Sodium Alginate),明膠、HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水;
另,C緩衝液包含0.2~10 wt%之二價陽離子鹽類,例如氯化鍶(Strontium Chloride•6H
2O)、磷酸鈣、氯化鈣、或硫酸鈣,0.01~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水;於本發明之一較佳實施例中,C緩衝液包含0.5 wt%之氯化鍶、0.094 wt%之1 M的HEPES緩衝液,以及剩餘百分比之純水;為方便使用,亦可以將C緩衝液配置成高濃度的濃縮型C緩衝液,例如配置成10倍濃縮的C緩衝液,使用時再稀釋即可;於以下的實施例中,於C緩衝液中添加氯化鍶作為二價陽離子鹽類進行測試。
又,D緩衝液中包含1~10 wt%之乙二胺四乙酸二鈉(Disodium ethylenediaminetetraacetate•2H
2O),0.1~1 wt%之氫氧化鈉(NaOH),0.05~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水;於本案之一較佳實施例中,D緩衝液包含1.53 wt%之乙二胺四乙酸二鈉,0.164 wt%之氫氧化鈉、0.082 wt%之1 M的HEPES緩衝液,以及剩餘百分比之純水;為方便使用,亦可以將D緩衝液配置成高濃度的濃縮型D緩衝液,例如配置成10倍濃度的D緩衝液,使用時再稀釋即可。
於開始細胞培養前,先將所需要使用的材料準備好,如下:將A凝膠材料放置於37℃水浴槽中大約10分鐘,使其徹底溶解;接著,將C緩衝液的10倍濃縮液,以不含有血清(serum-free)的細胞培養液稀釋為1倍的C緩衝液,值得注意的是,此步驟不可以使用1 X PBS緩衝液稀釋C緩衝液的10倍濃縮液。又,以1 X PBS緩衝液,稀釋D緩衝液的10倍濃縮液,以獲得1倍的D緩衝液;需注意,1倍的C緩衝液與的1倍的D緩衝液都是使用前才稀釋。
請參見第一圖,以本案之3D細胞培養膠體的套組進行細胞培養的方法如下:
步驟(a):取0.5 mL的A凝膠材料(1)於一試管中,接著將欲培養的細胞懸浮於生長培養液(growth medium)中,以獲得一細胞懸浮液,再將0.5 mL的細胞懸浮液加入含有0.5 mL A凝膠材料(1)的試管中,與A凝膠材料(1)充分混合,以獲得一混合溶液(2),此混合溶液(2)中的細胞密度可視所培養的細胞進行適當的調整,例如貼附型的細胞株,其培養的細胞以可以達到80%的培養盤滿度為佳,又以細胞密度介於10
4~10
7cells/mL為較常使用的細胞密度,而此實施例中混合溶液(2)中的細胞密度為10
5cells/mL;
步驟(b):將一導溫片(3)放置於一低溫裝置(4)上,以使導溫片(3)迅速且均勻的降溫,導溫片(3)可為但不限於金屬片,且此低溫裝置(4)可為但不限於冰磚或是可重複使用的冰包等物品;接著將一培養盤(5)放置於已降溫完成的導溫片(3)上,並於該培養盤(5)的培養孔洞中加入20~50 μL的混合溶液(2),靜置1~7分鐘以形成一膠體(6);為確定膠體(6)形成的狀況,可以利用微量吸量管的吸管尖端輕柔的碰觸膠體(6)表面,若膠體(6)已形成,則在吸管尖端離開膠體(6)表面時,膠體(6)表面不會被向外拉動;
步驟(c):膠體形成後,於膠體(6)上加入1 mL冰過、溫度約為4℃的1倍C緩衝液(7),並使C緩衝液(7)蓋過膠體(6),再靜置10~20分鐘以進行交聯,此實施例中係靜置15分鐘;
步驟(d):小心將1倍C緩衝液(7)移除,並加入用於培養此細胞的生長培養液(8);以及
步驟(e):將培養盤(5)放置於一所需溫度培養與條件,且每日更換一次生長培養液(8),直至細胞於膠體(6)內形成細胞球狀體(spheroid);其中,步驟(e)所述的所需溫度,是指培養該細胞的較佳溫度,以培養哺乳類動物細胞而言,37℃為常使用的培養溫度;又,培養時間也視細胞種類而定,一般而言,於培養3~14天之後,便可以觀察到膠體(6)內細胞所形成的細胞球狀體。
進一步的,當細胞長成後,欲將膠體(6)內的細胞取出以進行後續的觀察分析時,可進一步於步驟(e)之後,執行步驟(f)與步驟(g);請參見第二圖,步驟(f)與步驟(g)如下:
步驟(f):將培養盤(5)內的生長培養液(8)移除,再使用一冰過、溫度約為4℃的磷酸鹽緩衝液(9),例如1 X PBS緩衝液小心的清洗膠體(6),再移除磷酸鹽緩衝液(9),此清洗步驟至少執行一次;接著,加入冰過、溫度約為4℃的D緩衝液(10),使D緩衝液(10)與膠體(6)混合均勻,並於室溫作用大約5分鐘以上以使膠體(6)溶解;以及
步驟(g):將溶解後的膠體與細胞混合液自培養盤(5)內取出,並移入一離心管(11)中,再加入磷酸鹽緩衝液(9),以清洗溶解後的膠體與細胞混合液,接著以不傷害細胞的轉速進行離心步驟,例如以1000 rpm離心10分鐘,再移除上清液,便可收集細胞沉澱物(12)。
若想獲得單顆的細胞以進一步分析,可以再使用胰蛋白酶溶液(trypsin-EDTA溶液)處理細胞沉澱物(12),以將細胞球狀體中的細胞群分離,以獲得單顆的細胞。
實施例一、A凝膠材料成膠測試
請參見以下表一,本案發明人測試A凝膠材料中,海藻酸鈉(Sodium Alginate),明膠、HEPES緩衝液的比例對於成膠情形的影響;請參見表一,表一提供了七種配方,並針對每一種配方所製得的膠體進行檢測,七種配方的A凝膠材料都可以製作出膠體;其中「膠體滑動」是指膠體是否會在相對培養盤底部滑動,「光學透光度」是將所形成的膠體放在寫有字的紙上,觀察是否可以通過膠體看到紙上的字,而「不崩解時間」是指可以維持膠體型態的時間;根據表一,七種配方所形成的膠體,都具有良好的透光度,且不崩解的時間至少大於12天,確實可適用於3D細胞培養。又,以下的實施例是以表一中配方6的A凝膠材料形成的膠體進行3D細胞培養。
表一
海藻酸鈉 (wt%) | 明膠 (wt%) | HEPES (M) | 膠體形成 | 膠體滑動 | 光學透光度 | 不崩解時間(天) | |
配方1 | 1.5 | 10 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >14 |
配方2 | 1 | 4 | 0.01 | 可 | 會 | 透明 | >12 |
配方3 | 2 | 8 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >14 |
配方4 | 1.5 | 6 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >14 |
配方5 | 1 | 6 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >12 |
配方6 | 1.5 | 8 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >14 |
配方7 | 3 | 12 | 0.01 | 可 | 不會 | 透明 | >28 |
實施例二、細胞存活率測試
將Huh-7細胞分別以2D培養方法,以及以本發明之套組進行3D細胞培養,於培養48小時之後,進行MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide)測試,以評估存活細胞的比例;MTT測試為本領域常使用的細胞存活測試方法,故於此不再贅述其進行步驟。請參見第三圖,以本發明之套組進行培養的Huh-7細胞,培養後的活細胞數與初始培養細胞相比,有明顯上升的情形,表示本發明之套組對於細胞不具毒性,確實可用於細胞培養。
實施例三、細胞球狀體生長大小測試
本實施例中,分別將Huh-7細胞,以初始細胞量為1 X 10
5cells的數量,分別以基質膠(Matrigel)以及本發明之套組進行3D細胞培養,並觀察二組別中,細胞球狀體的生長情形;請參見第四圖,以基質膠(Matrigel)培養的細胞,於培養後第4天並沒有觀察到細胞球狀體,而以本發明套組培養的組別,於培養後第4天就可以觀察到細胞球狀體的生成,且細胞球狀體的直徑約為20 mm;此外,於培養後第7日觀察,以基質膠(Matrigel)培養的組別,其細胞球狀體的直徑約為50 mm,但以本發明套組培養的組別,細胞球狀體的直徑已達100 mm,顯然與基質膠相比,本發明之套組進行3D細胞培養,能更快看到細胞球狀體的生成,且細胞球狀體的生長情形也更佳。
實施例四、可培養細胞種類
請參見表二與第五圖,為發明人使用本發明3D細胞套組培養膠體的套組,培養多種癌細胞的實驗結果,以及其所形成的細胞球狀體的時間。根據表二與第五圖,所測試的細胞株都可以生長形成細胞球狀體,且可以觀察到細胞球狀體的時間都不大於5天;表示本發明之套組可適用於多種類的細胞株,且都能在短時間之內就觀察到細胞球狀體的形成。
表二
細胞株 | 培養初始細胞密度 | 細胞球狀體形成時間(天) |
Huh 7 | 1 X 10 5cells/mL | 3 |
RD | 1 X 10 5cells/mL | 4 |
Hep-2 | 1 X 10 5cells/mL | 4 |
H292 | 1 X 10 5cells/mL | 4 |
AGS | 3 X 10 5cells/mL | 3 |
SCM-1 | 3 X 10 5cells/mL | 3 |
SK-OV-3 | 3 X 10 5cells/mL | 4 |
OVCAR3 | 3 X 10 5cells/mL | 4 |
PANC-1 | 3 X 10 5cells/mL | 4 |
AsPC-1 | 3 X 10 5cells/mL | 5 |
綜上,本發明揭露一種3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,成膠步驟係分成兩階段操作,先於低溫環境,如10℃以下的操作環境使A凝膠材料形成一膠體之後,再於室溫條件下使膠體與C緩衝液交聯,以獲得用於3D細胞培養的立體培養基,此二階段操作的方法可以避免操作時膠體凝結速度太快而影響立體培養基的製備;本發明3D細胞培養膠體的套組操作簡單,膠體成形所需要的時間短且容易控制所形成的膠體硬度,此外本發明所產生的膠體具有水凝膠(hydrogel)的網狀結構,適合用於大多數的細胞株的3D培養,因此本發明的3D細胞培養膠體的套組應用範圍也相當廣泛;再者,本發明亦以實施例證實,本發明的3D細胞培養膠體的套組,與習知使用基質膠(Matrigel)進行3D細胞培養相比,能夠更快速地觀察到細胞球狀體的生成,更能提高實驗效率。
綜上所述,本發明3D細胞培養膠體的套組及其用於3D細胞培養的方法,的確能藉由上述所揭露之實施例,達到所預期之使用功效,且本發明亦未曾公開於申請前,誠已完全符合專利法之規定與要求。爰依法提出發明專利之申請,懇請惠予審查,並賜准專利,則實感德便。
惟,上述所揭之說明,僅為本發明之較佳實施例,非為限定本發明之保護範圍;其;大凡熟悉該項技藝之人士,其所依本發明之特徵範疇,所作之其它等效變化或修飾,皆應視為不脫離本發明之設計範疇。
1:A凝膠材料
2:混合溶液
3:導溫片
4:低溫裝置
5:培養盤
6:膠體
7:C緩衝液
8:生長培養液
9:磷酸鹽緩衝液
10:D緩衝液
11:離心管
12:細胞沉澱物
第一圖:本發明進行3D細胞培養的方法流程示意圖。
第二圖:本發明將培養細胞之膠體溶解以分析細胞的方法流程示意圖。
第三圖:以本發明培養細胞後之存活率測試圖。
第四圖:以基質膠與本發明進行3D細胞培養後之顯微鏡照片。
第五圖:以本發明培養細胞所形成之細胞球狀體顯微鏡照片。
無
1:A凝膠材料
2:混合溶液
3:導溫片
4:低溫裝置
5:培養盤
6:膠體
7:C緩衝液
8:生長培養液
Claims (10)
- 一種3D細胞培養膠體的套組,係包含: 一A凝膠材料,包含0.5~3 wt%之海藻酸鈉(Sodium Alginate),2.5~15 wt%之明膠、0.5~2 wt%之一HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水; 一C緩衝液,包含0.2~10 wt%之二價陽離子鹽類,0.01~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水;以及 一D緩衝液,包含1~10 wt%之乙二胺四乙酸二鈉(Disodium ethylenediaminetetraacetate•2H 2O),0.1~1 wt%之氫氧化鈉,0.05~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水。
- 如請求項1所述之3D細胞培養膠體的套組,其中該C緩衝液之二價陽離子鹽類為氯化鍶、磷酸鈣、氯化鈣、與硫酸鈣其中至少之一。
- 如請求項1所述之3D細胞培養膠體的套組,其中該HEPES緩衝液為0.5~3 M之HEPES緩衝液。
- 如請求項1所述之3D細胞培養膠體的套組,係進一步包括一導溫片(thermal conductive sheet)。
- 一種使用如請求項1所述的套組進行3D細胞培養的方法,係包括以下步驟: (a)將一細胞懸浮於一生長培養液中,以獲得一細胞懸浮液,再將該細胞懸浮液與一A凝膠材料以體積比1:1之比例混合,以獲得一混合溶液; (b)將一培養盤放置於一低溫元件上,並於該培養盤之各孔洞中加入該混合溶液,靜置1~7分鐘以形成一膠體; (c)於該膠體上加入一C緩衝液,並靜置10-20分鐘以進行交聯; (d)將該C緩衝液置換為該生長培養液;以及 (e)將該培養盤放置於一所需溫度培養,直至該細胞於該膠體內形成細胞球狀體(spheroid),其中該培養盤係每日更換一次該生長培養液。
- 如請求項5所述之方法,其中該A凝膠材料包含0.5~2 wt%之海藻酸鈉(Sodium Alginate),2.5~15 wt%之明膠、0.5~2 wt%之一HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水,且該C緩衝液包含包含0.2~10 wt%之二價陽離子鹽類,0.01~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水。
- 如請求項5所述之方法,進一步於該步驟(e)後進行一步驟(f),該步驟(f)係使用一磷酸鹽緩衝液清洗該細胞球狀體,於移除磷酸鹽緩衝液後,再加入一D緩衝液與該細胞球狀體混合均勻,並於室溫作用5分鐘以使該膠體溶解,其中該D緩衝液包含1~10 wt%之乙二胺四乙酸二鈉(Disodium ethylenediaminetetraacetate•2H 2O),0.1~1 wt%之氫氧化鈉,0.05~1 wt%之該HEPES緩衝液以及剩餘百分比之純水。
- 如請求項7所述之方法,進一步於該步驟(f)之後進行一步驟(g),該步驟(g)係使用該磷酸鹽緩衝液清洗該溶解後的膠體,離心後移除上清液並收集一細胞沉澱物並分析該細胞沉澱物中的細胞。
- 如請求項5所述之方法,其中該步驟(b)所述之低溫元件,是將一導溫片放置於一低溫裝置上進行降溫所獲得,且該所需溫度介於30~37℃,以及該混合溶液的細胞密度介於10 4~10 7cells/mL。
- 如請求項6所述之方法,其中該C緩衝液之二價陽離子鹽類為氯化鍶、磷酸鈣、氯化鈣、與硫酸鈣其中至少之一。
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TW109124447A TWI746069B (zh) | 2020-07-20 | 2020-07-20 | 3d細胞培養膠體的套組及其用於3d細胞培養的方法 |
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CN101773683A (zh) * | 2010-03-03 | 2010-07-14 | 天津大学 | 壳聚糖修饰的海藻酸盐水凝胶三维多孔支架及其制备方法 |
CN106148285A (zh) * | 2015-04-03 | 2016-11-23 | 广东工业大学 | 一种用于抗肿瘤药物筛选系统的三维细胞培养基质及其制备 |
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Title |
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TWI842554B (zh) | 2023-06-06 | 2024-05-11 | 基可生醫股份有限公司 | 異體移植膠體套組及其使用方法 |
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