TWI731357B - 醣複合疫苗、製造方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文揭露一種醣複合疫苗，其提供能對抗革蘭氏陰性菌感染的保護力、一種製造該醣複合疫苗的方法，以及使用該醣複合疫苗治療細菌感染的用途。本揭露的醣複合疫苗有具化學式(I)的結構：

Description

醣複合疫苗、製造方法及其用途
依37 C.F.R. 1.77(B)(6)條，針對發明人或共同發明人先前揭露發明內容之相關聲明
本申請案所述發明內容之標的，部分載於發明人吳世雄、吳宗益、李益銘及楊鳳玲已發表之文章〈鮑氏不動桿菌胞外多醣帶有的Pseudaminic Acid（Pse）對在噬菌體輔助下製造具高抗原性醣複合疫苗扮演關鍵角色〉（“Pseudaminic Acid on Exopolysaccharide of Acinetobacter baumannii Plays a Critical Role in Phage-Assisted Preparation of Glycoconjugate Vaccine with High Antigenicity”）。該文登載於2018年7月2日出刊之J. Am. Chem. Soc. 140, 8639-8643，由本發明四位發明團隊成員起草及/或撰寫完成，全文以引用方式併入本文中。該文內容亦載於同步提出之資訊揭露陳報書（Information Disclosure Statement），該陳報書係依Fed. Reg. 11076 第78號準則(Feb. 14, 2013)發布。
申請案相關文獻
本申請案主張2018年12月6日提交的美國專利臨時申請案第62/775,938號之權利，該臨時申請案全文內容以引用方式併入本文中。
1. 本發明所屬技術領域
本揭露大致關於一種醣複合疫苗，其可對抗革蘭氏陰性菌造成的感染，以及關於一種製造該醣複合疫苗的方法。
2. 本發明相關技術
疫苗有助於抵抗各式各樣的感染性疾病。許多疫苗係由注入受試者體內之去活性或減活性病原體所製造，而另一類稱為「次單位疫苗」的疫苗，則由表現於病原體表面上的蛋白質或多醣製成。一般偏好使用次單位疫苗而非去活性或減活性病原體疫苗，因為前者引發的副作用較少。研發及製造次單位疫苗時，需要辨識並分離病原體結構中的保護性抗原。目前發現，多醣抗原與蛋白質載體共軛後可提升免疫生成性，其中細菌多醣與載體蛋白以化學鍵相連。
經證實，醣複合疫苗可有效對抗不同種類的疾病，特別是由抗生素抗藥性細菌引發的感染性疾病。有鑑於此，製造醣複合物時必須選擇能誘發強力免疫反應，且具廣泛菌株涵蓋範圍的目標細菌胞外多醣（EPS）。另外，根據先前研究的結果，醣複合物帶有適當的EPS重複單元時，可較帶有整段EPS時表現出更佳的殺菌活性。然而，使用傳統化學水解法分解EPS時會產生異質寡醣片段，降低醣複合物的可重複性。雖然透過特殊設計寡醣的化學合成可生成同質寡醣，但過程耗時且產率低。
本文揭露一種製造細菌EPS同質寡醣片段的新方法，可使用具高致病毒性的野生型革蘭氏陰性菌（如鮑氏不動桿菌）菌株（包括具抗藥性的菌株）製造保護性疫苗。此醣複合疫苗不但易於製造，亦可有效抵抗後續的感染，並具備消滅活菌的效果。
下文針對本揭露內容進行概要說明，以使讀者掌握基本概念。本發明內容並非針對本揭露內容進行廣泛概述，且不指明本發明之關鍵/重要元素，亦不界定本發明之主張權利範圍。以下內容旨在簡要說明本文揭露的某些概念，以提示如後所述更詳細的發明內容說明。
根據本揭露內容之一態樣，提供一種醣複合疫苗，該疫苗可抗革蘭氏陰性菌，使受試者不被感染。該醣複合疫苗具化學式(I)的結構
Figure 02_image001
其中， L係馬來醯亞胺型聯結劑；且 n及m分別為介於2至20之間的整數或非整數。
根據本揭露內容的具體實施例，在化學式(I)中，馬來醯亞胺型聯結劑可選自由馬來醯亞胺己醯基（maleimidocaproyl, mc）、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽（maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate, mcc）及琥珀醯亞胺 3-溴乙醯胺丙酸鹽（succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate, SBAP）所組成的群組。
根據本揭露內容的具體實施例，在化學式(I)中，載體蛋白可選自由白喉棒狀桿菌197（Corynebacterium diphtheria 197, CRM 197）的白喉毒素（diphtheria, DT）突變體、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）的外毒素A（EPA）、白喉類毒素（diphtheria toxoid）、破傷風類毒素（tetanus toxoid）、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin）、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元（CTB）、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌（C. jejuni ）AcrA、空腸曲狀桿菌天然醣蛋白所組成的群組。
根據本揭露內容的一較佳具體實施例，在化學式(I)中，馬來醯亞胺型聯結劑係馬來醯亞胺己醯基，而載體蛋白係CRM197的DT突變體，n為4.8且m為16。
根據選擇性具體實施例，具化學式(I)的醣複合疫苗可進一步包括佐劑。
根據本揭露內容之另一態樣，提供一種製造具化學式(I)的本發明醣複合疫苗的方法。該方法包括以下步驟：
(a) 利用噬菌體尾刺蛋白（TSP）將分離細菌的胞外多醣（EPS）分解，以生成寡醣1 ；
(b) 以碳酸銨處理寡醣1 ，接著以巰基引入劑處理寡醣1 ，以生成含巰基的寡醣2 ；
(c) 將寡醣2 與具有複數個馬來醯亞胺型聯結劑的載體蛋白透過馬來醯亞胺反應耦合，該馬來醯亞胺反應發生於寡醣2 的巰基及載體蛋白中複數個馬來醯亞胺型聯結劑的馬來醯亞胺基之間；及
(d) 添加足量之半胱胺酸，使步驟(c)中的馬來醯亞胺反應停止，以生成具化學式(I)的醣複合疫苗。
Figure 02_image005
Figure 02_image007
根據本揭露內容的某些具體實施例，在步驟(a)中，EPS係自鮑氏不動桿菌菌株54149（Ab -54149）分離而出。
適合用於步驟(a)中的噬菌體尾刺蛋白之實例，包括但不限於噬菌體AB6尾刺蛋白、噬菌體P22尾刺蛋白、噬菌體SF6尾刺蛋白、噬菌體HK620尾刺蛋白、噬菌體T4尾刺蛋白及噬菌體T7尾刺蛋白。在一較佳具體實施例中，使用噬菌體AB6尾刺蛋白分解Ab -54149的EPS，以生成寡醣1 。
根據本揭露的某些具體實施例，在步驟(b)中，巰基引入劑係3,3'-二硫代雙(磺酸琥珀醯亞胺基丙酸酯)（DTSSP）、硫代雙[琥珀醯亞胺基丙酸酯]（DSP）、2-亞胺基硫雜環戊烷（2-iminothiolane）、N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯硫代乙酸酯（N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA）、N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯硫代丙酸酯（N-succinimidyl S-acetylthiopropionate, SATP）或SAT(PEG)4 。
根據本揭露內容的具體實施例，在化學式(I)中，馬來醯亞胺型聯結劑可選自由馬來醯亞胺己醯基（mc）、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽（mcc）及琥珀醯亞胺 3-溴乙醯胺丙酸鹽（SBAP）所組成的群組。
根據本揭露內容的具體實施例，在化學式(I)中，載體蛋白可選自由白喉棒狀桿菌197（Corynebacterium diphtheria 197, CRM 197）的白喉毒素（diphtheria, DT）突變體、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）的外毒素A（EPA）、白喉類毒素（diphtheria toxoid）、破傷風類毒素（tetanus toxoid）、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin）、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元（CTB）、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌（C. jejuni ）AcrA、空腸曲狀桿菌天然醣蛋白所組成的群組。
根據本揭露內容的較佳具體實施例，在化學式(I)中，馬來醯亞胺型聯結劑係馬來醯亞胺己醯基，而載體蛋白係CRM197的DT突變體，n為4.8且m為16。
根據本揭露內容的又一態樣，提供一種使受試者免於細菌感染的方法。該方法的步驟包括向受試者施予具有效量且具化學式(I)的本發明醣複合疫苗。
根據本揭露內容的具體實施例，該細菌可為猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149（Acinetobactor baumannii 54149）、猶他游動放線菌VKM Ac-674（Actinoplanes utahensis VKM Ac-674）、豚鼠氣單胞菌UU51（Aeromonas caviae UU51）、空腸曲狀桿菌81-176（Campylobacter jejuni 81-176）、空腸曲狀桿菌11168（Campylobacter jejuni 11168）、空腸彎曲菌VC167（Campylobacter coli VC167）、噬纖維菌（Cellulophaga funcicola ）、大腸桿菌O136（Escherichia coli O136）、幽門螺旋桿菌1061（Helicobector pylori 1061）、幽門螺旋桿菌26695（Helicobector pylori 26695）、幽門螺旋桿菌11687（Helicobector pylori 11687）、韓國生工菌屬VKM（Kribbella spp. VKM）、鮭魚立克次菌（Piscirickettsia salmonis ）、普通變形桿菌O39（Proteus vulgaris O39）、綠膿桿菌O7a（Pseudomonas aeruginosa O7a）、綠膿桿菌O7b（Pseudomonas aeruginosa O7b）、綠膿桿菌O7d（Pseudomonas aeruginosa O7d）、綠膿桿菌O9a（Pseudomonas aeruginosa O9a）、綠膿桿菌O9b（Pseudomonas aeruginosa O9b）、綠膿桿菌O10a（Pseudomonas aeruginosa O10a）、綠膿桿菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）、綠膿桿菌PA14（Pseudomonas aeruginosa PA14）、大西洋假單胞菌LAM 14165（Pseudomonas atlantica LAM 14165）、大西洋假單胞菌T9（Pseudomonas atlantica T9）、特異假交替單胞菌KMM 638（Pseudoalteromonas distincta KMM 638）、根瘤菌屬NGR234（Rhizobium sp. NGR234）、鮑氏志賀氏菌第七型（Shigella boydii type 7）、費氏中華根瘤菌 HH103（Sinorhizobium fredii HH103）、苜蓿中華根瘤菌Rm1021（Sinorhizobium meliloti Rm1021）、霍亂弧菌O:2（Vibrio cholera O:2）、海洋弧菌 YJ016（Vibrio vulnificus YJ016）或海洋弧菌27562（Vibrio vulnificus 27562）的任何一者。根據本揭露內容的另一些具體實施例，該細菌係有抗藥性的菌株。
根據本揭露內容的又一態樣，提供一種治療受試者體內細菌感染的方法。該方法的步驟包括向受試者施予具有效量且具化學式(I)的本發明醣複合疫苗。
根據本揭露內容的具體實施例，該細菌可為猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149（Acinetobactor baumannii 54149）、猶他游動放線菌VKM Ac-674（Actinoplanes utahensis VKM Ac-674）、豚鼠氣單胞菌UU51（Aeromonas caviae UU51）、空腸曲狀桿菌81-176（Campylobacter jejuni 81-176）、空腸曲狀桿菌11168（Campylobacter jejuni 11168）、空腸彎曲菌VC167（Campylobacter coli VC167）、噬纖維菌（Cellulophaga funcicola ）、大腸桿菌O136（Escherichia coli O136）、幽門螺旋桿菌1061（Helicobector pylori 1061）、幽門螺旋桿菌26695（Helicobector pylori 26695）、幽門螺旋桿菌11687（Helicobector pylori 11687）、韓國生工菌屬VKM（Kribbella spp. VKM）、鮭魚立克次菌（Piscirickettsia salmonis ）、普通變形桿菌O39（Proteus vulgaris O39）、綠膿桿菌O7a（Pseudomonas aeruginosa O7a）、綠膿桿菌O7b（Pseudomonas aeruginosa O7b）、綠膿桿菌O7d（Pseudomonas aeruginosa O7d）、綠膿桿菌O9a（Pseudomonas aeruginosa O9a）、綠膿桿菌O9b（Pseudomonas aeruginosa O9b）、綠膿桿菌O10a（Pseudomonas aeruginosa O10a）、綠膿桿菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）、綠膿桿菌PA14（Pseudomonas aeruginosa PA14）、大西洋假單胞菌LAM 14165（Pseudomonas atlantica LAM 14165）、大西洋假單胞菌T9（Pseudomonas atlantica T9）、特異假交替單胞菌KMM 638（Pseudoalteromonas distincta KMM 638）、根瘤菌屬NGR234（Rhizobium sp. NGR234）、鮑氏志賀氏菌第七型（Shigella boydii type 7）、費氏中華根瘤菌 HH103（Sinorhizobium fredii HH103）、苜蓿中華根瘤菌Rm1021（Sinorhizobium meliloti Rm1021）、霍亂弧菌O:2（Vibrio cholera O:2）、海洋弧菌 YJ016（Vibrio vulnificus YJ016）或海洋弧菌27562（Vibrio vulnificus 27562）的任何一者。
根據本揭露內容的最佳具體實施例，該方法進一步包括向受試者施予至少一抗菌製劑的步驟，以改善或減緩感染的相關症狀。
根據本揭露內容的具體實施例，抗菌製劑可為阿莫西林（amoxicillin）、安比西林（ampicillin）、阿奇黴素（azithromycin）、克拉維酸（clavulanic acid）、頭孢福辛（cefuroxime）、喜復黴素（cefixime）、頭孢泊肟（cefpodoxime）、頭孢曲松（ceftriaxone）、去氧羥四環素（doxycycline）、氟喹諾酮類抗生素（luoroquinolones）、巨環類抗生素（macrolides）或莫西沙星（moxifloxacin）的任何一者。
根據本揭露內容的具體實施例，該受試者為人類。
參照下文的實施方式說明與對應的所附圖式後，本揭露內容的諸多特徵及優點將更顯而易見。
以下的實施方式說明與對應的所附圖式，係用以說明本發明的實例，而非用以表示可建構或利用本發明實例的唯一方式。實施方式描述本發明實例的功能，以及建構並操作實例的步驟次序。然而，相同或相等的功能及次序可透過不同實例實現。
1. 定義
為敘述方便，以下整理本揭露內容所使用的特定用語。除非另有說明，本文使用的所有技術及科學術語皆與本發明所屬技術領域中具通常知識者的理解一致。
本文所使用的「佐劑」一詞，係指能藉由調節免疫細胞活性的方式，提升對抗原特異性免疫反應的物質。佐劑的實例包括但不限於佛氏佐劑、細菌細胞壁衍生物（如胞壁醯二肽(MDP)）、微脂體等。因此，佐劑係一種免疫調節劑。
本文所使用的「治療」一詞，係意圖指涉獲得預期的藥物效果及/或生理效果，如延遲或抑制癌症轉移。前述效果可為預防性的，即完全或部分預防疾病或其症狀，及/或為治療性的，即部分或完全治癒疾病及/或該疾病引起的副作用。本文所使用的「治療」一詞，包括針對哺乳類動物（尤其人類）體內的疾病所進行的預防性、治療性或舒緩性治療；且包括：(1) 能使個體不產生疾病或狀況（如癌症或心臟病）的預防性、治療性或舒緩性治療，該個體可能較易罹患但未被診斷出罹患該疾病；(2) 抑制疾病（如透過阻礙疾病進程的方式）或 (3) 緩解疾病（如透過減少該疾病症狀的方式）。
本文所使用的「給藥」、「施予」等詞可互相替代，其係指藥物運輸方式，包括但不限於對遭細菌感染的受試者藉靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內或皮下途徑施予製劑，該製劑提供受試者免疫保護能力。
本文所使用的「有效量」一詞，係指在必要時間內施打，以達成治療細菌感染預期目標的有效劑量。舉例而言，可降低、預防、延緩或抑制、阻礙細菌感染的製劑（即本發明的醣複合疫苗）可有效避免細菌散布至他處及/或生長。具有效量的製劑不必然能治癒疾病或狀況，但提供一種疾病或狀況的療法，使疾病或狀況的發作時間延後，或阻礙、預防疾病或狀況發生，或改善該疾病或狀況的症狀。具體的有效量或足夠量隨不同因素而異，包括待治療的狀況類型、病患的生理條件（如病患的身體質量、年齡或性別）、待治療的哺乳類動物或動物類型、治療時程、同時進行的療程（如有）的性質，以及具體使用的製劑等。有效量的表示方式如活性製劑的總質量（如克、毫克或微克）或活性製劑對身體質量的比率，如每公斤毫克數（mg/kg）。有效量可切分為一、二或多個具合適劑型的劑量，以在設定時間內給藥一、二或多次。
本文所使用的「受試者」或「病患」等詞可互相替代，且意指可施予本案化合物進行治療的哺乳類動物（包括人類）。「哺乳類動物」一詞係指哺乳綱包含的所有物種，包括人類、靈長類、家養及畜牧動物，如兔、豬、羊及牛；及動物園、競賽或寵物動物；及嚙齒類動物，如小鼠和大鼠。此外，除非另有說明，「受試者」或「病患」等詞皆包括公母兩性。因此，「受試者」或「病患」等詞包含任何可因本揭露內容中療法受惠的哺乳類動物。「受試者」或「病患」的實例包括但不限於人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥及禽類。在一較佳具體實施例中，受試者為人類。
用來框定本案數據的數值範圍及參數皆為近似值，儘管如此，具體實例中所提供的數值皆如實記載。然而，任何數值原先必然包含各測量方法中的標準差所導致的某些誤差。另外，本案所使用的「約」一詞，一般指位於一給定數值或範圍上下10%、5%、1%或0.5%。對本發明所屬技術領域中具通常知識者而言，「約」一詞亦指位於平均值的可接受標準誤差內。所有數值範圍、數量、數值及百分比，如本文所揭露的器材、時間長度、溫度、操作條件、數量比率等相關數字，除操作性實例中所述或另有說明者，皆應被理解為帶有「約」一詞的約略值。因此，除非有意思完全相反的說明，本揭露內容及所附請求項給定的數值參數皆為可按預期變動的近似值。在最低限度下，各數值參數至少應根據給定之有效位數並使用一般四捨五入法判讀。
除非另有說明，本文所使用的「一」、「一個」、「該」等單數修飾語亦指涉複數。
2. 較佳具體實施例的實施方式
本揭露內容係基於（至少部分基於）一項意外發現，即帶有合適細菌胞外多醣重複單元的醣複合物，呈現的殺菌活性較帶有完整細菌胞外多醣的醣複合物更高。因此，本揭露內容其中一態樣的目標為提供一種醣複合疫苗，其特徵為具有與載體蛋白以共價鍵結合的同質細菌寡醣片段。本揭露內容的其他態樣至少包括製造本發明醣複合疫苗的方法，以及使用本發明醣複合疫苗，以給予受試者對抗體內細菌感染的免疫保護能力，及/或治療遭細菌感染受試者的方法。
2.1 醣複合疫苗
根據本揭露內容的一態樣，提供一種醣複合疫苗，其具化學式(I)的結構
Figure 02_image001
其中， L係一馬來醯亞胺型聯結劑；及 n及m分別為介於2至20之間的整數或非整數。
在化學式(I)中，馬來醯亞胺型聯結劑（L）可為馬來醯亞胺己醯基（maleimidocaproyl, mc）、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽（maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate, mcc）及琥珀醯亞胺 3-溴乙醯胺丙酸鹽（succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate）任何一者。較佳地，馬來醯亞胺型聯結劑（L）為馬來醯亞胺己醯基（maleimidocaproyl, mc）。
載體蛋白可選自由白喉棒狀桿菌197（Corynebacterium diphtheriae , CRM 197）的白喉毒素（diphtheria, DT）突變體、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）的外毒素A（EPA）、白喉類毒素（diphtheria toxoid）、破傷風類毒素（tetanus toxoid）、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin）、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元（CTB）、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌（C. jejuni ）AcrA、空腸曲狀桿菌天然醣蛋白所組成的群組。較佳地，載體蛋白為CRM197的突變體。
根據本揭露內容的具體實施例，在化學式(I)中，n及m分別為值介於2至20之間的整數或非整數，如2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、14.0、14.1、14.2、14.3、14.4、14.5、14.6、14.7、14.8、14.9、15.0、15.1、15.2、15.3、15.4、15.5、15.6、15.7、15.8、15.9、16.0、16.1、16.2、16.3、16.4、16.5、16.6、16.7、16.8、16.9、17.0、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5、17.6、17.7、17.8、17.9、18.0、18.1、18.2、18.3、18.4、18.5、18.6、18.7、18.8、18.9、19.0、19.1、19.2、19.3、19.4、19.5、19.6、19.7、19.8、19.9及20.0。在某些具體實施例中，n為介於2至20之間的非整數（如4.8），而m為介於2至20之間的整數（如16）。
根據本揭露內容的一較佳具體實施例，在具化學式(I)的醣複合疫苗中，馬來醯亞胺型聯結劑L係馬來醯亞胺己醯基，而載體蛋白係DT突變體CRM197，n為4.8且m為16。
根據選擇性具體實施例，具化學式(I)的醣複合疫苗可進一步包括一佐劑。在某些具體實施例中，該佐劑係佛氏佐劑。在其他具體實施例中，該佐劑係細菌細胞壁衍生物（如胞壁醯二肽(MDP)）。
2.2 醣複合疫苗的製造
根據本揭露內容之另一態樣，提供一種製造具化學式(I)的本發明醣複合疫苗的方法。該醣複合疫苗特徵為具有與載體蛋白以共價鍵結合的同質細菌寡醣片段。該方法包括以下步驟：
(a) 利用噬菌體尾刺蛋白（TSP）分解自細菌分離的胞外多醣（EPS），以生成寡醣1 ；
(b) 以碳酸銨處理寡醣1 ，接著以巰基引入劑處理寡醣1 ，以生成含巰基的寡醣2 ；
(c) 將寡醣2 與具有複數個馬來醯亞胺型聯結劑的載體蛋白透過馬來醯亞胺反應耦合，該馬來醯亞胺反應發生於寡醣2 的巰基及載體蛋白中複數個馬來醯亞胺型聯結劑的馬來醯亞胺基之間；及
(d) 添加足量之半胱胺酸，使步驟(c)中的馬來醯亞胺反應停止，以生成具化學式(I)的醣複合疫苗。
Figure 02_image005
，及
Figure 02_image007
一般而言，製造2.1段所述的醣複合疫苗時，係透過將細菌抗原（較佳為鮑氏不動桿菌的同質細菌寡醣）與載體蛋白連結的方法製造。為達此目的，在本揭露內容的某些具體實施例中，首先將EPS自鮑氏不動桿菌菌株54149（Ab -54149）分離，分離方法如本揭露內容操作實例所述，或為本發明所屬技術領域具通常知識者習知的任何方法。接著，使用噬菌體尾刺蛋白（TSP）分解分離出的Ab -54149 EPS，以製造適合作為抗原的同質細菌寡醣。適合本案方法使用的噬菌體尾刺蛋白之實例，包括但不限於噬菌體AB6 TSP、噬菌體P22 TSP、噬菌體SF6 TSP、噬菌體HK620 TSP、噬菌體T4 TSP及噬菌體T7 TSP。在一較佳具體實施例中，使用噬菌體AB6 TSP（ΦAB6TSP）分解Ab -54149的EPS，並生成同質寡醣1 （步驟(a)）。值得注意的是，本發明方法中的步驟(a)製造細菌抗原時，不需要添加傳統的化學水解製劑，如酸（例如乙酸）或鹼。
根據本揭露內容的具體實施例，步驟(a)生成的寡醣1 由兩個→3)-β-N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)-(1→3)-[β-葡萄糖 (Glc)-(1→6)]-β-半乳糖 (Gal)-(1→重複單元組成，且各重複單元具有以Pse-(2→6)-α-Glc鏈結與Glc連結的Pse。
為達製造疫苗的目的，將細菌抗原或寡醣1 修飾為具有巰基，並將載體蛋白修飾為具有馬來醯亞胺基，以使兩者透過馬來醯亞胺反應耦合，該反應發生於該細菌抗原的巰基及載體蛋白中的馬來醯亞胺基之間。
因此，在步驟(b)中，首先以飽和碳酸銨溶液處理寡醣1 ，以將GalNAc環上的游離羥基轉換為一級胺，再將一級胺與巰基引入劑反應，藉此產生具巰基的寡醣2 。適合用於本內容方法中的巰基引入劑之實例，包括但不限於3,3'-二硫代雙(磺酸琥珀醯亞胺基丙酸酯)（DTSSP）、硫代雙[琥珀醯亞胺基丙酸酯]（DSP）、2-亞胺基硫雜環戊烷（2-iminothiolane）、N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯硫代乙酸酯（N-succinimidyl S-acetylthioacetate, SATA）、N-琥珀醯亞胺基 S-乙醯硫代丙酸酯（N-succinimidyl S-acetylthiopropionate, SATP）或SAT(PEG)4 。在一較佳具體實施例中，巰基引入劑係DTSSP。
同時，載體蛋白經修飾以在結構中包括複數個馬來醯亞胺型聯結劑，其中各聯結劑具有馬來醯亞胺基團。適合用於本揭露內容的馬來醯亞胺型聯結劑的實例，包括但不限於馬來醯亞胺己醯基（maleimidocaproyl, mc）、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽（maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate, mcc）及琥珀醯亞胺 3-溴乙醯胺丙酸鹽（succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate, SBAP）。在某些較佳具體實施例中，將載體蛋白與N-(ε-馬來醯亞胺己醯氧)磺基琥珀醯亞胺酯（N-(ε-maleimidocarproyloxy)sulfosuccinimide ester, sulfo-EMCS）反應，以生成結構中具有21個馬來醯亞胺己醯聯結劑的載體蛋白。適合用於本揭露內容的載體蛋白的實例，包括但不限於白喉棒狀桿菌197（Corynebacterium diphtheriae , CRM 197）的白喉毒素（diphtheria, DT）突變體、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa ）的外毒素A（EPA）、白喉類毒素（diphtheria toxoid）、破傷風類毒素（tetanus toxoid）、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素（heat labile enterotoxin）、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元（CTB）、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌（C. jejuni ）AcrA及空腸曲狀桿菌天然醣蛋白。較佳地，載體蛋白為CRM197的突變體。在某些較佳具體實施例中，載體蛋白係DT突變體CRM197。
接著在步驟(c)中，具巰基的寡醣2 及具有複數個馬來醯亞胺型聯結劑的載體蛋白透過馬來醯亞胺反應以共價鍵連結，該馬來醯亞胺反應發生於寡醣2 的巰基及載體蛋白的馬來醯亞胺基之間。當載體蛋白上的馬來醯亞胺基多於寡醣2 的巰基時，便可添加足量之半胱胺酸使馬來醯亞胺反應停止，以生成預期的醣複合疫苗（步驟(d)）。
根據本揭露內容的較佳具體實施例，由本案方法製造的醣複合疫苗具化學式(I)的結構，其中馬來醯亞胺型聯結劑L係馬來醯亞胺己醯基，而載體蛋白係DT突變體CRM197，n為4.8且m為16。
2.3 醣複合疫苗的用途
2.3.1 提供免疫保護力抵抗革蘭氏陰性菌感染的方法
本揭露內容另一態樣的目標，係提供一種保護受試者免於遭細菌感染的方法，具體而言，該感染由革蘭氏陰性菌引起。該方法的步驟包括施予受試者具有效量的本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗。
根據本揭露內容的特定具體實施例，本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗係使用佛氏完全佐劑製成，接著施予該製劑使測試動物（即兔子）具免疫力。自具免疫力的動物體內抽取血清，其中富含對寡醣1 及Ab -54149 EPS表現免疫生成性的抗體。另，抗體可能只能專一辨識Ab -54149菌株的EPS，而無法辨識由鮑氏不動桿菌的其他菌株（如Ab -SK44及Ab -SK17）分離而出的EPS。
另，在本揭露內容特定具體實施例中，當EPS（即Ab -SK44 EPS）上的Pse濃度降低時，經施打抗原（具低濃度Pse的EPS）獲得免疫力的動物，其體內的血清無法辨識Ab -SK44 EPS，由此證明Pse可能為關鍵免疫生成位點的假說無誤。因此，本案所述之具化學式(I)及高濃度Pse的醣複合疫苗適合提供免疫保護力，用以對抗由猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149（Acinetobactor baumannii 54149）、猶他游動放線菌VKM Ac-674（Actinoplanes utahensis VKM Ac-674）、豚鼠氣單胞菌UU51（Aeromonas caviae UU51）、空腸曲狀桿菌81-176（Campylobacter jejuni 81-176）、空腸曲狀桿菌11168（Campylobacter jejuni 11168）、空腸彎曲菌VC167（Campylobacter coli VC167）、噬纖維菌（Cellulophaga funcicola ）、大腸桿菌O136（Escherichia coli O136）、幽門螺旋桿菌1061（Helicobector pylori 1061）、幽門螺旋桿菌26695（Helicobector pylori 26695）、幽門螺旋桿菌11687（Helicobector pylori 11687）、韓國生工菌屬VKM（Kribbella spp. VKM）、鮭魚立克次菌（Piscirickettsia salmonis ）、普通變形桿菌O39（Proteus vulgaris O39）、綠膿桿菌O7a（Pseudomonas aeruginosa O7a）、綠膿桿菌O7b（Pseudomonas aeruginosa O7b）、綠膿桿菌O7d（Pseudomonas aeruginosa O7d）、綠膿桿菌O9a（Pseudomonas aeruginosa O9a）、綠膿桿菌O9b（Pseudomonas aeruginosa O9b）、綠膿桿菌O10a（Pseudomonas aeruginosa O10a）、綠膿桿菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）、綠膿桿菌PA14（Pseudomonas aeruginosa PA14）、大西洋假單胞菌LAM 14165（Pseudomonas atlantica LAM 14165）、大西洋假單胞菌T9（Pseudomonas atlantica T9）、特異假交替單胞菌KMM 638（Pseudoalteromonas distincta KMM 638）、根瘤菌屬NGR234（Rhizobium sp. NGR234）、鮑氏志賀氏菌第七型（Shigella boydii type 7）、費氏中華根瘤菌 HH103（Sinorhizobium fredii HH103）、苜蓿中華根瘤菌Rm1021（Sinorhizobium meliloti Rm1021）、霍亂弧菌O:2（Vibrio cholera O:2）、海洋弧菌 YJ016（Vibrio vulnificus YJ016）或海洋弧菌27562（Vibrio vulnificus 27562）所組成的群組選出的革蘭氏陰性菌。較佳地，該細菌係有抗藥性的菌株。
2.3.2 治療革蘭氏陰性菌感染的方法
本揭露內容另一態樣係針對一種保護受試者免於遭細菌感染的方法，具體而言，該感染由革蘭氏陰性菌引起。該方法的步驟包括施予具有效量且具化學式(I)的醣複合疫苗。
根據本揭露內容的特定具體實施例，本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗具備消滅活Ab -54149的能力。可被本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗消滅的細菌實例，包括但不限於猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149（Acinetobactor baumannii 54149）、猶他游動放線菌VKM Ac-674（Actinoplanes utahensis VKM Ac-674）、豚鼠氣單胞菌UU51（Aeromonas caviae UU51）、空腸曲狀桿菌81-176（Campylobacter jejuni 81-176）、空腸曲狀桿菌11168（Campylobacter jejuni 11168）、空腸彎曲菌VC167（Campylobacter coli VC167）、噬纖維菌（Cellulophaga funcicola ）、大腸桿菌O136（Escherichia coli O136）、幽門螺旋桿菌1061（Helicobector pylori 1061）、幽門螺旋桿菌26695（Helicobector pylori 26695）、幽門螺旋桿菌11687（Helicobector pylori 11687）、韓國生工菌屬VKM（Kribbella spp. VKM）、鮭魚立克次菌（Piscirickettsia salmonis ）、普通變形桿菌O39（Proteus vulgaris O39）、綠膿桿菌O7a（Pseudomonas aeruginosa O7a）、綠膿桿菌O7b（Pseudomonas aeruginosa O7b）、綠膿桿菌O7d（Pseudomonas aeruginosa O7d）、綠膿桿菌O9a（Pseudomonas aeruginosa O9a）、綠膿桿菌O9b（Pseudomonas aeruginosa O9b）、綠膿桿菌O10a（Pseudomonas aeruginosa O10a）、綠膿桿菌PAO1（Pseudomonas aeruginosa PAO1）、綠膿桿菌PA14（Pseudomonas aeruginosa PA14）、大西洋假單胞菌LAM 14165（Pseudomonas atlantica LAM 14165）、大西洋假單胞菌T9（Pseudomonas atlantica T9）、特異假交替單胞菌KMM 638（Pseudoalteromonas distincta KMM 638）、根瘤菌屬NGR234（Rhizobium sp. NGR234）、鮑氏志賀氏菌第七型（Shigella boydii type 7）、費氏中華根瘤菌 HH103（Sinorhizobium fredii HH103）、苜蓿中華根瘤菌Rm1021（Sinorhizobium meliloti Rm1021）、霍亂弧菌O:2（Vibrio cholera O:2）、海洋弧菌 YJ016（Vibrio vulnificus YJ016）或海洋弧菌27562（Vibrio vulnificus 27562）所組成的群組選出的革蘭氏陰性菌。較佳地，該細菌係有抗藥性的菌株。
根據本揭露內容的最佳具體實施例，該方法進一步包括向受試者施予至少一抗菌製劑的步驟，以改善或減緩該感染的相關症狀。可於施予本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗之前、同時或之後向受試者施予抗菌製劑。適合與本案所述之具化學式(I)的醣複合疫苗共同使用的抗菌製劑實例包括但不限於由阿莫西林（amoxicillin）、安比西林（ampicillin）、阿奇黴素（azithromycin）、克拉維酸（clavulanic acid）、頭孢福辛（cefuroxime）、喜復黴素（cefixime）、頭孢泊肟（cefpodoxime）、頭孢曲松（ceftriaxone）、去氧羥四環素（doxycycline）、氟喹諾酮類抗生素（luoroquinolones）、巨環類抗生素（macrolides）或莫西沙星（moxifloxacin）所組成的群組中選出的製劑。
以下所提供的實例，係用以說明本發明特定態樣，並協助本發明所屬領域中具通常知識者實作本發明。以下實例不應被理解為以任何方式限制本發明所主張的範圍。無需贅言，一般認為本發明所屬領域中具通常知識者可基於本文的說明發揮本發明的最大功效。
實例
器材與方法
萃取鮑氏不動桿菌胞外多醣（ EPS ） 。細菌表面多醣的粗萃取物，係根據Zamze et al. (J. Biol. Chem. 2002, 277, 41613)提出的實驗方法並稍作修改後萃取而得。簡言之，首先使用LB培養基，於37°C下培養鮑氏不動桿菌菌株54149細胞15小時；接著採集培養出的細胞，再將細胞懸浮於蒸餾水中，並加熱至100°C持續20分鐘以溶解細胞。將細胞溶解物以10,000 rpm速度離心20分鐘，將80%丙酮加入含細菌表面多醣的上清液，並靜置一夜使多醣析出。接著將沉澱物溶於10 mM Tris-HCL及1 mM CaCl2 ，調整酸鹼值為pH 7.5，並進一步於37°C下以核醣核酸酶（Sigma）及去氧核醣核酸酶（Roche）處理6小時，接著以蛋白酶K（Bioshop）處理12小時。接著，使用可截留1 kDa分子的膜以蒸餾水透析樣品，並將樣品凍乾處理。最後，使用HW-65F凝膠滲透管柱（TSK-GEL）進一步純化粗多醣萃取物，以去除任何殘餘細菌菌種。使用苯酚-硫酸法測定是否成功萃取出多醣，並測定其濃度。
使用 ΦAB6 TSP 分解鮑氏不動桿菌菌株 54149 EPS 。 將20 mg的Ab -54149胞外多醣（Ab -54149 EPS）粗萃取物溶解於25 mM Tris-HCL中，並於pH 7.5下將100 mM NaCl與500 µg純化後的ΦAB6 TSP共同於37°C下靜置6小時；接著，將混合物加熱至100°C持續15分鐘，以結束分解反應。以離心方式去除變性後的蛋白質，接著將粗寡醣置於P-6管柱（Bio-Rad）中並以蒸餾水洗脫。將被洗脫的碎片相混並凍乾處理，以取得化合物1 （11 mg，產率55%）。
質量光譜法分析。 本實驗使用的所有質量光譜法分析，皆以電噴灑游離-質譜法（ESI-MS）及ESI-MS-MS法進行。ESI-MS及ESI-MS-MS分析於配有標準ESI離子源的LTQ Orbitrap XL ETD質譜儀（Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA）上進行。分析時，使用Dionex的Ultimate 3000 RSLC系統（Dionex Corporation, Sunnyvale, CA）注入溶於80% ACN/H2 O及0.1% FA中的5 μL樣品，注入速率為50 μL/min。全質量掃描MS的條件如下：質量範圍0至6000 m/z，且m/z為400時解析度為60,000。使用LTQ依序分離目標離子，以取得MS2圖譜。電噴灑電壓維持於4 kV，毛細管溫度設定為275°C。
墨點分析。 醣複合物3 與佛氏完全佐劑共同調製後，便藉由皮下注射途徑注入兔子體內，使其具有免疫力。於第14、28及42天，進一步以醣複合物免疫增強兔子，並於第49天採集免疫增強血清。進行墨點分析時，使用微過濾裝置（Bio-Rad）將100 µL的化合物1 或全多醣沉積於PVDF膜上。將膜風乾5分鐘，接著使用溶於添加PBS的0.1% Tween 20（PBST）的5%脫脂牛奶於室溫下封膜1小時。接著，將膜與免疫增強血清於室溫下共同靜置1小時。將膜以PBST沖洗，接著與辣根過氧化物酶（HRP）共軛之抗兔IgG抗體（GE Healthcare）共同靜置1小時。最後，將膜以PBST再次沖洗，並使用以製劑增強的化學發光反應（Millipore）將免疫反應點視覺化。
流式細胞儀。 使用LB培養基隔夜培養Ab -54149菌，接著將培養物稀釋至106 CFU。將稀釋後的細菌與稀釋100倍、以醣複合物3 免疫增強的血清（PBS，1% BSA）共同靜置於冰上1小時。使用PBS清洗細菌，再將細菌與以Alexa Fluor 488標記的二級抗兔抗體（Thermo Fisher；使用含1% BSA的PBS稀釋400倍）共同靜置於冰上1小時。使用PBS進一步清洗細菌，並將細菌再懸浮於2 mL PBS中，接著使用MoFlo XDP流式細胞儀（Beckman Coulter）進行分析。與二級抗體共同靜置的細菌僅作為負控制組之用。
血清殺菌試驗。 使用LB培養基隔夜培養Ab -54149菌，接著以1:60000稀釋於PBS中至約104 CFU/mL。將細菌樣品分別置入無菌聚苯乙烯96孔滴定盤，每孔10 µL。使用PBS將以醣複合物3 免疫增強的血清連續3倍稀釋（1/3至1/729），接著將20 µL血清加入細菌懸浮液，於37°C下靜置15分鐘。以56°C加熱血清30分鐘，使內源性補體失去活性。靜置培養後，將30 µL新生兔補體（BRC）（Bio-Rad）滴入各孔中，並於37°C下靜置樣品1.5小時。負控制組僅包含Ab -54149及BRC。對各樣品及控制組進行測試，每組重複測試三次。自每孔取5 µL反應混合物滴於LB洋菜膠培養盤上，接著於37°C下隔夜培養。隔天計算培養後的CFU，以測定殺菌活性。將1/3稀釋與負控制組間CFU的差設定為100%細菌死亡率，並以此模式測定其他稀釋血清中的細菌死亡率。
實例 1 製造本案所述之醣複合物
根據方案I製造本案所述之 醣複合物。
方案I
Figure 02_image009
1.1 製造化合物 1
為製造細菌寡醣片段，首先由鮑氏不動桿菌菌株54149（Ab -54149）的細胞壁萃取細菌胞外多醣（EPS）。經發現，萃取出的EPS包含→3)-β-N-乙醯半乳糖胺 (GalNAc)-(1→3)-[β-葡萄糖 (Glc)-(1→6)]-β-半乳糖 (Gal)-(1→重複單元，且該重複單元大部分具有以Pse-(2→6)-α-Glc鏈結與Glc連結的Pse。接著，按「器材與方法」一節所述流程，使用ΦAB6尾刺蛋白（ΦAB6TSP）分解萃取出的Ab -54149 EPS，將萃取物切成片段，並生成包含兩個重複單元的同質寡醣化合物1 （11 mg，產率55%），並使用MS及NMR分析之。
化合物1 1 H NMR (500 MHZ , D2 O): δ 4.74-4.71 (m, 1H), 4.6-4.39 (m, 4H), 4.25-4.09 (m, 12H), 4.08-3.89 (m, 13H), 3.85-3.75 (m, 9H), 3.74-3.40 (m, 12H), 3.25-3.18 (m, 2H), 2.11-2.04 (m, 2H), 1.98-1.88 (m, 18H), 1.56-1.48 (m, 2H), 1.09 (s, 3H), 1.08 (s, 3H);13 C NMR (150 MHz, D2 O): δ = 174.77, 174.64, 173.72, 104.70, 103.51, 102.89, 100.44, 79.62, 75.34, 74.74, 73.68, 73.18, 72.39, 70.48, 69.80, 69.25, 68.51, 68.04, 66.87, 64.85, 62.24, 61.05, 59.39, 53.62, 51.42, 48.67, 35.20, 22.26, 22.07。
1.2 製造化合物 2
將碳酸銨（3.0 g，過量）加入溶於3.0 mL蒸餾水的化合物1 （20 mg）溶液中。將生成的懸浮液密封，並於室溫下攪拌7天。將反應後的混合物凍乾處理，直到萃餘物的乾燥重量維持恆定為止。最後獲得的醣基胺係無色固體，並在未經進一步純化的情形下，與3,3'-二硫代雙(磺酸琥珀醯亞胺基丙酸酯)（DTSSP）（1.0當量）於室溫下共同在pH 7.4 PBS緩衝液中反應一夜。反應開始時，每20分鐘使用1N NaOH(aq) 及1N HCl調整反應的pH值，共調整3次，使pH值維持在7左右。將二硫蘇糖醇（DTT）（1.0 mg）加入溶液中，於40°C 下反應2小時。接著，將溶液中的物質置入Sephadex LH-20管柱中純化，以獲得巰基產物化合物2 （8.8 mg，經三步驟後的產率為41.9%）。
化合物2 1 H NMR (600 MHZ , CDCl3 ): δ 4.74-4.71 (m, 1H), 4.55-4.49 (m, 4H), 4.34-4.16 (m, 12H), 4.12-3.85 (m, 13H), 3.85-3.70 (m, 9H), 3.68-3.48 (m, 12H), 3.33-3.30 (m, 2H), 2.90-2.57 (m, 4H, linker CH2 -CH2 ), 2.19-2.16 (m, 2H), 2.07-2.00 (m, 18H), 1.65-1.60 (m, 2H), 1.20 (s, 3H), 1.19 (s, 3H);13 C NMR (150 MHz, CDCl3 ): δ = 175.25, 175.09, 174.95, 174.83, 174.78, 174.65, 173.72, 104.70, 103.51, 102.90, 100.44, 81.63, 80.20, 79.62, 78.44, 76.55, 75.35, 74.74, 74.69, 73.68, 73.18, 72.40, 70.56, 70.48, 69.98, 69.75, 69.24, 69.17, 68.60, 68.49, 68.02, 66.85, 64.86, 62.25, 61.07, 60.99, 53.62, 51.42, 48.67, 39.38 (linker, CH2 ), 35.20, 22.34, 22.26, 22.09, 22.07, 21.95, 19.61 (聯結劑, CH2 ), 15.77。
1.3 製造 CRM197- 馬來醯亞胺
將1 mg/mL載體蛋白CRM197（白喉毒素突變體）與1 mL N-(ε-馬來醯亞胺己醯氧)磺基琥珀醯亞胺酯（N-(ε-maleimidocarproyloxy)sulfosuccinimide ester, sulfo-EMCS）混合於pH 8.0的PBS緩衝液中，並於室溫下緩緩攪拌2小時。接著以蒸餾水稀釋混合物，並使用Amicon Ultra-0.5以10 KDa離心，過程中更換4次去離子水。使用Nanodrop分光光度計測定蛋白質溶液的濃度（0.97 mg/mL，總量1 mL），並將蛋白質溶液凍乾，以取得CRM197-馬來醯亞胺（0.97 mg），可使用基質輔助雷射脫附游離飛行時間分析儀（MALDI-TOF）（正電模式，芥子酸基質，水）測定馬來醯亞胺的聚合數量。與CRM197共軛的馬來醯亞胺分子平均數量為21。
1.4 將化合物 2 與 CRM197- 馬來醯亞胺共軛以取得醣複合物 3
將實例1.3中的CRM197-馬來醯亞胺複合物（濃度0.97 mg/mL，總量0.980 mL）溶於pH 8.0的PBS中。接著，以莫耳數比1:40的比例加入化合物2 （1.1 mg）。後續流程與製造CRM197-馬來醯亞胺的方法相同。最後加入1 mg半胱胺酸，以淬熄過量的馬來醯亞胺基團。同樣使用MALDI-TOF測定醣複合物3 上的化合物1 聚合數量。基於蛋白質濃度的共軛產率為93%。
實例 2 動物免疫實驗
在此實例中，實例1的醣複合物與佛氏完全佐劑共同調製後，按「器材與方法」一節所述流程，以兩周為間隔施予兔子4次，使兔子具備免疫力。採集兔子血清以進行墨點分析。實驗結果如第1圖及第2圖所繪。
結果發現，經免疫增強的兔子血清可辨識Ab -54149 EPS及化合物1 ，顯示化合物1 具備優良免疫生成性（第1圖A）。值得注意的是，經免疫增強的血清對Ab -54149 EPS的反應較化合物1 敏感。此外，墨點分析結果顯示，由Ab -54149 EPS誘發的抗體及經醣複合物3 免疫增強的抗體皆會對類似抗原產生反應，因為兩種抗體皆能辨識Ab -54149 EPS及化合物1 。因此實驗推測，經醣複合物3 免疫增強的血清對於由其他250種鮑氏不動桿菌臨床菌株分離出的EPS亦具相當廣的辨識範圍，如同經Ab -54149 EPS誘發的抗體。然而，對於由其他鮑氏不動桿菌菌株及其他細菌分離出的不同EPS，經免疫增強的血清呈現較弱的交叉反應，顯示其對Ab-54149 EPS（第1圖B部分）具高特異性。第1圖B部分中的第c行至第h行繪示使用Ab -SK44、Ab -SK17、K. pneumoniae K1、K. pneumoniae K2及K. pneumoniae K64的實驗結果。
經免疫增強的血清不僅針對Ab -54149呈現優異的結合能力，亦能在殺菌試驗中明顯消滅活的Ab -54149、幽門螺旋桿菌26695及綠膿桿菌PAO1（第2圖A部分及第3圖）。值得注意的是，雖然Ab -SK44 EPS及Ab -54149 EPS所具備的醣質成分除Pse外多數相同，但Ab -SK44 EPS無法被經免疫增強的血清辨識，即代表Pse在抗原生成性上扮演關鍵角色。經免疫增強的血清無法辨識Ab -SK44 EPS的同時，Ab -54149 EPS及經ΦAB6TSP分解的產物上的Pse隨之減少，此結果證實了Pse的重要性（第2圖B部分）。最值得注意的是，經免疫增強的血清在長時間溫和的乙酸水解後，會特別與自Ab -54149 EPS釋放的Pse單醣結合，而非Ab -54149 EPS上的其他成分，包括唾液酸、GalNAcp 、Galp 及Glcp （第2圖C部分）。因此可合理推斷，抗體辨識特異性係取決於Pse及唾液酸的結構差異，即C7上的乙醯基、C9上的羥基，及C5、C7及C8手性相反等主結構差異。
可了解的是，上述具體實施例的描述僅為示例性，且本發明所屬技術領域中具通常知識者可對其進行各種修飾。上述發明內容、實例及數據係針對本發明示例性具體實施例的結構及用途提供完整說明。雖然本發明各種具體實施例已透過具備一定程度特殊性的敘述方式描述，或與一或多個個別具體實施例互相參照，本發明所屬技術領域中具通常知識者仍可在不背離本發明的精神及申請專利範圍之情形下，對所揭露的具體實施例進行諸多改變。
本專利或申請案資料包括至少一張彩色圖片。經申請並繳交必要費用後，貴局將提供本專利或專利申請案公開內容副本及彩圖。
本發明內容在參照以下所附圖式詳細說明後，將變得更顯而易見。
第 1 圖 根據本揭露內容的一具體實施例，繪示經本案醣複合物3 免疫增強的血清與鮑氏不動桿菌各種菌株的交互作用。(A) 使用一系列以不同倍數稀釋的血清，針對不同量的化合物1 及Ab -54149 EPS進行測試。(B) 與免疫增強血清反應的多種細菌胞外多醣。所使用的碳水化合物：a、b分別為化合物1 及Ab -54149 EPS；c、d分別為經ΦAB2 TSP分解的產物及Ab -SK44 EPS；e、f、g、h分別為Ab -SK17、克雷伯氏肺炎菌（K. pneumoniae ）K1、克雷伯氏肺炎菌K2及克雷伯氏肺炎菌 K64的全萃取物。在所有試驗中，抗血清以9000倍（9000x）稀釋，所使用的碳水化合物為10 µg。
第 2 圖 根據本揭露內容的一具體實施例，繪示經本發明醣複合物3 免疫增強的血清之殺菌能力及交互作用能力。(A) 一系列不同稀釋倍數（3x至729x）的免疫增強血清內的補體殺菌活性。按各洋菜膠培養盤上的CFU（見插圖）計算細菌死亡比率。數據由三次獨立實驗取得，結果以平均±標準差表示。(B) 以3,000倍稀釋的血清分別與不同劑量的Ab -54149 EPS、去PseAb -54149 EPS、化合物1 及去Pse化合物1 反應的結果。(C) 左圖中，以3,000倍稀釋的血清與自Ab -54149 EPS釋放的Pse（使用乙酸水解40、80及120分鐘）、Ab -54149 EPS反應。將水解反應120分鐘後產生的Pse、Ab -54149 EPS各取10 µg。a行的濃度為b行的10倍。右圖為10 µg及1 µg的唾液酸、GalNAcp 、Galp 、Glcp 分別與稀釋3,000倍的血清反應的結果。
第 3 圖 根據本揭露內容的一具體實施例，繪示經本發明醣複合物3 免疫增強的血清之殺菌能力及交互作用能力。(A) 按各洋菜膠培養盤上的CFU，計算一系列不同稀釋倍數（3x至243x）的免疫增強血清內的幽門螺旋桿菌補體殺菌活性。(B) 按各洋菜膠培養盤上的CFU，計算一系列不同稀釋倍數（3x至243x）的免疫增強血清內的綠膿桿菌補體殺菌活性。
Figure 108122733-A0101-11-0002-3

Claims (17)

  1. 一種可抗革蘭氏陰式菌之醣複合疫苗，其包括具化學式(I)結構的醣複合物，
    Figure 108122733-A0305-02-0031-9
     其中，L係一馬來醯亞胺型聯結劑，其與一載體蛋白透過形成於兩者之間的馬來醯亞胺鍵相連；且n為介於2至10之間的整數或非整數，m為介於2至20之間的整數或非整數。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的醣複合疫苗，其中該馬來醯亞胺型聯結劑係選自由馬來醯亞胺己醯基(maleimidocaproyl,mc)、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽(maleimidomethyl cyclohexane-1-carboxylate,mcc)及琥珀醯亞胺3-溴乙醯胺丙酸鹽(succinimidyl 3-(bromoacetamido)propionate,SBAP)所組成的群組。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的醣複合疫苗，其中該載體蛋白係選自由白喉棒狀桿菌197(Corynebacterium diphtheria 197,CRM 197)的白喉毒素(diphtheria,DT)突變體、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A(EPA)、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風類毒素(tetanus toxoid)、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat labile enterotoxin)、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌(C. jejuni)AcrA、空腸曲狀桿菌天然醣蛋白所組成的群組。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的醣複合疫苗，其中於化學式(I)中，該馬來醯亞胺型聯結劑係馬來醯亞胺己醯基，該載體蛋白係CRM197的DT突變體，n為4.8且m為16。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的醣複合疫苗，進一步包含一佐劑。
  6. 一種製造包括具化學式(I)結構的醣複合物的醣複合疫苗的方法，包含：(a)利用噬菌體尾刺蛋白(TSP)將分離自細菌的胞外多醣(EPS)分解，以生成一寡醣1；(b)以碳酸銨處理該寡醣1，接著以巰基引入劑處理該寡醣1，以生成含巰基的一寡醣2；(c)將該寡醣2與具有複數個馬來醯亞胺型聯結劑的一載體蛋白透過馬來醯亞胺反應耦合，該馬來醯亞胺反應發生於該寡醣2的巰基及該載體蛋白中該複數個馬來醯亞胺型聯結劑的馬來醯亞胺基之間；及(d)添加一足量之半胱胺酸，使步驟(c)中的該馬來醯亞胺反應停止，以生成具化學式(I)的醣複合疫苗；
    Figure 108122733-A0305-02-0032-2
    Figure 108122733-A0305-02-0033-4
    Figure 108122733-A0305-02-0033-5
     其中，L係一馬來醯亞胺型聯結劑，其與一載體蛋白透過形成於兩者之間的馬來醯亞胺鍵相連；且n為介於2至10之間的整數或非整數，m為介於2至20之間的整數或非整數。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中於步驟(a)中，該EPS係自鮑氏不動桿菌菌株54149(Ab-54149)分離而出。
  8. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中於步驟(a)中，該TSP係選自由噬菌體AB6尾刺蛋白、噬菌體P22尾刺蛋白、噬菌體SF6尾刺蛋白、噬菌體HK620尾刺蛋白、噬菌體T4尾刺蛋白及噬菌體T7尾刺蛋白所組成的群組。
  9. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中於步驟(b)中，該巰基引入劑係3,3'-二硫代雙(磺酸琥珀醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、硫代雙[琥珀醯亞胺基丙酸酯](DSP)、2-亞胺基硫雜環戊烷(2-iminothiolane)、N-琥珀醯亞胺基S-乙醯硫代乙酸酯(N-succinimidyl S-acetylthioacetate,SATA)、N-琥珀醯亞胺基S-乙醯硫代丙酸酯(N-succinimidyl S-acetylthiopropionate, SATP)或SAT(PEG)4。
  10. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中在化學式(I)中，該馬來醯亞胺型聯結劑係選自由馬來醯亞胺己醯基(mc)、馬來醯亞胺甲基環己烷-1-羧酸鹽(mcc)及琥珀醯亞胺3-溴乙醯胺丙酸鹽所組成的群組。
  11. 如申請專利範圍第10項所述的方法，其中該載體蛋白係選自由白喉棒狀桿菌197(Corynebacterium diphtheria 197,CRM 197)的白喉毒素(diphtheria,DT)突變體、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)的外毒素A(EPA)、白喉類毒素(diphtheria toxoid)、破傷風類毒素(tetanus toxoid)、金黃色葡萄球菌的去毒溶血素A、凝集因子A、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat labile enterotoxin)、大腸桿菌不耐熱腸毒素去毒變體、霍亂毒素B次單元(CTB)、霍亂毒素、霍亂毒素去毒變體、空腸曲狀桿菌(C.jejuni)AcrA、空腸曲狀桿菌天然醣蛋白所組成的群組。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中在化學式(I)中，該馬來醯亞胺型聯結劑係馬來醯亞胺己醯基，該載體蛋白係DT突變體CRM197，n為4.8且m為16。
  13. 一種醣複合物用於製備使受試者免於細菌感染的醣複合疫苗的用途，其中該醣複合物的結構如申請專利範圍第1至4項中任一項所定義。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的用途，其中該細菌係猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149(Acinetobactor baumannii 54149)、猶他游動放線菌VKM Ac-674(Actinoplanes utahensis VKM Ac-674)、豚鼠氣單胞菌UU51(Aeromonas caviae UU51)、空腸曲狀桿菌81-176(Campylobacter jejuni 81-176)、空腸曲狀桿菌11168(Campylobacter jejuni 11168)、空腸彎曲菌VC167(Campylobacter coli VC167)、噬纖維菌(Cellulophaga funcicola)、大腸桿菌O136(Escherichia coli O136)、幽門螺旋桿菌1061(Helicobector pylori 1061)、幽門螺旋桿菌26695(Helicobector pylori 26695)、幽門螺旋桿菌11687(Helicobector pylori 11687)、韓國生工菌屬VKM(Kribbella spp.VKM)、鮭魚立克次菌(Piscirickettsia salmonis)、普通變形桿菌O39(Proteus vulgaris O39)、綠膿桿菌O7a(Pseudomonas aeruginosa O7a)、綠膿桿菌O7b(Pseudomonas aeruginosa O7b)、綠膿桿菌O7d(Pseudomonas aeruginosa O7d)、綠膿桿菌O9a(Pseudomonas aeruginosa O9a)、綠膿桿菌O9b(Pseudomonas aeruginosa O9b)、綠膿桿菌O10a(Pseudomonas aeruginosa O10a)、綠膿桿菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)、綠膿桿菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)、大西洋假單胞菌LAM 14165(Pseudomonas atlantica LAM 14165)、大西洋假單胞菌T9(Pseudomonas atlantica T9)、特異假交替單胞菌KMM 638(Pseudoalteromonas distincta KMM 638)、根瘤菌屬NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、鮑氏志賀氏菌第七型(Shigella boydii type 7)、費氏中華根瘤菌HH103(Sinorhizobium fredii HH103)、苜蓿中華根瘤菌Rm1021(Sinorhizobium meliloti Rm1021)、霍亂弧菌O：2(Vibrio cholera O：2)、海洋弧菌YJ016(Vibrio vulnificus YJ016)或海洋弧菌27562(Vibrio vulnificus 27562)的任何一者。
  15. 一種醣複合物用於製備治療受試者體內細菌感染的醣複合疫苗的用途，其中該醣複合物的結構如申請專利範圍第1至4項中任一項項所定義。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的用途，其中該細菌係猶他游動放線菌鮑氏不動桿菌54149(Acinetobactor baumannii 54149)、猶他游動放線菌VKM Ac-674(Actinoplanes utahensis VKM Ac-674)、豚鼠氣單胞菌UU51(Aeromonas caviae UU51)、空腸曲狀桿菌81-176(Campylobacter jejuni 81-176)、空腸曲狀桿菌11168(Campylobacter jejuni 11168)、空腸彎曲菌VC167(Campylobacter coli VC167)、噬纖維菌(Cellulophaga funcicola)、大腸 桿菌O136(Escherichia coli O136)、幽門螺旋桿菌1061(Helicobector pylori 1061)、幽門螺旋桿菌26695(Helicobector pylori 26695)、幽門螺旋桿菌11687(Helicobector pylori 11687)、韓國生工菌屬VKM(Kribbella spp.VKM)、鮭魚立克次菌(Piscirickettsia salmonis)、普通變形桿菌O39(Proteus vulgaris O39)、綠膿桿菌O7a(Pseudomonas aeruginosa O7a)、綠膿桿菌O7b(Pseudomonas aeruginosa O7b)、綠膿桿菌O7d(Pseudomonas aeruginosa O7d)、綠膿桿菌O9a(Pseudomonas aeruginosa O9a)、綠膿桿菌O9b(Pseudomonas aeruginosa O9b)、綠膿桿菌O10a(Pseudomonas aeruginosa O10a)、綠膿桿菌PAO1(Pseudomonas aeruginosa PAO1)、綠膿桿菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)、大西洋假單胞菌LAM 14165(Pseudomonas atlantica LAM 14165)、大西洋假單胞菌T9(Pseudomonas atlantica T9)、特異假交替單胞菌KMM 638(Pseudoalteromonas distincta KMM 638)、根瘤菌屬NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、鮑氏志賀氏菌第七型(Shigella boydii type 7)、費氏中華根瘤菌HH103(Sinorhizobium fredii HH103)、苜蓿中華根瘤菌Rm1021(Sinorhizobium meliloti Rm1021)、霍亂弧菌O：2(Vibrio cholera O：2)、海洋弧菌YJ016(Vibrio vulnificus YJ016)或海洋弧菌27562(Vibrio vulnificus 27562)的任何一者。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的用途，進一步包含向受試者施予至少一抗菌製劑，該抗菌製劑係選自由阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、阿奇黴素(azithromycin)、克拉維酸(clavulanic acid)、頭孢福辛(cefuroxime)、喜復黴素(cefixime)、頭孢泊肟(cefpodoxime)、頭孢曲松(ceftriaxone)、去氧羥四環素(doxycycline)、氟喹諾酮類抗生素(luoroquinolones)、巨環類抗生素(macrolides)及莫西沙星(moxifloxacin)所組成的群組。
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