TWI727433B - 間質幹細胞於治療免疫相關疾病的用途 - Google Patents

間質幹細胞於治療免疫相關疾病的用途 Download PDF

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Abstract

本揭示內容是關於用以確認複數個間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)的方法，其中該複數個MSC可用以治療一個體之免疫相關疾病，舉例來說，關節炎。依據本揭示內容實施方式，該些間質幹細胞的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其吲哚胺2,3-二氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)的免疫抑制蛋白結合值(immunosuppressive protein binding value, IPBv)大於170。。本揭示內容亦提供經確認之MSC於製備藥物的用途，以及利用經確認之MSC或藥物來治療免疫相關疾病的方法。

Description

間質幹細胞於治療免疫相關疾病的用途
本揭示內容是關於治療疾病的領域。更具體來說，本揭示內容是關於用以確認特定間質幹細胞(mesenchymal stem cell，或稱為mesenchymal stromal cell；MSC)群之方法，以及經確認之MSC於治療諸如關節炎(arthritis)等免疫相關疾病的用途。
免疫系統是一種防禦系統，可保護個體免於遭受諸如病原菌感染(例如，病毒感染、細菌感染，或真菌感染)及癌症等不同疾病的侵害。依據免疫反應的時程及功能，免疫系統可分為二種系統，即先天性免疫系統(innate immune system)及後天性免疫系統(adaptive immune system或acquired immune system)。一般來說，先天性免疫系統提供個體第一道防禦防線，其招募先天性免疫細胞(包含自然殺手細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球、巨噬細胞、嗜中性球，以及/或是樹突細胞)至標的位置，進而活化呼吸爆發(respiratory burst)、補體級聯(complement cascade)或後天性免疫系統來消除標的分子(例如，病原菌)。相較於對標的分子不具專一性的先天性免疫系統，後天性免疫系統是由高度特殊化免疫細胞所組成，包含T細胞及B細胞，其可專一標的至標的分子。一旦經先天性免疫細胞活化後，該些高度特殊化免疫細胞可藉由釋放細胞毒素(cytotoxin)或顆粒酶(granzyme)來誘發細胞壞死或凋亡，或是藉由分泌抗體來促進凝集(agglutination)、調理作用(opsonization)、中和反應或補體功能，進而達到專一破壞或抑制標的分子的目的。
免疫系統對於維持個體的健康十分重要。然而，已知過度活化或不受控制的免疫反應會導致過度發炎，造成有害的組織損傷。目前治療免疫相關疾病的二種主要藥劑為非類固醇抗發炎藥物(Nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)及免疫抑制劑。不幸地，該些治療僅能暫時性地緩解症狀，而無法治癒免疫相關疾病。此外，投予NSAID或免疫抑制劑不但可能產生不良的副作用(例如，胃腸道潰瘍及出血、心血管疾病、腎臟疾病、過敏，以及感染)，亦會增加罹患癌症之風險。
有鑑於此，相關領域亟需一種可以更安全且準確之方式來治療免疫相關疾病的新穎方法，藉以改善病患的生活品質及壽命。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以確認複數個MSC的方法，其中該複數個MSC可用以治療一個體之免疫相關疾病。該方法包含： (a)使該複數個MSC接觸每毫升50-800單位(50-800 U/ml，約為每毫升2.5-40奈克(2.5-40 ng/ml))之IFN-γ； (b)決定該複數個MSC之吲哚胺2,3-二氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)的免疫抑制蛋白結合值(immunosuppressive protein binding value, IPBv)；以及 (c)基於步驟(b)的決定結果確認該複數個可用以治療該個體的MSC，其中該複數個MSC的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170。
可利用任一種習知技藝人士所知的方法來決定該複數個MSC的IPBv。依據某些實施方式，該複數個MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (a)將一第一抗體加入該複數個MSC中，其中該第一抗體對該IDO具有專一性，且與一螢光分子連結； (b)測量步驟(a)之產物的螢光強度；以及 (c)基於步驟(b)測量之螢光強度來決定該複數個MSC的IPBv。
在某些實施方式中，在步驟(c)中，該複數個MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (c-1)提供複數個微珠群，其中該複數個微珠群之各微珠與一第二抗體連結，且各微珠群之各微珠在同一微珠群中是與相同數量之該第二抗體連結，而不同微珠群之各微珠是與不同數量之該第二抗體連結，其中該第二抗體對該第一抗體具有專一性； (c-2)將該第一抗體加入步驟(c-1)之該些微珠群中； (c-3)測量步驟(c-2)之產物的螢光強度； (c-4)以與該些微珠群連結之該第二抗體的數量作為步驟(c-3)測量之該螢光強度的函數，以建構一校準圖(calibration plot)；以及 (c-5)基於步驟(b)測量之該螢光強度，以步驟(c-4)建構之該校準圖來決定該複數個MSC的IPBv。
由本發明方法確認的MSC可抑制個體的免疫反應，進而改善及/或減緩與免疫相關疾病的病徵。本揭示內容的第二態樣因此是關於一種經確認之MSC於製備一藥物之用途，其中該藥物係用以治療一個體之免疫相關疾病。
本揭示內容亦提供一種用以治療一個體之免疫相關疾病的方法。本發明方法包含對該個體投予一有效量之本揭示內容之MSC或藥物。
依據本揭示內容某些實施方式，在與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，MSC之IDO的IPBv大於170。
一般來說，可利用本發明MSC、藥物及/或方法治療的免疫相關疾病是一發炎性疾病(例如，骨關節炎(osteoarthritis, OA)或類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA))、移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GvHD)、移植排斥(transplant rejection)或自體免疫疾病(例如，牛皮癬(psoriasis))。依據本揭示內容某些操作實施例，免疫相關疾病是關節炎。
依據使用目的不同，MSC可以是該個體的自體(autologous)、同種異體(allogeneic)或異種(xenogeneic) MSC。較佳地，MSC是該個體的自體或同種異體MSC。
該個體是一哺乳動物。依據本揭示內容某些操作實施例，該個體是一人類。
在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
I. 定義
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比（例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者）均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆約為略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。此外，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。
「投予」(administered或administering) 在本揭示內容係指一遞送模式，其包含，但不限於，靜脈內、關節內、肌肉內、腹腔內、動脈內、顱內或皮下遞送本揭示內容之藥劑(例如，MSC)。
「治療」(treat)一詞包含部份或完全預防、改善、減輕及／或處理免疫相關疾病之病徵(symptom)、次要病徵(secondary disorder)或症狀(condition)。「治療」(treat)一詞於此說明書中亦指應用或施予本揭示內容之MSC至一個體，其係患有免疫相關疾病之病徵、次要病徵或症狀，以達到部份或完全減輕、減緩、治癒疾病、延遲發病、抑制病程發展、降低疾病嚴重性，及／或降低一或多個免疫相關疾病之病徵、症狀、或次要病徵的發生。免疫相關疾病之病徵、次要病徵及／或症狀包含，但不限於，疲勞、疼痛、腫脹、發紅、發燒、落髮、皮疹、僵硬、噁心、咳嗽、呼吸急促及尿量減少。在此「治療」亦可以是施用至患有早期該些病徵或症狀之個體，以降低該個體發展成為免疫相關疾病之病徵、次要病徵及／或症狀的風險。在此「治療」為可以有效地減少一個或多個病徵或臨床標記。換句話說，在此治療亦可以是降低、減緩或終止疾病病程、病徵或症狀的發展。
在本揭示內容中，「免疫抑制蛋白結合值」(immunosuppressive protein binding value或IPBv)一詞是表示一免疫抑制蛋白(例如，IDO分子)在一細胞(例如，MSC)內及/或上的表現量。依據本揭示內容實施方式，是以一細胞對一抗體的結合能力來決定該細胞之IPBv，亦即藉由決定一細胞的抗體結合能力(antibody-binding capacity, ABC)來決定該細胞之IPBv。具體來說，先將一抗體(例如，抗-IDO抗體)加至細胞，其中該抗體係與一報導分子(例如，一螢光分子)連結，且對免疫抑制蛋白(例如，IDO)具有結合親和力及/或專一性；反應一段時間後，移除未結合之抗體，接著以任一種習知技藝人士所知的方法(舉例來說，流式細胞儀分析，或酵素免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA))來測量報導分子的含量(例如，螢光強度)，藉以定量分析與細胞結合之抗體數量。基於免疫抑制蛋白(例如，IDO分子)與抗體(例如，抗-IDO抗體)之間的結合親和力，免疫抑制蛋白的細胞表現量會與抗體連結之報導分子的測量值(即細胞的ABC數值)成正比關係；因此，習知技藝人士可依據測量的ABC數值來決定細胞的IPBv。依據本揭示內容某些實施方式，係將ABC數值除以1,000，以得到IPBv。
「有效量」(effective amount) 在此處係指一藥劑的用量足以產生欲求的療效反應。有效量亦指一種化合物或組合物，其治療利益效果超越其毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病徵，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病徵的發生，或是可緩減與疾病或病徵相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。或者是，可將有效量表示成活性成分(例如，本揭示內容之MSC) 的濃度，例如莫耳濃度、重量濃度、體積濃度、重量莫耳濃度、莫耳分率、重量分率及混合比值。習知技藝人士可依據動物模式的劑量來計算藥劑( 例如，本發明MSC)的人體等效劑量(human equivalent dose, HED)。舉例來說，習知技藝人士可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration, FDA)所公告之「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式之最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用之最高安全劑量。
在本揭示內容中，當指一生物材料(例如，本揭示內容之MSC)是「自體的」(autologous)，表示該生物材料是源自或分離自欲進行治療的個體(例如，罹患免疫相關疾病的個體)。更具體來說，「自體的」(autologous)一詞係指由一供體取得該生物材料後，將該生物材料施予至一受體，其中該供體及該受體為同一個體。
在本揭示內容中，當指一生物材料(例如，本揭示內容之MSC)是「同種異體的」(allogeneic)，表示該生物材料是源自或分離自一供體，其與受體(例如，罹患免疫相關疾病的個體)為相同物種(species)，卻具有不同的基因組成。一般來說，相同物種之遠親雜交(outbred)、非合子(non-zygotic)孿生哺乳動物為彼此的同種異體。當可想見，一同種異體之供體與受體可以具有相同的HLA，或是不相同的HLA (即，具有一或多個不同的HLA決定位)。
當指一生物材料(例如，本揭示內容之MSC)是「異種的」(xenogeneic)，表示該生物材料是源自或分離自一供體，其與受體(例如，罹患免疫相關疾病的個體)為不同的物種。換言之，「異種的」(xenogeneic)一詞係指將一物種之供體的細胞移植至不同物種之個體體內；舉例來說，可將適量之豬的神經細胞施予至一個體，以治療其慢性疼痛及/或痙攣。
當「源自」(derived from)一詞與一生物材料(例如，本揭示內容之MSC)連用時，係指該生物材料是在某個時間點由所述來源取得。舉例來說，一源自一個體的細胞可以是一由該個體直接取得的初級細胞(即，未經修飾的細胞)。
「個體」(subject)一詞在本揭示內容是指包含人類等可接受本發明方法治療的哺乳動物。除非另有所指，否則「個體」(subject)一詞在本揭示內容同時意指男性及女性。
II. 發明詳細說明
(I) 用以確認可治療免疫相關疾病之 MSC 的方法
本揭示內容的第一態樣是關於一種用以確認複數個MSC的方法，其中該複數個MSC可用以治療一個體之免疫相關疾病。依據本揭示內容的實施方式，該方法包含： (a)使該複數個MSC接觸每毫升50-800單位之IFN-γ； (b)決定該複數個MSC之IDO的IPBv；以及 (c)基於步驟(b)的決定結果確認該複數個可用以治療該個體的MSC，其中該複數個MSC的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170。
可利用任一種本發明所屬技術領域具有通常知識者所知的方法來製備本發明方法之複數個MSC；舉例來說，以密度梯度來分離脂肪組織(adipose tissue, AT)、臍帶血(umbilical cord blood, UCB)、瓦頓氏凝膠(Wharton’s Jelly, WJ)或骨髓(bone marrow, BM)。依據使用目的不同，MSC可以是所述個體之自體MSC (即，由罹患免疫相關疾病之個體所收集的MSC)、同種異體MSC (即，由另一個體收集的MSC，其與罹患免疫相關疾病之個體為相同物種)，或是異種MSC (即，由與罹患免疫相關疾病之個體分屬不同物種之供體所收集的MSC)。較佳地，該MSC是個體之自體或同種異體 MSC。一般來說，可利用本發明方法所確認之MSC治療的個體是一哺乳動物；舉例來說，人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔子、狗、貓、牛、山羊、綿羊、猴子及馬。依據較佳的實施方式，該個體是人類。
在步驟(a)中，是每毫升 50-800單位(約為每毫升2.5-40奈克)的IFN-γ來刺激MSC，以製備活化態MSC。依據本揭示內容的實施方式，投予刺激物(即，IFN-γ)可模擬免疫相關疾病之病變位置的微環境，進而預測MSC於治療免疫相關疾病的免疫抑制能力。
接著，於步驟(b)決定活化態MSC之IDO的IPBv。依據本揭示內容某些實施方式，以活化態MSC的平均抗體結合能力(antibody binding capacity, ABC)來決定該活化態MSC的IPBv。具體來說，係將一抗體(以下簡稱「第一抗體」)加至活化態MSC中，以形成MSC免疫複合體，其中該第一抗體對IDO分子具有結合親和力及/或專一性(即，一抗-IDO抗體，例如一小鼠抗-IDO抗體)，且與一螢光分子連結。據此，第一抗體結合後，可藉由計算與IDO分子連結之螢光分子的數量來定量分析表現於活化態MSC內及/或上的IDO分子數量。例示性之用以偵測螢光分子的方法包含，但不限於，流式細胞儀、螢光顯微鏡、成像流式細胞儀(imaging flow cytometry, IFC)、螢光高效液相色層分析(fluorometric high-performance liquid chromatography, fluorometric HPLC)、磁調生物感測(magnetic modulation biosensing)，以及螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)。依據本揭示內容某些較佳實施例，是利用流式細胞儀來偵測螢光分子。
當可想見，所述螢光分子可以是任何在光激發後可重新發光的分子；舉例來說，綠色螢光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、增強型綠色螢光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)、紅色螢光蛋白(red fluorescent protein, RFP)、黃色螢光蛋白(yellow fluorescent protein, YFP)、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻紅素(phycoerythrin, PE)，以及異藻藍蛋白(allophycocyanine, APC)。在本揭示內容一操作實施例中，該螢光分子是PE。
當可理解，除了螢光分子之外，第一抗體亦可替代地與其他報導分子連結，例如，量子點等可經由適當方法計算的報導分子。
依據本揭示內容某些實施方式，係以複數個微珠群來決定活化態MSC的平均ABC (即，活化態MSC與第一抗體的結合能力)，其中該複數個微珠群之各微珠的直徑基本上等於MSC的平均直徑，且與一第二抗體連結，其中該第二抗體對第一抗體具有專一性(例如，一抗-小鼠抗體)。在該些實施方式中，共有四群微珠群，其中第一微珠群之各微珠係與第一ABC數量(例如12,257)的第二抗體連結，即各微珠與12,257個第二抗體連結，因此可與12,257個第一抗體結合；第二微珠群之各微珠係與第二ABC數量(例如72,745)的第二抗體連結，即各微珠與72,745個第二抗體連結，因此可與72,745個第一抗體結合；第三微珠群之各微珠係與第三ABC數量量(例如283,360)的第二抗體連結，即各微珠與283,360個第二抗體連結，因此可與283,360個第一抗體結合；而第四微珠群之各微珠則係與第四ABC數量(例如886,417)的第二抗體連結，即各微珠與886,417個第二抗體連結，因此可與886,417個第一抗體結合。
將與螢光連結之第一抗體(例如，與PE連結之小鼠抗-IDO抗體)加至上述第一到第四微珠群中，以形成第一、第二、第三及第四對照免疫複合體。可利用流式細胞儀等任一種上述方法來決定第一到第四對照免疫複合體的平均螢光強度。基於第一抗體(例如，小鼠抗-IDO抗體)與第二抗體(例如，抗-小鼠抗體)的結合親和力，與微珠群連結之第二抗體的數量會與對照免疫複合體的平均螢光強度成正比關係。因此可建構一校準圖，其中x軸對應於對照免疫複合體的平均螢光強度，而y軸則對應於與微珠群連結之第二抗體的數量。據此，可基於活化態MSC的螢光強度，以校準圖來決定活化態MSC對第一抗體的平均ABC數值。之後，將平均ABC數值除以1,000以得到活化態MSC的IPBv (即IPBv = ABC的平均數值 / 1,000).
接著，在步驟(c)中，基於步驟(b)測量之活化態MSC的IPBv來確認適用於治療免疫相關疾病的MSC。依據本揭示內容某些實施方式，在步驟(a)以每毫升50-800單位之IFN-γ刺激後，IPBv大於170 (例如，170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500或更高)的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。
依據某些實施方式，是以每毫升50單位(每毫升2.5奈克)的IFN-γ刺激MSC；在該些實施方式中，IPBv大於170的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。依據某些實施例，在投予每毫升50單位之IFN-γ刺激後，IPBv大於171.6的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。在某些特定實施例中，於投予每毫升50單位之IFN-γ刺激的情況下，IPBv介於171.6到378.5的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。
依據替代性的實施方式，是以每毫升800單位(每毫升40奈克)的IFN-γ刺激MSC；在該些實施方式中，IPBv大於400的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。依據某些實施例，在投予每毫升800單位之IFN-γ刺激後，IPBv大於423.4的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。在某些特定實施例中，於投予每毫升800單位之IFN-γ刺激的情況下，IPBv介於423.4到648.5的MSC確認為可用以治療免疫相關疾病。
基於IPBv與MSC治療功效的相關性，本揭示內容亦提供IPBv作為生物標記以製備試劑盒之用途。本揭示內容之用途的特徵在於： 該生物標記是複數個MSC之IDO的IPBv；以及 該試劑盒可用以預斷該複數個MSC是否可用以治療一罹患免疫相關疾病的個體，其中當將該複數個MSC與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，IPBv大於170代表該複數個MSC可用以治療該個體。
用以決定MSC之IPBv的方法與上述方法相似；為求簡潔，在此不再贅述。
以經確認之MSC治療的免疫相關疾病可以是任何由免疫反應所導致及/或與免疫反應相關的疾病、病徵或症狀，特別是由過度活化之免疫反應所導致及/或與過度活化之免疫反應相關的疾病、病徵或症狀；舉例來說，發炎性疾病、GvHD、移植排斥，或是自體免疫疾病。例示性之可以本發明MSC治療的發炎性疾病包含，但不限於，關節炎、過敏、炎症性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)、潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis)、動脈粥狀硬化(atherosclerosis)、多發性硬化(multiple sclerosis)、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis, AD)、感染，以及敗血症。例示性之可以本發明MSC治療的自體免疫疾病包含，但不限於，全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)、牛皮癬(psoriasis)、硬皮病(scleroderma)、葡萄膜炎(uveitis)、胰島素依賴型糖尿病(insulin dependent diabetes mellitus)、自體免疫心肌病(autoimmune cardiomyopathy)、自體免疫溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia)、自體免疫肝炎(autoimmune hepatitis)、自體免疫內耳病(autoimmune inner ear disease)、自體免疫淋巴球增生症候群(autoimmune lymphoproliferative syndrome)、自體免疫周邊神經病變(autoimmune peripheral neuropathy)、自體免疫胰臟炎(autoimmune pancreatitis)、自體免疫多內分泌症(autoimmune polyendocrine syndrome)、自體免疫黃體激素皮膚炎(autoimmune progesterone dermatitis)、自體免疫血小板減少性紫癜症(autoimmune thrombocytopenic purpura)、自體免疫蕁麻疹(autoimmune urticarial)，以及自體免疫葡萄膜炎(autoimmune uveitis)。依據本揭示內容某些實施方式，免疫相關疾病是關節炎；舉例來說，骨關節炎(osteoarthritis, OA)、類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)、牛皮癬性關節炎(psoriatic arthritis)、創傷性關節炎(traumatic arthritis)、敗血性關節炎(septic arthritis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)，以及幼年型類風濕性關節炎(juvenile idiopathic arthritis)。在一操作實施例中，免疫相關疾病是骨關節炎。
(II) 用以治療免疫相關疾病的方法
本揭示內容的第二態樣是關於本揭示內容第(I) 部分確認之MSC於製備藥物的用途，其中該藥物可用以治療一個體之免疫相關疾病。
本揭示內容亦提供利用本發明MSC或藥物來治療一個體之免疫相關疾病的方法。具體來說，該方法包含對該個體投予一有效量之本發明MSC或藥物。
如本揭示內容第(I) 部分所述，本發明MSC的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170；依據本揭示內容某些實施方式，是將未處理之MSC (naïve MSC；即未經IFN-γ或任何刺激物處理之MSC)投予至該個體以改善及/或減緩免疫相關疾病的病徵，其中該未處理之MSC的特徵於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170。較佳地，投予之MSC與每毫升50單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170，或是與每毫升800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於400。更佳地，投予之MSC與每毫升50單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於171.6，或是與每毫升800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於423.4。在某些實施例中，投予之MSC與每毫升50單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv為171.6到378.5 。在替代性的實施例中，投予之MSC與每毫升800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv為423.4到648.5。
依據本揭示內容某些實施方式，該個體為一人類，且對該個體投予約1×105 到1×109 的MSC。較佳地，投予有效量約為1×106 到1×108 的MSC。依據某些實施例，5×107 之MSC即足以對個體產生治療功效。
為了有效改善及/或減緩免疫相關疾病的病徵，可對個體投予一或多次本揭示內容之MSC或藥物。舉例來說，在整個治療過程中，可對個體投予一次本揭示內容之MSC或藥物。或者是，可以每天一次、每二天一次、每三天一次、每四天一次、每五天一次、每六天一次、每週一次、每二週一次、每三週一次、每月一次、每二個月一次、每三個月一次、每四個月一次、每五個月一次或更長時間一次(例如，每年一次)的方式對個體投予本揭示內容之MSC或藥物。
依據使用目的不同，投予的MSC可以是個體的自體、同種異體或異種MSC。
可以任何適當的路徑對個體投予本發明MSC及/或藥物；舉例來說，關節內注射、皮下注射、靜脈內注射、單次快速注射(bolus injection)、肌肉內注射，或是動脈內注射。依據某些實施例，是以關節內注射的方式對罹患關節炎的個體投予本發明MSC，以改善及/或減緩與關節炎相關的病徵。
當可想見，本發明MSC或藥物的投予路徑及給藥時間會隨著不同因素而有所變異，例如欲治療、預防或處理之疾病或特定病徵，以及病患的年齡、性別及狀況。本發明所屬技術領域具有通常知識者皆知該些因素對疾病及治療的影響，且可依據慣常實驗來調整MSC或藥物的投予路徑及給藥時間。
當可想見，可單獨對個體施予本發明方法，亦或是可與其他對治療免疫相關疾病有所助益的額外療法共同施予；舉例來說，NSAID或免疫抑制劑。依據治療目的不同，本發明方法可於投予該額外療法之前、期間或之後進行投予至個體。
下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。 實施例
材料及方法
培養 MSC
以DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)洗滌人類脂肪組織數次，移除紅血球後，加入0.1%第I型膠原酶於37°C水浴槽進行分解反應。完全分解後，離心收集基質血管細胞(stromal vascular fraction, SVF)沉澱物，並將其種植於培養瓶中。將細胞置於37°C之5% CO2 潮溼組織培養箱培養。隔日，利用DPBS洗滌細胞，以移除懸浮細胞及細胞碎片，並加入新的培養液。每2-3天置換新鮮培養液，直到細胞滿度到達80-90%。以胰蛋白酶收集MSC後，重新種植於新培養瓶中。培養結束時，將MSC懸浮於包含10% DMSO的冷凍保存液中，保存於液態氮。
IDO 定量試驗
1. 促發細胞 (Priming cell)
將細胞以每平方公分50,000個細胞的密度種植於培養瓶中，並以每毫升50、200或800單位之IFN-γ刺激24小時。接著，收集細胞進行細胞膜或細胞內蛋白染色；以與螢光分子結合的抗-IDO抗體來染色QSC磁珠後，藉由比對結合至細胞之抗-IDO抗體的螢光強度及QSC磁珠的螢光強度來定量分析IDO的表現量。
2. 細胞內蛋白染色
利用固定緩衝液於4°C固定經促發的細胞20分鐘後，以染色緩衝液(含有1% FBS的DPBS)洗滌二次。離心經固定的細胞，並移除上清液，之後將細胞懸染於通透緩衝液中，於4°C反應15分鐘。將經固定/通透的細胞重新懸浮於50微升之包含抗-IDO抗體的通透培養液中，並於4°C避光反應30分鐘。以通透緩衝液洗滌二次後，將細胞重新懸浮於染色緩衝液中，以進行流式細胞儀分析。
3. 以 QSC 磁珠進行定量分析
QSC磁珠是由四群磁珠群所組成，其中第一磁珠群的各磁珠具有12,257個山羊抗-小鼠抗體共價鍵結至其表面，第二磁珠群的各磁珠具有72,745個山羊抗-小鼠抗體共價鍵結至其表面，第三磁珠群的各磁珠具有283,360個山羊抗-小鼠抗體共價鍵結至其表面，而第四磁珠群的各磁珠具有886,417個山羊抗-小鼠抗體共價鍵結至其表面。四群磁珠群混合物的各磁珠可捕捉具有螢光標記的小鼠抗-人類IDO抗體。以抗-人類IDO抗體染色QSC 磁珠30分鐘後，利用1毫升之染色緩衝液洗滌二次。將磁珠重新懸浮於染色緩衝液中，以進行流式細胞儀分析。
利用流式細胞儀來分析MSC及QSC 磁珠的幾何平均螢光強度(geometric mean fluorescence intensity, Geo MFI)。由QSC磁珠的幾何平均螢光強度與製造商提供之QSC 磁珠的ABC數值來繪製線性回歸曲線。將MSC的幾何平均螢光強度與標準曲線進行比對，以決定MSC的ABC數值；之後將ABC數值除以1,000以得到IPBv (即，IPBv = 平均ABC / 1,000)。
以自體 MSC 治療膝部骨關節炎
本研究招募了12位罹患中度至重度膝部骨關節炎的個體，並分別取得其知情同意書。將該些個體之脂肪組織送至合作的製造商以製備MSC。製備5×107 個經分離且擴增的MSC，以進行單劑量注射。將製備的MSC冷凍保存於液態氮中，以待後續使用。僅將符合所有放行測試(包含7項放行測試)的MSC關節內注射至病患的膝部。於MSC注射1、4、12、24及48週後，觀察所有個體的初級與次級終點評估。初級與次級終點評估分別用以確認治療的安全性及功效。安全終點評估包含身體檢查、生命體徵檢查、常規實驗室檢測及依美國癌症研究所的常見不良事件評價標準4.0版本記錄不良反應。功效終點評估則包含以下檢測： (A)膝部骨關節炎的分類，其係以X射線依據Kellgren Lawrence分級系統進行測量，並分為0到4級。 (B)關節軟骨品質，其係以MRI進行評估，並由二位醫師評估MRI骨關節炎膝分數(MRI Osteoarthritis Knee Score, MOAKS)來予以分級。 (C)疼痛，其係於每日活動及運動活動中，以VAS進行評估，評估分數由0到100。 (D)膝功能，其係藉由 IKDC及KOOS問卷來進行評估，評估分數由0到100。
實施例 1 確認 MSC
1.1 決定 MSC 的平均 ABC
為了評估MSC於免疫相關疾病的功效，首先以QSC磁珠來決定MSC的IPBv。如材料及方法所述，QSC磁珠是由四群磁珠群所組成，其中各群之磁珠皆與特定數量之山羊抗-小鼠抗體結合。與螢光標記之抗-人類IDO抗體混合後，偵測具有不同螢光強度之四群磁珠群(第1A圖)。之後，基於QSC磁珠的螢光強度及與QSC磁珠結合之山羊抗-小鼠抗體的數量來建構校準圖(第1B圖)。
另一方面，利用流式細胞儀來分析經不同濃度之IFN-γ (即，每毫升50、200或800單位)刺激後MSC的螢光強度，第2A-2C圖分別闡述該些結果。基於測量的螢光強度，利用校準圖來決定經IFN-γ促發之MSC的平均ABC及IPBv。表1總結該些分析結果。
表1  經特定濃度之IFN-γ刺激後MSC的平均ABC及IPBv
IFN-γ濃度 (單位/毫升) 螢光強度 平均ABC IPBv
50 1921.4 254,466 254.5
200 3503.0 469,222 469.2
800 4446.2 598,250 598.3
1.2 活體內分析
本實施例將分析MSC的IPBv是否與其治療功效相關。如材料及方法所述，分別由12位罹患中度至重度膝部骨關節炎的個體製備MSC。以每毫升50、200或800單位之IFN-γ刺激24小時後，利用流式細胞儀分析活化態MSC，以決定其IPBv。表2之數據指出，MSC對關節炎的治療功效會與活化態MSC之IPBv成正比關係，其中相較於其他濃度，於每毫升50單位之IFN-γ刺激的MSC可觀察到IDO表現與VAS-運動(第12週)之間最高的相關係數，而於每毫升800單位之IFN-γ刺激的MSC則可觀察到IDO表現與膝功能改善(包含IKDC及KOOS評估，第12週)之間最高的相關係數。
表2　IDO表現與MSC對關節炎之治療功效的相關性
IDO定量分析結果 第12週的臨床結果
VAS-運動 IKDC KOOS
個體編號 IPBv 疼痛緩解% 膝功能改善%
每毫升50單位IFN-γ 每毫升200單位IFN-γ 每毫升800單位IFN-γ
02 254.5 469.2 598.3 100.0 100.0 100.0
04 169.2 389.6 479.5 50.0 52.7 75.9
05 301.3 485.3 558.7 97.5 65.6 81.8
06 323.5 583.5 648.5 100.0 83.3 83.5
07 378.5 556.1 608.2 100.0 74.6 82.8
08 377.7 598.9 645.9 88.2 81.3 87.4
09 130.7 270.3 338.0 43.3 37.5 43.1
10 235.3 444.3 517.5 100.0 91.9 98.5
11 209.7 388.6 458.5 100.0 82.4 95.1
12 121.1 301.5 419.5 30.8 54.1 60.3
13 243.5 391.7 463.2 100.0 80.4 96.2
16 305.2 562.2 632.8 100.0 74.2 80.8
IDO及臨床結果的相關係數 (p值) 每毫升50單位IFN-γ 0.750 0.554 0.502
(0.005) (0.062) (0.096)
每毫升200單位 IFN-γ 0.706 0.584 0.510
(0.010) (0.046) (0.090)
每毫升800單位 IFN-γ 0.679 0.639 0.548
(0.015) (0.025) (0.065)
基於表2的結果，可繪製出二條線性回歸公式。式(I)表示IDO表現與VAS-運動的相關性：
Figure 02_image001
(I)， 其中，x值為經每毫升50單位之IFN-γ刺激後，MSC的IPBv，且y值為投予MSC 12週後，個體於VAS-運動中的分數(由0到100)。依據式(I)，若將VAS-運動評估的分數設定為50，則x值會等於171.6。相較於經IFN-γ刺激後IPBv 小於171.6的MSC，經IFN-γ刺激後IPBv 大於171.6的MSC可明顯減緩關節炎病患的疼痛(表2)。
式(II)表示IDO表現與膝功能改善的相關性：
Figure 02_image003
(II)， 其中，x值為經每毫升800單位之IFN-γ刺激後，MSC的IPBv，且y值為投予MSC 12週後，個體於IKDC評估的分數(由0到100)。依據式(II)，若將IKDC評估的分數設定為50，則x值會等於423.4。相較於經IFN-γ刺激後IPBv 小於423.4的MSC，經IFN-γ刺激後IPBv 大於423.4的MSC可明顯改善病患的膝功能(表2)。
將MSC (其經每毫升50單位之IFN-γ刺激後具有大於171.6的IPBv，或經每毫升800單位之IFN-γ刺激後具有大於423.4的IPBv)關節內注射至病患的膝蓋。第3A-3E圖的結果證實，該MSC可有效改善個體骨關節炎的病徵(即，疼痛)，以及改善個體的膝功能。
總結上述，本揭示內容提供一種用以確認複數個可用以治療免疫相關疾病(舉例來說，關節炎)之MSC的方法。經確認之MSC在以每毫升50單位之IFN-γ刺激後具有大於171.6的IPBv，或是以每毫升800單位之IFN-γ刺激後具有大於423.4的IPBv。相較於不符合上述條件的MSC，由本發明方法確認之MSC可明顯改善免疫相關疾病的病徵，因此可用以製備藥物以治療或預防免疫相關疾病。
雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
無
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下： 第1A圖是依據本揭示內容實施例1.1所繪示之流式細胞儀分析結果； 第1B圖是依據本揭示內容實施例1.1所繪示之校準圖，其係關於螢光強度與量子簡單細胞(quantum simply cellular, QSC)磁珠之數量的相關性； 第2A-2C圖是依據本揭示內容實施例1.1所繪示之流式細胞儀分析結果；其分別闡述經每毫升50單位(第2A圖)、每毫升200單位(第2B圖)及每毫升800單位(第2C圖)之IFN-γ刺激後，MSC的螢光強度；以及 第3A-3E圖是依據本揭示內容實施例1.2所繪示之活體分析結果；其中經IFN-γ刺激後，IPBv大於171.6的MSC可顯著改善骨關節炎的病徵，且改善骨關節炎病患的膝功能；第3A圖：以視覺類比量表(visual analogue scale, VAS)來評估關節炎病患每日活動的疼痛分數；第3B圖：以VAS來評估關節炎病患運動活動的疼痛分數；第3C圖：以國際膝部文件委員會(international knee documentation committee, IKDC)主觀膝部評估表來評估關節炎病患的膝功能；第3D圖：以膝關節損傷及骨關節炎評分(knee injury and osteoarthritis outcome score, KOOS)來評估關節炎病患的膝功能；第3E圖：關節炎病患之膝部的核磁共振影像(magnetic resonance imaging, MRI)分數；基礎值：投予MSC之前；**p值 > 0.01。
無

Claims (14)

  1. 一種間質幹細胞(mesenchymal stem cell, MSC)於製備一藥物之用途，其中該藥物係用以治療一個體之免疫相關疾病，其中該MSC的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，該MSC之吲哚胺2,3-二氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)的免疫抑制蛋白結合值(immunosuppressive protein binding value, IPBv)大於170。
  2. 如請求項1所述之用途，其中該免疫相關疾病是關節炎。
  3. 如請求項1所述之用途，其中該MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (a)將一第一抗體加入該MSC中，其中該第一抗體對該IDO具有專一性，且與一螢光分子連結； (b)測量步驟(a)之產物的螢光強度；以及 (c)基於步驟(b)測量之螢光強度來決定該MSC的IPBv。
  4. 如請求項3所述之用途，其中在步驟(c)中，該MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (c-1)提供複數個微珠群，其中該複數個微珠群之各微珠與一第二抗體連結，且各微珠群之各微珠在同一微珠群中是與相同數量之該第二抗體連結，而不同微珠群之各微珠是與不同數量之該第二抗體連結，其中該第二抗體對該第一抗體具有專一性； (c-2)將該第一抗體加入步驟(c-1)之該些微珠群中； (c-3)測量步驟(c-2)之產物的螢光強度； (c-4)以與該些微珠群連結之該第二抗體的數量作為步驟(c-3)測量之該螢光強度的函數，以建構一校準圖；以及 (c-5)基於步驟(b)測量之該螢光強度，以步驟(c-4)建構之該校準圖來決定該MSC的IPBv。
  5. 如請求項1所述之用途，其中該MSC是該個體之自體MSC。
  6. 如請求項1所述之用途，其中該MSC是該個體之同種異體MSC。
  7. 如請求項1所述之用途，其中該個體是一人類。
  8. 一種用以確認複數個MSC的方法，其中該複數個MSC可用以治療一個體之免疫相關疾病；該方法包含： (a)使該複數個MSC接觸每毫升50-800單位之IFN-γ； (b)決定該複數個MSC之IDO的IPBv；以及 (c)基於步驟(b)的決定結果確認該複數個可用以治療該個體的MSC，其中該複數個MSC的特徵在於與每毫升50-800單位之IFN-γ接觸後，其IDO的IPBv大於170。
  9. 如請求項8所述之方法，其中該免疫相關疾病是關節炎。
  10. 如請求項8所述之方法，其中該複數個MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (a)將一第一抗體加入該複數個MSC中，其中該第一抗體對該IDO具有專一性，且與一螢光分子連結； (b)測量步驟(a)之產物的螢光強度；以及 (c)基於步驟(b)測量之螢光強度來決定該複數個MSC的IPBv。
  11. 如請求項10所述之方法，其中在步驟(c)中，該複數個MSC的IPBv是由以下步驟所決定： (c-1)提供複數個微珠群，其中該複數個微珠群之各微珠與一第二抗體連結，且各微珠群之各微珠在同一微珠群中是與相同數量之該第二抗體連結，而不同微珠群之各微珠是與不同數量之該第二抗體連結，其中該第二抗體對該第一抗體具有專一性； (c-2)將該第一抗體加入步驟(c-1)之該些微珠群中； (c-3)測量步驟(c-2)之產物的螢光強度； (c-4)以與該些微珠群連結之該第二抗體的數量作為步驟(c-3)測量之該螢光強度的函數，以建構一校準圖；以及 (c-5)基於步驟(b)測量之該螢光強度，以步驟(c-4)建構之該校準圖來決定該複數個MSC的IPBv。
  12. 如請求項8所述之方法，其中該複數個MSC是該個體之自體MSC。
  13. 如請求項8所述之方法，其中該複數個MSC是該個體之同種異體MSC。
  14. 如請求項8所述之方法，其中該個體是一人類。
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