TWI721237B

TWI721237B - 藉由具有蛋白質表現於其表面之囊泡遞送藥劑至自噬及凋亡細胞

Info

Publication number: TWI721237B
Application number: TW106146090A
Authority: TW
Inventors: 張新侯; 孫德珊
Original assignee: 慈濟學校財團法人慈濟大學
Priority date: 2017-12-27
Filing date: 2017-12-27
Publication date: 2021-03-11
Also published as: TW201927287A

Abstract

本發明產生用於特異性靶向及遞送藥劑至自噬及凋亡細胞之囊泡上之經工程改造之表面蛋白質表現。此外，本發明之囊泡可實現對自噬及凋亡細胞以及含有自噬及凋亡細胞之組織的靶向及藥物遞送之協同作用。

Description

藉由具有蛋白質表現於其表面之囊泡遞送藥劑至自噬及凋亡細胞

本發明係關於遞送藥劑至細胞領域。特定言之，本發明係關於經由具有經工程改造之蛋白質表現或結合於其表面之囊泡來遞送藥劑至自噬及/或凋亡細胞以及組織。

凋亡為經經研究之計劃性細胞死亡路徑。細胞消除之非凋亡形式包括具有壞死及自噬特徵之形式。凋亡藉由消除老化細胞、不必要的細胞及不健康細胞而在身體之發育及保持健康中起重要作用。凋亡過少或過多可引起多種疾病。當凋亡不正確地起作用時，應消除之細胞可能留存並且變成永生，例如在癌症及白血病中。當凋亡過度起作用時，其殺死過多細胞且造成嚴重的組織損壞。此為中風及神經退化性病症(諸如阿茲海默氏(Alzheimer's)、亨廷頓氏(Huntington's)及帕金森氏(Parkinson's)病)之情況。自噬，一種使蛋白質及細胞器在稱為自噬小體之雙膜結構中螯合且遞送至溶酶體以用於降解之過程，在疾病中為關鍵的。除癌症及神經退化以外，自噬之調節為廣泛多種其他疾病及病症中之治療策略。舉例而言，若干肝病、心肌疾病及肌肉疾病與錯誤摺疊之蛋白質聚集體之聚集相關。在此類疾病中，增加細胞自噬之藥劑可增強致病聚集體之清除且籍此有助於治療及降低疾病嚴重程度。此外，自噬抑制劑可充當治療劑以用於治療胰臟炎。因此，需要研發用於調節細胞中之凋亡及自噬，籍此治癒或改善自噬相關疾病之手段。

本發明提供蛋白質結合之囊泡，其包含表現或結合於囊泡表面之一或多種凝集素或其片段及視情況選用之藥劑。在一個實施例中，藥劑囊封於囊泡內且連接至囊泡之外表面。囊泡之特定實施例包括脂質體及微胞。囊泡可經人工工程改造或細胞衍生。凝集素或片段之特定實施例包括(但不限於)陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)、P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素、P-選擇素-配位體-1 (PSGL-1)、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、CD31、整合素αLβ2、VE-鈣黏素、CD44、CD300a、CD47、凝血栓蛋白1 (TSP1)及CD36，其用作第一蛋白質。凝集素或片段之特定實施例包括(但不限於)CD300a、CD47、凝血栓蛋白1 (TSP1)及CD36、Toll樣受體4 (TLR4)或其片段，其用作第二蛋白質。凝集素或片段之特定實施例包括(但不限於)一或多種第一蛋白質及一或多種第二蛋白質。在一些實施例中，囊泡包含M6PR與P-選擇素、E-選擇素、PSGL-1或半乳糖凝集素3之組合。在一些實施例中，囊泡包含Siglec 2與P-選擇素、半乳糖凝集素3或CD31之組合。在一些實施例中，囊泡包含P-選擇素或M6PR與TLR4、半乳糖凝集素3、CLEC2、整合素αLβ2或CD31之組合。藥劑之特定實施例包括(但不限於)診斷造影劑、細胞存活增強劑、細胞存活抑制劑、細胞組分、細胞器、細胞、細胞毒性劑、抗腫瘤藥物、毒素或抗體、脂質、蛋白質、DNA、RNA、治療劑或奈米材料。本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明之囊泡及醫藥學上可接受之載劑。本發明亦提供以將藥劑靶向遞送至自噬及/或凋亡細胞以及含有該細胞之組織之方法，其包含向個體投與本發明之蛋白質結合之囊泡。

本發明產生用於特異性靶向及遞送藥劑至自噬及/或凋亡細胞之表現或結合於囊泡上之經工程改造之表面蛋白質。特定言之，本發明之囊泡可實現對自噬及/或凋亡細胞以及含有自噬及/或凋亡細胞之組織之靶向及藥物遞送之協同作用。除非特定說明，否則當術語之定義偏離術語之常用含義時，申請人意欲使用下文中提供之定義。除非內容另有明確指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。如本文中所使用，除非另有說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。在多項從屬請求項的情況下，使用「或」僅以替代的方式引用超過一項前述申請專利範圍獨立項或申請專利範圍從屬項。如本文中所使用，術語「一或多個」可由熟習此項技術者容易地理解，尤其當在其使用情況下閱讀時。如本文中所使用，術語「脂質體」為通用術語，其涵蓋藉由產生密封型脂質雙層或聚集體而形成之多種單層及多層脂質媒劑。脂質體可表徵為具有囊泡結構，其具有雙層膜，通常包含磷脂，及通常包含水性組合物之內部介質。如本文中所使用，術語「微胞」係指分散於液體膠體中之界面活性劑分子之聚集物(或超分子集合體)。水性溶液中之典型微胞與親水性「頭部」區域形成聚集物，該等區域與周圍溶劑接觸，使微胞中心中之疏水性單尾區域螯合。如本文所使用，術語「藥劑」或「治療劑」係指能夠治療及/或改善病狀或疾病之藥劑。如本文中可互換地所用，術語「個人」、「個體」、「宿主」及「患者」係指哺乳動物，其包括(但不限於)鼠(大鼠、小鼠)、非人類靈長類動物、人類、犬科動物、貓科動物、有蹄動物(例如馬科動物、牛科動物、綿羊、豬科動物、山羊)等。如本文中所使用，術語「治療有效量」或「有效量」係指當投與哺乳動物或其他個體以用於治療疾病時，足以實現對疾病之此類治療的囊泡之量。如本文所使用，術語「治療(treatment/treating)」及其類似術語涵蓋對哺乳動物，尤其人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預防疾病在易患該疾病但尚未診斷患有該疾病之個體中發生；(b)抑制疾病，亦即遏制其發展；及(c)緩解疾病，亦即引起疾病消退。如本文中所使用，術語「結合位點」係指其中在兩個大分子之間形成共價鍵之位點，大部分為末端與側鏈分支鏈結合，且偶爾為分子頭對尾線形結合。在一個態樣中，本發明提供蛋白質結合之囊泡，其包含表現或結合於囊泡表面之一或多種凝集素或其片段及視情況選用之藥劑。在一個實施例中，藥劑囊封於囊泡內且連接至囊泡之外表面。在一些實施例中，囊泡為脂質體或微胞。囊泡可經人工工程改造或細胞衍生。在一些實施例中，凝集素或其片段係選自由以下組成之群：陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)、P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素、P-選擇素-配位體-1 (PSGL-1)、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、CD31、整合素αLβ2、VE-鈣黏素、CD300a、CD47、凝血栓蛋白1 (TSP1)及CD36或其片段。在一些實施例中，單獨的M6PR、P-選擇素、E-選擇素、P-選擇素-配位體-1 (PSGL-1)、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、整合素αLβ2、VE-鈣黏素足以引導囊泡靶向自噬及/或凋亡細胞以及含有自噬及/或凋亡細胞之組織，且充當第一蛋白質(EP)。在一些其他實施例中，囊泡包含M6PR與P-選擇素、E-選擇素、PSGL-1或半乳糖凝集素3之組合；或Siglec 2與P-選擇素或半乳糖凝集素3之組合。在一些實施例中，CD300a、CD47、凝血栓蛋白1 (TSP1)及CD36亦可充當第二蛋白質。因此，本發明亦提供囊泡，其包含一或多種選自由M6PR、P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素、P-選擇素-配位體-1 (PSGL-1)、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、CD31、整合素αLβ2及VE-鈣黏素組成之群之第一蛋白質，及一或多種選自由CD300a、CD47、凝血栓蛋白1 (TSP1)、Toll樣受體4 (TLR4)及CD36以及其片段組成之群之第二蛋白質。在一些實施例中，囊泡包含M6PR或P-選擇素與TLR4、半乳糖凝集素3、CLEC2、整合素αLβ2或CD31之組合。具有蛋白質標記之組合之囊泡可實現對自噬及/凋亡細胞以及含有自噬及/或凋亡細胞之組織的靶向及藥物遞送之協同作用。對靶向作用之協同作用可降低待遞送之藥劑之有效劑量，且因此可減小藥物之副作用。在一個實施例中，藥劑為診斷劑或治療劑。在一個實施例中，藥劑為自噬或凋亡藥物。在一些實施例中，藥劑之實例包括(但不限於)抗瘧疾藥物、自噬抑制劑、組蛋白脫乙醯基酶(HDAC)抑制劑、本文中所描述之EP或AP之拮抗劑、診斷造影劑、細胞存活增強劑(或細胞死亡抑制劑)、細胞存活抑制劑(或細胞死亡增強劑)、細胞(諸如幹細胞及祖細胞)、細胞組分、細胞器、細胞毒性劑、抗腫瘤藥物、毒素或抗體、脂質、蛋白質、DNA、RNA、治療劑及奈米材料。在一個實施例中，前述第一蛋白質或第二蛋白質之拮抗劑(諸如可溶形式、相應配位體以及中和及阻斷抗體)能夠充當解毒劑，以降低對自噬及凋亡細胞以及含有自噬及凋亡細胞之組織之囊泡靶向。在一些實施例中，藥劑為甲基巴多索隆(bardoxolone methyl)、氯奎寧(chloroquine)、奎寧(quinine)、氫氯奎寧(hydrochloroquine)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、Hsp90抑制劑、二甲雙胍(metformin)或克卓替尼(crizotinib)。本文中提供之脂質體包括單層脂質體、多層脂質體及多囊泡脂質體。本文中提供之脂質體可由帶正電、帶負電或中性磷脂組成。本發明中使用之脂質體可藉由此項技術中已知之不同方法製得。舉例而言，磷脂(諸如中性磷脂二油醯基磷脂醯膽鹼(DOPC)、二軟脂醯基膽鹼磷脂(DPPC)及/或EPC)可溶解於乙醇或其他有機溶劑中，且接著與用於包含於脂質雙層中之組分混合。混合物可進一步包括各種清潔劑。典型地，使脂質混合物渦旋，在乾冰/丙酮浴中冷凍且凍乾隔夜。凍乾製劑在-20℃或更低之溫度下長期儲存。在需要時復原經凍乾之脂質體。或者，可藉由在容器(例如玻璃、梨形燒瓶)中，在溶劑中混合脂質來製備脂質體。容器之體積應比所預期之脂質體懸浮液之大超過十倍。使用旋轉式蒸發器，在負壓下，在約40℃下移除溶劑。視所需脂質體體積而定，通常在約5分鐘至2小時內移除溶劑。可在真空中，在乾燥器中進一步乾燥組合物。由於隨時間推移而劣化之趨勢，通常在約1週之後廢棄經乾燥之脂質。微胞結構本身將大部分由用於形成微胞之聚合物分子之類型及組成以及微胞之溶劑環境決定。在一些實施例中，使用由親水性及疏水性單體單元組成之非離子型三嵌段共聚物構造微胞。在本發明之實施例中，使用泊洛沙姆(poloxamer)，其為聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)-聚(環氧乙烷)之三嵌段共聚物(PEO-PPO-PEO)。在一些實施例中，本發明之微胞可使用具有多種嵌段尺寸(例如處於上述範圍內之嵌段尺寸)之PEG-PLA聚合物且以多種比率(例如PEG:PLA為約1:10至約10:1，或該範圍內之任何整數比率)製備。本文中所描述之蛋白質結合於囊泡中係經由使用基於剪切力之方法將經功能性基團標記之脂質補充至囊泡中來進行(Yu B, Lee RJ, Lee LJ. Microfluidic methods for production of liposomes. Methods Enzymol. 2009;465:129-141 ；及 Jeong D, Jo W, Yoon J 等人 , Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 2014;35(34):9302-9310 )。在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明之囊泡及醫藥學上可接受之載劑。本發明之囊泡可以熟習此項技術者已知的多種不同方式調配。醫藥學上可接受之載劑部分由所投與之特定組合物以及用於投與組合物之特定方法決定。因此，存在廣泛多種適合的本發明之醫藥組合物之調配物(參見例如Remington's Pharmaceutical Sciences, 第20版增刊, 2003, 見上文)。有效調配物包括口服及鼻用調配物、用於非經腸投藥之調配物及經調配以用於長期釋放之組合物。出於投藥的目的，舉例而言，非經腸投藥，可使用水溶性鹽(例如NaCl)之無菌水溶液。其他或替代性載劑可包括芝麻油或花生油，以及水性丙二醇。視需要，可適當地緩衝水性溶液，且可用足夠的生理食鹽水或葡萄糖首先使液體稀釋劑等張。此等水性溶液尤其適用於靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內及瘤內(IT)注射。適用於口服投藥之調配物可由以下組成：(a)液體溶液，諸如懸浮於稀釋劑(諸如水、生理食鹽水或PEG 400)中之有效量的本發明之化合物；(b)膠囊、藥囊、藥物儲槽或錠劑，各含有預定量之活性成分，呈液體、固體、顆粒或明膠形式；(c)適合的液體中之懸浮液；(d)適合的乳液；及(e)貼片。上述液體溶液可為無菌溶液。醫藥學形式可包括以下中之一或多者：乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸鈣、玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、微晶纖維素、明膠、膠態二氧化矽、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸及其他賦形劑、著色劑、填充劑、結合劑、稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑、調味劑、染料、崩解劑及醫藥學上相容的載劑。口含錠形式可包含香料(例如蔗糖)中之活性成分，以及在惰性基質(諸如明膠及丙三醇或蔗糖及阿拉伯膠乳液、凝膠及其類似物)中包含活性成分之片劑，其除活性成分以外亦含有此項技術中已知的載劑。在另一態樣中，本發明提供以將感興趣的藥劑靶向遞送至自噬及/或凋亡細胞或含有該細胞之組織之方法，其包含向個體投與本發明之蛋白質結合之囊泡。在一個實施例中，在投與囊泡之前，該方法額外包含向標靶細胞或標靶組織投與自噬及/或凋亡誘導劑之步驟。藉由使用該步驟，標靶細胞或組織將發生自噬或凋亡，使得本發明之囊泡可靶向自噬及/或凋亡細胞或組織，且接著遞送感興趣的藥劑至細胞或組織。舉例而言，首先向個體投與抗肥胖症抗體，使得脂肪細胞或組織自噬及/或凋亡；接著投與具有抗肥胖症藥物之囊泡以靶向自噬及/或凋亡脂肪細胞或組織，使得可藉由抗肥胖症藥物進一步破壞脂肪細胞或組織。自噬為溶酶體降解路徑，其對於存活、分化、發育及穩定為必需的。藥劑或治療劑與本發明之囊泡一起遞送至自噬細胞係針對與自噬失調相關聯之疾病。與自噬失調相關聯之疾病包括(但不限於)創傷、暴露於化學及物理有毒因素、遺傳疾病、年齡相關之疾病、心血管疾病、感染性疾病、贅生性疾病、神經退化性疾病、代謝疾病、老化(當ATG5在整個生物體中過表現時)、肥胖症(當ATG7或前自噬轉錄因子EB[TFEB]在肝細胞中過表現時)、癌症(當beclin 1在KRAS誘導之肺腺瘤中表現時)、由β-澱粉狀蛋白或α-突觸核蛋白或毒性誘導之神經退化(當TFEB或beclin 1在大腦中過表現時或當胱抑素B，一種溶酶體半胱胺酸蛋白酶抑制劑，被基因剔除時)、肌肉退化病狀(當TFEB或beclin 1靶向骨胳肌肉時)及由囊腫性纖維化引起之慢性肺炎(當beclin 1在肺中表現時)。凋亡由多個前及抗凋亡信號之整合控制。藥劑或治療劑與本發明之囊泡一起遞送至凋亡細胞係針對與凋亡變化相關聯之疾病。與凋亡變化相關聯之疾病包括(但不限於)創傷、暴露於化學及物理有毒因素、遺傳疾病、年齡相關之疾病、年齡相關之疾病、心血管疾病、感染性疾病、贅生性疾病、神經退化性疾病、代謝疾病、老化、肥胖症、癌症、由β-澱粉狀蛋白或α-突觸核蛋白(阿茲海默症、帕金森病、亨廷頓氏病、肌肉萎縮性側索硬化)或毒性誘導之神經退化、肌肉退化病狀或由囊腫性纖維化引起之慢性肺炎、心臟血管病症(諸如局部缺血、心臟衰竭及感染性疾病)及自體免疫疾病(全身性紅斑性狼瘡症、自體免疫性淋巴增生症候群、類風濕性關節炎及甲狀腺炎)。本發明之囊泡可用於治療或診斷任何需要投與診斷劑或治療劑之疾病。任何適合的藥劑或治療劑皆可與本發明之囊泡一起使用。此外，本發明之囊泡適用於治療由病原體(諸如病毒、細菌、真菌及寄生蟲)引起之感染。可使用本發明之囊泡治療其他疾病。在一些實施例中，可以多種方式向患者投與本發明之囊泡或醫藥組合物，包括局部、非經腸、經靜脈內、皮內、皮下、肌肉內、經結腸、經直腸或腹膜內。優選地，非經腸、局部、經靜脈內、肌肉內、皮下、經口或經鼻(諸如經由吸入)投與醫藥組合物。在一些實施例中蛋白質結合之囊泡可遞送脂質、蛋白質、DNA、RNA、治療劑或奈米材料。在一些實施例中，治療劑為細胞存活增強劑(或細胞死亡抑制劑)。向個體遞送細胞存活增強劑(或細胞死亡抑制劑)能夠引導藥物介導之組織損傷之救援。在一些實施例中，藥劑為細胞存活抑制劑、細胞死亡增強劑或抗腫瘤劑。遞送細胞存活抑制劑(細胞死亡增強劑)或抗腫瘤劑能夠減少此等含有天然存在之自噬及凋亡細胞之組織(諸如腫瘤)之標靶細胞存活，或減少其中使用細胞毒素劑(諸如藥物、毒素或針對組織特異性蛋白質之抗體)在特異性組織中人工誘導之自噬及凋亡細胞之所選擇的特異性組織。在一些實施例中，治療劑為幹細胞或祖細胞。遞送幹細胞及祖細胞能夠發揮保護性生理學功能及救援含有自噬及凋亡細胞之組織。儘管已參考本發明之較佳實施例及實例描述本發明，但本發明之範疇不僅限於此等所描述之實施例。如熟習此項技術者將顯而易見，可在不偏離由隨附申請專利範圍所界定及限制之本發明之精神及範疇的情況下對上述本發明做出修改及變化。提供以下實例意欲說明本發明之實施例及優點且不欲限制其範疇。實例實例 1 活體外靶向自噬細胞之脂質體 脂質體製備藉由脂質體套組(Sigma-Aldrich Co.)及各別脂質製備脂質體。表面蛋白質之結合係經由使用基於剪切力之方法將功能性基團標記之脂質補充至脂質體中來進行(Yu B, Lee RJ, Lee LJ. Microfluidic methods for production of liposomes. Methods Enzymol. 2009;465:129-141 ；及Jeong D, Jo W, Yoon J 等人 , Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 2014;35(34):9302-9310 )。蛋白質(M6PR、P-選擇素、E-選擇素、PSGL-1、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、整合素αLβ2、VE-鈣黏素、CD300a、CD47、TSP1及CD36)與脂質體之蛋白質結合係基於由製造商提供之方法。測定針對自噬及凋亡細胞之相對接合程度。使小鼠B16-F10細胞懸浮4小時以誘導自噬及凋亡。分別使用Cyto-ID自噬偵測套組(Enzo Life Sciences)(參見圖1及圖3)及CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision)(參見圖2及圖4)套組，用綠色螢光染料(GFD)標記自噬及凋亡細胞。含有自噬及凋亡細胞之群體與用螢光染料鈣黃綠素-紅(CR)標記之各種蛋白質結合之脂質體接合。使用流式細胞測量術測定B16-F10-脂質體接合之群體(GFD及CR雙陽性群體)之百分比。將與未結合之細胞(「未結合」組)接合之脂質體及螢光珠粒之含量標準化至100% (參見圖1及圖2)。實例 2 經由各種蛋白質結合物特異性靶向受損組織之脂質體 硫代乙醯胺 ( TAA ) 肝炎小鼠模型中經工程改造之脂質體靶向受損肝臟 在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，分別將未結合之脂質體(含有螢光素)及M6PR結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)靜脈內注射至實驗小鼠中。在24小時之後，使用IVIS系統測定螢光含量(參見圖5)。此等結果表明M6PR結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)可將脂質體負載型螢光素特異性遞送至肝臟中。根據上文所提及之方法進行協同分析法。結果展示於圖6中。如圖中所示，肝臟中M6PR與P-sel、gal-3、siglec2、MMR、αLβ2、CD31、磷脂結合蛋白V、CD44或VE-鈣黏素之組合之螢光強度顯著高於單獨的M6PR。以上組合呈現協同作用。來源於小鼠 B16 - F10 細胞株之實體腫瘤 向小鼠之腹股溝位點皮下注射B16-F10黑素瘤細胞(1×10⁶ 個細胞/小鼠)。在第三天及第八天，分別向小鼠之眼窩竇注射對照性脂質體及M6PR結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在第十二天處死小鼠。使用IVIS® Spectrum觀測腫瘤之螢光強度且結果展示於圖7中。如圖中所示，腫瘤中M6PR結合之經工程改造之脂質體之螢光強度顯著高於其他器官，其表明M6PR結合之經工程改造之脂質體可鑑別腫瘤位點。根據上文所提及之方法進行協同分析法。分別向小鼠之眼窩竇注射對照性脂質體、M6PR、M6PR-p-sel結合之脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在第十二天處死小鼠。使用IVIS® Spectrum觀測腫瘤之螢光強度且結果展示於圖8中。如圖中所示，腫瘤中M6PR、M6PR-p-sel結合之脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體之螢光強度顯著高於其他器官。此外，M6PR-p-sel脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體與M6PR結合之經工程改造之脂質體相比呈現更好的協同功效。在抗脂肪抗體注射之後的脂肪組織 分別在第0及48小時向具有高脂肪飲食之小鼠之眼窩竇注射對照性Ig或抗脂肪抗體(75微克/小鼠)。分別在第6、24、54及72小時向小鼠之眼窩竇注射對照性脂質體、M6PR、M6PR-p-sel結合之脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在96小時之後處死小鼠以採集白色脂肪組織。使用IVIS® Spectrum觀測腫瘤之螢光強度且結果展示於圖9中。如圖中所示，脂肪組織中M6PR、M6PR-p-sel結合之脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體之螢光強度顯著高於對照物。此外，M6PR-p-sel脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體與M6PR結合之經工程改造之脂質體相比呈現更好的協同功效。受損組織含有自噬及凋亡細胞。 經硫代乙醯胺 ( TAA ) 處理之小鼠肝臟 在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，分別向實驗小鼠之眼窩竇靜脈內注射未結合之脂質體(含有螢光素)及M6PR結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在24小時之後，分別使用Cyto-ID自噬偵測套組(Enzo Life Sciences)及CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision)套組，用綠色螢光染料(GFD)標記自噬及凋亡肝細胞。含有自噬及凋亡肝細胞之群體與M6PR結合之經工程改造之脂質體接合，該等脂質體用螢光染料鈣黃綠素-紅(CR)標記。使用流式細胞測量術測定肝細胞-脂質體接合之群體(GFD及CR雙陽性群體)之百分比。將與未結合之細胞(「未結合」組)接合之脂質體及螢光珠粒之含量標準化至100% (參見圖10)。由 B16 - F10 細胞形成之實體腫瘤 向小鼠之腹股溝位點皮下注射B16-F10黑素瘤細胞(1×10⁶ 個細胞/小鼠)。在第三天及第八天，向小鼠之眼窩竇注射對照性脂質體及M6PR結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在第十二天處死小鼠。分別使用Cyto-ID自噬偵測套組(Enzo Life Sciences)及CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision)套組，用綠色螢光染料(GFD)標記自噬及凋亡腫瘤細胞。含有自噬及凋亡腫瘤細胞之群體與M6PR結合之經工程改造之脂質體接合，該等脂質體用螢光染料鈣黃綠素-紅(CR)標記。使用流式細胞測量術測定肝細胞-脂質體接合之群體(GFD及CR雙陽性群體)之百分比。將與未結合之細胞(「未結合」組)接合之脂質體及螢光珠粒之含量標準化至100% (參見圖11)。經抗脂肪抗體處理之脂肪組織 分別在第0及48小時向具有高脂肪飲食之小鼠之眼窩竇注射對照性Ig或抗脂肪抗體(75微克/小鼠)。分別在第6、24、54及72小時向小鼠之眼窩竇注射對照性脂質體、M6PR、M6PR-p-sel結合之脂質體及M6PR-Gal3結合之經工程改造之脂質體(含有螢光素)。在96小時之後處死小鼠以採集白色脂肪組織。分別使用Cyto-ID自噬偵測套組(Enzo Life Sciences)及CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision)套組，用綠色螢光染料(GFD)標記自噬及凋亡脂肪細胞。含有自噬及凋亡脂肪細胞之群體與M6PR結合之經工程改造之脂質體接合，該等脂質體用螢光染料鈣黃綠素-紅(CR)標記。使用流式細胞測量術測定肝細胞-脂質體接合之群體(GFD及CR雙陽性群體)之百分比。將與未結合之細胞(「未結合」組)接合之脂質體及螢光珠粒之含量標準化至100% (參見圖12)。實例 3 阻斷抗體、可溶性重組型蛋白質及可溶性 M6P 之處理能夠阻斷靶向自噬及凋亡細胞之 M6PR 結合之經工程改造之脂質體 / 小胞之靶向且可充當解毒劑 使小鼠B16-F10細胞懸浮4小時且接著用阻斷抗體或可溶性M6PR重組型蛋白質加其他M6PR+P-選擇素結合之脂質體處理。分別使用Cyto-ID自噬偵測套組(Enzo Life Sciences)及CaspGLOWTM Red Active Caspase-3 Staining Kit (BioVision)套組，用綠色螢光染料(GFD)標記自噬及凋亡細胞。含有自噬及凋亡細胞之群體與M6PR+P-選擇素結合之脂質體接合，該等脂質體用螢光染料鈣黃綠素-紅(CR)標記。使用流式細胞測量術測定B16-F10-脂質體接合之群體(GFD及CR雙陽性群體)之百分比。將與未結合之細胞(「未結合」組)接合之脂質體及螢光珠粒之含量標準化至100% (參見圖13及圖14)。實例 4 活體外特異性靶向自噬及凋亡細胞之脂質體負載型材料 ( 脂質、 DNA 、 RNA 、 蛋白質、藥物 ) 使小鼠B16-F10細胞懸浮4小時以誘導凋亡，且接著用卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型M6PR結合之脂質體處理且與不含血清之培養基一起培育。在24小時之後，使用流式細胞測量術測定凋亡細胞之百分比(參見圖17)。使用Molecular Probes®標記化學物質(DNA、RNA及蛋白質標記套組；ThermoFisher Scientific Co.)製備螢光標記之DNA、RNA及蛋白質。螢光DNA、RNA及蛋白質(Bcl-xL BH4主結構)經由複合物遞送至脂質體/MV或與細胞穿透肽R8 11結合(戊二醛；Sigma-Aldrich Co.)。此產生之M6PR接合之脂質體能夠實現DNA、RNA及蛋白質負載型脂質體對凋亡細胞之靶向(參見圖18)。表1. 使用與單一重組型蛋白質結合之卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型脂質體作為實例，經由借助於經還原之ALT含量進行之偵測來分析經TAA處理之小鼠之協同救援(+P ＜0.05，++P ＜0.01)。

表2. 使用與M6PR加第二蛋白質結合之卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型脂質體作為實例，經由借助於經還原之ALT含量進行之偵測來分析經TAA處理之小鼠之協同救援(+P ＜0.05，++P ＜0.01)。.

實例 6 活體內經由脂質體上之各種蛋白質結合物特異性靶向受損組織 ( IVIS ) 之 經工程改造之脂質體之說明 在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射theM6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型脂質體。在24小時之後，分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量(參見圖19)。此等結果表明選擇素結合之脂質體不僅能夠靶向受損組織，且亦能夠運載藥物以治癒標靶組織(參見圖19)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之Bcl-2表現質體負載型脂質體。在24小時之後，分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量(參見圖20)。此等結果表明選擇素結合之脂質體不僅能夠靶向受損組織，且亦能夠運載質體DNA以治癒標靶組織。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之卡斯蛋白酶-3 siRNA負載型脂質體。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖21)。此等結果表明選擇素結合之脂質體不僅能夠靶向受損組織，且亦能夠運載RNA以治癒標靶組織(參見圖21)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之抗凋亡Bcl-xL衍生之BH4主結構負載型脂質體。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖22)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射M6PR+半乳糖凝集素3、M6PR+P-選擇素、Siglec 2+P-選擇素及Siglec 2+半乳糖凝集素3結合之卡斯蛋白酶3抑制劑負載型脂質體。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖23)。實例 7 CD34 + 細胞藉由本發明之蛋白質結合之脂質體靶向損傷位點及蛋白質結合之脂質體對 CD34 ⁺ 細胞介導之救援之協同作用 向實驗小鼠靜脈內注射螢光(鈣黃綠素紅)標記之小鼠CD34⁺ 幹細胞(1×10⁷ 個細胞/小鼠)以及M6PR及M6PR+P-sel結合之脂質體/MV (2.5×10⁹ 個MV/小鼠)。使用IVIS系統測定螢光含量(參見圖24)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射小鼠CD34⁺ 幹細胞(1×10⁷ 個細胞/小鼠)以及M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1-結合之脂質體/MV (2.5×10⁹ 個MV/小鼠)。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖25)。實例 8 抗癌藥物或細胞抑制劑藉由本發明之蛋白質結合之脂質體靶向癌細胞 向小鼠之腹股溝位點皮下注射B16-F10黑素瘤細胞(1×10⁶ 個細胞/小鼠)。在第三天及第八天，分別向小鼠之眼窩竇注射MV (含有絲裂黴素C，0.2μ g)及MV (含有順鉑(cisplatin)：2μ g)。在第十二天處死小鼠以採集腫瘤。測定腫瘤之尺寸及重量(參見圖26(a)及(b))。如圖26中所示，MV可運載抗癌藥物至腫瘤且將藥物遞送至腫瘤中，以抑制或緩解腫瘤生長及減小腫瘤尺寸。根據上文所提及之方法，使用蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星)作為運載抗癌藥物之載劑。如圖27中所示，蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星)可抑制生長率(參見圖27(a))，且可亦降低小鼠之死亡率(圖27(b))。實例 9 藥物藉由本發明之蛋白質結合之脂質體靶向脂肪組織 分別在第0及48小時向具有高脂肪飲食之小鼠之眼窩竇注射對照性Ig或抗脂肪抗體(75微克/小鼠)。在第6小時、第24小時、第54小時及第72小時，分別向小鼠之眼窩竇注射MV (含有絲裂黴素C，0.2μ g)及MV (含有順鉑：2μ g)。測定小鼠之體重且結果展示於圖28中。結果表明MV (含有絲裂黴素C，0.2μ g)可降低小鼠之體重增加率。根據上文所提及之方法，在分析法中使用蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星)。如圖29中所示，蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星)可降低小鼠之體重增加率(圖29(a))。此外，抗脂肪抗體或脂質體(含有多柔比星)不會引起肝功能指數增長(圖29(b))。實例 10 本發明之蛋白質結合之脂質體在不負載有其他藥物 / 材料之情況下僅介導對受損組織之救援 與血清及細胞(C6/36)衍生之MV相比，血漿MV以較高表面P-選擇素含量來表現P-選擇素。藉由流式細胞測量術進行分析(參見圖30)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射血漿、血清及細胞(C6/36)衍生之MV (2.5×10⁹ 個MV/小鼠)。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖31)。在硫代乙醯胺(TAA)肝炎小鼠模型中，向實驗小鼠靜脈內注射小鼠CD34⁺ 幹細胞(1×10⁷ 個細胞/小鼠)以及血漿、血清及細胞(C6/36)衍生之MV (2.5×10⁹ 個MV/小鼠)。在24小時之後，分析血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量(參見圖32)。

圖1展示活體外靶向自噬細胞之脂質體。*P ＜0.05對比「無」組(n=3)。組1-15顯示具有或不具有蛋白質結合之各種脂質體之細胞結合程度。組：1，未結合；2，M6PR；3，P-選擇素；4，E-選擇素；5，PSGL-1；6，CD22；7，CD206；8，半乳糖凝集素3；9，磷脂結合蛋白V；10，整合素αLβ2；11，VE-鈣黏素；12，CD300a；13，CD47；14，TSP1及CD36、結合之脂質體。將未結合之組標準化至100%。圖2展示活體外靶向凋亡細胞之脂質體。*P ＜0.05對比「無」組(n=3)。組1-15顯示具有或不具有蛋白質結合之各種脂質體之細胞結合程度。組：1，未結合；2，M6PR；3，P-選擇素；4，E-選擇素；5，PSGL-1；6，CD22；7，CD206；8，半乳糖凝集素3；9，磷脂結合蛋白V；10，整合素αLβ2；11，VE-鈣黏素；12，CD300a；13，CD47；14，TSP1及CD36、結合之脂質體。將未結合之組標準化至100%。圖3展示自噬細胞(藍色群體)之流式細胞測量術分析及偵測之實例。圖4展示凋亡細胞(紫色群體)之流式細胞測量術分析及偵測之實例。圖5藉由活體內影像系統(IVIS)展示重組型蛋白質結合之脂質體之靶向作用。重組型M6PR結合之脂質體之螢光強度(標記螢光染料鈣黃綠素紅)。圖6藉由活體內影像系統(IVIS)展示B16-F10腫瘤細胞上重組型蛋白質結合之脂質體之靶向作用。使用螢光標記之脂質體。重組型M6PR蛋白質結合之脂質體之螢光強度(標記螢光染料鈣黃綠素紅)。無：用未結合之脂質體處理。圖7展示使用活體內影像系統(IVIS)鑑別重組型蛋白質結合之螢光脂質體是否對受損肝臟具有靶向作用。量測在具有或不具有TAA及脂質體處理情況下，小鼠器官(其包括心臟、肺、肝及脾)之相對螢光強度。A，指示小鼠器官(其包括心臟、肺、肝及脾)之亮視野影像。B-S，螢光影像，其中偽彩色影像B、D、F、H、J中之紅色部分展示於C、E、G、I、K中。協同靶向：B-C，M6PR加P-選擇素；D-E M6PR加半乳糖凝集素3及Siglec 2；F-G，M6PR加MMR及整合素αLβ2；H-I，M6PR加CD31及磷脂結合蛋白V；J-K，M6PR加CD44及VE-鈣黏素。與用未結合之脂質體(媒劑)處理之對照組相比，所有蛋白質結合之脂質體展示更高的肝優先靶向特性。此外，與單一蛋白質結合之組相比，此等具有兩種蛋白質結合之組中之螢光含量更高。圖8展示使用活體內影像系統(IVIS)鑑別重組型蛋白質結合之螢光脂質體是否對腫瘤具有靶向作用。吾人發現螢光負載型脂質體更有效地靶向B16-F10黑素瘤細胞形成之腫瘤(M6PR、M6PR+P-選擇素及M6PR+半乳糖凝集素3組對比未經處理及媒劑組)。圖9展示使用活體內影像系統(IVIS)鑑別重組型蛋白質結合之螢光脂質體是否對受損白色脂肪組織(用抗脂肪-組織抗體預處理)具有靶向作用。C57BL/6J小鼠用或不用兔抗小鼠脂肪細胞抗體處理。接著，用具有重組型蛋白質結合物之螢光(鈣黃綠素紅)脂質體處理小鼠。組：1，未經處理；2，未結合之脂質體；3，M6PR+半乳糖凝集素3；4，M6PR+P-選擇素；5，M6PR。圖10展示受損小鼠肝臟含有自噬及凋亡細胞。*P ＜0.05，與正常組相比(n=4)。圖11展示小鼠B16-F10細胞形成之實體腫瘤含有自噬及凋亡細胞。*P ＜0.05，與正常組相比(n=4)。圖12展示經抗脂肪抗體處理之小鼠脂肪組織含有自噬及凋亡細胞。*P ＜0.05，與正常組相比(n=4)。圖13展示脂質體標靶對凋亡細胞之阻斷。阻斷抗體及可溶性M6PR重組型蛋白質(分別為圖3及4)能夠阻斷靶向凋亡細胞之M6PR結合之脂質體小胞之靶向(圖2)且可充當解毒劑。脂質體製劑：圖1，未結合；圖2，M6PR+P-選擇素結合型；3，M6PR+P-選擇素結合之脂質體+阻斷抗體；4，M6PR+P-選擇素結合之脂質體+可溶性M6PR重組型蛋白質。圖14展示脂質體標靶對自噬細胞之阻斷。阻斷抗體及可溶性M6PR重組型蛋白質(分別為圖3及4)能夠阻斷靶向自噬細胞之M6PR+P-選擇素結合之脂質體小胞之靶向(圖2)且可充當解毒劑。脂質體製劑：圖1，未結合；圖2，M6PR+P-選擇素結合型；3，M6PR+P-選擇素結合之脂質體+阻斷抗體；4，M6PR+P-選擇素結合之脂質體+可溶性M6PR重組型蛋白質。圖15展示靶向凋亡細胞之脂質體。組1-4分別指示未經處理、M6PR+P-選擇素、M6PR+E-選擇素及M6PR+PSGL-1結合之組。*P＜0.05，與未經處理(圖1)之組相比(n=4)。此等結果表明特異性阻斷抗體、特異性可溶性重組型蛋白質及唾液酸基-路易斯x寡醣(lewis x oligosaccharide)能夠充當解毒劑，以阻斷靶向凋亡細胞之P-選擇素、E-選擇素及PSGL-1結合之脂質體。圖16展示靶向自噬細胞之脂質體。組1-4分別指示未經處理、M6PR+P-選擇素、M6PR+E-選擇素及M6PR+PSGL-1結合之組。*P＜0.05，與未經處理(圖1)之組相比(n=4)。此等結果表明特異性阻斷抗體、特異性可溶性重組型蛋白質及唾液酸基-路易斯x寡醣能夠充當解毒劑，以阻斷靶向自噬細胞之P-選擇素、E-選擇素及PSGL-1結合之脂質體。圖17展示卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型M6PR結合之脂質體活體外對經剝離之凋亡B16-F10細胞之救援。*P＜0.05，與經剝離之組相比(n=4)。此等結果表明M6PR結合之脂質體可將脂質體負載型卡斯蛋白酶-3抑制劑(BioVision)特異性遞送至凋亡細胞中。圖18展示DNA-(白色圖)、RNA-(灰色圖)、蛋白質(黑色圖)-負載型及M6PR結合之脂質體對DNA、RNA及蛋白質遞送至B16-F10細胞之作用。使用流式細胞測量術分析在具有或不具有脂質體情況下，B16-F10細胞之相對螢光含量。*P＜0.05，與各別未結合之組相比(n=4)。圖19展示M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合型、卡斯蛋白酶-3抑制劑負載型脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之作用。分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量。P-選擇素：P-sel；E-選擇素：E-sel；P-選擇素醣蛋白配位體1：PSGL-1。#P＜0.05，與未結合之MV組相比。**P＜0.01，與各別重組型蛋白質結合之組相比(n=6)。圖20展示M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合型、Bcl -2表現質體負載型脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之作用。分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量。P-選擇素：P-sel；E-選擇素：E-sel；P-選擇素醣蛋白配位體1；PSGL-1。#P＜0.05，與無脂質體/MV組相比。**P＜0.01，與各別重組型蛋白質結合之組相比(n=6)。圖21展示M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合型、卡斯蛋白酶-3 siRNA負載型脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之作用。分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量。P-選擇素：P-sel；E-選擇素：E-sel；P-選擇素醣蛋白配位體1；PSGL-1。#P＜0.05，與未結合之MV組相比。**P＜0.01，與各別重組型蛋白質結合之組相比(n=6)。圖22展示M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之抗凋亡Bcl-xL衍生之BH4主結構負載型脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之作用。分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量。P-選擇素：P-sel；E-選擇素：E-sel；P-選擇素醣蛋白配位體1；PSGL-1。#P＜0.05，與未結合之MV組相比。**P＜0.01，與各別重組型蛋白質結合之組(負載有抗凋亡Bcl-xL衍生之BH4主結構)相比(n=6)。圖23展示M6PR+半乳糖凝集素3、M6PR+P-選擇素、Siglec 2+P-選擇素及Siglec 2+半乳糖凝集素3結合之卡斯蛋白酶3抑制劑負載型脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之協同作用。分析血小板計數(PLT)及血漿丙胺酸轉胺酶(ALT)含量。P-選擇素：P-sel；半乳糖凝集素3：Gal3。##P＜0.01，與無BSA組相比。*P＜0.05，**P＜0.01，與各別單一重組型蛋白質結合之組(負載有卡斯蛋白酶3抑制劑)相比(n=6)。圖24展示M6PR及P-選擇素(P-sel)結合之脂質體/MV對靶向受損組織之螢光標記之CD34+幹細胞的促進作用之IVIS分析。本文中展示經TAA處理之小鼠模型中之肝臟。圖25展示M6PR、M6PR+P-選擇素-、M6PR+E-選擇素-及M6PR+PSGL-1結合之脂質體/MV對經TAA處理之小鼠之救援之作用。分析血漿天冬胺酸轉胺酶(AST)含量。P-選擇素：P-sel；E-選擇素：E-sel；P-選擇素醣蛋白配位體1；PSGL-1。#P＜0.05，與未結合之MV組相比。**P＜0.01，與各別M6PR結合之脂質體/MV組相比(n=6)。圖26展示MP負載型抗癌藥物對腫瘤之生長率之作用。(a)各組之腫瘤曲線。(b)各組之腫瘤之重量及體積。媒劑：標準生理食鹽水(對照物)，MMC：絲裂黴素C(抗癌藥物)。圖27(a)及(b)展示蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星(doxorubicin))可抑制腫瘤生長率(參見圖27(a))且亦可降低小鼠死亡率(圖27(b))。圖28展示脂質體負載型絲裂黴素C對脂肪小鼠之作用。脂質體-藥物：脂質體負載型絲裂黴素C，CIg：對照性Ig。圖29(a)及(b)展示蛋白質結合之經工程改造之脂質體(含有多柔比星)可降低小鼠之體重增長率(a)。此外，抗脂肪抗體或脂質體(含有多柔比星)不會引起肝功能指數增長(b)。圖30展示與血清及細胞(C6/36)衍生之MV相比，血漿MV以相對較高之表面P-選擇素含量來表現P-選擇素。藉由流式細胞測量術進行分析。*P＜0.05，與血清衍生之MV組相比(n=4)。圖31展示TAA小鼠模型中血漿衍生之MP對肝臟損傷之救援之作用(n=4)。圖32展示血漿肝酶AST含量，其指示實驗小鼠之肝功能(AST含量越高表明肝功能越低)。*P＜0.05，與血清衍生之MV組相比(n=4)。此等結果表明血漿MV能夠救援靶向組織中之損傷。

Claims

一種蛋白質結合之囊泡，其包含表現或結合於該囊泡之表面之一或多種凝集素或其片段及視情況選用之藥劑；其中該凝集素或其片段選自由以下組成之群：陽離子依賴性甘露糖-6-磷酸受體(M6PR)、P-選擇素、E-選擇素、L-選擇素、P-選擇素-配位體-1(PSGL-1)、CD22、CD206、半乳糖凝集素3、磷脂結合蛋白V、CD31、整合素αLβ2、VE-鈣黏素、CD44及Siglec 2，其用作第一蛋白質。
如請求項1之囊泡，其中該藥劑囊封於該囊泡內或連接至該囊泡之外表面。
如請求項1之囊泡，其中該囊泡為脂質體或微胞。
如請求項1之囊泡，其中該囊泡可經人工工程改造或細胞衍生。
如請求項1之囊泡，其包含選自由以下凝集素或其片段組成之群之第二蛋白質：CD300a、CD47、凝血栓蛋白1(TSP1)及CD36、Toll樣受體4(TLR4)或其片段。
如請求項1之囊泡，其包含一或多種如請求項1之第一蛋白質及一或多種如請求項5之第二蛋白質。
如請求項1之囊泡，其包含M6PR與P-選擇素、E-選擇素、PSGL-1或半乳糖凝集素3之組合。
如請求項1之囊泡，其包含Siglec 2與P-選擇素、半乳糖凝集素3或CD31之組合。
如請求項1之囊泡，其包含P-選擇素或M6PR與TLR4、半乳糖凝集素3、CLEC2、整合素αLβ2或CD31之組合。
如請求項1之囊泡，其中該藥劑為診斷造影劑、細胞存活增強劑、細胞存活抑制劑、細胞組分、細胞器、細胞、細胞毒性劑、抗腫瘤藥物、毒素或抗體、脂質、蛋白質、DNA、RNA、治療劑或奈米材料。
如請求項1或5之囊泡，其中該藥劑包含第一蛋白質之拮抗劑及/或第二蛋白質及第二蛋白質之拮抗劑，能夠充當解毒劑以減少對自噬及/或凋亡細胞以及含有自噬及/或凋亡細胞之組織之囊泡靶向。
如請求項11之囊泡，其中該第一蛋白質及該第二蛋白質之拮抗劑包含可溶性形式、相應配位體以及中和及阻斷抗體。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之囊泡及醫藥學上可接受之載劑。
一種如請求項1至12中任一項之蛋白質結合之囊泡之用途，其用於製備將藥劑靶向遞送至自噬及/或凋亡細胞以及含有該自噬及/或凋亡細胞之組織之藥劑。
如請求項14之用途，其中該藥劑之投與方法額外包含向標靶細胞或標靶組織投與自噬及/或凋亡誘導劑之步驟。
如請求項14之用途，其中該藥劑係針對與自噬失調相關聯之疾病。
如請求項16之用途，其中該與自噬失調相關聯之疾病為創傷、暴露於化學及物理有毒因素、遺傳疾病、年齡相關之疾病、心血管疾病、感染性疾病、贅生性疾病、神經退化性疾病、代謝疾病、老化、肥胖症、癌症、由β-澱粉狀蛋白或α-突觸核蛋白或毒性誘導之神經退化、肌肉退化病狀或由囊腫性纖維化引起之慢性肺炎。
如請求項15之用途，其中該藥劑係針對與凋亡變化相關聯之疾病。
如請求項18之用途，其中該與凋亡變化相關聯之疾病為創傷、暴露於化學及物理有毒因素、遺傳疾病、年齡相關之疾病、心血管疾病、感染性疾病、贅生性疾病、神經退化性疾病、代謝疾病、老化、肥胖症、癌症、由β-澱粉狀蛋白或α-突觸核蛋白或毒性誘導之神經退化、肌肉退化病狀或由囊腫性纖維化引起之慢性肺炎，或自體免疫疾病。
如請求項19之用途，其中該神經退化性病症為阿茲海默症(alzheimer)、帕金森氏病(parkinson)、亨廷頓氏病(huntington)、肌肉萎縮性側索硬化或中風，該心臟血管病症為局部缺血、心臟衰竭或感染性疾病，且該自體免疫疾病為全身性紅斑性狼瘡症、自體免疫性淋巴增生症候群、類風濕性關節炎或甲狀腺炎。
如請求項16或18之用途，其中該藥劑係診斷劑或治療劑。