TWI707693B - 於蛋白質溶液中控制雙硫鍵形成之方法 - Google Patents

Abstract

本發明揭示經研發用於控制藉由生物過程所產生之多聚體蛋白質(multimeric protein)的多肽之間二硫鍵形成的方法。亦揭示可控制該二硫鍵形成的蛋白質溶液參數(protein solution parameter)。在一個實例中，本發明揭示的方法能夠用於控制半抗體分子(half antibody molecule)在抗體溶液中的比例。

Description

於蛋白質溶液中控制雙硫鍵形成之方法 相關申請

本申請案主張2014年5月28日所申請的美國臨時申請案62/004,175號的權益，且該申請之揭示內容明確併入本文作為參考。

本發明涉及生物技術方法以及重組蛋白和抗體的生物製造。

蛋白質的多肽之間的二硫鍵形成是正確的蛋白質裝配和結構的一個關鍵面向。蛋白質的多聚體化可能依賴於多肽(例如多肽單體/多聚體)之間形成充分程度的二硫鍵。抗體代表一類蛋白質，其特別依賴於二硫鍵形成。

抗體通常由四個多肽構成，即兩條輕鏈和兩條重鏈(L：H：H：L)。大多數抗體在四條多肽鏈之間含有二硫鍵。重鏈多肽之間的二硫鍵有時不會形成，導致形成在兩對重鏈和輕鏈之間不含鏈間二硫鍵的抗體。通常而言，參見圖1。這些抗體已被稱為半抗體(在本文中縮寫為「Hab」)。

某些抗體類別和類型更容易形成半抗體，如免疫球蛋白G，亞類4(本文縮寫為「IgG4」)的抗體。在天然抗體和重組抗體二者的生產中， 顯著比例的IgG4(至少高達35%)被製成半抗體(halfantibodies)(Miesageset al.,2012,Biotechnol Bioeng.109(8)：2048-58)。

在生理條件下，由於兩個重鏈-輕鏈抗體半部之間的強力非共價相互作用，半抗體通常作為完整的、功能性抗體存在，儘管缺乏鏈間二硫鍵。(Roseet al.,2011,Structure,19(9)：1274-82)。半抗體形成與異常蛋白質的形成相關(參見圖1)。例如，IgG4抗體中的半抗體形成可能是由於鉸鏈區的一級胺基酸序列和結構，其導致IgG4抗體能夠進行動態的Fab臂交換，其中兩個抗體能夠彼此重組以形成雙特異性抗體。(參見，例如，美國專利4,470,925號；美國專利申請公開US 2011/0086366 A1號)。IgG4亞類的這種特徵可能是由鉸鏈區柔性的增加引起的，這使其更容易形成環狀鏈內二硫鍵。(Bloomet al.,1997,Protein Sci.6(2)：407-15；Schuurmanet al.,2001,Mol Immunol.38(1)：1-8)。半抗體的形成可以追溯到重鏈恒定結構域中的缺失，如在某些骨髓瘤中產生的抗體中(Spiegelberget al.,1975,Biochemistry 14(10)：2157-63)。

目前尚不知曉半抗體與任何獨特的臨床症狀或毒理學相關。然而，半抗體的濃度是產生和/或製造治療性IgG4抗體的關鍵品質屬性。對於能夠用來控制最終藥物物質中多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵形成的上游或下游抗體加工條件的程度上瞭解是貧乏的。

本文所揭示之發明涵蓋經研發用於控制藉由生物過程所產生的蛋白質的多肽之間二硫鍵形成的方法學。一方面，本發明包括用於控制通過生物過程產生的多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵數目的方法。 這一方面的某些具體實施例包括以下步驟：(a)將多肽在生物過程中特定的時間點與條件溶液(conditioned solution)接觸，其中該條件溶液包含一種或多種預定的溶液參數，和(b)將包含該多肽的條件溶液在預定的溫度培育預定的時間，其中該多肽與該條件溶液的培育控制了蛋白質多肽間的二硫鍵形成。在某些具體實施例中，當應用本文揭示的方法時，蛋白質多肽之間的二硫鍵數目增加。在其它具體實施例中，蛋白質多肽之間的二硫鍵數目減少。而在具體實施例中，蛋白質多肽之間的二硫鍵數目得到維持。

在本文所揭示方法的某些具體實施例中，該預定的溶液參數包括下列一種或多種：氧化還原試劑本體(redox reagent identity)、氧化還原試劑濃度、pH、氣體本體、溶解的氣體濃度、電導率和活細胞密度。

在本文所揭示方法的某些具體實施例中，該氧化還原試劑本體是2-巰基乙胺(2-MEA)、還原型穀胱甘肽、氧化型穀胱甘肽、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)或亞硫酸鈉。在這些具體實施例的一些中，該氧化還原試劑本體是2-巰基乙胺(2-MEA)。在這些具體實施例的一些中，該氧化還原試劑的莫耳濃度(molarity)與蛋白質的莫耳濃度之比為至少約4：1、8：1、16：1或32：1。

在本文所揭示方法的某些具體實施例中，該培育的預定溫度為約2℃至約23℃之間。在其它具體實施例中，該培育的預定溫度為約23℃至約37℃之間或更高。在本文所揭示方法的一些具體實施例中，在培育期間對包含該多聚體蛋白質的多肽的條件溶液進行混合。

在一些具體實施例中，本文所揭示方法的生物過程包括批式、半連續或連續生物過程。在一些具體實施例中，將該多聚體蛋白質的多肽在生物過程中的特定時間點與條件溶液接觸，該時間點發生在生物 過程中在生物反應器操作和/或進料批式細胞培養操作之後。

在某些具體實施例中，本文所揭示方法進一步包括在該生物過程中的特定時間點將該多肽從該生物過程中移出的步驟。一些此等具體實施例中，本文所揭示方法進一步包括在培育之後將該多肽返還至該生物過程的步驟。

本文所揭示方法的另一方面，將該多聚體蛋白質的多肽與條件溶液在生物過程中的特定時間點接觸，該特定時間點為當多肽處於包含多個細胞的溶液中時。一些此等具體實施例中，該特定時間點是當該多肽位於包含多個細胞的生物反應器、容納槽(holding tank)或非生物反應器單元操作容器中的時間點。

在本文所揭示方法的另一方面，將多聚體蛋白質的多肽與條件溶液在特定時間點接觸，該時間點是當該多聚體蛋白質處於無細胞溶液中時。一些此等具體實施例中，該特定時間點發生在病毒滅活、調節、色譜、過濾、稀釋、濃縮步驟或任何無細胞的生物過程步驟過程中。在其它具體實施例中，該特定時間點發生在生物過程的澄清階段、澄清的收穫品階段、捕獲階段、中間色譜階段(intermediate chromatography stage)或精修色譜階段(polishing chromatography stage)過程中。在這些具體實施例的一些中，該生物過程中的特定時間點包括其中該多肽位於容納槽中的時間點。在某些其它具體實施例中，該條件溶液的pH包括該多肽在培育步驟之後為約3.0至約5.0之間。

在一個具體實施例中，含有該多聚體蛋白質的多肽的無細胞溶液包含蛋白A洗提液(Protein A eluate)。在另一具體實施例中，含有該多聚體蛋白質的多肽的無細胞溶液包含澄清的收穫品。

在本文所揭示方法的一些具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽是蛋白質的單體。在其它具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽是蛋 白質的多聚體。

在另一方面，根據本文所揭示方法進行控制的多聚體蛋白質是抗體。在這些具體實施例的一些中，該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽。在其它具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽包含輕鏈多肽。而在其它具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽和輕鏈多肽。在一個具體實施例中，本文所揭示方法中的抗體是IgG4抗體。在另一具體實施例中，本文所揭示方法中的抗體包括那他珠單抗(natalizumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)或夫蘇木單抗(fresolimumab)。

在另一方面，根據本文所揭示方法進行控制的該多聚體蛋白質是抗體片段。在這些具體實施例的一些中，該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽。在其它具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽包含輕鏈多肽。而在其它具體實施例中，該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽和輕鏈多肽。在一個具體實施例中，本文所揭示方法的抗體片段是IgG4抗體片段。

而在另一方面，根據本文所揭示方法進行控制的該多聚體蛋白質是非抗體蛋白質。在某些具體實施例中，該非抗體方法是酶。

在另一方面中，本文揭示了一種控制包含抗體分子群體的溶液中半抗體分子的比例的方法。這一方面的某些具體實施例包括以下步驟：(a)將該包含抗體分子群體的溶液與條件溶液接觸，其中該條件溶液包含預定的溶液參數，和(b)將包含該抗體分子的條件溶液在預定的溫度培育預定的時間，其中將該抗體分子與該條件溶液一起培育控制條件抗體溶液中半抗體分子的比例。在這一方面的某些具體實施例中，該預定的溶液參數包括氧化還原試劑選擇、氧化還原試劑濃度、pH、氣體選擇、溶解的氣體濃度、電導率、活細胞密度和/或蛋白質濃度。

在一些具體實施例中，該條件抗體溶液中半抗體分子的比例低於30%。在其它具體實施例中，該條件抗體溶液中半抗體分子的比例低於20%。而在其它具體實施例中，該條件抗體溶液中半抗體分子的比例低於15%。

圖1：能夠對其應用控制二硫鍵形成的生物製造方法的示例性多聚體蛋白質的示意圖。圖1A描繪了完整抗體(左)和半抗體(右)，其中蛋白質單體亞基(粗線)通過二硫鍵(細線)和強力非共價相互作用(星號)彼此聯合。在這種實例中，完整抗體含有全部多聚體亞基之間的二硫鍵，包括兩個較大重鏈亞基之間的鏈間二硫鍵。在半抗體中，鏈間二硫鍵反而作為鏈內二硫鍵存在，從而使得重鏈亞基之間不存在共價鍵。然而，強力非共價相互作用維持了兩個重鏈亞基之間的強力聯合。完整抗體或半抗體可對單一靶物或對兩種不同的靶物(雙重特異性)具有特異性。圖1B描繪了經由鏈間二硫鍵彼此相連的抗體片段(左)或在片段內鏈內二硫鍵的情況下彼此完全分開的抗體片段(右)。在這種情況下，由於缺乏蛋白質的某些區段，在片段之間不存在強力非共價相互作用，並且因此在存在鏈內二硫鍵時該抗體片段彼此不聯合。這些片段可能對相同的靶物或對兩種不同的靶物(雙重特異性)具有特異性。

圖2：生物過程的單元操作的示意圖，包含用於實施本文所揭示方法的多個時間點。方法的實施可以(1)在單元操作之內，如通過向生物反應器添加或包括在色譜柱的清洗步驟中，(2)在單元操作之間，如在生物反應器和收穫品容納槽之間的轉移過程中，或(3)在加工中間產品(intermiediate)如色譜洗提液或生物收穫品的保持步驟(hold step)過 程中。其它生物過程方案是可能的，包括在該生物過程中包括不同的或另外的單元操作。變化的實例包括其它澄清操作(除了離心和深度過濾)或包括另外Polishing的色譜步驟。

圖3描繪了含有細胞的(未澄清的收穫品)保持研究(hold study)，在該研究中，保持時間、溫度和初始活細胞密度(VCD)有所變化。半抗體含量占全部抗體分子的百分比作為保持時間(天數)的函數顯示於圖3A和圖3C。在圖3A中，半抗體含量作為保持時間的函數在三個不同的溫度下測量：8℃/寒冷(圓圈)、21℃/室溫(方形)或37℃/溫暖(三角)。在圖3C中，作為保持時間的函數測量混合樣品(圓圈)或未混合的低VCD樣品(菱形)的半抗體含量。活細胞密度以百萬細胞每mL(x10⁶細胞每mL)作為保持時間(天數)的函數示於圖3B和圖3D。在圖3B中，半抗體含量作為保持時間的函數在三個不同的溫度下測量：8℃/寒冷(圓圈)、21℃/室溫(方形)或37℃/溫暖(三角)。在圖3D中，作為保持時間的函數測量混合樣品(圓圈)或未混合的低VCD樣品(菱形)的半抗體含量。

圖4描繪了在含有細胞的(未澄清的收穫品)保持研究中混合對IgG4半抗體的影響。在通過旋轉混合(虛線圓圈)或沒有混合(實線圓圈)的條件下的半抗體含量占全部抗體分子的百分比作為保持時間(天數)的函數顯示。將樣品保持在8℃。兩種條件下的初始細胞存活力均為大約2.5x10⁶細胞/mL。

圖5描繪了在含有細胞的(未澄清的收穫品)保持研究中添加氧化還原試劑的影響。半抗體含量占全部抗體分子的百分比作為保持時間(天數)的函數作為無穀胱甘肽添加(圓圈)、添加5mM還原型穀胱甘肽(GSH)和0.5mM氧化型穀胱甘肽(GSSG，方形)或添加0.5mM GSH和5mM GSSG(三角)的函數顯示。將樣品保持在8℃保持指定的時 間。全部三種條件的初始細胞存活力均為大約2.5x10⁶細胞/mL。

圖6描繪了在高pH(7.1)和低pH(6.9)兩個設定點在接近其運行終點處向生物反應器添加0.5mM 2-MEA、2mM 2-MEA和5mM還原性穀胱甘肽(GSH)氧化還原試劑的影響。在pH 7.1(空心方形)或pH 6.9(實心方形)添加2mM 2-MEA、在pH 7.1(空心方形)或pH 6.9(實心方形)添加0.5mM 2-MEA或添加5mM還原型穀胱甘肽(GSH)(實心菱形)的條件下，半抗體含量占全部抗體分子的百分比作為保持時間(天數)的函數顯示。空心方形和實心方形的數據系列幾乎彼此重疊。

圖7描繪了兩種不同的初始細胞存活力對用2-MEA處理的半抗體比例的影響。半抗體含量占全部抗體分子的百分比作為處理後保持時間(小時)的函數顯示。樣品獲得自生物反應器，將該生物反應器控制的各個參數控制在指定的程度。研究的兩種不同的初始存活力為在進料批式培養第12天(D12)的70%存活力(圓圈)和在進料批式培養第14天(D14)的45%存活力(方形)。

圖8描繪了溫度和pH條件對獲得自先前用2-MEA處理的生物反應器的澄清的收穫品的影響。半抗體含量占總抗體分子的百分比作為保持時間(小時)的函數，作為以少於0.1的pH增加(實心菱形)或大於0.5的pH增加(空心菱形)在2-8℃保持或在室溫(21℃)以少於0.1的pH增加(實心三角)或大於0.5的pH增加(空心三角)的函數。

圖9描繪了2-MEA處理對在室溫(21℃)或8℃培育保持之後的澄清的收穫材料中半抗體比例的影響。圖9描繪了每種樣品在用或不用2-MEA處理的條件下在最初兩個小時中的半抗體比例。測試條件包括室溫(21℃)不添加2-MEA(圓圈)、室溫(21℃)添加2-MEA(菱形)、8℃不添加2-MEA(方形)、8℃添加2-MEA(三角)。

圖10描繪了在室溫(21℃)或8℃培育保持後2-MEA處理對在澄 清的收穫材料中半抗體比例的影響。圖10描繪了各樣品在7天(168小時)中使用或不使用2-MEA處理的條件下半抗體的比例。試驗條件包括：室溫(21℃)不添加2-MEA(圓圈)，室溫(21℃)添加2-MEA(菱形)，8℃不添加2-MEA(方形)，和8℃添加2-MEA(三角)。

圖11描繪了用於評價多種氧化還原試劑控制生物過程中存在的半抗體比例的能力的非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的結果。將氧化還原試劑加入到蛋白A洗提液並在pH4.8於室溫進行培育2小時。在蛋白A柱上將所有樣品重新純化，以除去任何存在的氧化還原試劑。測試條件包括無氧化還原試劑(泳道1)，2mM 2-MEA(泳道2)，3mM 2-MEA(泳道3)，2mM MEA+2mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)(泳道4)，2mM還原型穀胱甘肽(GSH)(泳道5)2mM GSH+2mM GSSG(泳道6)，2mM巰基乙醇(泳道7)，和2mM二硫蘇糖醇(泳道8)。

圖12描繪了分析IgG4抗體的非還原性十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖像。在變性的條件下，例如在SDS-PAGE上，半抗體表現為與完整抗體的不同條帶。泳道1：分子量標記，泳道10：用半抗體控制方法處理前的IgG4測試樣品，泳道11：用設計為減少總半抗體的半抗體控制方法處理的IgG4測試樣品。

本揭示內容包括控制由生物過程產生的蛋白質的多肽之間二硫鍵形成的方法。測量多肽之間二硫鍵形成(例如數目)的一個方法是測量存在於包含抗體分子群體的溶液中半抗體(Hab)分子的比例。通過測量條件溶液對免疫球蛋白G亞類4(IgG4)抗體溶液中存在的半抗體濃度的影響，測量條件溶液對多肽之間二硫鍵形成的影響。如本文所 揭示的，含多肽的溶液的某些參數對多肽之間二硫鍵的形成具有預料不到的並且是強力的影響。揭示了許多方法以控制二硫鍵形成，包括降低、增加或維持多肽之間二硫鍵形成的程度的策略。如本文中詳細揭示的，這些方法可應用在用於蛋白質生產的典型生物過程內的多個點，該蛋白質生產包括例如抗體蛋白或抗體片段的生產。(圖2)。

IgG4具有數種特性，使它們成為有吸引力的治療候選以及用於測量多肽之間的二硫鍵形成的卓越模型。例如，IgG4具有長血清半衰期和低Fc功能和/或效應子功能(effector function)。(Bruggemann等人，1987，實驗醫學雜誌166(5)：1351-61)。然而，IgG4抗體也有不同尋常的性質，該等性質在體內是不理想的：IgG4抗體是不穩定的、動態分子，其參與Fab臂交換(Fab arm exchange)。施用的治療性IgG4抗體可能與具有不理想的特徵的內源IgG4抗體進行交換。該過程的隨機性引入了不可預測性，這對於人用免疫治療非常不理想。

這些圍繞IgG4的Fab臂交換作用和半抗體的體內影響的不確定性使得最小化最終治療性抗體組合物中存在的半抗體程度是理想的。之前，Hab比例通過將IgG4抗體鉸鏈區的胺基酸序列突變為IgG1鉸鏈區的胺基酸序列來進行降低，這已被證明顯著地穩定了IgG4重鏈之間的共價二硫鍵相互作用(Angalet al.,1993，分子免疫學30(1)：105-8；Schuurman等人，2001；美國專利申請揭示號US 2011/0086366 A1)。改變胺基酸序列和所產生的抗體的蛋白質結構，特別是對於已處於積極的臨床研究中的治療性抗體，提出了科學和監管兩方面的挑戰。結果是，這種誘變策略在許多情況下無法應用，在這些情況下使用具有特定水平半抗體的治療性IgG4的臨床和甚至臨床前經驗一直很重要。因此，必須建立控制半抗體濃度程度的策略以確保整個後續的對治療性IgG4分子的臨床研究和商品化的分子一致 性。

本文所揭示方法包括用於控制由生物過程產生的多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵形成的多種方法。本文所揭示方法包括應用條件溶液的含有細胞的和無細胞的方法，該條件溶液包含預定的溶液參數、包括氧化還原試劑本體、氧化還原試劑濃度、pH、氣體本體、溶解的氣體水平/電導率和/或活細胞密度。這些方法可以在生物過程內的一個或多個點來控制、降低、增加或維持多聚體蛋白質的多肽之間的二硫鍵形成，諸如例如IgG4抗體的重鏈之間的二硫鍵形成。多肽單體和/或多聚體之間二硫鍵的形成的控制對於實現多聚體蛋白質產品的生命週期內產品質量的一致性或在生產多聚體蛋白質的生物等效版本或生物類似版本時是必需的。

條件溶液

在一個方面中，本文呈現的方法揭示了將蛋白質的多肽與「條件溶液」接觸，該「條件溶液」已經過優化以產生理想的多肽之間二硫鍵的形成或數目。這種條件溶液已經預先確定來控制所需二硫鍵的形成。在某些具體實施例中，該條件溶液已經預先確定以減少蛋白質的多肽之間二硫鍵的數目。在其它具體實施例中，該條件溶液已經預先確定以增加蛋白質的多肽之間二硫鍵的數目。又在其它具體實施例中，該條件溶液已經預先確定以維持蛋白質的多肽之間二硫鍵的數目。培育條件和預定的條件參數對二硫鍵形成的影響可以通過測量蛋白質溶液中存在的IgG4半抗體的比例來證明。在所揭示方法的一些具體實施例中，測定包含多聚體蛋白質的溶液中半抗體分子(Hab)的比例。半抗體分子的比例的測定可以用作測量多聚體蛋白質的多肽之間的二硫鍵形成的方法。

作為根據本所揭示方法中使用的「條件溶液」包括一種或多種預定的溶液參數。在某些具體實施例中，在將所揭示方法應用於產生蛋白質的生物過程之前，在將該方法應用於用來產生感興趣的蛋白質的生物過程之前，測定條件溶液的參數。在該方法的一個方面，該條件溶液是含有細胞的。在另一個方面中，該條件溶液是無細胞的。關於這些方面中每一個的其它細節在本說明書別處揭示的(見下文)。

對二硫鍵的形成或數目的控制可能受到選擇用於實施該方法的具體多肽、蛋白質和/或蛋白質類別的特性的影響。對二硫鍵的形成的控制也可能受到用於產生感興趣的蛋白質的生物過程的特性的影響，包括例如生物過程的設計和包括該生物過程的單元操作的特性。因此，可能有必要進行初步測試研究以優化一種或多種條件溶液參數來實現使用所選擇的蛋白質和生物過程時期望的結果。這樣的測試研究和實驗的非限制性實例在此揭示(參見「實施例」部分，下文)

本文揭示的不同的預定溶液條件可獨立地或與其它預定溶液條件組合應用。對於示例性研究，參照表2(如下)。每一種本文所揭示的條件根據所揭示方法對蛋白質多肽之間的二硫鍵形成提供了一定水平的控制。一種預定的溶液條件可能會影響在任意給定溶液中的一種或多種其它預定的溶液條件。在一些情況中，一些預定的溶液條件會與一種或多種其它預定的溶液條件「互補」，這允許使用較少的極端條件以產生所期望的二硫鍵形成的結果。例如，在溶液中使用特定的氣體和氣壓(例如，氧氣)可能需要氧化還原試劑的濃度降低以實現與不使用該特定氣體的情況下的溶液相同的結果。在某些具體實施例中，應用預定的溶液條件的組合對二硫鍵的形成產生加合效果。在其它具體實施例中，應用預定的溶液條件的組合產生對二硫鍵的形成產生協同效果。

如本文所使用的，術語「預定的溶液參數」指的是一種或多種參數、特性、性質、組成、含量和/或溶液的其它屬性。

在所揭示方法的一些應用中，Hab分子在溶液中的比例是所期望的二硫鍵形成的結果。一方面，將所揭示方法用於控制包含抗體分子群體的溶液中半抗體分子的比例。在這些應用中，將所揭示方法用於控制涉及Hab的形成的二硫鍵。該方法能夠產生具有期望比例的Hab分子的條件抗體溶液。

在一些具體實施例中，Hab分子在溶液中所期望的比例作為絕對量或絕對量的範圍而被選擇。通過使用所揭示方法，能夠以期望的絕對量或Hab的比例為目標控制溶液中Hab分子的比例。有可能使用所揭示方法來提高或降低Hab的比例。在某些具體實施例中，Hab分子在溶液中的期望的比例小於5%、約5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-50%，或大於50%。

在其它具體實施例中，Hab分子在溶液中所期望的比例作為與應用所揭示方法之前的溶液相比的百分比變化或百分比變化的範圍(如百分比增加或減少)而被選擇。通過使用所揭示方法，能夠以Hab比例的期望的百分比變化為目標控制Hab分子在溶液中的比例。

在一些具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是減少約1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、50%，或更多。在某些其它具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是減少約1-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-50%，或超過50%。又在其它具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是減少約1-50%。

在其它具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是增加大約1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、50%，或更多。在 某些其它具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是增加約1-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-25%、25-30%、30-50%，或超過50%。又在其它具體實施例中，所期望的溶液中Hab分子比例的變化是增加約1-50%。

氧化還原試劑

在所揭示方法的一個方面，預定的溶液參數是條件溶液中使用的氧化還原試劑的本體。如本文所用，術語「氧化還原試劑」是指以混合物的形式含有其還原形式、其氧化形式或其還原形式及其氧化形式的組合的試劑。根據所揭示方法，氧化還原試劑可以取決於對於特定蛋白質和/或生物過程所期望的二硫鍵形成結果而存在或不存在於條件溶液中。在氧化還原試劑存在於條件溶液中的具體實施例中，鑒定一特定的氧化還原試劑用於包括在條件溶液中。

適合於所揭示方法的氧化還原試劑的非限制性實例包括2-巰基乙胺(2-mercaptoethylamine)(2-MEA)、還原型穀胱甘肽、氧化型穀胱甘肽、2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)(DTT)、半胱氨酸、胱氨酸、二硫丁胺(dithiobutylamine)和亞硫酸鈉(sodium sulfite)。取決於特定的蛋白質和/或溶液，某些氧化還原試劑可以產生卓越的結果。普通技術人員能夠對特定蛋白質溶液鑒定、選擇和測試不同的氧化還原試劑，以確定根據所揭示方法使用哪種氧化還原試劑。(參見，例如，美國專利申請揭示號US 20130259882 A1)。在某些具體實施例中，在本文所揭示方法中使用的氧化還原試劑是巰基乙胺(2-MEA)。2-MEA已被證明特異性減少IgG4的鉸鏈區的二硫鍵。(Palmer et al.,1963,Biochem J.,238(7)：2393-2398)。

氧化還原試劑使用已在抗體領域出於不同的目的得到了研究。例 如，氧化還原試劑如2-巰基乙胺(2-MEA)已經被用於特異性減少兩個Fab臂之間的鏈間二硫鍵，以促進Fab臂交換。(King et al.,1992,Biochem J.,281(2)：317-23)。

在本文所揭示方法的某些具體實施例中，一種預定的溶液參數是條件溶液中氧化還原試劑的濃度。可根據所揭示方法使用某個濃度範圍的所選的(多種)氧化還原試劑。一旦選擇了一氧化還原試劑，該氧化還原試劑的濃度必須根據所選擇的氧化還原試劑、蛋白質和/或生物過程進行優化。在條件溶液中存在氧化還原試劑的方法的一些具體實施例中，條件溶液中較低濃度的氧化還原試劑會導致蛋白質多肽之間二硫鍵形成的增加。例如，在一個實驗中，條件溶液中較低濃度的氧化還原試劑的使用導致半抗體分子在溶液中抗體分子群體中的比例降低(表2)。

在條件溶液中存在氧化還原試劑的方法的其它具體實施例中，條件溶液中較高濃度的氧化還原試劑會導致蛋白質多肽之間二硫鍵的形成或數目的減少。例如，在一個實驗中，條件溶液中較高濃度的氧化還原試劑的使用導致半抗體分子在溶液中抗體分子群體中的比例增加。(表2)。

在某些具體實施例中，氧化還原試劑的最佳濃度包括0.01、0.1、0.5、1、2、5、25、50mM或更高。

氧化還原試劑的最佳濃度也可能受到溶液中蛋白質或多肽的濃度的影響。因此，在某些具體實施例中，氧化還原試劑濃度與蛋白質濃度的比例可在確定了條件溶液中的最佳氧化還原試劑參數時進行評估。氧化還原試劑濃度與蛋白質濃度的比例可在除了為條件溶液確定氧化還原試劑濃度之外或替代為條件溶液確定氧化還原試劑濃度來確定。

在某些具體實施例中，氧化還原試劑莫耳濃度與蛋白質莫耳濃度的最佳比例包括至少2：1、4：1、8：1、16：1、32：1、64：1、72：1、88：1、100：1或更高。在該方法的某些具體實施例中，如某些無細胞蛋白質溶液，氧化還原試劑莫耳濃度與蛋白質莫耳濃度的比例包括約4：1至約40：1。

培育時間

在所揭示方法的另一個方面，將條件溶液與該多聚體蛋白質的多肽一起培育預定的時間。如在所揭示方法的其它方面所見，預定的培育時間可能受到選擇用於應用該方法的蛋白質、生物過程和/或其它溶液條件的特性的影響。取決於條件溶液的預定溶液參數，培育時間可以是短如1分鐘或更短，或超過一周或更長。例如，如果氧化還原試劑在條件溶液中的濃度較高時，培育時間可能必需要更短，以避免損害蛋白質。反之，如果氧化還原試劑的濃度較低，培育時間可能必須要更長，以實現期望的對二硫鍵的控制。作為另一說明性實例，如果將蛋白質在特定的pH下培育較長的時間週期可能導致蛋白質的不穩定性，同一蛋白在相同的特定pH值如果只培育很短的持續時間則可能保持穩定。因此，更極端的pH值可被應用到一些蛋白質，如果對培育時間進行相應的調整以盡可能減少蛋白質的不穩定性。這樣的測試研究和實驗的其它非限制性實例在實施例2和圖3中揭示。

培育溫度

在所揭示方法的另一個方面，將條件溶液與多肽一起在預定的溫度培育。如在所揭示方法的其它方面所見，預定的培育溫度可能受到選擇用於應用該方法的蛋白質、生物過程和/或其它溶液條件的特性的 影響。此外，不同的蛋白質在特定的溫度包括不同的穩定性。例如，所期望的結果取決於培育溫度可能更快或更慢發生。在某些具體實施例中，溫度可以降低從而促進二硫鍵形成和半抗體向完整抗體的轉化。在其它具體實施例中，溫度可以提高以促進完整抗體向半抗體的轉化。這樣的測試研究和實驗的另外的非限制性實例在實施例4和圖3中揭示。

在本文所揭示方法的某些具體實施例中，將條件溶液與多肽在約2℃至約40℃的預定溫度下培育。

pH

在所揭示方法的另一個方面，條件溶液中的一種預定的溶液參數是條件溶液的pH值。如在所揭示方法的其它方面所見，條件溶液的最佳pH可能受到選擇用於應用該方法的蛋白質、生物過程和/或其它溶液條件的特性的影響。此外，也可以優化該蛋白質在特定pH值下培育的時間週期。條件溶液的pH通常根據與條件溶液培育後得到的含有多肽的溶液所需的pH來確定。在一些具體實施例中，pH值未經調整，並使其保持在大約中性的pH(例如，在6到8之間)。在某些其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至介於約4.0和約4.8之間。在其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至介於約3.0和4.0之間。在其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至介於約2.5和4.8之間。又在其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至約2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7或約4.8。在某些其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至約2.5或更低。又在其它具體實施例中，將含有多肽的溶液的pH調整至 約4.8或更高。這樣的測試研究和實驗的另外的非限制性實例在實施例10和表3中揭示。

氣體本體和溶解氣體濃度

在該方法的另一方面，一種預定的溶液參數是添加到該條件溶液的氣體本體。根據所揭示方法，取決於對於特定蛋白質和/或生物過程所期望的二硫鍵形成，氣體可以存在或不存在於該條件溶液中。在條件溶液中存在氣體的具體實施例中，一種或多種特定氣體被選擇包括在該條件溶液中。可以選擇的氣體的實例是氧氣(O₂)、二氧化碳(CO₂)、氮氣(N)，以及不同的混合氣體的組合物，如20% O₂/10%CO₂/70%空氣或20% O₂/5%CO₂/75%空氣。

在本文所揭示方法的某些條件溶液中存在氣體的具體實施例中，另一預定的溶液參數是條件溶液中的溶解氣體的水平。可以根據所揭示方法使用選擇的一種或多種氣體的某個範圍的溶解氣體的水平。一旦選擇了氣體，則必須根據所選擇的氣體、蛋白質和/或生物過程對氣體濃度進行優化。

電導率

在該方法的另一方面，一種預定的溶液參數是條件溶液的電導率。根據所揭示方法中，取決於對於特定蛋白質和/或生物過程所需的二硫鍵形成結果，可將電導率設定為期望的水平。電導率可以通過添加鹽，如氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨、磷酸鈉或本領域中已知的修改溶液電導率的其它化學物質來控制。另外，根據它們的典型電導率，可以選擇生物過程中的某些階段作為半抗體控制點。例如，通常在生理電導率(10-15mS/cm)進行細胞培養過程，而離子交換加載材料通常是低電導 率的(<10mS/cm)。

活細胞密度

在該方法的另一方面，一種預定的溶液參數是條件溶液中的活細胞密度。在某些具體實施例中，生物反應器單元操作在特定一天在已經與指定的活細胞密度匹配的生物反應器運轉中終止。根據所揭示方法，取決於對於特定蛋白質和/或生物過程所需的二硫鍵形成結果，條件溶液中可以存在或不存在活細胞。在某些具體實施例中，活細胞密度為至少約2×10⁶細胞/mL。

含有細胞的方法

在一個方面，所揭示方法可以在生物過程中該蛋白質或多肽處於包含多個細胞的溶液(也稱作「含有細胞的溶液」、「含有細胞的懸浮液」或「未澄清的收穫品」)中的時間點上應用。用於蛋白質生產中使用的典型的生物過程，在該生物過程中的特定時間點感興趣的蛋白質存在於包含多個細胞的溶液中。在這些時間點，該蛋白質可以存在於幾個可能的生物過程位置，包括例如生物反應器、容納槽或包含多個細胞的非生物反應器單元操作容器。未澄清的收穫品可以從如進料-批式、批式或灌注(連續)工藝等這些生物反應器工藝獲得。在一些具體實施例中，該方法可以應用在與生物反應器分開的容器中。又在其它具體實施例中，該方法可以在專門設計來使用特定條件溶液實現所需的二硫鍵形成的單元操作容器中應用。例如，可以設計該單元操作容器以實現在特定條件下所期望的半抗體向完整抗體的轉化。這些單獨的容器的非限制性實例包括管式反應器(tubular reactor)、連續攪拌釜反應器(continuous stirred-tank reactor)(CSTR)，和作為循環回路 (circulation loop)。有關這些生物過程位置的其它信息在說明書中的其它位置提供。

在感興趣的蛋白質存在於包含多個細胞的溶液中的方法的一些具體實施例中，將該蛋白質與條件溶液接觸，該條件溶液包括活細胞的群體。在這些具體實施例的某些中，條件溶液可以是包含該蛋白質和多個細胞的相同的溶液。例如，如果將所揭示方法應用到存在於生物反應器中的蛋白質，那麼在該生物反應器中的溶液(例如培養基)將被認為是條件溶液，其包含活細胞。如此，在這種說明性實例中，該預定的溶液參數將對應於已含有感興趣的蛋白質的溶液的參數。在其它這樣的具體實施例中，該方法包括將該蛋白質與自生物過程獲得的條件溶液一起培育，該條件溶液諸如例如在進料-批式或批式生物反應器運轉(campaign)結束時獲得的包含活細胞的溶液。在一些具體實施例中，將所揭示方法應用於進料-批式或批式生物反應器運轉結束時和蛋白質生產生物過程的澄清或捕獲步驟之前。然而，取決於特定的蛋白質、生物過程和所期望的二硫鍵形成的結果，可以在蛋白生產生物過程的幾乎任何階段實施「保持」步驟，這取決於多種考慮，如實現二硫鍵形成的結果所需的時間、試劑的成本和/或實施的簡便性。

在某些具體實施例中，所揭示方法包括一步驟，其中使包含蛋白質的含有細胞的溶液經歷特定的預定時間的「保持」。這種「保持」步驟在典型的蛋白質生產生物過程中是一種非常規的步驟。如實施例中所闡述的，取決於測試條件和條件溶液參數，在細胞存在下保持生物治療性IgG4抗體能夠令人驚訝地減少、增加或大致維持抗體群體中存在的半抗體的比例(參見例如，圖3和實施例1至7)。因此，通過將包含活細胞的條件溶液與多肽一起培育預定的時間，多肽之間的二硫鍵形成能夠得到控制。

在某些具體實施例中，在「保持」步驟中沒有使用受控的進料(controlled feeding)。在另一具體實施例中，對於一個更加精簡過程，生物反應器本身可以作為保持容器使用，並且可以關閉典型的意圖維持細胞存活力的生物反應器控制或進料。如果保持步驟在生物反應器中進行，在培育保持時間內，受控的進料可以繼續、改變或中止。在某些具體實施例中，該方法的「保持」步驟過程中的條件不像生物反應器中那樣受到嚴格地監測和調整。例如，在一些這樣的具體實施例中，「保持」抗體樣品的氧氣水平和pH參數僅以設計成維持或控制細胞存活力或生產率的方式最低限度地監測和調整，或不監測和調整。

在其它具體實施例中，在該方法的「保持」步驟過程中的條件得到積極的監測和調整。例如，在一些這樣的具體實施例中，「保持」抗體樣品的氧氣水平和pH參數受到積極和嚴密的監測和調整。在保持步驟過程中積極監測和調整條件溶液的條件可發生在保持步驟的整個持續過程中、在保持步驟的部分持續過程中，或不在保持步驟的持續過程中。在保持步驟過程中積極監測和調整條件溶液可以應用於確保在抗體樣品上所期望的結果的再現性，即使這種積極的監測和調整可能對於實現所需的二硫鍵形成的結果而言不是必需的。這種包括保持步驟的方法已在如本文所揭示的使用各種條件、溶液和配置的多種規模下得到了證明。保持含有多聚體蛋白質的溶液的單元操作(例如，所揭示方法的「保持」步驟)可以使用至少一個貯存器(reservoir)進行。貯存器的體積可以在較寬的範圍內取決於生產該蛋白質所使用的生物過程而變化。例如，可用於實現這種單元操作的貯存器可具有約1mL至約20,000L的體積，如在商業生產生物過程中。貯存器能夠將含有該抗體的流體容納一段範圍寬泛的時間段，其範圍從約1分鐘 長達3周或更長的時間(在特定的生產設計的具體實施例中)。貯存器可同時用於容納和冷藏(例如，在低於25℃、低於15℃或低於10℃的溫度)或容納和加熱(例如，在高於25℃、高於30℃或高於35℃的溫度)含有該抗體的溶液。該貯存器可具有任意形狀，包括圓形圓柱體、橢圓形圓柱體或大致上為長方形的密封且非滲透性的袋。

在未澄清的收穫品保持中的不同培育條件已經顯示導致了不同的結果。在一個方面，對於該含有細胞的蛋白質溶液而言最重要的預條件溶液(preconditioned solution)包括保持時間、保持溫度、收穫時的細胞存活力(通過收穫日控制)和攪拌(參見圖3-4)。在一個示例性具體實施例中，可以收集含有細胞的(未澄清的)收穫品並冷卻至8℃持續10天或更長時間，然後是在澄清和捕獲下游步驟中的後續加工。

此外，如以上問所揭示的，本文提供的方法揭示了向含有細胞的蛋白質溶液添加氧化還原試劑從而加速多肽之間的二硫鍵形成。例如，如通過半抗體向完整抗體的轉化所觀察到的，包含氧化還原試劑的含有細胞的蛋白質溶液可以以比不含氧化還原試劑的未澄清的收穫樣品更快的速率和更大的程度降低Hab的比例(圖5)。在一個具體實施例中，為了降低半抗體的水平，可以將氧化還原試劑的雞尾酒混合物(cocktail)，例如0.5mN還原型穀胱甘肽和5mM氧化型穀胱甘肽，添加到含有細胞的收穫品，持續數天而非數周，再進行後續的下游加工。

無細胞的方法

在另一方面，所揭示方法可以在生物過程、生物過程步驟或單元操作中多肽處於「無細胞」溶液中的時間點處應用。這些無細胞溶液包含感興趣的蛋白質，但基本上沒有細胞存在於該溶液中。這些無細 胞溶液中較低水平的異質性和複雜性對於應用的本文所揭示方法是有利的。在某些具體實施例中，無細胞溶液包含蛋白A洗提液。在其它具體實施例中，無細胞溶液包含澄清的收穫品。其它溶液、緩衝劑和/或洗提液可以用於根據本文描述的方法中的無細胞溶液中。

對於蛋白質生產中使用的典型的生物過程，感興趣的蛋白質存在於生物過程、生物過程步驟或單元操作特定時間點的「無細胞」溶液中。在某些示例性具體實施例中，所揭示方法應用於病毒滅活、調節、色譜、過濾、稀釋、濃縮或任何其它無細胞的生物過程步驟過程中的時間點。(圖2)。其中蛋白質溶液可以是無細胞的生物過程中的步驟的其它非限制性實例，包括，但不限於，澄清的收穫品、捕獲洗提液、中間色譜過程的中間產品或精修色譜過程的中間產品。(圖2)。在整個生物過程中有許多應用所揭示方法的機會，其典型地包括其中溶液相的條件得到積極操作的步驟，包括例如當降低pH以實現病毒滅活或當在色譜柱操作之前或之後調整pH或電導率時。在某些具體實施例中，所揭示方法會應用在澄清的收穫品階段。在某些其它具體實施例中，所揭示方法會應用在捕獲洗提液階段。在一些具體實施例中，該無細胞溶液是捕獲後溶液。

如本文所揭示的，用於無細胞溶液方法的最佳培育條件和預定的條件參數應首先針對感興趣的特定蛋白質確定。培育條件和預定的條件參數對二硫鍵形成的影響可以通過測量存在於該蛋白質溶液中的半抗體(例如，IgG4半抗體)的比例來證明。在一些具體實施例中，可以將氧化還原試劑添加到無細胞溶液，例如過程中間產品，以迅速提高多聚體蛋白質的多肽之間的二硫鍵形成。使用本文所揭示方法，通過測量無細胞的蛋白質溶液中IgG4半抗體的比例，多肽之間的二硫鍵能夠有效地通過以特定濃度添加某些氧化還原試劑來控制，該氧化 還原試劑包括例如2-MEA。例如，進行了優化培育條件和預定的條件參數以減少半抗體的研究，其評估示例性條件如pH值、時間、溫度、氧化還原試劑的濃度和IgG4抗體的濃度。參見，例如，實施例9至15。在一個這樣的示例性研究中，當將包含IgG4抗體的澄清的收穫品與氧化還原試劑2-巰基乙胺(2-MEA)一起在2-8℃培育並在蛋白A柱上純化以去除氧化還原試劑時，Hab的比例在1小時內從約18%降低至約9%內，並在一定條件下，在短至10分鐘內。(參見，例如圖9)。在某些具體實施例中，在所揭示方法中使用的氧化還原試劑為2-MEA。2-MEA被證明是用於降低測試的示例性抗體溶液中Hab含量最有效的氧化還原試劑。在某些具體實施例中，無細胞溶液中的多肽之間二硫鍵的形成高度依賴於條件溶液的pH。

定義

如本文所用，在名詞前的單詞「一個/一種」表示一個或多個/一種或多種該特定的名詞。例如，短語「抗體」表示「一種或多種抗體」。

如本文使用的術語「抗體」泛指任何免疫球蛋白(Ig)分子，其由四條多肽鏈組成，兩條重(H)鏈和兩條輕鏈(L)，或其任何功能突變體、變體或衍生物，它們保留了免疫球蛋白(Ig)分子的基本表位結合特徵。在大多數的抗體中，每條重鏈由重鏈可變區(在本文中縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區組成。重鏈恒定區由三個結構域，即CH1、CH2和CH3組成。每條輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區組成。輕鏈恒定區由一個結構域CL組成。的VH和VL區可以進一步細分為高變區，其稱為互補決定區(CDR)，穿插以更保守的稱為框架區(FR)的區域。每個VH和VL由三個CDR和四個FR構成，佈置為從胺基末端到羧基末端以下述順序：FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3、CDR3和FR4。抗體還可以是雙特異性抗體、三特異性抗體、二聚體抗體、三聚體抗體或多聚體抗體。(參見，例如，美國專利申請揭示號US20120251541 A1)。

如本文所用的術語「抗體片段」指完整抗體的一部分，並且通常是一條多肽鏈(或是重(H)鏈或是輕(L)鏈)，其保留了Ig分子的基本表位結合特徵，或其任何功能突變體、變體或衍生物。抗體片段的實例包括，但不限於，F_ab、F_ab'、F_(ab')2和F_v片段，功能性重鏈片段，功能性輕鏈片段，Affibodies®和Nanobodies®。

「人源化抗體」是源自非人類物種的抗體，其中在重鏈和輕鏈的框架和恒定結構域的某些胺基酸經過了突變，從而避免或消除在人中的免疫應答。非人(例如鼠)抗體的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗體。對於大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的高變區的殘基由來自非人物種(供體抗體)的高變區的殘基替換，該非人物種如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類，其具有所需的特異性、親和力和能力。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(FR)殘基被相應的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含未在受體抗體或供體抗體中發現的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能。在一般情況下，人源化抗體會包含基本上全部的至少一個通常為兩個可變域，其中全部或基本上全部高變環對應於那些非人免疫球蛋白，而全部或基本上全部FR區是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體通常還會包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那部分。更多詳情，參見Joneset al.,1986,Nature 321：522-525；Riechmann et al.,1988,Nature 332：323-329；Prestaet al.,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596。

治療性抗體的非限制性實例包括：帕尼單抗(panitumumab)、奧馬 珠單抗(omalizumab)、阿巴伏單抗(abagovomab)、阿昔單抗(abciximab)、阿托續單抗(actoxumab)、阿達木單抗(adalimumab)、阿德木單抗(adecatumumab)、阿非莫單抗(afelimomab)、阿托珠单抗(afutuzumab)、阿珠单抗(alacizumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿表妥昔单抗(amatuximab)、马安莫单抗(anatumomab)、阿泊珠单抗(apolizumab)、阿替奴单抗(atinumab)、托珠單抗(tocilizumab)、巴利昔單抗(basilizimab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、貝利單抗(belimumab)、貝伐單抗(bevacizumab)、比西單抗(biciromab)、卡那单抗(canakinumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、迪諾賽单抗(densumab)、依庫珠單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依法珠單抗(efalizumab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、达珠单抗(etaracizumab)、依那西普(etanercept)、戈利木單抗(golimumab)、英利昔單抗(infliximab)、那他珠單抗(natalizumab)、帕利珠單抗(palivizumab)、帕尼單抗(panitumumab)、帕妥珠單抗(pertuzumab)、蘭尼單抗(ranibizumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托珠單抗(tocilizumab)、曲妥珠單抗(trastuzumab)。

如本文所用的術語「非抗體蛋白質」是任何無法通過以下任何一種免疫球蛋白特異性親和力相互作用而被結合的蛋白質：蛋白A結合至Fc區，蛋白G結合至Fab區，蛋白G結合至Fc區，或蛋白L結合至免疫球蛋白輕鏈。在某些具體實施例中，非抗體蛋白質是生物治療性蛋白質。生物治療性蛋白質可以是，例如，工程化的蛋白質、酶、激素、血液因子、生長因子或免疫因子。術語「非抗體蛋白質」可指生物過程的任何階段的蛋白質產物，包括純化階段之前、期間或之後。非抗體蛋白質是純化和/或分離自包含非抗體蛋白質和其它成分的非均相溶液的重組蛋白質。這類成分的實例是污染性蛋白、脂質和核酸， 其存在於液體培養基中或來自宿主細胞(例如，來自哺乳動物、酵母或細菌宿主細胞)，以及其它生物污染物(例如，病毒和細菌污染物)。

術語「多聚體蛋白質」在本文中定義為包括這樣的蛋白質，其包含通過一個或多個二硫鍵而關聯或結合的一個或多個。多聚體蛋白質可以作為超過一個多肽單體子單元的複合物存在，其中每個單體子單元與一個或多個其它單體子單元通過一個或多個二硫鍵相關聯。多聚體蛋白質可以包含兩個或更多個相同的多肽鏈，而不含任何不同的多肽鏈(「同源多聚(homomultimeric)」)。「同源多聚體」由同一多肽鏈的兩個或更多個拷貝組成。類似地，「同源二聚體」由同一多肽鏈的兩個拷貝組成，「同源三聚體」由同一多肽鏈的三個拷貝組成，等等。或者，多聚體蛋白質可以包含至少兩種不同的多肽鏈。(「異源多聚(heteromultimeric)」)。如果該異源多聚體具有三個或更多個多肽鏈，那麼其中一些可以是彼此相同的，只要至少有一個與其它不同。術語「多聚體」涵蓋指定了多聚體含有多少多肽鏈的術語如「二聚體」、「三聚體」或「四聚體」。抗體是多聚體蛋白質的實例。抗體樣多聚體蛋白質的實例包括scFv、雙抗體(diabody)和三體(tribody)或三抗體分子(triabody molecules)，或Fc-融合蛋白的多聚體。可能作為多聚體蛋白存在的非抗體蛋白質的實例包括纖維蛋白原、載脂蛋白異源二聚體、血小板衍生生長因子、顫蛋白(reelin)和豬頜下腺粘蛋白(porcine submaxillary mucin)。

如本文所用的術語「多肽」意指具有至少或約4個胺基酸，至少或約5個胺基酸，至少或約6個胺基酸，至少或約7個胺基酸，至少或約8個胺基酸，至少或約9個胺基酸，至少或約10個胺基酸，至少或約11個胺基酸，至少或大約12個胺基酸，至少或約13個胺基酸，至少或約14個胺基酸，至少或約15個胺基酸，至少或約16個 胺基酸，至少或約17個胺基酸，至少或約18個胺基酸，至少或約19個胺基酸，或者至少或約20個胺基酸的長度，或大於20個胺基酸的長度的多肽序列。本文所用的「多肽」的定義中包括蛋白質的單聚體(例如單體)和多聚體形式(例如二聚體，三聚體等)。纖維蛋白原是六聚體蛋白質的一個實例。多肽的其它實例包括重鏈和輕鏈抗體肽。

術語「完整抗體」包括其中存在重鏈間二硫鍵的抗體，使得完整抗體使用非還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳或其它使用非還原性的變性溶液條件的分析技術時作為兩條輕鏈多肽和兩條重鏈多肽的組合被觀察到。(參見，例如，圖11和圖12)。

術語「半抗體」包括其中不存在重鏈間二硫鍵的抗體(例如IgG4抗體)，使得半抗體使用非還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳或其它使用非還原性的變性溶液條件的分析技術時作為單一輕鏈多肽和單一重鏈多肽的組合被觀察到。在非變性條件下，半抗體是難以檢測的，原因是強力的鏈間非共價相互作用在沒有鏈間二硫鍵存在的情況下仍然普遍存在。(Tayloret al.,2006,Anal Biochem.353(2)：204-208)。半抗體示於圖1A，而含半抗體的樣品的非還原性十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳分析的結果包括在圖12中。

如本文所用的術語「半抗體轉化」或「半抗體的轉化」指一種生化過程，通過該過程半抗體成為完整抗體，例如，通過鏈間二硫鍵的形成或改造。

術語「活性」包括多種活性，例如抗體或半抗體對一種或多種抗原、靶物或配體的結合特異性和親和力。

術語「IgG4」包括在次級免疫應答過程中產生的和最常見於血液中的一個IgG免疫球蛋白子類。這些IgG抗體通常包含γ4重鏈。

本文所揭示方法為IgG4抗體，特別是治療性IgG4抗體提供了顯 著益處。可以通過本文提供的方法來生產的IgG4抗體的非限制性實例包括那他珠單抗(natalizumab)(Tysabri®，Biogen Idec)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)(Mylotarg®，輝瑞)和fresolimumab(建新公司)。針對α4β1(VLA-4)和α4β7整聯蛋白的α4亞基的那他珠單抗和特異性針對CD33的吉妥珠單抗是先前批准用於人用的兩種人源化IgG4抗體。那他珠單抗是多發性硬化症(multiple sclerosis)(MS)的有效治療手段，而吉妥珠單抗與細胞毒性卡奇黴素衍生物(cytotoxic calicheamicin derivative)綴合用於治療急性髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia)(AML)(Zohren et al.,2008，Blood 111：3893-3895)。另一種基於人源化IgG4的治療劑TGN1412(CD28特異性)的開發在引起了健康個體中的意外不良事件之後中斷。那他珠單抗也與不良事件有關，特別是進行性多灶性腦白質病(progressive multifocal leukoencephalopathy)，一種JC多瘤病毒對中樞神經系統(CNS)的感染。

術語「半分子交換」指對於抗體，例如IgG4的一類蛋白質修飾，其中將抗體重鏈和所連接的輕鏈(半分子)與來自另一IgG4分子的重-輕鏈對互換。如此一來，抗體分子可以獲取識別兩種不同抗原的兩個不同的Fab臂(產生雙特異性分子)，而它們的Fc結構域結構保持不變。(Labrijn et al.,2013,Proc Natl Acad Sci USA.110(13)：5145-50)。也可發生物種間的半分子交換，產生改變Fc結構域結構，其同樣包含來自兩個物種貢獻者中每一個的結構域。(Labrijn et al.,2009,Nature Biotechnol.27(8)：767-771)。半分子交換也被稱為「Fab臂交換」。(Rispens等人。2011,J Am Chem Soc.133(26)：10302-10311)。

術語「非還原性」指這樣的條件，在該條件下二硫鍵(例如，二硫連接)得到保留。具體而言，在該條件下二硫鍵保持完整，並且不 轉化為游離硫氫化合物(sulfhydrils)。

術語「基本上不含」意指組合物(例如，液體培養基)是至少或約90%不含(例如，至少或約95%，96%、97%、98%，或至少或約99%不含，或約100%不含)指定物質。

術語「培養」或「細胞培養」意指在一組受控的物理條件下維持細胞或使細胞增殖。

術語「連續過程/工藝/方法(continuous process)」意指連續實現或產生一結果的過程(例如，從液體培養基中連續產生治療性蛋白質藥物物質的過程)。例如，在系統處於操作中時連續地產生治療性抗體藥物物質(當然，算入抗體通過系統移動到出口時的初始遲滯期)。(大體上，參見，Shuleet al.,1992 Bioprocess engineering：basic concepts.New York：Prentice-Hall)。一個示例性的連續生物製造系統在國際專利申請號PCT/US2014/019909中描述。

術語「半連續過程/工藝/方法(semi-continuous process)」意指大體上連續的用於純化目標分子的過程，其中流體材料在任何單一工藝步驟的輸入或輸出是不連續的或間歇性的。例如，一個工藝步驟(例如，一個結合和洗提色譜步驟)中的輸入可以連續加載；然而，輸出可以間歇地進行收集，其中在純化過程中的其它工藝步驟是連續的。因此，在一些具體實施例中，本文描述的過程是「半連續的」，因為它們包括以間歇的方式操作的至少一個單元操作，而在該過程或系統中的其它單元操作可以以連續的方式操作。

術語「回收」或「進行回收」意指為了(自液體培養基或稀釋的液體培養基中存在的一種或多種其它成分(例如，培養基蛋白質或存在於或分泌自哺乳動物細胞的一種或多種其它成分(例如，DNA、RNA或其它蛋白質)))部分純化或分離(例如，按重量計至少或約5%，例如， 至少或約10%，15%，20%，25%，30%，40%，45%，50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，或至少或約95%純的蛋白質)所進行的步驟。通常，使用結合蛋白質的樹脂進行捕獲(例如，通過使用親和色譜法)。在本文中描述了用於從液體培養基中或稀釋的液體培養基中捕獲蛋白質的非限制性方法，而其它方法是本領域已知的。蛋白質可以使用色譜柱或色譜膜從液體培養基中回收(例如，任何的本文該的色譜柱或色譜膜)。

術語「純化」意指為了將抗體與存在於含有抗體的流體中的一種或多種其它成分(例如，液體培養基蛋白或存在於或分泌自哺乳動物細胞的一種或多種其它成分(例如，DNA、RNA或其它蛋白質))分離而進行的步驟。例如，純化可以在初始捕獲步驟之後進行。純化可以使用結合的抗體的樹脂來進行(例如，通過使用親和色譜、陰離子或陽離子交換色譜或分子篩色譜)。抗體可以使用色譜柱或色譜膜(例如，任何本文中所描述的色譜柱或色譜膜)從含有蛋白質的流體進行精修(polish)。

術語「洗提液」是工藝術語，並且意指從色譜柱或色譜膜放出的含有可檢測量的抗體的流體。一個非限制性實例是蛋白A洗提液。

術語「過濾」意指從液體(例如，本文該的任何系統或過程中存在的液體培養基或流體)去除至少部分的(例如，至少80%，90%，95%，96%，97%，98%或99%)不需要的生物污染物(例如，哺乳動物細胞、細菌、酵母細胞、病毒或分枝桿菌(mycobacteria))和/或顆粒狀物質(例如，沉澱的蛋白質)。

術語「澄清」意指從液體(例如液體培養基)去除細胞、細胞碎片和其它大的生物反應器或細胞培養雜質。澄清蛋白質樣品的幾種方法是本領域已知的。澄清方法的非限制性實例包括離心、微濾 (microfiltration)、深層過濾(depth filtration)、無菌過濾(sterile filtration)、沉澱、絮凝和液-液萃取。澄清步驟完成之後立即獲得的溶液通常被稱為「澄清的收穫品」。由於澄清過程，澄清的收穫品是基本上無細胞的。

術語「調節步驟」意指生物過程中的一個步驟，其中將含有多肽的一種流體與一種或多種其它流體組合以改變含有多肽的流體的參數，如氧化還原試劑濃度、pH、溶解的氣體水平、電導率和/或活細胞密度。調節方法的非限制性實例包括添加低或高pH溶液以分別減少或增加pH，添加濃縮物以增加電導率或氧化還原試劑濃度，或向無細胞流體添加含有細胞的流體。流體添加的方法包括直接添加到保持容器，如罐或袋，或線內添加(inline addition)，其中在工藝流中將兩種或更多種流體彼此組合。在某些具體實施例中，使用緩衝液調節貯存器進行調節步驟。

術語「灌注生物反應器」意指含有在第一液體培養基中的多個細胞的生物反應器，其中對存在於該生物反應器中的細胞的培養包括定期或連續去除該第一液體培養基，並在同一時間或稍後向該生物反應器添加基本上相同體積的第二液體培養基。在一些實例中，在培養期間在漸增的時期期間(例如，一段約24小時的時期，一段在約1分鐘至約24小時之間的時期，或一段大於24小時的時期)內在去除的第一液體培養基和添加的體積方面存在一種漸進的變化(例如，增加或減少)(例如以每天為基礎的培養基重新進料速率)。每天去除和替換的培養基所占的分數可以根據所培養的特定細胞、初始接種密度和特定時間處的細胞密度而變化。「RV」或「反應器容積」意指在培養過程開始時存在的培養基的體積(例如，接種後存在的培養基的總體積)。

術語「進料批式生物反應器」是工藝術語，並且意指含有在第一液體培養基中的多個細胞的生物反應器，其中對存在於該生物反應器中的細胞的培養包括定期或連續向第一液體培養基添加第二液體培養基，而無需實質性或顯著地從細胞培養物去除該第一液體培養基或第二液體培養基。該第二液體培養基可與該第一液體培養基相同。在進料批式培養的一些實例中，該第二液體培養基是第一液體培養基的濃縮形式。在進料批式培養的一些實例中，該第二液體培養基作為乾粉添加。

術語「生物過程」，如本文所用，通常指根據所揭示方法應用於蛋白質的任何過程。在某些具體實施例中，該生物過程是可在從液體培養基製造治療性蛋白質藥物物質的過程中進行的一個或多個功能性步驟(「單元操作」)。典型的生物過程的一個實例示於圖2。生物過程的非限制性實例包括過濾(例如，從含有抗體的流體去除污染物細菌、酵母、病毒或分枝桿菌，和/或顆粒狀物質)、捕獲、表位標示的去除、純化、保持或儲存、精修、病毒滅活、調節含有抗體的流體的離子濃度和/或pH，和去除不需要的鹽。在某些具體實施例中，生物過程是生物反應器過程、種子培養(seed train)、捕獲色譜、中間色譜、過濾、離心、沉澱、絮凝、UV照射和/或病毒滅活。在某些具體實施例中，生物過程發生在生物反應器或色譜裝置內。

在一些具體實施例中，術語「監測」指測量特定的過程參數或過程輸出如產品質量屬性(包括半抗體水平)、pH、溶解氧、培養基組分、生物過程單元操作和流速的能力。監測可根據實驗或生物過程的具體設計來應用。例如，監測可應用在生物過程中的一個或多個特定的點、應用於生物過程中某些步驟或時間段或應用於生物過程的持續時間。

在一些具體實施例中，如本文所用的術語「控制」指通過調整一種或多種培育條件和/或預定的溶液參數來改變多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵的形成或數目的能力。「控制」還指在生物過程的特定時間點的過程中增加、減少或維持多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵的形成或數目的能力。在一些具體實施例中，術語「控制」指在生物過程或單元操作的一個特定步驟或階段中改變IgG4抗體中存在的半抗體的水平的能力。可以進行調整的這樣的參數的非限制性實例包括時間、溫度、pH、氧化還原試劑本體和濃度、氣體本體、溶解氣體水平、電導率和/或活細胞密度。

如本文所用，術語「臨界質量屬性」，也稱為「CQA」，意指應處於適當的限值、範圍或分佈中以確保所需產物質量的物理、化學、生物或微生物特性或特徵。CQA的一個實例是多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵的數目。CQA的另一個實例是抗體溶液中半抗體的比例。CQA的其它非限制性實例包括產品純度、效力、荷電同種型概貌(charged isoform profile)、轉譯後修飾、氧化、還原、脫醯胺化、加合物的形成、夾子形式(clipped forms)、酶裂解、比活性、肽圖譜、二聚體含量、產物聚集、位點特異性糖基化、總聚糖和/或糖基化譜(glycosylation profile)。為所揭示方法的具體應用選擇適當的CQA和適當的測定法在本領域普通技術人員的能力範圍之內。

在某些具體實施例中，抗體的CQA通過測量來確定。在一些這樣的具體實施例中，CQA使用高通量和/或快速的分析技術來測定。在某些具體實施例中，CQA使用包括以下非限制性實例的分析技術來測定：高效液相色譜(HPLC)、差示折射法(differential refractometry)、螢光、超高效液相色譜(UPLC)、多角度激光光散射分析(MALLS)、質譜法、串聯質譜、等電聚焦、SDS-PAGE和/或差示掃描量熱法。又在 其它具體實施例中，該高通量和/或快速分析技術由機器人進行。在進一步的具體實施例中，該機器人是一種液體處理機器人(iquid-handling robot)。

色譜

如本文該的蛋白生產生物過程常常涉及使用一種或多種色譜柱。可以在色譜過程中採用一種或多種不同類型的緩衝液。如本領域已知的，用在本文該的過程中的一種或多種類型的緩衝液將取決於存在於色譜柱中的樹脂或色譜柱的色譜膜、感興趣的蛋白質和單元操作。例如，可以選擇在本文該任何過程中使用色譜柱期間採用的緩衝液的體積和類型，以優化一種或多種CQA或以下蛋白質特性中的一種或多種：蛋白質總的產率、蛋白質的活性、抗體的純度水平和生物污染物從含有蛋白質的流體中的去除(例如，不存在活性病毒、分枝桿菌、酵母、細菌或哺乳動物細胞)。

可在當前描述的生物過程中執行的單元操作包括，例如，澄清蛋白質、捕獲蛋白質、滅活含有該蛋白質的流體中存在的病毒、純化蛋白質、保持含有蛋白質的流體、保持含有蛋白質和細胞的流體、從含有蛋白質的流體中過濾或去除顆粒狀物質和/或細胞和調節含有蛋白質的流體的離子濃度和/或pH。

可使用色譜柱或色譜樹脂進行回收的單元操作，例如利用一個回收機構。回收機構的非限制性實例包括蛋白A結合回收機構、蛋白質或蛋白質片段結合回收機構、底物結合回收機構、適體結合回收機構(aptamer-binding recovery mechanism)、標簽結合回收機構(例如，基於聚組氨酸標記的回收機構)和輔因子結合回收機構。捕獲也可以使用可用於進行陽離子交換或陰離子交換色譜或分子篩色譜的樹脂進行。 可用於回收蛋白質的非限制性的樹脂在本文中描述。

可使用含有樹脂色譜柱或色譜膜來進行純化蛋白質的單元操作，例如，利用回收系統。回收機制的非限制性實例包括蛋白A結合回收機構、蛋白質或蛋白質片段結合回收機構、底物結合回收機構、適體結合回收機構、標簽結合回收機構(例如，基於聚組氨酸標記的回收機構)和輔因子結合回收機構。純化也可以使用可用於進行陽離子交換或陰離子交換色譜或分子篩色譜的樹脂進行。可用於純化蛋白質的非限制性的樹脂在本文中描述。

過濾含有蛋白質的流體的單元操作可以使用過濾器或含有分子篩樹脂的色譜柱或色譜膜來進行。如本領域已知的，在本領域有各種各樣的亞微米過濾器(例如，具有小於1微米、小於0.5微米、小於0.3微米、約0.2微米、小於0.2微米、小於100納米、小於80納米、小於60納米、小於40納米、小於20納米或小於10納米的孔尺寸的過濾器)可用，其能夠去除任何沉澱的物質和/或細胞(例如，沉澱的、未折疊的蛋白質；沉澱的、不需要的宿主細胞蛋白質；沉澱的脂質；細菌；酵母細胞；真菌細胞；分枝桿菌；和/或哺乳動物細胞)。已知具有約0.2微米或小於0.2微米的孔尺寸的過濾器有效地從含有蛋白質的流體中去除細菌。含有分子篩樹脂的色譜柱或色譜膜也可用於進行過濾含有蛋白質的流體的單元操作。

培養方法

本文中描述的一些方法進一步包括在包含液體培養基的生物反應器(例如，灌注或進料批式生物反應器)中培養產生多聚體蛋白質或多聚體蛋白質的多肽亞單位的細胞的步驟，其中將一定體積或是含有細胞或是基本上不含細胞的該液體培養基連續地或週期性地從生物 反應器中移除。該生物反應器可具有例如在約1升至約10,000升之間的體積(例如，約1升至約50升之間，約50升至約500升之間，約500升至約1000升之間，500升至約5000升之間，約500升至約10,000升之間，約5000升至約10,000升之間，約1升約10,000升之間，約1升至約8000升之間，約1升和約6000升之間，約1升至約5000升之間，約100升和約5000升之間，約10升至約100升之間，約10升至約4000升之間，約10升至約3000升之間，約10升和約2000升之間，或約10升至約1,000升之間)，或更多。存在於生物反應器的液體培養基的量可以是，例如，約0.5升至約5000升之間(例如，約0.5升至約25升之間，約25升至約250升之間，約250升至約500升之間，250升至約2500升之間，約250升至約5000升之間，約2500升至約5000升之間，約0.5升至約5,000升之間，約0.5升至約4,000升之間，約0.5升至約3,000升之間，約0.5升至約2,500升之間，約50升至約2500升之間，約5升至約50升之間，約5升至約2000升之間，約5升至約1500升之間，約5升至約1000升之間，或約5升至約500升之間)。例如，培養細胞可以使用批式進料生物反應器或灌注生物反應器進行。培養細胞的非限制性實例和不同方面在下文描述，並且可以以任意組合使用。

細胞

在本文描述的一些方法中培養的細胞可以是細菌(例如，革蘭氏陰性細菌)、酵母(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或 Arxula adeninivorans)或哺乳動物細胞。哺乳動物細胞可以是生長在懸浮液中的細胞或貼壁細胞。可以在本文該的任何方法中培養哺乳細胞的非限制性實例包括：中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(例如，CHO DG44細胞或CHO-K1s細胞)、SP2.0、骨髓瘤細胞(例如，NS/0)、B細胞、雜交瘤細胞、T細胞、人胚胎腎(HEK)細胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)、非洲綠猴腎上皮細胞(Vero)細胞和Madin-Darby狗(可卡獵犬(Cocker Spaniel))腎上皮細胞(MDCK)細胞。在一些培養貼壁細胞的實例中，培養也可以包含多個微載體(microcarrier)(例如，含有一個或多個孔的微載體)。可以在本文該的任何方法中培養的其它哺乳動物細胞是本領域已知的。

哺乳動物細胞可以含有編碼蛋白質的重組核酸(例如，穩定整合至哺乳動物細胞的基因組中的核酸)。編碼示例性抗體的重組核酸的非限制性實例在下文描述，正如可以使用本文描述的方法產生的抗體。在一些情況下，在生物反應器(例如，本文該的任何生物反應器)中培養的該哺乳動物細胞衍生自更大的培養。

可將編碼蛋白質的核酸使用各種各樣的分子生物學和分子遺傳學中已知的方法引入哺乳動物細胞。非限制性實例包括轉染(例如，脂轉染(lipofection))、轉導(例如，慢病毒(lentivirus)、腺病毒(lentivirus)或逆轉錄病毒(retrovirus)感染)和電穿孔。在一些情況下，編碼蛋白質的核酸沒有穩定地整合到哺乳動物細胞的染色體中(瞬時轉染)，而在其它情況中核酸得到了整合。可替代地或除此之外，編碼蛋白質的核酸可存在於質粒和/或哺乳動物人工染色體(例如，人的人工染色體)中。可替代地或除此之外，可將該核酸使用病毒載體(例如，慢病毒、逆轉錄病毒或腺病毒載體)引入到細胞中。該核酸可以與啟動子序列(例如，強啟動子，如β-肌動蛋白啟動子和CMV啟動子，或誘導型啟動 子)可操作地連接。如果需要的話，含有核酸的載體可還含有選擇標記(例如，為哺乳動物細胞賦予潮黴素、嘌呤黴素或新黴素抗性的基因)。

在一些情況下，該蛋白質是分泌蛋白，並由哺乳動物細胞釋放至胞外培養基中(例如，該第一和/或第二液體培養基)。例如，編碼可溶性蛋白的核酸序列可以含有編碼在蛋白質的N-或C-末端的分泌信號肽的序列，其通過存在於哺乳動物細胞中的酶裂解，並且隨後釋放到胞外培養基(例如，該第一和/或第二液體培養基)中。

培養基

液體培養基(例如，該第一和/或第二組織培養基)可以補充有哺乳動物血清(例如，胎牛血清和牛血清)，和/或生長激素或生長因子(例如，胰島素、運鐵蛋白和表皮生長因子)。可替代地或除此之外，該液體培養基(例如，該第一和/或第二液體培養基)可以是化學成分確定的液體培養基(chemically-defined liquid culture medium)、不含動物來源組分的液體培養基(animal-derived component free liquid culture medium)、無血清液體培養基或含有血清的液體培養基。化學成分確定的液體培養基、不含動物來源組分的液體培養基、無血清液體培養基或含有血清的液體培養基的非限制性實例為商業上可獲得的。

液體培養基通常含有能量源(例如，碳水化合物，如葡萄糖)、必需胺基酸(例如，二十種胺基酸加上半胱氨酸的基礎組合)、維生素和/或低濃度的所需的其它有機化合物、游離脂肪酸和/或痕量元素。如果需要，該液體培養基(例如，該第一和/或第二液體培養基)可以補充有例如哺乳動物激素或生長因子(例如，胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽和緩衝液(例如，鈣、鎂、和磷酸鹽)、核苷和堿基(例如， 腺苷、胸苷和次黃嘌呤)、蛋白質和組織水解產物，和/或這些添加劑的任意組合。

在本文該的任何方法中可用於培養細胞的多種不同的液體培養基是本領域已知的。可能在本方法中也有用的培養基組分包括，但不限於，氧化還原試劑、化學成分確定的(CD)的水解產物，例如，CD腖、CD多肽(兩個或更多個胺基酸)和CD生長因子。液體組織培養基和培養基成分的其它實例是本領域已知的。熟練的從業者會理解本文描述的第一液體培養基和第二液體培養基可以是同一類型的培養基或是不同培養基。

對於蛋白質生產中使用的生物過程，感興趣的蛋白質(例如，多聚體蛋白質)在該生物過程期間的特定時間點存在於包含多個細胞的溶液中。在這些時間點期間，該蛋白質可存在於幾個可能的位置，包括例如生物反應器、容納槽或包含多個細胞的非生物反應器單元操作容器。

進料批式生物反應器(Fed-Batch Bioreactor)

可用於培養存在於具有蛋白質的溶液中的多個細胞的生物反應器的一個非限制性實例是進料批式生物反應器。在進料批式生物反應器中培養細胞包括，在培養期間的大部分時間，向第一液體培養基添加(例如，週期性或連續添加)第二體積的第二液體培養基。第二液體培養基的添加可以連續地(例如，以某個速率，該速率將生物反應器體積或該第一液體培養基體積的0.1%至300%之間(例如，1%至250%之間，1%至100%之間，100%至200%之間，5%至150%之間，10%至50%之間，15%至40%之間，8%至80%之間，和4%至30%之間)的體積歷時任意給定的時間段(例如，歷時24小時期間，歷時約1小 時至約24小時的漸增時間期間，或歷時超過24小時的漸增時間期間)添加)或週期性地(例如，每三天一次、隔天一次、每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次或每天五次)進行，或它們的任意組合。在週期性進行的情況下，添加的體積(例如，在約24小時期間內，在約1小時至約24小時的漸增時間期間內，或在超過24小時的漸增時間期間內)可以是例如生物反應器體積或第一液體培養基體積的0.1%至300%之間(例如，1%至200%之間、1%至100%之間，100%至200%之間，5%至150%之間，10%至50%之間，15%至40%之間，8%至80%之間和4%至30%之間)。

灌注生物反應器

本文該的培養步驟可以使用灌注生物反應器進行。在灌注生物反應器中培養細胞包括從生物反應器中去除第一體積的第一液體培養基(例如，含有任何濃度的細胞，例如基本上不含細胞的第一體積的第一液體培養基)，並向該第一液體培養基添加第二體積的第二液體培養基。去除和添加可以同時或依次進行，或者以兩種方式的組合進行。此外，去除和添加可以連續地或週期性地進行，或者它們的任意組合。在某些情況中，去除的第一體積的第一液體培養基和添加的第二體積的第二液體培養基可以在每24小時的時期內(或者，可替換地，在約1小時至約24小時的漸增時間期間或超過24小時的漸增時間期間)在整個或部分培養期間保持大致相同。如本領域已知的，去除該第一體積的第一液體培養基的速率(體積/單位時間)和添加該第二體積的第二液體培養基的速率(體積/單位時間)可以有所變化。去除該第一體積的第一液體培養基的速率(體積/單位時間)和添加該第二體積的第二液體培養基的速率(體積/單位時間)可以是大約相同的或可以 是不同的。使用灌注生物反應器來培養細胞用於蛋白質生產是在本領域中充分描述的。

本文該的任何生物反應器的內表面可具有至少一種塗層(例如明膠、膠原蛋白、聚-L-鳥氨酸、聚苯乙烯和層粘連蛋白中的至少一種塗層)，和如本領域已知的一個或多個用於噴射O₂、CO₂和N₂到液體培養基中的端口，和用於攪拌液體培養基的攪拌機構。生物反應器可在受控的濕潤氣氛(例如，在大於20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的濕度，或100%的濕度)中培育細胞培養物。該生物反應器還可以配備有能夠從生物反應器去除一定體積的液體培養基的機械裝置，和任選地在將該液體培養基轉移出該生物反應器的過程期間從該液體培養基去除細胞的該機械裝置內的過濾器(例如，ATF系統)。

根據請求保護的方法，溶液中的蛋白質濃度可以大於約1.0mg/mL、大於約1.5mg/mL、大於約2.0mg/mL、大於約2.5mg/mL、大於約3.0mg/mL、大於約3.5mg/mL、大於約4.0mg/mL、大於約4.5mg/mL、大於約5.0mg/mL、大於約5.5mg/mL、大於約6.0mg/mL、大於約6.5mg/mL、大於約7.0mg/mL、大於約7.5mg/mL、大於約8.0mg/mL、大於約8.5mg/mL、大於約9.0mg/mL、大於約10.0mg/mL、大於約12.5mg/mL或大於約15.0mg/mL。在某些具體實施例中，請求保護的方法中含有細胞的溶液中的蛋白質濃度為約0.01mg/mL至約20mg/mL。在其它具體實施例中，請求保護的方法中含有細胞的溶液中的蛋白質濃度為約0.1mg/mL至約100mg/mL。

概括而言，除非另有說明，本發明的實施採用化學、分子生物學、重組DNA技術、免疫學(尤其是，例如，免疫球蛋白技術)的常規技術，和電泳中的標準技術。參見，例如，Sambrook et al.,1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Paul,S.(編輯)，Antibody engineering protocols(Vol.51).Humana Press；McCafferty等人(編輯)，1996,Antibody engineering：a practical approach,Practical Approach Series,169,IRL press；Harlow等人(編輯)，1999,Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Ausubel et al.,2007,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,NY；Bousse et al.,2001,Anal.Chem.73：1207-1212；Knapp et al.,2001,Proceedings of the μTAS 2001 Symposium,Micro Total Analysis Systems 2001,7-10,Kluwer Academic Publishers,Dordrecht,Netherlands；Mhatre et al.,1999,Rapid Commun Mass Spectrom.13(24)：2503-10)。在這些出版物中揭示的技術通過引用整體併入本文。

除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的含義相同。本文描述科學技術和材料用於本發明中的使用；其它合適的技術和材料也可以使用。材料、技術和實例僅是說明性的，並不旨在進行限制。所有的出版物、專利申請、專利、序列、數據庫條目以及本文提及的其它參考文獻都通過引用整體併入本文。在衝突的情況下，以包括定義的本說明書為准。

以下的實施例說明了本發明的具體具體實施例，及其多種用途。它們僅出於解釋性目的闡述，並且不應理解為以任何方式對本發明範圍進行限制。

實施例 實施例1. 控制IgG4半抗體的比例：評估未澄清的收穫品 總體方法

在未澄清的細胞培養收穫品中研究了控制IgG4半抗體水平的能力，這是一個含有細胞的系統。在本實施例中，使進料批式生物反應器運轉終止時獲得的未澄清的收穫品經歷了多種實驗條件，並作為時間的函數檢測IgG4群體中存在的半抗體(Hab)的百分比。關鍵實驗條件包括下列：未澄清的收穫品保持時間、保持溫度和收穫時的(由收穫日控制)細胞存活力。與半抗體水平一起，次要實驗輸出包括多種溶液相參數，例如pH、活細胞密度和溶解的氣體。

材料、方法和分析技術

為了測量半抗體含量，未澄清的收穫樣品純化的進行通過0.2微米過濾，繼之以使用填充有獲得自GE Life Sciences的MabSelect SuRe樹脂的PreDictor Robo柱(200微升)在Freedom EVO 150 Tecan液體處理器上的純化。通過非還原性SDS-PAGE進行半抗體分析。在非還原條件下的SDS-PAGE根據標準技術進行(例如，參見Sambrook et al.,1989；Ausubelet al.,2007)。用Simply Blue SafeStain(Life Technologies，目錄號LC6065)進行對凝膠的染色。半抗體水平從掃描的凝膠圖像測量並通過光密度計定量。

未澄清的收穫樣品的製備和處理

將大約20毫升未澄清的收穫品分配到多個20毫升PETG瓶，使頂部空間最小。對將未澄清的收穫品分配成20毫升樣品的步驟進行設計，以通過將未澄清的收穫品轉移至攪拌式培養瓶(spinner flask)中而確保每個樣品的均質和無菌，該攪拌式培養瓶受到持續攪拌，同時將樣品通過連續移液獲得。瓶僅打開一次用於分析和/或純化。在分配未澄清的收穫樣品期間需要特別小心地控制初始細胞密度。在指定的 時間點，測試未澄清的收穫樣品的溶液相特徵如pH、溶解的氣體和活細胞密度，接著進行捕獲純化。然後測定經純化的樣品的Hab含量。

在本實施例中呈現的實驗的結果也在2升和5升未澄清的收穫樣品中得到了確認，其使用一次性袋收集。因此，本文所揭示方法的規模可以擴大到較大體積的抗體生產，如在抗體的商業生產和/或製造中。

實施例2. 保持時間：未澄清的收穫品

在主要實驗研究中對幾個關鍵變量進行了研究，以證明控制抗體樣品中存在的IgG4半抗體水平的能力。這些關鍵變量包括未澄清的收穫品保持時間、保持溫度和初始活細胞密度(由收穫時的存活力控制)。

為了針對每個實驗建立基線半抗體比例值，測量了使用傳統規程製備的抗體樣品中半抗體的含量，該傳統規程由0分鐘保持時間組成(例如沒有保持步驟)並且不根據本文所揭示方法調整任何其它條件。這種純化的樣品的半抗體含量平均為約21%(如通過非還原性SDS-PAGE所測定)。

未澄清的收穫液從治療性IgG4分子的進料批式培養物中獲得。在帶有Delta V控制的15升Broadley James玻璃容器中進行細胞培養。在整個未澄清的收穫樣品保持期間，使用Vi-Cell Cell Viability Analyzer(Beckman Coulter)測量活細胞密度和存活力百分比，並使用Blood Gas Analyzer(Siemens)測量pH、pCO₂和PO₂。

根據不同的測試條件，在細胞存在下保持生物治療性IgG4能夠減少、增加或大致維持抗體群體中存在的半抗體水平。這些實驗的結 果示於圖3。

實施例3. 初始活細胞密度：未澄清的收穫品

在本研究中測試的第二個主要實驗變量或控制參數為初始活細胞密度(圖3B和3D)。

生物反應器樣品在兩個不同的收穫日獲取，代表了大約為70%和35%的細胞存活力。在本實驗中，初始活細胞密度評估為4.5×10⁶個細胞/mL(來自進料批式反應器的較早收穫日)或2.5×10⁶個細胞/mL(來自進料批式反應器的較晚收穫日)。保持溫度在兩個測試細胞密度條件之間保持恒定在8℃。在本實驗中，對於具有2.5×10⁶個細胞/mL的相對較低的初始活細胞密度的8℃樣品而言半抗體水平沒有降低。

在仔細分析時，觀察到一旦活細胞密度測量結果降低至約2×10⁶個細胞/mL，在任一實驗測試條件都不再發生進一步半抗體減少(圖3)。在具有不同初始活細胞密度的兩種樣品中都觀察到了這個現象。在整個數據集中觀察到了Hab轉化對活細胞密度的強烈依賴性，並且圖3B和3D中所呈現的結果應該是代表性的。

實施例4. 保持時間：未澄清的收穫品

將未澄清的收穫品保持在三種不同的溫度：2-10℃(冷室)、20-22℃(環境溫度)和37℃(暖室)。

從對實驗結果的分析中浮現出了幾個潛在的控制參數。半抗體含量被認為受到未澄清的收穫品中活細胞的存在的顯著影響。

在圖3A中，在寒冷溫度(8℃)保持條件觀察到了半抗體最為顯著的降低，其對應於在本研究中評估的最高水平的活細胞密度。在溫暖 條件(37℃)下的半抗體趨勢既包括從21%至19%的立刻降低，又包括最終增加至約25%的最終半抗體水平。在37℃半抗體進展從降低到增加的變化直接對應於存在於樣品中的所有細胞都不再存活的點(圖3B)，這是對於活細胞在半抗體控制過程中的重要作用的另一指示。

因此，在含有細胞的(未澄清的)收穫品保持條件中升高的溫度的影響表明了一個能夠增加半抗體水平的控制參數。

實施例5. 保持過程中的攪拌：未澄清的收穫品

除了保持溫度方面的變化，通過將選擇的未澄清收穫品的樣品在保持期間置於旋轉器上測試了混合或攪拌的效果，並使其它樣品在整個保持過程中保持靜止(靜態)。

還研究了混合含有細胞的溶液對IgG4半抗體水平的效果(圖4)。將低初始活細胞密度樣品(來自圖3C)保持在或者(1)靜態的、不混合狀態，或者(2)使用旋轉器連續混合。混合未澄清的收穫品溶液能夠顯著加速半抗體的減少，在8℃保持兩周之後達到大約13%的半抗體，相比之下在同樣這些時間和溫度條件下不進行任何混合時半抗體大於多於20%(圖4)。

實施例6. 向含有細胞的系統添加氧化還原試劑：未澄清收穫品的評估

為了進一步加快半抗體向完整抗體的轉化，將氧化還原試劑(具體為還原型和氧化型穀胱甘肽)直接添加到含有細胞的系統(未澄清的收穫品)中，接著進行純化和分析評估。將未澄清的收穫樣品保持在8℃。

在第一個實驗中，未澄清的收穫樣品中的初始細胞存活力低，僅 為2.5×10⁶細胞/mL。雖然這種低細胞存活力條件在不存在穀胱甘肽時在半抗體方面並沒有表現出任何改變(圖5，圓圈)，但是穀胱甘肽的添加，無論是用5mM氧化型穀胱甘肽和0.5mM還原型穀胱甘肽(圖5，方形)或是用0.5mM氧化型穀胱甘肽和5mM還原型穀胱甘肽(圖5，三角)，均顯著減少了半抗體並且這樣做遠快於在任何所研究的不含氧化還原試劑的條件。

如圖5中所示，實現的最低半抗體水平為如下條件：使用0.5mM還原型穀胱甘肽和5mM氧化型穀胱甘肽、在大約4天內保持在8℃下含有細胞的收穫品條件中(圖5，三角)。有可能該低半抗體含量是在早於4天的某個時間實現的。然而，對於這些條件最早的時間點測量是四天。對於使用更高水平的還原型穀胱甘肽的條件(5mM還原型穀胱甘肽與5mM氧化型穀胱甘肽的比例)，也觀察到了顯著降低的半抗體，雖然只有在兩個星期的更長培育期之後。(圖5，方形)。

實施例7. 向含有細胞的系統添加氧化還原試劑：在生物反應器操作期間

在第二個實驗中，通過將2-MEA直接添加至生物過程中一個不同的含有細胞的系統中，即一個生物反應器內，評價了另一氧化還原試劑，即2-MEA。使用氧化還原試劑還研究了生物反應器的pH對半抗體控制的影響。具體而言，通過添加氧化還原試劑連同兩種pH水平(高pH：7.1，低pH：6.9)研究了生物反應器培養物中的0.5mM和2mM 2-MEA以及5mM還原型穀胱甘肽(GSH)。該研究的結果示於圖6。培養物的pH被確定為不會對Hab轉化和Hab穩定性產生影響，表明對於在生物反應器含有細胞的系統中測試的條件而言，通過添加氧化還原試劑進行的Hab轉化相對於pH是魯棒的(robust)。

對含有細胞的生物反應器內半抗體比例的這些研究表明，2-MEA是測試的最有效的氧化還原劑，並且2mM 2-MEA的濃度有效地將生物反應器中Hab的比例控制在8-10%之內至少24小時(圖6，方形和三角)。對於所有的測試條件，Hab的比例在氧化還原試劑添加後的最早期顯著下降，對於所有情況達到了10%以下，除了一個條件以外(圖6)。有趣的是，除了2mM 2-MEA的其它所有條件，Hab比例隨時間增加至接近初始Hab水平。(圖6)。復原回半抗體最為迅速的是0.5mM 2-MEA，表明氧化還原試劑的濃度可能是控制抗體溶液中的Hab比例的關鍵參數。

還進行了另外的實驗以確定生物反應器內的初始細胞存活力對Hab進展的潛在影響以及2-MEA實現Hab比例控制的能力。在本研究中，將2mM 2-MEA添加到接近進料批式生物反應器運轉的運行結束時的兩個單獨的生物反應器中，其具有70%或45%的細胞存活力(分別為第12和14天)。在兩個生物反應器中，添加2-MEA均能夠在添加後幾乎立即減少Hab比例至10%以下。(圖7)。與上文該關於細胞存活力的觀察結果相一致，生物反應器內Hab比例作為時間的函數依賴於2-MEA添加之時的初始細胞存活力。在較低的初始存活力(45%)，Hab比例在暴露於生物反應器中的2-MEA 24小時之後從8%增加到14%(圖7，方形)。然而，具有較高的初始存活力(70%)的培養在歷時24小時暴露於生物反應器中的2-MEA的過程中得到了穩定的Hab概貌(圖7，圓圈)。這些結果表明了生物反應器中培養物的活細胞密度能夠影響Hab向完整抗體轉化的穩定性。

實施例8. 向含有細胞的系統添加氧化還原試劑：在細胞去除後評估穩定性

在通過從未澄清的收穫樣品去除細胞和細胞碎片來去除細胞以生成對應樣品的澄清的收穫品之後，對於在含有細胞的系統中使用氧化還原試劑將Hab轉化成完整抗體的穩定性進行了評估。在這項研究中，將含有細胞的系統(生物反應器)用2mM 2-MEA處理24小時。未澄清的收穫品的樣品取自含有細胞的系統，然後澄清以去除細胞和細胞碎片，因此得到澄清的收穫品。監測培育箱中不同條件下保持的澄清的收穫樣品的等分試樣中的Hab比例，該條件包括兩個溫度(或者是2-8℃或者是21℃/室溫)，以及經由氣體頂部空間操縱的不同幅度的pH升高。其結果示於圖8。

這些測量的結果表明，溫度可以充當另一用於半抗體控制的參數。例如，當在2-8℃下保持2-MEA處理的澄清的收穫品時，Hab的比例從保持時間開始時(t=0)測量的9-10%下降，在歷時七天的過程中降至6%。(圖8，實心和空心菱形)。相反，當保持在室溫時(21℃)，Hab在2-MEA處理的澄清的收穫品中的比例在歷時七天的過程中實際上有所增加(圖8，實心和空心三角)。

在存儲在沒有頂部空間(圖8，實心三角/菱形)的澄清的收穫樣品和存儲在具有頂部空間的那些收穫樣品(圖8，空心三角/菱形)之間沒有觀察到差異。這個特定實驗的結果表明，pH漂移沒有影響所研究的條件下經2-MEA處理的澄清的收穫品中的Hab比例。

這些研究表明，將氧化還原試劑如2-MEA和穀胱甘肽直接添加至接近運行結束處的含有細胞的生物反應器可用於控制過程中存在的半抗體的比例。此外，這些使用氧化還原試劑的研究已評估了選擇的參數對Hab比例控制的影響，該參數包括氧化還原試劑本體和濃度、pH值和細胞存活力。

實施例9. 在無細胞系統中控制IgG4半抗體的比例：評估向澄清的收穫品添加氧化還原試劑

進行研究以進一步評估直接向澄清的收穫材料添加2-MEA，該澄清的收穫材料是一種無細胞樣品。在這些實驗中，澄清的樣品分別接受2mM 2-MEA或不接受氧化還原試劑，接著在或者2-8℃或者室溫(21℃)下進行培育保持。在歷時7天(168小時)的培育中測定了Hab的比例。最先的2個小時的結果示於圖9，而到7天時得到的結果示於圖10。這些結果表明，添加2-MEA後接著在8℃進行培育能夠將Hab比例顯著降低至10%以下(圖9，三角)，並且Hab比例維持在10%以下至少7天(圖10，三角)。對於在室溫(21℃)培育的含有2-MEA的樣品，在添加2-MEA之後Hab比例幾乎也立即迅速降低(圖9，菱形)。然而，對於培育的第1-7日，Hab水平在初始的下降達到大約11% Hab的持續水平後不久增加(圖10，菱形)。在對照樣品中，儲存在8℃或室溫(21℃)無2-MEA條件下的材料在Hab比例方面(圖9，方形；圖10，圓圈)沒有變化。

這項研究表明，氧化還原試劑如2-MEA可以直接添加到無細胞系統如澄清的收穫品以實現半抗體控制。此外，這種選項代表了生物過程中另一個Hab比例可以得到控制的階段。也研究了溫度對用2-MEA處理的澄清的收穫品的影響，並且發現與上述對於在過程中較早時向含有細胞的系統生物反應器添加2-MEA的情況下的澄清的收穫樣品所觀察結果一致。當設計對Hab比例具有充分控制的生物過程時，在過程中的多個時間點使用氧化還原試劑如2-MEA控制Hab比例的能力提供了靈活性。

實施例10. 產品質量的確認

分析了已經根據上述實施例經過了2-MEA處理的幾個來自澄清和未澄清的收穫品的樣品的多個產品質量屬性，包括糖基化譜、荷電變體、質譜的譜和通過凝膠電泳得到的純度。在所有情況下，在未處理和處理過的樣本之間沒有觀察到差異，除了樣品中存在的半抗體水平(數據未顯示)。

實施例11. 控制無細胞系統中IgG4半抗體比例：對捕獲後溶液的評估 總體方法

對還原劑和氧化劑進行了研究，以評估控制無細胞系統中IgG4半抗體水平的能力。在本研究中，將純化自細胞培養物收穫材料的捕獲蛋白A洗提液(捕獲後溶液)用於研究影響半抗體水平的控制參數。假定還原劑如2-巰基乙胺(2-MEA)能夠有效地減少抗體樣品中的半抗體含量。進行了優化減少半抗體的條件的研究，評估了培育條件如pH、時間、溫度、2-MEA的濃度和IgG4的濃度。

材料、方法和分析技術

實驗流程：未澄清的收穫材料收集自IgG4抗體的進料批式培養物，通過過濾澄清，然後用裝填有MabSelect Sure蛋白A樹脂(GE Healthcare)的柱純化。將蛋白A洗提液調節至指明的實驗條件，培育，然後通過使用填充有MabSelect SuRe蛋白質的PreDictor Robo Column(200uL)再純化以去除任何添加的還原試劑或氧化試劑。通過使用獲得自Invitrogen的4-20% Tris甘氨酸凝膠對蛋白A Robo Column再純化洗提液進行了非還原性的SDS凝膠分析。用Simply Blue SafeStain(Life Technologies，目錄號LC6065)進行了凝膠的染色。 從掃描的凝膠圖像測量了半抗體水平並通過光密度計進行定量。一個示例性凝膠示於圖11。

實施例12. 向無細胞系統添加氧化還原試劑：對捕獲後溶液的評估

對幾種還原和氧化試劑測試了它們減少或增加捕獲後溶液的IgG4群體中存在的半抗體水平的能力。2-MEA在降低蛋白A洗提液(捕獲後溶液)的IgG4半抗體水平方面與測試的其它還原劑相比是最有效的，該還原劑包括2-巰基乙醇和還原型穀胱甘肽(GSH)。在這項篩選研究期間對於所有氧化還原試劑測試條件將pH保持恒定在4.8。也測試了氧化還原試劑二硫蘇糖醇(DTT)，但被證明不適合於根據所描述的方法的使用。據觀察，DTT減少了完整IgG4抗體成為重鏈和輕鏈片段，並且和也增加了半抗體的水平(圖11，泳道8)。由於重鏈和輕鏈片段的存在，DTT樣品中Hab的百分比不能精確地計算。其結果示於表1並進一步示於圖11。

有趣的是，向蛋白A洗提液添加氧化型穀胱甘肽(GSSG)對在2-MEA或還原性穀胱甘肽存在下所觀察到的半抗體減少沒有可測量的影響(表1)。

(*)-生成了重鏈和輕鏈片段。因此，沒有定量半抗體比例。

實施例13. 氧化還原試劑2-MEA的濃度對半抗體比例的影響

2-MEA被證明對於減少Hab含量是測試的最有效的還原劑，並因此被選擇用於進一步的實驗。為了評價2-MEA對產品質量的影響，評估了不用和用2-MEA調節(在最佳條件下)的蛋白A洗提液(約9-10mg/ml總抗體)。設計這些實驗來研究2-MEA濃度對澄清的樣品中半抗體水平的影響。測試的2-MEA濃度列於表2並且範圍從0mM至50mM。在不存在任何2-MEA(0mM)的情況下，觀察到Hab含量為27%(表2)。然而，在0.5和5mM之間的2-MEA濃度，樣品中的IgG4半抗體的水平降低(表2，粗體行)。最值得注意的是，在1mM 2-MEA的存在下，半抗體的水平從27%減少到15.2%。較高濃度的2-MEA(25mM和50mM)導致了半抗體水平的增加(46和58%)，並且還產生了重鏈和輕鏈片段(表2)。

有趣的是，在2-MEA存在下(在pH 4.8下1、2和3mM)半抗體水平在大約30分鐘內下降。對於5、15和22小時培育觀察到了類似程度的減少，這表明平衡條件迅速實現，並且延長的培育是不利的(結果未示出)。

(*)-生成了重鏈和輕鏈片段。因此沒有定量半抗體比例。

實施例14. pH對半抗體比例的影響

還研究了澄清的抗體樣品的pH對半抗體水平的影響。含有0mM或2mM濃度的2-MEA的抗體樣品在4.0、4.8或7的pH值下進行了測試。

對於含有2mM的2-MEA的抗體樣品，半抗體水平的降低在較低的pH(4.0和4.8)比中性pH 7.0(表3)大得多。在pH 4時，半抗體水平從不存在2-MEA(0mM)時的27.1%降低至包含2mM 2-MEA濃度的溶液中的20.8%。(表3)。在pH 4.8時，半抗體水平從不存在2-MEA(0mM)時的28.9%降低至包含2mM 2-MEA濃度的溶液中的20.4%。(表3)。然而，在pH7時，半抗體水平從不存在2-MEA(0mM)時的27.4%僅降低至包含2mM 2-MEA濃度的溶液中的24.5%。(表3)。

在蛋白A洗提溶液中添加氯化鈉至40mM的濃度在pH 4.8或中性pH 7.0在2mM 2-MEA的存在下對半抗體減少的水平沒有可測量的影響(表3)。

在2-MEA的存在(1，2和3mM，在pH 4.8)下，半抗體水平在30分鐘內下降。使用延長的培育時間(5、15和22小時)的類似結果表明，平衡條件被迅速實現(數據未顯示)。

實施例15. 關鍵因素鑒定

為了鑒定在2-MEA存在下影響澄清的蛋白A洗提溶液中半抗體水平的(多個)關鍵因素，使用五個因素進行了完整雙水平析因實驗(full two-level factorial experiment)：pH、溫度、培育時間、還原劑(2-MEA)濃度和IgG4的濃度。基於上述實施例中揭示的實驗結果，以及之前進行的多種其它範圍確定和優化實驗，為該五個因素選擇了低值和高值。在這些實驗中測試的值示於下表4中，並將代表性的凝膠示於圖12。

測試了三十七個樣品。蛋白A洗提液中測量的半抗體初始水平(18.5%)在低濃度的2-MEA(0.5和3mM)存在下在pH 3.4於30分鐘內降低至8-9%。在這個特定實施例中，研究的其它因素，包括溫度、時間、2-MEA濃度和IgG4濃度，在所研究的範圍內並沒有顯示出對半抗體水平具有統計學上顯著的影響。

總的來說，這些結果表明，IgG4半抗體的水平能夠通過向捕獲後溶液如蛋白A洗提液添加氧化還原試劑2-MEA來有效地控制。

Claims (29)

1. 一種控制藉由生物過程所產生之多聚體蛋白質的多肽之間二硫鍵數目的方法，該方法包括：(a)在該生物過程中特定的時間點將該多肽與條件溶液接觸，其中該條件溶液具有介於4至6之間的pH，其中該條件溶液包含氧化還原試劑，其中該氧化還原試劑為2-巰基乙胺(2-MEA)，及(b)將包含該多肽的條件溶液在預定的溫度培育預定的時間，其中該培育之預定的溫度係介於2℃與8℃之間；其中該多肽與該條件溶液之培育係增加蛋白質多肽之間所形成的二硫鍵數目。
2. 如請求項1的方法，其中該氧化還原試劑的莫耳濃度與蛋白質的莫耳濃度之比為至少約4：1、8：1、16：1或32：1。
3. 如請求項1的方法，其中在培育期間對包含該多肽的條件溶液進行混合。
4. 如請求項1的方法，進一步包括：在該生物過程中的特定時間點將該多肽從該生物過程中移出。
5. 如請求項4的方法，進一步包括：在培育之後將該多肽返還至該生物過程。
6. 如請求項1的方法，其中該生物過程包括批式、半連續或連續生物過程。
7. 如請求項1的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括生物過程中在生物反應器操作或進料批式細胞培養操作之後的時間點。
8. 如請求項1的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括其中該多 肽處於包含多個細胞的溶液中的時間點。
9. 如請求項8的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括其中該多肽位於包含多個細胞的生物反應器、容納槽或非生物反應器單元操作容器中的時間點。
10. 如請求項1的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括其中該多肽處於無細胞溶液中的時間點。
11. 如請求項10的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括其中該多肽位於容納槽中的時間點。
12. 如請求項10的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括在病毒滅活、調節、色譜、過濾、稀釋、濃縮步驟或任何無細胞的生物過程步驟過程中的時間點。
13. 如請求項10的方法，其中該生物過程中的特定時間點包括在生物過程的澄清階段、澄清的收穫品階段、捕獲階段、中間色譜階段(intermediate chromatography stage)或精修色譜階段(polishing chromatography stage)過程中的時間點。
14. 如請求項10的方法，其中該無細胞溶液包含澄清的收穫品(clarified harvest)。
15. 如請求項10的方法，其中該無細胞溶液包含蛋白A洗提液(Protein A eluate)。
16. 如請求項1的方法，其中該多聚體蛋白質是非抗體蛋白質。
17. 如請求項1的方法，其中該多聚體蛋白質是抗體。
18. 如請求項1的方法，其中該多聚體蛋白質是抗體片段。
19. 如請求項17或18的方法，其中該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽。
20. 如請求項17或18的方法，其中該多聚體蛋白質的多肽包含輕鏈 多肽。
21. 如請求項17或18的方法，其中該多聚體蛋白質的多肽包含重鏈多肽和輕鏈多肽。
22. 如請求項1的方法，其中該多肽是蛋白質的單體或多聚體。
23. 一種控制包含抗體分子群體的溶液中半抗體分子的比例的方法，該方法包括：(a)將該包含抗體分子群體的溶液與條件溶液接觸，其中該條件溶液包含氧化還原試劑，其中該氧化還原試劑為2-巰基乙胺(2-MEA)；及(b)將包含該抗體分子的條件溶液在預定的溫度培育預定的時間；其中將該抗體分子與該條件溶液之培育在條件抗體溶液中減少半抗體分子的比例，其中該條件溶液具有介於4至6之間的pH；且其中該培育之預定的溫度係介於2℃與8℃之間。
24. 如請求項18或23的方法，其中該抗體是IgG4抗體。
25. 如請求項23的方法，其中該抗體是抗體片段。
26. 如請求項18或25的方法，其中該抗體片段是IgG4抗體片段。
27. 如請求項23的方法，其中該條件抗體溶液中半抗體分子的比例低於30%。
28. 如請求項23的方法，其中該條件抗體溶液中半抗體分子的比例低於15%。
29. 如請求項24的方法，其中該抗體溶液包含那他珠單抗(natalizumab)、吉妥珠單抗(gemtuzumab)或夫蘇木單抗(fresolimumab)。

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