TWI693403B - 免疫檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種免疫檢測方法，其包含：提供碟片；提供捕獲抗體於基板上；添加樣品於分流槽；施加第一轉速，以從分流槽傳送包含抗原的樣品至反應槽；施加第二轉速，以沉降樣品於基板，使樣品中的抗原與捕獲抗體結合而獲得第一複合物；利用毛細作用力，使樣品從反應槽流出並填滿流道；施加第三轉速，以將樣品從流道傳送至廢液槽；提供偵測抗體於基板上，使偵測抗體與第一複合物結合而獲得第二複合物；以及檢測第二複合物的來自侷域性表面電漿共振之光譜訊號。

Description

免疫檢測方法
本發明係關於一種免疫檢測方法，特別是關於一種能夠簡化注入試劑的步驟的侷域性表面電漿共振的免疫檢測方法。
由於醫療科技的進步，人們的壽命得以延長。在各式醫療科技中，提供用以協助診斷的醫學數據之檢測技術極為重要。目前，檢測技術與儀器集中於大型醫院，造成受試者需特地前往醫院並經歷漫長的檢測流程，導致受試者的檢測意願降低。
因此能夠使檢驗更快速的完成的重點照護檢驗(Point-of-Care Testing)因應而生。其中，又以能將各種檢測儀器微小化、容易攜帶、檢驗辨識度高且操作方便的微流體碟片(microfluidic disk)為主流產品。同時，微流體碟片還能搭配離心平台以減少反應時間。
舉例而言，結合酵素連結免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)及微流體碟片之碟片式ELISA(CD ELISA)能夠藉由液體依序釋放及系統微小化的優點，來減少整體檢測時間。然而碟片式ELISA存在靈敏度不足及注入試劑的步驟繁瑣等缺點。是故，仍需提供一種能夠簡化注入試劑步驟的免疫檢測方法。
鑒於上述問題，本發明之目的為提供一種免疫檢測方法，結合免疫分析法、微流體碟片、能夠放大光學訊號之侷域性表面電漿共振(Localized surface plasmon resonance，LSPR)技術，並以微流體功能搭配程式自動化控制馬達轉速，達到簡化注入試劑的步驟、自動化注液與移液。除此之外，在習知技術係將微孔盤放置於大型離心機中旋轉，利用離心沉降的方式增加試劑與基材的反應效率，然而卻需要額外的設備與特殊的旋轉台機構。本發明的方法只需要單一馬達即可完成包含離心沉降的所有檢測流程，不須外加的設備，能降低成本並提高產品競爭力。
本發明之目的係為提供一種免疫檢測方法，其包含：提供碟片，所述碟片包含分流槽及複數個碟片單元，各碟片單元包含以流道連接至廢液槽的反應槽、以及設置於反應槽內的基板，基板包埋複數個第一奈米粒子；提供捕獲抗體(capture antibody)於基板上；添加樣品於分流槽；施加第一轉速，以從分流槽傳送包含抗原(antigen)的樣品至反應槽；施加第二轉速，以沉降樣品於基板，使樣品中的抗原與捕獲抗體結合而獲得第一複合物；利用毛細作用力，使樣品從反應槽流出並填滿流道；施加第三轉速，以將樣品從流道傳送至廢液槽；提供偵測抗體(detection antibody)於基板上，以結合偵測抗體與第一複合物為第二複合物；以及檢測第二複合物的來自侷域性表面電漿共振之光譜訊號，複數個第一奈米粒子震動而產生侷域性表面電漿共振。其中，第二轉速大於第一轉速。
本發明的免疫檢測方法具有下述優點：
(1)本發明的方法藉由改變離心力與毛細作用力之平衡，有效且可調地注入試劑，相較於需以人力重複注入多種試劑於微滴定盤的方法，能夠簡化製程、縮短檢測時間與降低人力操作誤差及成本。同時，習知的碟片設計中，反應槽與碟片單元設置於同平面上，但是易存在空氣排出不良之問題。然本發明之反應槽則沿徑向凸出設置，因此能有效地藉由立體結構排除空氣。本發明亦藉由調整平面上之碟片單元與反應槽之間的連接流道寬度，以使碟片兼顧排氣順暢與試劑所需體積較小之優點。
(2)本發明的方法利用馬達控制轉速將反應槽中的液體完整移出並清洗，且利用離心力與毛細作用力排空液體之方法使得基板表面維持於接近乾燥之狀態，使後續光學檢測時，能獲得正確且穩定的數據。
S51~S58、S601~S624:步驟
1:碟片
100、400:碟片單元
110、410:分流槽
110a:圓心
120、420、2020:反應槽
121:基板
122:反應區
130、430、2030:廢液槽
140、440:儲存槽
150:流道
160:端部
2401:水膜
2601、2602:部份
401:等分盤
402:毛細管
450:虹吸通道
451:計量通道
452:連接通道
453:排氣通道
701:捕獲抗體
702:牛血清蛋白
703:抗原
704:偵測抗體
D、L:長度
h、H:寬度
第1圖係本發明之較佳實施例的碟片示意圖。
第2圖係本發明之較佳實施例的碟片侷部放大圖。
第3圖係本發明之較佳實施例的碟片態樣圖。
第4圖係本發明之較佳實施例的碟片示意圖。
第5圖係本發明之較佳實施例的碟片清洗流程示意圖。
第6圖係本發明之較佳實施例的反應流程示意圖。
第7圖係本發明之較佳實施例的等分試樣示意圖。
第8圖係本發明之等分試樣之分析圖。
第9圖係本發明之等分試樣之分析圖。
第10圖係本發明之等分試樣之角速度分析圖。
第11圖係本發明之等分試樣之變異係數分析圖。
第12圖係本發明之等分試樣之定量裝置示意圖。
第13圖係本發明之填充液體之流道示意圖。
第14圖係本發明之填充液體之轉速分析圖。
第15圖係本發明之填充液體之流態影像圖。
第16圖係本發明之填充液體之反應槽影像圖。
第17圖係本發明之液體排空之流道示意圖。
第18圖係本發明之液體排空之分析圖。
第19圖係本發明之虹吸流道的設置示意圖。
第20圖係本發明之虹吸流道之關鍵轉速分析圖。
第21圖係本發明之虹吸流道之殘留水分的影像圖。
第22圖係本發明之虹吸流道之殘留水分的分析圖。
第23圖係本發明之偵測面積範圍的示意圖。
第24圖係本發明之培育轉速的分析圖。
第25圖係本發明之培育轉速的分析圖。
第26圖係本發明之清洗次數之分析圖。
第27圖係本發明之精準度之分析圖。
為使上述目的、技術特徵及實際實施後之效益更易於使本領域具通常知識者理解，將於下文中以實施例搭配圖式更詳細地說明。
在一實施例中，可提供碟片，碟片可包含分流槽及複數個碟片單元。碟片單元的數量可大於等於8個。各碟片單元可包含以流道連接至廢液槽的反應槽以及設置於反應槽內的基板。各碟片單元可包含儲存槽。基板上可設置複數個第一奈米粒子。複數個第一奈米粒子可為奈米金粒子或奈米銀粒子。與廢液槽連接之流道之第一部分的延伸方向通過碟片之圓心。可提供捕獲抗體於基板上。
在一實施例中，可施加第一轉速，利用第一轉速產生的離心力驅動碟片時的離心壓力與樣品的表面張力之壓差阻力，以使樣品從分流槽傳送至反應槽。樣品可包含抗原。可施加第二轉速，利用第二轉速產生的離心力沉降樣品於基板上，使樣品與捕獲抗體接觸，並使樣品中的抗原與捕獲抗體特異性結合為第一複合物。可利用毛細作用力，使樣品從反應槽流出並填滿流道，然而樣品並未溢出流道，亦即尚未被傳送至廢液槽。可施加第三轉速，以利用第三轉速所造成的角速度之歐拉力，將樣品從流道傳送至廢液槽。
在一實施例中，可提供偵測抗體於基板上，以特異性結合偵測抗體與第一複合物為第二複合物可檢測第二複合物的侷域性表面電漿共振之光譜訊號。複數個第一奈米粒子可震動而產生侷域性表面電漿共振。偵測抗體可包含複數個第二奈米粒子，複數個第一奈米粒子與複數個第二奈米粒子可震動以偏移光譜訊號的波長，進而放大光譜訊號，以增進光譜訊號的靈敏度。
可於傳送捕獲抗體、樣品或偵測抗體後，傳送清洗液，以將殘餘液體移除，進而增進檢驗方法的精準度。
在一實施例中，在提供捕獲抗體於基板上之步驟與提供偵測抗體於基板上之步驟之間，可包含提供阻隔劑於基板上之步驟。捕獲抗體、抗原、偵測抗體、清洗液以及阻隔劑可為所屬技術領域中具有通常知識者為習知的捕獲抗體、抗原、偵測抗體、清洗液以及阻隔劑。
在本發明之較佳實施例中，所選用的免疫檢測藥劑如下：
(A)單株小鼠抗心肌鈣蛋白I(Monoclonal mouse anti-cardiac troponin I，HyTest/19C7)，濃度：3.6mg/ml。
(B)重組人類心肌鈣蛋白I(Recombinant human cardiac troponin I，HyTest/8RTI7)，濃度：0.9mg/ml。
(C)單株小鼠抗心肌鈣蛋白I(Monoclonal mouse anti-cardiac troponin I，HyTest/16A11)，濃度：8.3mg/ml。
(D)磷酸鹽緩衝液(BSA buffer)。
(E)10X磷酸鹽緩衝液(10 X PBS)，其包含：80g/L NaCl、2g/L KCl、14.4g/L NaHPO4與2.4g/L KH2PO4。
(F)界面活性劑Tween-20
(G)含有磷酸鹽緩衝液界面活性劑Tween-20(Phosphate Buffered Saline Tween-20，PBST)，其包含1 X PBS與Tween-20。
(H)食用色素。
在本發明之較佳實施例中，所選用的微流體碟片材料如下：
(A)生物性相容膠帶(3M，美國)。
(B)聚碳酸酯(Polycarbonate，PC)扇形檢測片(昆良工業股份有限公司，台灣)。
(C)帶有奈米金粒子玻璃基材(希華晶體科技股份有限公司，台灣)。
(D)微滴定盤(希華晶體科技股份有限公司，台灣)。
在本發明之較佳實施例中，詳細操作步驟如下。
配製與合成
選用面積為0.07cm2之圓形玻璃片作為基板，選用捕獲抗體的濃度為3000ng/cm2。另，將抗原濃度序列稀釋為0、64、320、1600、8000、40000、200000pg/mL。取1mM，20mL四氯金酸溶液加熱至沸騰後，快速加入38.8mM，2mL的檸檬酸鈉溶液，加熱至溶液顏色為紅色，獲得金奈米粒子(Au NPs)。將每100μL的AuNPs與濃度為1mg/ml，1uL的辣根過氧化物酶(SA-HRP)混合，獲得辣根過氧化物酶-金奈米粒子(SA-HRP@Au NPs)。
碟片設計
參照第1圖，碟片1具有設置於碟片中心的分流槽110以及8個碟片單元100。碟片1為圓形時，碟片具有圓心110A。分流槽110連接所有碟片單元100以等分試劑(aliquoting)。碟片單元100具有反應槽120、廢液槽130、儲存槽140及流道150。反應槽120內設置塗佈金奈米粒子的基板。首先，試劑會暫存於儲存槽140，而後藉離心力使各試劑於反應槽120內反應，並藉毛細現象使試劑流出反應槽並填滿流道150，再利用離心力使試劑傳送至廢液槽130。因此，使用者僅需單次注入試劑，便能使試劑自動等量分配至多個反應槽120中，以保留試劑於反應槽120中培育，使試劑披覆在基板。
參照第2圖，(A)係反應槽之正視圖，(B)及(C)係反應槽之側視圖。長度L為可在離心平台上旋轉偵測的最小長度，長度D為偵測面積的直徑。長度L可為1mm以上，若小於1mm時，無法做旋轉偵測；若大於10mm時，產生使用試劑體積用量大之負面效果。反應槽120內設置有基板121，以形成反應區122。
參照第3圖，由於基板能設置於反應槽內之不同處，故分別以Type A、Type B與Type C之三種態樣比較設置處對於檢測的影響，結果如表1所示。
表1
Figure 108101856-A0305-02-0010-1
參照表1，可知Type C的設置方法所需的試劑體積少、容易排除試劑而不易使試劑殘留，檢驗結果具有趨勢。因此，選用Type C。
接續上述，提供以雕刻機加工之PMMA，使PMMA上存在流道，即獲得碟片單元。參照第4圖，(A)係碟片示意圖，(B)係碟片單元示意圖，(C)係碟片單元侷部放大示意圖，(D)係碟片單元的實品圖。
如(A)所示，碟片包含等分盤401和8個碟片單元400。等分盤401包含中心分流槽410，等分盤401的外圍設置8個毛細管402，毛細管402連接碟片單元400並將等分的液體輸送到碟片單元400。如(B)所示，碟片單元400包含沿軸向突出的平面微流體結構與反應槽420。平面微流體結構包括儲存槽440、連接反應槽的連接通道452、計量通道451、虹吸通道450、排氣通道453與廢液槽430。如(C)所示，徑向設置之反應槽420包括塗有金奈米粒子的玻璃基板421與塑膠帽423。
比較例
使用已批覆奈米金粒子的玻璃基板取代微滴定盤底部之透明塑材之微滴定盤，並進行免疫吸附反應，如下所述：
(1)以60W微波30分鐘，使捕獲抗體披覆於帶有奈米金粒子之玻璃上，移除試劑並清洗4次。
(2)於微滴定盤內依序加入牛血清蛋白(BSA)、抗原、金奈米粒子標定的偵測抗體，藉由2700rpm高轉速旋轉20分鐘以沉積於孔盤底部之玻璃上，並於沉積後移除試劑並清洗4次。
(3)將孔盤翻轉180度，透過高速離心將液體甩乾，以減少表面水漬，並以波長550nm進行光學量測。
實例
將LSPR技術結合至微流體離心式平台，在平台上進行試劑的離心、沉降與移除，再於光學儀器中檢測，詳細步驟如下所述：
(1)披覆步驟
將捕獲抗體以1000rpm之低轉速傳送至反應槽，以60W微波30分鐘，使其批覆於帶有奈米金粒子之玻璃上。提高轉速至2700rpm以移除未結合的捕獲抗體至廢液槽。再於儲存槽加入作為清洗液的PBST，以1000rpm之低轉速驅動試劑至反應槽進行清洗，清洗完畢後，使PBST通過虹吸流道。最後提高轉速至2700rpm，使PBST排至廢液槽。
(2)培育與清洗步驟：
將牛血清蛋白以1000rpm離心而傳送至反應槽，以2700rpm離心20分鐘沉降其於玻璃上。結束後提高轉速至2700rpm將未結合的牛血清蛋白排至廢液槽。再於儲存槽加入PBST，以1000rpm之低轉速驅動PBST至反應槽清洗，清洗完畢後，使PBST通過虹吸流道。最後，提高轉速至2700rpm，使PBST排至廢液槽。利用相同之離心速度、離心時間與離心次數，分別再將抗原以及SA-HRP@Au NPs沉降。
(3)檢測步驟：
將碟片於光學儀器上以波長550nm檢測。
參照第5圖與第6圖。步驟S51~S54係注入試劑後使試劑填滿，再使試劑爬升以排空試劑，步驟S55~58係注入清洗液使清洗液填滿，再使清洗液爬升以排空清洗液。
步驟S601~S603，在反應槽620中將捕獲抗體結合於基板。步驟S604~S606用清洗液將未結合於基板上的捕獲抗體移除。步驟S607~S609提供阻隔劑在基板上。步驟S610~S612，用清洗液將未結合於基板上的阻隔劑移除。步驟S613~S615，結合抗原與捕獲抗體。步驟S616~S618，用清洗液將未結合於捕獲抗體上的抗原移除。步驟S619~S621，結合偵測抗體與抗原，形成偵測抗體-抗原-捕獲抗體的三明治結構。步驟S622~S624，用清洗液將未結合於抗原上的偵測抗體移除。
接續上述，進行比較例與實例之分析。
分析一、等分試樣
參照第7圖，其係本發明之較佳實施例的等分試樣示意圖。代表一種試劑只需注入一次，可減少檢驗的整體注入次數以大幅節省時間與人力。選用不同直徑的通道時，液體突破通道的時間不一，而誤差源自θ方向的填充。角加速度越大，液體填滿槽體且突破通道的時間差較小，液體體積量變異小。
參照第8圖，(A)係角加速度對液體分流的分析圖，(B)係角加速度對突破時間差的分析圖。如(A)所示，可知槽體深度0.5mm時，深度較小所以阻力較大，填滿中心分流槽的時間較長，而變異係數高。如(B)所示，可知在槽體深度足夠的情況，填滿中心分流槽體所需的時間較短。
接續上述，選用直徑為0.2、0.4與0.8mm的通道進行流量的誤差分析，其結果如第9圖所示。可知，以越小的通道連接時，在第一個通道和最後 一個通道流出的體積量之誤差小。因此固定通道管徑為0.2mm，分析突破時間差、流量與變異係數，其結果如第10與11圖所示。
參照第10圖，(A)係各角加速度的突破時間差的分析圖，(B)係各角加速度的流量的分析圖。
參照第11圖，其係本發明之等分試樣之變異係數分析圖，各角加速度下得到的△t和Qr相乘之數值與變異係數C.V.相關。提高馬達加速時的角加速度能縮減填滿中央分流槽的時間，使液體迅速填滿針頭前端且突破流出，同時若使用較窄的通道，能使液體之分流的等量分配變異係數可控制於3~5%。
參照第12圖，(A)與(B)係分別為具有及不具有定量裝置之碟片。由於等分存在誤差，可能造成全部的試劑排至廢液槽。因此將反應槽旁增加定量裝置，將多餘的試劑流至廢液槽。
分析二、填充液體
若入口流道設計較為寬深，流道阻力小而流量增加，液體迅速往反應槽流入，堵塞排氣通道致無法排氣，難以完整填充反應槽，產生液體累積，造成液體在流道的高度高於虹吸流道，使全部的液體排入廢液槽。因此，本發明利用如第4圖(C)所示之徑向凸出的反應槽423以及液體寬度h與連接通道之寬度H的比值來克服排除空氣的問題。
參照第13圖，從入口流道流出的液體寬度定為寬度h，連接通道寬度為寬度H，不同轉速下有不同的比值(h/H)。其中，連接通道寬度H代表反應槽之入口寬度。
固定液體流入反應槽之入口流道的水力直徑為0.4mm，改變轉速為1000、2000、3000、4000與5000rpm，h/H為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mm，且探討各轉速下的流量，其結果如第14圖所示。
可知進入反應槽的體積流量在填充過程中極為重要。在低體積流速(Q<300)，液體完全充滿反應槽，排氣良好，過量的液體通過計量通道溢流到廢液槽。在中等體積流速(300<Q<900)，反應室因空氣排出不良，沒有完全充滿液體，液體流過毛細管頂部並進入廢液槽，同時過量的液體也通過計量通道流入廢液槽。在高體積流速(900<Q)，連接通道中觀察到阻止液體流入反應槽的大氣泡，大部分液體流入廢液槽，反應室未被填充。可知，填充效果係根據流體設計變化，另外還與比值(h/H)有關。若比值(h/H)小於0.3，則可成功填充。
參照第15圖，(A)、(B)與(C)係分別為轉速為1000rpm、轉速為2000rpm~4000rpm以及5000rpm下之流態影像圖。
如(A)所示，液體順利排氣而成功保留。如(B)所示，連續的液體將氣泡占用應填入之液體體積，使液體因為虹吸而排至廢液槽。如(C)所示，排氣孔閥堵住，導致反應槽無法填滿液體，填充反應槽失效，液體排至廢液槽。
參照第16圖，(A)與(B)係分別為轉速1000rpm下之反應槽之俯視圖與側視圖，且(C)與(D)係分別為轉速5000rpm下之反應槽之俯視圖與側視圖。當轉速為1000rpm時，液體順利充填反應槽，而當轉速提升至5000rpm時，液體無法充填反應槽。
分析三、液體排空
參照第17圖，(A)係經親水表面處理之液體排空示意圖，(B)係未經親水表面處理之液體排空示意圖，(C)部分係液體排空之流道示意圖。
如(A)所示，液體自動藉由虹吸作用通過虹吸流道的最高點並至廢液槽前，再提高馬達轉速，反應槽內的液體會跟著連接通道內的液體一併帶至廢液槽。惟，表面處理之效果隨著時間失效。如(B)所示，為避免試劑直接通過虹吸通道進入廢液槽，反應槽與虹吸通道之溢流點之間存在徑向差△R。徑向差△R定義為離心後水位平衡處到虹吸最高點之差。依據徑向差△R設定安全的累積高度，以避免液體通過虹吸通道直接進入廢液槽，並使液體驅動。液體通過表面不改質流道之抬升的移動距離隨馬達角加速度和流道水力直徑dH而變化，藉由改變轉速使液體受動量而抬升。如(C)所示，流道的長度在高轉速(ωH>2000rpm)時須高於反應槽之液面，寬度與深度皆為0.4mm。當馬達轉至高轉速時，液體將因離心力驅動而進入反應槽中；再將馬達轉速降至低轉速(ωL<10rpm)，此時離心力小於毛細管力，因此流道中的液體將因毛細管力驅動而填滿流道；最後將馬達提升至高轉速，反應槽中的液體因虹吸現象而排至廢液槽。
設定轉速4000rpm，再將轉速降至0rpm，設定10000、40000、70000、100000rpm/s的角加速度，並設定傾角為15、30、45度，觀察液體抬升的高度，其結果如第18圖所示。
參照第18圖，(A)係角加速度分析圖，(B)係傾角分析圖。可知較高的角加速度產生較大的歐拉力，液體抬升的高度隨之增加。當水力直徑愈大，阻力愈小，液體抬升高度愈大，反之亦然。同時，傾角的角度影響抬升所需的角加速度，可知傾角的角度愈大，液體抬升高度愈大，反之亦然。
即使讓液體通過虹吸通道的最高點而將液體排至廢液槽，但若施加的轉速未達關鍵轉速，仍會有液體殘留於連接廢液槽前端的流道內，導致後 續注入並離心液體後，會直接將液體排至廢液槽，無法保留液體作離心沉降的培育。是故，針對虹吸流道的設置方式進行分析。
參照第19圖，(A)與(B)分別為虹吸流道之設計1與設計2，進行分析之結果如第20圖所示，液體排空之虹吸通流道的水力直徑愈大時，會因阻力較小，使液體排空的關鍵轉速下降；反之亦然。同時，可知設計2之虹吸通道，其延伸方向為離心方向，亦即與廢液槽130連接之流道150之端部160的延伸方向，通過碟片的圓心110A，因此關鍵轉速相較於設計1之虹吸通道更低。
由於進行LSPR感測時，玻璃表面須為乾燥。因此在本發明中，利用上述的液體排空方式，使反應槽中的液體藉由虹吸通道排至廢液槽。
參照第21圖，可知玻璃表面存在殘餘水分造成水膜2401。接著，對存在水膜與完全乾燥之基板進行分析，結果如第22圖所示，雖水膜僅使訊號略為增加，與完全乾燥之結果相近。
分析三、試劑的體積
Anti IgG-HRP@Au NPs的吸光值(O.D.)固定，STD相同濃度下，STD體積加入量越多，最後數據越高，實驗與垂直沉積於底部感測玻璃之試劑的高度有關，其結果如第23圖所示。
參照第23圖，(A)表示試劑的培育高度為高度H1，(B)表示本發明之實例之具體大小，其中離心平台上旋轉偵測的最小長度之長度L係為10mm，偵測面積的直徑之長度D為3mm，且試劑的培育高度之高度H1係為3mm。其中，所需試劑的體積Vtotal係為反應槽體積Vchamber、連接通道體積Vchannel以及流道體積Vdisk channel的總和。反應槽體積Vchamber為圓形面積再乘以厚度，原設計(如(C)所示)的直徑之長度D為6；而新設計(如(D)所示)之長度D為3。連接通道體積Vchannel為 長方形面積再乘以厚度，原設計與新設計的長度L皆為10，且厚度為4。流道體積Vdisk channel則為部份2601與部分2602之體積總和(如(E)所示)，部份2601之體積為長乘以寬，再乘以深；部份2602之體積則為虹吸流道之體積，其體積設定為1。本發明之實例能有效減少試劑用量。
同時，將比較例與實例所需至試劑體積進行分析，其結果如表2所示。
Figure 108101856-A0305-02-0017-2
如表2所示，可知本發明之實例能夠大幅減少使用試劑之體積。
分析五、試劑的培育轉速和時間
選用培育時間為20分鐘，選用轉速2700rpm作為最佳的離心沉降培育轉速。將抗原濃度序列稀釋為0、64、320、1600、8000、40000、200000pg/mL在離心式免疫分析儀上做檢測，其結果如第24圖所示，可知比較例與實例之吸光值仍存在差異。為了提升實例之偵測訊號，提升培育轉速，其結果如第25圖所示。
參照第25圖，可知增加轉速能提升訊號。當以轉速5000rpm離心沉降培育時，無論培育時間為10分鐘或20分鐘，訊號並未再加以提升，因此，選用轉速5000rpm作離心沉降培育10分鐘。
分析六、反應的清洗次數
由於免疫吸附法反應檢測需要經過多次的清洗，以避免非特異性的蛋白吸附或殘留於反應槽。是故，分析清洗次數的影響。於沉降後移除試劑並分別以清洗液PBST清洗1次和4次，結果如第26圖所示。可知清洗1次的訊號略大於清洗4次的訊號，然而差異不大。
分析七、精準度
進行本發明之實例與比較例之分析，其結果如第27圖所示。可知本發明之實例與比較例趨勢相似，因此實例之分析能力與微滴定盤相近。
綜上所述，雖然本發明已以上述實施例及實例具體描述本發明之免疫檢測方法，然而本發明所屬技術領域中具有通常知識者應理解的是，可在不違背本發明之技術原理及精神下，對實施例作修改與變化。因此本發明之權利保護範圍應如申請專利範圍所述。
1:碟片
100:碟片單元
110a:圓心
110:分流槽
120:反應槽
121:基板
122:反應區
130:廢液槽
140:儲存槽
150:流道

Claims (6)

  1. 一種免疫檢測方法，其包含：提供一碟片，該碟片包含一分流槽及複數個碟片單元，各該碟片單元包含：一反應槽，以一流道連接至一廢液槽；以及一基板，設置於該反應槽內，該基板包埋複數個第一奈米粒子；提供一捕獲抗體於該基板上；將包含一抗原的一樣品添加於該分流槽；施加一第一轉速，以使該分流槽中的該樣品移至該反應槽；施加一第二轉速，以沉降該樣品於該基板，使該樣品中的該抗原與該捕獲抗體結合而獲得一第一複合物；利用毛細作用力，使該樣品從該反應槽流出並填滿該流道；施加一第三轉速，以將該樣品從該流道移至該廢液槽；提供一偵測抗體於該基板上，使該偵測抗體與該第一複合物結合為一第二複合物；以及檢測該第二複合物的一光譜訊號，其中該光譜訊號係來自該複數個第一奈米粒子震動而產生的侷域性表面電漿共振；其中，該第一轉速小於1500rpm，該第二轉速大於2500rpm，且該第三轉速為2700rpm。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之免疫檢測方法，其中與該廢液槽連接之該流道之一端部的延伸方向通過該碟片之圓心。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之免疫檢測方法，其中該偵測抗體包含複數個第二奈米粒子，該複數個第一奈米粒子與該複數個第二奈米粒子震動以偏移該光譜訊號的波長，使該光譜訊號放大。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之免疫檢測方法，其中該複數個第一奈米粒子與該複數個第二奈米粒子中之至少一者為奈米金粒子。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之免疫檢測方法，其進一步包含一清洗步驟，該清洗步驟包含下述步驟：施加該第一轉速，以從該分流槽傳送一清洗液至該反應槽；利用毛細作用力，使該清洗液從該反應槽流出並填滿該流道；以及施加該第三轉速，以將該清洗液從該流道傳送至該廢液槽，其中該清洗步驟發生在提供該捕獲抗體於該基板上之步驟與將包含該抗原的該樣品添加於該分流槽之步驟之間；施加該第三轉速之步驟與提供該偵測抗體於該基板上之步驟之間；以及提供該偵測抗體於該基板上之步驟以及檢測該第二複合物的該光譜訊號之間。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之免疫檢測方法，其中在施加該第三轉速之步驟與提供該偵測抗體於該基板上之步驟之間，進一步包含提供阻隔劑於該基板上之步驟。
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