TWI693401B - 用於篩選及分離純化待測物的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於篩選及分離純化待測物的方法。

Description

用於篩選及分離純化待測物的方法
本發明是關於一種用於篩選及分離純化待測物的方法。
細胞可活性(cell viability)程度作為評估細胞生理狀態的重要標記，其會受到外在環境因子之變化而出現可被偵測的差異。特別地，由於細胞間存在基因表達上的差異，這導致基因型相同之細胞也可能產生不同之環境耐受性，並能藉由細胞可活性程度的差異來區別之。例如，腫瘤的藥物抗性往往被視作臨床化療失敗的關鍵因素，但在腫瘤發展的早期，具有藥物抗性表現之腫瘤細胞僅占整體腫瘤組織中的極少部分，且細胞生理特性上並未異於周邊未帶有藥物抗性的腫瘤細胞，這使得藥物抗性難以被偵測。然而，一旦投入抗癌藥物，未帶有藥物抗性的腫瘤細胞與帶有藥物抗性的腫瘤細胞便會出現明顯的細胞可活性程度差異，從而能輕易地分辨之。因此，藉由調控細胞生存之外部環境(例如藥物、放射線、氧化壓力、毒化物或細胞自我凋亡等相關之處理)，便能透過細胞可活性程度的差異來區別出高環境耐受性的細胞群。
習知用於分離具有不同細胞可活性程度之細胞的方式大多仰賴細胞大小或表面抗原的差異，但細胞生理狀態的改變並不一定會促成細胞大小與表面抗原出現明顯之轉變，從而使得習知的分離方式並無法有效辨別具有不同細胞可活性程度之細胞。另一方面，抗體標記的前處理過程冗長且花費可觀，並且可能會造成細胞表現與狀態上的改變，因此已有出現以無標記(label-free)的方式來分離具有不同細胞可活性程度之細胞。
雙液相系統(aqueous two-phase system,ATPS)及介電泳(dielectrophoresis,DEP)為兩種常用的無標記細胞分離方法。ATPS主要是利用生 物分子對於不同溶液介質之親和性差異來進行分離。例如，活細胞由於表面呈現高度疏水性，在乙二醇(polyethylene glycol,PEG)與聚葡萄糖(Dextran)溶液構成之弱酸性ATPS環境下會朝高PEG之溶液相位移動，而死細胞則無此傾向，故整合ATPS之微流體系統能有效地分離活與死這兩種不同細胞活性的細胞。然而，若想進行更為精確之細胞生理狀態分離(例如分離出具有不同抗藥性基因表現程度之細胞)，ATPS無法做到。另一方面，DEP透過不均勻交流電場誘導之細胞極化程度，會隨著細胞在不同生理狀態下膜與質間的介電性與導電度差異而出現強度上的變化，因而能利用DEP來辨識與分離處於不同生理狀態之細胞。透過與微流體系統的整合，大量藉由金屬電極誘發DEP之死活細胞分離平台被開發，並應用於細菌、酵母菌與血球細胞的分離。然而，傳統固態金屬電極為主的DEP平台有著明顯的缺點，例如晶片的製程繁瑣、操作缺乏靈活性與造價昂貴。
因此，本領域的技術人員亟需研發出新穎之篩選及分離純化待測物的方法，以克服習知技術的缺點並造福有此需求的廣大族群。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於篩選及分離純化待測物的方法，其是利用一光誘導介電泳(optically-induced dielectrophoresis,ODEP)裝置來進行，該方法包含以下步驟：(a)對至少一待測物進行一處理，得到一經處理的待測物；(b)將該經處理的待測物導入該光誘導介電泳裝置，其中該光誘導介電泳裝置包括一主要微通道、至少一側邊微通道、至少一標的物收集槽及一具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力(optically-induced dielectrophoretic force)光圖形模組，該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組於該主要微通道內篩選該經處理的待測物，俾以使用一分離純化法將該經處理的待測物分離成至少一標的物；以及(c)將該標的物收集至該標的物收集槽。
在本發明的一實施例中，該方法用於篩選待測物的尺寸或可活性程度，及分離純化具有不同尺寸或可活性程度之待測物。
在本發明的一實施例中，該標的待測物為一微生物、一植物細胞、一動物細胞、一化學材料微粒或一金屬微粒。
在本發明的一實施例中，該處理為能誘導細胞出現細胞可活性差異之處理方式，或能誘導該細胞、該化學材料微粒或該金屬微粒出現尺寸差異之處理方式。
在本發明的一實施例中，當該處理能誘導細胞出現細胞可活性差異之處理方式時，係為藥物、放射線、氧化壓力、毒化物或細胞自我凋亡之處理。
在本發明的一實施例中，該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組包括至少一第一移動光圖形，該至少一第一移動光圖形具有一介於0.01μm/s至1cm/s的光圖形移動速度，及該光圖形移動速度為變速。
在本發明的一實施例中，該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組包括複數第二移動光圖形，各該些第二移動光圖形具有一介於0.01μm/s至1cm/s的光圖形移動速度，該些第二移動光圖形之間的光圖形移動速度不同，及該光圖形移動速度為定速。
在本發明的一實施例中，該分離純化法是藉由一選自於下列所構成之群組中的物理驅動來進行：流體驅動、電磁驅動、光驅動以及光誘導介電泳力驅動。
在本發明的一實施例中，該方法進一步用於篩選及分離純化具有不同環境耐受性基因表現程度之細胞。
在本發明的一實施例中，該環境耐受性基因為藥物、放射線、氧化壓力、毒化物或細胞自我凋亡相關之基因。
綜上所述，本發明用於篩選及分離純化待測物的方法之功效在於：操作簡易靈活，靈敏度、解析度與精密度高，可成功篩選待測物的尺寸或可活性程度及分離純化出具有不同尺寸或可活性程度之待測物，以利於區別不同環境耐受性之細胞群體(如抗藥性、放射線抗性、氧化壓力抗性、毒物抗性或細胞自我凋亡程度等)或不同尺寸的化學材料微粒或金屬微粒，並作為後端研究分析或臨床應用之前端篩選儀器，同時能因應不同之檢體情況做出即時性的調整，有利於精準醫療之建立。此外，經本發明方法所分離純化之細胞，一方面 可配合前置處理條件來知曉其環境耐受度上的差異(例如抗藥性、放射線抗性、氧化壓力抗性、毒物抗性或細胞自我凋亡程度等)，另一方面則可探究不同環境因子導致之細胞分群結果是否會在基因或分生機轉層次上出現差異。是故，本發明在臨床醫學與基礎研究兩方面皆具有重要之應用價值。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1:ODEP裝置
11:側邊微通道
12:主要微通道
121:細胞分離區域
1211:亞區域1
1212:亞區域2
1213:亞區域3
1214:亞區域4
13:標的物收集槽
131:第一標的物收集槽
132:第二標的物收集槽
133:第三標的物收集槽
134:第四標的物收集槽
14:樣品置放槽
15:廢物排出槽
16:聚二甲基矽氧烷基質
17:第一氧化銦錫玻璃基質
18:微通道層
19:第二氧化銦錫玻璃基質
21:抽吸式第一注射泵
22:抽吸式第二注射泵
23:函數產生器
24:電腦
25:商用數位投影機
26:電荷耦合裝置
27:螢光顯微鏡
271:4X物鏡
272:10X物鏡
28:螢幕
29:燈
3:光誘導介電泳力光圖形模組
8:ODEP裝置結合層流系統
81:側邊微通道
82:主要微通道
821:ODEP光圖形操作區
831:第一標的物收集槽
832:第二標的物收集槽
833:第三標的物收集槽
841:第一層流液體注入槽
842:第二層流液體注入槽
85:樣品置放槽
圖1A是本發明光誘導介電泳(ODEP)裝置的示意圖。
圖1B是本發明ODEP裝置的組裝圖。
圖1C是本發明ODEP裝置的架設示意圖。
圖1D是本發明ODEP裝置的架設實體圖。
圖2A是本發明方法之操作流程圖，其中Dx5表示帶有抗癌藥物抗藥性的MES-SA細胞；鈣黃綠素(calcein-AM)表示一種可辨識活細胞之螢光染劑；DiB表示一種細胞質膜(cytoplasmic membrane)標記染料；EthD-1表示一種可辨識死細胞之螢光染劑。
圖2B是本發明方法之另一操作流程圖。
圖3A是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之活細胞比例之數據圖，其中細胞之死活是藉由螢光死活染劑(即鈣黃綠素(calcein-AM)與EthD-1)來區別之。
圖3B是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之細胞可活性之數據圖，其中細胞可活性是藉由測定細胞內粒線體氧化還原能力之MTT試驗來區別之。
圖3C是未經藥物處理的Dx5細胞及MES-SA細胞大小之數據圖，其中NS表示沒有顯著差異。
圖3D是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之細胞大小的影響之數據圖，其中NS表示沒有顯著差異。
圖4是抗癌藥物處理前後操作MES-SA細胞及Dx5細胞的移動光條之最大速度的數據圖，其中NS表示沒有顯著差異；**表示p<0.01；****表示p<0.0001。
圖5是具有12種不同移動速度的移動矩形光條中死細胞(亦即EthD-1螢光染劑-陽性細胞)的百分比之數據圖。
圖6A是依據本發明方法(使用圖2A的操作模式)所篩選及分離純化的細胞之抗藥性基因表現分析數據圖，其中ND表示未偵測到；NS表示沒有顯著差異；****表示p<0.0001。
圖6B是依據本發明方法(使用圖2B的操作模式)所篩選及分離純化的細胞之抗藥性基因表現分析之另一數據圖，其中ND表示未偵測到；****表示p<0.0001
圖7A是依據本發明方法所篩選及分離純化的細胞以螢光顯微鏡觀察細胞分離區域中的細胞分佈之影像圖。
圖7B是依據本發明方法所篩選及分離純化的細胞(亦即MES-SA細胞及Dx5細胞)在細胞分離區域的4個亞區域中的分佈情形(百分比)之數據圖。
圖8A是本發明光誘導介電泳(ODEP)裝置結合層流系統之示意圖。
圖8B是根據本發明方法所進行之兩種不同尺寸(粒子直徑分別為30μm與14.6μm)乳膠微粒的篩選與純化分離之示意圖。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語「細胞可活性(cell viability)」意指一給定樣品中健康細胞(活細胞)的數目或百分比，而在單顆細胞中細胞可活性則與該細胞之細胞膜完整性、酵素活性、氧化還原能力具有高度關聯，細胞可活性越高的細胞，其細胞膜完整性與細胞內酵素活性越高，細胞生理狀態越為接近健康活細胞；反之，若細胞之細胞可活性越低，則細胞的生理狀態則趨向受損或死細胞。
如本文中所使用的，用語「光誘導介電泳(optically-induced dielectrophoresis,ODEP)」意指透過光電半導體材料為基板，藉由控制基板下方光線之投射來形成虛擬電極，以誘發特定範圍之不均勻電場來使基板上方細胞極化與移動(即介電泳現象)之技術。
如本文中所使用的，用語「光誘導介電泳力(optically-induced dielectrophoresis force)」意指當一粒子存在於非均勻電場(由光誘導所產生)中時，受到電場極化而誘發出電偶極(induced dipole)，由於粒子與其周遭懸浮液的極化程度有所差異而產生介電泳力。其中，光誘導介電泳力(F DEP )是依據下列公式(I)進行計算：F DEP =2πr 3 ε 0 ε m Re[f CM ]▽|E| 2 (I)r表示粒子半徑；ε 0 表示真空介電常數(vacuum permittivity)；ε m 表示周圍溶液的相對介電常數；▽|E| 2 表示施加電場梯度的平方；Re[f CM ]表示克勞修斯-莫索提因子(Clausius-Mossotti factor(f CM ))的實數部分(real part)。
如本文中所使用的，用語「光圖形(light image)」意指任何藉光學設備(如投影機、雷射等裝置)投射之光線所構成的圖案。在光誘導介電泳系統中，此一光圖形會直接投射在光電半導體材料上，且其強度須能誘導出穩定的非均勻電場，以利於光誘導介電泳力的生成。
如本文中所使用的，用語「層流(laminar flow)」意指當流道尺寸被限縮至微米等級(即微流道)時，流體間呈現平行移動之現象。
實施例1. 用於分離純化細胞可活性程度的光誘導介電泳(ODEP)裝置配置
本發明之光誘導介電泳裝置是藉由在微流體系統(microfluidic system)中以ODEP為基礎的細胞操作技術來篩選及分離純化具有不同細胞可活性程度之細胞。ODEP裝置的設計(layout)顯示於圖1A。圖1A是本發明ODEP裝置1的示意圖。由圖1A可見，ODEP裝置1包括四個側邊微通道(side microchannel)11、一主要微通道(main microchannel)12、四個標的物收集槽13(包括第一標的物收集槽131、第二標的物收集槽132、第三標的物收集槽133及第四標的物收集槽134)、一樣品置放槽14及一廢物排出槽15。每個標的物收集槽 13對應設置於每個側邊微通道11的末端。樣品置放槽14及廢物排出槽15分別設置於主要微通道12的兩相對末端。主要微通道12的長度為20mm、寬度為1.4mm、高度為50μm。第一標的物收集槽131及第二標的物收集槽132之側邊微流道長度為5.0mm、寬度為415μm、高度為50μm；第三標的物收集槽133及第四標的物收集槽134之側邊微流道長度為7.5mm、寬度為415μm、高度為50μm。主要微通道12用來細胞懸浮、樣品運送及細胞篩選(cell sorting)。側邊微通道11用來收集及分離細胞。主要微通道12定義出一細胞分離區域(cell isolation zone)121，用來進行以ODEP為基礎的細胞操作，細胞分離區域121的長度為2.6mm、寬度為1.4mm、高度為50μm。樣品置放槽14用來裝載新鮮細胞懸浮液樣品，廢物排出槽15用來收集廢物細胞懸浮液樣品。
圖1B是本發明ODEP裝置1的組裝圖。由圖1B可見，ODEP裝置1包括一位於頂部的聚二甲基矽氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)基質16、一第一氧化銦錫(indium-tin oxide,ITO)玻璃基質17、兩側設有生物相容性膠膜的微通道層18(包括主要微通道12及側邊微通道11)(厚度為50μm)、及一位於底部的第二氧化銦錫玻璃基質19。第二氧化銦錫玻璃基質19具有光導電材料(photoconductive material)，包括20nm厚的n-型氫化非晶矽(hydrogenated amorphous silicon)層及500nm厚的氫化非晶矽層。標的物收集槽13、樣品置放槽14及廢物排出槽15分別位於聚二甲基矽氧烷基質16及第一氧化銦錫玻璃基質17上的六個孔洞，其直接與微通道層18連接。
樣品的注入及取出方式如下：透過連接導管將抽吸式第一注射泵與廢物排出槽15相接，並將細胞懸浮液樣品注入樣品置放槽14的一PDMS孔洞，接而啟動抽吸式第一注射泵，便可將細胞懸浮液樣品由樣品置放槽14吸入主要微通道12之細胞分離區域121內。待標的細胞被收集至側邊微通道11，標的物收集槽13會透過一連接管與第二注射泵相接，則啟動第二注射泵可將標的細胞由側邊微通道11取出。
本發明ODEP裝置1的微組裝(microfabrication)及實驗設定如下：全部組裝過程是依據電腦數值控制機械加工(computer numerical controlled(CNC)machining)、金屬模-沖壓組裝製程(metal mold-punching fabrication process)、PDMS翻模(PDMS replica molding)、利用濺鍍(sputtering)及高密度電漿 化學氣相沈積(high-density plasma chemical vapor deposition,HDPCVD)之薄膜技術(thin-film technology)，及電漿氧化-支援的接合製程(plasma oxidation-aided bonding process)。簡言之，聚二甲基矽氧烷基質16是藉由電腦數值控制機械加工及PDMS翻模的組合而製成。為製備第一氧化銦錫玻璃基質17，利用鑽頭(drill)(旋轉速度26,000rpm)於氧化銦錫(ITO)玻璃(7 Ω,0.7mm；Ritek，台灣)機械式鑽出六個孔洞。關於微通道層18，透過手動沖壓操作使用自製金屬模製造出兩側設有生物相容性膠膜(L298,Sun-yieh，台灣)的微通道層18的中空結構。關於第二氧化銦錫(ITO)玻璃基質19，首先將70nm厚的ITO鍍膜濺鍍至乾淨的玻璃上，接而使用熱退火(thermal annealing)製程(240℃，60分鐘)。透過HDPCVD法將20nm厚的n-型氫化非晶矽(n-型a-Si：H)層沉積於ITO玻璃上。接著，透過HDPCVD法將500nm厚的氫化非晶矽(a-Si：H)層沉積於經處理的ITO玻璃上。之後，藉由O2電漿表面處理(plasma surface treatment)將聚二甲基矽氧烷基質16與第一氧化銦錫玻璃基質17結合，接而利用兩側設有生物相容性膠膜的微通道層18將結合聚二甲基矽氧烷基質16的第一氧化銦錫玻璃基質17與第二氧化銦錫玻璃基質19組裝。
圖1C是本發明ODEP裝置1的架設示意圖。圖1D是本發明ODEP裝置1的架設實體圖。在操作過程中，ODEP裝置1整合於一晶片，利用抽吸式第一注射泵(syringe pump)21將裝載好的細胞懸浮液樣品經由樣品置放槽14運送至主要微通道12。利用抽吸式第二注射泵22收取經分離並暫存於標的物收集槽13的細胞。利用函數產生器(function generator)23於第一氧化銦錫玻璃基質17與第二氧化銦錫玻璃基質19之間施加交流電(alternating current,AC)。與電腦24連結的商用數位投影機(commercial digital projector)25(PLC-XU350,SANYO，日本)透過10X物鏡272將光圖形(light image)顯示於具有光導電材料的第二氧化銦錫玻璃基質19上，俾以對操作的細胞產生光誘導介電泳力(optically-induced dielectrophoresis force)。此外，配備有電荷耦合裝置(Charge-coupled device,CCD)26的螢光顯微鏡27(Zoom 160,OPTEM,USA)(包括4X物鏡271)被用來觀察操作的細胞，並顯示於螢幕28。至於燈(lamp)29是用來生成顯微鏡觀察細胞所需要之背景光源，以便操作過程中能清楚觀察細胞 之移動路徑與其螢光染色，且由燈投射之顯微鏡背景光源強度並不會影響投影機投射之光圖形對細胞之操作。
實施例2. 本發明用於篩選細胞可活性程度及分離純化具有不同細胞可活性程度之細胞的操作方式
在本實施例中，本發明的方法是利用ODEP裝置來進行，操作流程顯示於圖2A及圖2B。簡言之，經抗癌藥物(亦即多柔比星(doxorubicin))處理的人類子宮肉瘤細胞(human uterine sarcoma cell)MES-SA細胞(來自食品工業發展研究所BCRC生物資源保存與研究中心)以螢光染劑進行染色，俾以鑑定細胞為活或死的狀態。接著，製備細胞懸浮液樣品，然後將之裝載至ODEP裝置中。之後，透過投影機投射之光圖形與光誘導介電泳力將細胞聚集至圖2A的(I)及(II)所示的細胞分離區域的起始線(圖2A的(I)與(II)分別顯示一動態光圖形，其由大正方形慢慢限縮成一光條，而把分散的細胞集中至起始線上)，接而以具有12種不同移動速度(起始速度16.7μm/s；增速度(increment)為每217μm的移動距離16.7μm/s；終端速度200μm/s)的移動矩形光條(moving rectangular light bar)(亦即光誘導介電泳力光圖形模組3，即圖2A的(III)~(VI)，其包括至少一第一移動光圖形，第一移動光圖形的光圖形移動速度為變速)(長度1.3mm，寬度100μm)來操作細胞並將細胞沿細胞分離區域擴張，如圖2A的(III)~(VI)所示。接著，以螢光顯微鏡觀察，俾以評估細胞篩選情形，如圖2A的(VII)所示。之後，將分佈於4個對應的側邊微通道中的細胞分離區域的4個亞區域之細胞分離。在操作過程中，使用具有大面積(長度2.6mm，寬度1.3mm)的光圖形來照射細胞分離區域(如圖2A的(VIII)所示)，然後將光圖形分裂成位於4個側邊微通道入口前方之4個較小的矩形光圖形(長度415.8μm，寬度222.8μm)，如圖2A的(IX)所示。之後，移動4個矩形光圖形來操作位於4個亞區域(包括亞區域1 1211、亞區域2 1212、亞區域3 1213及亞區域4 1214)內的細胞，即可藉光誘導介電泳力將細胞遞送至4個對應的側邊微通道中，如圖2A的(X)~(XI)所示。
在圖2B的操作模式中，由於真實樣品之細胞速度並無法經由實驗得知，故其與圖2A的差別在於，用來操作細胞的移動矩形光條(亦即光誘導介電泳力光圖形模組3，即圖2B的(III)~(IX)，其包括複數第二移動光圖形，第二移動光圖形之間的光圖形移動速度不同，及光圖形移動速度為定速)之速度是 未定的。圖2B的(I)及(II)是細胞篩選流程之前的細胞染色、裝載及操作流程，相同於圖2A的(I)及(II)所示。在後續用於篩選及分離細胞的步驟中，與圖2A的模式之主要差異在於使用具有廣大速度範圍(由高至低速)的移動矩形光條來篩選細胞樣品。在操作過程中，使用具有高移動速度(例如500μm/s)的矩形光條來操作細胞(亦即篩選細胞，藉由光誘導介電泳力來驅動細胞)，如圖2B的(III)及(IV)所示。如果沒有操作細胞(參見圖2B的(IV))，下一輪篩選的移動速度會漸減(減速25μm/s)。一旦超過兩個細胞可以特定移動速度的移動光條進行操作(參見圖2B的(V))，移動光條被設定停止在定義出的細胞分離區域的末端，如圖2B的(VI)所示。在圖2B的操作模式中，光圖形的操作是由高速往低速遞減，在光圖形移動速度高於細胞可被操作之速度時，不會有任何的細胞被光圖形所移動。然而，在圖2B的(V)至(VI)，一旦光圖形之移動速度足夠操作至少兩顆細胞或以上，則此一速度會被定義成此模式中細胞之最大操作速度，且後續11條移動光條之速度會依據細胞之最大操作速度來定義之。因此，在圖2B的(VI)中，移動光條上顯示兩個細胞之原因在於示意本模式之最大細胞操作速度至少要能同時操作兩顆細胞，而在圖2B的(IV)中移動光條未有細胞則是因為光圖形速度大於細胞操作速度，細胞無法被操作，故光圖形上不會出現細胞。隨後，根據圖2B的(VI)所得之最大操作速度定義的具有不同速度的其他11個移動光條被配置來篩選位於細胞分離區域內的細胞，如圖2B的(VII)~(IX)所示。接著，這11個移動光條被配置排列並停止在細胞分離區域，如圖2B的(IX)所示。之後的步驟與圖2A的流程相同。簡言之，以螢光顯微鏡觀察，俾以評估細胞篩選情形，如圖2B的(X)所示。之後，將分佈於4個對應的側邊微通道中的細胞分離區域的4個亞區域(包括亞區域1 1211、亞區域2 1212、亞區域3 1213及亞區域4 1214)之細胞分離，如圖2B的(XI)~(XIV)所示。
本發明的方法是用來篩選細胞可活性程度及分離純化具有不同細胞可活性程度之細胞，而關鍵的作用方式為對細胞產生的光誘導介電泳力(ODEP force)，它會隨細胞質的導電性(conductivity)產生變化。基於此，具有12種不同移動速度的移動矩形光條被用來操作細胞，以供依據細胞可活性的程度在細胞分離區域中篩選及分離細胞，如圖2A所示。
實施例3. 抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之活細胞比例、細胞可活性及細胞大小的影響之評估
在本實施例中，帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞株(MES-SA/Dx5細胞，簡稱“Dx5”，來自食品工業發展研究所BCRC生物資源保存與研究中心)及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞株(MES-SA細胞，來源同Dx5細胞)被處理以不同濃度(0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μg/mL)的多柔比星(多柔比星鹽酸鹽(doxorubicin hydrochloride)，Enzo Life Sciences，CH)歷時48小時。接著，藉由螢光染料染色及顯微鏡觀察來評估活細胞百分比。簡言之，對經藥物處理的Dx5細胞分別以DiB細胞質膜標記染料(Biotium,CA USA)及EthD-1螢光染劑(乙錠同質二聚體(ethidium homodimer-1)；Thermo Fisher Scientific,MA USA)染色，俾以辨識活的(藍色染色)及死的(紅色染色)Dx5細胞。對經藥物處理的MES-SA細胞分別以鈣黃綠素(calcein-AM)及EthD-1螢光染劑(LIVE/DEAD1 Viability/Cytotoxicity Kit L-3224；Thermo Fisher Scientific,MA USA)染色，俾以辨識活的(綠色染色)及死的(紅色染色)細胞。全部分析是依照廠商提供的操作指引來進行。之後，使用螢光顯微鏡(Zoom 160,OPTEM,USA)進行觀察。接著，藉由測定活細胞相對於全部細胞的數目來評估癌細胞的整體可活性。
細胞可活性亦藉由常用的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT)(Sigma Aldrich,MO USA)分析來檢測細胞間去氫酶活性而評估。簡言之，分別對MES-SA細胞及Dx5細胞處理以多柔比星，然後依據MTT分析套組所提供的操作指引來分析經抗癌藥物處理的癌細胞可活性(%)。本實施例的結果顯示於圖3A及圖3B。
圖3A是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之活細胞比例之數據圖。圖3B是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之細胞可活性之數據圖。由圖3A可見，關於Dx5細胞，會隨著藥物濃度增加而使活細胞百分比有些微降低。整體而言，經藥物處理的Dx5細胞之活細胞百分比維持在81.1%~98.5%的範圍。相反地，關於MES-SA細胞，當藥物濃度由0μg/mL增加至5.0μg/mL時，活細胞百分比有顯著降低，於此之後活細胞百分比沒有顯著差異(p>0.05)。整體而言，經藥物處理的MES-SA 細胞之活細胞百分比維持在20.0%~50.3%的範圍。由圖3B可見，當MES-SA細胞被處理以不同濃度的多柔比星時，細胞可活性(%)接近於0%。相反地，關於Dx5細胞，當藥物濃度由0μg/mL增加至5.0μg/mL時，細胞可活性(%)有顯著的降低，於此之後當藥物濃度由5.0μg/mL增加至10.0μg/mL時，細胞可活性(%)沒有顯著差異(p>0.05)。基於本實施例的結果，本發明選用5.0μg/mL的多柔比星濃度作為後續實驗之用，因為此濃度對Dx5細胞及MES-SA細胞之活與死細胞狀態產生較顯著的影響(在此濃度下Dx5細胞及MES-SA細胞的活細胞百分比分別為95.5%及26.1%；細胞可活性(%)分別為73.5%及2.2%)。
為評估細胞大小可否影響細胞篩選機制，以顯微鏡評估2種經藥物處理(5.0μg/mL多柔比星處理48小時)的癌細胞株(亦即Dx5細胞及MES-SA細胞)的大小差異。結果顯示於圖3C及圖3D。圖3C是未經藥物處理的Dx5細胞及MES-SA細胞大小之數據圖。圖3D是抗癌藥物(多柔比星)對帶有及未帶有抗癌藥物抗藥性的癌細胞之細胞大小的影響之數據圖。由圖3C可見，在沒有藥物處理下，MES-SA細胞及Dx5細胞的平均直徑分別為18.2±1.9μm及18.2±2.0μm，沒有顯著差異(p>0.05)。由圖3D可見，對細胞進行藥物處理之後，MES-SA細胞及Dx5細胞的活與死細胞的大小亦沒有顯著差異(p>0.05)(細胞直徑範圍17.0~17.7μm)。據此，細胞大小對依據細胞可活性程度篩選細胞的作用機制之影響可被合理排除。
實施例4. 用於篩選及分離具有不同細胞可活性程度之細胞的最佳ODEP操作條件
為驗證本發明方法的可行性，以實驗決定最佳操作條件，包括ODEP的用電條件及移動矩形光條的速度。關於用電條件，ODEP的電壓及頻率分別設定為10V及2MHz，此條件可減少細胞聚集(cell aggregation)，加速細胞篩選及分離過程，如圖2A所示。此外，以實驗找出ODEP操作力(ODEP manipulation force)，它是介於光誘導介電泳力及摩擦力之間的淨力(net force)，產生於被操作的細胞，亦即帶有及未帶有抗藥性的活與死的癌細胞。簡言之，在穩定狀態(steady state)，細胞的ODEP操作力是藉由周圍流體的黏滯阻力(viscous drag)來平衡。因此，一移動細胞的流體動力黏滯阻力一般被用來評估一 細胞的淨ODEP操作力(依據斯托克斯定律(Stoke’s law)(公式(II))，描述在一連續流(continuous flow)條件下施加於一球體粒子的拖曳力(drag force)(F即force))。
F=6πrην (II)r表示細胞半徑；η表示流體的黏度；ν表示一細胞的最大速度。
因此，依據斯托克斯定律，產生於細胞的ODEP操作力可透過量測操作細胞(亦即活與死的MES-SA細胞及Dx5細胞)的移動光條的最大速度而評估，據此決定出圖2A的移動光條的最佳操作速度。圖4是抗癌藥物處理前後操作MES-SA細胞及Dx5細胞的移動光條之最大速度的數據圖。由圖4可見，藥物處理前，操作活的MES-SA細胞與Dx5細胞之移動光條的最大速度分別是215.8±18.0μm/s及229.2±37.2μm/s，表示兩者之間沒有顯著差異(p>0.05)。此結果與圖3C未經藥物處理的Dx5細胞及MES-SA細胞大小之數據一致(沒有顯著差異)，其為決定細胞的光誘導介電泳力(公式(I))產生的重要因子。在活的MES-SA細胞與Dx5細胞被處理以5.0μg/mL多柔比星歷時48小時之後，操作活的Dx5細胞的移動光條之最大速度為206.7±41.0μm/s，與藥物處理前MES-SA細胞與Dx5細胞所測者沒有顯著差異(p>0.05)。然而，關於經藥物處理之活的MES-SA細胞，前述速度(78.3±54.4μm/s)顯著降低(相較於經藥物處理之活的Dx5細胞)(p<0.05)。此現象並非由細胞大小所致，因為圖3D顯示經藥物處理之活的MES-SA細胞及Dx5細胞在細胞大小上沒有顯著差異，故藥物處理後MES-SA細胞與Dx5細胞所測之速度差異是由細胞可活性之不同所導致。
此外，關於經藥物處理之死的MES-SA細胞及Dx5細胞，圖4顯示操作這些細胞的移動光條的最大速度(20.6±6.8μm/s及26.9±24.2μm/s)沒有顯著差異(p>0.05)，且這些速度顯著低於活的MES-SA細胞。此結果可解釋為細胞損傷的程度增加，而導致經損傷之細胞的細胞質有離子損失(ion loss)增加，所測之最大速度下降的情形。本實施例的結果顯示，具有不同速度的移動光條(亦即具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組)可依據細胞可活性程度的差異而被用來篩選經藥物處理之活的Dx5細胞(206.7±41.0μm/s)、活的MES-SA細胞(78.3±54.4μm/s)及死的細胞(20.6±6.8~26.9±24.2μm/s)。據此，具有12種不同移動速度(起始速度16.7μm/s；增速度為每217μm的移動距離16.7 μm/s；終端速度200μm/s)的移動矩形光條可用來篩選及分離純化經藥物處理的癌細胞，如圖2A所示。
實施例5. 依據本發明方法的可行性評估及該方法所篩選及分離純化的細胞之抗藥性基因表現分析
為評估本發明方法的可行性(feasibility)，執行圖2A所示的操作流程。在本實施例中，對MES-SA細胞及Dx5細胞處理以5.0μg/mL多柔比星48小時。之後，將等量經藥物處理的MES-SA細胞及Dx5細胞均勻混合，然後以圖2A的操作方法進行細胞篩選及分離純化。接著，以顯微鏡觀察具有12種不同移動速度的移動矩形光條中死細胞(亦即EthD-1螢光染劑-陽性細胞)的百分比。結果顯示於圖5。
圖5是具有12種不同移動速度的移動矩形光條中死細胞(亦即EthD-1螢光染劑-陽性細胞)的百分比之數據圖。由圖5可見，死細胞的百分比由低至高速(亦即16.7μm/s至200μm/s)減少，其中當速度為200μm/s時死細胞的百分比達至6.1%。此外，在圖5中，移動速度與死細胞的百分比有相關性(R2：0.937)，這證明本發明的方法確實可依據細胞可活性的程度而用來篩選及分離細胞。
為評估分佈於細胞分離區域的4個亞區域中經藥物處理的癌細胞之抗藥性本質，本發明將經由圖2A及圖2B的操作途徑所篩選及分離純化出的經藥物處理的癌細胞進行後續多重抗藥性基因表現分析(multidrug resistance gene expression assay)。
在本實施例中，多重抗藥性基因(ATP結合匣子族B成員1(ATP binding cassette subfamily B member 1,ABCB1))(Hs00184500_m1；Thermo Fisher Scientific,MA USA)及持家基因(house-keeping gene,glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(Hs02758991_g1；Thermo Fisher Scientific,MA USA)是依據本領域中詳知的方法來定量，參見Chiu TK et al.(2016),Sci Rep.,6：32851.doi：10.1038/srep32851。簡言之，使用PicoPure RNA分離套組(Thermo Fisher Scientific,MA USA)從細胞中萃取出RNA。接著，使用SuperScript® IV反轉錄酶套組(SuperScript® IV Reverse Transcriptase Kit)(Thermo Fisher Scientific,MA USA)進行反轉錄及使用TaqMan® PreAmp Master Mix Kit(Thermo Fisher Scientific,MA USA)進行預擴增(preamplification)。之後，使用StepOneTM即時PCR系統(StepOneTM Real Time PCR system)(Thermo Fisher Scientific,MA USA)定量出mRNA位準(level)。結果顯示於圖6A。
圖6A是依據本發明方法(使用圖2A的操作模式，亞區域1~4的對應位置請參見圖2A)所篩選及分離純化的細胞之抗藥性基因表現分析數據圖。由圖6A可見，ABCB1基因表現由亞區域1(subzone 1)1211(沒有偵測到ABCB1基因表現)顯著增加至亞區域3(subzone 3)1213，且亞區域31213與亞區域4 1214中細胞的ABCB1基因表現沒有顯著差異(p>0.05)。這個結果證實，本發明方法確實可用於篩選及分離純化具有不同程度的抗藥性基因表現之經藥物處理的細胞。
在圖2A的操作模式中，用來操作細胞的移動矩形光條之速度是已知的。本實施例接著執行圖2B所示的操作流程，亦即用來操作細胞的移動矩形光條之速度是未定的，並參照前述的方法，將由此篩選及分離純化出的經藥物處理的癌細胞進行多重抗藥性基因表現分析。結果顯示於圖6B。
圖6B是依據本發明方法(使用圖2B的操作模式，亞區域1~4的對應位置請參見圖2B)所篩選及分離純化的細胞之抗藥性基因表現分析之另一數據圖。由圖6B可見，ABCB1基因表現由亞區域1 1211(沒有偵測到ABCB1基因表現)顯著增加至亞區域4(subzone 4)1214，且亞區域3 1213與亞區域4 1214中細胞的ABCB1基因表現有顯著差異(p<0.05)。這個結果證實，不論用來操作細胞的移動矩形光條之速度是已知(參見圖2A)或是未定(參見圖2B)，本發明方法確實可用於篩選及分離純化具有不同程度的抗藥性基因表現之經藥物處理的細胞。
為進一步瞭解依據圖2B的操作模式之細胞分離區域的4個亞區域中細胞的分佈情形，將等量的經藥物處理及經螢光染劑染色的MES-SA細胞與Dx5細胞混合而製備用於測試的細胞樣品。接著，使用圖2B的操作模式來處理細胞樣品，然後以螢光顯微鏡觀察，俾以定量活與死的Dx5細胞及MES-SA細胞。結果顯示於圖7A。
圖7A是依據本發明方法所篩選及分離純化的細胞以螢光顯微鏡觀察細胞分離區域中的細胞分佈之影像圖。由圖7A可見，活的Dx5細胞(藍色染色)數目由亞區域1至亞區域4逐漸增加，而死細胞(紅色染色)數目由亞區域1至亞區域4減少。為進一步評估此細胞分佈中細胞活與死的狀態及細胞種類，圖2B的操作模式被重複進行3次，俾以從細胞分離區域的4個亞區域中收集足夠量的細胞以供後續細胞計數。結果顯示於圖7B。
圖7B是依據本發明方法所篩選及分離純化的細胞(亦即MES-SA細胞及Dx5細胞)在細胞分離區域的4個亞區域中的分佈情形(百分比)之數據圖。由圖7B可見，活的Dx5細胞百分比由32.0%(亞區域1)增加至82.4%(亞區域4)，而死細胞百分比由52.0%(亞區域1)減少至11.8%(亞區域4)。關於活的MES-SA細胞，細胞在亞區域1~4中的百分比分別為16.0%、12.5%、4.8%及5.9%。在4個亞區域中多數經藥物處理的死細胞為MES-SA細胞，而僅有少數為Dx5細胞(基於圖3A的結果，以5.0μg/mL多柔比星處理48小時，死的MES-SA細胞及Dx5細胞百分比分別為73.9%及4.5%)。理論上，關於這些死細胞，ABCB1基因表現不會被偵測到。因此，圖6B中4個亞區域中所偵測到的ABCB1基因表現可歸因於這4個亞區域中有活的Dx5細胞及活的MES-SA細胞。此外，由圖7B可見，在亞區域1中有48.0%的細胞(包括32.0%活的Dx5細胞及16.0%活的MES-SA細胞)是活細胞。然而，這些細胞的ABCB1基因表現在圖6B的亞區域1中未被偵測到。此現象可解釋為這些細胞可能天生不具有ABCB1基因或僅有少量ABCB1基因表現。因此，這些經藥物處理的細胞易受到多柔比星的細胞毒性作用影響。本實施例的結果證實，本發明方法確實可用於篩選及分離純化具有不同程度的抗藥性基因表現之經藥物處理的細胞。
實施例6. 依據本發明方法篩選及分離純化不同尺寸之乳膠微粒
圖8A是本發明光誘導介電泳(ODEP)裝置結合層流系統8之示意圖，其設計用於篩選及分離純化具有不同尺寸之乳膠顆粒。由圖8A可見，ODEP裝置結合層流系統8包括六個側邊微通道(side microchannel)81、一主要微通道(main microchannel)82、三個標的物收集槽(包括第一標的物收集槽831、第二標的物收集槽832及第三標的物收集槽833)、兩個層流液體注入槽(包括第一層流液體注入槽841及第二層流液體注入槽842)及一樣品置放槽85。每個標 的物收集槽、層流液體注入槽及樣品置放槽各對應於一側邊微通道81的末端。主要微通道82的長度為4.15mm、寬度為1.35mm、高度為50μm。第二層流液體注入槽842及第二標的物收集槽832之線形側邊微通道的長度為10mm、寬度為450μm、高度為50μm。第一層流液體注入槽841、第一標的物收集槽831、第三標的物收集槽833及樣品置放槽85之弧形側邊微通道81的平均長度為11.0mm、寬度為450μm、高度為50μm。主要微通道82用來進行不同尺寸之乳膠顆粒篩選。側邊微通道81用來注入層流液體、注入樣品、以及收集已分離之乳膠顆粒。主要微通道82定義出一ODEP光圖形操作區821，用來進行以ODEP為基礎的不同尺寸乳膠顆粒篩選，ODEP光圖形操作區821的長度為4mm、寬度為1.2mm、高度為50μm。樣品置放槽85用來注入欲純化分離之樣品。其中，第一層流液體注入槽841對應第一標的物收集槽831、第二層流液體注入槽842對應第二標的物收集槽832、以及樣品置放槽85對應第三標的物收集槽833之設計有利於在本發明ODEP裝置結合層流系統8中建構穩定之三層流系統，可讓在ODEP光圖形操作區821中被篩選開之不同尺寸的乳膠顆粒，順應流體之移動被分離與收集至不同的標的物收集槽。
圖8B是根據本發明方法所進行之兩種不同尺寸(粒子直徑分別為30μm與14.6μm)乳膠微粒的篩選與純化分離。透過公式(I)可知曉光誘導介電泳力之強度與操作粒子之大小具有正相關性，這使得大尺寸的粒子受移動光圖形之操作速度會高於小尺寸之粒子，因而能夠過一速度由低速往高速變化之移動矩形光條(長度4mm，寬度100μm)來篩選不同尺寸的粒子。後續，利用流道內層流之特性，可將不同尺寸的粒子分離並收集至對應的標的物收集槽。在本實驗中，當電參數條件設置為10V及100kHz且背景溶液為5% BSA(Bovine serum albumin；牛血清白蛋白)之蔗糖溶液時，可利用一等加速度移動矩形光條(加速度為110.4 μm/s2；始速度0μm/s；終端速度552μm/s)將等量混合了14.6μm與30μm的乳膠微粒分離與純化至不同的速度區間。另外，建立一穩定之三層流系統仰賴於讓注入之流體流動速度都維持等速(第一層流液體注入槽841、第二層流液體注入槽842與樣品置放槽85之液體進入速度皆為0.5μL/min)，這使得三道流體不僅能保持平行移動，同時其流體寬度相同且分別流入不同的標的物收集槽，因而能在主流道中建立出收集不同尺寸粒子之高、中、低速區間(高 中低速之區別為移動矩形光條之速度範圍)。根據圖8B顯示之流體移動方向(由右至左)，等量混合了14.6μm與30μm乳膠微粒之樣品會從樣品置放槽85導入ODEP光圖形操作區821之低速區間(0-318μm/s)。接著，在ODEP光圖形操作區821中透過複數條等加速度之移動矩形光條進行不同尺寸乳膠顆粒的篩選，並透過三層流將篩選之乳膠顆粒純化分離至對應之標的物收集槽。其中，大尺寸之乳膠微粒(30μm)會因生成之光誘導介電泳力強度較大，而集中於高速區間(450-552μm/s)，並收集至第一標的物收集槽831；相反地，小尺寸的乳膠微粒(14.6μm)由於受到的光誘導介電泳力強度較小，則多集中於中速區間(318-450μm/s)，並收集至第二標的物收集槽832。第三標的物收集槽833可用於收集第三種樣品，但由於本實施例中僅兩種不同尺寸大小之乳膠顆粒，故第三標的物收集槽833在本實施例中僅用於維持穩定之三層流(未有乳膠顆粒流入)。本實施例的結果證實，本發明方法確實可用於篩選及分離純化不同尺寸的乳膠微粒。
綜上所述，本發明用於篩選及分離純化待測物的方法之功效在於：操作簡易靈活，靈敏度、解析度與精密度高，可成功篩選待測物的尺寸或可活性程度及分離純化出具有不同尺寸或可活性程度之待測物，以利於區別不同環境耐受性之細胞群體(如抗藥性、放射線抗性、氧化壓力抗性、毒物抗性或細胞自我凋亡程度等)或不同尺寸的化學材料微粒或金屬微粒，並作為後端研究分析或臨床應用之前端篩選儀器，同時能因應不同之檢體情況做出即時性的調整，有利於精準醫療之建立。此外，經本發明方法所分離純化之細胞，一方面可配合前置處理條件來知曉其環境耐受度上的差異(例如抗藥性、放射線抗性、氧化壓力抗性、毒物抗性或細胞自我凋亡程度等)，另一方面則可探究不同環境因子導致之細胞分群結果是否會在基因或分生機轉層次上出現差異。是故，本發明在臨床醫學與基礎研究兩方面皆具有重要之應用價值。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。

Claims (10)

  1. 一種用於篩選及分離純化待測物的方法，其是利用一光誘導介電泳(optically-induced dielectrophoresis,ODEP)裝置來進行，該方法包含以下步驟：(a)對至少一待測物進行一處理，得到一經處理的待測物；(b)將該經處理的待測物導入該光誘導介電泳裝置，其中該光誘導介電泳裝置包括一主要微通道、至少一側邊微通道、至少一標的物收集槽及一具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力(optically-induced dielectrophoretic force)光圖形模組，該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組於該主要微通道內篩選該經處理的待測物，俾以使用一分離純化法將該經處理的待測物分離成至少一標的物；以及(c)將該標的物收集至該標的物收集槽。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其用於篩選待測物的尺寸或可活性程度，及分離純化具有不同尺寸或可活性程度之待測物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該待測物為一微生物、一植物細胞、一動物細胞、一化學材料微粒或一金屬微粒。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該處理為能誘導細胞出現細胞可活性差異之處理方式，或能誘導該細胞、該化學材料微粒或該金屬微粒出現尺寸差異之處理方式。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中當該處理能誘導細胞出現細胞可活性差異之處理方式時，係為藥物、放射線、氧化壓力、毒化物或細胞自我凋亡之處理。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組包括至少一第一移動光圖形，該至少一第一移動光 圖形具有一介於0.01μm/s至1cm/s的光圖形移動速度，及該光圖形移動速度為變速。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該具有可調控光圖形速度的光誘導介電泳力光圖形模組包括複數第二移動光圖形，各該些第二移動光圖形具有一介於0.01μm/s至1cm/s的光圖形移動速度，該些第二移動光圖形之間的光圖形移動速度不同，及該光圖形移動速度為定速。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該分離純化法是藉由一選自於下列所構成之群組中的物理驅動來進行：流體驅動、電磁驅動、光驅動以及光誘導介電泳力驅動。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其進一步用於篩選及分離純化具有不同環境耐受性基因表現程度之細胞。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該環境耐受性基因為藥物、放射線、氧化壓力、毒化物或細胞自我凋亡相關之基因。
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