TWI692446B - 磁珠、製造該磁珠之方法及使用該磁珠之檢測方法及套組 - Google Patents

Abstract

本揭露提供一種磁珠，包括一磁性顆粒，由具有胺基之矽氧烷包覆磁性粒子所形成；一蛋白質連接子，耦合至磁性顆粒；以及一抗體，締合至蛋白質連接子。本揭露亦提供此磁珠的製造方法及使用此磁珠的檢測法。本揭露又提供一種檢測高密度脂蛋白之套組。

Description

磁珠、製造該磁珠之方法及使用該磁珠之檢測方法及套組

本揭露係關於一種磁珠，特別是關於一種用於檢測物質的磁珠。以及此磁珠之製造方法與使用此磁珠之檢測法及套組。

攜帶膽固醇的高密度脂蛋白(HDL)與攜帶膽固醇的低密度脂蛋白(LDL) 就像是血液這條河川裡的「油輪」。因為膽固醇不溶於水，所以必須透過脂蛋白來載運才得以在血液裡面輸送。脂蛋白除了攜帶膽固醇，也會攜帶三酸甘油酯，由於三酸甘油酯比較輕，膽固醇比較重，因此脂蛋白中攜帶的膽固醇及三酸甘油酯比例不同則使得脂蛋白的密度也相異。高密度脂蛋白中，三酸甘油酯比例較少，膽固醇比例較多，整體密度較高；而低密度脂蛋白中，三酸甘油酯比例較多，膽固醇比例較少，整體密度較低。

低密度脂蛋白主要負責將肝臟製造出的膽固醇運送到全身，因此低密度脂蛋白量過多時會累積在血管中，引發疾病產生。高密度脂蛋白的功能是將全身的膽固醇運回肝臟代謝，有如血管的清道夫。因此，高密度脂蛋白的含量越多代表血管越「乾淨」。因此，高密度脂蛋白對動脈血管有保護作用，若高密度脂蛋白的含量偏低，則容易發生動脈硬化疾病，如狹心症、心肌梗塞等。

以往，藉由定量血液中高密度脂蛋白的含量而測定發生動脈硬化疾病的機率。然而，近幾年的研究發現，高密度脂蛋白的含量無法準確地預測發生動脈硬化疾病的機率，反而是高密度脂蛋白的品質對於預測發生動脈硬化疾病的機率有決定性的影響。

高密度脂蛋白的品質能夠藉由測定高密度脂蛋白的抗氧化活性而得知，抗氧化活性越高的高密度脂蛋白品質越佳。以往是利用低溫超高速離心法以分離高密度脂蛋白與低密度脂蛋白，之後再測定高密度脂蛋白的抗氧化活性。然而，超高速離心法除了儀器設備高昂，需要專業人員操作等不便之外，對於具有活性的蛋白質，如高密度脂蛋白而言，離心分離的時間通常為12~36小時，即使全程於低溫下進行，也難以維持蛋白質的完整活性。因此，需要能縮短分離時間，且維持蛋白質活性的分離方法。近年來，有使用磁珠抓取蛋白質的方法。以表面締合抗體的磁珠，利用抗體的專一性抓取待測蛋白質之後，再將待測蛋白質從磁珠上洗滌(elute)至溶液中，以獲取待測蛋白質之方法。由於磁珠具有磁性，因此能夠以磁場將磁珠與磁珠所存在的溶液分離。利用磁珠抓取溶液中的待測物質，即能夠不施加離心而將待測物質從溶液中分離，縮短分離蛋白質的時間。

現有的磁珠雖大致符合需求，但是所獲得的測定數據與使用低溫超高速離心法所獲得的數據相比，無法產生高相關性，因此仍有改善空間。

本揭露提供一種磁珠，包括一磁性顆粒，由具有胺基之矽氧烷包覆磁性粒子所形成；一蛋白質連接子，耦合至磁性顆粒；以及一抗體，締合至蛋白質連接子， 且該磁珠表面具有如式(1)所示之結構:

式(1)，其中

為磁性粒子；n為1至10之正整數； X為具有胺基之矽氧烷；G為蛋白質連接子；Ab為抗體。

本揭露另提供一種磁珠的製造方法，至少包括下述步驟：     (a)在鹼性條件下，將四氧化三鐵與巰基醇反應，形成具有羥基之四氧化三鐵奈米粒子；     (b)將具有羥基之四氧化三鐵奈米粒子分散於一溶液中，加入胺基矽烷於溶液，進行溶膠凝膠反應，形成由具有胺基之矽氧烷包覆四氧化三鐵奈米粒子的磁性顆粒；     (c)以耦合劑將蛋白質連接子耦合至磁性顆粒；及     (d)將抗體締合至磁性顆粒。

本揭露又提供一種檢測方法，其至少包括下列步驟：     準備一如前所述之磁珠；     將一待測試樣與磁珠均勻混合，使試樣中的待測物與磁珠上的抗體締合；     利用磁分離，將磁珠與待測試樣分離成為磁珠及上清液；     利用氧化螢光試劑與締合於磁珠上之待測物進行反應；及     測量氧化螢光試劑之螢光數值。

本揭露還提供一種用以檢測高密度脂蛋白之套組，其至少包括:如前所述之磁珠；及一氧化螢光檢測試劑。

共沉澱法為製造磁珠的常用方法，然而，此種方法中，製作出來的磁珠有顆粒團聚的問題，所以磁珠的顆粒彼此間的粒徑差異大，各顆粒之間的比表面積(表面積/體積)的比值差異大。因此，即使每一批次皆使用總體積相同的磁珠，然而，因為顆粒之間的表面積差異大，則每一批次之間的磁珠的總表面積不相同，則能夠抓取的待測物質的量也相差甚遠，無法反應出是待測物質的含量差異或是磁珠所能夠抓取的總量的差異。利用此種磁珠雖然能夠將待測物質從溶液中分離，然而，卻只能夠達到分離物質的需求，無法直接以磁珠定量待測物質。因此需要磁珠的顆粒間彼此的比表面積相近，亦即粒徑均一度高的磁珠，以達到定量分析的需求。

本申請人發現，使磁性顆粒表面帶有電荷，則能夠使磁性顆粒彼此間不易團聚，所形成的磁性顆粒大小均一，所以各磁性顆粒之間的比表面積(表面積/體積)的比值相近。使用此種由此種磁性顆粒所製造的磁珠，則每一批次的顆粒之間的表面積差異小、總表面積相近，則能夠抓取的待測物質的量也相近，因此能夠用以定量所抓取的待測物質。

圖1為磁珠構造之示意圖。磁珠的中心部為磁性顆粒MP，由具有胺基的矽氧烷包覆磁性粒子所形成；磁性顆粒外層具有作為蛋白質連接子之蛋白質G耦合至磁性顆粒；蛋白質G的另一端則進一步與抗體Ab締合。

磁性顆粒MP由具有胺基的矽氧烷包覆磁性粒子所形成。磁性粒子能夠使用具有磁性的物質製作而得到，例如四氧化三鐵奈米粒子、磁性鎳奈米粒子等。四氧化三鐵奈米粒子可由氯化亞鐵及氯化鐵製備。在四氧化三鐵奈米粒子的表面可經由修飾，使其帶有正電荷或負電荷。在一實施例中，本揭露之四氧化三鐵奈米粒子是帶有羥基的四氧化三鐵奈米粒子。

在一實施例中，使用巰基醇使四氧化三鐵奈米粒子的表面帶有羥基。將氯化亞鐵與氯化鐵混合，形成四氧化三鐵。接著，在鹼性條件下，將四氧化三鐵與巰基醇反應，形成表面帶有羥基的四氧化三鐵奈米粒子。如下方反應式。

由於巰基醇中的硫與鐵形成配位基鍵結，因此能夠改質四氧化三鐵奈米粒子使其表面具有羥基。修飾後的四氧化三鐵奈米粒子表面具有如下式(2)所示結構，其中S另一端接磁性粒子，例如四氧化三鐵奈米粒子(以

表示)，n為1至10的正整數。

式(2)

巰基醇可為碳原子1至10的具有硫醇基的醇類，例如可為碳原子數1至6。例如，2-巰基乙醇、2-巰基丙醇、3-巰基-2-丁醇、2-巰基-3-丁醇、3-甲基-3-巰基-1-丁醇、3-巰基-2-甲基-戊醇、4-巰基-4-甲基-2-戊醇、6-巰基-1-己醇。

在一實施例中，反應溶液中巰基醇的濃度為0.01~10mM，例如可為0.04~5mM、0.1~2mM。巰基醇的濃度過高，則四氧化三鐵容易氧化為三氧化二鐵奈米粒子，造成磁性下降；巰基醇的濃度過低，則形成的奈米粒子帶電不均勻，在後續製備顆粒的步驟中，容易使顆粒團聚。

在一實施例中，鹼性條件為pH值9~13。例如為9~12、10~13、10~12。鹼性條件可於溶液中加入有機鹼或無機鹼等鹼性物質而達成，例如，氨水、小蘇打水等。

製備的四氧化三鐵奈米粒子尺寸介於15~50nm之間，例如15~30nm。當四氧化三鐵奈米粒子的尺寸為30nm以下時，具有超順磁特性。

經過巰基醇改質的四氧化三鐵奈米粒子，因為是表面帶有電荷之四氧化三鐵奈米粒子，因此所形成的顆粒彼此不會團聚，在溶液中均勻分散且單離。且顆粒之間具有優良的粒徑均一度，例如，以動態光散射粒徑分析儀測量的結果，多分散性指數(polydispersity index，PDI)小於0.01，或小於0.05，或小於0.1，或小於0.2。

在一實施例中，將表面具有羥基的四氧化三鐵奈米粒子利用矽烷進行溶膠凝膠反應，使其產生水解縮合反應，形成由矽氧烷包覆四氧化三鐵奈米粒子的磁性顆粒。在此步驟中，若使用具有胺基之矽烷，則所製備的磁性顆粒表面也帶有胺基。胺基於後續步驟中，能夠促進蛋白質連接子耦合至磁性顆粒。而經過巰基醇改質的表面具有羥基的四氧化三鐵奈米粒子經過溶膠凝膠反應之後，巰基醇在四氧化三鐵奈米粒子表面形成二價基團。

具有胺基之矽烷與四氧化三鐵奈米粒子表面的羥基反應後，形成具有胺基之矽氧烷包覆四氧化三鐵奈米粒子的磁性顆粒。以X表示矽氧烷之網狀結構。磁性顆粒表面具有如下式(3)所示結構，其中

為磁性粒子，例如四氧化三鐵奈米粒子；n為1至10之正整數；X為矽氧烷。

式(3)

若使用胺基矽烷進行溶膠凝膠反應，則所形成的矽氧烷也具有胺基，有助於在後述的步驟中蛋白質連接子的耦合。在一實施例中，上述矽氧烷X具有如下式(4)所示的重複單元，

式(4)，式中

表示鍵結至另一重複單元的Si，或是R；其中，R可為H、碳原子數1至6的烷基、或碳原子數1至6的烷基胺基團。

胺基矽烷為具有胺基之矽烷，例如，3-胺基丙基三乙氧基矽烷(APTES)、3-胺基丙基三甲氧基矽烷、胺基丙基甲基二乙氧基矽烷、胺基丙基甲基二甲氧基矽烷等。

反應溶液中胺基矽烷的濃度為10~2000mM之間，例如100~1000mM。胺基矽烷的濃度過高，則所形成的介於薄膜與顆粒之間的狀態；胺基矽烷的濃度過低，則形成的顆粒大小不均勻。

溶膠凝膠反應例如可在室溫下進行，例如15~38℃，或20~28℃。反應時間為例如12~48小時之間。

製備的磁性顆粒的表面電荷利用Zeta-Potential表面電位分析儀測量磁性顆粒的表面電荷為60~-60mv之間，例如可為50~-50mv之間、40~-40mv之間或20~-20mv之間。

製備的磁性顆粒具有較佳的粒徑均一度，例如以動態粒徑分析儀測得的多分散性指數作為粒徑均一度，其值可為0.001~0.2之間，例如0.001~0.1。

經由上述步驟製備的磁性顆粒，進一步使用耦合劑將蛋白質連接子耦合至顆粒表面，以進行蛋白質連接子的修飾。蛋白質連接子可使用蛋白質G或蛋白質A。耦合劑可使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide，EDC)及/或N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)。

在一實施例中，具有磁性顆粒的溶液中同時含有EDC、NHS及蛋白質G，蛋白質G所帶有的羧基先與EDC活化反應，之後NHS會取代EDC並形成活化脂，增加胺基矽烷改質後的胺基與蛋白質G的羧基的反應效率，形成醯胺鍵鍵結。

磁性顆粒表面耦合有蛋白質連接子，而蛋白質連接子與抗體的Fc區結合。由於磁性顆粒表面帶有胺基，因此能夠均勻耦合蛋白質連接子，因此，締合至蛋白質連接子的抗體彼此間的方向性一致。如此一來，抗體中與抗原作用的Fab區不會因為抗體方向的不一致性而產生遮蔽或幾何分子障礙，能夠提升抗體抗原的生物親和能力。

抗體所辨認的物質，可為蛋白質、胜肽、或其他有機物質，也可以辨認化合物，例如具有催化活性的觸媒等。

蛋白質，較佳為具有活性的功能性蛋白質，例如，具有抗氧化活性、磷酸化活性、去磷酸化活性、脫氫活性、水解活性等活性的蛋白質。具體而言，可列舉高密度脂蛋白、肌酸激酶(Creatine kinase)、肌酸磷化酶(CPK)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase)、丙酮酸脱氢酶、琥珀酸脫氫酶、脂解酶(Lipase)等。亦可為從生物中萃取出的具有活性的功能性蛋白。

經由上述步驟後，磁珠表面具有如下式(5)所示結構，其中

為磁性粒子；n為1至10之正整數；X為矽氧烷；G為蛋白質連接子；Ab為抗體。

式(5)

本揭露之磁珠因為是使用粒徑均一度高之經過巰基醇改質的磁性粒子所形成的磁性顆粒而製造，因此磁珠間彼此不會團聚，在溶液中均勻分散且單離，且磁珠的粒徑均一度高，因此所抓取的待測物質能夠反應出待測物質的濃度，而無須將待測物質從磁珠上洗滌至溶液中再加以定量。

本揭露之磁珠能夠搭配常用之物質檢測法，例如DHR螢光檢測法、DCFH螢光檢測法等用以定量物質及/或偵測物質的品質。

使用本揭露之磁珠，能夠快速地檢測物質，包括下列步驟。將磁珠與含有待測物質之溶液混合之後，使待測物質與磁珠上的抗體締合；接著利用磁離，將磁珠與溶液分離，獲得與待測物質結合之磁珠以及上清液；依照情況潤洗磁珠之後，利用物質檢測法，檢測磁珠上的待測物質。若使用螢光檢測法，則測量螢光試劑之螢光讀值。磁珠能夠偵測的物質，包括蛋白質、胜肽、短胜肽、化合物等。

本揭露之磁珠，亦可搭配其他所需的試劑，成為檢測套組。例如氧化螢光檢測試劑、檢測所需的正標準品及副標準品、稀釋劑等。

為了讓本揭露之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉數實施例，來說明本揭露所述之磁珠及檢測方法。

[製備例1]製備帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子     將2g氯化亞鐵(Iron(II) chloride tetrahydrate, FeCl ₂•4H ₂O)(SHOWA)及5.4g氯化鐵(Iron(III) chloride hexahydrate, FeCl ₃•6H ₂O)(Acros Organics)混合，之後溶於50ml之去離子水中。在上述溶液中，Fe ²⁺與Fe ³⁺之莫耳比為1:2。將上述溶液置於分離式反應瓶，以氮氣置換反應瓶中的氣體，於常溫下使用電動攪拌器，以轉速400rpm進行攪拌，攪拌2h時間。再以超音波震盪器進行震盪2h時間，使溶液均勻。     接著以1drop/5sec的速度、將2.3M之氨水溶液滴入溶液中，直到溶液的酸鹼值為12。之後加入2-巰基乙醇(2-Mercaptoethanol)(Alfa Aesar)使其於溶液中的最終濃度為0.050mM，持續攪拌1小時，形成表面帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子。     接著，使用銣鐵硼強力磁鐵分離溶液中之帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子，以去離子水與乙醇以體積比1:2混合之潤洗液進行潤洗，潤洗三次之後，將帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子儲存於去離子水中。

[製備例2~7] 製備帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子     除了將製備例1中之2-巰基乙醇的濃度變更為如表1所示之外，以與製備例1相同之步驟，合成四氧化三鐵奈米粒子。

以場發射掃描式電子顯微鏡(FE-SEM)觀察製備例3的帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子，結果如圖2所示。圖2為放大100,000倍之影像圖。可觀察到每個奈米粒子彼此分離，沒有明顯的團聚現象。

[表面電荷分析]     使用Zeta-Potential表面電位分析儀(Malvern，型號Nano-S90)測量四氧化三鐵奈米粒子之表面電位。操作依照儀器的操作步驟進行，參數設定使用Flow cell作為測量元件，元件上每個特定位置共測量10次，分別測量5個特定位置，求取平均值。以Zeta-Potential表面電位分析儀測量製備例3的帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子的表面電位為+2.83mv，證實所製備的奈米粒子表面帶有電荷。

以SQUID進行磁性分析，製備例3的帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子不產生磁滯區域，代表其無矯頑磁力現象，具有超順磁性質。其最大飽和磁化量約為26.4emu/g。

將製備例3的四氧化三鐵奈米粒子與KBr粉體以1；100的重量比，置於瑪瑙研缽中研磨均勻。之後使用傅立葉轉換紅外線光譜儀(FT-IR)進行分析。掃瞄範圍為500~3500cm ^-1，解析度為2cm ^-1，掃描次數為32scan。將結果顯示於圖11。     由圖11的光譜圖可觀察到四氧化三鐵奈米粒子(FeNP)在波數595cm-1處有Fe-O的收縮與彎曲的特徵峰，顯示成功以共沉澱法製做出四氧化三鐵奈米粒子。此外，在3440cm-1有O-H的伸縮吸收峰、在2850~3000cm-1有烷基C-H的對稱與非對稱伸縮特徵吸收峰，表示成功在四氧化三鐵奈米粒子表面修飾2-巰基乙醇，並帶有羥基。

[粒徑均一度]     將0.1mg之待測四氧化三鐵奈米粒子分散於10m的去離子水中，於石英四面比色管內注入2ml溶液，使用動態光散射粒徑分析儀(DLS，Malvern，型號Nano-S90)，於恆溫25℃環境下兩分鐘後以每個步驟掃描15次，並且進行3個步驟進行平均，得到平均粒徑(nm)，並且以多分散性指數(polydispersity index，PDI)表示粒徑均一度。將製備例1~7之四氧化三鐵奈米粒子進行粒徑分析，所得的結果如表1所示。

[表1]

圖3為製備例3之粒徑分析圖，製備例3之四氧化三鐵奈米粒子的粒徑介於20~30nm之間，平均粒徑為25nm，且由動態光散射粒徑分析儀所測得的粒徑均一度為0.05，由此可得知粒子的粒徑分布較均一，可知奈米粒子無團聚現象。     由表1可知，製備例1~7之四氧化三鐵奈米粒子其粒徑介於20~50nm之間。製備例1~7之四氧化三鐵奈米粒子其粒徑均一度之值為0.05~0.2之間，粒徑均一度高。

[製備例8]製備磁性顆粒     將100mg之製備例3所得到之帶有羥基之四氧化三鐵奈米粒子分散於120ml之濃度為99.5%的乙醇中，將其置於500ml分離式的四頸反應瓶中，以氮氣置換瓶中之氣體，以轉速400rpm進行電動攪拌，再以1drop/5sec的速度、將3-胺基丙基三乙氧基矽烷(APTES)(Acros Organics)滴入溶液中，使溶液中的3-胺基丙基三乙氧基矽烷的最終濃度為92mM，於室溫下反應24小時，合成由矽氧烷包覆四氧化三鐵奈米粒子所形成之磁性顆粒。     反應結束後，使用銣鐵硼強力磁鐵分離溶液中之磁性顆粒，使用99.5%之乙醇進行潤洗，潤洗三次之後，將磁性顆粒儲存於99.5%之乙醇中。

[製備例9~11] 製備磁性顆粒     除了將製備例8中所使用的3-胺基丙基三乙氧基矽烷(APTES)的最終濃度分別替換成322mM、552mM、782mM之外，以與製備例8相同之步驟，合成磁性顆粒。

將製備例8~11之磁性顆粒進行粒徑分析，將所得到的結果顯示於表2。

[表2]

由表2可知，製備例8之磁性顆粒其粒徑介於25~40nm之間。製備例8及9之磁性顆粒的粒徑均一度介於為0.005~0.008之間，粒徑均一度高。

[製備例12]製備耦合有蛋白質G的磁性顆粒     使用2g氯化亞鐵(Iron(II) chloride tetrahydrate, FeCl ₂•4H ₂O)(SHOWA)、5.4g氯化鐵(Iron(III) chloride hexahydrate, FeCl ₃•6H ₂O)(Acros Organics)以及50μL之0.2M之2-巰基乙醇，依照製備例1所述的方式，製備四氧化三鐵奈米粒子。之後以3-胺基丙基三乙氧基矽烷的最終濃度為92mM的條件進行修飾，製備磁性顆粒。     將1mg所製備的磁性顆粒分散於20ml的磷酸緩衝溶液(PBS)中，於溶液中加入50mM、50μL之1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(EDC)(Acros Organics)、4.8mg的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)(Alfa Aesar)以及75μg的蛋白質G(Mybiosource)。之後將溶液置於4℃，反應8~12小時，期間每一小時將溶液搖晃均勻。     反應結束後，使用銣鐵硼強力磁鐵分離溶液中之耦合有蛋白質G的磁性顆粒，保存上清液以供後續定量實驗，之後使用磷酸緩衝溶液潤洗耦合有蛋白質G的磁性顆粒，潤洗三次之後，將其保存於磷酸緩衝溶液中。

[製備例13~15] 製備耦合有蛋白質G的磁性顆粒     除了將3-胺基丙基三乙氧基矽烷的最終濃度變更為322mM、552mM、782mM之外，依照製備例12的方法，製備耦合有蛋白質G的磁性顆粒。分別保存製備後的上清液，以供後續定量實驗。

將所保存的上清液，參照BioRad蛋白質分析套組(Bio-Rad)的實驗手冊進行蛋白質定量。計算上清液所含有的蛋白質G的濃度之後，換算為蛋白質G的量。將總添加的蛋白質G的量扣除上清液中的蛋白質G的量，即可計算耦合至磁性顆粒的蛋白質G的量。

表3

由上表可知，製備例12~15使用APTES包覆四氧化三鐵奈米粒子形成的具有胺基的磁性顆粒，可促進蛋白質G耦合至磁性顆粒。

使用製備例13及14之耦合有蛋白質G的磁性顆粒，以XPS進行元素分析，將所得的氮元素能譜結果顯示於圖4。圖4顯示製備例13(FeNP@APTES@Protein G 0.7%)及製備例14(FeNP@APTES@Protein G 1.2%)之磁性顆粒在鍵結能399.5ev有胺基之氮(C-N)的特徵峰，且在401.7ev具有醯胺訊號峰的鍵結氮特徵訊號，推測蛋白質G以醯胺鍵與該磁性顆粒之矽氧烷耦合。

[製備例16]製備締合有抗高密度脂蛋白抗體之磁珠     將1mg製備例13所製備之耦合有蛋白質G的磁性顆粒分散於20ml的磷酸緩衝溶液(PBS)中，於溶液中加入50μg的抗高密度脂蛋白小鼠IgG2a抗體(Mybiosource)，於4℃反應24小時，使抗體締合至蛋白質G，製備締合有抗高密度脂蛋白抗體之磁珠。反應結束後，以銣鐵硼強力磁鐵分離溶液及磁珠，以PBS潤洗磁珠三次，保存於去離子水中。

[製備例17]製備締合有抗高密度脂蛋白抗體之磁珠     使用製備例14之耦合有蛋白質G的磁性顆粒以與製備例14相同方法，製造締合有抗高密度脂蛋白抗體之磁珠。

[實施例1] 與高密度脂蛋白結合之分析     將1mg製備例16所製備之磁珠分散於20ml的磷酸緩衝溶液(PBS)中，於溶液中加入50μg的高密度脂蛋白，於4℃反應1小時，使磁珠上的抗體與抗原之高密度脂蛋白作用。接著，使用銣鐵硼強力磁鐵分離溶液及磁珠，以PBS潤洗磁珠三次。接著，於加入60μg的標記有FITC螢光之抗高密度脂蛋白雞IgY抗體(Mybiosource)，於室溫下反應1小時，之後以共軛焦雷射掃描顯微鏡觀察，影像結果如圖5。能夠觀察到磁珠具有FITC之綠色螢光，證實磁珠中的抗體能夠專一性地與高密度脂蛋白結合。

[實施例2] 蛋白質的抗氧化能力分析     使用經離心分離及透析純化之高密度脂蛋白檢體，以Bio-Rad Bradford assay進行蛋白質定量之後，作為高密度脂蛋白抗原。     將100μg製備例16及17之磁珠，分別與50μg的高密度脂蛋白抗原及去離子水進行反應，反應為常溫25℃、1小時，反應後使用銣鐵硼強力磁鐵分離溶液及磁珠，以PBS潤洗磁珠三次。 將所有吸附高密度脂蛋白抗原之磁珠與HBS緩衝溶液混合成體積150μL，加入25μL、50μM之DHR氧化螢光試劑(Sigma-Aldrich廠商)，以全波長式多功能微盤分析儀(Thermo，型號¸Varioskan Flash)設定激發光為485nm、接收光為538nm，每10分鐘測量一次螢光數值，共測量1小時，重複測量三次。使用所獲得的螢光數值變化曲線計算斜率值，作為蛋白質抗氧化能力之數值。斜率值越低，表示蛋白質所具有的抗氧化能力越佳。將結果顯示於圖6。     由圖6可知，磁珠與去離子水混合之對照組(DHR)的斜率為365FU/min，而製備例16的磁珠與高密度脂蛋白抗原混合的組別(DHR+0.7%FeNP@HDL)的斜率為192FU/min；製備例17的磁珠與高密度脂蛋白抗原混合的組別(DHR+1.2%FeNP@HDL)的斜率為210FU/min，兩者皆比對照組低。由上述結果可知，使用本揭露的磁珠抓取的高密度脂蛋白，能夠維持高密度脂蛋白的抗氧化活性。

[實施例3] 定量蛋白質活性的分析     使用製備例16之磁珠，將高密度脂蛋白的量分別變更為5、10、15、20μg，以與實施例2相同方法，進行蛋白質抗氧化能力分析，將結果顯示於圖7。

[對照例1]     將溶液中的2-巰基乙醇的最終濃度設為0.198μM，APTES的濃度設為0.2mM，使用與製備例13之相同方法，於磁性顆粒上耦合蛋白質G；接著依照與製備例16之相同方法，於蛋白質G上締合抗體。     使用上述製備所得之磁珠，將高密度脂蛋白的量分別變更為5、10、15、20μg，以與實施例2相同方法，進行蛋白質抗氧化能力分析，將結果顯示於圖8。

由圖7的結果可知，使用製備例16的磁珠所抓取的高密度脂蛋白仍然具有抗氧化的活性，而且，添加的高密度脂蛋白的量越多，整體的抗氧化活性越高，顯示磁珠能夠用以定量蛋白質活性。相較於此，由圖8的結果可知，使用對照例1的磁珠的組別，添加的高密度脂蛋白的量與整體的抗氧化活性沒有呈現出相關性。

[實施例4]     使用台北醫學大學之以通過臨床試驗審核之臨床研究計畫所取得的50組高血脂臨床患者血清。使用製備例16之磁珠依照與實施例2相同之方法，測量締合於磁珠的蛋白質的抗氧化能力。

[實施例5]     除了將磁珠變更為製備例17之磁珠之外，依照與實施例2相同之方法，測量締合於磁珠的蛋白質的抗氧化能力。

[對照例2]     使用與實施例4相同的患者的血清，以超高速離心分離法之密度梯度(density gradient)離心，進行高密度脂蛋白的分離，再以DHR氧化螢光試劑測量蛋白質的抗氧化能力，此方法為目前分離高密度脂蛋白的黃金準則。     超高速離心法之密度梯度離心的步驟如下，首先配置密度為1.006g/ml之NaBr緩衝溶液，接著將0.5ml之血清置入超高速離心管，接著再加入2.5mlNaBr緩衝溶液。在-20℃，以120,000xg離心24小時，取得密度為1.063～1.21g/ml之高密度脂蛋白。接著，將獲得的高密度脂蛋白進行透析純化。之後，將純化的高密度脂蛋白依照前述之DHR氧化螢光試劑分析法測量蛋白質的抗氧化能力。

將實施例4及對照例2所得到的蛋白質抗氧化數據作圖，將所得結果示於圖9。由圖9可知使用製備例16之322mMAPTES改質磁珠與傳統超高速離心分離法所獲得之高密度脂蛋白的抗氧化值呈現正相關性，計算得到的線性回歸相關係數為0.57，顯示使用本揭露之磁珠能夠達到與傳統超高速離心分離法相似之定量效果。

將實施例5及對照例2所得到的蛋白質抗氧化數據作圖，將所得結果示於圖10。由圖10可知使用製備例17之552mMAPTES改質磁珠與傳統超高速離心分離法所獲得之高密度脂蛋白的抗氧化值呈現正相關性，計算得到的線性回歸相關係數為0.79，在統計上顯示具有強相關性，顯示使用本揭露之磁珠能夠達到與傳統超高速離心分離法之定量效果。

藉由本揭露之磁珠，由於磁珠之粒徑均一度高，且表面經由胺基修飾提高與蛋白質G的耦合，進而使抗體締合率佳，因此能夠達到定量蛋白質的效果。且由於能夠使用磁離快速分離磁珠與溶液，因此能夠縮短分離蛋白質的時間，維持蛋白質的活性。

雖然本發明已以數個較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作任意之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

MP:磁性顆粒

G:蛋白質G

Ab:抗體

圖1為本揭露之磁珠的結構示意圖。     圖2為本揭露之一製備例的四氧化三鐵奈米粒子之場發射掃描式電子顯微鏡的影像圖。     圖3為本揭露之一製備例的四氧化三鐵奈米粒子之動態光散射粒徑分析的結果圖。     圖4為本揭露之一製備例的耦合有蛋白質G的磁性顆粒之氮元素能譜結果圖。     圖5為本揭露之一製備例的磁珠與抗原作用之螢光影像圖。     圖6為使用本揭露之一製備例的磁珠，以DHR螢光試劑測量的高密度脂蛋白活性結果圖。     圖7為使用本揭露之一製備例的分散磁珠所獲得的高密度脂蛋白活性結果圖。     圖8為使用本揭露之一製備例的團聚磁珠所獲得的高密度脂蛋白活性結果圖。     圖9為使用本揭露之一製備例的磁珠所獲得的高密度脂蛋白活性結果與使用傳統離心分析法所獲得的高密度脂蛋白活性結果之相關圖。     圖10為使用本揭露之另一製備例的磁珠所獲得的高密度脂蛋白活性結果與使用傳統離心分析法所獲得的高密度脂蛋白活性結果之相關圖。 圖11為使用本揭露之一製備例的磁珠所獲得的傅立葉轉換紅外線光譜圖。

MP:磁性顆粒

G:蛋白質G

Ab:抗體

Claims (23)

1. 一種磁珠，包括一磁性顆粒，由具有胺基之矽氧烷包覆磁性粒子所形成；一蛋白質連接子，耦合至該磁性顆粒；以及一抗體，締合至該蛋白質連接子，且該磁珠表面具有如式(1)所示之結構

   

   ，其中

   

   為磁性粒子；n為1至10之正整數；X為具有胺基之矽氧烷；G為蛋白質連接子；Ab為抗體，其中該磁性粒子為四氧化三鐵奈米粒子。
2. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該四氧化三鐵奈米粒子的粒徑範圍為15~50nm之間。
3. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該磁珠為複數個，該些磁性顆粒的粒徑均一度為0.001~0.2之間。
4. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該磁性顆粒具有表面電荷，範圍為60~-60mv之間。
5. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該蛋白質連接子以醯胺鍵與該磁性顆粒之該矽氧烷耦合。
6. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該抗體為辨認具有活性的蛋白質之抗體。
7. 如申請專利範圍第1項所述之磁珠，其中該抗體為抗高密度脂蛋白之抗體。
8. 一種磁珠的製造方法，至少包括下述步驟：(a)在鹼性條件下，將四氧化三鐵與巰基醇反應，形成具有羥基之四氧化三鐵奈米粒子；(b)將該具有羥基之四氧化三鐵奈米粒子分散於一溶液中，加入胺基矽烷於該溶液，進行溶膠凝膠反應，形成由具有胺基之矽氧烷包覆該四氧化三鐵奈米粒子的磁性顆粒；(c)以耦合劑將蛋白質連接子耦合至該磁性顆粒；及(d)將抗體締合至該磁性顆粒。
9. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該巰基醇的濃度為0.01~10mM。
10. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該巰基醇為碳原子數為1~10之具有硫醇基的醇類。
11. 如申請專利範圍第10項所述之磁珠的製造方法，其中該巰基醇為2-巰基乙醇。
12. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該胺基矽烷為3-胺基丙基三乙氧基矽烷(APTES)。
13. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該具有胺基矽烷的濃度為10~2000mM之間。
14. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該抗體為辨認具有活性的蛋白質之抗體。
15. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該抗體為抗高密度脂蛋白之抗體。
16. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該磁性顆粒在該溶液中為均勻分散且單離。
17. 如申請專利範圍第8項所述之磁珠的製造方法，其中該鹼性條件為pH值9~13之間。
18. 一種檢測方法，其至少包括下列步驟：(a)準備一如申請專利範圍第1~7項中任一項所述之磁珠；(b)將一待測試樣與該磁珠均勻混合，使該試樣中一待測物與該磁珠上的抗體締合；(c)利用磁分離，將該磁珠與該待測試樣分離成為該磁珠及上清液；(d)利用氧化螢光試劑與締合於該磁珠上之該待測物進行反應；及(e)測量該氧化螢光試劑之螢光數值。
19. 如申請專利範圍第18項所述之檢測方法，其中該待測物為蛋白質。
20. 如申請專利範圍第19項所述之檢測方法，其中該蛋白質為高密度脂蛋白。
21. 如申請專利範圍第18項所述之檢測方法，其中該待測試樣為血液樣本。
22. 一種用以檢測高密度脂蛋白之套組，其至少包括： 一如申請專利範圍第1~7項中任一項所述之磁珠；及一氧化螢光檢測試劑。
23. 如申請專利範圍第22項所述之套組，其中該檢測試劑更包括一偵測高密度脂蛋白的正標準品與一偵測高密度脂蛋白的負標準品。

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