TWI666014B

TWI666014B - 芸香苷、牡丹酚及銀杏內酯a用於製備抑制或延緩nmda受體過度活化之藥物的用途

Info

Publication number: TWI666014B
Application number: TW104139028A
Authority: TW
Inventors: 林炎壽; 蔡涵容; 林恬瑄; 郭力禎; 李智翰
Original assignee: 國立臺灣師範大學
Priority date: 2015-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2019-07-21
Also published as: TW201717923A

Abstract

本發明係關於一種NMDA受體或AMPA受體拮抗劑的用途，用於製備預防、治療、抑制或延緩因NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病的藥物，其中NMDA受體拮抗劑係選自於由牡丹酚(Paeonol)、黃芩素(Baicalein)、芸香苷(Rutin)、銀杏內酯(Ginkgolide A)及其組合所組成之群組，且AMPA受體拮抗劑係為黃芩素(Baicalein)。

Description

芸香苷、牡丹酚及銀杏內酯A用於製備抑制或延緩NMDA 受體過度活化之藥物的用途

本發明係關於一種受體拮抗劑的用途，特別是一種N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-D-aspartate；NMDA)受體拮抗劑或α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid；AMPA)受體拮抗劑之用途，其係用於製備預防、治療、抑制或延緩因麩胺酸過多所引起NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病的藥物，其中NMDA受體拮抗劑係選自於由牡丹酚(Paeonol)、黃芩素(Baicalein)、芸香苷(Rutin)、銀杏內酯(Ginkgolide A)及其組合所組成之群組，且AMPA受體拮抗劑係為黃芩素(Baicalein)。

阿兹海默症是一種病因未明的原發性退化性腦變性疾病。發病多於老年期，病程緩慢且不可逆，臨床上以智能損害為主。病理改變主要為皮質瀰漫性萎縮、腦溝腦迴增寬、腦室擴大、神經元大量減少、老年斑、神經元纖維結等病變，並且常見膽鹼乙醯化酶及乙醯膽鹼表現量顯著減少。雖然阿茲海默症的致病機轉至今仍不明確，但普遍認為和β-類澱粉蛋白寡聚體(β-amyloid oligomer；Aβ寡聚體)沉積於大腦皮質而造成腦神經元細胞的破壞有關，但其對影響神經元細胞之分子機轉仍屬未知。截至目前，阿茲海默症並無有效治癒方式，只能利用藥物來減緩病人的病程惡化。

傳統用來減緩病人病程惡化的藥物包括膽鹼酯酶抑制劑，包括愛憶欣^®(Aricept^®)、憶思能^®(Exelon^®)與利憶靈^®(Reminyl^®)，可改善患者之記憶與認知功能，用於治療輕度至中度阿茲海默氏症。此外，如第1圖所示，麩胺酸(glutamate)也是腦部重要的神經傳導物質，主要作用於NMDA受體或AMPA受體，其過度活化將會導致興奮毒性而造成神經元細胞傷害，這被認為可能是阿茲海默氏症致病機轉之一，故拮抗NMDA受體或AMPA受體之作用將有助於改善失智情況。美金剛(memantine)為NMDA受體拮抗劑，美國食品藥物管理局於2003年10月核准上市，是目前唯一用於治療中至重度阿茲海默症之藥物。

有鑑於上述習知技藝之問題，本發明之目的就是在提供一種NMDA受體拮抗劑或AMPA受體拮抗劑之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病的藥物，以解決現有藥物有限的問題。

根據本發明之一目的，提出一種NMDA受體拮抗劑之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA 受體過度活化之疾病的藥物，其中NMDA受體拮抗劑可選自於由牡丹酚(Paeonol)、黃芩素(Baicalein)、芸香苷(Rutin)、銀杏內酯(Ginkgolide A)及其組合所組成之群組。

根據本發明之另一目的，提出AMPA受體拮抗劑之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起AMPA受體過度活化之疾病的藥物，其中AMPA受體拮抗劑可為黃芩素。

根據本發明之再一目的，提出一種銀杏萃取物之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體過度活化之疾病的藥物，其中銀杏萃取物可包括芸香苷、銀杏內酯或其組合。

根據本發明之又一目的，提出一種白芍萃取物之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體過度活化之疾病的藥物，其中白芍萃取物可包括牡丹酚。

根據本發明之一目的，提出一種黃芩萃取物之用途，可用於製備預防、治療、抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病的藥物，其中黃芩萃取物可包括黃芩素。

較佳地，藥物可透過減緩或抑制因β-類澱粉蛋白(Aβ)寡聚體引起麩胺酸過多所造成之突觸失能而預防、治療、抑制或延緩阿茲海默症。

較佳地，疾病可包括帕金森氏症、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、多發性硬化症、癲癇或神經疼痛。

此外，本發明更提出一種銀杏萃取物之用途，可作為NMDA受體之拮抗劑，其中銀杏萃取物可包括芸香苷、銀杏內酯或其組合。

此外，本發明更提出一種白芍萃取物之用途，可作為NMDA受體之拮抗劑，其中白芍萃取物可包括牡丹酚。

此外，本發明更提出一種黃芩萃取物之用途，可作為AMPA受體及NMDA受體之拮抗劑，其中黃芩萃取物可包括黃芩素。

承上所述，依本發明之NMDA受體拮抗劑或AMPA受體拮抗劑之用途，其可具有一或多個下述優點：

(1)自銀杏、白芍及黃芩之中藥中所萃取之天然萃取物，能夠作為NMDA受體拮抗劑或AMPA受體拮抗劑，而能預防、治療、抑制或延緩個體因體內因麩胺酸過多所引起NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病，例如包括帕金森氏症、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、多發性硬化症、癲癇或神經疼痛。

(2)牡丹酚、黃芩素、芸香苷、銀杏內酯等天然萃取物，能夠改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致之突觸失能，進而預防、治療、抑制或延緩阿茲海默症。

第1圖 Aβ寡聚體透過引起麩胺酸過多存在於突觸間而造成神經元死亡之訊息傳導示意圖。

第2圖確認初級培養細胞確實為神經元細胞之蛋白質表現示意圖。

第3圖建立篩藥平台之結果示意圖。

第4圖白芍中純物質成分牡丹酚(Paeonol；PN)可抑制Aβ寡聚體所引起神經細胞的去極化之結果示意圖。

第5圖 Aβ寡聚體可透過至少四種受體使神經元細胞去極化之結果示意圖。

第6圖白芍中純物質成分牡丹酚(Paeonol；PN)無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化，但可抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

第7圖黃芩中純物質成分黃芩素(Baicalein；BE)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

第8圖黃芩中純物質成分黃芩素(Baicalcin；BE)可以抑制AMPA或NMDA所引起神經細胞的去極化之結果示意圖。

第9圖銀杏中純物質成分芸香苷(Rutin；RT)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

第10圖銀杏中純物質成分芸香苷(Rutin；RT)無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化，但可抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

第11圖銀杏中純物質成分銀杏內酯(Ginkgolide A；GA)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

第12圖銀杏中純物質成分銀杏內酯(Ginkgolide A；GA)可以抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化之結果示意圖。

如使用於以上及整份說明書中，除非另有說明，下列用語應理解為具有以下含義。

如用於本文中，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包含複數參照，除非上下文另有明確地說明。

用語「個體(subject)」可指患有因麩胺酸過多所引起N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-D-aspartate；NMDA)受體或α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid；AMPA)受體過度活化之疾病的脊椎動物，或被認為需要因麩胺酸過多所引起N-甲基-D-天門冬胺酸(N-methyl-D-aspartate；NMDA)受體或α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid；AMPA)受體過度活化之疾病治療的脊椎動物。個體包含溫血動物，例如哺乳動物，例如靈長類動物，而更佳地為人類。非人類的靈長類也是個體。用語個體包含馴養的動物，如貓、狗等，家畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)及實驗動物(例如，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。因此，獸醫用途及醫學製劑亦涵蓋於本文中。

根據本發明之一實施例中，因麩胺酸過多所引起AMPA受體或NMDA受體過度活化之疾病的藥物可構成為適合於所選之投藥的模式的任何形式。較佳地，該藥物可配製用於口服投藥。投藥的其他醫學上可接受的途徑包含靜脈內、皮下、肌肉內、經皮、經直腸或吸入等。

所述藥物的劑量可藉由本發明所屬技術領域中具有通常知識者根據實際狀況而判定。單位劑量或多劑量的形式皆屬本發明之範圍，其各在特定臨床情況提供優點。根據本發明之實施例，所述藥物待施用的實際量可根據年齡、體重、待治療個體的狀況及其他合併症而變化，並取決於醫療專業人員的判斷力。

在以下的實施例中，美金剛(memantine)為NMDA受體拮抗劑，目前是唯一核准用於治療中至重度阿茲海默氏症的藥物，因此在以下的實施例中，利用memantine作為陽性對照組。

在本發明中，因麩胺酸過多所引起AMPA受體或NMDA受體過度活化之疾病是指該由於體內神經傳導物質麩胺酸表現量過多，導致其下游NMDA受體或AMPA受體過度活化，例如阿茲海默症、帕金森氏症、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、多發性硬化症、癲癇或神經疼痛等。在一實施例中，以阿茲海默症中Aβ寡聚體的存在，使得神經元細胞中麩胺酸過度表現，造成神經元細胞過度去極化作為範例。

實驗方法及材料

試劑及抗體

於本申請案中所使用之試劑及抗體包括DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagle medium；Gibco,Grand Island,N.Y.,USA)；胎牛血清(Fetal bovine serum；FBS；Thermo Scientific/Hyclone,Logan,UT,USA)；左旋麩醯胺酸(L-glutamine)；B27添加劑；Neurobasal A/Neurobasal培養基(Invitrogen/Gibco,Grand Island,NY,USA)；抗寡聚物兔多株抗體(A11)(Invitrogen/Gibco,Grand Island,NY,USA)；抗寡聚物小鼠單株抗體(6E10)(Covance)；AMPA受體(AMPAR)；第三型β微管蛋白抗體及突觸結合蛋白抗體(Abcam,Cambridge,UK)；PSD-95抗體(BD Falcon,Franklin Lakes,NJ,USA)；vGLUT多株抗體(SYSY,Gottingen,Germany)；GAPDH抗體(Epitomics,Burlingame,CA,USA)；Alexa 488-共軛抗兔抗體(Invitrogen)；DyLight 549-共軛抗兔IgG抗體和DyLight 488-共軛抗兔IgG抗體(Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA,USA)；山葵過氧化氫酶-共軛二級抗體(Horseradish peroxide(HRP)-conjugated secondary antibody；Thermo Scientific/Pierce,Rockford,IL,USA)；DiBAC4(3)染料(Lifetechnologies,Eugene,OR,USA)；以及自中草藥萃取的化合物是來自Sun Ten Pharmaceutical Co.，而其他未特別註明之化學品皆來自Sigma(St.Louis,MO,USA)。以上所述之試劑及抗體僅為示例，並不以此為限，本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠了解並以等效之試劑及抗體加以取代。

細胞培養及小鼠神經元初級培養

在一實施例中，自出生後1至3天(P1至P3)之C57BL/6小鼠取得大腦皮質(Cerebral cortexes)。本實施例之實驗流程係基於Brewer及Torricelli(Brewer and Torricelli,2007)所揭露的方法並加以修改。簡單地說，在一實施例中，自C57BL/6小鼠分離之約200毫克(mg)的大腦皮質組織暫時地培養於預冷的Neurobasal A培養基中，接著將該些組織碎片放入試管中，加入木瓜酶(papain)後搖晃20分鐘使細胞解離。將重力沈澱後的殘餘物(residues)培養於新鮮的Neurobasal A培養基中，接著微量吸量管溫和且重複混合(pipetting)45秒後，靜置2分鐘待其沈澱，重複此步驟三次，並於每次重複之步驟中將上清液收集於新的試管中。根據Brewer及Torricelli所揭露的方法，將所收集的細胞小心地置於多用途梯度分離液(OptiPrep gradient tube)中，在以2000rpm離心15分鐘後，將上層吸去，並將含有神經元細胞之下層分離至含有新鮮之Neurobasal A培養基的試管中。接著利用新鮮之Neurobasal A培養基以1250rpm離心5分鐘反覆清洗神經元細胞2次，以移除梯度分離液。最後，將清洗後之神經元細胞以1.04×10⁵/cm²的密度接種於塗佈有聚-D-離胺酸(poly-D-lysine)之培養皿中，並且每三天更換新的Neurobasal A培養基。

西方墨點法分析

將細胞溶解於溶解緩衝液(lysis buffer)(含20mM三羥甲基氨基甲烷(Tris-Base,pH 7.9)、20mM氯化鈉(NaCl)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)、20mM β-甘油磷酸鈉(β-glycerophosphate)、1mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol；DTT)、1mM苯甲基磺醯化氟(phenylmethylsulfonyl fluoride；PMSF)、25nM去磷酸酶抑制劑(calyculin A)、1錠/50ml蛋白水解酶抑制劑(protease inhibitor；Roche,Mannheim,Germany)及0.5%界面活性劑(Triton X-100)中。將得之細胞溶解物以13,500rpm離心20分鐘。將各樣本具相同蛋白質量之上清液等量取出，以Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)檢測蛋白質濃度後，再加入十二烷基磺酸鈉(SDS)樣本緩衝液，以95℃加熱10分鐘後，利用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)分離。電泳完成後，將蛋白質轉漬於聚二氟乙烯(polyvinylidene difluoride；PVDF)膜，並將聚二氟乙烯膜上之蛋白質依序與其一級抗體及山葵過氧化氫酶-共軛(Horseradish peroxidase-conjugated；HRP-conjugated)之二級抗體作用後，以化學冷光法測定冷光強度，操作步驟係參考試劑操作手冊(Millipore Corporation,Billerica,MA,USA)。

小鼠神經元細胞免疫細胞化學分析

將培養之神經元細胞種植於塗佈有聚-D-離胺酸的蓋玻片上，在分化後的特定時點，將細胞以磷酸緩衝液(PBS)清洗後，以配置於磷酸緩衝液中的4%多聚甲醛溶液固定細胞30分鐘，並浸於配置於磷酸緩衝液中的0.3% Triton X-100溶液10分鐘。接著，將檢體以配置於磷酸緩衝液中的3%小牛血清蛋白(BSA)溶液於室溫下阻斷(blocking)1小時，加入一級抗體培養2小時並以磷酸緩衝液清洗。加入二級抗體培養1小時並以磷酸緩衝液清洗。細胞核利用赫斯特染色劑(Hochest)染色15分鐘後，再另外利用PBS清洗。接著將該蓋玻片利用Fluoromount G螢光封片劑 (Southern Biotech,Birmingham,AL,USA)固定於玻片上。利用連結有CCD照相機之Leica SP2共軛焦顯微鏡擷取影像(Leica,Wetzlar,Germany)或是Zeiss Axio Observer D1顯微鏡(Carl Zeiss,Jena,Germany)，並利用Leica Confocal軟體(Leica)處理影像。

存活分析(MTT試驗)

在一實施例中，細胞存活率係利用本發明所屬技術領域中具有通常知識者所熟知且於文獻(Denizot and Lang,1986)中記載之MTT試驗進行分析。簡單來說，將神經元細胞以每孔2x10⁵個細胞的密度種於24孔細胞培養分隔盤中。在細胞處理後，於每孔中加入25μl的MTT試劑，使MTT試劑在孔中的最後濃度為2.5毫克/毫升(mg/ml)。在37℃的溫度下孵化3小時，接著將培養基換為300μl的DMSO，以溶解甲臢(formazan)結晶。將該細胞培養分隔盤搖晃10分鐘，接著利用微盤分光光度計於490奈米波長下測定吸光值，並將吸光值以基於控制組的百分比呈現。

製備均質之Aβ寡聚體

在一實施例中，製備均質之Aβ寡聚體的方法係基於Mauro Fa的文章(Fa et al.,2010)，並加以部分修改。簡單來說，將0.5毫克之Aβ 1-42胜肽溶解於400μl之六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol；HFIP)，並且震盪數秒後，於室溫下靜置20分鐘，以使Aβ 1-42胜肽開始單體化及溶解。快速將Aβ 1-42/六氟異丙醇溶液分裝至新的矽化微量試管(siliconized eppendorfs)中，並置於抽氣櫃中使六氟異丙醇揮發2小時，直到可見透明的胜肽膜。在約0.0625毫克之胜肽膜中加入470μl的水及30μl之1% NH₄OH緩衝液，使其濃度為約6.92μM。在室溫下20分鐘後，將該樣品以14000 x g離心15分鐘。將離心後之上清液分裝至新的矽化微量試管，並利用塗佈鐵氟龍之微攪拌子(microstir bar)以500rpm的速度，於室溫下攪拌48小時。同時利用相同程序製備載體溶液(vehicle solution)。

斑點免疫試驗(Dot-blot immunoassay)

在一實施例中，將0.22μm孔隙之聚二氟乙烯膜浸於100%濃度之甲醇中2分鐘，接著將其置於清洗緩衝液(含1X TBST及0.05% Tween-20)中。將濾紙及聚二氟乙烯膜置於斑點免疫試驗裝置中。在每個溝槽內加入清洗緩衝液後待其乾燥，並重複此步驟三次。在每個溝槽內加入檢體後待其乾燥，並重複利用清洗緩衝液清洗溝槽三次。接著，將聚二氟乙烯膜自斑點免疫試驗裝置移至含有清洗緩衝液之槽內。利用考馬斯亮藍R-250(Coomassie brilliant blue R-250)將該聚二氟乙烯膜染色，並利用50%濃度之甲醇退染三次。將聚二氟乙烯膜以配置於清洗緩衝液中的5%牛奶阻斷(blocking)隔夜。接著，加入一級抗體(A11或6E10)與聚二氟乙烯膜共同孵化2小時，並加入山葵過氧化氫酶-共軛二級抗體(對於A11加入抗兔抗體或對於6E10加入抗小鼠抗體)與聚二氟乙烯膜共同孵化1小時。最後，以化學冷光法測定冷光強度，操作步驟係參考試劑操作手冊指示。

DiBAC4(3)藥物篩選試驗

將雙(1,3-二丁基巴比妥酸)三次甲基氧雜菁(bis-(1,3 dibutylbarbituric acid)-trimethine oxonol；DiBAC4(3))溶於DMSO中，以使濃度為1mM且可儲存於-20℃。在一實施例中，進行實驗時，可利用KRH緩衝液(含127mM NaCl、5mM KCl、mM CaCl₂、1.2mM MgCl₂、6mM葡萄糖及25mM HEPES)將DiBAC4(3)配置為5μM之溶液。將神經元細胞及HEK 293T細胞之培養基置換為含有5μM之DiBAC4(3)的KRH溶液，並於37℃下孵化該些細胞，而該些孵化之細胞在未洗去 DiBAC4(3)染劑的情況下進行下列實驗。在488nm激發波長及505-550nm波段通過濾光器記錄紅色螢光的影像(Yamada et al.,2001)。在實驗中，在處理前1分鐘或是處理後第0、1、3、5、7分鐘等時間點記錄紫外光-可見光、紅色螢光及DAPI的影像，並且利用MetaMorph(版本7.5.3.0)定量紅色螢光改變的強度。該些影像通常是拍攝自三重複或四重複之各實驗組中的一視野，故大約會得到三至四個影像。利用DAPI的影像來分辨各個神經元細胞，並在各影像中挑選3~4個神經元細胞進行螢光亮度之定量。因此，於所述結果中，平均會利用9~16個神經元細胞的結果來進行統計，此僅為示例，並不以此為限。

統計分析

於本申請案中，數據係以平均±標準差(means±SD)來呈現。處理之效果係利用雙尾學生t檢驗(two-tailed Student's t test)進行評估，當p值<0.05時，認為其係具有統計上意義。

實驗結果

建立細胞模式

如第2圖所示，其係為根據本發明一實施例，建立麩胺酸神經元初級培養(primary culture)的示意圖。在初級培養培養神經元細胞後，利用只會表達於神經元細胞突觸間的蛋白質突觸結合蛋白(synaptotagmin)確認神經元細胞間可形成聯結。如第2圖(A)部分所示，synaptotagmin確實表達於所培養的細胞之突觸間，並且在西方墨點法的結果中(第2圖(B部分)亦可發現，只有在培養的細胞中可以發現AMPA受體、NMDA受體、突觸結合蛋白、PSD-95、第三型β微管蛋白等僅有在神經元細胞表現的蛋白質。此外，利用只會表達於神經元細胞的專一蛋白vGLUT1/2確認所培養神經元細胞之純度，可達85%以上。

建立篩藥平台

在建立初級培養的細胞株並確認其為神經元細胞後，進一步利用該些神經元細胞建立藥物篩選平台。

如第3圖所示，在加入感應膜電位變化的螢光染劑後，加入次能促進膜電位變化的KCl及麩胺酸作為陽性控制組，加入水或白胺酸(leucine)作為陰性控制組。在(A)部分中可見，在KCl及麩胺酸刺激下，螢光的確有所增強；但在水或白胺酸刺激下，螢光確實沒有增強。也就表示，在KCl及麩胺酸刺激下，膜電位有變化；但在水或白胺酸刺激下，膜電位沒有變化。

另一方面，為模擬阿茲海默症患者中，類澱粉蛋白會形成Aβ寡聚體的情況，便將類澱粉蛋白進行聚合，並利用免疫斑點試驗(Dot blot)確認是否形成Aβ寡聚體。請參見第3圖(B)部分，類澱粉蛋白確實已形成Aβ寡聚體。進一步，在本發明之一實施例中，利用美金剛作為陽性對照組，表示其可有效減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化，以避免突觸失能。根據實驗結果，現有臨床用藥美金剛對於可使導麩胺酸神經元一半死亡的致死濃度(IC₅₀)約為100μM(第3圖(C)部分)，故利用此濃度進行後續實驗。所述濃度僅為示例，應不以此為限。

為確認美金剛能夠減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化，以美金剛單獨處理神經元細胞5分鐘後，並不會引起感應膜電位改變的螢光染劑有任何改變(第3圖(D)部分)，接著更以KCl強迫神經元細胞去極化，以確認神經元細胞還是活的。如圖所示，在第10分鐘加入KCl後，螢光確實增強，表示神經元細胞能夠去極化，且該神經元細胞是活的、是可以有改變的。

若是加入Aβ寡聚體使下游麩胺酸受體過度活化後，確實能引起螢光增強，表示神經元細胞去極化；而若進一步以美金剛與神經元細胞前處理2小時後再以Aβ寡聚體刺激，則無法引起螢光增強(第3圖(E)、(F)部分)，這也就表示美金剛能夠有效避免Aβ寡聚體所引起之麩胺酸受體過度活化。換句話說，根據本發明之一實施例所構建之篩藥平台能夠用於篩選避免Aβ寡聚體所引起之麩胺酸受體過度活化的藥物。

白芍中純物質成分牡丹酚(Paeonol；PN)可抑制Aβ寡聚體所引起神經細胞的去極化

根據實驗結果看來，神經元細胞對於牡丹酚之耐受性高，至1000μM仍未影響神經元細胞的存活率(第4圖(A)部分)。然而，由於牡丹酚係溶於DMSO中，為避免過高的DMSO影響神經元細胞生長，故利用880μM作為麩胺酸神經元細胞一半死亡的致死濃度(IC₅₀)進行後續實驗。在此DMSO濃度((A)部分D.(vol1)及D.(vol2))下，單獨加入DMSO至培養液中培養細胞，仍不致於影響神經元細胞生長。所述濃度僅為示例，應不以此為限。

為確認牡丹酚能夠減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化，以牡丹酚單獨處理神經元細胞5分鐘後，發現不會引起感應膜電位改變的螢光染劑有任何改變(第4圖(B)部分)。然而，若是利用牡丹酚前處理神經元細胞2小時後，再以Aβ寡聚體刺激神經元細胞，Aβ寡聚體(DMSO+Aβ)所引起螢光增強的現象(表示神經去極化)，可以被牡丹酚在以1/5、1/3 IC₅₀(即176μM、293μM)的濃度前處理神經元細胞2小時後所抑制(第4圖(C)部分)。其中，在第4圖(B)部分的共軛焦螢光顯微鏡結果中，僅呈現1/5 IC₅₀之牡丹酚所作用的結果，其餘濃度之牡丹酚的結果請參照第4圖(C)部分之定量結果，而美金剛(美金剛+Aβ)亦於同一實施例中作為陽性對照組。

Aβ寡聚體可透過至少四種受體使神經元細胞去極化

第5圖(A)、(B)部分所示，其中CNQX為AMPA受體之拮抗劑，而MK801為NMDA受體之拮抗劑，將所述拮抗劑分別單獨處理神經元細胞後，發現螢光染劑之亮度沒有任何改變，最後以KCl分別處理經所述拮抗劑處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，表示神經元細胞是活的、是可以有改變的。

另一方面，請參照第5圖(C)部分，其中CNQX為AMPA受體之拮抗劑、MK801為NMDA受體之拮抗劑、MCPG為mGlu受體之拮抗劑、且mecamylamine(Mecamyl.)為菸鹼型乙醯膽鹼受體(nicotinic acetylcholine receptors；nAchR)之拮抗劑，分別以三種不同濃度的拮抗劑前處理神經元細胞(第5圖(D)部分虛線右側)，並加入美金剛(M.+Aβ)作為陽性控制組(第5圖(D)部分虛線左側)。從圖中結果可知，不論AMPA受體之拮抗劑、NMDA受體之拮抗劑、mGlu受體之拮抗劑或是nAchR受體之拮抗劑，在150μM的濃度下，都可以抑制掉Aβ寡聚體所引起的螢光改變(第5圖(C)部分)。這也就表示，Aβ寡聚體使神經元細胞去極化的現象至少與上述4種受體有關。要說明的是，在此僅呈現單一濃度之拮抗劑所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。最後亦以KCl分別處理經所述拮抗劑處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的。

白芍中純物質成分牡丹酚(Paeonol；PN)無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化，但可抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化

如第6圖(A)、(B)部分所示，不論是利用AMPA受體的活化劑AMPA或是利用NMDA受體的活化劑NMDA處理，在處理5分鐘後，皆可引起感應膜電位改變之螢光染劑的螢光增強，表示神經元細胞的去極化；然而，若利用菸鹼型乙醯膽鹼受體的活化劑cystisine，則在500μM的濃度下，仍無法引起感應膜電位改變之螢光染劑的螢光增強，表示神經元細胞並未去極化。

接著，以1/5、1/3 IC₅₀(即176μM、293μM)的濃度的牡丹酚(PN)前處理神經元細胞後，再利用AMPA受體的活化劑AMPA處理神經元細胞，觀察神經元細胞的變化。由第6圖(C)部分可見，牡丹酚無法抑制掉因AMPA受體的活化劑AMPA所引起的螢光改變，這也就表示牡丹酚無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化；然而AMPA受體之拮抗劑CNQX確實能夠抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化。要說明的是，在此僅呈現1/3 IC₅₀之牡丹酚濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。將上述第6圖(C)部分中螢光強度以MetaMorph軟體定量及統計，可見1/5或1/3 IC₅₀(即176μM或293μM)之牡丹酚濃度下，對於AMPA所引起神經元細胞的去極化皆無抑制效果(第6圖(D)部分)，僅有在加入AMPA受體之拮抗劑CNQX時，才能抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化。

另一方面，如第6圖(E)、(F)部分所示，以1/5、1/3 IC₅₀，即176μM、293μM之濃度的牡丹酚前處理神經元後再加入NMDA受體之活化劑NMDA，可以發現低濃度(即1/5 IC₅₀、176μM)的牡丹酚無法抑制因NMDA所引起的螢光改變，但高濃度(即1/3 IC₅₀、293μM)可以抑制因NMDA所引起的螢光改變。要說明的是，在此僅呈現1/3 IC₅₀之牡丹酚濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。另外，以已知是麩胺酸受體之NMDA受體之拮抗劑MK801前處理細胞，作為陽性對照組。由結果可見，加入NMDA受體之拮抗劑MK801前處理後，確實能抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化。可見1/5 IC₅₀(即176μM)之牡丹酚濃度下，對於NMDA所引起神經元細胞的去極化無抑制效果，但在1/3 IC₅₀(即293μM)之牡丹酚濃度下，牡丹酚對於NMDA所引起神經元細胞的去極化有抑制效果(第6圖(F)部分)。

黃芩中純物質成分黃芩素(Baicalein；BE)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化

根據實驗結果，黃芩素對於可使麩胺酸神經元細胞一半死亡的致死濃度(IC₅₀)約為42μM(第7圖(A)部分)，故利用此濃度進行後續實驗。所述濃度僅為示例，應不以此為限。

為確認黃芩素能夠減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化，利用不同濃度之黃芩素前處理神經元細胞2小時後，再以Aβ寡聚體刺激神經元細胞。由結果可見，Aβ寡聚體(DMSO+Aβ)所引起螢光增強的現象(表示神經去極化)，可以被黃芩素在以1/10、1/5、1/3 IC₅₀(即4μM、8μM、14μM)的濃度前處理神經元細胞2小時後所抑制(第7圖(B)、(C)部分)。其中，美金剛(美金剛+Aβ)亦於同一實施例中作為陽性對照組。最後以KCl分別處理經黃芩素處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於黃芩素前處理的結果。所以，黃芩素在此三種濃度下單獨與神經元細胞培養並不會引起螢光強度有任何改變；而在前處理後以Aβ寡聚體刺激的條件下，則此三種濃度皆可抑制因Aβ寡聚體刺激後所引起螢光強度的增加，亦即抑制去極化的發生。

黃芩中純物質成分黃芩素(Baicalein；BE)可以抑制AMPA或NMDA所引起神經細胞的去極化

如第8圖(A)~(D)部分所示，不論是利用AMPA受體的活化劑AMPA或是利用NMDA受體的活化劑NMDA處理，在處理5分鐘後，皆可引起感應膜電位改變之螢光染劑的螢光增強，表示神經元細胞的去極化。

接著，如第8圖(A)、(B)部分所示，以1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM或14μM)之濃度的黃芩素前處理神經元後再加入AMPA受體之活化劑AMPA，可以發現不論是1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM或14μM)之濃度的黃芩素，皆能抑制因AMPA所引起的螢光改變。要說明的是，在此僅呈現4μM之黃芩素濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。另外以已知是麩胺酸受體之AMPA受體之拮抗劑CNQX前處理細胞，作為陽性對照組。由結果可見，加入AMPA受體之拮抗劑CNQX時，確實能抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化。可見在1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM、或14μM)之黃芩素濃度下，黃芩素亦確實能抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化(第8圖(B)部分)。最後以KCl分別處理經黃芩素處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於黃芩素前處理的結果。

另一方面，如第8圖(C)、(D)部分所示，以1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM或14μM)之濃度的黃芩素前處理神經元後再加入NMDA受體之活化劑NMDA，可以發現1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM或14μM)之濃度的黃芩素皆可以抑制因NMDA所引起的螢光改變。要說明的是，在此僅呈現4μM之牡丹酚濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。另外以已知是麩胺酸受體之NMDA受體之拮抗劑MK801前處理細胞，作為陽性對照組。由結果可見，加入NMDA受體之拮抗劑MK801時，確實能抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化。可見在1/10、1/5或1/3 IC₅₀(即4μM、8μM、或14μM)之黃芩素濃度下，黃芩素亦確實能抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化(第8圖(D)部分)。最後以KCl分別處理經黃芩素處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於黃芩素前處理的結果。

銀杏中純物質成分芸香苷(Rutin；RT)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化

根據實驗結果，芸香苷對於可使麩胺酸神經元細胞一半死亡的致死濃度(IC₅₀)約為7.4mM(第9圖(A)部分)，故利用此濃度進行後續實驗。所述濃度僅為示例，應不以此為限。

為確認芸香苷能夠減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化，以芸香苷單獨處理神經元細胞5分鐘後，發現不會引起感應膜電位改變的螢光染劑有任何改變(第9圖(B)、(C)部分)。然而，利用不同濃度之芸香苷前處理神經元細胞2小時後，再以Aβ寡聚體刺激神經元細胞。由結果可見，Aβ寡聚體(DMSO+Aβ)所引起螢光增強的現象(表示神經去極化)，可以被芸香苷在以1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)的濃度前處理神經元細胞2小時後所抑制(第9圖(B)、(C)部分)。其中，美金剛(美金剛+Aβ)亦於同一實施例中作為陽性對照組。要說明的是，在此僅呈現1/30 IC₅₀之芸香苷濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。最後以KCl分別處理經芸香苷處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於芸香苷前處理的結果。所以，芸香苷在此二種濃度下單獨與神經元細胞培養並不會引起螢光強度有任何改變；而在前處理後以Aβ寡聚體刺激的條件下，則此二種濃度皆可抑制因Aβ寡聚體刺激後所引起螢光強度的增加，亦即抑制去極化的發生。

銀杏中純物質成分芸香苷(Rutin；RT)無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化，但可抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化

如第10圖(A)、(C)部分所示，不論是利用AMPA受體的活化劑AMPA或是利用NMDA受體的活化劑NMDA處理，在處理5分鐘後，皆可引起感應膜電位改變之螢光染劑的螢光增強，表示神經元細胞的去極化。

接著，以1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)之濃度的芸香苷(RT)前處理神經元細胞後，再利用AMPA受體的活化劑AMPA處理神經元細胞，觀察神經元細胞的變化。由第10圖(A)部分可見，芸香苷無法抑制掉因AMPA受體的活化劑AMPA所引起的螢光改變，這也就表示芸香苷無法抑制AMPA所引起神經元細胞的去極化。要說明的是，在此僅呈現1/10 IC₅₀之芸香苷濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。將上述第10圖(A)部分中螢光強度以MetaMorph軟體定量及統計，可見1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)之芸香苷濃度下，對於AMPA所引起神經元細胞的去極化皆無抑制效果(第10圖(B)部分)。

另一方面，如第10圖(C)、(D)部分所示，以1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)之濃度的芸香苷前處理神經元後再加入NMDA受體之活化劑NMDA，可以發現1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)之濃度的芸香苷皆可以抑制因NMDA所引起的螢光改變。要說明的是，在此僅呈現1/30 IC₅₀之芸香苷濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。另外，以已知是麩胺酸受體之NMDA受體之拮抗劑MK801前處理細胞，作為陽性對照組。由結果可見，加入NMDA受體之拮抗劑MK801前處理後，確實能抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化。可見在1/30、1/10 IC₅₀(即247μM、740μM)之芸香苷濃度下，芸香苷對於NMDA所引起神經元細胞的去極化有抑制效果(第10圖(D)部分)。最後以KCl分別處理經芸香苷處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於芸香苷前處理的結果。

銀杏中純物質成分銀杏內酯(Ginkgolide A；GA)可抑制Aβ寡聚體所引起神經元細胞的去極化

根據實驗結果，隨著銀杏內酯的濃度增加，神經元細胞的存活率逐漸下降，在銀杏內酯濃度為1000μM時，神經元細胞的存活率仍有約75%(第11圖(A)部分)。然而，為避免過高的DMSO影響神經元細胞生長，便利用外推法推算銀杏內酯對於可使麩胺酸神經元細胞一半死亡的致死濃度(IC₅₀)，銀杏內酯對於神經元細胞之致死濃度約為3mM，故利用此濃度進行後續實驗。所述濃度僅為示例，應不以此為限。

為確認銀杏內酯能夠減緩、改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致下游受體過度活化以銀杏內酯或DMSO單獨處理神經元細胞5分鐘後，發現不會引起感應膜電位改變的螢光染劑有任何改變(第11圖(B)、(C)部分)。然而，利用不同濃度之銀杏內酯前處理神經元細胞2小時後，再以Aβ寡聚體刺激神經元細胞。由結果可見，Aβ寡聚體(DMSO+Aβ)所引起螢光增強的現象(表示神經去極化)，可以被銀杏內酯在以1/30、1/10 IC₅₀(即100μM、300μM)的濃度前處理神經元細胞2小時後所抑制(第11圖(B)、(C)部分)。其中，美金剛(美金剛+Aβ)亦於同一實施例中作為陽性對照組。要說明的是，在此僅呈現1/30 IC₅₀之銀杏內酯濃度下所作用的代表圖像作為示例，並不以此為限。最後以KCl分別處理經銀杏內酯處理後之神經元細胞，發現螢光染劑之亮度增強，確認進行實驗之神經元細胞是活的、是可以有改變的，沒有去極化的發生是由於銀杏內酯前處理的結果。所以，銀杏內酯在此二種濃度下單獨與神經元細胞培養並不會引起螢光強度有任何改變；而在前處理後以Aβ寡聚體刺激的條件下，則此二種濃度皆可抑制因Aβ寡聚體刺激後所引起螢光強度的增加，亦即抑制去極化的發生。

銀杏中純物質成分銀杏內酯(Ginkgolide A；GA)可以抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化

如第12圖(A)、(B)部分所示，利用NMDA受體的活化劑NMDA處理神經元細胞，在處理5分鐘後，可引起感應膜電位改變之螢光染劑的螢光增強，表示神經元細胞的去極化。

進一步，如第12圖(A)、(B)部分所示，以1/30、1/10 IC₅₀(即100μM、300μM)之濃度的銀杏內酯前處理神經元後再加入NMDA受體之活化劑NMDA，可以發現低濃度(即1/30 IC₅₀、100μM)的銀杏內酯無法抑制因NMDA所引起的螢光改變，但高濃度(即1/10 IC₅₀、300μM)的銀杏內酯可以抑制因NMDA所引起的螢光改變。其中，銀杏內酯之濃度僅為示例，並不以此為限。另外，以已知是麩胺酸受體之NMDA受體之拮抗劑MK801前處理細胞，作為陽性對照組。由結果可見，加入NMDA受體之拮抗劑MK801前處理神經元細胞後，確實能抑制NMDA所引起神經元細胞的去極化。可見1/30 IC₅₀(即100μM)之銀杏內酯濃度下，對於NMDA所引起神經元細胞的去極化無抑制效果，但在1/10 IC₅₀(即300μM) 之銀杏內酯濃度下，銀杏內酯對於NMDA所引起神經元細胞的去極化有抑制效果(第12圖(B)部分)。

綜上所述，不論是牡丹酚(Paeonol)、黃芩素(Baicalein)、芸香苷(Rutin)或銀杏內酯(Ginkgolide A)皆能有效抑制Aβ寡聚體所引起神經細胞的去極化，表示該些萃取物皆有潛力能夠製成藥物，用以有效地改善由Aβ寡聚體引起麩胺酸過多所導致之突觸失能，進而預防、治療、抑制或延緩阿茲海默症。此外，牡丹酚、黃芩素、芸香苷或銀杏內酯分別能夠作為NMDA受體拮抗劑或AMPA受體拮抗劑，進而能製成藥物，應用於預防、治療、抑制或延緩因體內因麩胺酸過多所引起NMDA受體或AMPA受體過度活化之疾病，例如包括帕金森氏症、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、多發性硬化症、癲癇或神經疼痛。

本發明所屬技術領域中具有通常知識者將理解到，以上所述僅為舉例性，而非為限制性者，可對本發明的較佳實施例進行許多變化及修改，且可進行這些變化及修改而不脫離本發明的精神。因此，其旨在使所附的申請專利範圍涵蓋落入本發明的真實精神及範疇內之所有這樣的等效變異。

Claims

一種芸香苷在製備抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體過度活化之藥物的用途，其中該芸香苷之作用濃度為247μM至1000μM。
一種牡丹酚在製備抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體過度活化之藥物的用途，其中該牡丹酚的作用濃度為293μM至500μM。
一種銀杏內酯A在製備抑制或延緩個體因麩胺酸過多所引起NMDA受體過度活化之藥物的用途，其中該銀杏內酯A的作用濃度為300μM至500μM。
如申請專利範圍第1~3項中任一項所述之用途，其中該藥物係透過減緩或抑制個體因β-類澱粉蛋白(Aβ)寡聚體引起麩胺酸過多所造成之突觸失能。
如申請專利範圍第1~3項中任一項所述之用途，其中該藥物係用於減緩或抑制阿茲海默症、帕金森氏症、杭丁頓氏舞蹈症(Huntington's disease)、多發性硬化症、癲癇或神經疼痛。