TWI665216B - 抗人類tim-3抗體及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)抗體，該抗體可結合包含人類TIM-3蛋白之胺基酸序列RKGDVSL (SEQ ID NO: 9)及/或EKFNLKL (SEQ ID NO: 10)之肽。該抗體可調節免疫細胞活性。該抗體或其結合片段可用於據報導可表現細胞表面TIM-3之癌症的診斷、預後及治療，諸如肺癌、肝癌、食道癌及固態腫瘤。

Description

抗人類TIM-3抗體及其使用方法
本發明係關於用於產生特異性結合至人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3；TIM-3)之抗體的方法及該等抗體的用途。
免疫反應在抵擋癌症上扮演重要的作用。因此，T細胞衰竭可能與宿主中的腫瘤生長有關。T細胞衰竭係由多種機制引起。計畫性細胞死亡分子(programmed cell death molecule；PD-1)係衰竭T細胞之標記物。阻斷PD-1與其配體(PD-1配體，或PD1L)之相互作用可部分地恢復T細胞功能。 除PD-1以外，在患有固態腫瘤之小鼠中的CD8+ 腫瘤浸潤性淋巴細胞上發現T細胞免疫球蛋白黏蛋白3 (TIM-3)表現。TIM-3最初被認為係T輔助細胞(Th) 1-特異性之I型膜蛋白。TIM-3 是一個免疫檢查站，可調節巨噬細胞活化作用並且在Th1免疫性及耐受性誘導上扮演重要的作用。 所有表現TIM-3之腫瘤浸潤性淋巴細胞亦被發現可以表現PD-1。此等表現TIM-3及PD-1之淋巴細胞占浸潤腫瘤之T細胞的大部分。此外，此等表現TIM-3及PD-1之淋巴細胞亦呈現出最嚴重的衰竭表現型：這些細胞無法增殖且亦無法產生IL-2、TNF及IFN-γ。(Sakuishi等人, J. Exp. Med., 2010, 207(10): 2187-2194)。 最近，TIM-3也已被發現在調節其他細胞上是有作用的，諸如Th17細胞、CD4(+) CD25(+)調節性T細胞(Treg s)、CD8(+) T細胞及某些先天性免疫細胞(innate immune cells)。 因為TIM-3路徑與自體免疫疾病、慢性病毒感染及癌症之發病機制有關，所以需要尋找可抑制或阻斷TIM-3信號傳導路徑之藥劑。
本發明之實施例係關於可與TIM-3特異性結合而由此抑制TIM-3之功能的抗體。TIM-3信號傳導路徑經發現係與T細胞衰竭有關。因此，本發明之抗體可用以預防或治療與T細胞衰竭有關之疾病或病狀，諸如自體免疫疾病及癌症。 本發明之一個態樣係關於與抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)抗體或其結合片段(例如scFv、Fab或(Fab)2 )。根據本發明之一個實施例，抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)抗體或其結合片段可結合TIM-3中由RKGDVSL (SEQ ID NO: 9)及/或EKFNLKL (SEQ ID NO: 10)之序列組成的抗原決定基。該抗體或其結合片段之解離常數(Kd)為10 nM或低於10 nM。該抗體或其結合片段可經由TIM-3調節人類免疫細胞活性。 根據本發明之實施例，抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)抗體或其結合片段包含具有以下互補決定區(complementarity determining region；CDR)序列之重鏈可變域：HCDR1 (SEQ ID NO: 3)、HCDR2 (SEQ ID NO: 4)、HCDR3 (SEQ ID NO: 5)，及/或具有以下CDR序列之輕鏈可變域：LCDR1 (SEQ ID NO: 6)、LCDR2 (SEQ ID NO: 7)及LCDR3 (SEQ ID NO: 8)。 根據本發明之實施例，抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3 (TIM-3)抗體或其結合片段包含具有SEQ ID NO: 1序列之重鏈及/或具有SEQ ID NO: 2序列之輕鏈。 根據本發明之實施例，抗體或其結合片段可誘導T細胞分泌包括IFN-γ及/或TNF-α之細胞介素。根據本發明之一些實施例，抗體為單株抗體。 根據本發明之實施例，本發明之抗體或其結合片段可用於診斷、預後及治療會表現細胞表面TIM-3之癌症。此等癌症(例如)包括肺癌、肝癌、食道癌及固態腫瘤。 從以下描述及所附申請專利範圍就顯而易知本發明之其他態樣及優點。
定義 如本文所使用，「互補決定區(complementarity-determining region；CDR)」係指可變區中與抗原識別有關的三個高度變異序列。三個CDR係藉由四個「構架」區域分散在輕鏈或重鏈可變區中。CDR主要負責與抗原之抗原決定基結合。各鏈之CDR通常稱為(自N末端開始連續編號之)CDR1、CDR2及CDR3，且亦以特定CDR所位於其中之鏈加以識別。因此，VH CDR3表示係位於其所在抗體的重鏈可變域中，而VL CDR1係為其所在抗體之輕鏈可變域的CDR1。此等可分別簡稱為HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中H係指重鏈，而L係指輕鏈。 不同輕鏈或重鏈之構架區(framework region；FR)的序列在物種內是相對保守的。抗體之構架區(亦即構成輕鏈及重鏈之組合構架區)係用以安置三維空間內之CDR且使其排列對準。側接3個CDR之四個FR稱為FR1、FR2、FR3及FR4。 可使用此項技術中各種熟知的定義確定CDR及構架區(FR)之胺基酸序列，例如Kabat、Chothia、國際免疫遺傳學資料庫(international ImMunoGeneTics database，IMGT)，及AbM (參見例如Johnson等人, 見上文；Chothia及 Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196, 901-917；Chothia等人 (1989) Nature 342, 877-883；Chothia等人 (1992) J. Mol. Biol. 227, 799-817；Al-Lazikani等人, J. Mol. Biol. 1997, 273(4))。抗原組合位點之定義亦描述於以下中：Ruiz等人 Nucleic Acids Res., 28, 219-221 (2000)；及Lefranc Nucleic Acids Res. Jan 1; 29 (1):207-9 (2001)；MacCallum等人, J. Mol. Biol., 262: 732-745 (1996)；及Martin等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 9268-9272 (1989)；Martin等人, Methods Enzymol., 203: 121-153, (1991)；Pedersen 等人, Immunomethods, 1, 126, (1992)；及Rees等人, 於Sternberg M. J. E. (編), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172 1996中)。 抗體會與抗原上「抗原決定基」結合。抗原決定基係位於抗原上與抗體特異性結合之相互作用位點，且抗原決定基可包括少數胺基酸或肽片段之部分。舉例而言，抗原決定基可包括5或6個或超過6個胺基酸殘基的一段肽。 本發明之實施例係關於與人類TIM-3特異性結合之抗體分子。此等抗人類TIM-3抗體分子可用以治療及/或診斷免疫疾病或癌性疾病。 免疫反應在抵擋癌症上扮演重要的作用。然而在慢性病毒感染及癌症中，已發現T細胞衰竭與此等疾病相關。T細胞衰竭由多種機制所引起。計畫性細胞死亡分子(PD-1)係衰竭T細胞之標記物。阻斷PD-1與其配體(PD-1配體，或PD1L)之相互作用可部分地恢復T細胞功能。 除PD-1以外，T細胞免疫球蛋白黏蛋白3 (TIM-3)是一種免疫檢查站標記物，亦發現其與T細胞衰竭有關。TIM-3最初被認為係T輔助細胞(Th) 1-特異性之I型膜蛋白。TIM-3 (免疫檢查站)可調節巨噬細胞活化作用，並且在Th1免疫性及耐受性誘導上扮演關鍵角色。 患有固態腫瘤之小鼠中的CD8+ 腫瘤浸潤性淋巴細胞上也發現TIM-3表現。所有表現TIM-3之腫瘤浸潤性淋巴細胞亦被發現可以表現PD-1。此等表現TIM-3及PD-1之淋巴細胞占浸潤腫瘤之T細胞的大部分。此外，此等表現TIM-3及PD-1之淋巴細胞亦呈現出最嚴重的衰竭表現型：這些細胞無法增殖且亦無法產生IL-2、TNF及IFN-γ。(Sakuishi等人, J. Exp. Med., 2010, 207(10): 2187-2194)。 最近，TIM-3也已被發現在調節其它細胞上是有作用的，諸如Th17細胞、CD4(+) CD25(+)調節性T細胞(Treg s)、CD8(+) T細胞及某些先天性免疫細胞。因為TIM-3路徑與自體免疫疾病、慢性病毒感染及癌症之發病機制有關，所以本發明抗體可用於此等疾病之治療。 根據本發明之實施例，產生抗人類TIM-3之抗體的若干純系。抗體可變結構域序列係經確定。 進一步研究一個例示性抗體，8C11。針對8C11之位在TIM-3胞外結構域上的抗原決定基被發現係在RKGDVSL及/或EKFNLKL之區域。咸發現8C11可與TIM-3結合，會干擾TIM-3與其配體(半乳糖凝集素-9)之間的相互作用。此外，8C11結合至TIM-3並不會誘導T細胞死亡，即抗體與TIM-3之結合並不會觸發TIM-3信號傳導路徑。因此，本發明抗體沒有誘導T細胞衰竭之風險。 此外，本發明抗體可促進T細胞之IFN-γ及TNF-α分泌，藉此增強免疫反應。此等抗體能夠抑制動物模型中腫瘤生長。因此，本發明抗體可用以治療癌症，諸如肺癌、乳癌、胰臟癌、肝癌、結腸直腸癌或前列腺癌。 本發明實施例將藉由以下實例加以說明。熟習此項技術者應理解，此等實例僅用於說明，且在不悖離本發明發明範疇情況下，其他修改及變化是有可能性的。 實例1：抗人類TIM-3單株抗體之產生 為了產生抗人類TIM-3之單株抗體，用經純化重組人類TIM-3抗原(呈具有6×His標記之融合蛋白)激發BALB/c小鼠。採集脾細胞，接著與Fo細胞融合後培養。利用以TIM-3抗原為基礎之ELISA挑選出可分泌出能夠識別TIM-3抗原之單株抗體的融合瘤細胞。所選擇的純系以FACS分析加以驗證。許多純系係以如下文所述分離出來及分析。 實例2：抗TIM-3抗體8C11與CD4+及CD8+ T細胞之結合 藉由FACS分析評估此等抗體是否可識別細胞表面上的天然TIM-3分子。在此等測試中，CD4 T細胞及CD8T細胞用CD3/CD28動態珠刺激以誘導TIM-3表現。此等細胞隨後分別用細胞標記物CD4-FITC、CD8-APC及TIM-3 PE (2E2)染色，作為對照組。 圖3A顯示單株抗體8C11與人類CD4 T細胞結合之結果，且圖3B顯示單株抗體8C11與人類CD8 T細胞結合之結果。此等結果顯示在人類CD4或CD8 T細胞上之TIM-3表現會被抗TIM-3單株抗體8C11偵測到。亦即，抗TIM-3抗體8C11可識別細胞表面上之天然TIM-3。 實例3：以ELISA測定27個抗體純系之人類TIM-3結合 為了分析上文所述經分離之27個抗體純系之TIM-3結合能力，將個別融合瘤純系在3 ml培養上澄液中進行擴增。將此等培養上澄液稀釋1倍，以進一步分析。將人類TIM-3蛋白(其係以具有TIM-3之殘基22-202且具有His標記的蛋白質表現)塗覆在96孔ELISA板(0.2 µg/孔)上，並將CD40 (其係以具有CD40之殘基21-193的肽表現)以0.2 µg/孔塗覆在孔中且作為陰性對照組之用。小鼠抗組胺酸標記抗體作為陽性對照組之用。 在抗體純系結合之後，經與辣根過氧化酶(horse radish peroxidase；HRP)共軛之山羊抗小鼠IgG作為第二抗體，且3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(TMB)作為受質，以評估抗體-TIM-3結合。讀取OD450以計算活性，並將結果示於圖2中。 如圖2中所示，若干純系具有結合TIM-3之良好親和力，包括8C11、3F10、9A11、6F9及CH11，該等抗體皆具有結合活性(在此分析中OD450＞0.9)。以下實驗大部分係使用8C11純系為實例。然而，熟習此項技術者應理解亦可使用具有合理結合親和力之其他抗體。因此，本發明之範疇不限於8C11純系或本文所述之任何特定實例。 實例4：抗人類TIM-3抗體8C11阻斷F293細胞上之半乳糖凝集素-9/TIM-3結合 為了評估抗人類TIM-3抗體阻斷半乳糖凝集素-9/TIM-3結合之能力，建立以F293細胞為基礎的分析。將半乳糖凝集素-9基因選殖至哺乳動物表現載體中，選殖出人類TIM-3胞外結構域之基因，並與人類IgG1 Fc結構域融合。隨後將融合基因選殖至哺乳動物表現載體中。為了產生可表現半乳糖凝集素-9之F293細胞株及產生人類TIM-3胞外結構域之重組蛋白，使用轉染試劑盒將質體引入至F293細胞中，且隨後用G418處理來挑選出穩定轉型細胞(transformant)。 分析系統建立成競爭分析。結果示於圖4A-圖4C中。圖4A顯示F293細胞在經半乳糖凝集素-9轉染之前不會與TIM-3誘餌(亦即與人類IgG1 Fc結構域融合之重組TIM-3胞外結構域)結合。圖4B顯示F293細胞經以半乳糖凝集素-9轉染之後，就能夠結合可表現經與人類IgG1 Fc結構域融合之重組TIM-3胞外結構域的細胞。在圖4C中，結果顯示抗人類TIM-3抗體8C11會與半乳糖凝集素-9/TIM-3結合進行競爭。因此，抗人類TIM-3抗體8C11可用以干擾經由TIM-3介導之信號傳導路徑，藉此抑制半乳糖凝集素-9或TIM-3功能。 實例5：抗人類TIM-3抗體8C11可藉由阻斷半乳糖凝集素-9/TIM-3結合來減少人類T細胞死亡 人類T細胞中半乳糖凝集素-9/TIM-3之信號傳導路徑會誘導細胞死亡且降低T細胞活性。為了研究抗人類TIM-3抗體8C11是否能夠阻斷半乳糖凝集素-9/TIM-3信號傳導路徑，吾人建立半乳糖凝集素-9誘導之T細胞死亡模型。以源於正常小鼠之IgG抗體作為陰性對照組，而單株抗體2E2作為陽性對照組。CD25係作為人類T細胞早期活化標記物。 此T細胞死亡分析之結果示於圖5中。如圖5中所示，經過半乳糖凝集素-9處理會誘導約40.2% CD4+CD25+T細胞，此等細胞為具有免疫抑制作用之調節性T細胞。添加對照組IgG實質上不會影響此類T細胞族群之誘導，而添加抗TIM-3抗體2E2卻會造成此類T細胞族群一些減少，減少至35.8%。相反地，添加本發明之抗TIM-3抗體(8C11)會顯著減少CD4+CD25+ T細胞族群(19.2%)。 此等結果表示，抗人類TIM-3抗體8C11能夠阻斷人類T細胞中之半乳糖凝集素-9/TIM-3信號傳導，而降低人類T細胞死亡。因此，抗人類TIM-3抗體8C11可用以治療由半乳糖凝集素-9/TIM-3信號傳導介導的疾病及/或病狀。 實例6：抗人類TIM-3抗體8C11不會誘導T細胞死亡 因為8C11可以與TIM-3結合，所以其可能會或可能不會觸發TIM-3受體之信號傳導路徑。為了研究抗人類TIM-3抗體8C11是否能夠與人類T細胞相互作用且觸發其信號傳導而引起細胞死亡，吾人分離出人類CD4+及CD8+ T細胞，並且用CD3、CD28及/或抗IL4、IL-12誘導進行細胞分化。CD25作為人類T細胞早期活化標記物。碘化丙錠(propidium iodide；PI)染色用來評估細胞死亡狀況。藉由FACS分析，發現抗人類TIM-3抗體8C11不會誘導T細胞死亡。 如圖6A及圖6B中所示，抗TIM-3抗體8C11會產生類似於對照組抗體mIgG及抗TIM-3 2E2之彼等作用。此觀測結果推測，抗體8C11不會誘導人類CD4+ T細胞死亡。此外，如圖6C及圖6D中所示，抗TIM-3抗體8C11亦不會誘導人類CD8+ T細胞死亡，此等結果顯示出如同對照組抗體mIgG及單株抗體2E2類似的模式。 因此，8C11可與TIM-3結合但不會觸發由TIM-3介導之信號傳導路徑。如上文所提及，8C11可阻斷半乳糖凝集素-9與TIM-3之間的相互作用。因此，8C11可作為治療TIM-3介導之疾病或病狀的治療劑，但沒有誘導T細胞衰竭的顧慮。 實例7：TIM-3上之抗原決定基 為了確定與抗體結合之抗原決定基，在小鼠單株抗體存在及不存在下，藉由使用經胃蛋白酶消化之片段及HDX MS方法量測重組蛋白中之氫-氘交換。 將重組蛋白(15 pmol)及蛋白-抗體複合物(15 pmol：10 pmol)以1:10的比例在交換緩衝液(於PBS中之99.9% D2 O，pH 7.4)中稀釋，以便在室溫下引發HD交換。在7個時間點(10s、30s、60s、300s、600s、1200s、4800s)，取出等分試樣(各2 pmol之靶蛋白)且與預先冷卻之淬滅緩衝液混合(最終濃度成1 M鹽酸胍、150 mM參(2-羧乙基)膦及0.5%甲酸)。 緊接著將淬滅之混合物加載至自製胃蛋白酶管柱上進行線上消化。隨後將經消化之肽混合物加載至逆相管柱(Zorbax 300SB-C18，0.3×5 mm；Agilent Technologies, Wilmington ,DE , USA)上。去鹽肽隨後在自製管柱(LiChrospher 5 μm，75 μm內徑,長度10 cm)上使用8%-95% HPLC緩衝液(99.9%乙腈/0.1%甲酸/0.025%三氟乙酸)之線性梯度以0.5 μl/分鐘之流動速率分離持續10分鐘。 LC設備連線至藉由Xcalibur 2.2軟體(Thermo Fisher, San Jose, CA, USA)運作之2D線性離子阱質譜儀(Orbitrap Classic; Thermo Fisher, San Jose, CA, USA)。在Orbitrap中歷經350 - 1,600 Da之範圍且在m/z 400處以60,000之解析度進行全掃描MS。使用[Si(CH3 )2 O]6 H+ 之離子信號以m/z 536.165365作為鎖定質量進行內部校準。電噴灑電壓設為0.2 kV，且毛細管之溫度設為200℃。MS及MS/MS自動增益控制設為1,000 ms (全掃描)及120 ms (MS/MS)，或對於最大累積時間或離子分別為2×106 離子(全掃描)及3×103 離子(MS/MS)。 使用Proteome Discoverer軟體(版本1.4，Thermo Fisher Scientific)進行肽鑑定。針對單個蛋白資料庫使用SEQUEST搜尋引擎搜尋MS/MS譜。以肽鑑定而言，完整肽質量的質量公差(mass tolerance)設為20 ppm，而CID片段離子設為0.5 Da。隨後以高信賴度及搜尋引擎等級1之肽鑑定為基礎篩選肽譜匹配(Peptide-spectrum match；PSM)，以確保總體錯誤發現率低於0.01。 對於HDX概況分析，以靶蛋白鑑定之LC-MS/MS結果製造出肽鑑定模板。隨後將模板預載於安裝在MATLAB中之ExMS模組內。HDX之MS譜經加載及分析以計算出對於各肽所併入氘之數目，隨後以兩個獨立實驗之氘併入的平均數表示。 將重複HDX-MS實驗之可再現性結果選擇出來，以呈現出HDX概況。在肽序列RKGDVSL (SEQ ID NO: 9，TIM-3上之殘基87-93)及EKFNLKL (SEQ ID NO: 10，TIM-3上之殘基119-125)中發現兩個抗原決定基區域，與小鼠單株抗體不存在下相比，在該抗體存在下時顯示具有較低之氘併入(圖7A及7B)。 圖7A顯示在抗體存在及不存在下，肽片段(RKGDVSL (SEQ ID NO: 9)中氘併入隨時間變化之關係的函數。與抗體不存在下相比，當抗體存在下的併入速率顯著較慢，表示此肽片段在抗體結合時受保護免於溶解。亦即，此肽片段與抗體結合有關。 圖7B顯示在抗體存在及不存在下，肽片段EKFNLKL (SEQ ID NO: 10)中之氘併入隨時間變化之關係的函數。與抗體不存在下相比，在抗體存在下之併入速率顯著較慢，表示此肽片段在抗體結合時受保護免於溶解。亦即，此肽片段與抗體結合有關。 根據以上實驗，發現單株抗體8C11之結合抗原決定基定係位於跨越RKGDVSL (SEQ ID NO: 9)與EKFNLKL (SEQ ID NO: 10)之區域。為了確認此等區域包括結合單株抗體8C11之抗原決定基並研究在此等區域內對於結合單株抗體8C11而言重要的殘基，吾人進行此等區域中之丙胺酸掃描。 圖7C中所示之結果確認結合單株抗體8C11之抗原決定基實際上係位於此等區域中。此外，從丙胺酸掃描之結果顯示殘基90 (D90A)及121 (F121A)處之丙胺酸取代會消除單株抗體8C11與TIM-3之結合。相反地，殘基88 (K88A)、117 (N117A)、119 (E119A)及120 (K120A)處之丙胺酸取代則不會消除單株抗體2E28C11與TIM-3之結合。此等結果顯示殘基D-90及F-121對於單株抗體8C11與TIM-3結合具關鍵性。 實例8：抗TIM-3抗體8C11調節人類T細胞之IFN-γ及TNF-α分泌 衰竭T細胞無法產生適當免疫反應之重要因子，諸如TNF-α及IFN-γ。為了測試本發明之抗TIM-3抗體是否能夠促進T細胞產生此等因子，所以進行以下實驗。人類CD4或CD8 T細胞經抗體處理或未經抗體處理，並用CD3/CD28動態珠刺激3天。隨後收集上澄液以便進一步多重分析。結果顯示處理組中IFN-γ或TNF-α之分泌會增加。與抗TIM-3單株抗體2E2處理組相比，使用抗TIM-3單株抗體8C11之處理組顯示實質上增加更多。 圖8A顯示經過抗TIM-3單株抗體8C11處理會增強人類T細胞之IFN-γ分泌。圖8B顯示經過抗TIM-3單株抗體8C11處理會增強人類T細胞之TNF-α分泌。此等結果表示本發明抗體可用於預防或逆轉T細胞衰竭，藉此增強正常免疫反應。 實例9：編碼8C11單株抗體之基因的選殖 編碼8C11 單株抗體之基因之選殖係根據下文所描述之方法進行。儘管以下步驟可能陳述特定病狀及參數，熟習此項技術者應理解此僅為用於說明本發明之實施例的實例，且在不悖離本發明範疇的情況下，其他修飾及變化形式是有可能性的。 抗體基因之cDNA選殖及製備 將融合瘤培養在已確知成分的培養基中。當細胞數達到約10x106 個細胞/毫升時，以離心採集細胞，接著根據說明手冊添加TRIzol套組以提取總RNA。根據供應商之說明手冊，使用小鼠Ig-引子組選殖抗體cDNA之可變區。將5微克之總RNA為模板、50 ng/ml隨機引子及10 µM dNTP混合在PCR管內之DEPC水中，以製備出第一股cDNA。 將反應混合物在65℃下培育5分鐘，且隨後放置在冰上。輕輕地混合10 µl cDNA合成混合物，其含有2 µl 10x RT緩衝液、4 µl 25 mM MgCl2 、2 µl DTT、1 µl 4單位RNaseOUT及1 µl 200單位SuperScript III RT且藉由短暫離心加以聚集。反應管在25℃下培育10分鐘，隨後在50℃下培育50分鐘。在85℃下加熱5分鐘終止反應，接著將管置於冰上冷卻。反應管經短暫離心以收集反應產物，並且添加1 µl RNase H，且將混合物在37℃下培育20分鐘。 具有5 µl cDNA、5 µl 10倍濃度反應緩衝液、1 µl 10 mM dNTP混合物、1 µl 2.5單位Taq聚合酶及1 µl正向及反向引子之組成物加入再蒸餾水製成最終體積為50 µl之反應混合物，並進行PCR反應。為了擴增抗體輕鏈及重鏈，94℃是第一步，接著將94℃維持30秒、55℃維持30秒及72℃維持1分鐘，循環重複30次。在反應循環之後，最終步驟為72℃維持10分鐘。反應混合物以2%瓊脂糖凝膠進行分析。將具有預測分子量之產物接合至選殖載體中，接著測定核苷酸序列。 根據序列資訊，使用ExPASY轉譯工具將抗體序列轉譯成蛋白序列。所得抗人類TIM-3抗體8C11之序列包含重鏈胺基酸序列及輕鏈序列。此等序列中之互補決定區(CDR)藉由Kabat等人, Sequences of proteins of immunological interest, 第五版, NIH出版91-3242, Bethesda Md. (1991), 第1-3卷之方法確定。 圖1描繪8C11抗體可變重鏈區(SEQ ID NO: 1)及輕鏈區(SEQ ID NO: 2)之胺基酸序列。所示者是構架區(FR1、FR2、FR3及FR4)及CDR (HCDR1 SEQ ID NO: 3、HCDR2 SEQ ID NO: 4、HCDR3 SEQ ID NO: 5、LCDR1 SEQ ID NO: 6、LCDR2 SEQ ID NO: 7及LCDR3 SEQ ID NO: 8)。 實例10：異種移植動物模型說明抗人類TIM-3抗體8C11之腫瘤生長抑制能力 腫瘤生長常常與T細胞衰竭有關。T細胞衰竭會導致免疫反應降低，此讓癌細胞未受制止性地生長。因為發現抗TIM-3抗體可逆轉T細胞衰竭或使T細胞衰竭狀況降至最低，例如阻斷半乳糖凝集素-9/TIM-3結合及增強T細胞之IFN-γ及TNF-α分泌，因此此等抗體可能可以預防或減緩癌細胞之生長。為了測試這個，進行以下實驗。 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlwjl /YckNarl小鼠(5至6週齡)以腹膜內方式(i.p.)注射0.5×106 人類新鮮PBMC，且在實驗第0天經皮下(s.c.)注射含於50 µL PBS中之總共106 個A375人類黑素瘤細胞。小鼠經抗TIM-3單株抗體(每次注射為5 mg/kg之8C11)、抗hPD-L1單株抗體(每次注射為8 mg/kg)、Combo (每次注射為5 mg/kg之抗TIM-3 (8C11) 加上抗8 mg/kg 之hPD-1 )，或鹽水對照組處理。 小鼠在第0、2、4天以腹膜內注射方式投與抗TIM-3抗體，且在第0、3、6、9、12天投與抗PD-L1抗體。每天監測存活小鼠及異種移植物抗宿主反應達28天。處死出現異種移植物抗宿主疾病(xGVHD)之臨床症狀的動物(＞15%體重減輕、駝背姿勢、活動性降低、脫毛、呼吸急促)，且記錄存活之終點。在第25天處死小鼠且取出皮下腫瘤，經稱重，並且經處理以便用於免疫組織化學(IHC)及FACS分析。 結果顯示截至第21天，僅以抗人類TIM-3抗體8C11處理會降低腫瘤生長約30%，而僅以抗hPD-L1處理會降低腫瘤生長約20%。然而，與抗hPD-L1之組合處理會使腫瘤生長降低約70%。此等結果表示在抑制腫瘤細胞生長上，抗TIM-3抗體比抗PD-L1抗體更有效。更重要地，此等結果顯示抗人類TIM-3抗體8C11與抗hPD-L1之組合處理存在著協同作用。因為PD-1及TIM-3係被認為與T細胞衰竭有關之兩個主要受體，僅以抗TIM-3抗體處理或與抗PD-1抗體共同處理都可用於對抗T細胞衰竭，且因此抗TIM-3抗體可用以治療與免疫抑制(T細胞衰竭)有關之疾病或病狀。 本發明之一些實施例係關於本發明抗體用於治療與TIM-3所介導之T細胞衰竭有關的疾病或病症之用途。此等疾病包括癌症，諸如肺癌、乳癌、胰臟癌、肝癌、結腸直腸癌或前列腺癌。根據本發明之實施例，用於治療此類癌症之方法包含向有需要之個體投與有效量之本發明抗體。有效量為實現治療所需之量。熟習此項技術者應理解有效量將視疾病、患者(年齡、重量)、劑型、投與途徑等而定。熟習此項技術者能夠在無需過度實驗之情況下確定有效量。可以任何適合之方式投藥，包括注射，諸如皮下注射、肌肉內注射、靜脈內注射、腹膜內注射等。 雖然已根據數量有限之實施例描述本發明，但受益於本發明之熟習此項技術者將瞭解，可設計出未脫離如本文所揭示之本發明範疇的其他實施例。因此，本發明之範疇應僅受所附申請專利範圍限制。
圖1顯示，根據本發明之一個實施例，單株抗人類TIM-3抗體8C11之重鏈及輕鏈可變區的序列。互補決定區(CDR)序列係以粗體及加底線的序列呈現。構架序列係分散在CDR序列之間且側接CDR序列。 圖2顯示不同抗人類TIM-3抗體之結合活性。此等結果總結鼠類抗體8C11及其他TIM-3結合抗體之結合數據。 圖3A及圖3B顯示，在FACS分析中單株抗體8C11分別與人類CD4或CD8 T細胞結合。此等結果顯示8C11能夠結合CD4+及CD8+ T細胞。 圖4A顯示人類TIM-3-hFc重組蛋白(Tim3誘餌受體)不能結合經半乳糖凝集素-9(Galectin-9)轉染前的F293細胞。圖4B顯示FACS分析中人類TIM-3-hFc重組蛋白可結合經半乳糖凝集素-9轉染之F293細胞。圖4C顯示抗人類TIM-3抗體8C11可阻斷TIM-3-hFc與半乳糖凝集素-9之結合(抗人類TIM-3抗體8C11可跟TIM-3-hFc競爭與半乳糖凝集素-9之結合)。 圖5顯示抗人類TIM-3抗體8C11可阻斷半乳糖凝集素-9與人類CD4 T細胞之結合，藉此減少細胞凋亡。 圖6A-6B顯示TIM-3單株抗體8C11不會誘導人類CD4+ T細胞死亡。圖6C-6D顯示TIM-3單株抗體8C11不會誘導人類CD8+ T細胞死亡。 圖7A及圖7B係顯示HDX-MS研究之結果，該研究是量測在沒有或有抗人類TIM-3抗體存在下，肽片段的氫及氘交換速率。在抗體之存在或不存在下，對人類TIM-3之胞外結構域的肽片段進行HDX。經過HDX的肽隨後用MS對氘交換之程度進行分析。此等結果顯示，抗人類TIM-3抗體會優先與TIM-3中之兩個肽區域結合，此表示抗原決定基位於此等兩個區域中。圖7C顯示，在與單株抗體結合之TIM-3抗原決定基區域中所進行的定點突變作用(site-directed mutagenesis)對與單株抗體8C11結合所造成影響的分析結果。 圖8A顯示抗TIM-3單株抗體8C11會增強人類T細胞之IFN-γ分泌。圖8B顯示抗TIM-3單株抗體8C11會增強人類T細胞之TNF-α分泌。 圖9顯示抗人類TIM-3抗體8C11之治療性應用。利用動物模型，抗人類TIM-3抗體8C11經證明可以抑制黑色素瘤生長。當該治療與抗-PD-L1抗體組合使用時，會因為協同作用讓此治療效果甚至更顯著。

Claims (11)

  1. 一種抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(T-cell immunoglobulin domain and mucin domain 3；TIM-3)抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段能夠結合抗原決定基，該等抗原決定基位於TIM-3中具有RKGDVSL(SEQ ID NO：9)之序列的區域及具有EKFNLKL(SEQ ID NO：10)之序列的區域，且其中該抗體或該結合片段包含具有以下互補決定區(complementarity determining region；CDR)序列之重鏈可變域：HCDR1為SEQ ID NO：3、HCDR2為SEQ ID NO：4及HCDR3為SEQ ID NO：5，以及具有以下CDR序列之輕鏈可變域：LCDR1為SEQ ID NO：6、LCDR2為SEQ ID NO：7及LCDR3為SEQ ID NO：8。
  2. 如請求項1之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段之解離常數(Kd)為10nM或低於10nM。
  3. 如請求項1之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段能夠經由TIM-3調節人類免疫細胞活性。
  4. 如請求項1之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該重鏈包含SEQ ID NO：1之序列。
  5. 如請求項1之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該輕鏈包含SEQ ID NO：2之序列。
  6. 如請求項1之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該重鏈包含SEQ ID NO：1之序列且該輕鏈包含SEQ ID NO：2之序列。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該抗體或其結合片段能夠誘導T細胞分泌包含IFN-γ及/或TNF-α之細胞介素。
  8. 如請求項7之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段，其中該抗體為單株抗體。
  9. 一種用於治療癌症之醫藥組合物，其中該醫藥組合物包含如請求項1至6中任一項之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段。
  10. 如請求項9之醫藥組合物，其中該癌症為肺癌、乳癌、胰臟癌、肝癌、結腸直腸癌或前列腺癌。
  11. 一種用於診斷癌症之方法，其包含：使來自測試個體之樣本與如請求項1至6中任一項之抗人類T細胞免疫球蛋白結構域及黏蛋白結構域3(TIM-3)抗體或其結合片段反應，以確定該抗體或其結合片段與樣本中T細胞之間結合之程度；其中該結合程度大於參考值表示癌性病狀。
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Akashi K. TIM-3 Is a Novel Therapeutic Target for Eradicating Acute Myelogenous Leukemia Stem Cells in Innovative Medicine: Basic Research and Development (Nakao K, Minato N, Uemoto S, editors, Springer, Tokyo, 2015 , P307-314 Sánchez-Fueyo et al: Tim-3 inhibits T helper type 1–mediated auto- and alloimmune responses and promotes immunological tolerance. Nat Immunol 2003; 4: 1093-1101 Sabatos et al: Interaction of Tim-3 and Tim-3 ligand regulates T helper type 1 responses and induction of peripheral tolerance. Nat Immunol 2003; 4: pp. 1102-10 Wang et al. Microglia activity modulated by T cell Ig and mucin domain protein 3 (Tim-3). Cell Immunol. 2015;293(1):49-58. Hou et al., T-Cell Immunoglobulin- and Mucin-Domain-Containing Molecule 3 Signaling Blockade Improves Cell-Mediated Immunity Against Malaria. J Infect Dis. 2016 Nov 15;214(10):1547-1556. *
Hou et al., T-Cell Immunoglobulin- and Mucin-Domain-Containing Molecule 3 Signaling Blockade Improves Cell-Mediated Immunity Against Malaria. J Infect Dis. 2016 Nov 15;214(10):1547-1556.
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