TWI662127B - 增加琥珀醯基－ｃｏａ衍生化合物之生產的方法 - Google Patents

Abstract

本發明有關於一種藉由一真核細胞改善琥珀醯基-CoA衍生化合物之生產的方法。這個方法可有利地被使用在例如己二酸的生物生產。

Description

增加琥珀醯基-COA衍生化合物之生產的方法 發明領域

這個發明有關於一種藉由一真核細胞(eukaryotic cell)改善一琥珀醯基-CoA衍生化合物(succinyl-CoA derived compound)之生產的方法。再者，本發明有關於一種藉由該方法而可獲得的被轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA連接酶(succinyl-CoA ligase)的聚核苷酸之經工程化的真核細胞以及一種包含有培養該經工程化的真核細胞生產己二酸(adipic acid)或己二酸酯(adipic acid ester)或己二酸硫酯(adipic acid thioester)的方法。本發明亦有關於一包含有一能夠轉化一己二酯(adipic ester)、己二酸酯或己二酸硫酯成為5-甲醯基戊酸酯(5-formylpentanoate)的酵素之經工程化的真核細胞以及一種藉由培養該細胞生產5-甲醯基戊酸酯的方法。本發明亦有關於一包含有一能夠轉化5-甲醯基戊酸酯成為6-胺基己酸(6-amino caproic acid)的酵素之經工程化的真核細胞和一種藉由培養該經工程化的細胞生產6-胺基己酸的方法以及一種從該6-胺基己酸生產己內醯胺(caprolactam)的方法。

發明背景

琥珀醯基-輔酶A(succinyl-coenzyme A)是一必需的中間物在許多代謝途徑中，並且是一關鍵前驅物在許多(工業相關的)貴重化合物[諸如脂肪酸、類胡蘿蔔素(carotenoids)、類異戊二烯(isoprenoids)、維生素(vitamins)、胺基酸、脂肪、蠟酯(wax esters)、(多)醣、聚羥基烷酯(polyhydroxyalkanoates)、斯達汀(statins)、聚酮(polyketides)]中。特別地，琥珀醯基-CoA亦是工業上重要大量的化學己二胺(hexamethylene diamine)與己二酸的前驅物。

此等琥珀醯基-CoA-衍生化合物的一生物合成生產途徑可天然地存在於一微生物中，但是為了產生一功能性生物合成途徑，該微生物通常必須被工程化(例如藉由導入編碼特殊酵素的基因)。

當天然的(野生型)細胞不能夠生產感興趣的琥珀醯基-CoA-衍生化合物時，代謝工程的使用可提供給真核細胞表現可支持此一方法的異源基因(heterologous genes)。在此等例子中，異源基因產物通常被標靶至細胞的細胞溶質隔間(cytosolic compartment)。因為一琥珀醯基-CoA-衍生化合物的生物合成將完全地或部分地發生在細胞的細胞溶質(cytosol)，在細胞溶質隔間中供應足夠數量的前驅物琥珀醯基-CoA是重要的。在真核生物中，琥珀醯基-CoA的生物合成主要發生在粒線體。琥珀醯基-CoA是三羧酸(tricarboxylic acid)或克氏循環(Krebs cycle)的一中間物。2種酵素在粒線體中產生並且使用琥珀醯基-CoA。α-酮戊二酸去氫酶複合物(alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex)生產琥珀醯基-CoA，並且在一後續反應中琥珀醯基-CoA藉由一可逆的琥珀醯基-CoA接合酶酵素被轉化成琥珀酸，引起ATP(或GTP)產生。在工業相關的真核微生物中，已沒有琥珀醯基-CoA形成在粒線體外的實例。在血紅素(haem)生物合成中，例如，第一步驟涉及琥珀醯基-CoA與甘胺酸至胺基酮戊酸(aminolevulinate,ALA)的反應。由於琥珀醯基-CoA的位置，這個步驟發生在粒線體，並且ALA接著被運送至後續的酵素反應將發生的細胞溶質內。

發明的一目標是增加一琥珀醯基-CoA衍生化合物在一真核細胞中的生產。

發明之詳細說明

在一第一方面，本發明提供一種藉由一能夠生產一琥珀醯基-CoA衍生化合物的真核細胞改善一琥珀醯基-CoA衍生化合物之生產的方法，其包含有以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸轉形該細胞。

除非另有指明，如此處所用的術語“一(a)”或“一(an)”被定義為“至少一者”。

當提及一呈單數的名詞(例如一化合物、一細胞等等)時，複數被意指要被包括。

當提及一酸(例如己二酸)時，共軛鹼或鹽類亦被包括。

“一琥珀醯基-CoA接合酶”被定義為一可包含有一、二或更多個可各個由一不同的基因所編碼的單體的多肽。例如，來自大腸桿菌的琥珀醯基-CoA接合酶由2個分別由sucC與sucD基因所編碼的單體a與b構成。同樣地，來自啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)的琥珀醯基-CoA接合酶亦由2個分別由lsc1與lsc 2基因所編碼的單體a與b構成。因此，“一”編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸”亦被瞭解包含有複數個聚核苷酸(諸如二、三或更多個聚核苷酸)編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的實例。

術語“多肽”、“胜肽(peptide)”以及“蛋白質(protein)”在此可被交換地使用以意指胺基酸殘基的一聚合物。該等術語適用於一或多個胺基酸殘基是一對應的天然發生的胺基酸的一人工化學類似物之胺基酸聚合物以及天然發生的胺基酸聚合物。天然發生的胺基酸的此等類似物的必要性質是當被併入至一蛋白質內時，那個蛋白質是特別地與相同蛋白質但完全地由天然發生的胺基酸構成所引起的抗體反應。術語“多肽”、“胜肽”以及“蛋白質”亦包含有修飾，包括但不限於糖化作用(glycosylation)、脂質附著(lipid attachment)、硫酸化(sulfation)、麩胺酸殘基的γ-羧化作用(gamma-carboxylation)、羥化作用(hydroxylation)以及ADP-核糖苷化作用(ADP-ribosylation)。

如此處所用的，術語“酵素”被定義為一在一細胞中催化一(生物)化學反應的蛋白質。

如此處所用的，術語“聚核苷酸”包括涉及一呈單或雙股形式的去氧核糖核苷酸(deoxyribonucleotide)或核糖核苷酸(ribonucleotide)聚合物，並且除非另有限制，包含具有天然核苷酸的必要性質的已知類似物(它們以一相似於天然發生的核苷酸的方式雜合至單股核酸)(例如，胜肽核酸)。一聚核苷酸可以是一天然的或異源的結構或調節基因的全長或一子序列。除非另有指示，該術語包括涉及特殊序列以及它們的互補序列。

術語“同源的(homologous)”或“內生的(endogenous)”當被使用以指示在一特定(重組)核酸或多肽分子與一特定宿主生物或宿主細胞之間的關係時，被了解意指在本質上該核酸或多肽分子藉由一宿主細胞或相同物種(特別是相同的變種或菌株)的生物所生產。

術語“異源的(heterologous)”當被使用關於一核酸(DNA或RNA)或蛋白質意指一不是天然發生有如它存在的生物、細胞、基因組或DNA或RNA序列的一部分或者在不同於它被天然發現的一細胞或基因組或DNA或RNA序列的位置之核酸或蛋白質。異源的核酸或蛋白質不是它被導入的細胞內生的，但是已從另一細胞而被獲得或者被合成地或重組地生產。

如此處所用的，術語“基因”意指一含有一關於一核酸聚合酶(在酵母菌中，RNA聚合酶II)的模板的核酸序列。基因被轉錄成mRNA，接著被轉譯成蛋白質。

為了增加被導入的蛋白質在依據本發明的方法的一真核酵母菌細胞中呈活化形式被表現的可能性，對應的編碼核苷酸序列可針對被選擇的酵母菌宿主細胞所具者而被改造以最佳化它的密碼子使用。數種關於密碼子最佳化的方法是本技藝所熟知。一針對依據本發明的真核細胞最佳化該等核苷酸序列的密碼子使用的較佳方法是如在WO2008/000632所描述的密碼子對最佳化技術(codon pair optimization technology)。密碼子對最佳化是一種用於在一宿主細胞中生產一多肽的方法，其中該等編碼該多肽的核苷酸序列已關於它們的密碼子使用而被修飾(特別是被使用的密碼子對)以獲得該編碼該多肽的核苷酸序列的經改善的表現和/或該多肽的經改善的生產。

通常，一編碼一蛋白質的核苷酸序列被可操作地連接至一引起在依據本發明的酵母菌細胞中的對應核苷酸序列的足夠表現的啟動子以給予該細胞生產一種二羧酸的能力。

如此處所用的，術語“可操作地連接”意指聚核苷酸要素(或者編碼序列或核酸序列)在一功能性關係中的一連結。一核酸序列是“可操作地連接”，當它與另一個核酸序列被放入至一功能性關係中。例如，一啟動子或增強子(enhancer)被可操作地連接至一編碼序列，若它影響該編碼序列的轉錄。

如此處所用的，術語“啟動子”意指一座落在該基因的轉錄起始位置的轉錄方向的上游起作用控制一或多個基因的轉錄，並且藉由一針對DNA-依賴的RNA聚合酶的結合位址的存在而被結構地鑑定的核酸片段，轉錄起始位址以及任何其他序列被一熟習此技藝者所知曉。一“組成(constitutive)”啟動子是一在大多數環境與發展條件下有活性的啟動子。一“可誘發的(inducible)”啟動子是一在環境或發展調節下有活性的啟動子。

一可被使用以達到一編碼一蛋白質的核苷酸序列的表現的啟動子對於編碼要被表現的蛋白質的核苷酸序列可以不是天生的，亦即一啟動子對於它可被操作地連接的核苷酸序列(編碼序列)是異源的。較佳地，該啟動子是同源的，亦即對該宿主細胞內生性的。

在酵母菌細胞中適合的啟動子是熟習此技藝者所知曉的。適合的啟動子可以是，但不限於TDH1、TDH3、GAL7、GAL10、GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PH05、ADC1、ACT1、TRP1、URA3、LEU2、ENO1、TPI1。其它適合的啟動子包括PDC1、GPD1、PGK1以及TEF1。

通常一編碼一蛋白質的核苷酸序列包含有一終止子(terminator)。任何在細胞中作用的終止子可被使用在本發明。較佳的終止子是從該宿主細胞的天然基因而被獲得。適合的終止子序列是本技藝所熟知。較佳地，此等終止子被組合以預防在本發明的宿主細胞中反義調節的mRNA衰敗的突變(參見例如：Shirley et al.,2002,genetics 161:1465-1482)。

申請人已驚訝地發現：當該細胞已被轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸時，藉由一能夠生產一琥珀醯基-CoA衍生化合物的真核細胞生產一琥珀醯基-CoA衍生化合物相較於一不被轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸的細胞是較高的。在本發明的上下文中，“一琥珀醯基-CoA衍生化合物的生產”被定義為每發酵培養基的體積琥珀醯基-CoA衍生化合物的數量。為了建立一真核細胞的一琥珀醯基-CoA衍生化合物的生產在轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸後相較於一沒有已被轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸的真核細胞的一琥珀醯基-CoA衍生化合物的生產是否被改善，發酵條件(特別是對於2種細胞的發酵長度)較佳地相似的甚至更佳地實質上相同的或甚至有利地完全相同的。較佳地該等發酵條件被選擇藉此琥珀醯基-CoA衍生化合物的數量增加上達完成發酵。

在說明書的上下文中，“琥珀醯基-CoA接合酶”被定義為一能夠可逆的偶合輔酶A與琥珀酸的酵素。

在一具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶屬於酵素E.C.6.2.1.5或E.C. 6.2.1.4的酵素種類。該EC酵素種類是一酵素根據由生物化學與分子生物學的國際協會的命名委員會(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology,NC-IUBMB)所提供的酵素命名法(Enzyme Nomenclature)而被分類或可被分類的種類，此命名法可在http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/被發現。沒有已被(尚未)分類在一特殊分類但可如此而被分類的其他適合的酵素被意指要被包括。

在一較佳具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶在該細胞溶質或該細胞中是有活性的。琥珀醯基-CoA-衍生化合物的生物合成可完全地或部分地發生在該細胞溶質。琥珀醯基-CoA接合酶的胺基酸序列可包含有一標靶信號，例如一過氧化體的(peroxisomal)或粒線體的標靶信號。一熟習此技藝者可知道方法以決定蛋白質的位置，例如，如在Emanuelsson et al. 2007. Nature Protocols 2: 953-971所描述的。結果該琥珀醯基-CoA接合酶包含有一標靶信號，該在依據本發明的方法中的真核細胞包含有該酵素的一截短形式可為較佳的，其中該標靶信號被移除。刪除標靶信號可使該蛋白質位於該細胞溶質，這可導致該琥珀醯基-CoA-衍生化合物的增加生產。

該琥珀醯基-CoA接合酶可包含有任何適合的接合酶並且可衍生自任何生物。該生物可以是一真核生物、細菌或一古細菌(archeon)。

在一具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶是衍生自一真核生物，更佳地自釀母菌屬(Saccharomyces)[例如啤酒酵母菌(S. cerevisae)]。一適合的真核生物的琥珀醯基-CoA接合酶可由啤酒酵母菌基因LSC1和/或LSC2和/或它們的同源物所編碼。

在另一個具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶是原核生物的，亦即衍生自一細菌或古細菌，更佳地來自大腸桿菌。以一編碼一酵母菌(諸如酵母菌屬)琥珀醯基-CoA接合酶替代一原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸轉形一能夠生產一琥珀醯基-CoA衍生化合物的真核細胞在一些例子中不可導致改善一琥珀醯基-CoA衍生化合物的生產。一適合的原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶可由大腸桿菌基因sucC和/或sucD以及它們的同源物所編碼。

在一特別的具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶.可包含有一含有SEQ ID 15和/或16和/或含有SEQ ID 17和/或18和/或它們的同源物的胺基酸序列。此等琥珀醯基-CoA接合酶可例如由分別地包含有SEQ ID 1和/或2或包含有SEQ ID 3與4和/或它們的同源物的核苷酸序列所編碼。熟習此技藝者亦能夠根據普通一般的知識建構這些序列的功能性類似物(可被使用作為一替代)。

在一較佳具體例中，該琥珀醯基-CoA接合酶包含有一含有SEQ ID 15和/或16和/或它們的同源物的胺基酸序列。此琥珀醯基-CoA接合酶可例如由分別地包含有SEQ ID 1和/或2和/或它們的同源物的聚核苷酸序列所編碼。熟習此技藝者亦能夠根據普通一般的知識建構這些序列的功能性類似物(可被使用作為一替代)。

術語“同源物(homologue)”在此特別被使用於具有一至少30%、較佳地至少40%、更佳地至少60%、更佳地至少65%、更佳地至少70%、更佳地至少75%、更佳地至少80%、特別地至少85%、更特別地至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列相同性的聚核苷酸或多肽。術語同源物亦被意指包括由於基因密碼的變質(degeneracy)以及編碼相同的多肽序列而不同於另一種核酸序列的核酸序列(聚核苷酸序列)。

序列相同性在此被定義為一如由比較該等序列所決定的在2或更多胺基酸(多肽或蛋白質)序列或者2或更多核酸(聚核苷酸)序列之間的關係。通常，序列相同性或相似性在所比較的序列的全長上被比較。在本技藝中，“相同性”視情況亦意指如由在成串的此等序列之間的相配所決定的在胺基酸或核酸序列之間的關係度。

測定相同性的較佳方法被設計以提供在所試驗的序列之間的最大相配。測定相同性與相似性的方法被編纂在公眾可獲得的電腦程式中。在2個胺基酸序列之間或在2個核苷酸序列之間的百分比相同性可使用尼德曼與溫施演算法(Needleman and Wunsch algorithm)(Needleman,S. B. and Wunsch,C. D.(1970) J. MoI. Biol. 48,443-453)(在此被併入本案以作為參考資料)而被測定。胺基酸序列與核苷酸序列這兩者可藉由演算法而被比對。該尼德曼-溫施演算法已在電腦程式NEEDLE中被執行。為了這個發明的目的，來自EMBOSS套裝軟體的NEEDLE程式被使用(版本2.8.0或更高，EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite(2000) Rice,P. LongdenJ. and Bleasby,A. Trends in genetics 16,(6) pp 276-277,http://emboss.bioinformatics.nl/)，在此被併入本案以作為參考資料)。針對蛋白質序列，EBLOSUM62被使用於代替矩陣(substitution matrix)。針對核苷酸序列，EDNAFULL被使用。所使用的選擇性參數是一為10的空白-開放懲罰(gap-open penalty)以及一為0.5的空白擴展懲罰(gap extension penalty)。熟習此技藝者將意識到：當使用不同的演算法時，所有這些不同的參數將產生些微不同的結果但是2個序列的總百分比相同性沒有顯著地被改變。

在本發明的上下文中，“一琥珀醯基-CoA衍生產物”被瞭解包括可藉由一包括琥珀醯基-CoA的生物合成途徑序列或藉由一包括一或更多生物化學步驟的生產方法而被生產的任何產物。該途徑不需被限制至一生物功能。例如，WO2009/113853(在此被併入本案以做為參考資料)描述一能夠生產一琥珀醯基-CoA衍生產物的微生物，該微生物已被轉形以編碼一生物合成途徑的部分以生產尤其是己二酸(在本發明的上下文中是一琥珀醯基-CoA衍生化合物)的酵素的聚核苷酸。在這個生物合成途徑中，己二酸藉由偶合乙醯基-CoA(acetyl-CoA)與琥珀醯基-CoA繼而許多後續的酵素反應而被形成。然而，己二酸的生產可不是該生物合成途徑的一生物功能。除了己二酸之外，此琥珀醯基-CoA衍生產物的實例包括脂肪酸(fatty acids)、類胡蘿蔔素(carotenoids)、類異戊二烯(isoprenoids)、維生素(vitamins)、胺基酸、脂質、蠟酯(wax esters)、(多)醣[(poly)saccharides]、聚羥基烷酯(polyhydroxyalkanoates)、斯達汀(statins)、聚酮(polyketides)以及血紅素(haem)。在一較佳具體例中，該琥珀醯基-CoA衍生化合物是己二酸。

適合的真核細胞可特別地被選自於下列群組：真菌(fungi)；後生動物(metazoan)；植物界(Viridiplantae)[特別是阿拉伯芥(Arabidopsis)以及衣藻目(Chlamydomonadales)]；雙滴蟲目(Diplomonads)[特別是賈第蟲屬(Giardiinae)]；內阿米巴科(Entamoebidae)[特別是內阿米巴屬Entaboeba]；眼蟲門(Euglenozoa)[特別是眼蟲屬(Euglena)]；泥生目(Pelobiontida)[特別是根足鞭毛藻屬(Mastigamoeba)]；以及囊泡蟲類(Alveolata)[特別是隱胞子蟲屬(Cryptosporidium)]。

適合的真菌特別包括選自於在下列群組之中的真菌以及酵母菌：根黴菌屬(Rhizopus)、紅黴菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、麴菌屬(Aspergillus)、瘤胃真菌(Piromyces)、毛芽胞菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克鲁维酵母菌屬(Kluyveromyces)、酵母菌屬、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)[諸如解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lypolytica)]。

在一較佳具體例中，該真核細胞是酵母菌，更佳地啤酒酵母菌。相較於細菌(諸如大腸桿菌)，酵母菌提供一非常適合的選擇以生產上面所提及的琥珀醯基-CoA衍生產物，因為由於酵母菌-為基礎的方法可在低pH下運行，酵母菌不易感於噬菌體或其他感染。因此，酵母菌的使用不需要一無菌方法，藉此降低感興趣的產物的成本價格。

真核細胞的轉形可藉由本技藝已知的方法而被做出，例如如由R. D. Gietz and R. H. Schiestl,High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method(2007),Nature Protocols 2,31-34所描述的。

在一第二方面，本發明提供一可由一依據本發明的第一方面的方法獲得的被轉形以一編碼一琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸經工程化的真核細胞。依據本發明的第二方面的經工程化的真核細胞較佳地適合於生產一或更多的酵素，藉此一琥珀醯基-CoA衍生化合物可在一生物合成途徑中被生產。一此一生物合成途徑是一己二酸生物合成途徑。因此，在另一個具體例中，第二方面發明的經工程化的真核細胞進一步包含有一己二酸生物合成途徑(較佳地一CoA依賴己二酸生物合成途徑)。

一依據本發明的第二方面的經工程化的真核細胞在此被定義為一含有或者被轉形或遺傳修飾以一不是在真核細胞中天然發生的核苷酸序列的細胞，或者它含有內生的核酸序列的額外複本(copy)或複本(copies)，或者它包含有一內生的核酸序列的一刪除或破壞。一野生型真核細胞在此被定義為重組真核細胞的親代細胞。

一具有一核苷酸序列的基因修飾在此被使用以指示一基因或一核苷酸序列藉由任何可獲得的方式而被導入至一(真核)細胞。一核苷酸序列或基因可依據本技藝的任何方法而被製備，例如萃取自一生物或藉由化學方式而被合成。

己二酸生物合成途徑較佳地包含有一選自於由下列所構成的群組的酵素：一能夠醯基基團轉移的酵素[諸如例如一巰解酶(thiolase)]、一能夠催化一2,3-烯酸酯部分(2,3-enoate moiety)或一2-烯醯基部分(2-enoyl moiety)的一碳-碳雙鍵的還原的酵素(如例如一烯醯基還原酶)、一能夠催化一3-羥基醯基酯(3-hydroxyacyl ester)或3-羥基醯基硫酯(3-hydroxyacyl thioester)脫水成為一2-烯醯基酯(2-enoyl ester)或硫酯的酵素[諸如例如一脫水酶(dehydratase)]、一能夠催化一羰基基團(carbonyl group)還原成一醇基團(alcohol group)或能夠催化一3-氧基醯基酯(3-oxoacyl ester)或3-氧基醯基硫酯(3-oxoacyl thioester)還原成對應的3-羥基醯基酯或硫酯的酵素[諸如一酮還原酶(ketoreductase)或一去氫酶]，以及一能夠轉化一己二酸酯或己二酸硫酯成為己二酸的酵素[諸如一醯基-CoA轉移酶(acyl-CoA transferase)或一醯基-CoA水解酶(acyl-CoA hydrolase)]。

在一特別的具體例中，該巰解酶是一β-酮己二醯基巰解酶(beta-ketoadipyl CoA thiolase)[例如來自不動菌屬(Acinetobacter)]。此巰解酶可包含有可包含有一含有SEQ ID 20和/或它的一同源物的序列。此巰解酶例如由一包含有該含有SEQ ID 9的序列之基因所編碼。

在一特別的具體例中，該烯醯基還原酶是一烯醯基-CoA還原酶[例如來自熱帶念珠菌(Candida tropicalis)]。它可包含有一含有SEQ ID 23和/或它的一同源物的序列。

在一特別的具體例中，該脫水酶是一烯醯基-CoA脫水酶，例如來自不動菌屬。此脫水酶可包含有一含有SEQ ID 22和/或它的一同源物的序列。此脫水酶例如由一包含有該含有SEQ ID 11的序列之基因所編碼。

在一特別的具體例中，該酮還原酶或去氫酶包含有一含有SEQ ID 21和/或它的一同源物的序列。此酮還原酶或一去氫酶例如由一包含有該含有SEQ ID 10的序列之基因所編碼。

在一特別的具體例中，該醯基-CoA轉移酶包含有一含有SEQ ID 24和/或25和/或它們的一同源物的序列。此醯基-CoA轉移酶例如由一包含有該含有分別地SEQ ID 13和/或14的序列之基因所編碼。

在一第三方面，本發明提供一種生產己二酸或己二酸酯或己二酸硫酯的方法，其包含有培養依據本發明的第二方面的經工程化的真核細胞。

在一第四方面，依據本發明的第二方面的經工程化的真核細胞進一步包含有一能夠轉化一己二酯、己二酸酯或己二酸硫酯成為5-甲醯基戊酸酯的酵素。

在一第五方面，本發明提供一種生產5-甲醯基戊酸酯的方法，其包含有培養依據本發明的第四方面的經工程化的真核細胞。

在一第六方面，本發明提供一進一步包含有一能夠轉化5-甲醯基戊酸酯成為6-胺基己酸的酵素之依據本發明的第四方面的經工程化的真核細胞。

在一第七方面，本發明提供一種生產6-胺基己酸的方法，其包含有培養依據本發明的第六方面的經工程化的真核細胞。

在一第八方面，本發明提供一種生產己內醯胺的方法，其包含有根據依據本發明的第七方面的方法製備6-胺基己酸以及環化6-胺基己酸，藉此形成己內醯胺。

實施例 1.材料與方法

寡核苷酸藉由Invitrogen(Carlsbad CA,US)而被合成。DNA定序在SEQLAB(Gttingen,Germany)或藉由Baseclear(Leiden,The Netherlands)而被執行。DNA合成在GeneArt(Regensburg,Germany)或DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)被進行。限制酵素由Invitrogen或New England Biolabs所供應。被使用於轉形的菌株是依據由廠商所提供的規程的大腸桿菌DH10B electromax勝任細胞(Invitrogen)。所有核苷酸是被最佳化用於在酵母菌中轉形的密碼子。

2.產生用於在啤酒酵母菌整合載體中的己二酸生產的基因表現盒(gene expression cassettes)

被使用在這個實施例的所有DNA片段從DNA2.0(Menlo Park,CA,USA)或Geneart被訂購作為合成的DNA。下列DNA分子被使用：編碼一不動菌屬巰解酶(SEQ ID 9)、一不動菌屬酮還原酶(SEQ ID 10)、一不動菌屬脫水酶(SEQ ID 11)、一熱帶念珠菌(Candida tropicalis)烯醯基還原酶(SEQ ID 12)以及一不動菌屬醯基-CoA轉移酶(SEQ ID 13以及14)的DNA。所有DNA分子(10 μg)使用限制酵素SapI而被限制。所欲的DNA片段產生啟動子-基因-終止子盒並且使用QiaQuick Gel Extraction Kit(Qiagen,Hilden,Germany)而被純化離開瓊脂糖凝膠(agarose gel)。再者，載體骨架pRS414(SEQ ID 6，Trp1篩選標記)、pRS415(SEQ ID 7，Leu2篩選標記)以及pRS416(SEQ ID 8，Ura3篩選標記)由DNA2.0所合成。3種所獲得的載體以限制酵素XhoI與NotI而被消化。線性化的載體類似於純化自瓊脂糖凝膠的途徑表現盒。

3.產生啤酒酵母菌表現質體以及以己二酸途徑基因轉形啤酒酵母菌

除了超過一片段被插入在該載體之外，在啤酒酵母菌中的活體內同源重組如在Kazuko Lida,Tomoko Tada,Hidetoshi Iida,Molecular cloning in yeast by in vivo homologous recombination of the yeast putative al subunit of the voltage-gated calcium channel(2004),FEBS Letters,vol. 576,291-296所描述的而被實質地做出。最終的表現載體藉由轉形線性化的DNA片段而被組合。所有轉形以菌株啤酒酵母菌CENPK2-1C(基因型MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ 1；MAL2-8^C；SUC2)而被做出。為了建構質體pADI154，線性化的載體骨架SEQ ID 6以及關於基因adi21(SEQ ID 9)、adi 22(SEQ ID 10)和adi23(SEQ ID 11)的表現盒被共轉形。類似的，為了產生質體pADI155，線性化的載體骨架SEQ ID 7組合以基因adi8(SEQ ID 12)、adi24(SEQ ID 13)和adi25(SEQ ID 14)的表現盒而被使用。

轉形體被放置在Yeast Nitrogen Base(YNB) w/o AA(Difco)+2%葡萄糖+添加化合物以克服剩餘的營養缺陷(auxotrophies)(添加白胺酸與組胺酸用於產生pADI154，以及添加色胺酸與組胺酸用於組合pADI155)。在液體培養基中的培養使用Verduyn培養基而被進行(C. Verduyn,E. Postma,“Effect of Benzoic Acid on Metabolic Fluxes in Yeasts: A Continuous-Culture Study on the Regulation of Respiration and Alcoholic Fermentation”,(1992) Yeast.,vol. 8,501-517)。當轉形體根據篩選生長而被鑑定時，在啤酒酵母菌中的質體使用ZymoResearch Yeast Plasmid Isolation Kit(ZymoResearch Corporation,USA)而被分離。因此所獲得的質體隨後被轉形在大腸桿菌Top10或XL1-blue細胞中，並且隨後被純化離開大腸桿菌。這個步驟確保一高品質的質體DNA。最後，該等質體被定序以確保僅正確的DNA序列被轉形並且被使用於進一步的研究。經定序以及確認的質體pAdDI154和pADI155被再轉形在啤酒酵母菌菌株中。該等菌株藉由分離單一菌落而被再畫線(restreak)和純化。該等菌株被再畫線在如該等轉形體最初被放置者的相同類型的盤上。單一菌落被培養在24微滴定盤的下列培養基(Verduyn,1992)中：(NH4)2SO4，5 g；KH2PO4，3 g；MgS04‧7H2O，0.5 g；EDTA，15 mg；ZnS04‧7H2O，4.5 mg；CoCl2‧6H2O，0.3 mg；MnCl2‧4H20，1 mg；CuSO4‧5H2O，0.3 mg；CaCl2‧2H20，4.5 mg；H3BO3，1 mg；KI，0.1 mg；以及0.025 ml聚矽氧消泡劑(silicone antifoam,BDH)。經濾膜-殺菌的維生素在這個培養基的熱殺菌(20℃)之後被添加。每升的最終維生素濃度為：生物素(biotin)，0.05 mg；泛酸鈣(calcium pantothenate)，1 mg；菸鹼酸(nicotinic acid)，1 mg；肌醇(inositol)，25 mg；硫胺素HCl(thiamine HCl)，1 mg；吡哆醇HCl(pyridoxine HCl)，1 mg；以及對胺苯甲酸(para-aminobenzoic acid)，0.2 mg。對於第一生物質相，(72小時)，4%半乳糖被添加，對於生產相(96小時)8%半乳糖與1%碳酸鈣被添加。上澄液被分離並且使用LC-MS在己二酸含量上予以分析。

下列的LCMS條件被應用：管柱，Waters Acquity UPLC HSS T3,1.8 μm,30 mm*2.1 mm；流速，1 mL/min；溫度，60℃。質譜法(Mass spectrometry) ESI在負模式。移動相A：0.1%配於水的甲酸(formic acid)。注射體積5 μl，全循環。移動相B：配於乙腈的0.1%甲酸。

梯度：

己二酸在0.98洗提時間下從管柱被洗提。己二酸生產被呈現在表1(雙重的菌落)。

表1.　己二酸生產

4.以己二酸途徑基因轉形啤酒酵母菌包括以編碼琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸轉形

質體pADI156藉由在線性化的載體pRS416骨架SEQ ID 8與關於基因sucC(SEQ ID 1)、sucD(SEQ ID 2)(sucC和sucD是內生性大腸桿菌基因)和Lin1129[SEQ ID 5；Lin1129對應於一編碼乙醛去氫酶的來自英諾克李斯特菌(Listeria innocua)的基因]的表現盒之間重組而被建構。SEQ ID 1、2、5和8被共轉形在啤酒酵母菌CENPk2-1c(基因型MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ 1；MAL2-8^C；SUC2)。質體pADI156從啤酒酵母菌被分離並且序列被證明。質體pADI164藉由使用標準的限制位址選殖從pADI156移除Lin1129表現盒而被建構並且被再轉形在啤酒酵母菌CENPk2-1c中。所形成的轉形體含有所有3種質體pADI154、pADI155以及pADI164。Verduyn培養基[含有色胺酸、尿嘧啶(uracil)以及白胺酸，視存在的營養缺陷而定]被使用作為用於轉形的培養基。當所有3種質體pADI154、pADI155以及pADI164被轉形，3種化合物沒有被添加。該菌株被培養並且培養液的上澄液如在實施例3所描述的而被分析己二酸生產。

質體pADI157藉由線性化的載體pRS416骨架(SEQ ID 8)以及關於基因Lsc1(SEQ ID 3),Lsc2(SEQ ID 4)與Lin1129(SEQ ID 5)的表現盒而被建構。Lin1129對應於一編碼乙醛去氫酶的來自英諾克李斯特菌基因。Lsc1與Lsc2是內生性酵母菌屬基因。該啤酒酵母菌琥珀醯基-CoA接合酶是位在粒線體。為了使啤酒酵母菌琥珀醯基-CoA接合酶位於細胞溶質，啤酒酵母菌琥珀醯基-CoA接合酶次單體(subunits)的粒線體標靶序列(MTS)被移除。由LSC1與LSC2基因所編碼的蛋白質的MTS的長度依據Emanuelsson et al. 2007. Nature Protocols 2: 953-971使用非植物生物族群(non-plant organism group)由TargetP 1.1伺服器(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)所預測。該Lsc1蛋白質的MTS是24個胺基酸在N-端。該Lsc 2蛋白質的MTS是30個胺基酸在N-端。隨後，兩者蛋白質的MTS(除了N-端甲硫胺酸之外)被移除，導致分別由seq ID 17與18所表示的蛋白質序列。載體pRS416以及SEQ ID 3、4和5被共轉形在啤酒酵母菌CENPk2-1c(基因型MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ 1；MAL2-8^C；SUC2)。質體pADI157從啤酒酵母菌被分離並且序列被證明。質體pADI165藉由使用標準的限制位址選殖從pADI157移除Lin1129表現盒而被建構並且被再轉形至啤酒酵母菌CENPk2-1c中。所形成的轉形體控制所有3種質體pADI154、pADI155以及pADIS165。Verduyn培養基(含有色胺酸、尿嘧啶以及白胺酸，視營養缺陷而定)被使用作為一用於轉形的培養基。當所有3種質體pADI154、pADI155以及pADI165被轉形時，3種化合物沒有被添加。該菌株被培養並且培養液的上澄液如在實施例3所描的而被分析己二酸生產。己二酸生產被呈現在表2中。

表2.　己二酸生產

驚訝地，懷有己二酸途徑基因並且被轉形以酵母菌琥珀醯基-CoA Lsc1與Lsc2的菌株沒有比未被轉形以Lsc1與Lsc2的菌株生產更多的己二酸。然而，當該等酵母菌細胞被轉形以原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶基因sucC與sucD，己二酸的生產被改善。

<110>　DSM智慧財產有限公司

<120>　增加琥珀醯基-COA衍生化合物之生產的方法

<130>　27896-WO-PCT

<160>　25

<170>　PatentIn版本3.5

<210>　1

<211>　1168

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　sucC

<400>　1

<210>　2

<211>　871

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　sucD

<400>　2

<210>　3

<211>　922

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　Lsc1

<400>　3

<210>　4

<211>　1198

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　Lsc2

<400>　4

<210>　5

<211>　1407

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　Lin1129

<400>　5

<210>　6

<211>　4788

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　pRS414

<400>　6

<210>　7

<211>　6021

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　pRS415

<400>　7

<210>　8

<211>　4898

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　pRS416

<400>　8

<210>　9

<211>　1207

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　DcaF

<400>　9

<210>　10

<211>　1519

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　DcaH

<400>　10

<210>　11

<211>　787

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　DcaE

<400>　11

<210>　12

<211>　1096

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　ETR1

<400>　12

<210>　13

<211>　673

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　DcaI

<400>　13

<210>　14

<211>　676

<212>　DNA

<213>　人工DNA

<220>

<223>　DcaJ

<400>　14

<210>　15

<211>　388

<212>　PRT

<213>　大腸桿菌胺基酸序列

<400>　15

<210>　16

<211>　289

<212>　PRT

<213>　大腸桿菌胺基酸序列

<400>　16

<210>　17

<211>　306

<212>　PRT

<213>　啤酒酵母菌胺基酸序列

<400>　17

<210>　18

<211>　398

<212>　PRT

<213>　啤酒酵母菌胺基酸序列

<400>　18

<210>　19

<211>　469

<212>　PRT

<213>　英諾克李斯特菌胺基酸序列

<400>　19

<210>　20

<211>　401

<212>　PRT

<213>　不動菌屬物種(Acinetobacter sp.)(菌株ADP1)胺基酸序列

<400>　20

<210>　21

<211>　505

<212>　PRT

<213>　不動菌屬物種(菌株ADP1)胺基酸序列

<400>　21

<210>　22

<211>　261

<212>　PRT

<213>　不動菌屬物種(菌株ADP1)胺基酸序列

<400>　22

<210>　23

<211>　364

<212>　PRT

<213>　熱帶念珠菌胺基酸序列

<400>　23

<210>　24

<211>　223

<212>　PRT

<213>　不動菌屬物種(菌株ADP1)胺基酸序列

<400>　24

<210>　25

<211>　224

<212>　PRT

<213>　不動菌屬物種(菌株ADP1)胺基酸序列

<400>　25

Claims (15)

1. 一種經工程化的真核細胞，其係以一編碼原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶的聚核苷酸轉形，其中該真核細胞屬真菌之物種，其中該原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶在該經工程化的真核細胞的細胞溶質中是有活性的，其中該經工程化的真核細胞進一步包含一用於生產琥珀醯基-CoA衍生化合物的生物合成途徑，其中該生物合成途徑包含引進編碼生產該琥珀醯基-CoA衍生化合物之酵素的基因，以及該琥珀醯基-CoA衍生化合物之生物合成生產係完全地或部分地發生在該經工程化的真核細胞之細胞溶質中。
2. 如申請專利範圍第1項的經工程化的真核細胞，其中該真菌之物種為一酵母菌之物種。
3. 如申請專利範圍第1項的經工程化的真核細胞，其中該真菌之物種為一釀母菌屬(Saccharomyces)、根黴菌屬(Rhizopus)、紅黴菌屬(Neurospora)、青黴菌屬(Penicillium)、麴菌屬(Aspergillus)、瘤胃真菌(Piromyces)、毛芽胞菌屬(Trichosporon)、念珠菌屬(Candida)、漢遜氏酵母菌屬(Hansenula)、克鲁维酵母菌屬(Kluyveromyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、或耶氏酵母屬(Yarrowia)之物種。
4. 如申請專利範圍第3項的經工程化的真核細胞，其中該釀母菌屬之物種為一啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，且其中該耶氏酵母屬之物種為一解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lypolytica)。
5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的經工程化的真核細胞，其中該原核生物的琥珀醯基-CoA接合酶包含SEQ ID：15和/或16和/或其等之同源物的胺基酸序列。
6. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的經工程化的真核細胞，其中該生物合成途徑係己二酸生物合成途徑。
7. 如申請專利範圍第6項的經工程化的真核細胞，其中該己二酸生物合成途徑包含有一選自於由下列所構成的群組的酵素：一能夠將醯基基團轉移的酵素、一能夠催化2,3-烯酸酯(2,3-enoate)部分或2-烯醯基(2-enoyl)部分的碳-碳雙鍵的還原的酵素、一能夠催化3-羥基醯基酯或3-羥基醯基硫酯脫水成為2-烯醯基酯或硫酯的酵素、一能夠催化羰基基團還原成醇基團或能夠催化3-側氧醯基酯或3-側氧醯基硫酯還原成對應的3-羥基醯基酯或硫酯的酵素，以及一能夠轉化己二酸酯或己二酸硫酯成為己二酸的酵素。
8. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的經工程化的真核細胞，其中該生物合成途徑係5-甲醯基戊酸酯生物合成途徑。
9. 如申請專利範圍第8項的經工程化的真核細胞，其中該5-甲醯基戊酸酯生物合成途徑包含一能夠轉化己二酯、己二酸酯或己二酸硫酯成為5-甲醯基戊酸酯的酵素。
10. 如申請專利範圍第1至4項中任一項的經工程化的真核細胞，其中該生物合成途徑係6-胺基己酸生物合成途徑。
11. 如申請專利範圍第10項的經工程化的真核細胞，其中該6-胺基己酸生物合成途徑包含一能夠轉化5-甲醯基戊酸酯成為6-胺基己酸的酵素。
12. 一種生產己二酸的方法，其包含培養如申請專利範圍第6或7項的經工程化的真核細胞。
13. 一種生產5-甲醯基戊酸酯的方法，其包含培養如申請專利範圍第8或9項的經工程化的真核細胞。
14. 一種生產6-胺基己酸的方法，其包含培養如申請專利範圍第10或11項的經工程化的真核細胞。
15. 一種生產己內醯胺的方法，其包含依據如申請專利範圍第14項的方法製備6-胺基己酸以及環化6-胺基己酸，藉此形成己內醯胺。