TWI661832B - 仙草萃取物於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種仙草萃取物於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途，該萃取物係萃取自仙草(Mesona procumbens Hemsl.)，藉由其中仙草乙醇萃取物、仙草多醣萃取物及其複方，促進傷口癒合的速度，可應用於改善糖尿病患者傷口不易癒合的問題，進而降低感染的風險。

Description

仙草萃取物於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途

本發明係關於一種仙草萃取物的用途，尤其是關於一種將仙草萃取物用於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途。

糖尿病係國人十大死因之第五位(衛福部，2016)，其除了增加心血管疾病、腎臟病等慢性病的盛行率外，更會增加感染的風險和死亡機率，因此被世界醫學和公衛專家認為是誘發感染症的可怕殺手，深切地影響國人健康及生活品質。有文獻指出，糖尿病患的一生當中，發生糖尿病足部潰瘍(DFUs)的機率約為10~25%，其將導致非創傷性的下肢截肢。該傷口之所以難以癒合，仍因周邊神經發生病變，使身體保護性感覺減退或喪失，因此當有外傷時，患者經常無法及時察覺，加上容易合併有下肢血管狹窄或阻塞的現象，供應至足部之血流顯著減少，因而較易讓足部增加感染機率，形成癒合不良的傷口或潰瘍，甚至截肢。此外，亦有文獻指出，醣化最終產物(Advanced glycation end products,AGEs)在糖尿病患者體內透過非酵素性的蛋白質醣化而產生，並於糖尿病併發症扮演重要的角色，而傷口不易癒合可能係醣化最終產物所致，在其作用下誘發細胞受損，進而使基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMPs)及其組織抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMPs)的表現調控失衡；目前已知其中的MMP-9及TIMP-1與傷口癒合過程有密切的關聯。

仙草(Mesona procumbens Hemsl.)為唇形科仙草屬一年生草本植物，長期被國人食用且屬於傳統藥用植物之一。已知仙草含有多醣體、黃酮類、 萜類及酚類等成分，過去研究顯示，仙草萃取物具有高抗氧化能力、降血糖、降血壓、保護肝臟、心肌及腎臟等功能，然而至今對於傷口癒合，特別是糖尿病患者傷口癒合的影響，並無相關的研究。

多醣成分在一些文獻中已證實具增強免疫機能，而免疫力降低會延長傷口的癒合。若未能有效控制糖尿病，巨噬細胞的功能會被破壞而減弱免疫反應，將使受感染的風險增大，導致傷口久難癒合，因此糖尿病患者應特別重視傷口照護，以避免更嚴重的後果，此外，若能利用一可促進傷口癒合的組成物，協助加速傷口的縮小，將更能減低糖尿病患者受感染的風險並改善癒後。

本發明目的之一在於提供一種仙草萃取物於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途，藉由醫藥組成物中的仙草萃取物或其複方改善糖尿病病患傷口不易癒合的問題。

在本發明的一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物中的仙草萃取物可利用仙草(Mesona procumbens Hemsl.)經乙醇萃取所獲得。萃取時，可以液固比1：10~30之比例，利用乙醇於24~28℃下萃取約20~28小時。其中，液固比為1：20時為較佳，萃取溫度為25~27℃時為較佳，而萃取時間為約24小時為較佳。

在本發明一實施例的一態樣中，該促進傷口癒合醫藥組成物中的仙草乙醇萃取物其濃度係20~60μg/mL，25~50μg/mL為較佳。

在本發明的另一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物中的仙草萃取物係一萃取自仙草(Mesona procumbens Hemsl.)的仙草多醣萃取物，其係以水萃取後再以乙醇萃取所獲得。萃取時，可以液固比1：10~30之比例，利用水於約119~123℃下萃取約20~30分鐘。其中，液固比為1：10時為較佳，萃取溫度為120~122℃時為較佳，而萃取時間為20分鐘為較佳。所獲得的水萃物乾燥後，再以液固比1：3~5的比例，較佳為1：4，以乙醇萃取而獲得。

本發明一實施例的一態樣中，該促進傷口癒合醫藥組成物中的仙草多醣萃取物其濃度係20~60μg/mL，25~50μg/mL為較佳。

在本發明的再一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物進一步包括白鶴靈芝萃取物，該白鶴靈芝萃取物係利用白鶴靈芝(Rhinacanthus nasutus)經水萃取所獲得。萃取時，可以液固比1：10~30之比例，利用水於約119~123℃下萃取約20~30分鐘。其中，液固比為1：10時為較佳，萃取溫度為120~122℃時為較佳，而萃取時間為約20分鐘為較佳。

在本發明的一實施例中，前述促進傷口癒合醫藥組成物中所含之仙草多醣萃取物與該白鶴靈芝萃取物之比例係0.8~1.2：1.2~0.8，整體濃度約為20~30μg/mL，約25μg/mL時為較佳。

在本發明的一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物係用以降低MIP-2蛋白的表現、降低MMP-9蛋白的表現或提升TIMP-1蛋白的表現。

在本發明的一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物中除仙草乙醇萃取物、仙草多醣萃取物以及仙草多醣與白鶴靈芝複方外，可進一步包括一載劑或其他輔劑。

在本發明的一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物之劑型，可為但不限於液態、固態、半固態或氣霧態。其中，該醫藥組成物為液態時，可包括但不限於：糖漿劑、溶液劑、乳劑、懸浮劑、膠漿劑或乳漿劑；該醫藥組成物為固態時，可包括但不限於：錠劑、顆粒劑、膠囊劑或散劑；或該醫藥組成物為半固態時，可包括但不限於：軟膏劑、凝膠劑。

在本發明的一實施例中，該促進傷口癒合醫藥組成物，亦可進一步添加於食品、保健食品或膳食補充品中。

以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

圖1係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠傷口癒合作用影響於不同傷口開創後天數之比較照片。

圖2係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對糖尿病鼠傷口癒合作用影響於不同傷口開創後天數之比較照片。

圖3係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠以及糖尿病鼠皮膚傷口組織切片之染色(H&E)結果圖。

圖4係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠以及糖尿病鼠皮膚組織中MIP-2蛋白之免疫組織化學染色之結果圖。

圖5係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠以及糖尿病鼠皮膚組織中MMP-9蛋白之免疫組織化學染色之結果圖。

圖6係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠以及糖尿病鼠皮膚組織中TIMP-1蛋白之免疫組織化學染色之結果圖。

萃取物樣本

本發明實施例所使用之仙草樣本其學名為Mesona procumbens Hemsl.，而作為複方組成之白鶴靈芝，其學名則為Rhinacanthus nasutus(購自吉春興業有限公司，彰化，台灣)。

實施例1 仙草乙醇萃取物之製備

取乾燥全株仙草，秤取適當數量後以粉碎機研磨成粉。以液固比1：10~30之比例加入乙醇混合後於室溫下(約24~28℃之間)浸泡約20~28小時進行萃取，萃取液經過濾、減壓濃縮後，使用冷凍乾燥即可取得仙草乙醇萃取物粉末。萃取時，液固比為1：20時為較佳，萃取溫度為25~27℃時為較佳，而萃取時間為約24小時為較佳。

實施例2 仙草多醣萃取物之製備

取乾燥全株仙草，秤取適當數量後以粉碎機研磨成粉。以液固比1：10~30之比例加入去離子水混合後，於約119~123℃下萃取約20~30分鐘。之後進行抽氣過濾，保留濾液，即取得仙草水萃取液。接著，將仙草水萃取液與乙醇以1：3~5之比例混合振盪均勻後離心，之後去除上部乙醇層，將底部沉澱置於37℃烘箱乾燥，即可取得仙草多醣萃取物。製備水萃物時，液固比為1：10時為較佳，萃取溫度為120~122℃時為較佳，而萃取時間為約20分鐘為較佳。後續以乙醇萃取時，乙醇之液固比為1：4時為較佳。

實施例3 白鶴靈芝水萃取物之製備

取乾燥全株白鶴靈芝草，秤取適當數量後以粉碎機研磨成粉。以液固比1：10~30之比例加入去離子水混合後，於約119~123℃下萃取約20~30分鐘。之後進行抽氣過濾，將過濾後萃取液進行冷凍乾燥，即可取得白鶴靈芝水萃物粉末。萃取時，液固比為1：10時為較佳，萃取溫度為120~122℃時為較佳，而萃取時間為約20分鐘為較佳。

實施例4 動物傷口癒合試驗

實施例4-1 糖尿病病動物之動物模式

本發明所利用之動物模式係誘導糖尿病一型的C57BL/6小鼠。首先將所購買之C57BL/6小鼠經一週適應飼養後，分為正常鼠以及誘導產生糖尿病的糖尿病鼠兩組。針對糖尿病鼠組之實驗動物，以每天劑量65mg/kg的鏈脲佐菌素[Streptozotocin，簡稱STZ，溶於0.05M檸檬酸鹽緩衝溶液(Citrate buffer,pH 4.5)中]於腹腔注射一次，連續7天；正常鼠組則注射等體積的檸檬酸鹽緩衝溶液。待7天後，於尾部採血，以血糖儀(羅氏全活力ACCU-CHEK Active)測定實驗動物之禁食(24小時)血糖值，若禁食血糖值大於180mg/dL者則視為誘導成功。

糖尿病鼠誘導成功後，為避免血糖值分佈不均影響的結果差異，將小鼠血糖值再以S型分佈(每組10隻)，使各組間小鼠血糖平均值相當，以排除差異性。後續將於每隻小鼠背部製造兩個左右對稱之傷口，並分別給予不同 的樣品處理。正常鼠組分別包括以：1.生理食鹽水；2.仙草乙醇萃取物-低劑量；以及3.仙草多醣萃取物-低劑量進行處理。糖尿病鼠組則分別包括以：1.生理食鹽水；2.仙草乙醇萃取物-低劑量；3.仙草乙醇萃取物-高劑量；4.仙草多醣萃取物-低劑量；5.仙草多醣萃取物-高劑量；以及6.仙草多醣及白鶴靈芝複方進行處理。

實施例4-2 動物之傷口開創

將前述實施例4-1已確定誘發糖尿病之小鼠及正常鼠進行開創手術，首次開創傷口時利用Avertin(2,2,2-Tribromoethanol+2-Methyl-2-butanol)作為麻醉劑(此為液態)，使用劑量根據每隻小鼠體重換算所需用量，以腹腔注射方式進行。待麻醉藥效開始作用後，輕壓小鼠後腳確認是否有反射動作，若無反射動作則開始以電動剃毛刀逆毛剃除背部毛髮。剃除毛髮後以碘酒及酒精於背部皮膚先後消毒，於頭部及尾部拉起皮膚並在背部中線對折，使用8mm切片打孔機(Integra® Miltex®/33-37)移除背部皮膚，攤平後即為兩個對稱之傷口。

實施例4-3 傷口癒合試驗

於皮膚移除完畢後立即進行止血及消毒，分別依照前述實施例4-1的分組給予不同條件之處理。樣品使用噴劑方式給予，給予體積約為100μL，單方部分，其中低劑量使用之濃度約為25μg/mL，高劑量使用之濃度則約為50μg/mL。仙草多醣與白鶴靈芝複方之濃度比例則以1：1調配成25μg/mL。施予後使用防水敷料(3M Tegaderm)覆蓋傷口，避免外在環境影響傷口，最後再使用網狀繃帶固定。後續傷口清創及更換敷料則利用2%異氟醚(Isoflurane)於氣體麻醉裝置進行吸入麻醉，減低動物清創傷口時之疼痛，並以0.9%生理食鹽水清理傷口。傷口敷料更換頻率為每三天更換一次，並同時進行樣品給予及拍照記錄，藉以評估傷口修復及癒合能力。直到傷口癒合(傷口開創後第15天)即可進行犧牲。傷口癒合之狀況如圖1與圖2之照片所示。圖1係本發明實施例中利用仙草萃取物對正常鼠傷口癒合作用之影響結果。圖2則是對於糖尿病鼠之傷口癒合作用之影響結果。

實施例4-4 傷口面積定量

於每次更換傷口敷料所拍的傷口照片，利用ImageJ定量軟體量化傷口面積，並以初始傷口面積(直徑8mm)為100%，計算後續各天數之傷口 面積百分比，定量結果如下述表1(正常鼠)與表2(糖尿病鼠)。其中，結果數值係利用Statistical Package for Social Science(SPSS)統計軟體進行分析，以ANOVA程式做單因子變異數分析，並以鄧肯多重比較法(Duncan’s multiple-range comparison)進行顯著性差異比較(p<0.05)，結果以means±SEM表示。

由圖1與表1之結果可知，對於正常鼠而言，無論是仙草乙醇萃取物，或是仙草多醣萃取物，於傷口開創後3~15天間，皆有優於控制組(僅施予生理食鹽水)約4~12%傷口面積的減小效果，特別是仙草多醣萃取物於傷口開創3 天後，相較於控制組，有減少高達12%傷口面積的功效。整體上，仙草多醣萃取物對於傷口癒合的效果又優於仙草乙醇萃取物，但二者相較於正常鼠控制組同樣具有較佳之促進傷口癒合之效果。

請繼續參閱圖2與表2，對於誘導產生糖尿病的小鼠而言，以低劑量仙草乙醇萃取物作用時，相較於控制組(僅施予生理食鹽水)，於傷口形成後第9天開始產生傷口癒合的促進效果，於第9~15天間，相較於控制組減少約4~10%的傷口面積。然而，當以高劑量的仙草乙醇萃取物作用，於第3天時，相較於控制組即已產生減少約13%傷口面積的效果，於3~15天間則減少有約5~13%傷口面積的效果，較低劑量的仙草乙醇萃取物之效果為佳。相較之下，以低劑量仙草多醣萃取物作用時，相較於控制組，於3~15天間減少有約4~13%傷口面積，而以高劑量仙草多醣初萃物作用時，則減少有約3.8~13%傷口面積，二者功效接近，且皆於約第9天時相較於控制組可減少約13%面積為較佳。另一方面，以仙草多醣與白鶴靈芝複方作用時，相較於控制組，於3~15天間減少有高達約7~20%傷口面積，其中，於第6~9天時，則有相較於控制組減少高達17~20%傷口面積之效用。

對照圖1、表1與圖2、表2的試驗結果可知，利用本發明實施例之仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物作用於正常鼠與糖尿病鼠時，在傷口癒合之促進效果上相近。然而，糖尿病鼠本身具有傷口癒合困難的情形，但藉由本發明仙草萃取物之作用，可使其接近正常鼠皮膚傷口癒合之作用，而使其較一般未施予仙草萃取物時之傷口癒合之作用顯然為佳。

實施例4-5 組織切片與分析

組織切片係以蘇木素-伊紅進行染色(Haematoxylin-Eosin stain,H&E stain)，觀察術後第15天皮膚組織縱切面之組織病理變化。另外，也進行術後第15天皮膚組織切片的免疫組織化學染色(Immunohistochemistry stain,IHC stain)，檢測與傷口癒合相關因子的表現狀況。

H&E染色法是藉由其中的蘇木素將嗜鹼性結構染成藍紫色，其可與細胞核內的核酸結合，而其中的伊紅則可將嗜酸性結構染成粉紅色，容易與細胞質中的蛋白質結合。

H&E染色係以術後第15天的組織切片進行。取傷口中心區皮膚組織1cm×1cm面積，浸於10%中性福馬林固定一週。之後經組織粗修並分割成小塊後放入包埋盒內脫水一夜，之後進行石蠟包埋、切片，切片完成後烘乾石蠟固定，最後以蘇木素-伊紅染色，並使用顯微鏡觀察並拍照，其結果如圖3所示。由圖3切片染色結果可知，仙草萃取物除了可加速傷口之縮小外，也可促使肉芽組織與再上皮化之程度增加，使傷口癒合更為快速，特別是對於糖尿病鼠而言有極優秀之傷口癒合效果。

另一方面，IHC染色法則是指在抗體上結合螢光或可呈色的化學物質，利用免疫學原理中抗原和抗體間專一性的結合反應，檢測細胞或組織中是否有目標抗原的存在，可用以量測抗原的表現量，也可觀察抗原所表現的位置。

因此，同樣準備術後第15天的組織切片以IHC染色法進行染色，分別進行皮膚潰瘍癒合指標MMP-9蛋白及TIMP-1蛋白與發炎相關激素MIP-2蛋白之分析，其結果如圖4~6所示。

請參閱圖4~6，圖4係本發明實施例中利用不同仙草萃取物對正常鼠以及糖尿病鼠皮膚組織中MIP-2蛋白之免疫組織化學染色之結果圖，圖5係針對MMP-9蛋白，而圖6係針對TIMP-1蛋白。由圖4之結果可知，對於正常鼠而言，低劑量的仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物似乎並不影響MIP-2蛋白的表現，但對於糖尿病鼠而言，在低劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，MIP-2染色數目相較於控制組降低不少，而在高劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，MIP-2染色的數目更為減少，可見仙草萃取物可降低MIP-2蛋白的表現量，因而可緩和發炎的狀況。同樣的，以仙草多醣與白鶴靈芝複方作用，也可顯著降低MIP-2蛋白的表現量。

由圖5之結果可知，對於正常鼠而言，低劑量的仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物似乎並不影響MMP-9蛋白的表現，但對於糖尿病鼠而言，在低劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，MMP-9染色的數目相較於控制組降低不少，而在高劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，MMP-9染色的數目幾乎快要消失，可見仙草萃取物可大幅降低MMP-9蛋白的表 現量，因而也可緩和潰瘍的狀況。同樣的，以仙草多醣與白鶴靈芝複方作用，也具有顯著降低MMP-9蛋白表現量的效果。

此外，由圖6之結果可知，對於正常鼠而言，低劑量的仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物對於TIMP-1蛋白表現的增加雖然沒那麼明顯，但對於糖尿病鼠而言，在低劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，TIMP-1染色的數目相較於控制組增加不少，而在高劑量仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物的作用下，TIMP-1染色的數目增加更多，可見仙草萃取物可提高TIMP-1蛋白的表現量，而進一步抑制MMP蛋白的表現，達到緩和潰瘍的狀況。此結果正好與圖2傷口癒合之促進作用與圖3中皮膚組織之修復效用相呼應。同樣的，以仙草多醣與白鶴靈芝複方作用，也具有增加TIMP-1蛋白表現量的效果。

藉由上述試驗可知，本發明實施例之仙草乙醇萃取物或仙草多醣萃取物以及仙草多醣與白鶴靈芝複方，皆能加速縮小糖尿病鼠之傷口面積，而以H&E染色結果，呈現出能促使肉芽組織及再上皮化程度增加的效果，且由IHC染色中觀察到可降低MIP-2蛋白及MMP-9蛋白的表現，而提升TIMP-1蛋白的表現相對，因此可運用並改善於糖尿病傷口不易癒合的難題。

此外，於製備包含本發明實施例之促進傷口癒合醫藥組成物時，除仙草乙醇萃取物、仙草多醣萃取物或仙草多醣與白鶴靈芝複方外，亦可進一步加入所屬技術領域所熟知之載劑或其他輔劑。而其劑型，可為但不限於液態、固態、半固態或氣霧態。其中，該醫藥組成物為液態時，可包括但不限於：糖漿劑、溶液劑、乳劑、懸浮劑、膠漿劑或乳漿劑；該醫藥組成物為固態時，可包括但不限於：錠劑、顆粒劑、膠囊劑或散劑；或該醫藥組成物為半固態時，可包括但不限於：軟膏劑、凝膠劑。此外，本發明實施例之促進傷口癒合醫藥組成物，亦可進一步添加於食品、保健食品或膳食補充品中。

Claims (6)

1. 一種仙草多醣萃取物於製備促進傷口癒合醫藥組成物之用途，該仙草多醣萃取物係將仙草(Mesona procumbens Hemsl)以水萃取後再以乙醇萃取所獲得。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該仙草多醣萃取物之濃度係20~60μg/mL。
3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該仙草多醣萃取物之濃度係25~50μg/mL。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該促進傷口癒合醫藥組成物進一步包括白鶴靈芝萃取物，該白鶴靈芝萃取物係以水萃取所獲得。
5. 如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該醫藥組成物中所含之仙草多醣萃取物與該白鶴靈芝萃取物之比例係0.8~1.2：1.2~0.8，整體濃度係20~30μg/mL。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該醫藥組成物係用以降低MIP-2蛋白的表現、降低MMP-9蛋白的表現或提升TIMP-1蛋白的表現。