TWI661766B - 以植物產生加蘭他敏的方法 - Google Patents

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TWI661766B
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陳玟吟
楊宗霖
郭詠琪
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Abstract

本發明提供一種以植物產生加蘭他敏(galanthamine)的方法，包括：(a)對一活體植株進行一熱處理，以誘導於其中之加蘭他敏的累積，其中該活體植株為一石蒜科(Amaryllidaceae)植物；以及(b)將該活體植株置於一培養液中，並對該活體植株進行一電刺激處理，以使存在於該活體植株中之該加蘭他敏釋放至該培養液中。

Description

以植物產生加蘭他敏的方法
本發明關於產生加蘭他敏的方法，且特別關於一種以植物產生加蘭他敏的方法，與一種適用於此方法之電刺激處理裝置。
氫溴酸加蘭他敏(galanthamine hydrobromide)於2001年已被美國食品藥物管理局(FDA)批准於治療阿茲海默症(Alzheimer's disease)用藥之一，且已可在22個國家上市。目前氫溴酸加蘭他敏製備方式包括全合成、半合成及植物萃取等。
全合成法至少需8個步驟，且還需複雜純化方法，因此合成成本居高不下。半合成法為氫溴酸加蘭他敏目前之主要供給方式，不過其半和成的前驅物也須來自水仙科及石蒜科植物。而植物萃取方面，如商品料Nivalin主要為取自水仙，然而水仙中加蘭他敏(galanthamine,GAL)含量僅約0.01-0.1%，而此導致後段萃取成本高。儘管其他的石蒜屬植物也可為加蘭他敏原料藥的材料來源，不過由於種球繁殖數低、病害等原因導致野外數量遽減，所以仍不易降低萃取成本。
因此，目前仍亟需一種新穎且低成本之加蘭他敏產生方法。
本發明提供一種以植物產生加蘭他敏(galanthamine)的方法，包括：(a)對一活體植株進行一熱處理，以誘導於其中之加蘭他敏的累積，其中該活體植株為一石蒜科(Amaryllidaceae)植物；以及(b)將該活體植株置於一培養液中，並對該活體植株進行一電刺激處理，以使存在於該活體植株中之該加蘭他敏釋放至該培養液中。
本發明也提供一種電刺激裝置，包括：一槽體；一正電極；一負電極；以及一電位控制器，其中該正電極與負電極為梳狀電極，且該正電極與負電極以直立方式設置於槽體中，並位於相對之兩側，且該正電極與負電極經由分別之導線連接至該電位控制器。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：
100、200‧‧‧電刺激裝置
101‧‧‧槽體
103‧‧‧正電極
103s‧‧‧正電極之支持部
103t‧‧‧正電極之梳齒
105‧‧‧負電極
105s‧‧‧負電極之支持部
105t‧‧‧負電極之梳齒
203‧‧‧正電極
205‧‧‧負電極
107a、107b、207a、207b‧‧‧導線
109、209‧‧‧電位控制器
211‧‧‧上蓋
W‧‧‧梳齒本身的寬度
T‧‧‧梳齒本身的厚度
S‧‧‧各個梳齒間距
M‧‧‧培養液
P、P’‧‧‧活體植株
第1圖顯示，本發明以植物產生加蘭他敏的方法之一實施例中所採用的電刺激裝置100的示意圖。
第2A圖顯示，本發明以植物產生加蘭他敏的方法之另一實施例中所採用的電刺激裝置200的示意圖。
第2B圖顯示，電刺激裝置200之一例子的實際照片。
第3A圖顯示，本發明方法中之熱處理的一實施例，於其中只針對植株之鱗莖以下部分進行水浴加熱。
第3B圖顯示，本發明方法中之熱處理的一實施例，於其中針對植株之全株進行烘箱加熱。
第4圖顯示，於本發明一實施例中，進行鱗莖以下部分加熱之植株與進行全株加熱之植株的加蘭他敏含量。
第5圖顯示，於本發明一實施例中，僅經過熱處理之植株與經過熱處理結合電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量。第0天：馴化完成當天。
第6圖顯示，於一比較例中，無電刺激處理之植株與僅經過電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量。第0天：馴化完成當天。
第7圖顯示，於一比較例中，經過不同化學誘導劑處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量。
本發明提供一種以植物產生加蘭他敏(galanthamine)的方法。上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法可包括下列步驟，但不限於此。
首先，對一活體植株進行一熱處理，以誘導於其中之加蘭他敏的累積，而所述之活體植株可為一石蒜科(Amaryllidaceae)石蒜科植物。
上述石蒜科植物並無特別限制，只要是其可藉由代謝而產生加蘭他敏即可，例如，上述石蒜科植物可包括一石蒜屬(Lycoris)植物、一孤挺花屬(Hippeastrum)植物、一水仙屬(Narcissus)植物等，但不限於此。石蒜屬植物的例子可包括，但 不限於，金花石蒜(Lycoris aurea)、黃花石蒜(Lycoris flavescens)、紅藍石蒜(Lycoris haywardii)、紅花石蒜(Lycoris radiate)等。孤挺花屬植物則可包括孤挺花(Hippeastrum equestre)、白色孤挺花(Hippeastrum hybridum)、朱頂紅皇后(Hippeastrum reginae)、巴西朱頂紅(Hippeastrum brasiliense)、白肋朱頂紅(Hippeastrum reticulatum)等，但不限於此。而水仙屬(Narcissus)植物的例子可包括水仙(Narcissus tazetta)、丁香水仙(Narcissus jonquilla)、黃水仙(Narcissus pseudonarcissus)等，但不限於此。在一實施例中，在本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中，係採用金花石蒜作為上述活體植株。
又，於上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中對於活體植株所進行之熱處理也無特別限制，只要其溫度及/或處理時間不造成所採用之活體植株損傷或死亡即可。例如，上述熱處理之溫度可為約40-60℃，如40℃、50℃、55℃、57℃、60℃等，但不限此，又例如，上述熱處理之時間可為約30-120分鐘，如40分鐘、50分鐘、60分鐘、90分鐘等，但也不限於此。在一實施例中，於上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中，對於活體植株所進行之熱處理之溫度可為約55℃。又，在一實施例中，於上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中，對於活體植株進行熱處理之間可為約60分鐘。在一特定實施例中，於上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中，以約55℃對於活體植株進行熱處理約60分鐘。在另一特定實施例中，於上述本發明之以植物產生加蘭他敏的方法中，以約50℃對於活體植株進行熱處理約90分鐘。
此外，於上述對於活體植株所進行之熱處理的方式 也無特別限制，只要可達成對植物進行加熱之效果即可，例如，可採用烘箱加熱(oven heating)、隔液體加熱(double boiling)、電加熱(electric heating)、微波加熱(microwave heating)等，但不限於此。在一實施例中，上述對於活體植株所進行之熱處理的方式為烘箱加熱。在另一實施例中，上述對於活體植株所進行之熱處理的方式為隔液體加熱。
再者，於本發明以植物產生加蘭他敏的方法中，針對活體植株而言，其受到上述熱處理的部位及/或範圍也無特殊限制，只要針對此部位及/或範圍所進行之熱處理，可以促使加蘭他敏產生及/或累積即可。例如，熱處理可針對活體植株之全株進行或可僅針對活體植物之特定部位或器官進行，但不限於此。在一實施例中，熱處理可針對活體植株之全株進行。在另一實施例中，熱處理可針對活體植株之鱗莖以下的部分進行。
在一特定實施例中，於本發明以植物產生加蘭他敏的方法中，係採用將活體植株之全株置於烘箱進行加熱作為上述針對活體植株所進行之熱處理。
在一實施例中，於上述對活體植株進行熱處理的步驟中，活體植株係被置於一液體中。由於上述液體主要係用於避免及/或降低活體植物於上述熱處理時所可能造成之損傷，因此，只要時具有上述功效之液體，皆可作為熱處理步驟中所採用的液體，並無其他特殊限制。上述液體的例子，可包括，但不限於，水、培養液等，但不限於此。
在另一實施例中，於上述對活體植株進行熱處理的步驟中，可單獨對活體植株進行熱處理而不須伴隨液體存在。
接著，在對活體植株進行熱處理之後，將所述活體植株置於一培養液中，並對上述活體植株進行一電刺激處理，以使存在於活體植株中之加蘭他敏釋放至培養液中。
由於上述培養液主要係用於導電及用於避免及/或降低活體植物於上述電刺激時所可能造成之損傷以達成對活體植物之電刺激，因此，只要時具有上述功效之液體，皆可作為本發明以植物產生加蘭他敏的方法中所採用的培養液，並無其他特殊限制。
在一實施例中，在上述培養液之固體成份中，氮、磷、鉀含量可為約30-55w/w%，例如30w/w%、35w/w%、40w/w%、42w/w%、45w/w%、50w/w%、55w/w%等，但不限於此。
又，在一實施例中，上述培養液的導電度(electrical conductivity)可為約1500-2000μS/cm，例如1500-1800μS/cm、1650-2000μS/cm、1650-1800μS/cm等，但不限於此。在一特定實施例中，上述培養液的導電度可為約1650-1800μS/cm。
再者，上述培養液之pH值，可依據所採用之石蒜科植物所適合生長之pH值而定，例如，上述培養液之pH值可在pH 5-7的範圍內，如，pH 5-6、pH 5.5-6、pH 5.5-6.5、pH 5.8-6.5、pH 6-7等，但不限於此。在一實施例中，上述培養液之pH值可為約pH 5.8。
此外，前述之於上述對活體植株進行熱處理的步驟中，活體植株係被置於一液體中之實施例中所使用作為上述液體的培養液，其成分可與於電刺激處理之步驟中所使用的培養液相同或不同。在一實施例中，前述之於上述對活體植株進行熱處理 的步驟中，活體植株係被置於一液體中之實施例中所使用作為上述液體的培養液，其成分可與於電刺激處理之步驟中所使用的培養液相同。
而在上述熱處理步驟中所使用之培養液的成分與電刺激處理步驟中所使用之培養液的成分相同時，於熱處理步驟之後，可將熱處理步驟中所使用之培養液更換成新的培養液然後再進行電刺激處理，或者於熱處理步驟之後，可將熱處理步驟中所使用之培養液直接作為後續電刺激處理中所使用之培養液，即，於熱處理步驟後，不需更換培養液而直接於相同之培養液對活體植物進行電刺激處理。在一實施例中，於熱處理步驟之後，可將熱處理步驟中所使用之培養液直接作為後續電刺激處理中所使用之培養液。
而上述電刺激處理所施予之電壓為不造成活體植物損傷即可。例如，上述電刺激處理所施予之電壓可為約3-40V，如3V、10V、15V、30V、35V、40V等，但不限此。在一實施例中，上述電刺激處理所施予之電壓可為約30V。
此外，執行上述電刺激處理的時間同樣為不造成活體植物損傷即可，例如可為約1-30分鐘，如2-10分鐘、2-20分鐘、5-10分鐘、5-20分鐘、5-30分鐘等，但不限於此。在一實施例中，執行上述電刺激處理的時間為10分鐘。在另一實施例中，執行上述電刺激處理的時間為20分鐘。
另外，上述電刺激處理的例子，可包括間歇式電刺激(intermittent electrical stimulation)，但不限於此。而上述間歇式電刺激之電源開啟(power-on)之時間可為0.1-300秒，例如， 0.1-30秒、0.1-60秒、0.1-120秒、30-180秒、60-300秒等，但不限於此。而上述間歇式電刺激之電源關閉(power-off)之時間可為約0.1-300秒，例如，0.1-30秒、0.1-60秒、0.1-120秒、30-180秒、60-300秒等，但不限於此。在一實施例中，上述間歇式電刺激可以電源開啟之時間與電源關閉之時間皆為約1分鐘來進行。
而在上述電刺激處理中，一正電極及一負電極與上述培養液接觸，且位於上述活體植株之兩側並與其接觸，或者，一正電極及一負電極可與上述培養液接觸，且位於上述活體植株之兩側但不與其接觸，以對活體植株進行電刺激，但不限於此。
電刺激處理中所使用之正電極與負電極之材料的導電度獨立地可為約100s/cm以上，例如1x102-6x105s/cm，但不限於此。又，正電極與負電極之材料的例子，可獨立地可包括，但不限於白金、石墨、銀、金等。在一實施例中，正電極與負電極之材料皆為白金。
在一實施例中，對上述活體植株所進行之電刺激處理，可由如第1圖所示意之一電刺激裝置所進行。
參見第1圖。第1圖顯示本發明以植物產生加蘭他敏的方法之一實施例中所採用的電刺激裝置100的示意圖。電刺激裝置100具有一槽體101、一正電極103、一負電極105、導線107a與107b與一電位控制器109。正電極103與負電極105為梳狀電極。又，正電極103與負電極105以直立方式設置於槽體101中，並位於相對之兩側。
進行電刺激處理之前，先將培養液M添加於槽體中，並將至少一活體植株P置於槽體內之培養液中。將正電極103經由 導線107a與電位控制器109之正極連接，而負電極105經由導線107b與電位控制器109之負極連接，並對電位控制器109設定所需之電壓。之後，開啟電位控制器109之電源，以開始對至少一活體植株P的電刺激處理。
槽體101之形狀與大小並無特別限制，可視操作需要而定，只要其可以同時容納正電極103、負電極105以及至少一活體植株P與培養液M即可。例如，當處理對象為少量植株時，槽體101可為一小槽體，其可容納少量植株，如1-19個植株，以及正電極103、負電極10與培養液M，而當處理對象為大量植株時，槽體101可為一大槽體，其可容納大量植株，如數十、數百或更多個植株，以及正電極103、負電極10與培養液M，但不限於此。在一實施例中，槽體為一矩形槽體。槽體101之材質可為玻璃、塑膠等，但不限於此。
梳狀之正電極103與負電極105，其導電度與材料可與前方所述之正電極與負電極相同，因此不再於此進行贅述。
又，梳狀之正電極103具有一支持部103s與至少兩個梳齒103t，其中梳齒103t與支持部103s於同一平面上連接並與支持部103s可呈直角，但無特殊限制。同樣地，梳狀之負電極105也具有一支持部105s與至少兩個梳齒105t，其中梳齒105t與支持部105s於同一平面上連接並與支持部105s可呈直角，但也無特殊限制。
由於正電極103與負電極105兩者於外觀結構上相同，因此以下僅以正電極103進行外觀及/或結構之示例說明，以避免贅述。
可視操作需要而定而設置梳齒之數目，並無特殊限制。例如，當處理對象為少量植株時，正電極103可具有較少之梳齒數目，例如2-10個梳齒，而當處理對象為大量植株時，正電極103可具有較多之梳齒數目，例如10-30個梳齒，但不限於此。
而梳狀之正電極103之兩個梳齒之間的間隔S的大小，也無特殊限制，其可依據槽體大小及/或梳齒本身的寬度W及/或厚度T而定。在一實施例中，正電極103之兩個梳齒之間的間隔S的大小可為約0.1-10cm，但不限於此。
相似地，梳狀之正電極103之梳齒103t本身的寬度W及/或厚度T，也無特殊限制，其可依據各個梳齒間隔S的大小及/或槽體大小而定。
此外，在正電極103具有大於2個梳齒的情況下，各個梳齒間隔S可為相同大小，也可為不同大小。在一實施例中，各個梳齒間隔S可為相同大小。
在另一實施例中，對上述活體植株所進行之電刺激處理，可由如第2A圖所示意之一電刺激裝置所進行。
參見第2A圖。第2A圖顯示本發明以植物產生加蘭他敏的方法之另一實施例中所採用的電刺激裝置200的示意圖。電刺激裝置200具有一管狀或柱狀槽體201、一正電極203、一負電極205、導線207a與207b、一電位控制器209與一上蓋211，其中正電極201與203穿過並延伸出上蓋211，而當將上蓋211蓋住槽體201之開口時，正電極203與負電極205進入槽體201中。又，正電極203與負電極205經由導線207a與207b分別連接至電位控制器209之正極與負極。
進行電刺激處理之前，先將上述培養液M添加於槽體並將一活體植株P’置於槽體內之培養液M中。接著，將上蓋211蓋住槽體201之開口以使正電極201與203進入槽體201中。然後，將正電極203經由導線207a與電位控制器209之正極連接，而負電極205經由導線207b與電位控制器209之負極連接，並對電位控制器209設定所需之電壓。之後，開啟電位控制器209之電源，以開始對活體植株P’的電刺激處理。
在一實施例中，槽體201之材質可為玻璃、塑膠等，但不限於此。
正電極203與負電極205，其導電度與材料可與前方所述之正電極與負電極相同，因此不再於此進行贅述。
關於本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，除了上述熱處理與電刺激處理之步驟外，還可視需要而定包含任何於下方敘述之步驟，或其任意組合，但不限於此。
首先，本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，在對上述活體植株進行熱處理之前，還可更包括一對上述活體植株進行馴化的步驟。
上述馴化的時間並無特別限制，只要使上述活體植株可適應液體培養即可。在一實施例中，上述馴化的時間可為約0.5-14天，例如，0.5天、1天、5天、7天、10天、14天等，但不限於此。
上述馴化可包括將上述活體植物培養於一馴化培養液中，但不限於此。而上述馴化培養液的成分可與熱處理步驟中所使用之培養液的成分相同或不同(當在對活體植株進行熱處理 的步驟中，活體植株係被置於一培養液中時)。而在上述馴化培養液的成分與熱處理處理步驟中所使用之培養液的成分相同時，於馴化步驟之後，可將馴化步驟中所使用之培養液更換成新的培養液之後再進行熱處理，或者於馴化步驟之後，可將馴化步驟中所使用之培養液直接作為後續熱處理中所使用之培養液，即，於馴化步驟後，不需更換培養液而直接於相同之培養液對活體植物進行熱處理。在一實施例中，於馴化步驟之後，可將馴化步驟中所使用之培養液直接作為後續熱處理中所使用之培養液。
再來，本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，在將所述活體植株置於一培養液中，並對上述活體植株進行一電刺激處理之後，還可更包括一使上述活體植株進行修復的步驟。
上述使活體植株進行修復的步驟可包括將上述活體植物培養於一修復培養液中，但不限於此。而上述修復培養液的成分可與電刺激處理步驟中所使用之培養液的成分相同或不同。在一實施例中，上述修復培養液的成分可與與電刺激處理步驟中所使用之培養液的成分相同。而在上述修復培養液的成分與電刺激處理步驟中所使用之培養液的成分相同時，於電刺激處理之後，可將活體植物置於一新的培養液以進行修復步驟，或者於電刺激處理之後，可將電刺激處理中所使用之培養液直接作為後續修復步驟中所使用之培養液，即，於電刺激處理後，不需更換培養液而直接使植物於相同之培養液中進行修復。在一實施例中，於電刺激處理之後，將活體植物置於一新的培養液以進行修復步驟。
將使上述活體植株修復之時間並無特別限制，只要 上述活體植株能夠有足夠時間進行修復即可。在一實施例中，將使上述活體植株修復之時間可為約2小時-14天，例如，2小時、4小時、8小時、16小時、0.5天、1天、5天、7天、10天、14天等，但不限於此。
又，本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，在上述之活體植株進行修復的步驟之後，還可更包括依序重複上述之對此活體植株進行熱處理的步驟、上述之將此活體植株置於培養液中並對此活體植株進行電刺激處理的步驟，與上述之使上述活體植株進行修復的步驟，以可多次重複利用一相同之活體植株。
再來，本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，在將所述活體植株置於一培養液中，並對上述活體植株進行一電刺激處理之後，還可更包括從上述培養液收集加蘭他敏的步驟。
從上述培養液收集加蘭他敏的步驟並無特別限制，只要由此所獲得之產物有加蘭他敏即可，例如，可藉由任何分離及/或純化方法，但不限於此。在一實施例中，係藉由將上述培養液進行冷凍乾燥來收集加蘭他敏。
在一實施例中，於本發明以植物產生加蘭他敏之方法中，先將一金花石蒜之活體植株之全株以烘箱加熱，以誘導於其中之加蘭他敏的累積，接著將此金花石蒜之活體植株置於導電度約1650-1800μS/cm的培養液中，並以30V之電壓進行間隔1分鐘(1分鐘通電，1分鐘停止通電(關閉電源))之間歇式電刺激處理共20分鐘，之後收集上述培養液並進行冷凍乾燥，以獲得加蘭他敏。
而於上述實施例中，在將金花石蒜之活體植株進行 烘箱加熱前，可先將金花石蒜之活體植株馴養7天。
藉由本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，可在不傷害植株條件下，重複獲得所需之加蘭他敏。換言之，藉由本發明之以植物產生加蘭他敏的方法，可將植物本身作為生產加蘭他敏之化學工廠，而由此植物化學工廠，可持續產出加蘭他敏。
另外，根據上述，本發明還提供一種電刺激裝置，其可為任何前方所述之電刺激裝置100。電刺激100之相關說明與前方所述相同，因此不於此再進行贅述。
實施例
A.材料
1.活體植株
1.1金花石蒜
1.1.1金花石蒜全株
來源：獲自工業技術研究院組培實驗室
1.2孤挺花
1.2.1孤挺花全株
來源：獲自工業技術研究院組培實驗室
2.培養液
2.1 Peters花多多肥11號5-11-26-TE(水耕養液)
2.1.1製造商
Scotts(美國)
2.1.2培養液配製
將5公克之上述市售之養液粉末加入含1公升水之血清瓶中(調配成200倍稀釋的養液)，並磁石攪拌子放入血清瓶。 將血清瓶置於磁石攪拌儀器上，進行攪拌以使粉末溶解形成培養液。於攪拌20分鐘後，利用鹼性的氫氧化鉀(KOH)進行滴定以將培養液之pH調整至5.8，此pH值為較適合石蒜科植物生長的條件。
所配製出之培養液的導電度(electrical conductivity,EC)為1650-1800μS/cm，且此培養液之固體成份之主要成分，氮、磷、鉀的含量約42%(w/w)。
接著，將配製好的培養液進行高溫高壓滅菌處理15分鐘。之後，將培養液進行冷卻並備用。
2.2 MS培養液(Murashge and Skoog medium)
2.2.1依照一般MS培養液所規定之各成分與其含量進行配製
B.電刺激處理所使用之電刺激裝置的設置
第2A圖顯示於此試驗中所使用之電刺激裝置的示意圖。參見第2圖。首先，提供一電刺激裝置200。電刺激裝置200具有一玻璃槽體(玻璃試管)201、一白金絲之正電極203、一白金絲之負電極205、導線207a與207b、一電位控制器209與一上蓋211，其中正電極201與203穿過並延伸出上蓋211，而當將上蓋211蓋住槽體201之開口時，正電極203與負電極205進入槽體201中。又，正電極203與負電極205經由導線207a與207b分別連接至電位控制器209之正極與負極。於電刺激處理之前，將上方「A.材料」之「2.1.2」所配製之培養液M(導電度(EC)為1650-1800μS/cm、pH 5.8)加入槽體201中。第2B圖顯示於此試驗中所使用之電刺激裝置200的實際照片。
C.適用於活體植株之電刺激處理的電壓的測試
將金花石蒜全株P’置於上述電刺激裝置200中，其中金花石蒜P’之鱗莖以下部分浸泡於上述的培養液中。接著，將上蓋211蓋於玻璃槽體(玻璃試管)201之開口使白金電極末端緊貼於金花石蒜P’之鱗莖兩側(實際照片參見第2B圖)。之後，開始通電，並監測電流變化，以確認適用於活體植株之電刺激的電壓範圍。
結果顯示，當在施予一4.1V之低電壓時，此植株、培養液、與電刺激裝置，即具導電效果，且電流可為0.01安培。而當將電壓調整至30V之高電壓時，電流值也僅上升至0.27安培。因此由此可確認能夠以廣泛之電壓範圍來進行電刺激處理。
D.實施例與比較例
1.實施例1
熱處理誘導植株累積加蘭他敏的確認
方法
1.1植株之鱗莖以下部分加熱
將金花石蒜之活體植株(來源：組培苗(tissue culture seedlings)；培養時間：6個月，鱗莖之球徑：0.8-1cm)，放置於玻璃試管中，並添加RO水，其中RO水只覆蓋至鱗莖。接著，將植株鱗莖以下部分以50℃以水浴加熱90分鐘(加熱範圍：只針對植株之鱗莖以下部分進行水浴加熱)(參見第3A圖)。於加熱完成後，將植株取出，並將整株植株進行萃取，並將全株萃取物進行液相色譜法-質譜聯用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LCMS)分析，以測定全株植株中之加蘭他敏(galahthamine,GAL)含量。
1.2.植株全株加熱
將金花石蒜之活體植株(來源：組培苗；培養時間：6個月，鱗莖之球徑：0.8-1cm)，放置於一試管中，並添加RO水，其中RO水只覆蓋至鱗莖。接著，試管放入50℃烘箱加熱90分鐘(加熱範圍：全株植株)(參見第3B圖)。於加熱完成後，將植株取出，並將整株植株進行萃取，並將全株萃取物進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定全株植株中之加蘭他敏含量。
結果
進行鱗莖以下部分加熱之植株與進行全株加熱之植株的加蘭他敏含量如第4圖所示。
第4圖顯示，相較於控制組(植株於室溫環境，未經加熱處理)，進行鱗莖以下部分加熱的植株與進行全株加熱的植株，其皆具有較高之加蘭他敏含量。進行鱗莖以下部分加熱的植株與進行全株加熱的植株，其加蘭他敏的含量為控制組之1.75-2倍。
又，第4圖也顯示，進行全株加熱的植株其加蘭他敏的含量高於僅進行鱗莖以下部分加熱的植株。
2.實施例2
對金花石蒜進行熱處理或熱處理結合電刺激處理
方法
2.1植株之馴化
將濾紙裁剪後置於圓形玻璃試管(直徑3.5公分)之底部，用以支撐植株。接著，將金花石蒜植株置於試管內，並將30mL之「A.材料」之「2.1.2」所配製之培養液加入試管中。之 後培養植株以進行植株之馴化。於馴化7天後，再對植株進行熱處理與電刺激之實驗。
2.2熱處理
於馴化後，將含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)直接置於55℃烘箱以進行熱處理60分鐘。然後，將玻璃試管中之培養液回收至50mL之塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。接著，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討單獨熱處理對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
2.3熱處理結合電刺激處理
於馴化後，將含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)直接置於55℃烘箱以進行熱處理60分鐘。將作為正電極與負電極之兩條白金線穿過一上蓋並固定於其上。於熱處理後，將具有正電極與負電極的上蓋蓋住含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)的開口以使正電極與負電極進入試管中，並使上蓋與試管開口密合。需注意的是，正電極與負電極於試管中不可互相接觸，且兩電極之末端需置於植株之鱗莖兩側(參見第2A圖或第2B圖)。之後對植株進行間歇式電刺激，即以間歇方式進行通電。具體而言，通電1分鐘後，停止通電1分鐘，之後再重複上述通電與停止通電，以避免電熱效應造成溫度劇烈上升。於重複上述通電方式10次後，將玻璃試管內之培養液回收置一50mL的塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。之後，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討熱處理加上電刺激處理對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
2.4將經過上方步驟2.2與2.3處理的植株置於試管中以新的養液(「A.材料」之「2.1.2」所配製之培養液)繼續進行培養，待7日後，再將上述相同植株分別重複步驟2.2與2.3處理，以確認上述植株於實驗第7日之加蘭他敏釋放量。
2.5再次進行步驟2.4之處理，以確認上述植株於實驗第14日之加蘭他敏釋放量。
結果
僅經過熱處理與經過熱處理結合電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量如第5圖所示。
第5圖顯示，於實驗第0天、第7天與第14天，經過熱處理與電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量皆高於僅經過熱處理之植株。
3.實施例3
對孤挺花進行熱處理結合電刺激處理
方法
3.1植株之馴化
將濾紙裁剪後置於圓形玻璃試管(直徑3.5公分)之底部，用以支撐植株。接著，將孤挺花植株置於試管內，並將30mL之「A.材料」之「2.1.2」所配製之培養液加入試管中。之後培養植株以進行植株之馴化。於馴化7天後，再對植株進行熱處理與電刺激處理之實驗。
3.2熱處理
於馴化後，將含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)直接置於55℃烘箱以進行熱處理60分鐘。然後，將玻璃試管中之培養液回收至50mL之塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。接著，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討單獨熱處理對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
3.3熱處理結合電刺激處理
於馴化後，將含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)直接置於55℃烘箱以進行熱處理60分鐘。將作為正電極與負電極之兩條白金線穿過一上蓋並固定於其上。於熱處理後，將具有正電極與負電極的上蓋蓋住含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)的開口以使正電極與負電極進入試管中，並使上蓋與試管開口密合。需注意的是，正電極與負電極於試管中不可互相接觸，且兩電極之末端需置於植株之鱗莖兩側(參見第2A圖或第2B圖)。之後對植株進行間歇式電刺激，即以間歇方式進行通電。具體而言，通電1分鐘後，停止通電1分鐘，之後再重複上述通電與停止通電，以避免電熱效應造成溫度劇烈上升。於重複上述通電方式10次後，將玻璃試管內之培養液回收置一50mL的塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。之後，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討熱處理加上電刺激處理對於 植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
結果
僅經過熱處理與經過熱處理結合電刺激處理之孤挺花植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量如表1所示。
--：低於檢測線
表1顯示，經過熱處理結合電刺激處理之馴化後孤挺花植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量高於僅經過熱處理之植株。
4.比較例1
馴化後之植株進行電刺激處理與無電刺激之加蘭他敏釋放
方法
4.1植株之馴化
將濾紙裁剪後置於圓形玻璃試管(直徑3.5公分)之底部，用以支撐植株。接著，將金花石蒜植株置於試管內，並將30mL之「A.材料」之「2.1.2」所配製之培養液加入試管中。之後培養植株以進行植株之馴化。於馴化7天後，再對植株進行電刺 激處理與無電刺激之實驗。
4.2無電刺激處理
於馴化後，當天直接將植株試管內之培養液回收至50mL之塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。之後，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討馴化對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
4.3電刺激處理(無進行熱處理)
將作為正電極與負電極之兩條白金線穿過一上蓋並固定於其上。於馴化後將具有正電極與負電極的上蓋蓋住含植株與培養液的試管(保留原培養液，未更換新培養液)的開口以使正電極與負電極進入試管中，並使上蓋與試管開口密合。需注意的是，正電極與負電極於試管中不可互相接觸，且兩電極之末端需置於植株之鱗莖兩側(參見第2A圖或第2B圖)。之後對植株進行間歇式電刺激，即以間歇方式進行通電。具體而言，通電1分鐘後，停止通電1分鐘，之後再重複上述通電與停止通電，以避免電熱效應造成溫度劇烈上升。於重複上述通電方式10次後，將玻璃試管內之培養液回收置一50mL的塑膠離心管中並以-20℃進行冷凍。之後，將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。
將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討馴化後無熱處理，直接進行電刺激處理，對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
4.4將經過上方步驟4.2與4.3處理的植株以新的養 液繼續進行培養於試管中，待7日後，再將上述相同植株分別重複步驟4.2與4.3處理，以確認上述植株於實驗第7日之加蘭他敏釋放量。
4.5再次進行步驟4.4之處理，以確認上述植株於實驗第14日之加蘭他敏釋放量。
結果
僅放置於培養液中進行馴化而無電刺激與馴化後僅經過電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量如第6圖所示。
第6圖顯示，於實驗第7天與第14天，經過電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量皆高於無電刺激之植株。
然而，依據第5圖與第6圖所示之結果可知，經過熱處理與電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量遠高於僅經過電刺激處理之植株。
5.比較例2
植株進行化學誘導劑處理之加蘭他敏釋放
方法
配製含有化學誘導劑(甲殼素(chitin,CA)、水楊酸(salicylic acid,SA)與茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MJ))的MS培養液(化學誘導劑終濃度25μM)。由於化學誘導劑無法進行高溫高壓滅菌，因此於室溫下配製好上述培養液後，再將其於無菌操作台中進行過濾除菌。於空白組中，培養液不含任何藥劑。
選擇鱗莖直徑在0.6-0.8cm之帶葉及根的金花石蒜健 康植株，並將其去除鱗莖表面乾枯之表皮。將上述植株放置於具有含有化學誘導劑之MS培養液的試管中，並以3000-4000Lux照度，搭配光照時間16小時，黑暗時間8小時與環境溫度25-27℃下進行培養。
於培養第0、3、7、14、28與35天分別收培養液30mL。將回收之培養液進行冷凍乾燥以形成粉末。將所獲得之粉末進行液相色譜法-質譜聯用分析，以測定其中之加蘭他敏的含量，以探討上化學刺激處理對於植株產生並釋放加蘭他敏至培養液的影響。
結果
結果如表2與第7圖所示。
-：未檢測
表2與第7圖顯示，以茉莉酸甲酯誘導植株產生與釋 放加蘭他敏之效果最佳。
然而，依據第5圖與第7圖所示之結果可知，經過熱處理與電刺激處理之植株所釋放至培養液中之加蘭他敏的量遠高於僅經過化學誘導劑處理之植株。
整合前述實驗結果可以清楚得知，經過熱處理與電刺激處理之植株，相較於單獨熱處理、單獨電刺激處理或化學誘導劑處理之植株，皆可產生並釋放較大量之加蘭他敏，且因此可以清楚得知熱處理結合電刺激處理，具有在以植物產生加蘭他敏之製程上，具有極佳之協同功效。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

Claims (27)

  1. 一種以植物產生加蘭他敏(galanthamine)的方法，包括：(a)對一活體植株進行一熱處理，以誘導於其中之加蘭他敏的累積，其中該活體植株為一石蒜科(Amaryllidaceae)植物；(b)於該熱處理之後，將該活體植株置於一培養液中，並對該活體植株進行一電刺激處理，以使存在於該活體植株中之該加蘭他敏釋放至該培養液中；以及(c)於該電刺激處理之後，將該活體植株置於一修復培養液中以使該活體植株復原。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該石蒜科植物包括一石蒜屬(Lycoris)植物、一孤挺花屬(Hippeastrum)植物或一水仙屬(Narcissus)植物。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該石蒜屬植物包括金花石蒜(Lycoris aurea)、黃花石蒜(Lycoris flavescens)、紅藍石蒜(Lycoris haywardii)或紅花石蒜(Lycoris radiate)。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該孤挺花屬植物包括孤挺花(Hippeastrum equestre)、白色孤挺花(Hippeastrum hybridum)、朱頂紅皇后(Hippeastrum reginae)、巴西朱頂紅(Hippeastrum brasiliense)或白肋朱頂紅(Hippeastrum reticulatum)。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該水仙屬植物包括水仙(Narcissus tazetta)、丁香水仙(Narcissus jonquilla)或黃水仙(Narcissus pseudonarcissus)。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該熱處理之溫度為40-60℃。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該熱處理之時間為30-120分鐘。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該熱處理之方式包括烘箱加熱(oven heating)、隔液體加熱(double boiling)、電加熱(electric heating)或微波加熱(microwave heating)。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該熱處理係針對該活體植株之全株進行或僅針對該活體植株之鱗莖以下的部分進行。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中於步驟(a)中，該活體植株為置於一液體中。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該液體為該培養液。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該培養液固體成分中氮、磷、鉀含量為30-55w/w%。
  13. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該培養液的導電度(electrical conductivity)為1500-2000μS/cm。
  14. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該培養液的pH值為pH 5-7。
  15. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該電刺激處理所提供之電壓為3-40V。
  16. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該電刺激處理之時間為1-30分鐘。
  17. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該電刺激處理包括間歇式電刺激(intermittent electrical stimulation)。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該間歇式電刺激係以電源開啟(power-on)之時間為0.1-300秒與電源關閉(power-off)之時間為0.1-300秒來進行。
  19. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中於該電刺激處理中，一正電極與一負電極與該培養液接觸並置於上述活體植株之兩側以對活體植株進行電刺激。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該正電極與負電極之材料的導電度為1x102-6x105 s/cm。
  21. 如申請專利範圍第19項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該正電極與負電極之材料獨立地包括白金、石墨、銀或金。
  22. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，於步驟(a)之前，更包括(a’)對該活體植株進行馴化。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該馴化之時間為0.5-14天。
  24. 如申請專利範圍第22項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該馴化包括將該活體植物培養於一馴化培養液中。
  25. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，其中該活體植株置於該修復培養液中2小時-7天。
  26. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，更包括於步驟(c)之後更包括(d)以該活體植物來重複步驟(a)-(c)。
  27. 如申請專利範圍第1項所述之以植物產生加蘭他敏的方法，於步驟(b)之後，更包括(c’)從該培養液收集該加蘭他敏。
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