TWI652067B

TWI652067B - 黏膜疫苗用佐劑

Info

Publication number: TWI652067B
Application number: TW104117890A
Authority: TW
Inventors: 城內直; 藤永由佳子; 油谷雅廣; 菅原庸; 松村拓大
Original assignee: 國立大學法人大阪大學
Priority date: 2014-06-04
Filing date: 2015-06-03
Publication date: 2019-03-01
Also published as: EP3153175B1; WO2015186678A1; EP3153175A1; JPWO2015186678A1; TW201625298A; EP3153175A4; US10226529B2; US20170196970A1; JP6541158B2

Abstract

本發明係以提供對黏膜誘導充分的免疫反應且安全性高的黏膜疫苗用佐劑為課題。

依據本發明，可提供一種黏膜疫苗用佐劑，其包含由肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分的HA1、HA2、及變異HA3所形成的複合體蛋白質。

Description

黏膜疫苗用佐劑

本發明係關於有效且安全的黏膜疫苗用佐劑，以及包含該佐劑與疫苗抗原的黏膜疫苗製劑。

近年來，作為免於流行性感冒、AIDS等之感染症而防禦生物的免疫機構，覆蓋呼吸器官‧消化器官‧生殖器官等的黏膜中的免疫機構正日益明瞭。例如，於流行性感冒病毒感染所誘導的免疫，與被分泌於黏膜上的IgA抗體、中和被誘導於血中的病毒的IgG抗體、及溶解感染細胞並阻止病毒傳播的細胞障礙性T細胞等有關。此類黏膜免疫機構係存在於感染初期階段的免疫系統，於感染時或感染初期中的生物防禦執行重要任務。據此，誘導於病原體侵入的門戸之第一次障壁的黏膜面之防禦感染的免疫系統的黏膜疫苗，可謂對於各式各樣的黏膜感染症為有效的。

黏膜疫苗係藉由經鼻等之經黏膜投予，使於黏膜組織中產生分泌型IgA抗體的同時，使血清中產生IgG抗體。據此，黏膜疫苗由於可對抗病原體而於黏膜系統及全身系統兩者誘導免疫反應，又於操作性‧安全性‧經濟性之任一者的點，皆較歷來之利用注射者更為優異，故被期待作為新的疫苗而應用於臨床上，其開發正在進行著。

另一方面，已明瞭黏膜疫苗於單獨投予抗原亦無法誘導足夠的免疫反應，為了於黏膜面誘導有效果的免疫反應，與黏膜疫苗用佐劑之併用為不可或缺的。迄今，作為黏膜疫苗用佐劑，有許多的報告，例如已知霍亂毒素(cholera toxin：CT)、毒素原性大腸菌之不耐熱性腸毒素(heat-labile enterotoxin：LT)之類的細菌內毒素為將黏膜免疫活性化的代表性佐劑(非專利文獻1、2)。然而，藉由LT之經鼻投予，有所謂引起顏面神經麻痺(伯耳氏癱(Bell's palsy))的臨床治療經驗，現今，於促進CT、LT之類的毒素本身作為經鼻佐劑之開發已認識到於安全性之面向上有問題。又，雖非毒素，但減弱內毒素LPS之活性的MPL、或細菌之鞭毛蛋白質(flagellin)(專利文獻1)、雙股RNA(Poly(I：C))(專利文獻2)等亦被作為黏膜免疫活性化之佐劑被研究，但任一者皆因誘發過度的炎症反應，故此等於安全性的面向亦無法稱為可滿足者。據此，現狀係有效且安全的黏膜疫苗用佐劑迄今尚未達實用化。

另一方面，成為食物中毒之原因的肉毒桿菌(botulinus bacillus)之產生的肉毒神經毒素(NTX)係紅血球凝集素(HA)及未顯示紅血球凝集活性的無毒成分(NTNH)結合，而形成所謂分子量為30萬、50萬、90萬的巨大神經毒素複合體(progenitor toxin：PTX)。肉毒毒素(botulinus toxin)係於肉毒中毒中遮斷神經傳導而引起致死的毒素，但相反地，已積極地利用其活性而用於作為有用的神經傳導阻礙劑。例如，A型肉毒毒素複合體 (BOTOX)被用於眼瞼痙攣、單側顏面痙攣、痙性斜頸、斜視等之治療或皺紋改善為已知的。上述之神經毒素複合體中，已知無毒成分的紅血球凝集素(HA)，於基底膜側破壞上皮細胞之障壁機能，而具有輸送肉毒神經毒素、巨大分子的機能。又，使用NTX及白蛋白抗原，與HA一起皮下投予至小鼠時，藉由IL-6產生，增強抗原特異性的血中抗體產生(非專利文獻3)。於專利文獻3、4已記載關於HA之亞成分(subcomponent)(HA1或HA3)之佐劑活性或作為核酸之細胞內導入載體之利用，但未探討關於由HA之亞成分(HA1、HA2、HA3)所形成的複合體蛋白質。本發明者們已報告：HA之作用點為存在於培氏斑(Peyer's patch)之上皮細胞層的M細胞(培氏斑M細胞)，神經毒素複合體藉由HA而自M細胞藉由胞吞轉送(transcytosis)移行至基底側並進行侵入(非專利文獻4)。然而，於此研究，調查神經毒素複合體(結合毒素部分的HA)之腸道上皮障壁通過機能，關於不含毒素部分的HA單獨對M細胞的作用或黏膜感染症之疫苗之遞送佐劑作用則迄今尚未被探討。又，雖然非專利文獻5已記載HA複合體之M細胞配向性，非專利文獻6、7已記載HA2-HA3對E型鈣黏蛋白(E-cadherin)結合的參與，但關於HA複合體之黏膜疫苗佐劑作用則未被探討。

先前技術文獻 專利文獻

專利文獻1 WO2005/070455

專利文獻2 日本特開2005-97267號公報

專利文獻3 日本特開2009-132686號公報

專利文獻4 日本特表2009-81997號公報

非專利文獻

非專利文獻1 J. Xu-Amano, et al., J. Exp. Med., 178, 1309 (1993)

非專利文獻2 I. Takahashi, et al., J. Infect. Dis. 173, 627 (1996)

非專利文獻3 J. Lee, et al., Microbiology, 151, 3739 (2005)

非專利文獻4 松村拓大等人，日本細菌學雜誌64(1)79(2009)

非專利文獻5 Matsumura T, Sugawara Y, Yutani M, Fujinaga Y. Type A HA-positive botulinum toxin complex crosses the intestinal epithelial barrier via M cell, Toxins 2012, Miami Beach, USA, 5-8 Dec. 2012

非專利文獻6 J Cell Biol. 2010 May 10;189(4):691-700

非專利文獻7 J Biol Chem. 2013 Dec 6;288(49):35617-25

[發明概要]

因此，本發明之目的係提供對黏膜誘導充分的免疫反應且安全性高的黏膜疫苗用佐劑。

本發明者們著眼於肉毒毒素之無毒性成分的紅血球凝集素(HA)，將由HA之亞成分(HA1、HA2、HA3)所形成的野生型肉毒B型HA(野生型BHA)複合體、及對 HA3導入變異的變異型肉毒B型HA(變異型BHA)複合體、或野生型肉毒A型HA(野生型AHA)複合體、及對HA3導入變異的變異型肉毒A型HA(變異型AHA)複合體，與流行性感冒HA抗原一起經鼻投予至小鼠後，確認任一者皆於血清中促進IgG抗體之產生，於黏膜上促進分泌型IgA抗體之產生，使於黏膜系統及全身系統兩者誘導免疫，及確認對CpG、LPS刺激所致的自然免疫(IL-6產生等)無影響，獲得上述複合體蛋白質作為非炎症誘發性之黏膜疫苗用佐劑為有效的見解。再者，變異型BHA及變異型AHA係與野生型BHA及野生型AHA不同，因對形成黏膜障壁的細胞間接著無影響，故亦無由於細胞間接著被破壞而產生的細胞間隙有炎症誘導分子等異物侵入體內深部的可能性，獲得所謂更高安全性的黏膜疫苗用佐劑的見解，遂而完成本發明。

本發明包含以下之發明。

(1)一種佐劑，其係包含由肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分HA1、HA2、及HA3所形成的複合體蛋白質的佐劑，其特徵為HA1為下述之(a)或(b)記載之蛋白質，HA2為下述之(c)或(d)記載之蛋白質，HA3為下述之(e)或(f)記載之蛋白質，(a)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質；(b)包含於序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(a)之蛋白質同等之活性的蛋白質； (c)包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；(d)包含於序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(c)之蛋白質同等之活性的蛋白質；(e)包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被其他胺基酸取代的胺基酸序列的蛋白質；(f)包含於前述(e)之蛋白質之胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、及第607號之胺基酸以外之部位有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(e)之蛋白質同等之活性的蛋白質。

(2)一種佐劑，其係包含由肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分HA1、HA2、及HA3所形成的複合體蛋白質的佐劑，其特徵為HA1為下述之(g)或(h)記載之蛋白質，HA2為下述之(i)或(j)記載之蛋白質，HA3為下述之(k)或(l)記載之蛋白質，(g)包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質；(h)包含於序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(g)之蛋白質同等之活性的蛋白質；(i)包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；(j)包含於序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(i)之蛋白質同等之活性的蛋白質；(k)包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被其他胺基酸取代的胺基酸序列的蛋白質；(l)包含於前述(k)之蛋白質之胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、及第607號之胺基酸以外之部位有1至數個胺基酸被刪除、取代或添加的胺基酸序列，且具有與前述(k)之蛋白質同等之活性的蛋白質。

(3)如(1)或(2)記載之佐劑，其中HA3為包含序列識別號3或序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個之胺基酸被其他胺基酸取代的胺基酸序列的蛋白質。

(4)如(3)記載之佐劑，其中其他胺基酸為丙胺酸。

(5)如(1)~(4)中任一項記載之佐劑，其於與疫苗抗原同時使用、或於疫苗抗原投予前或抗原投予後使用。

(6)如(5)記載之佐劑，其中前述疫苗抗原為次單元抗原或不活化抗原。

(7)如(5)或(6)記載之佐劑，其中前述疫苗抗原為來自黏膜感染症之病原體的抗原。

(8)如(7)記載之佐劑，其中前述黏膜感染症之病原體為病毒或細菌。

(9)如(8)記載之佐劑，其中前述病毒為流行性感冒病毒、人類免疫不全病毒(HIV)、水痘病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒(Rubella virus)、腮腺炎病毒(mumps virus)、小兒麻痺病毒(polio virus)、輪狀病毒(rotavirus)、諾羅病毒(norovirus)、腺病毒、泡疹病毒(herpesvirus)、RS病毒、登革熱病毒(dengue virus)、日本腦炎病毒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、愛彼斯坦-巴爾(Epstein-Barr，EB)病毒、或肝炎病毒(A型、B型、C型)。

(10)如(8)記載之佐劑，其中前述細菌為百日咳菌、腦膜炎雙球菌(meningococcus)、流行性感冒b型菌、肺炎球菌、結核菌、破傷風菌、或霍亂菌。

(11)如(1)~(10)中任一項記載之佐劑，其經黏膜投予。

(12)如(11)記載之佐劑，其中經黏膜投予係鼻腔內投予。

(13)一種黏膜疫苗製劑，其包含疫苗抗原與如(1)~(12)中任一項記載之佐劑。

本發明之佐劑與來自流行性感冒病毒等之黏膜感染症的病原體的抗原同時投予至鼻腔內等之黏膜時，會促進血清中IgG抗體、黏膜上分泌型IgA抗體之產生，且增強抗原特異性全身系統及黏膜系統免疫反應。因此、本發明之佐劑有用於作為呼吸器官疾病或消化器官疾病用之黏膜疫苗用佐劑。而且，本發明之佐劑於使用肉毒毒素之無毒成分的紅血球凝集素(hemagglutinin：HA)之亞成分的點，又對自然免疫無影響且難以產生黏膜投予時的炎症的點，再者，因對形成黏膜障壁的E型鈣黏蛋白(cadherin)細胞間接著無影響，亦不會有炎症誘導分子等之異物自因細胞間接著被破壞而產生的細胞間隙侵入體內深部的可能性的點，安全性非常地高。

本案主張2014年6月4日申請的日本國專利申請案2014-116241號之優先權，包含該專利申請案之說明書記載的內容。

第1圖表示實施例1之野生型肉毒B型HA(BHA)複合體製作所使用的重組肉毒B型HA1-3之胺基酸序列。畫底線部分表示來自載體之胺基酸序列(包含FLAG標籤序列：序列識別號7、Strep標籤序列：序列識別號8)。

第2圖表示使用實施例1之野生型肉毒A型HA(AHA)複合體製作所使用的重組肉毒A型HA1-3之胺基酸序列。畫底線部分表示來自載體的胺基酸序列(包含FLAG標籤序列：序列識別號21及序列識別號7、Strep標籤序列：序列識別號22)。

第3圖表示實施例1之變異型(L473A、M508A、F569A、K607A)肉毒B型HA(BHA)複合體製作所使用的重組肉毒B型HA3之胺基酸序列。畫底線部分表示來自載體之胺基酸序列(包含Strep標籤序列：序列識別號8)，四角形所包圍的胺基酸表示變異導入(胺基酸取代)的胺基酸。

第4圖表示實施例1之變異型(L473A、M508A、F569A、K607A)肉毒A型HA(AHA)複合體製作所使用的重組肉毒A型HA3之胺基酸序列。畫底線部分表示來自載體之胺基酸序列(包含Strep標籤序列：序列識別號22)，四角形所包圍的胺基酸表示變異導入(胺基酸取代)的胺基酸。

第5圖表示野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體之利用凝膠過濾管柱層析的純化。

第6圖表示BHA複合體與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的亞成分之鑑定結果。

第7圖表示使用嵌合肉毒HA3亞成分的利用下拉試驗(Pull-down assay)之與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的BHA3領域之鑑定結果。

第8圖表示使用變異型BHA複合體的利用下拉試驗(A)及TER試驗(B)之與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的BHA3之胺基酸之鑑定結果。

第9圖表示使用野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體的下拉試驗之結果。

第10圖表示使用野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體之Caco-2細胞的細胞間接著阻礙評價(對頂端側(Apical)添加)之結果。

第11圖表示使用野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體之Caco-2細胞的細胞間接著阻礙評價(對基底側(Basolateral)添加)之結果。

第12圖表示野生型HA複合體及變異型(K607A)HA複合體之M細胞配向性(觀察濾胞關連上皮(FAE：follicle-associated epithelium)中的HA複合體的局部存在的顯微鏡相片)(UEA-1：利用FITC-標示的UEA-1的M細胞之染色像、HA：HA複合體之染色像)。

第13圖表示藉由M細胞之形態與細胞間殘留的聚葡糖(dextran)評價黏膜組織上皮層中的野生型HA複合體及變異型(K607A)HA複合體之細胞間接著破壞能力的結果(D-10：FITC-標示的聚葡糖(10K))。

第14圖表示野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體所致的自然免疫活性化(IL-6產生量)。

第15圖表示變異型(K607A)BHA複合體及其亞成分所致的自然免疫活性化(TNF-α/IL-6產生量)。

第16圖表示以ELISA測定血中之流行性感冒抗原特異性IgG之產生量的結果(SV：流行性感冒裂解疫苗(influenza split vaccine)單獨投予組、SV+BHAwt：流行性感冒裂解疫苗+野生型BHA複合體投予組、SV+BHAmut：流行性感冒裂解疫苗+變異型(K607A)BHA複合體投予組、SV+CTB：流行性感冒裂解疫苗+霍亂毒素B次單元投予組、NC：無投予組。***p<0.0001 **p<0.001 *p<0.01)。

第17圖表示以ELISA測定鼻腔洗淨液中、肺泡洗淨液中之流行性感冒抗原特異性IgA之產生量的結果(SV：流行性感冒裂解疫苗單獨投予組、SV+BHAwt：流行性感冒裂解疫苗+野生型BHA複合體投予組、SV+BHAmut：流行性感冒裂解疫苗+變異型(K607A)BHA複合體投予組、SV+CTB：流行性感冒裂解疫苗+霍亂毒素B次單元投予組、NC：無投予組。***p<0.0001 **p<0.001 *p<0.01。

第18圖表示以ELISA測定血中之流行性感冒抗原特異性IgG(A)與鼻腔洗淨液中之流行性感冒抗原特異性IgA(B)之產生量的結果(SV：流行性感冒裂解疫苗單獨投予組、SV+AHAwt：流行性感冒裂解疫苗+野生型AHA複合體投予組、SV+AHA L473A：流行性感冒裂解疫苗+變異型(L473A)AHA複合體投予組、SV+AHA M508A：流行性感冒裂解疫苗+變異型(M508A)AHA複合體投予組、SV+AHA F569A：流行性感冒裂解疫苗+變異型(F569A)AHA複合體投予組、SV+AHA K607A：流行性感冒裂解疫苗+變異型(K607A)AHA複合體投予組、SV+BHAwt：流行性感冒裂解疫苗+野生型BHA複合體投予組、SV+BHA K607A：流行性感冒裂解疫苗+變異型(K607A)BHA複合體投予組、SV+CTB：流行性感冒裂解疫苗+霍亂毒素B次單元投予組、NC：無投予組。

[用以實施發明之形態]

本發明之黏膜疫苗用佐劑(以下，簡稱為「佐劑」)係自為肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分HA1、HA2、及HA3所形成的複合體蛋白質。於本發明，「佐劑」係指以提高疫苗抗原之免疫原性為目的所投予的物質。

肉毒毒素係依肉毒桿菌(Clostridium botulinum)所產生的毒素之抗原性的不同而被分類為A~G型，但本發明之佐劑中的肉毒毒素複合體係A型或B型為較佳。

形成本發明之佐劑所含的複合體蛋白質的HA1、HA2、HA3係各自為：包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即，包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質，或者，包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質為較佳；由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質，或者，由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質為更佳。於本發明，上述之序列識別號3或序列識別號17所示的胺基酸序列中的特定位之胺基酸取代係只要於第473號、第508號、第569號、第607號之至少1處所即可，可為任意之2個處所或3個處所，亦可為全部。

形成本發明之佐劑所含的複合體蛋白質的HA1、HA2、HA3係各自為：包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個之胺基酸被其他胺基酸取代的胺基酸序列的蛋白質，或者，包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個之胺基酸被其他胺基酸取代的胺基酸序列的蛋白質為較佳；由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質，或者，由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質為更佳。

於此處，就胺基酸之取代而言，只要對細胞間接著無影響、且具有黏膜佐劑活性即可，並未特別限制。例如，可列舉非意指以使野生型肉毒B型HA或A型HA所具有的對細胞間接著的影響降低而將特定位之胺基酸做構造上的、電氣上的、極性或疏水性等之性質類似的胺基酸間之取代的保存的胺基酸取代，而是彼等之性質相異的胺基酸間之取代。

於上述序列識別號3或序列識別號17所示的胺基酸序列，就第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之取代胺基酸而言，丙胺酸為較佳。因此，就本發明之佐劑中所含的複合體蛋白質之特佳例而言，可列舉：包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第508號之甲硫胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第569號之苯丙胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第607號之離胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質。

就本發明之佐劑所含的複合體蛋白質之特佳的其他例而言，可列舉：包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第508號之甲硫胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第569號之苯丙胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質；包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即由包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第607號之離胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質。

就本發明之佐劑所含的複合體蛋白質之最佳例而言，可列舉：由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第508號之甲硫胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第569號之苯丙胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第607號之離胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質。

就本發明之佐劑所含的複合體蛋白質之最佳其他之例而言，可列舉：由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第508號之甲硫胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第569號之苯丙胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質；由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質、由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質、及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第607號之離胺酸被取代為丙胺酸的胺基酸序列而成的蛋白質所形成的複合體蛋白質。

於本說明書，胺基酸取代之標記係將對作為對象的胺基酸序列之N末端作為被第1號取代的胺基酸之位置的數字，有藉由於左側表示野生型之胺基酸殘基、右側表示改變的胺基酸殘基而進行的情形。例如，於序列識別號3所示的胺基酸序列第607號之離胺酸(K)被取代為丙胺酸(A)的情形，標記為BHA3 K607A或K607A。

又，只要各自具有與形成複合體蛋白質的上述6個之蛋白質同等之活性即可，可為該等之相同蛋白質，該形成複合體蛋白質的上述6個之蛋白質：包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質；包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質；包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質；包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質；較佳為由序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列而成的蛋白質；由序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質；由序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質；由序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列而成的蛋白質；由序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列而成的蛋白質；及由序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列而成的蛋白質，即由序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列而成的蛋白質。以下，將上述之序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列稱為「序列識別號3之改變胺基酸序列」，將序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列稱為「序列識別號17之改變胺基酸序列」。

於此處，「具有同等之活性」係指與由各自之相同蛋白質所形成的複合體蛋白質具有同等之黏膜佐劑活性、或對細胞間接著無影響，且具有同等之黏膜佐劑活性，該複合體蛋白質為包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，由包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質，或包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質、包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質、及包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，由包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號、第508號、第569號、或第607號之任1者以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質所形成的複合體蛋白質。

又，「黏膜佐劑活性」係指，與疫苗抗原一起經黏膜投予時，於黏膜系統及全身系統兩者中增強抗該抗原的特異性抗體的產生之活性。較佳地，係指對自然免疫的影響輕微，且於黏膜系統及全身系統兩者增強抗該抗原的特異性抗體之產生的活性，更佳地係指對自然免疫無影響，且於黏膜系統及全身系統兩者增強抗該抗原的特異性抗體之產生的活性。就此類相同蛋白質而言，例如，可列舉序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列、序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號3之改變胺基酸序列中的於第473號、第508號、第569號、及第607號之胺基酸以外的部位有1至數個胺基酸被刪除、取代、插入、或添加的胺基酸序列而成的蛋白質，或者，序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列、序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號17之改變胺基酸序列中的於第473號、第508號、第569號、及第607號之胺基酸以外之部位有1至數個胺基酸被刪除、取代、插入、或添加的胺基酸序列而成的蛋白質。其中，「1至數個」之範圍係指以定點(site-specific)突然誘變法等之周知變異蛋白質製作法可刪除、取代、或添加的程度的數目，只要保持前述之活性，其個數並未被限制，指1~30個、1~25個、1~20個、1~15個、1~12個，較佳為1~10個、1~9個、1~8個、1~7個、1~6個，更佳為1~5個、1~4個、1~3個、1~2個。就「取代」而言，只要具有同等之活性即可，並未特別限制，惟例如可列舉保存的胺基酸取代。保存的胺基酸取代係指例如構造、電性的、極性或疏水性等之性質類似的胺基酸間之取代。此等性質係例如亦可以胺基酸側鏈之類似性加以分類，可分類為如下列的群組。具有酸性側鏈的胺基酸基團(天冬胺酸(aspartic acid)、麩胺酸)、具有鹼性側鏈的胺基酸基團(離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有非極性側鏈的胺基酸基團(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、具有非帶電極性側鏈的胺基酸基團(甘胺酸、天冬醯胺酸(asparagine)、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸(threonine)、酪胺酸)、具有疏水性側鏈的胺基酸基團(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有分支側鏈的胺基酸基團(蘇胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸)、具有芳香族側鏈的胺基酸基團(酪胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、組胺酸)、具有羥基亞甲基的胺基酸基團(絲胺酸及蘇胺酸)、具有含有醯胺基的側鏈的基團(天冬醯胺酸及麩醯胺酸)等。

又，以下之8群組各自包含於本技術領域被認可之相互保存的取代的胺基酸(例如，參照Creighton,Proteins 1984)。

1)丙胺酸、甘胺酸；2)天冬胺酸、麩胺酸；3)天冬醯胺酸、麩醯胺酸；4)精胺酸、離胺酸；5)異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、纈胺酸；6)苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸；7)絲胺酸、蘇胺酸；及8)半胱胺酸、甲硫胺酸。

又，就相同蛋白質而言，可為包含對於序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列、序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號3之改變胺基酸序列具有90%以上之同源性的胺基酸序列的蛋白質，或可為包含對於序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列、序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號17之改變胺基酸序列具有90%以上之同源性的胺基酸序列的蛋白質；由對序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列、序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號3之改變胺基酸序列具有90%以上之同源性的胺基酸序列而成的蛋白質，或由對序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列、序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列、或序列識別號17之改變胺基酸序列具有90%以上之同源性的胺基酸序列而成的蛋白質為較佳。其中，「90%以上之同源性」係指較佳為95%以上，更佳為97%以上，最佳為98%以上之序列之同源性。胺基酸序列之同源性可藉由FASTA檢索或BLAST檢索來決定。

本發明之佐劑之製作方法並未特別限定。上述之複合體蛋白質可為來自天然物，亦可為將形成該複合體蛋白質的各自蛋白質藉由基因重組法而製造，並藉由使用彼等而使複合體形成的方法而取得者。藉由基因重組法製作的情形，使用編碼各蛋白質的基因，藉由本身周知之方法來進行即可。即，野生型之HA1、HA2、HA3係可藉由構築包含編碼各自序列識別號1、2、3所示的胺基酸序列的基因(鹼基序列各自以序列識別號4、5、6表示)、或編碼各自序列識別號15、16、17所示的胺基酸序列的基因(鹼基序列各自以序列識別號18、19、20表示)的表現載體而導入適當宿主細胞並培養而可加以製造。又，於序列識別號3或序列識別號17所示的胺基酸序列，上述之特定位具有胺基酸取代的變異型HA3可藉由併用使用與目的之點變異序列互補的引子對的PCR及DpnI限制酶處理的定點誘變(site-directed mutagenesis)法而製作(Gene 1994 Dec 30；151(1-2)：119-23)。

例如，製作於序列識別號3所示的胺基酸序列第607位之離胺酸(K)被取代為丙胺酸(A)的變異型HA3的情形，使用將「aaa」(編碼離胺酸的密碼子)變換為「gct」(編碼丙胺酸的密碼子)的互補的引子對，將編碼野性型HA3的表現質體藉由PCR法而經放大來進行。或者，HA1、HA2、HA3亦可基於其胺基酸序列藉由化學合成而加以製造。

又，HA1、HA2、HA3之相同蛋白質係對編碼各自序列識別號1、2、3、或序列識別號15、16、17所示的胺基酸序列的基因，藉由應用例如定點突然誘變法等，獲得編碼相同蛋白質的基因，使用此基因而同樣地藉由周知之重組DNA法可加以製造。關於此等之製造，具體而言，可參考Molecular Clonin 2nd Edt.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)等之基本書而容易地進行。

製造的HA1、HA2、HA3蛋白質可於磷酸緩衝液等之溶媒中藉由培育2~8小時、較佳為3~5小時、更佳為3小時，於25~40℃、較佳為37℃，而使形成複合體。又，亦可自HA1、HA2、HA3蛋白質製作融合蛋白質。製作融合蛋白質的方法係可使用將各自編碼 HA1、HA2、HA3蛋白質的DNA片段與框架結合而導入適當表現載體，藉由適當宿主而將其轉錄、轉譯而使蛋白質表現的周知方法。

本發明之佐劑對活體的投予係通常與疫苗抗原同時投予，但亦可於疫苗抗原投予前或抗原投予後投予。又，佐劑與疫苗抗原同時投予的情形，與疫苗實質上同時地投予即可，例如，可將佐劑與疫苗抗原對對象完全地同時投予，亦可於一定之時間內(較佳為數分鐘以內)連續地投予。

上述疫苗抗原係不活化抗原或次單元抗原較佳。不活化抗原係指喪失感染能力的病原體(病毒、細菌等)之抗原，可列舉為完全病毒粒子的病毒顆粒(virion)、不完全病毒粒子、病毒顆粒構成粒子、病毒非構造蛋白質、感染防禦抗原、中和反應的抗原決定位(epitope)等。用以不活化的處理可列舉物理性處理(X射線、熱、超音波等)、化學性處理(福馬林、水銀、醇、氯等)等。又，「次單元疫苗」係指不活化疫苗中所含的各式各樣的抗原中，僅包含作為疫苗有效成分的特定之抗原(感染防禦抗原)的疫苗。例如可列舉，若為流行性感冒病毒，僅包含經純化的表面抗原之紅血球凝集素(HA)與神經胺酸酶(neuraminidase，NA)的疫苗。

又，上述疫苗抗原係只要與本發明之佐劑一起誘發黏膜免疫反應即可，並未特別限定，但典型地，為來自黏膜感染症之病原體之抗原。黏膜感染症之病原體可為病毒，亦可為細菌。就病毒而言，例如，可列舉流行性感冒病毒、人類免疫不全病毒(HIV)、水痘病毒、麻疹病毒、德國麻疹病毒、腮腺炎病毒、小兒麻痺病毒、輪狀病毒、諾羅病毒、腺病毒、泡疹病毒、RS病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、嚴重急性呼吸道症候群(SARS)病毒、巨細胞病毒、愛彼斯坦-巴爾(EB)病毒、肝炎病毒(A型、B型、C型)等，但未限定於此等。又，就細菌而言，例如，可列舉百日咳菌、腦膜炎雙球菌、流行性感冒b型菌、肺炎球菌、結核菌、破傷風菌、霍亂菌等，但未限定於此等。此等之來自病原體的抗原可為來自天然物，亦可為藉由基因重組等手法而人為製作者。

又，於上述疫苗抗原，亦可包含用於減敏療法(hyposensitization therapy)的過敏原。因此，本發明之佐劑亦可使用作為過敏原疫苗用之佐劑。過敏原疫苗係指藉由對活體投予過敏原，使抗過敏原的IgG抗體產生而阻斷成為過敏的原因的IgE之作用，或者於活體內使對過敏原特異性的1型輔助型T細胞(Th1細胞)增加，用以使參與過敏症狀的2型輔助型T細胞(Th2細胞)減少的疫苗，可藉由減敏而抑制過敏症狀。過敏原之種類並未特別限定，但可列舉食物過敏原(酪蛋白、乳白蛋白(lactalbumin)、乳球蛋白(lactoglobulin)、類卵黏蛋白(ovomucoid)、卵白蛋白(ovalbumin)、伴白蛋白(conalbumin)等)、家塵(house dust)過敏原(蟎類過敏原等)、花粉過敏原(杉花粉過敏原、豬草(ragweed)過敏原、果園草(orchard grass)過敏原等)、動物之體毛等之過敏原等。

本發明之佐劑可與上述黏膜疫苗抗原一起經黏膜投予。「經黏膜投予」係指經由黏膜的投予形態。黏膜包含消化器、呼吸器、泌尿生殖器等尤其外通性之中腔器官的內壁，具體而言，可列舉鼻腔、口腔、咽頭、肺泡、氣管、腸道、陰道等，但較佳為鼻腔。因此，經黏膜投予之形態係例如可列舉，鼻腔內、口腔內、肺泡內、氣道內、陰道內、直腸內投予，但鼻腔內投予為較佳。佐劑及黏膜疫苗之黏膜投予係可因應被投予部位而以適當方法來進行。例如，經鼻或經口投予的情形，於鼻腔或口腔內，可使用噴霧、滴下、塗布等之方法。又，肺泡內投予的情形，可藉由使用吸入器或噴霧器的方法、投予使用氣溶膠化劑的處方所致的製劑的方法而進行。

本發明之佐劑之投予量係依投予對象之年齡、體重、疾病之種類、投予方法、投予形態等而異，但例如可例示，與疫苗抗原同時地，通常每一成人一次時，經口投予的情形係10μg~100mg，較佳為1μg~10mg，經鼻投予的情形係0.1μg~100mg，較佳為1μg~10mg。投予對象可因應與佐劑一起使用的疫苗抗原的種類而適宜決定，除人類之外，亦包含人類以外之哺乳類、鳥類、甲殼類等。

又，將本發明之佐劑與疫苗抗原一起投予至對象的頻率係可考慮投予對象之年齡、體重、病史、及經過、疾病之種類等，由本項技術領域中具通常知識者容易地決定。投予係與通常之疫苗製劑同樣地，於疾病發生前之適當時期，通常，以1~數次/日，僅1日或以1~數週間之間隔投予數次即可。投予較佳為一邊觀察經過一邊施予，隔至少約1週之間隔作追加免疫為較佳。追加免疫之間隔係至少約2週為較佳。藉由進行追加免疫，可產生更高效果的感染防禦效果。

本發明之佐劑因與疫苗抗原一起同時地投予，可與藥理學上可容許的因應劑型的載體一起與疫苗抗原混合，以周知之各種方法加以製劑化而作成疫苗製劑。

疫苗製劑中之佐劑之摻合量可藉由組合的疫苗抗原之種類而適宜決定。又，該製劑中的佐劑之含量亦未特別限定，只要藉由經黏膜投予可使誘導充分的抗原免疫反應的量即可，但通常，相對於製劑全體，為0.1~90重量%，較佳為0.5~80重量%，更佳為1~50重量%。

就本發明之黏膜疫苗製劑之劑型而言，只要可經黏膜投予的劑型即可，未特別限定，但例如可列舉液劑、懸浮劑(懸浮液)、噴霧劑、粉末劑等。本發明之黏膜疫苗製劑中可因應需要添加疫苗製劑通常使用的各種添加物，例如，助溶劑、凝集防止劑、黏度調節劑、pH調節劑、等張化劑、乳化劑、抗氧化劑、增量劑、界面活性劑、稀釋劑、保存劑、安定化劑、防濕劑、保濕劑等。

本發明之疫苗製劑係可以液狀或乾燥的形態，置入密栓的小瓶、注射器、霧化器(atomizer)、密封的安瓿來提供。

[實施例]

以下，藉由實施例而更具體地說明本發明，但本發明並未限定於此等實施例。又，本實施例所獲得的資料之統計處理係使用司徒頓t檢驗(student t-test)進行。

(實施例1)肉毒B型HA(BHA)複合體及A型HA(AHA)複合體之製作

A.野生型肉毒B型HA(野生型BHA)及野生型A型HA(野生型AHA)複合體之製作

(1)質體之製作

將編碼肉毒B型HA亞成分(BHA1、BHA2、BHA3)之各自的蛋白質(BHA1：由序列識別號1之胺基酸序列之7-294位之胺基酸序列而成的蛋白質、BHA2：由序列識別號2之胺基酸序列之2-146位之胺基酸序列而成的蛋白質、BHA3：由序列識別號3之胺基酸序列之19-626位之胺基酸序列而成的蛋白質)的基因、及編碼肉毒A型HA亞成分(AHA1、AHA2、AHA3)之各自的蛋白質(AHA1：由序列識別號15之胺基酸序列之6-293位之胺基酸序列而成的蛋白質、AHA2：由序列識別號之胺基酸序列16之2-146位之胺基酸序列而成的蛋白質、AHA3：由序列識別號17之胺基酸序列之20-626位之胺基酸序列而成的蛋白質)的基因，各自使用下述之引子而將肉毒桿菌B-Okra(Clostridium botulinum B-Okra)株之基因體DNA作為模板，以PCR法加以放大。

(BHA1放大用引子)

BHA1正向引子(forward primer)：cactataagcttatccaaaattcattaaatg(序列識別號9)

BHA1反向引子：gttgataggtaccttatgggttactcatag(序列識別號10)

(BHA2放大用引子)

BHA2正向引子：tgaataagctttcagctgaaagaacttttc(序列識別號11)

BHA2反向引子：cactttggtaccttatattttttcaagtttga(序列識別號12)

(BHA3放大用引子)

BHA3正向引子：gaaaaagggtaccaatatagtgatactattg(序列識別號13)

BHA3反向引子：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc(序列識別號14)

(AHA1放大用引子)

AHA1正向引子：catgccatggtaatccaaaattcattaaa(序列識別號23)

AHA1反向引子：cgggatccttacttgtcatcgtcatccttgtagtctgggttacgaatattccatttc(序列識別號24)

(AHA2放大用引子)

AHA2正向引子：tgaataagctttcagttgaaagaacttttctac(序列識別號25)

AHA2反向引子：ctttggtaccttatattttttcaagtttgaac(序列識別號26)

(AHA3放大用引子)

AHA3正向引子：aaagttaggtaccctagtgatactattgatttag(序列識別號27)

AHA3反向引子：cgtgtcgacttaattagtaatatctatatgc(序列識別號28)

關於經放大的DNA片段，BHA1、BHA2係插入pT7-FLAG-1(Sigma)之HindIII-SalI位置，關於BHA3，係插入pET52b(+)(Novagen)之KpnI-SalI位置(pET-BHA3)，AHA1係插入pET52b(+)之NcoI-BamHI位置，AHA2係插入pT7-FLAG-1之HindIII-KpnI位置，AHA3係插入pET52b(+)之KpnI-SalI位置。

(2)蛋白質表現

製作的質體係各自單獨轉形於大腸菌株Rosetta2(DE3)(Novagen)。蛋白質表現誘導係使用Overnight Express Autoinduction system 1(Novagen)來進行。BHA1及BHA3係於30℃進行蛋白質表現誘導36小時，於BHA2係於18℃進行蛋白質表現誘導40小時。AHA1及AHA3係於30℃進行蛋白質表現誘導36小時，於AHA2係於18℃進行蛋白質表現誘導40小時。大腸菌係藉由離心而回收，並於-80℃保存。

(3)蛋白質純化及複合體製作

BHA1、BHA2係使用抗FLAG M2瓊脂糖(Sigma)而進行純化。BHA3係使用StrepTrap HP(GE Healthcare)而進行純化。經純化的重組體蛋白質FLAG-BHA1、FLAG-BHA2、Strep-BHA3之胺基序列示於第1圖。AHA1、AHA2係使用抗FLAG M2瓊脂糖(Sigma)而進行純化。AHA3係使用StrepTrap HP(GE Healthcare)而進行純化。經純化的重組體蛋白質AHA1-FLAG、FLAG-AHA2、Strep-AHA3之胺基序列示於第2圖。將各自純化的重組體蛋白質以BHA1：BHA2：BHA3=4：4：1、AHA1：AHA2：AHA3=4：4：1之莫耳比加以混合，並於37℃培育3小時後，藉由StrepTrap HP進行純化，而獲得BHA複合體(BHA)。

B.變異型肉毒B型HA(變異型BHA)複合體及變異型肉毒A型HA(變異型AHA)複合體之製作

關於表現BHA3之E型鈣黏蛋白結合性缺失變異體(BHA3 L473A、BHA3 M508A、BHA3 F569A、BHA3 K607A)的質體，將上述pET-BHA3作為模板而藉由PCR法進行變異導入而獲得。接著，使用與上述(2)及(3)相同之方法，獲得4種之變異型BHA複合體。Strep-BHA3變異型(L473A、M508A、F569A、K607A)之胺基序列示於第3圖。關於AHA3之E型鈣黏蛋白結合性缺失變異體(AHA3 L473A、AHA3 M508A、AHA3 F569A、AHA3 K607A)，亦使用相同之方法，獲得4種之變異型AHA複合體。Strep-AHA3變異型(L473A、M508A、F569A、K607A)之胺基序列示於第4圖。

C.肉毒B型HA(BHA)複合體及A型HA(AHA)複合體之凝膠過濾層析

將A.所製作的野生型BHA複合體及野生型AHA複合體、以及B.所製作的變異型BHA複合體及變異型AHA複合體，藉由Superdex 200 10/300 GL(GE Healthcare)加以分離。本試驗之BHA複合體(BHA)之HA1、HA2、HA3係各自使用N末端FLAG標籤HA1、N末端FLAG標籤HA2、N末端Strep標籤HA3，AHA複合體(AHA)之HA1、HA2、HA3係各自使用C末端FLAG標籤HA1、N末端FLAG標籤HA2、N末端Strep標籤HA3。野生型複合體(BHA)以及變異型(K607A)BHA複合體之結果示於第5圖。

(實施例2)BHA複合體與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的亞成分之探討

為血清型B型的肉毒HA複合體(BHA)係具有與小鼠、或人類之E型鈣黏蛋白結合而破壞細胞間接著的特性。另一方面，血清型C型之肉毒HA(CHA)並無E型鈣黏蛋白結合活性。因此，為了鑑定BHA複合體與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的亞成分，改變BHA與CHA之亞成分之組合，並製作嵌合肉毒HA複合體，將與E型鈣黏蛋白之相互作用使用下拉(Pull-down)試驗而解析。下拉試驗係使嵌合肉毒HA吸附於StrepTactin superflow瓊脂糖(Novagen)後，使用自大腸菌表現系統純化的E型鈣黏蛋白(EC1/2)或HEK293細胞表現系統而純化的E型鈣黏蛋白全長蛋白質反應，將共沉降的蛋白質藉由使用抗E型鈣黏蛋白抗體(ECCD-2，Takara)的西方氏墨漬法(Western blotting method)而加以解析。結果示於第6圖。如第6圖所示，肉毒HA3亞成分為血清型B的情形，觀察到與E型鈣黏蛋白之結合。即，暗示BHA3亞成分對E型鈣黏蛋白之結合為重要的。

(實施例3)與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的BHA3區域的鑑定

為了探討BHA3之哪一區域於E型鈣黏蛋白結合上為重要，使用C型肉毒HA3亞成分(CHA3)與B型肉毒HA3亞成分(BHA3)，製作嵌合肉毒HA3亞成分，將與E型鈣黏蛋白之相互作用使用下拉試驗加以解析。結果示於第7圖。如第7圖所示，相對於融合BHA3之第473號以後的區域的嵌合肉毒HA複合體具有E型鈣黏蛋白結合能力，於融合BHA3之第485號以後的區域的嵌合肉毒HA複合體則E型鈣黏蛋白結合能力消失。由以上可知，暗示自BHA3之第473號之胺基酸至C末端的區域係與E型鈣黏蛋白之相互作用上為重要的。

(實施例4)與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的BHA3之胺基酸之鑑定

探討於B型肉毒HA3亞成分(BHA3)之第473號之胺基酸至C末端的區域，哪一胺基酸對於與E型鈣黏蛋白之相互作用為重要的。自序列比對(sequence alignment)指出與C型肉毒HA(CHA)相異的胺基酸，使用與實施例1相同之方法製作將此胺基酸變換為丙胺酸的BHA3點變異體(L473A、E501A、D503A、L504A、R505A、N506A、M508A、N509A、H534A、D535A、F569A、T574A、D576A、N582A、Q584A、Q585A、N586A、L587A、N588A、K607A、E609A)，使用下拉試驗解析與E型鈣黏蛋白之相互作用。結果示於第8圖A。如第8圖A所示，於L473A、M508A、F569A、K607A之變異體，與E型鈣黏蛋白之結合能力減弱成為明顯的。尤其，茲認為於L473A、M508A、K607A，戲劇性地降低E型鈣黏蛋白結合能力。

其次，為了探討對第8圖A所解析的BHA變異體之細胞間結合的影響，使用來自人類結腸癌的Caco-2細胞，進行經上皮層電阻值(Transepithelial electrical resistance：TER)試驗。於24孔細胞培養盤中，置入細胞嵌件(cell inserts)(Transwell盤)，於嵌件內接種Caco-2細胞。Caco-2細胞之細胞間接著形成係藉由計測TER值而評價。TER值成為2000Ω‧cm²以上後，將野生型BHA複合體或變異型BHA複合體(BHA3點變異體：L473A、R505A、M508A、N509A、H534A、F569A、K607A、E609A)，添加於基底側(Basolateral)(10nM)，經時觀察添加後之TER值之變化。結果示於第8圖B。如第8圖B所示，於WT複合體，相對TER值之減少係於添加後8小時被顯著觀察，於K607A變異型複合體與M508A變異型複合體，幾乎未觀察到TER值的降低。於L473A變異型複合體亦未觀察到細胞間接著的破壞能力減弱。另一方面，於F569A，TER值減少稍微緩和，暗示有參與與E型鈣黏蛋白之相互作用的胺基酸的可能性。由以上之結果，暗示L473、M508、F569、K607為BHA複合體與E型鈣黏蛋白之相互作用上重要的胺基酸的可能性。

(實施例5)野性型BHA複合體或變異型(K607A)BHA複合體與E型鈣黏蛋白之相互作用

將BHA複合體與細胞間接著之構成要素的E型鈣黏蛋白之相互作用，藉由將來自人類結腸癌的Caco-2細胞之1%Triton X-100提取液與將HA複合體固定化的樹脂加以混合，並以下拉試驗及西方氏墨漬(western blotting)法加以解析。結果示於第9圖。如第9圖所示，確認野生型BHA複合體係與Caco-2細胞之E型鈣黏蛋白直接結合。另一方面，變異型(K607A)BHA複合體顯然並未與Caco-2細胞之E型鈣黏蛋白結合。

(實施例6)變異型(K607A)BHA複合體之對細胞間接著的影響之探討

變異型(K607A)BHA複合體之對細胞間接著的影響，於Caco-2細胞之TER試驗，藉由進行高用量處理(1μM)而加以評價。結果示於第10圖。如第10圖所示，將野性型BHA複合體(WT)自頂端側(Apical)處理的Caco-2培養孔中，顯示處理後12小時以內大幅地TER值減少。另一方面，於變異型BHA複合體(Mut)，經過24小時後亦未觀察到TER值變化，於2次獨立的探討結果中，觀察到約略相同的結果。

又，如第11圖所示，自基底側(Basolateral)處理Caco-2細胞的情形，於6.25nM之低濃度的野性型 BHA複合體(WT)處理，相對於於12小時以內呈現大幅的TER值減少，於變異型BHA複合體(Mut)，即使於400nM之高濃度，完全未顯示TER值變化。由以上之結果，顯然可知：相對於野生型BHA複合體強烈阻礙Caco-2細胞之細胞間接著，變異型(K607A)BHA複合體對細胞間接著具有完全未呈現影響的特性。

(實施例7)野性型HA複合體或變異型(K607A)HA複合體之M細胞配向性

將肉毒A型或B型之HA2以Alexa 568標示，與HA1、HA3複合化而製作野性型HA複合體(A型、B型)。同樣地，將肉毒A型或B型之HA2以Alexa 568標示，與HA1、HA3(K607A變異)複合化而製作變異型HA複合體(A型、B型)。各自注入此等之野性型HA複合體或變異型HA複合體600nM於小鼠結紮腸道，以共焦顯微鏡觀察2小時後之HA複合體之所在(localization)。M細胞以FITC-標示的UEA-1染色。其結果示於第12圖。如第12圖所示，觀察到野性型HA複合體對M細胞之結合及胞吞轉送。又，顯然可知：變異型(K607A)HA複合體與野生型HA複合體同樣地呈現高M細胞配向性。

(實施例8)黏膜組織上皮層中的野性型HA複合體或變異型(K607A)HA複合體之細胞間接著破壞能力的探討

為了探討野性型HA複合體(A型、B型)或變異型(K607A)HA複合體(A型、B型)對小鼠黏膜上皮組織之細胞間接著的影響，於小鼠結紮腸道中注入5μM之各 HA複合體與2mg/mL之FITC-標示的聚葡糖(FITC-labled dextran)(10K)之混合液，以共焦顯微鏡觀察2小時後之進入細胞間隙的聚葡糖(dextran)。M細胞以玫紅(Rhodamine)-標示的UEA-1染色。結果示於第13圖。如第13圖所示，血清型A、B兩者皆於以野生型HA複合體(HAwt)處理的腸道上皮層，觀察到聚葡糖之殘留(綠色點：圖中，於白色點可見的部分)。又，於HAwt，觀察到UEA-1陽性細胞之形態異常(圖中，以白色框包圍的部分)。另一方面，於變異型(K607A)HA複合體(HAmut)，未觀察到聚葡糖殘留，且UEA-1陽性細胞之形態亦正常。由以上之結果暗示，相對於HAwt破壞鄰近結紮腸道之上皮層存在的UEA-1陽性細胞之細胞間接著，HAmut為對黏膜上皮之細胞間接著無影響的安全的黏膜佐劑候補。

(實施例9)野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體佐劑之自然免疫活性化能力之評價

使用未處理之小鼠脾臓細胞，測定野生型BHA複合體及變異型(K607A)BHA複合體佐劑處理所致的IL-6細胞激素(cytokine)之產生量，而評價BHA複合體佐劑之自然免疫活性化能力。

採取於SPF環境下飼育的未處理小鼠(C57BL/6、6週齡、雌性、購自日本CLEA股份有限公司)之脾臓細胞，於96孔盤中以1×10⁶個細胞/孔之細胞密度接種。之後，將BHA複合體(BHA)自20μg/mL之濃度作階段稀釋(20μg/mL、2μg/mL、0.2μg/mL)，而刺激脾臓細胞。又，與BHA複合體佐劑一起以LPS(1μg/mL)之TLR配位體進行共刺激。自刺激開始24小時後，回收培養上清液，測定培養上清液中之細胞激素量(IL-6)(R&D systems)。結果示於第14圖。如第14圖所示，BHA複合體佐劑單獨所致的IL-6產生為野生型BHA複合體(BHAwt)、變異型(K607A)BHA複合體(BHAmut)兩者的檢出界限以下。又，BHA複合體佐劑係野生型BHA複合體(BHAwt)、變異型(K607A)BHA複合體(BHAmut)一起，因對LPS刺激所致的IL-6產生無影響，茲認為未增強或抑制其他之自然免疫活性化訊息。

再者，對於變異型(K607A)BHA複合體佐劑(BHAmut)與其亞成分(BHA1、BHA2、BHA3mut)，測定TNF-alpha與IL-6產生量。結果示於第15圖。如第15圖所示，即使以LPS(1μg/mL、0.33μg/mL、0.11μg/mL、0.037μg/mL)之100倍濃度之BHA複合體或BHA亞成分(100μg/mL、33μg/mL、11μg/mL、3.7μg/mL)處理脾臓細胞，TNF-alpha或IL-6產生為檢出界限以下。由此等結果，BHA複合體佐劑於野生型、變異型兩者對自然免疫活性化訊息無影響，暗示為非炎症誘發型佐劑。

(實施例10)使用流行性感冒HA抗原的野生型及變異型BHA複合體之經鼻佐劑效果

使用流行性感冒裂解疫苗作為抗原，而評價BHA複合體之佐劑效果。

(1)實驗動物及材料

BALB/c小鼠及C57BL/6小鼠(6週齡、雌性)係購自日本CLEA股份有限公司。飼育係於SPF環境下進行。

使用接受至北里第一三共疫苗股份有限公司的小鼠馴化A/Puerto Rico/8/34(H1N1)裂解型疫苗(以下，稱為「裂解型疫苗」)作為免疫抗原。實驗期間，抗原係冷藏保存於4℃之暗處。

使用實施例1所製作的野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑及變異型BHA複合體(BHAmut：K607A)佐劑作為佐劑。內毒素含量係將0.5EU/mL以下設定為純化之基準。保存係於-80℃冷凍保存，使用前才融解用於免疫。霍亂毒素佐劑(CTB)係於每隻小鼠，混合1μg之霍亂毒素B次單元(目錄編號033-20611、和光純藥股份有限公司)及1ng之霍亂毒素(目錄編號033-20621、和光純藥股份有限公司)，而調製。保存係於-80℃冷凍保存，使用前才融解而用於免疫。

(2)試驗方法

將裂解型疫苗抗原1μg、及BHA複合體(BHA)佐劑20μg、或霍亂毒素混合(CTB)佐劑1.001μg以PBS(-)調製成12μL，作成每一隻之疫苗製劑。對6週齡之小鼠，將各疫苗製劑各6μL投予至兩鼻腔內。以2週間隔共計4次(0日、14日、28日、42日)投予。14日、28日、42日之追加免疫前才使用KETALAR(第一三共股份有限公司)/Selactar(Bayer股份有限公司)來麻醉，自眼窩靜脈叢採血。獲得的血液於4℃靜置一晚，藉由桌上冷卻離心分離機進行血清分離(9100g、10分鐘、4℃)。獲得的血清檢體於-20℃冷凍保存。為了評價BHA複合體之佐劑效果，測定血清檢體之IgG(總IgG、IgG1、IG2a、IG2c)。

於免疫開始第56日，藉由KETALAR/Selactar麻醉後，經心臓穿刺進行全採血的安樂死處分。之後立即各自採取鼻腔洗淨液、肺泡洗淨液。鼻腔洗淨液、肺泡洗淨採取後，於冰上或冷藏保存至ELISA試驗。

ELISA試驗係如下列進行。將裂解疫苗抗原以1μg/mL之濃度，被覆平盤(4℃，隔夜)，阻斷(blocking)係藉由1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)於室溫靜置2小時進行。試料血清係使用1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)，作階段稀釋。2次抗體係依據各自之子類(subclass)的HRP標示抗體。顯色後使用平盤讀數機而計測OD，並計測流行性感冒抗原特異性的抗體產生量。鼻腔洗淨液、肺泡洗淨液係使用1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)而階段稀釋，為了評價BHA複合體佐劑所致的抗原特異性的黏膜免疫之增強效果，測定流行性感冒抗原特異性的黏膜IgA產生量。

(3)試驗結果

對流行性感冒抗原為特異性的血中IgG之測定結果(免疫開始第56日)示於第16圖。如第16圖所示，以野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑、變異型BHA複合體(BHAmut：K607A)佐劑與流行性感冒抗原來免疫的群組，與流行性感冒抗原單獨來免疫的群組相比，誘導有意義的高抗原特異性的血中抗體反應。此以經評價的全部IgG子類被確認。

鼻腔洗淨液、肺泡洗淨液中之分泌型IgA產生量之測定結果示於第17圖。如第17圖所示，於以野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑或變異型BHA複合體(BHAmut：K607A)佐劑與流行性感冒抗原來免疫的群組，觀察到高抗原特異性的IgA產生。相對於此，以流行性感冒抗原單獨來免疫的小鼠，幾乎未觀察分泌型IgA產生。由以上之結果，證明BHA複合體作為非炎症誘發型之新穎黏膜佐劑為有效。

(實施例11)使用流行性感冒HA抗原的野生型及變異型AHA複合體或野生型及變異型BHA複合體之經鼻佐劑效果

(1)實驗動物及材料

BALB/c小鼠(6週齡、雌性)係購自日本CLEA股份有限公司。飼育於SPF環境下進行。

使用接收自北里第一三共疫苗股份有限公司的小鼠馴化A/Puerto Rico/8/34(H1N1)裂解型疫苗(以下，稱為「裂解型疫苗」)作為免疫抗原。實驗期間，抗原冷藏保存於4℃之暗處。

使用實施例1所製作的野生型AHA複合體(AHAwt)佐劑、野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑、變異型AHA複合體(AHA L473A、AHA M508A、AHA F569A、 AHA K607A)佐劑、及變異型BHA複合體(BHA K607A)佐劑作為佐劑。內毒素含量係將0.5EU/mL以下作為純化之基準而設定。保存係於-80℃冷凍保存，使用前才融解並用於免疫。霍亂毒素佐劑(CTB)係每一隻小鼠，混合1μg之霍亂毒素B次單元(目錄編號033-20611，和光純藥股份有限公司)與1ng之霍亂毒素(目錄編號033-20621，和光純藥股份有限公司)，並調製。保存係於-80℃冷凍保存，使用前才融解並用於免疫。

(2)試驗方法

將裂解型疫苗抗原1μg、及AHA複合體(AHA)佐劑20μg、BHA複合體(BHA)佐劑20μg、或霍亂毒素混合(CTB)佐劑1.001μg以PBS(-)調製成12μL，作為每一隻之疫苗製劑。對6週齡之小鼠，將各疫苗製劑各6μL投予至兩鼻腔內。以2週間隔共計3次(0日、14日、28日)投予。於免疫開始第42日，KETALAR/Selactar所致的麻醉後，藉由心臓穿刺進行全採血的安樂死處分。獲得的血液於4℃靜置一晚，藉由桌上冷卻離心分離機進行血清分離(9100g、10分鐘、4℃)。獲得的血清檢體係於-20℃冷凍保存。為了評價AHA複合體、或BHA複合體之佐劑效果，測定血清檢體之IgG(總IgG)。安樂死處分後，採取鼻腔洗淨液。鼻腔洗淨液係採取後，於冰上或冷藏保存至ELISA試驗。

ELISA試驗係如下列進行。將裂解疫苗抗原以1μg/mL之濃度，被覆平盤(4℃，隔夜)，阻斷係藉由1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)於室溫靜置2小時進行。試料血清係使用1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)，作階段稀釋。2次抗體係依據各自之子類的HRP標示抗體。顯色後使用平盤讀數機而計測OD，並計測流行性感冒抗原特異性的抗體產生量。鼻腔洗淨液使用1%BSA/PBST(Tween20：0.05%)而進行階段稀釋，為了評價AHA複合體、或BHA複合體佐劑所致的抗原特異性的黏膜免疫之增強效果，測定流行性感冒抗原特異性的黏膜IgA產生量。

(3)試驗結果

將對流行性感冒抗原為特異性的血中IgG之測定結果示於第18圖A。如第18圖A所示，於以野生型AHA複合體(AHAwt)佐劑、野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑、變異型AHA複合體(AHA L473A、AHA M508A、AHA F569A、AHA K607A)佐劑、或變異型BHA複合體(BHA K607A)佐劑與流行性感冒抗原來免疫的群組，與以流行性感冒抗原單獨來免疫的群組相比，誘導出高抗原特異性的血中抗體反應。又，野生型AHA複合體佐劑、野生型BHA複合體佐劑、變異型AHA複合體佐劑、及變異型BHA複合體佐劑之抗原特異性的血中抗體之增強活性為同等。

鼻腔洗淨液之分泌型IgA產生量之測定結果示於第18圖B。如第18圖B所示，以野生型AHA複合體(AHAwt)佐劑、野生型BHA複合體(BHAwt)佐劑、變異型AHA複合體(AHA L473A、AHA M508A、AHA F569A、AHA K607A)佐劑、或變異型BHA複合體(BHA K607A)佐劑及流行性感冒抗原來免疫的群組中，與以流行性感冒抗原單獨免疫的群組相比，觀察到高抗原特異性的黏膜IgA產生。又，野生型AHA複合體佐劑、野生型BHA複合體佐劑、變異型AHA複合體佐劑、及變異型BHA複合體佐劑之抗原特異的黏膜IgA抗體之增強活性為同等。由以上之結果，野生型AHA複合體佐劑、野生型BHA複合體佐劑、變異型AHA複合體佐劑、及變異型BHA複合體佐劑之黏膜佐劑活性為同等，暗示不會有受到變異插入處的差異之影響的可能性。

[產業上之可利用性]

本發明可利用於黏膜佐劑及包含其之黏膜疫苗製劑之製造領域。

本說明書中引用的全部刊物、專利及專利申請案直接作為參考而併入本說明書。

<110> 第一三共股份有限公司大阪大學

<120> 黏膜疫苗用佐劑

<130> PH-6219TW

<150> JP2014-116241

<151> 2014-06-04

<160> 28

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 肉毒桿菌

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Claims

一種佐劑，其係包含由肉毒桿菌B型肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分HA1、HA2、及HA3所形成的複合體蛋白質的佐劑，其特徵為HA1為下述之(a)記載之蛋白質，HA2為下述之(c)記載之蛋白質，HA3為下述之(e)記載之蛋白質，(a)包含序列識別號1所示的胺基酸序列中的第7號~第294號之胺基酸序列的蛋白質；(c)包含序列識別號2所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；(e)包含序列識別號3所示的胺基酸序列中的第19號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號3所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質。
一種佐劑，其係包含由肉毒桿菌A型肉毒毒素之紅血球凝集素(HA)之亞成分HA1、HA2、及HA3所形成的複合體蛋白質的佐劑，其特徵為HA1為下述之(g)記載之蛋白質，HA2為下述之(i)記載之蛋白質，HA3為下述之(k)記載之蛋白質，(g)包含序列識別號15所示的胺基酸序列中的第6號~第293號之胺基酸序列的蛋白質；(i)包含序列識別號16所示的胺基酸序列中的第2號~第146號之胺基酸序列的蛋白質；(k)包含序列識別號17所示的胺基酸序列中的第20號~第626號之胺基酸序列的蛋白質，即包含序列識別號17所示的胺基酸序列之第473號之白胺酸、第508號之甲硫胺酸、第569號之苯丙胺酸、或第607號之離胺酸之任一個以上之胺基酸被取代為其他胺基酸的胺基酸序列的蛋白質。
如請求項1或2之佐劑，其中其他胺基酸為丙胺酸。
如請求項1或2之佐劑，其於與疫苗抗原同時使用、或於疫苗抗原投予前或抗原投予後使用。
如請求項4之佐劑，其中該疫苗抗原為流行性感冒抗原。
如請求項1或2之佐劑，其係經黏膜投予。
如請求項6之佐劑，其中經黏膜投予係鼻腔內投予。
一種黏膜疫苗製劑，其包含疫苗抗原、與如請求項1至7中任一項之佐劑。