TWI650420B - 免疫保護性初代間質幹細胞及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明描述免疫保護性初代間質幹細胞(Immunoprotective primary mesenchymal stem cells，IP-MSC)，其游離地(episomally)表現多種免疫活性多肽，特異性靶向病原體(例如病毒、細菌或寄生蟲之感染性種類)或毒素。該IP-MSC表現兩種或兩種以上(例如2至約100種)免疫活性多肽(例如完全抗體、單鏈抗體(ScFV)、Fab或F(ab)2抗體片段、雙功能抗體(diabodies)、三功能抗體(tribodies)及其類似物)及視情況一或多種其他免疫調節多肽，例如細胞激素，諸如介白素(interleukin)(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9及IL-12)、干擾素(例如IFNα、IFNβ或IFNω)及其類似物，可增強該免疫活性多肽之有效性。
Description
本申請案為2013年3月14日提出申請之美國申請案第13/826,285號之部分接續申請案，其以全文引用的方式併入本文中。
本發明係關於間質幹細胞(mesenchymal stem cell)。更特定言之，本發明係關於用於遞送針對病理性試劑(諸如病原體及毒素)具有免疫活性之多肽的初代間質幹細胞(MSC)以及製備該等MSC及使用該等針對病理性試劑之MSC的方法。
此申請案之生物序列資訊包括於ASCII正文檔案中，該ASCII正文檔案具有檔案名稱「TU-491-SEQ.txt」，產生於2013年3月11日且具有12,954字節之檔案大小，其以引用之方式併入本文中。
間質幹細胞(MSC)係目前用作針對多種病症(包括癌症及自體免疫疾病)之基因治療載體之獨特多潛能祖細胞。儘管主要已知MSC在同種異體MSC移植期間之消炎特性，但有證據表明在一定背景下MSC可實際上提昇應變性免疫性。MSC已在廣泛多種組織中識別出，該等組織包括骨髓、脂肪組織、胎盤及臍帶血。脂肪組織為已知的最富含
MSC之來源中之一者。
已成功地在多種臨床及臨床前背景下將MSC移植進入同種異體宿主。此等供體MSC常常提昇免疫耐受性，包括對移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GvHD)之抑制，該抑制可在自主要組織相容複合體(major histocompatibility complex，MHC)失配的供體移植細胞或組織之後發展。MSC轉移之後減少的GvHD症狀已歸因於對T細胞及B細胞增殖之直接MSC抑制，停止自然殺傷細胞之細胞毒性及樹突狀細胞(dendritic cell，DC)成熟。至少一種研究已報告針對移植的同種異體MSC之抗體之產生。儘管如此，能夠預防GvHD亦表明表現外來抗原之MSC可能在細胞疫苗接種期間具有優於其他細胞類型(亦即DC)之優勢，該優勢在於選擇性誘發僅對由MSC且不特定為供體MSC表現之外來抗原之免疫反應。
亦已活體內探索經修飾之MSC之用途以便增強MSC之免疫調節特性。MSC經轉導以在小鼠模型中過度產生IL-10抑制之膠原蛋白誘發的關節炎(Choi等人，2008)。此外，移植進入阿茲海默氏症小鼠模型之表現升糖素樣胜肽-1之MSC導致大腦中的A-β沈積減少(Klinge等人，2011)。在骨質減少的小鼠模型中，接受具有穩定的骨形態生成蛋白之過度表現之轉導MSC的小鼠具有增加的骨密度(Kumar等人，2010)。在脊髓損傷之大鼠模型中，用穩定地過度表現大腦衍生神經營養因素之MSC治療的大鼠具有比僅投與MSC之大鼠更佳的總體結果(Sasaki等人，2009)。最後，在膀胱出口阻斷之大鼠模型中，接受具有肝細胞生長因子之穩定的過度表現之轉導MSC的大鼠具有降低的膀胱中之膠原蛋白堆積(Song等人，2012)。此等研究表明經修飾之MSC為適用的及可行的用於表現蛋白質及遞送蛋白質以靶向多種疾病及組織之媒劑。
由於MSC之歸屬腫瘤微環境之先天性傾向，因此已研究MSC作
為抗癌治療劑之遞送媒劑，且在(Loebinger及Janes，2010)中充分綜述。MSC亦已用於經由IFNα或IFNγ之表現促進致瘤細胞之凋亡(Li等人，2006；Ren等人，2008)。另外，最近已探索MSC用於預防及抑制腫瘤形成及轉移。Wei等人之研究檢驗在投與轉移性纖維肉瘤細胞之小鼠腫瘤模型中與經修飾的E7融合蛋白質疫苗組合之人類乳突狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)不朽化MSC(表現HPV蛋白質E6/E7)之用途(Wei等人，2011)。此小組發現僅經使用表現E7之MSC及經修飾之E7蛋白質痘苗而免疫的小鼠顯示腫瘤生長之減緩及E7特定抗體反應。單獨接受MSC或蛋白質疫苗之小鼠不能夠產生抗E7反應或抑制轉移性肉瘤之腫瘤生長。儘管預先確定此等不朽化MSC為非致瘤的，不同於在投與之後僅在極短時間內即可偵測之初代MSC(亦即非不朽化)，該等不朽化MSC存留在小鼠中長於21天(Gao等人，2001；Abraham等人，2004；Ohtaki等人，2008；Prockop，2009)。因此，即使不朽化MSC被證明為非惡性的，使用不朽化MSC可能在長期中存在未預見的結果(亦即未在此研究中評定之與內源性MSC外部競爭及使免疫調節能力不同)。其他研究已表明不朽化MSC可能變為致瘤的，且因此必須謹慎研究以確定其是否對於使用確實安全。移植的初代非不朽化MSC僅存留活體內至多幾天(Gao等人，2001；Abraham等人，2004；Ohtaki等人，2008；Prockop，2009)。
雖然主要針對MSC之免疫抑制特性稱讚MSC，然若干公開報告亦已直接顯示MSC提昇應變性免疫性。在共培養物中，MSC促進B細胞增殖、IL-6表現及分泌IgG之漿細胞活體外形成；此等B細胞反應可經與TLR促效劑(脂多醣或CpG DNA)組合之MSC進一步增強。受破傷風類毒素脈衝之MSC促進破傷風類毒素特定CD4 T細胞株之增殖及細胞激素表現(IL-4、IL-10、IFNγ)。類似地，在存在抗原下用淋巴細胞以低比率(1：100)培養的MSC改進淋巴細胞增殖及部分與IL-6及TGFβ
相關之CD4 Th17亞型形成。亦已發現MSC表現MHC-I及交叉存在用於活體外及活體內擴增CD8 T細胞之抗原。
亦已發現MSC免疫調節取決於外部信號。在存在發炎性細胞激素或刺激劑下，預先抑制之MSC治療可能變為免疫刺激性。舉例而言，經特定病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)分子處理之MSC可能變為抗發炎性的或促發炎性的，視用於活體外處理MSC之PAMP而定。在膠原蛋白誘導的關節炎(一種發炎性疾病)背景期間，同種異體MSC之移植據報道促進Th1免疫反應及IL-6分泌，其藉由MSC之直接TNFα刺激活體外模擬。亦據報導投與MSC加劇膠原蛋白誘導的關節炎疾病且擴增IL-6及IL-17之脾細胞分泌。據報導使用IFNγ預處理MSC(在適度範圍內)上調MHC-I及MHC-II表現且改進抗原吞噬作用及呈現能力，進而刺激CD4及CD8 T細胞增殖及抗腫瘤CD8+細胞毒性T-淋巴細胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTLs)之產生。
疫苗常常為有效及有成本效益的預防感染性疾病之手段。疫苗已證明在根除一種破壞性疾病天花中變化的潛能，同時提供控制其他疾病之能力，該等疾病包括以前引起普遍發病率及死亡率之白喉、脊髓灰質炎及麻疹。疫苗之研發包含病原體之減毒或不活化型式之測試或病原體組分(亦即亞單位、類毒素及類似病毒之顆粒疫苗)之識別，當接受者暴露於實際病原體時該病原體組分引發保護其免於疾病的免疫反應。在理想的世界中單一疫苗將能夠靶向所有主要人類病原體(通用)，在不誘發非所需副作用的情況下引發對此等病原體之強保護性免疫性，且生產每劑量仍相當便宜。在病毒或宿主細胞產生的蛋白質的情況下，包括人類轉譯後加工、模擬天然感染之疫苗生產將可能證明為優於細菌或其他表現體系。
迄今為止傳統疫苗方法未能提供針對HIV、肺結核、瘧疾及許多
其他疾病(包括登革熱、疱疹及甚至感冒)之保護。為何傳統疫苗方法對於此等疾病尚未成功的原因複雜且多變。舉例而言，HIV整合功能性原病毒基因組進入宿主細胞之DNA，進而確定潛伏或存留。一旦確定潛伏/存留，即使使用高度活性抗反轉錄病毒治療，已不可能根除HIV。
更新替代性免疫接種方法包括DNA及細胞疫苗。DNA疫苗包括使用編碼抗原之質體轉染在疫苗接種之組織部位處的細胞，該編碼抗原之質體使得局部細胞(亦即肌細胞)就地產生疫苗抗原。細胞疫苗直接轉移表現或呈現該疫苗抗原之受預脈衝或轉染的宿主抗原呈現細胞(例如樹突狀細胞、DC)。此等方法之優勢為疫苗抗原係活體內產生且易於供免疫學加工使用。儘管有大量成功的臨床前測試報告，該等方法仍受到阻礙。人類中的DNA疫苗接種研究顯示不良功效，已將其與小鼠與人類之間的先天性差異相聯繫(Cavenaugh等人，2011；Wang等人，2011)。DC疫苗接種策略已顯示對於治療性癌症疫苗接種之有限臨床成功且因需要個人定製所致而具有較高生產成本(Bhargava等人，2012；Palucka及Banchereau，2012)。
當前疫苗技術上之另一侷限性為涉及研發針對給定病原體之疫苗中的時間。在暴露於新出現的病原體與故意或偶然釋放的病原體及毒素之情況下此係尤其難以解決，其中需要用於快速保護以限制該等新出現的病原體及生物威脅之手段。本文所述之方法及游離轉染之MSC滿足此等需求。
本發明提供免疫保護性初代間質幹細胞(immunoprotective primary mesenchymal stem cell，IP-MSC)以及製備與使用IP-MSC之方法，該等IP-MSC游離地表現多種特異性地靶向病原體(例如病毒、細菌或寄生蟲之感染性物質)或毒素之免疫活性多肽。使用一或多種編
碼兩種或兩種以上(例如2至約100種)可表現的免疫活性多肽(例如完全抗體、單鏈可變抗體片段(single chain variable antibodies fragment，ScFV)、Fab或F(ab')2抗體片段、雙功能抗體、三功能抗體及其類似物)之游離型載體來轉染IP-MSC。視情況，IP-MSC可表現一或多種其他免疫調節多肽，例如諸如介白素(interleukin)(例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9及IL-12)、干擾素(interferon)(例如IFNα、IFNβ或IFNω)之細胞激素及其類似物，其可增強抗原結合多肽中和病原體或毒素之有效性。各免疫活性多肽包含來自中和抗體(例如來自暴露個體之原生抗體)或該中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列，該中和抗體對由病原體產生的抗原具有特異性或對毒素具有特異性，或包含抗原結合區之變異體之胺基酸序列，該抗原結合區之變異體在其胺基酸序列中包括一或多個取代(例如保守取代)，且較佳地與原生抗原結合區共享至少約50%序列一致性(例如至少約60%、70%、80%、90%或95%序列一致性)。各抗原結合區胜肽或其變異體係經配置及定向以特異性結合至且中和病原體或毒素。
在一些實施例中，IP-MSC表現例如至少2、3、4、5或6種免疫活性多肽，或高達約10、20、30、40、50、60、70、80、90或100種免疫活性多肽，該等免疫活性多肽特異性地靶向病原體或毒素。舉例而言，各免疫活性多肽可特異性地靶向且結合至來自病原性生物體之蛋白質或其片段、或結合至毒素(例如蓖麻毒素、相思子毒素、炭疽病毒素、肉毒毒素)，該毒素可由生物體就地產生或可以化學分離或純化形式遇到。
IP-MSC適用於產生針對或治療因病原體或暴露於毒素所導致之感染的被動免疫性(例如藉由中和)。可在醫藥學上可接受之載劑(例如緩衝液(諸如磷酸鹽緩衝鹽水)或任何其他適合於維持有活力的轉染初代MSC之緩衝材料)中提供IP-MSC來用作用於治療或預防由病原體所
導致的感染性疾病或改善毒素之有害影響之醫藥組合物。在一些實施例中，IP-MSC包含骨-骨髓衍生MSC，而在一些其他實施例中，IP-MSC包含脂肪MSC細胞、胎盤MSC細胞或臍帶血MSC細胞。
本文所述之IP-MSC尤其適用於針對病原體及毒素之至少部分臨時被動保護，因為初代MSC為通常不由免疫系統靶向之低免疫性細胞。因此，經治療的個體可耐受IP-MSC，允許細胞存活對於待表現、產生及釋放之免疫活性多肽結合至且中和個體已暴露或可能暴露至的病原性生物體或毒素而言足夠的時間。此外，初代MSC通常在身體中具有有限的壽命，因此改善用MSC治療之非所需長期副作用(例如致癌性)的可能性，該長期副作用可能為不朽化MSC之問題。
提供本發明之以下實施例1至35以進一步說明本發明之範疇及各種態樣。提供此等實施例作為本文所述之IP-MSC及方法之非限制性說明。
實施例1包含免疫保護性初代間質幹細胞(IP-MSC)，其游離地表現多種特異靶向病原體或毒素之免疫活性多肽。使用一或多種編碼免疫活性多肽之游離型載體轉染IP-MSC。各免疫活性多肽包含來自對由病原體產生的抗原具有特異性或對毒素具有特異性之中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列，或抗原結合區序列之變異體之胺基酸序列，該抗原結合區序列之變異體在其胺基酸序列中包含一或多個取代且與抗原結合區之序列共享至少約50%序列一致性；且抗原結合區序列或其變異體係經配置且定向以特異性結合至且中和病原體或毒素；且其中游離型載體視情況包括誘導性細胞凋亡基因。
實施例2包含實施例1之IP-MSC，其中IP-MSC游離地表現2至約100種免疫活性多肽。
實施例3包含實施例1或2之IP-MSC，其中IP-MSC亦表現一或多種其他免疫調節劑。
實施例4包含實施例3之IP-MSC，其中一或多種免疫調節劑選自介白素及干擾素。
實施例5包含實施例3之IP-MSC，其中一或多種免疫調節劑係選自L-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-9、IL-12、IFNα、IFNβ及IFNω。
實施例6包含實施例1至5中之任一者之IP-MSC，其中各免疫活性多肽係選自全長抗體、單鏈可變抗體片段(single-chain variable antibody fragment，ScFV)、單價抗體抗原結合片段(monovalent antibody antigen-binding fragment，Fab)、二價抗體抗原結合片段(divalent antibody antigen-binding fragment，F(ab')2)、雙功能抗體及三功能抗體。
實施例7包含實施例1至6中之任一者之IP-MSC，其中免疫活性多肽中之一或多者包含抗原結合區之變異體之胺基酸序列，且其中變異體之胺基酸序列取代包含保守取代。
實施例8包含實施例1至7中之任一者之IP-MSC，其中免疫活性多肽中之一或多者包含抗原結合區之變異體之胺基酸序列，且其中變異體之胺基酸序列與抗原結合區之序列共享至少約80序列一致性。
實施例9包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為病毒病原體。
實施例10包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為細菌病原體。
實施例11包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為單細胞寄生蟲病原體。
實施例12包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為多細胞寄生蟲病原體。
實施例13包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為選自由以下各者組成之群之病毒病原體：腺病毒；乳突狀瘤病毒；嗜
肝DNA病毒(hepadnavirus)；小病毒；痘病毒；EB病毒(Epstein-Barr virus)；巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)；單純疱疹病毒；玫瑰疹病毒(roseolovirus)；水痘帶狀疱疹病毒；絲狀病毒；副黏液病毒；正黏液病毒；棒狀病毒；沙粒狀病毒；冠狀病毒；人類腸道病毒；A型肝炎病毒；人類鼻病毒；脊髓灰質炎病毒；反轉錄病毒；輪狀病毒；黃病毒；C型肝炎病毒；及風疹病毒。
實施例14包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中病原體為來自選自由以下各者組成之群之屬的細菌病原體：芽孢桿菌屬(Bacillus)；博特氏桿菌屬(Bordetella)；疏螺旋體屬(Borrelia)；布氏桿菌屬(Brucella)；伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)；曲狀桿菌屬(Campylobacter)；衣原體(Chlamydia)、披衣菌(Chlamydophila)；梭菌屬(Clostridium)；棒狀桿菌屬(Corynebacterium)；腸球菌屬(Enterococcus)；埃希氏菌屬(Escherichia)；弗朗西斯氏菌屬(Francisella)；嗜血桿菌屬(Haemophilus)；螺旋桿菌屬(Helicobacter)；軍團菌屬(Legionella)；鉤端螺旋體屬(Leptospira)；李斯特氏菌屬(Listeria)；分枝桿菌屬(Mycobacterium)；黴漿菌屬(Mycoplasma)；奈瑟氏菌屬(Neisseria)；假單胞菌屬(Pseudomonas)；立克次體屬(Rickettsia)；沙門氏菌屬(Salmonella)；志賀桿菌屬(Shigella)；葡萄球菌屬(Staphylococcus)；鏈球菌屬(Streptococcus)；密螺旋體屬(Treponema)；弧菌屬(Vibrio)；及耶氏菌屬(Yersinia)。
實施例15包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中該病原體為選自由以下各者組成之群之寄生蟲病原體：棘阿米巴蟲(Acanthamoeba)；異尖線蟲(Anisakis)；蛔蟲(Ascaris lumbricoides)；大腸纖毛蟲(Balantidium coli)；絛蟲類(Cestoda)(絛蟲(tapeworm))；恙蟲；螺旋蠅(Cochliomyia hominivorax)；溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)；肝片吸蟲(Fasciola hepatica)；梨形鞭毛蟲(Giardia lamblia)；鉤蟲；利什曼原蟲(Leishmania)；鋸齒狀舌形蟲(Linguatula serrata)、肝吸蟲；羅阿絲狀蟲(Loa loa)；並殖吸蟲屬(Paragonimus)(肺吸蟲)；蟯蟲；惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)；住血吸蟲(Schistosoma)；糞擬圓蟲(Strongyloides stercoralis)；絛蟲；弓蟲(Toxoplasma gondii)；錐蟲(Trypanosoma)；鞭蟲；及潘氏絲狀蟲(Wuchereria bancrofti)。
實施例16包含實施例1至8中之任一者之IP-MSC，其中抗原多肽係選自由以下各者組成之群：流感血球凝集素1(hemagglutinin 1，HA1)；流感血球凝集素2(HA2)；流感神經胺糖酸酶(neuraminidase，NA)；拉沙病毒(Lassa virus，LASV)醣蛋白1(glycoprotein 1，gp1)；LASV醣蛋白2(gp2)；LASV核衣殼相關蛋白質(nucleocapsid-associated protein，NP)；LASV L蛋白質；LASV Z蛋白質；SARS病毒S蛋白質；伊波拉病毒GP2；麻疹病毒融合體1(fusion 1，F1)蛋白質；HIV-1跨膜(transmembrane，TM)蛋白質；HIV-1醣蛋白41(gp41)；HIV-1醣蛋白120(gp120)；C型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)包膜醣蛋白1(envelope glycoprotein 1，E1)；HCV包膜醣蛋白2(E2)；HCV核衣殼蛋白質(p22)；西尼羅河病毒(West Nile virus，WNV)包膜醣蛋白(E)；日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)包膜醣蛋白(E)；黃熱病病毒(yellow fever virus，YFV)包膜醣蛋白(E)；蜱媒腦炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TBEV)包膜醣蛋白(E)；G型肝炎病毒(hepatitis G virus，HGV)包膜醣蛋白1(E1)；呼吸道合胞體病毒(respiratory synctival virus，RSV)融合體(F)蛋白質；單純疱疹病毒1(herpes simplex virus 1，HSV-1)gD蛋白質；HSV-1 gG蛋白質；HSV-2 gD蛋白質；HSV-2 gG蛋白質；B型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)核心蛋白；EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)醣蛋白125(gp125)；細菌外膜蛋白質組合因子BamA；細菌易位組合模組蛋
白質TamA；細菌多肽運輸相關蛋白質域蛋白質；細菌表面抗原D15；炭疽病保護性蛋白質；炭疽病致死性因子；炭疽病水腫因子；傷寒沙門氏菌S1Da；傷寒沙門氏菌S1Db；霍亂毒素；霍亂熱休克蛋白；肉毒梭菌(Clostridium botulinum)抗原S；肉毒桿菌毒素；耶氏桿菌(Yersina pestis)F1；耶氏桿菌V抗原；耶氏桿菌YopH；耶氏桿菌YopM；耶氏桿菌YopD；耶氏桿菌纖維蛋白溶酶原活化因子(Pla)；瘧原蟲環子孢子蛋白質(circumsporozoite protein，CSP)；瘧原蟲子孢子表面蛋白質(SSP2/TRAP)；瘧原蟲肝階段抗原1(liver stage antigen 1，LSA1)；瘧原蟲輸出蛋白質1(exported protein 1，EXP 1)；瘧原蟲紅血球結合抗原175(erythrocyte binding antigen 175，EBA-175)；瘧原蟲富半胱胺酸保護性抗原(cysteine-rich protective antigen，cyRPA)；瘧原蟲熱休克蛋白70(heat shock protein 70，hsp70)；住血吸蟲Sm29；及住血吸蟲信號轉導蛋白質14-3-3。
實施例17包含實施例1至16中之任一者之IP-MSC，其中IP-MSC係自骨髓衍生間質幹細胞製備。
實施例18包含實施例1至16中之任一者之IP-MSC，其中IP-MSC係自脂肪衍生間質幹細胞製備。
實施例19包含實施例1至18中之任一者之用於治療病原體之感染或來自暴露於毒素的毒性的IP-MSC。
實施例20包含實施例1至18中之任一者之用於預防病原體之感染或預防來自暴露於毒素之毒性的IP-MSC。
實施例21包含用於治療由病原體所導致的感染或治療暴露於毒素之醫藥組合物，該醫藥組合物包含在醫藥學上可接受之載劑中的實施例1至20中之任一者之IP-MSC。
實施例22包含用於預防由病原體所導致的感染或用於改善暴露於毒素之影響的醫藥組合物，該醫藥組合物包含在醫藥學上可接受之
載劑中的實施例1至20中之任一者之IP-MSC。
實施例23包含實施例1至20中之任一者之IP-MSC的用途，其用於預防由病原體所導致之感染或預防來自暴露於毒素之毒性。
實施例24包含實施例1至20中之任一者之IP-MSC的用途，其用於治療由病原體所導致的持續感染或用於改善暴露於毒素之影響。
實施例25包含實施例1至20中之任一者之IP-MSC的用途，其用於製造用以治療由病原體所導致的感染或用於改善暴露於毒素之影響的醫藥組合物。
實施例26包含實施例1至20中之任一者之IP-MSC的用途，其用於製造用以預防由病原體所導致的感染或預防來自暴露於毒素之毒性的醫藥組合物。
實施例27包含一種治療由病原體所導致的感染或治療暴露於毒素之方法，其包含向個體投與治療有效劑量的實施例1至20中之任一者之IP-MSC。
實施例28包含一種預防由病原體所導致的感染或預防來自暴露於毒素之毒性之方法，其包含向個體投與預防性劑量的實施例1至20中之任一者之IP-MSC。
實施例29包含一種治療或預防爆發由病原體所引起的疾病或改善暴露於毒素之方法，其包含向暴露於或處於暴露於病原體或毒素之危險的個體投與免疫保護性初代間質幹細胞(IP-MSC)之步驟；其中使用一或多種編碼至少兩種免疫活性多肽之游離型載體轉染IP-MSC，該等免疫活性多肽特異性地靶向病原體或毒素，各免疫活性多肽包含對病原體或毒素具有特異性之中和抗體之抗原結合區，或編碼該抗原結合區之變異體，其中該變異體在該抗原結合區之胺基酸序列中包括一或多個取代且與該中和抗體之抗原結合區共享至少50%序列一致性。
實施例30包含實施例29之方法，其包括使用一或多種編碼至少兩種免疫活性多肽之游離型載體轉染初代間質幹細胞之其他步驟。
實施例31包含實施例30之方法，其包括在轉染初代MSC之前識別獲自一或多個病原性疾病或毒素暴露之倖存者的一或多個血液樣品中該病原體或毒素之中和抗體之其他步驟。
實施例32包含實施例29至31中任一者之方法，其包括在轉染初代MSC之前製備一或多種游離型載體之其他步驟，該等游離型載體編碼至少兩種或兩種以上免疫活性多肽之可表現胺基酸序列。
實施例33包含實施例29至32中任一者之方法，其中IP-MSC係選自實施例1至20中之任一者。
實施例34包含一種製備預防性或治療性間質幹細胞的方法，該等間質幹細胞用於治療或預防爆發由病原體所引起的疾病或用於改善暴露於毒素，該方法包含以下步驟：使用一或多種游離型載體轉染初代間質幹細胞以產生表現免疫活性多肽之免疫保護性初代間質幹細胞(IP-MSC)，該等游離型載體編碼至少兩種免疫活性多肽，該等免疫活性多肽包含對該病原體或毒素具有特異性之中和抗體之抗原結合區的胺基酸或編碼該抗原結合區序列之變異體；其中該變異體在來自該抗原結合區之胺基酸序列中包括一或多個取代且與該中和抗體之抗原結合區序列共享至少50%序列一致性。
實施例35包含實施例34之方法，其包括在轉染初代MSC之前自獲自一或多個病原性疾病或毒素暴露之倖存者的血液樣品識別病原體或毒素之中和抗體之附加步驟。
實施例36包含實施例34或實施例35之方法，其包括在轉染初代MSC之前製備一或多種游離型載體之附加步驟，該等游離型載體編碼至少兩種或兩種以上免疫活性多肽之可表現的胺基酸序列。
實施例37包含實施例34至36中之任一者之方法，其中IP-MSC係
選自實施例1至20中之任一者。
實施例38包含一種編碼免疫保護性多肽之可表現的胺基酸序列之游離型載體；其中各免疫活性多肽包含來自對由病原體產生的抗原具有特異性或對毒素具有特異性之中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列或抗原結合區序列之變異體之胺基酸序列，該抗原結合區序列之變異體在其胺基酸序列中包含一或多個取代且與抗原結合區序列共享至少約50%序列一致性；抗原結合區序列或其變異體經配置以特異性結合至且中和病原體或毒素；且其中游離型載體視情況包括誘導性細胞凋亡基因。
圖1提供全長IgG抗體、ScFV、串接雙功能抗體及三功能抗體之圖解說明。
圖2示意性地展示用於轉染如本文所述之初代MSC之游離型載體(圖A)；及用於轉染人類脂肪MSC以表現人類抗-LASV MAb GP19.7E之雙順反子載體(圖B)。
圖3展示人類抗-LASV IgG MAb GP10.4B(SEQ ID NO：1)及人類抗-LASV MAb GP19.7E(SEQ ID NO：1)之重鏈之核苷酸序列。
圖4展示人類抗-LASV IgG MAb GP10.4B(SEQ ID NO：3)及人類抗-LASV MAb GP19.7E(SEQ ID NO：4)之輕鏈之核苷酸序列。
圖5展示人類抗-LASV IgG MAb GP10.4B(HC：SEQ ID NO：5；LC：SEQ ID NO：7)及人類抗-LASV MAb GP19.7E(HC：SEQ ID NO：6；LC：SEQ ID NO：8)之重鏈與輕鏈之胺基酸序列。
圖6提供經人類抗-LASV IgG MAb GP10.4B及人類抗-LASV MAb GP19.7E治療的天竺鼠與經不含抗體之培養基治療的對照天竺鼠相比，倖存者之百分比與LASV感染後天數的關係圖示。
本文所述之免疫保護性初代間質幹細胞游離地表現多種特異性地靶向所關注之病原體或毒素的免疫活性多肽。各免疫活性多肽包含對由病原體產生的抗原具有特異性或對毒素具有特異性之中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列或抗原結合區之變異體之胺基酸序列，該抗原結合區之變異體在其胺基酸序列中包含一或多個取代且與抗原結合區共享至少約50%序列一致性。抗原結合區或其變異體經配置及定向以特異性結合至且中和病原體或毒素，亦即當IP-MSC與病原體或毒素接觸時，例如當向個體投與IP-MSC且個體暴露於病原體或毒素時。變異體中的取代可包含保守取代或由保守取代組成，或在一些情況下相對於原生抗原結合區增強變異體之結合親和力或結合選擇性之非保守取代，或提高、增強或另外合乎需要地影響免疫活性多肽之一或多種特性(諸如物理、化學或構形特性)者。
可潛在地採用IP-MSC針對任何可識別中和抗體之病原體或毒素。本文所述之IP-MSC及方法尤其適用於提供一種可相對快速展開但短期(例如至多一個月或兩個月)的針對病原體或毒素之被動免疫性。該等病原體包括病毒、細菌、寄生蟲(單細胞及多細胞寄生蟲)及其類似物。舉例而言，在故意或偶然釋放病原體或毒素之情況下，IP-MSC可用作保護劑。此外，針對特定病原性病毒(例如LASV、伊波拉病毒、登革熱病毒)、細菌(傷寒立克次體(Rickettsia typhi)、奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis)、疏螺旋體屬(Borrelia spp.)、霍亂弧菌(Vibrio cholerae)及其類似物)或寄生蟲(例如瘧原蟲(Plasmodium)、錐蟲(Trypanosoma)、利什曼原蟲(Leishmania)、住血吸蟲(Schistosoma)及其類似物)之IP-MSC可用作行進至病原體為地方性的區域之個體之臨時保護，或用於預防一般由醫院中之病患獲得之感染(例如耐二甲氧苯青黴素之金黃色葡萄球菌(Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus)、綠膿桿菌(Psuedomonas Aeruginosa)、耐萬古
黴素之腸球菌(Vancomycin-Resistant Enterococci)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)及其類似物)。
圍繞MSC設計的治療劑之重要促成因素為在培養中易於分離及擴增MSC。理論上，MSC之單一骨髓收集可得到足夠的用於數千臨床應用之MSC，歸因於其內在擴增能力(Newman等人，2009)。該擴增可能性極大地促進MSC用於臨床應用之GMP製造能力且當與其他細胞類型相比時具有較低的生產成本。
如本文所使用，術語「免疫活性多肽」及其語法變體係指包括編碼所關注之病原體或毒素之中和抗體的抗原結合區或抗原結合區之變異體之胜肽的多肽，該抗原結合區之變異體保持對於病原體或毒素之特異性但與原生抗體結構之不同之處在於在原生抗原結合區之胺基酸序列中存在一或多個取代(例如保守取代)。免疫活性多肽之非限制性實例包括全長抗體(例如IgG抗體)、該等全長抗體之抗原結合片段及其他包括一或多個該等經配置及定向以結合至抗原之抗體的互補決定區(complementarity determining region，CDR)之多肽。功能性抗原結合抗體片段包括Fab、F(ab')2、Fv、ScFv、雙功能抗體及三功能抗體多肽。
如本文所使用，術語「抗原結合區」係指結合至抗原之抗體之位點。抗原結合區由重鏈可變域及輕鏈可變域(VH及VL)構成，其中之每一者包括四個保守構架區(framework regions，FR)及三個CDRs。CDRs在序列方面變化且確定抗體對特定抗原之特異性。VH及VL域一起形成特異性地結合特定抗原之位點。
Fab(抗原結合片段)抗體片段為包含由多肽及聚胜肽構成之抗體之單價抗原結合域的免疫活性多肽，該多肽由重鏈可變區(VH)及重鏈恆定區1(CH1)部分組成，該聚胜肽由輕鏈可變(VL)及輕鏈恆定(CL)部分組成，其中CL及CH1部分較佳地藉由在Cys殘基之間的雙硫鍵結合
在一起。
FV抗體片段為含有VH及VL域之二聚體。
F(ab')2片段係由兩個藉由在其CH1部分之間的雙硫橋鍵結合在一起的Fab型多肽構成。
ScFV(「單鏈可變片段」或「單鏈抗體」)為包含藉由可撓性的通常親水性的鍵聯胜肽接合在一起之VL及VH胜肽之免疫活性多肽，該鍵聯胜肽具有足夠長度(通常約15個胺基酸之長度)以使得VL及VH以抗原結合組態締合。一種常見可撓性鍵聯胜肽為(Gly4Ser)3。視情況，可藉由一或多個分子間雙硫鍵來穩定VH及VL之締合。
如本文所使用及如在此項技術中一般理解，術語「雙功能抗體」係指包含(a)兩個藉由較短胜肽或在兩個ScFV之間(例如在VL部分之間)的鍵而鍵聯在一起以形成串接二聚ScFV的ScFV或(b)包含兩個類似ScFV之多肽之複合物的免疫活性多肽，該等類似ScFV之多肽中之鍵聯胜肽太短而不能得到在相同多肽鏈之VL及VH之間的直接相互作用以致強制兩個該等分子分子間締合為二聚體。雙功能抗體之兩個抗原結合域可對相同抗原或兩個不同抗原具有特異性。
如本文所使用及如在此項技術中一般理解，術語「三功能抗體」係指包含三個類似ScFV之抗原結合域之免疫活性多肽。在結構上，三功能抗體為由兩個藉由雙硫橋鍵結合在一起的多肽鏈構成的二聚體，其中第一多肽包含經由CL多肽鏈鍵聯至附加VL域之ScFV，且第二多肽包含經由CH1多肽鏈鍵聯至附加VH域之ScFV。雙硫橋鍵在CL中的Cys殘基與CH1中的Cys殘基之間形成，以使得第一多肽之附加VL與第二多肽之附加VH以抗原結合組態締合，以使得呈整體形式之三功能抗體包括三個抗原結合域。三功能抗體之三個抗原結合域可對相同抗原或兩個或三個不同抗原具有特異性。
圖1示意性地展示如上文所論述的全長IgG抗體、ScFV、串接型
雙功能抗體及三功能抗體。
除非本文另外指明或明顯與內容矛盾，否則在描述本發明之內容中(尤其在以下申請專利範圍之內容中)使用術語「一」及「該」及類似指示物應理解為涵蓋單個與複數個。除非另外說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應理解為開放的術語(亦即意謂「包括(但不限於)」)。除非本文另外指示，否則本文中數值範圍之列舉僅意欲充當單獨提及屬於該範圍之各獨立值之簡寫方法，且各獨立值如同在本文中單獨地敍述一般併入本說明書中。除非本文另外指明或與內容明顯矛盾，否則本文所述之所有方法可以任何適合之順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲更好地闡明本發明且並不對本發明之範疇造成限制。本說明書中之語言不應視作指示任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。
較佳地，免疫保護性多肽與天然存在之(原生)抗體之抗原結合區共享至少約50%序列一致性(例如與天然存在之抗體抗原結合區共享至少約55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列一致性)。如本文所使用，術語「天然存在之抗體」、「原生抗體」及其語法變體係指對所關注之病原體或毒素具有特異性之抗體，其自暴露於病原體或毒素之個體之血液樣品識別出。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之病毒病原體之非限制性實例包括：腺病毒；乳突狀瘤病毒；嗜肝DNA病毒(例如B型肝炎)；小病毒；痘病毒(例如小痘病毒、牛痘病毒)；EB病毒；細胞巨大病毒(cytomegalovirus，CMV)；單純疱疹病毒；玫瑰疹病毒；水痘帶狀疱疹病毒；絲狀病毒(例如伊波拉(Ebola)病毒及馬堡(Marburg)病毒)；副黏液病毒(例如麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、人類呼吸道合胞體病毒(RSV)、
副流感病毒、新城雞瘟病毒(Newcastle disease virus)及人類偏肺病毒)；正黏液病毒(例如A型流感、B型流感及C型流感)；棒狀病毒(例如狂犬病毒屬，亦稱為狂犬病病毒)；沙粒狀病毒(例如拉沙病毒)；冠狀病毒(嚴重急性呼吸道症候群(SARS))；人類腸病毒；A型肝炎病毒；人類鼻病毒；脊髓灰質炎病毒；反轉錄病毒(例如人類免疫缺陷病毒1(HIV-1))；輪狀病毒；黃病毒屬(例如西尼羅河病毒、登革熱病毒、黃熱病病毒)；肝炎病毒(例如C型肝炎病毒)；及風疹病毒。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之細菌病原體之非限制性實例包括任何來自選自以下各者之屬的病原性細菌物質：芽孢桿菌屬；博特氏桿菌屬；疏螺旋體屬；布氏桿菌屬；伯克霍爾德氏菌屬；曲狀桿菌屬；衣原體、披衣菌；梭菌屬；棒狀桿菌屬；腸球菌屬；埃希氏菌屬；弗朗西斯氏菌屬；嗜血桿菌屬；螺旋桿菌屬；軍團菌屬；鉤端螺旋體屬；李斯特氏菌屬；分枝桿菌屬；黴漿菌屬；奈瑟氏菌屬；假單胞菌屬；立克次體屬；沙門氏菌屬；志賀桿菌屬；葡萄球菌屬；鏈球菌屬；密螺旋體屬；弧菌屬；及耶氏菌屬。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之寄生蟲病原體之非限制性實例包括單細胞寄生蟲及多細胞寄生蟲，諸如：棘阿米巴蟲；異尖線蟲；蛔蟲；大腸纖毛蟲；絛蟲類(絛蟲)；恙蟲；螺旋蠅；溶組織內阿米巴；肝片吸蟲；梨形鞭毛蟲；鉤蟲；利什曼原蟲；鋸齒狀舌形蟲；肝臟吸蟲；羅阿絲狀蟲；並殖吸蟲屬(肺吸蟲)；蟯蟲；惡性瘧原蟲；住血吸蟲；糞擬圓蟲、絛蟲、弓蟲；錐蟲；鞭蟲；及潘氏絲狀蟲。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之病毒抗原之非限制性實例包括：流感多肽(諸如血球凝集素1(HA1)、血球凝集素2(HA2)及神經胺糖酸酶(NA))；拉沙病毒(LASV)多肽(諸如LASV醣蛋白1(gp1)、LASV醣蛋白2(gp2)、LASV核衣殼相關蛋白質
(NP)、LASV L蛋白質及LASV Z蛋白質)；SARS病毒多肽(諸如SARS病毒S蛋白質)；伊波拉病毒多肽(諸如伊波拉病毒GP2)；麻疹病毒多肽(諸如麻疹病毒融合體1(F1)蛋白質)；HIV-1多肽(諸如HIV跨膜(TM)蛋白質、HIV醣蛋白41(gp41)、HIV醣蛋白120(gp120))；C型肝炎病毒(HCV)多肽(諸如HCV包膜醣蛋白1(E1)、HCV包膜醣蛋白2(E2)、HCV核衣殼蛋白(p22))；西尼羅河病毒(WNV)多肽(諸如WNV包膜醣蛋白(E))；日本腦炎病毒(JEV)多肽(諸如JEV包膜醣蛋白(E))；黃熱病病毒(YFV)多肽(諸如YFV包膜醣蛋白(E))；蜱媒腦炎病毒(TBEV)多肽(諸如TBEV包膜醣蛋白(E))；G型肝炎病毒(HGV)多肽(諸如HGV包膜醣蛋白1(E1))；呼吸道合胞體病毒(RSV)多肽(諸如RSV融合體(F)蛋白質)；單純疱疹病毒(HSV)多肽(諸如HSV-1 gD蛋白質、HSV-1 gG蛋白質、HSV-2 gD蛋白質及HSV-2 gG蛋白質)；B型肝炎病毒(HBV)多肽(諸如HBV核心蛋白)；及EB病毒(EBV)多肽(諸如EBV醣蛋白125(gp125))。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之細菌抗原之非限制性實例包括：外膜蛋白質組合因子BamA；易位組合模組蛋白質TamA；多肽運輸相關蛋白質域蛋白質；來自廣泛多種細菌物質之細菌表面抗原D15；炭疽芽孢桿菌多肽(諸如炭疽病保護性蛋白質、炭疽病致死性因子及炭疽病水腫因子)；傷寒沙門氏菌多肽(諸如S1Da及S1Db)；霍亂弧菌多肽(諸如霍亂毒素及霍亂熱休克蛋白)；肉毒梭菌多肽(諸如抗原S及肉毒桿菌毒素)；及耶氏桿菌多肽(諸如F1、V抗原、YopH、YopM、YopD及纖維蛋白溶酶原活化因子(Pla))。
可藉由經本文所述之IP-MSC產生的免疫保護性多肽靶向之寄生蟲抗原之非限制性實例包括：瘧疾(瘧原蟲)多肽(諸如環子孢子蛋白質(CSP)、子孢子表面蛋白質(SSP2/TRAP)、肝臟階段抗原1(LSA1)、輸出蛋白質1(EXP 1)、紅血球結合抗原175(EBA-175)、富半胱胺酸保
護性抗原(cyRPA)及瘧原蟲熱休克蛋白70(hsp70))；及住血吸蟲多肽(諸如Sm29及信號轉導蛋白質14-3-3)。
較佳地，IP-MSC係非經腸投與(例如靜脈內、皮下或肌肉內注射或輸液)。IP-MSC可與醫藥學上可接受之載劑媒劑(例如無菌水、生理鹽水、右旋糖溶液、磷酸鹽緩衝鹽水及類似適合於投與活幹細胞的材料)結合調配成溶液、懸浮液或乳液。視情況，維持等張性(例如甘露糖醇)或化學穩定性(例如防腐劑)之添加劑可包括於載劑中。
如本文所使用，「治療有效劑量」為當投與IP-MSC時導致減輕或消除已經存在的疾病症狀之量(例如IP-MSC之數目)(例如約十萬至約一億個細胞)。向個體投與之劑量及劑數(例如單劑或多劑)將隨多種因素而變化，包括投與途徑、病患病征及特徵(性別、年齡、體重、健康狀況、身材)、症狀程度、並行治療、治療頻率及所需效果、由IP-MSC表現之抗原多肽之身分與數目及其類似因素。現有劑量範圍之調節及操控以及在個體中測定IP-MSC之治療有效性的活體外及活體內方法係充分在醫療技術中之一般技術者之能力內。
「預防劑量」為當投與MSC時預防病原體(由IP-MSC表現之多肽自其衍生)之感染的量(例如IP-MSC之數目)(例如約十萬至約一億個細胞)。向個體投與之劑量及劑數(例如單劑或多劑)將隨多種因素而變化，包括投與途徑、病患病征及特徵(性別、年齡、體重、健康狀況、身材)、症狀程度、並行治療、治療頻率及所需效果、由IP-MSC表現之抗原多肽之身分與數目及其類似因素。現有劑量範圍之調節及操控以及在個體中測定IP-MSC之預防有效性的活體外及活體內方法係充分在醫療技術中之一般技術者之能力內。
如本文所使用，術語「游離地轉染」及其語法變體係指使用外源性游離型DNA(例如質體或其他游離型載體)非整合轉染以產生具有未改變之染色體DNA之細胞，其中由DNA編碼之多肽係在MSC內之
游離體中表現，亦即在無外源性DNA之基因組整合之情況下。如本文所使用，術語「游離體」及其語法變體係指在細胞核中複製的封閉環形DNA分子，且意欲包涵引入MSC中之外源性質體。較佳地，初代MSC係使用編碼抗原多肽之質體轉染，且較佳地亦編碼調節元件(例如啟動子)以有助於抗原多肽之游離型表現。視情況，亦可使用誘導性細胞凋亡基因游離地轉染MSC從而當由適合之信號活化(例如使用四環素控制之轉錄活化(Tetracycline-Controlled Transcriptional Activation)，亦稱為「Tet-on及Tet-off」，其中四環素或多西環素用於開啟凋亡基因之轉錄)時誘發細胞死亡(細胞凋亡)，使得必要或需要時(例如若出現非所需副作用)可自個體消除IP-MSC。術語「游離型載體」係指包含質體或其他編碼抗原多肽之環形DNA的表現載體。
可藉由任何適合之方法游離地轉染初代MSC。舉例而言，可使用電穿孔、脂質體轉染及其類似方法使用編碼抗原多肽之質體轉染初代MSC。電穿孔為用於轉染之較佳方法，不同於其他使用陽離子脂質之轉染方法(亦即脂質體轉染)，當加工用於遞送之MSC時脂質體轉染方法在轉染之後可能存在可能不能完全移除的殘餘脂質，且可能引起未預見的副作用。
適合於用作轉染真核細胞(例如初代MSC)之非整合載體之游離型載體之非限制性實例包括基於猿猴病毒40之載體、基於EB病毒之載體、基於乳突狀瘤病毒之載體、基於BK病毒之載體及其類似物，其在分子遺傳技術中已為吾人所熟知。
本文亦描述一種治療或預防病原性疾病或改善暴露於毒素之方法，其利用本文所述之IP-MSC。一個方法實施例包含以下步驟：視情況識別獲自病原性疾病或毒素暴露之一或多個倖存者之血液樣品中該病原體或毒素之中和抗體；使用一或多種編碼至少兩種免疫活性多肽之游離型載體轉染初代間質幹細胞以產生表現免疫活性多肽之IP-
MSC，該等免疫活性多肽包含對該病原體或毒素具有特異性之中和抗體(例如在步驟(a)中識別的抗體)之抗原結合區或編碼該抗原結合區之變異體；及向暴露於或處於暴露於該病原體或毒素之危險的個體投與IP-MSC。變異體(若採用)在該抗原結合區之胺基酸序列中包括一或多個取代，較佳地與該中和抗體之抗原結合區共享至少50%序列一致性。
運輸來自暴露於病原劑或毒素之倖存者之免疫細胞的先進方法. 來自血液樣品之周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)之分離及低溫貯藏應保留儘可能多之B細胞之完整性，以確保最終回收率與豐富及罕有特異性之特徵。作為概念之驗證，使用基於現代重組蛋白質之免疫診斷法識別在西非臨床研究點(Kenema Government Hospital，Sierra Leone and Irrua Specialist Teaching Hospital，Nigeria)之恢復期拉沙熱(LF)病患。在完全知情同意之後抽取全血，且在專用及配備齊全的細胞培養套組中分離PBMC。使用現有緩衝液(RPMI/20%FBS△/10%DMSO)及方法(約-1℃/min之冷卻速率至約-80℃之最終溫度，>5×106個細胞/瓶)冷凍保存PBMC，在解凍後產生極有活力的細胞培養物。樣品在IATA核准的低溫容器中快速運輸至U.S.用於進一步加工。在低溫貯藏之前B細胞之數目及百分比係藉由定量流動式細胞測量術(藉助於高度便攜型BD ACCURIC6細胞計數器)，藉由測定來自各分離程序之PBMC且特別是B細胞(CD19+、CD20+)、T細胞(CD3+、CD4+、CD8+)、NK細胞(CD16+、CD56+)及單核細胞(CD14+、CD16+)之總數現場評估。在解凍時重複該程序以確定PBMC及細胞亞群損失率。類似程序可用於識別其他由文件証明最近感染之個體之PBMC產生的抗體(例如流感抗體)。適當時(如在流感中)可繞過低溫貯藏，允許自抽取的新鮮血液分離B細胞。
在自病原體或毒素恢復之指標病患中快速測定微生物群落之方法. 為說明可快速部署MSC基因遞送平台作為針對高風險族群(戰士、第一反應者等)之抗高度傳染性疾病之防火道，使用在Sierra Leone或Nigeria中識別的新穎病原體作為模型。此緊密複製或模擬在暴露於病原體或毒素(例如已知或未知病因)以及故意釋放或偶然釋放的病原體或毒素之後約2週至3週病患可達的情境。
微生物宏基因組、微生物核酸之不偏特徵可快速識別在自未知生物威脅恢復的病患中的感染性病原體。通常藉由培養或藉由靶向分子方法(諸如PCR或抗原捕獲)識別存在於臨床樣品中的微生物。培養為耗時的且許多微生物根本不能活體外培養。靶向方法亦為不利的，因為其要求先驗瞭解該生物體。來自Sierra Leone及Nigeria之未知原因發熱(fever of unknown origin，FUO)樣品中約30%之微生物讀數在基因銀行資料庫中不匹配。本文所述之技術為靈敏的(亦即能夠在內源性微生物之不同混合物中偵測低複本病原體)及可縮放的(亦即能夠快速考察較大數目之病患樣品)。使用低於奈克量之RNA研發用於構造Illumina定序庫之經改良的分子方法。當前的庫構造方法係按比例擴大的因此可同時加工數百個樣品。研發可快速識別所有存在於大規模下一代定序資料集中之微生物的生物資訊管線。現場使用此等方法，在約2天內自未知病毒及在約4天內自未知細菌組合全基因組。
識別病原體毒性決定因素(例如病毒進入醣蛋白或毒素)之電腦程式. 毒性因素係指使得微生物能夠在人類中自身產生及增強其引起疾病之可能性的蛋白質(亦即基因產物)。研發可快速識別來自大型宏基因組資料集之先前未知生物之毒性因素的生物資訊及計算管線，其利用若干公開可供使用的毒性因素數據庫(MvirDB、Tox-Prot、SCORPION、PRINTS毒性因素、VFDB、TVFac、Islander、ARGO及VIDA之子集)，且實現針對新完成的基因組序列資料之毒性因素之快
速(在幾個小時內)識別。進行實驗以確認程式正確識別可由保護性抗體靶向之毒性因素之能力。
保護性抗體. 藉由使用MACS分離器(Miltenyi Biotec)及塗佈有例如αCD2、CD4、CD11b、CD16、CD36、αIgE、CD235a及其類似物之磁性顆粒消耗來自PBMC之非B細胞來富集B細胞。結合至經螢光染料標記的重組毒性決定因素(例如LASV GP或流感病毒血球凝集素，HA)之抗原特異性循環記憶B細胞係藉由流動式細胞量測術分類且以單細胞密度直接沈積於96孔培養盤中。自單細胞(Norgen Biotek，Qiagen)分離RNA且反轉錄成cDNA，伴以免疫球蛋白重鏈及輕鏈之連續擴增。定製設計的寡糖允許直接選殖重鏈及輕鏈基因進入專有載體用於表現為完全人類單株抗體(CHOLCelectTM，美國專利US 8076102，Luis M Branco等人，其以全文引用的方式併入本文中)，或經再改造為單鏈、雙功能抗體或三功能抗體以快速表現及自大腸桿菌培養物純化。針對結合至毒性決定因素(GP或HA)之ELISAs或病原體中和(基於擬顆粒)分析用於快速識別潛在地保護性抗體。具有所需特性的抗體在本文所述之多株表現載體中選殖，且以單一特異性形式在活病毒中和分析中測試以驗證在更相關活體外生物體系中的效能。
避免形成嵌合不恰當混雜抗體之方法. 為確保最廣泛適用的、保護性的且耐逸出突變的平台之研發，實施寡株抗體設計。為此目的，以全長及單鏈(ScFV)型式測試合乎需要地呈現中和特性之各抗體。歸因於關鍵抗原結合CDRs之真實表示，許多ScFV保留母體完整IgGs之特性。或者，雙功能抗體及三功能抗體組合可併入針對治療性用途之表現載體平台中。當在單個MSC內表現多於一種抗體時此IgG/ScFV寡株方法將防止形成不適當地混合的重鏈及輕鏈。在一些實施例中，藉由整合若干ScFVs及一種全長抗體達成治療效能之所需位準，該全長抗體之效應功能可經識別或一旦轉化為單鏈變異體後失去效能。
允許表現程度及持續時間足以保護以免攻擊之載體設計. 多複本、非感染性的、非整合的環形游離體用於表現同時針對多種(可能數百種)細菌、病毒、真菌或寄生蟲蛋白質或蛋白質類毒素之保護性完全人類單鏈抗體片段、全長IgGs或其他免疫活性多肽(參見圖1，其展示IgG、ScFV、雙功能抗體及三功能抗體型免疫調節劑)。在一些較佳實施例中，游離體係基於來源於EB病毒(EBV)核抗原1表現卡匣(EBNA1)之組份及複製之OriP來源。此等較佳地為所利用的EBV之唯一組份，以使得未複製或組合病毒。此體系在間質幹細胞中產生穩定的染色體外存留及長期異位基因表現。在本文所述之方法中，ScFVs或其他免疫活性多肽實際上以保護性含量在MSC中表現且自MSC分泌。hADMSC中的全長LASV中和抗體已表現為概念之驗證。基於EBV之游離體之在人類細胞中引入及維持極大型人類基因組DNA片段(>300kb)的能力為本文所述之方法之另一顯著優勢。此特徵允許在載體中選殖許多表現元件，該載體能夠在細菌中複製、經受大規模純化、轉染進入hMSC及以游離型質體形式複製。免疫活性多肽(例如ScFVs)之靶向表現程度對於各免疫活性多肽為約10pg/細胞/日，較佳地表現程度為5pg/細胞/日。對於各免疫活性多肽而言生產率為10pg/細胞/日之含有約1×1011MSC輸液每日產生約1公克可溶性多肽，在75kg成人之循環中相當於15mg/mL含量(適合之治療性劑量位準)。啟動子及其他調節元件用於驅動各類型之免疫調節分子之表現。
文獻中的若干報告表明來自MSC中的充分特徵化啟動子的非經典表現模型。人類細胞巨大病毒主要直接早期基因啟動子(CMV-MIE)為已知的最強啟動子中之一者，且為在生成每公升多公克產生重組蛋白質藥物之穩定哺乳動物細胞株中之主要元件。然而在MSC中相對不充分地轉錄CMV-MIE。相比之下，EF1A、UBC及CAGG啟動子已在
無明顯跡象或啟動子沉默之情況下表明MSC中之高表現程度。在本文所述之方法中所採用的游離型載體可包括任何該等啟動子。圖2圖A提供pEBV MSC游離型載體之代表性及非限制性實例之圖解說明。亦針對大腸桿菌中的質體之擴增提供不含抗生素選擇標記之表現載體。
游離型質體之複製性質使用干擾耐抗生素性基因之開放閱讀框架之限制核酸內切酶來消除其線性化。因此，可設想基因重組將引起耐抗生素性基因之表現，可能在人類中在選定的情況下產生非所需耐抗生素性介導的副作用。若需要或期望，可藉由使用用於大腸桿菌菌株中的質體之生長及傳播之代謝可選標記取代耐抗生素性基因來避免此情境。
針對個體治療性分子之靶向表現程度之調節元件的設計及關閉. 採用載體中的調節元件來調整所關注之各免疫調節分子之期望的分泌含量及血清含量。全長抗體、ScFV或其他免疫活性多肽之表現受益於強啟動子(例如CMV、EF1A、CAGG等)以在投與MSCs之後在不到一天內達成治療性血清含量。其他免疫調節分子(諸如細胞激素)常常藉由MSC在較低程度下短暫表現及分泌。為調整所需的不同程度之可撓性及表現之時序，自低級基本啟動子(亦即TK)或經由來自Tet on/off啟動子之控制誘導來驅動該等基因。Tet啟動子體系受益於無害的諸如無水四環素之抗生素類似物之使用，該無水四環素在低於使用四環素2個自然對數之濃度下活化Tet啟動子，並未引起腸菌族之調節異常，並未引起對聚酮抗生素之耐性，且並未呈現抗生素活性。無水四環素充分可溶於水，且可投與至飲用口糧中以強化選定的基因在轉染之MSC中之活化。無水四環素之潛在毒性，可藉由投與諸如多西環素之其他類似物規避人體中的四環素之一級斷裂產物，該多西環素為亦活化Tet on/off啟動子體系之經FDA批准的四環素類似物。較佳地在故障安全「切斷開關(kill switch)」之設計中採用此體系，該故障安全
「切斷開關」之設計為藉由在不適當之副作用的情況下或當所期望的治療性端點已達成時嚴格調節有效促凋亡基因(例如Bax)之誘導性表現以引發經轉染MSC之靶向細胞凋亡。Tet-on體系中之最新進展已在至多低於在初始Tet體系(Tet-On AdvancedTM，Tet-On 3GTM)中100倍之濃度下引起對啟動子洩漏性及對Dox的反應性之大幅增強抑制。藥物可選標記並非用於維持經轉染MSC中的載體穩定性：基於EBV之載體，已知其複製及在每細胞循環90%-92%之速率下持留於子細胞中。
載體安全/免疫原性研究. 因為游離體不會產生複製病毒，且其中表現該等游離體之細胞不會以任何顯著量產生MHC分子，游離體不會引起將防礙平台在個體中的連續使用之載體衍生的免疫性。此可藉由設計偵測對來源於EB病毒(EBV)核抗原1表現卡匣之組份及對MSC背景(HLA分型)之免疫反應的靈敏分析(抗體ELISA及基於T細胞之分析)來確認。進行基因研究以探究EBV整合進入宿主細胞染色體(FISH，Southern blot，qPCR)之速率，且量測載體之短暫複製性質。已報告EBV載體在不存在可選標記之情況下每細胞循環保留約90%至92%複製。降低的複製率有助於自宿主體系清除載體。藉由跟蹤螢光標記細胞來在非人類靈長類動物(non-human primates，NHP)中評估注射的MSC之區室化，該等螢光標記細胞預負載有一旦酯化將不再跨過脂質雙層且變為高度螢光的細胞膜可滲透染料(綠色CMFDA、橙色CMTMR)。於新鮮製備的組織部分(淋巴結、肝、脾、肌肉、大腦、胰、腎、腸、心、肺、眼、雄性及雌性生殖組織)上或經由全身掃描進行該等量測。加工附加組織部分以便分離DNA及RNA用於載體序列及相應轉錄物之分析。對各免疫活性多肽、細胞激素及關閉轉錄物具有特異性之寡糖之設計允許評估所有組織中的個體基因表現。在一些組織中一些啟動子比其他啟動子更加主動地轉錄，要求評估注射之後的周邊組織之較佳的MSC之定域及MSC之停留與重組基因之相應轉錄
活性。為此目的，可包括兩個人工「條形碼」核酸標記，一個對Tet on/off驅動的RNA轉錄物具有特異性，而另一個對游離型載體DNA具有特異性。此等標記允許在NHP及人類基因組及轉錄組背景中快速識別極獨特序列(參見圖2)。
MSC作為用於治療性分子之短暫遞送媒劑. MSC經受大規模電穿孔，具有高達90%效率。MaxCyte,Inc.(Gaithersburg,MD)出售「MaxCyte® VLXTM Large Scale Transfection System」，其為佔據面積較小、易於使用的針對在無菌、封閉轉染環境中之極大容量短暫轉染而特別設計的儀器。使用流動電穿孔技術，MAXCYTE VLX可在不到約30分鐘內轉染高達約2×1011個細胞，其中在無菌、封閉的轉染環境中具有高細胞生活力及轉染效率。此cGMP順應體系適用於自實驗室經由cGMP試驗及商業製造快速生產重組蛋白質。MSC可在大規模細胞培養環境中在化學限定(CD)培養基中生長。生物加工改造中的最新進展已引起CD調配物之快速發展，該等CD調配物支持MSC之大規模擴增而不損失多能性特徵及基因穩定性之保持。脂肪衍生MSC可易於使用產生約1×108個MSC之一般程序自吸脂程序取得，因此在儲備(大致25次加倍，>3×1015個細胞)剩餘壽命及加倍數目(大致25)之前提供用於活體外擴增之充足細胞數目，該加倍數目足以在輸液之後維持活體內治療性分子之表現及遞送若干週。在48至72小時範圍內MSC一般顯示加倍速率，因此可能提供在50天至75天範圍內之活體內壽命。輸入的MSC之周轉率可藉由量測轉基因產物之循環程度來評估，且可藉由根據在人類中的血液、鼻吸入物及尿液中之qPCR偵測EBV序列來評估。在期望的治療性時間間隔之後可藉由藉助於建置於表現載體中的促凋亡基因之控制誘導性表現誘發自毀壞來達成MSC之基本完全消除。亦可評估在注射之後循環MSC衍生免疫活性多肽或其他免
疫調節劑之含量及在NHP中載體誘導的自體免疫性或GVHD反應。在人類中，可量測與自體免疫或同種異體的免疫反應相關之附加標記，諸如肝損傷之生物標記(ALT、AST)、肝之生物標記(ALB、BIL、GGT、ALP等)及腎功能標記(BUN、CRE、尿素、電解質等)。
分離、表徵及儲備用於治療性用途之MSC. 淋巴造血系抗原之表現之缺乏區分MSCs與造血細胞、內皮細胞、內皮祖細胞、單核細胞、B細胞及紅血球母細胞。初代MSC為非永生的且因此受初代細胞之約50個區段之「海弗利克限制(Hayflick limit)」。儘管如此，擴增能力為巨大的，一個細胞能夠產生高達約1015個子細胞。另外，MSC具有較低的批次間變化。可藉由彙集較大數目之預篩選的供體脂肪組織衍生之MSC產生能夠快速保護數百萬處於風險下之個體的細胞庫尺寸：活體外100個供體，1×108個細胞/供體×25代=約3×1017個細胞；約1×1011個細胞/輸液=約3百萬劑量。兩種方法可用於生成治療性MSC庫：(1)分離、擴增、測試、儲備，之後為轉染、回收及投與；及(2)分離、擴增、測試、轉染、儲備以在融化及短暫回收後產生即將投與的細胞。
就表徵而言，可測試主細胞庫之無菌性、黴漿菌，活體外及活體內外源因子測試、反轉錄病毒測試、細胞識別、電子顯微鏡及多個特異性病毒PCR分析(FDA在其1993及1997導引文件中要求14，且已用若干推薦的病毒(另外，主要為多瘤病毒)擴充彼清單)。在初代培養條件下在可能初始使用血清之情況下可針對牛病毒之9CFR圖進行測試。同樣，若在標準操作期間細胞與豬類動物產物接觸，則較佳地進行針對豬類動物病毒之測試。
藥物代謝動力學/藥效動力學(PK/PD). 使用MSC用於組織修復之侷限性中之一者已為在活體外擴增及再注射進入人體(細胞自其衍生)之後細胞不可能永久移植器官。MSC循環有限時間(例如若干週或若
干月)，無論注射進入MHC匹配抑或不匹配的個體。在成人MSC普遍基因遞送平台之研發中的此特定缺點在本文所述之方法中為益處。可在NHP中對於研發的各經改造的遞送載體平台評估在經轉染MSC中表現之各轉基因之藥物代謝動力學(PK)概況。在食蟹獼猴中進行一次合乎需要之單次劑量PK研究，使用經靜脈(IV)投與的經轉染MSC。在此類研究中分別向2隻雄性猴及2隻雌性猴靜脈內(i.v.)投與高劑量(約1011個細胞)、中間劑量(約108個細胞)及較低劑量(約105個細胞)之MSC。
待評價的端點包括：籠側觀測、體重、定性食物消耗、眼科學、心電圖、臨床病理學(例如血液學、化學作用、凝聚、尿分析)；免疫學(例如免疫球蛋白及周邊白血球(諸如B細胞、T細胞及單核細胞))；免疫原性；總體病變(例如屍體解剖及選定的器官重量)；病理組織學；組織結合；及藥物代謝動力學。可使用在第1、3、6、12、24、36、48及63天利用抗體特異性捕獲及偵測(HRP標記的反標識)試劑之合格夾層類型ELISA來監測各重組抗體之血清濃度歷時9週。可藉由使用WINNONLIN軟體(Pharsight Corp.)之無隔室方法執行PK分析。各抗體之藥物代謝動力學參數可以最大血清濃度(Cmax)、劑量標準化血清濃度(Cmax/D)、自時間0至無限在濃度-時間曲線下之面積(AUC0-∞)、自時間0至無限在濃度-時間曲線下之劑量標準化面積(AUC0-∞/D)、總體消除率(CL)、以穩態分佈之容量(Vss)、在終端相期間之分佈之表觀容量(Vz)、末端消除相半衰期(t1/2,末端)及平均滯留時間(MRT)表示。在新鮮製備的組織部分上或經由全身掃描可藉由如上文所述跟蹤螢光標記細胞來評估NHP中注射的MSC之周邊循環及隔室化，該等螢光標記細胞預負載有細胞膜可滲透CMFDA或CMTMR染料。可藉由如上文所概述之qPCR來監測載體DNA序列及轉錄物。
可再用性. 存在大量的概括活體內針對MSC之排斥反應缺乏之文獻。儘管如此，可在NHP中使用多次注射經同源及異源DNA載體修飾
之同基因型MSC來評價此現象，之後為同種異體反應之免疫學概況分析。舉例而言，可使用一個同基因型MSC大丸劑注射一組NHP，同基因型MSC使用表現LASV抗體之游離型載體轉染，而另一組使用表現流感抗體之類似載體轉染。可每週評估對MSC平台及對載體之組份之免疫反應歷時77天之時程，期間應偵測任何免疫學反應。在藉由投與多西環素或其他四環素類似物激活關閉機制之後可以類似方式評估NHP中之安全性及免疫原性。在施以多西環素療程之後，可以類似方式評估對載體組份及MSC遞送平台之不利免疫學反應，例如首先對於最初2週而言每半日評估，隨後對於另外的77天而言每週評估。可藉由確立之分析跟蹤凋亡細胞死亡之另外的標記，諸如增加的血清乳酸去氫酶(serum lactic dehydrogenase，LDH)及卡斯蛋白酶，及在循環MSC中之磷脂醯絲胺酸(phosphatidyl serine，PS)。若在此77日時間段之後對載體及MSC之免疫學反應為不可偵測的，可使用同源MSC再注射NHP，一組使用經同源載體轉染之MSC，而另一組將接受異源DNA載體。同源及異源載體將具有相同背景，但具有不同重組抗體譜。此方法可說明針對MSC及表現DNA載體之免疫原性，與重組抗體譜無關。評估針對MSC平台之免疫學反應之77日時刻表係基於對食蟹獼猴中之人類抗體多劑量毒物動力學研究進行選擇，該等研究顯示在此時間段內以10mg/kg投與的重組抗體之最大血清含量降低平均5000倍。
在該等研究中，在首次投與之後一些NHP在大約50至60天可能出現抗人類抗體反應，同時一些動物可能從未出現可偵測的對異源IgG之體液反應。
運輸MSC. 合乎需要地，可在允許溫鏈(37℃)運輸遺傳修飾的MSC，從而使得消除冷鏈運輸，伴以提高的樣品容量及細胞監測技術之裝置中運輸MSC，諸如來自MicroQ Technologies之裝置。此等裝置維持精確的溫熱的溫度自約24小時至約168小時，藉以給予充足時間
用於在世界上任何地方使用備用治療。可引入另外的用於儲存及運輸囊封細胞之容量，且按需要可製備能夠支持氣體交換的膠囊。自囊封至投與的經過時間將考慮IP-MSC中的代謝變化、細胞生長速率、生活力中的變化及任何將影響效能之另外的產物變化。
注入表現保護性抗體之MSC的獼猴中之攻擊研究。 使用表現抗-LASV GP單鏈抗體之獼猴MSCs注入食蟹獼猴，隨後藉由使用1000空斑形成單位(plaque forming unit，pfu)之LASV病毒(Josiah病毒株)肌肉內(IM)注射來攻擊，且如Geisbert等人Animals showing clinical signs consistent with terminal LF are euthanized所述評估。在攻擊之後，加工生物樣品用於藉由空斑分析及RT-PCR來量測病毒血症。定序病毒RNA以識別在NHPs中治療時是否出現GPC基因中之特異性突變。對於任何死於攻擊之動物而言，取用包括組織、血液及其他身體流體之多種生物樣品用於病理組織學、免疫組織化學、病毒分離及基因組偵測。藉由進行一系列西方墨點法及ELISA分析來監測存活獼猴之對病毒抗原的體液反應以偵測對主要病毒結構蛋白(G1、G2、NP、Z)之任何抗體反應之證據。使用表現針對流感病毒之保護性抗體之MSC構築體的類似研究係用於人類攻擊研究。
提供以下非限制性實例來說明本文所述之IP-MSC及方法之某些特徵及態樣。
自來自Sierra Leone之不早於出院之後8週及至多康復數月的確診的成人拉沙熱病(Lassa fever，LF)倖存者收集約三十毫升全血。藉由菲科爾(Ficoll)梯度離心自血液樣品分離周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將其冷凍保存且在絕熱包裝(dry shipper)中運輸至美國。在96孔培養盤中以低密度塗覆PBMC之培養
物，且使用R848及介白素-2(IL-2)刺激用於B細胞之多株激活。篩選來自在刺激之後顯示菌落生長的孔之上清液用於人類IgG結合至塗佈有重組表現之LASV NP、GPC(GP1+GP2)、GP1或Z蛋白質之ELISA培養盤。擴張、選殖及再篩選具有顯著反應性之純系。自產生對LASV蛋白質之IgG特異性之B細胞純系分離RNA。藉由RT-PCR擴增來自IgG之人類輕鏈(LC)及重鏈(HC)基因，且在線性單鏈表現載體中選殖。使用匹配的LC及HC構築體共轉染HEK-293T細胞以分析個體LASV人類單株抗體(human monoclonal antibodies，huMAbs)之表現及純化較小量之用於初步活體外表徵研究之抗體。
自Sierra Leone運送的冷凍PBMCs具有產生抗體之記憶B細胞之優良生活力及高頻率。分離多於75個來自不同病患之醣蛋白之獨立B細胞純系。在免疫沈澱及ELISA分析中確定LASV GPC組分特異性huMAbs之結合及特異性概況。
LASV空斑減少中和測試(plaque reduction neutralization test，PRNT)分析。可在感染Vero或Vero E-6細胞之前使用多種各MAb之稀釋液(例如約10pM至約300nm)預培育拉沙病毒(Josiah、GA391及803213病毒株，其存在良好天竺鼠模型且為可供使用的)。可在感染之後藉由使用磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline，PBS)洗滌兩次來移除病毒，且可將具有0.5%瓊脂糖覆層之細胞培養基添加至各培養物。在中性染紅色之後可在其後約48小時計數空斑。隨後繪製抑制程度相對於濃度之曲線且可計算IC50(阻斷50%進入所需之蛋白質的量)。
兩種命名為GP10.4B及GP19.7E之識別的LASV huMAbs在LASV空斑減少中和測試(PRNT)分析中展示活體外病毒中和。GP19.7E明顯地比10.4B更加有效。huMAbs GP10.4B及GP19.7E亦展現顯著針對活LASV之中和潛能。GP10.4B及GP19.7E之重鏈(HC)及輕鏈(LC)核苷酸
序列顯示於圖3(HC)及圖4(LC)中。相應胺基酸序列顯示於圖5中。
脂肪組織衍生MSC以約1百萬個細胞/孔之密度在補充有10% FBS之經修飾的伊格爾培養基α(modified Eagle's medium alpha，MEM alpha)培養基中接種於6孔培養盤中。第二天，根據製造商建議使用LIPOFECTAMINE 2000(Invitrogen)或PEI(Polyplus)及pCMVintA_17HSD：huMAb 19.7E構築體來轉染細胞：使用最佳Kozak序列及去卷積5' UTRs再改造來自huMAbs GP19.7E之輕鏈及重鏈抗體基因，且以串接形式及在相反方向上在雙順反子哺乳動物表現載體中選殖(圖3，圖B)。在短暫轉染之HEK-293T/17細胞中，相反方向基因構築體產生比來自串接對應物高之分泌的抗體含量。藉由使用相反抗體基因構築體轉染來產生表現huMAb GP19.7E之NS0細胞株。轉染後約48小時，採集上清液且在用於ELISA之1×PBS/0.1% BSA/0.1% TWEEN-20中連續稀釋。使用此方法脂肪MSC產生約60 ng/mL之GP19.7E抗體，相較於空載體對照物之不可偵測的信號。
為說明抗-LASV IgG huMAbs之免疫治療活性，在與LASV攻擊同一天使用MAb GP19.7E及MAb GP10.4B分別為約30mg/Kg及15mg/Kg之單劑量注射遠親雜交天竺鼠。LASV Josiah適於藉由腹膜內(i.p.)途徑產生均一致死性模型之遠親雜交天竺鼠。此等遠親雜交天竺鼠展示與在近親天竺鼠病毒株13及人類中觀察到的彼等疾病類似之疾病之臨床病徵。到實驗之第16天，使用不含抗體的稀釋液注射之所有對照天竺鼠死亡，伴以拉沙熱病之典型病徵(圖6)。經huMAb治療之天竺鼠追蹤至21天。此等經huMAb治療之動物未死亡或顯示拉沙熱病之任何病徵。此等結果說明使用此拉沙病毒醣蛋白特異性huMAbs之組合進行治療不僅延長生存期，而且提供完全保護以免於拉沙病毒之致死性
影響。
本發明之較佳實施例描述於本文中，包括本發明人已知之進行本發明的最佳模式。在閱讀前文描述之後，彼等較佳實施例之變化對於一般熟習此項技術者可變得顯而易見。本發明人期望熟練的技術人員適當時採用該等變化，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之其他方式來實施本發明。相應地，若適用法律允許，則本發明包括在此隨附之申請專利範圍中所陳述之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文另外指明或者與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任一組合。
以下參考文獻及任何其他未特定列於下文之此前確認的參考文獻係以全文引用之方式併入本文中。
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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<212> DNA
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<220>
<223> huMAb GP10.4B單株抗體重鏈
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<400> 8
Claims (17)
- 一種免疫保護性初代間質幹細胞(Immunoprotective primary mesenchymal stem cells，IP-MSC)，其游離地(episomally)表現多種特異性靶向拉沙病毒(Lassa virus，LASV)之免疫活性多肽；該IP-MSC係經一或多種游離型載體轉染，該游離型載體編碼多種特異性靶向該LASV之可表現免疫活性多肽；其中各免疫活性多肽包含來自中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列，該中和抗體特異性結合LASV抗原且中和該LASV；且其中該游離型載體視情況包括誘導性細胞凋亡基因。
- 如請求項1之IP-MSC，其中該IP-MSC游離地表現2至約100種免疫活性多肽。
- 如請求項1或2之IP-MSC，其中各免疫活性多肽係選自全長抗體、抗體單鏈可變抗體片段(single-chain variable antibody fragment，ScFV)、單價抗體抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)、二價抗體抗原結合片段(divalent antibody antigen-binding fragment，F(ab')2)、雙功能抗體(diabody)及三功能抗體(tribody)。
- 如請求項1或2之IP-MSC，其中該拉沙病毒(LASV)抗原係選自：LASV醣蛋白1(glycoprotein 1，gp1)；LASV醣蛋白2(gp2)；LASV核衣殼相關蛋白質(nucleocapsid-associated protein，NP)；LASV L蛋白質及LASV Z蛋白質。
- 如請求項1或2之IP-MSC，其中該等IP-MSC係自骨髓衍生間質幹細胞或脂肪衍生間質幹細胞所製備。
- 一種用於治療拉沙病毒感染的醫藥組合物，該組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中之如請求項1至5中任一項之IP-MSC。
- 一種如請求項1至5中任一項之IP-MSC之用途，其用製備治療拉沙病毒感染之藥劑。
- 一種免疫保護性初代間質幹細胞(IP-MSC)，其游離地表現多種特異性靶向拉沙病毒(LASV)之免疫活性多肽；該IP-MSC係經一或多種游離型載體轉染，該游離型載體編碼多種特異性靶向該LASV之可表現免疫活性多肽；其中各免疫活性多肽包含來自中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列，該中和抗體對LASV抗原具有特異性；該抗原結合區序列係經配置以特異性結合該抗原且中和該LASV；其中該免疫活性多肽包含至少一單株抗體，該單株抗體選自：包含SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：7之輕鏈之單株抗體及包含SEQ ID NO：6之重鏈及SEQ ID NO：8之輕鏈之單株抗體。
- 如請求項8之IP-MSC，其中各免疫活性多肽係選自全長抗體、單鏈可變抗體片段(ScFV)、單價抗體抗原結合片段(Fab)、二價抗體抗原結合片段(F(ab')2)、雙功能抗體及三功能抗體。
- 如請求項8或9之IP-MSC，其中該等IP-MSC係自骨髓衍生間質幹細胞或脂肪衍生間質幹細胞所製備。
- 一種用於治療拉沙病毒感染的醫藥組合物，該組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中之如請求項8或9之IP-MSC。
- 一種如請求項8或9之IP-MSC之用途，其用製備治療拉沙病毒感染之藥劑。
- 一種免疫保護性初代間質幹細胞(IP-MSC)，其游離地表現多種特異性靶向拉沙病毒(LASV)之免疫活性多肽；該IP-MSC係經一或多種游離型載體轉染，該游離型載體編碼多種特異性靶向該LASV之可表現免疫活性多肽；其中各免疫活性多肽包含來自中和抗體之抗原結合區的胺基酸序列，該中和抗體對LASV抗原具有特異性；該抗原結合區序列係經配置以特異性結合該抗原且中和該LASV；其中該IP-MSC係自骨髓衍生間質幹細胞或脂肪衍生間質幹細胞所製備；且該LASV抗原係選自：LASV醣蛋白1(gp1)；LASV醣蛋白2(gp2)；LASV核衣殼相關蛋白質(NP)；LASV L蛋白質及LASV Z蛋白質。
- 如請求項13之IP-MSC，其中該免疫活性多肽包含至少一單株抗體，該單株抗體選自：包含SEQ ID NO：5之重鏈及SEQ ID NO：7之輕鏈之單株抗體；及包含SEQ ID NO：6之重鏈及SEQ ID NO：8之輕鏈之單株抗體。
- 如請求項13或14之IP-MSC，其中各免疫活性多肽係選自全長抗體、單鏈可變抗體片段(ScFV)、單價抗體抗原結合片段(Fab)、二價抗體抗原結合片段(F(ab')2)、雙功能抗體及三功能抗體。
- 一種用於治療拉沙病毒感染的醫藥組合物，該組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中之如請求項13或14之IP-MSC。
- 一種如請求項13或14之IP-MSC之用途，其用製備治療拉沙病毒感染之藥劑。
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