TWI649088B - 紫錐花及丹蔘萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及抗病毒組合物之製備方法 - Google Patents

紫錐花及丹蔘萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及抗病毒組合物之製備方法 Download PDF

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Abstract

本發明提供一種植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途，該植物萃取物包含一紫錐花萃取物、一丹蔘萃取物、或其組合，其係透過滅殺腺病毒、抑制腺病毒與腸病毒吸附與穿透細胞等方式阻止腺病毒及腸病毒感染。本發明亦提供一種對抗腺病毒及腸病毒之抗病毒組合物之製備方法。

Description

紫錐花及丹蔘萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及抗病毒組合物之製備方法
本發明係關於一種植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及該抗病毒組合物之製備方法，特別係關於紫錐花及丹蔘萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及包含紫錐花及丹蔘萃取物之抗病毒組合物之製備方法。
自從1969年腸病毒71型(Enterovirus 71，亦簡稱EV71)最初在美國加州被發現，其被認為與美國、歐洲、澳大利亞、日本、巴西、和馬來西亞等地之爆發有關。1988年以前，保加利亞、匈牙利、及馬來西亞先後在1975年、1978年、及1997年發生三次嚴重爆發，造成數十起致死案例。上一世紀最嚴重的腸病毒71型流行病於1998年在台灣爆發。統計報告顯示當時有129,106件手足口病(hand-foot-and-mouth disease)與疱疹性咽峽炎(herpangina)案例、405件嚴重神經系統併發症及肺水腫案例、以及78名孩童死亡。本世紀，腸病毒71型繼續在台灣以及其他亞洲國家流竄，因此造成沉重的疾病負擔。例如，自2007年以來腸病毒71型每年在中國大陸造成數百至上千件致死案例；在越南，有時會出現數十到幾百個腸病毒71型的致死病例(2005年、2007年、2009年、及2011年)。雖然在台灣已發展出腸病毒71型感染併發重症臨床處置建議，但死亡率的降低卻伴隨多數腦幹炎與心肺衰竭的倖存者可能具有神經系統後遺症和認知障礙。新近研究進一步證明中樞神經系統之腸病毒71型感染可能導致包括神經發育和認知功能方面的長期後遺症，亦可能增加注意力不足過動症(attention deficient and hyperactivity disorder，ADHD)的風險。腸病毒71型之疾病與實驗室持續監 測是有必要的，以利可能的早期控管和預防措施。然而，目前沒有可用的腸病毒71型特異性抗病毒藥物。
人類腺病毒(human adenoviruses)具有超過50種血清型，並且經常引起兒童的呼吸道疾病，以及在移植或免疫缺陷患者、有時甚至在免疫功能健全的成年人引起嚴重感染性疾病。由於腺病毒是透過飛沫散播，其容易在兒童間傳染，進而導致學校或幼稚園內的疾病爆發。根據台灣疾病管制局的統計，人類腺病毒是最常見的呼吸道病毒，且全年在台灣流傳。腺病毒3型和7型最近在台灣引起社區爆發，造成急性呼吸衰竭和致死病例，特別是年幼或罹患如神經系統疾病之病患往往會發展為嚴重甚至致死的疾病。因此，腺病毒感染會導致兒童重症負擔和令人憂心的併發症。
目前市面上缺乏治療腸病毒71型和人類腺病毒的特異性抗病毒藥物。因此，開發安全而有效的藥物以同時治療或預防腸病毒71型和人類腺病毒引起的嚴重疾病實為至關重要。
緣此，本發明之一目的在提供一種植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途，其中該植物萃取物包含一紫錐花(Echinacea purpurea)萃取物、一丹蔘(Salvia miltiorrhiza)萃取物、或其組合，該病毒包含一腺病毒，且進一步包含一腸病毒。
在本發明之一實施例中，該腺病毒為人類腺病毒3型(human adenovirus type 3，亦簡稱HAdV3)，該腸病毒為腸病毒71型。
在本發明之一實施例中，該紫錐花萃取物係以水或一醇水混合物萃取一紫錐花而製得，較佳為萃取一乾燥紫錐花的地上部；該丹蔘萃取物係以水或一醇水混合物萃取一丹蔘而製得，例如萃取一丹蔘的根部或根莖；該醇水混合物包含1-95%(v/v)之乙醇。
在本發明之一實施例中，該植物萃取物包含一紫錐花的水萃取物與一丹蔘的70%乙醇萃取物，其重量比為1：9至9：1，較佳為3：7。
在本發明之一實施例中，該紫錐花萃取物能抑制該腺病毒及該腸病毒吸附細胞，抑制該腺病毒穿透細胞，且能直接滅殺腺病毒。
在本發明之一實施例中，該丹蔘萃取物能抑制該腺病毒及該腸病毒吸附細胞，且能抑制該腺病毒及該腸病毒穿透細胞。
本發明之另一目的在提供一種對抗腺病毒及腸病毒之抗病毒組合物之製備方法，包含如下步驟：(a)以水或一醇水混合物萃取一紫錐花而獲得一紫錐花萃取物，(b)以水或一醇水混合物萃取一丹蔘而獲得一丹蔘萃取物，以及(c)以一特定比例混合該紫錐花萃取物與該丹蔘萃取物而獲得一抗病毒組合物。
在本發明之一實施例中，步驟(a)係以水萃取一乾燥紫錐花，該乾燥紫錐花與水之重量比為1：5至1：20，萃取起始溫度為95℃以上，而後降溫至60-80℃；步驟(b)係以一70%乙醇水溶液進行萃取，該丹蔘與該70%乙醇水溶液之重量比為1：5至1：10，萃取溫度為10-60℃；步驟(c)之該特定比例係一紫錐花的水萃取物與一丹蔘的70%乙醇萃取物的重量比為1：9至9：1，較佳為3：7。
本發明利用紫錐花萃取物、丹蔘萃取物、或其組合製備一種安全而有效的抗病毒組合物，因此提供一種抑制腺病毒及腸病毒感染的策略。該抗病毒組合物可藉由滅殺腺病毒、抑制腺病毒與腸病毒吸附與穿透宿主細胞等方式達到阻止或減少腺病毒與腸病毒感染的目標，並且具備預防及治療一個體因腺病毒與腸病毒感染所引發病症的潛力。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1A係為本發明紫錐花的水萃取物的高效液相層析(high performance liquid chromatogrphy，簡稱HPLC)層析圖譜，偵測波長為330nm；圖中波峰a代表咖啡它酸(17.0min)、波峰b代表綠櫞酸(19.6min)、波峰c代表洋薊酸(21.0min)、波峰d代表紫錐菊苷(22.4min)、波峰e代表菊苣酸(25.1min)。
圖1B係為本發明紫錐花的水萃取物的HPLC層析圖譜，偵測波長為260nm；圖中波峰f代表烷醯胺8/9(39.4min)。
圖2係為本發明丹蔘的70%乙醇萃取物的HPLC層析圖譜，偵測波長為270nm；圖中波峰g代表丹參酚酸B(14.92min)、波峰h代表丹參酮I及隱丹參酮(39.04min)、波峰i代表丹參酮IIA(44.5min)。
圖3A顯示本發明紫錐花地上部的水萃取物(簡稱EPA-W)對人類腺病毒3型的抗病毒效果。
圖3B顯示本發明EPA-W對腸病毒71型的抗病毒效果。
圖3C顯示本發明丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物(簡稱SMf-2-E)對人類腺病毒3型的抗病毒效果。
圖3D顯示SMf-2-E對腸病毒71型的抗病毒效果。
圖4A顯示EPA-W與SMf-2-E依重量比3：7混合所得抗病毒組合物對人類腺病毒3型的抗病毒效果。
圖4B顯示EPA-W與SMf-2-E依重量比3：7混合所得抗病毒組合物對腸病毒71型的抗病毒效果。
圖5A顯示EPA-W對人類腺病毒3型的病毒滅殺效果。
圖5B顯示SMf-2-E對人類腺病毒3型的病毒滅殺效果。
圖5C顯示EPA-W對腸病毒71型的病毒滅殺效果。
圖5D顯示SMf-2-E對腸病毒71型的病毒滅殺效果。
圖6A顯示EPA-W對人類腺病毒3型吸附Vero細胞的抑制效果。
圖6B顯示EPA-W對腸病毒71型吸附Vero細胞的抑制效果。
圖6C顯示SMf-2-E對人類腺病毒3型吸附Vero細胞的抑制效果
圖6D顯示SMf-2-E對腸病毒71型吸附Vero細胞的抑制效果。
圖7A顯示EPA-W(10μg/mL)對人類腺病毒3型穿透Vero細胞的抑制效果。
圖7B顯示EPA-W(200μg/mL)對腸病毒71型穿透Vero細胞的抑制效果。
圖7C顯示SMf-2-E(10μg/mL)對人類腺病毒3型穿透Vero細胞的抑制效果。
圖7D顯示SMf-2-E(50μg/mL)對腸病毒71型穿透Vero細胞的抑制效果。
本發明提供一種植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途，其中該植物萃取物包含一紫錐花萃取物、一丹蔘萃取物、或其組合，該病毒包含腸病毒及腺病毒。本發明亦提供一種前述抗病毒組合物的製備方法。以下實施例 係舉例說明以水或醇水混合物對紫錐花及丹蔘進行萃取的方法，並藉由病毒蝕斑試驗(plaque assay)及細胞毒性試驗(cytotoxicity assay)分別驗證紫錐花萃取物、丹蔘萃取物、或其不同比例組合之抗病毒效果及不具細胞毒性。此外，病毒滅殺試驗(virucidal assay)、吸附試驗(attachment assay)、及穿透試驗(penetration assay)的結果顯示本發明抗病毒組合物的抗病毒機制包括紫錐花萃取物可滅殺腺病毒、抑制腺病毒與腸病毒吸附細胞、及抑制腺病毒穿透細胞，且丹蔘萃取物可抑制腺病毒與腸病毒吸附細胞及抑制腺病毒與腸病毒穿透細胞。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文中所謂「水萃取物」係指以水為溶劑對片狀、塊狀、粒狀、或粉末狀之植物原料進行萃取而獲得的組合物，其最終形態可為液體或固體。
本文中所謂「%醇萃取物」係指以醇水混合物為溶劑對片狀、塊狀、粒狀、或粉末狀之植物原料進行萃取而獲得的組合物，其最終形態可為液體或固體。
材料及方法 細胞培養
本發明實施例中使用細胞包含購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)的非洲綠猴腎臟上皮的Vero細胞(ATCC CCL-81)、人類肺腺癌細胞株A549(ATCC CCL-185)、及人類橫紋肌細胞瘤細胞株RD(ATCC CCL-136)。Vero細胞及A549細胞培養於添加Earle’s平衡鹽(Earle’s Balanced Salts)、10%熱滅活胎牛血清(fetal bovine serum，簡稱FBS)、及1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素溶液之最低基本培養基(Minimum Essential Medium，HyClone)。RD細胞培養於添加10% FBS及1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素溶液之DMEM培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，HyClone)。所有細胞皆在37℃、含有5%二氧化碳之濕潤空氣中進行培養。
病毒製備
人類腺病毒3型及腸病毒71型之2847株(HQ283527)係分離自臺灣的臨床樣本。人類腺病毒3型及腸病毒71型係依下列步驟分別以A549細胞及 RD細胞複製擴增。首先，細胞滿度達到約80-90%時移除培養基，以磷酸緩衝鹽溶液(簡稱PBS溶液；137mM氯化鈉，2.7mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，1.8mM磷酸二氫鉀，pH7.4)潤洗細胞一次，再加入稀釋過的病毒液，使病毒液均勻覆蓋所有細胞，於細胞培養箱中(37℃、5%二氧化碳)感染2小時，期間每30分鐘搖晃一次細胞培養瓶。前述感染後移除病毒液，以PBS溶液潤洗細胞一次，再加入含2% FBS的完全培養基(complete medium)，於細胞培養箱中(37℃、5%二氧化碳)培養細胞至超過70%細胞呈現細胞病變(cytopathic effect)。其後，以離心方式(2500rpm、4℃、20分鐘)收集受病毒感染之細胞及上清液。使用液態氮和37℃水浴槽對該細胞及少許上清液進行冷凍溶解3次以破壞細胞並釋放細胞內病毒顆粒，再以離心方式(2500rpm、4℃、20分鐘)收集細胞裂解液的上清液，使其與前次離心所得上清液混合，即製備得含有病毒顆粒之病毒液。病毒液之效價(titer)係以Vero細胞的病毒蝕斑試驗加以測定，表示方式為每毫升(mL)之病毒蝕斑形成單位(plaque forming unit，PFU)。庫存病毒儲存於-80℃備用。
病毒蝕斑試驗
本發明實施例使用病毒蝕斑減少試驗(plaque reduction assay)測試植物萃取物的抗病毒活性。簡言之，將Vero細胞依4×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，在37℃、5%二氧化碳的條件下隔夜培養。隔天，將50-100PFU病毒與不同稀釋倍數之植物萃取物混合至總體積為500μL並在37℃下作用2小時，再將該混合物逐孔加入前述6孔培養盤中的Vero細胞，於37℃下再培養2小時。其後，移除6孔培養盤內的混合物，將含有2% FBS、1%2-[4-(羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，簡稱HEPES)、1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素、及3%洋菜之2mL最低基本培養基添加至各孔。該6孔培養盤置於37℃下培養5-7天後，加入10%甲醛(formaldehyde)固定細胞至少1小時，並以0.05%結晶紫對細胞染色以計數病毒蝕斑。植物萃取物對病毒複製的抑制效力依下列公式計算：[1-(VD/VC)]×100%
VD：經植物萃取物處理的病毒蝕斑數目
VC：未經植物萃取物處理的病毒蝕斑數目
病毒蝕斑數目減少50%及90%所需的植物萃取物濃度分別表示為IC50及IC90，可由病毒蝕斑試驗的劑量反應曲線經迴歸分析計算而得。
細胞毒性試驗及選擇指數(selective index，SI)
本發明實施例使用2,3-雙(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2氫-四唑-5-甲醯胺內鹽(2,3-Bis-[2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl]-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide inner salt，簡稱XTT內鹽)進行細胞毒性試驗以探討植物萃取物對細胞存活率的影響，操作簡述如下。將Vero細胞依3×104個細胞/孔接種於96孔培養盤，在37℃、5%二氧化碳的條件下隔夜培養。隔天，依100μL/孔加入不同稀釋倍數之植物萃取物。該96孔培養盤置於37℃下培養2天後，將相當於20%培養基體積之現配XTT溶液加入。該96孔培養盤在37℃下培養3小時後，測定各孔在波長450nm及650nm的吸光值，以在450nm的吸光值扣除在650nm的背景吸光值計算得待測物或溶劑對照物的吸光值，再依下列細胞毒性比例公式計算不同濃度植物萃取物的細胞毒性：[1-(At/As)]×100%
At：待測物的吸光值
As：溶劑對照物的吸光值
由前述細胞毒性比例可推算出植物萃取物的半數細胞毒性濃度(50% cytotoxicity concentration，CC50)，其定義為使細胞存活率降低50%所需的植物萃取物濃度。選擇指數之值為CC50/IC50。
病毒滅殺試驗
病毒滅殺試驗係依據Cheng等人(Cheng HY,Lin TC,Yang CM,Wang KC,Lin LT,Lin CC,J Antimicrob Chemother.2004 Apr；53(4)：577-83)的方法進行並略做修改。將含有人類腺病毒3型或腸病毒71型之病毒液與不同濃度的植物萃取物在37℃下混合2小時，再以病毒蝕斑試驗測定各該混合物的殘餘感染力。
吸附試驗
吸附試驗係依據Cheng等人(Cheng HY,Lin TC,Yang CM,Wang KC,Lin LT,Lin CC,J Antimicrob Chemother.2004 Apr；53(4)：577-83)的方法進行並略做修改。為了檢驗植物萃取物是否影響病毒吸附，在添加或未添加經連續 稀釋之植物萃取物的情況下，以病毒感染在4℃下預冷1小時之單層Vero細胞，其係依4×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，並在4℃下培養細胞2小時。其後，以低溫的PBS溶液清洗該受感染之單層Vero細胞3次。前述細胞以含有2% FBS、1% HEPES、1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素、及3%洋菜之最低基本培養基覆蓋，於37℃下培養5-7天，再依病毒蝕斑試驗計算植物萃取物對病毒吸附的抑制效力。
穿透試驗
穿透試驗係依據Cheng等人(Cheng HY,Lin TC,Yang CM,Wang KC,Lin LT,Lin CC,J Antimicrob Chemother.2004 Apr；53(4)：577-83)的方法進行並略做修改。為了檢驗植物萃取物是否影響病毒侵入細胞，先以病毒感染在4℃下預冷1小時之單層Vero細胞，其係依4×105個細胞/孔接種於6孔培養盤，並在4℃下培養細胞2小時以利病毒吸附。其後，將植物萃取物添加至受感染之單層Vero細胞，控制組細胞未添加植物萃取物，接著在37℃下進行培養以使病毒的穿透力最大化。每隔10分鐘利用酸性PBS溶液(pH 3)處理該受感染之單層Vero細胞1分鐘，以使未穿透細胞之病毒失活，再立即添加pH 11的PBS溶液以中和該酸性PBS溶液。移除該中和的PBS溶液後，該細胞以含有2% FBS、1% HEPES、1%青黴素-鏈黴素-兩性黴素、及3%洋菜之最低基本培養基覆蓋，於37℃下培養5-7天，再依病毒蝕斑試驗計算植物萃取物對病毒穿透的抑制效力。
實施例1 植物萃取物之製備及指標成分分析 1.1製備方法
本實施例舉例說明本發明用於製備抗病毒組合物之植物萃取物之製備方法。紫錐花萃取物及丹蔘萃取物係以水或醇水混合物為萃取溶劑。文中所謂醇水混合物係指各種醇類與水的混合物，如甲醇水溶液、乙醇水溶液、2-丙醇水溶液，其中，該醇類相對於該醇水混合物的體積比(v/v)可為1-95%。不同種類植物之萃取物有相似的製備方法，下方以紫錐花的水萃取物及丹蔘的70%乙醇萃取物為例，說明該二種植物的水萃取物或醇萃取物的製備步驟。
為製備紫錐花的水萃取物，首先將紫錐花的地上部或根部在45-50℃下烘乾至含水量約為8-12%，並將其粉碎為粒徑約10公分至60目(mesh)的顆粒。進行萃取時，將顆粒狀紫錐花原料與水依重量比1：5至1：20混合，較 佳為依重量比1：10混合。萃取溫度首先上升至95℃以上以滅菌，而後自然降溫至60-80℃萃取2小時，共萃取2次，即可獲得紫錐花的水萃取物。該萃取物可進一步過濾及在60-70℃進行減壓濃縮，於此例中濃縮液的固形物含量約為38%。經此萃取步驟，約可萃取出15-20%紫錐花原料(依乾重計)。
為製備丹蔘的70%乙醇萃取物，首先將新鮮丹蔘的根部或根莖清洗及切成薄片。將薄片狀丹蔘原料與70%乙醇水溶液依1：5至1：10之重量體積比(w/v)混合，較佳為依1：8之重量體積比混合，在10-60℃，較佳為40-50℃下萃取1-2天，共萃取2次，即可獲得丹蔘的70%乙醇萃取物。該萃取物可進一步過濾及濃縮，於此例中濃縮液的固形物含量約為1.14%(w/w)。經此萃取步驟，約可萃取出10-15%丹蔘原料(依乾重計)。
1.2指標成分分析
為辨識紫錐花萃取物的組成，利用高效液相層析(high performance liquid chromatography，簡稱HPLC)系統對實施例1.1中紫錐花的水萃取物進行指標成分分析，標準品包括菊苣酸(cichoric acid)、咖啡它酸(caftaric acid)、綠櫞酸(chlorogenic acid)、洋薊酸(cynarin)、紫錐菊苷(echinacoside)等酚類化合物(phenolic compounds)及烷醯胺8/9(alkamides 8/9)。該HPLC系統包含Hitachi L-7100幫浦配備L-7400偵測器及逆相層析管柱Mightysil RP-18GP250-4.6、5μm(Kanto Chemical Co.)。進行分析時，依表1之梯度程式混合0.1%磷酸水溶液與甲醇作為移動相，流速為1.0mL/min，管柱溫度為35℃，酚類化合物及烷醯胺之偵測波長分別為330nm及260nm。同時，依據公定分析化學家協會(Association of Official Analytical communities，AOAC)所發表988.12「粗製蔗糖中糊精dextran」的酚硫酸分析法，對紫錐花的水萃取物進行多醣體的萃取分析。以糊精(dextrin)作為多醣體標準品，秤取不同量之後，與蒸餾水混合形成總體積各為400μL的多種濃度糊精溶液，分別與100μL(5%)試藥級酚溶液混和，再分別加入1mL濃硫酸(95-98%)並快速混合，以沸水隔水加熱2分鐘，待反應液冷卻到室溫後利用全波長微量免疫分析儀以波長485nm分析。
圖1A及圖1B分別顯示本發明紫錐花的水萃取物的HPLC層析圖譜。依據前述酚類化合物及烷醯胺8/9標準品(溶於70%甲醇)的標準曲線及圖1A-1B可得定量結果如表2。由表2可知，紫錐花的水萃取物包含8911μg/mL菊苣酸，6470μg/mL咖啡它酸，62μg/mL烷醯胺，以及9585μg/mL多醣體。
為辨識丹蔘萃取物的組成，同樣利用HPLC系統對實施例1.1中丹蔘的70%乙醇萃取物進行指標成分分析，標準品包括丹蔘酚酸B(Salvianolic acid B)、丹蔘酮I(Tanshinone I)與隱丹蔘酮(Cryptotanshinone)、及丹蔘酮IIA(Tanshinone IIA)。進行分析時，依表3之梯度程式混合0.25%醋酸水溶液與甲醇作為移動相(pH 2.77)，流速為0.5mL/min，管柱溫度為40℃，偵測波長為270nm。
圖2顯示本發明丹蔘的70%乙醇萃取物的HPLC層析圖譜。依據丹蔘酚酸類(溶於70%甲醇)及丹蔘酮類標準品(溶於丙酮)的標準曲線及圖2可得定量結果如表4。
實施例2 紫錐花萃取物與丹蔘萃取物之抗病毒活性
本實施例以人類腺病毒3型及腸病毒71型為例示，說明本發明紫錐花萃取物及丹蔘萃取物對抗腺病毒與腸病毒之效用。藉由病毒蝕斑試驗，研究人員自上百種植物萃取物中篩選出對人類腺病毒3型及腸病毒71型具有最佳抗病毒活性的植物萃取物是紫錐花萃取物及丹蔘萃取物。
圖3A-3B分別顯示本發明紫錐花地上部的水萃取物(簡稱EPA-W)對人類腺病毒3型及腸病毒71型的抗病毒效果；圖3C-3D分別顯示本發明丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物(簡稱SMf-2-E)對人類腺病毒3型及腸病毒71型的抗病毒效果。針對圖3A-3D之劑量反應曲線進行迴歸分析可計算得使病毒蝕斑數目減少50%及90%所需的該些萃取物之最小濃度，即IC50與IC90。
表5顯示紫錐花及丹蔘的多種萃取物對抗人類腺病毒3型及腸病毒71型之IC50與IC90數值。表5所列紫錐花萃取物包括紫錐花地上部的水萃取物(簡稱EPA-W)、紫錐花地上部的70%乙醇萃取物(簡稱EPA-E)、紫錐花根部的70%乙醇萃取物(簡稱EPR-E)、及紫錐花根部的二氧化碳超臨界流體萃取物(簡稱EPR-C)；丹蔘萃取物包括丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物(簡稱SMf-2-E)及丹蔘根部及根莖的水萃取物(簡稱SMf-W)。依據表5，丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物具有最低的抗人類腺病毒3型與抗腸病毒71型之IC50，其值分別為3.4μg/mL及8.3μg/mL；紫錐花地上部的水萃取物具有次低的抗人類腺病毒3型與抗腸病毒71型之IC50，其值分別為4.6μg/mL及82.2μg/mL。此結果顯示不論溶劑為水或醇水混合物，紫錐花萃取物與丹蔘萃取物皆具備對抗腺病毒與腸病毒之功效，其中以紫錐花地上部的水萃取物及丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物表現出最佳的抗病毒效果。
在細胞毒性試驗中，表5之所有紫錐花萃取物在濃度為1500μg/mL的情況下皆未顯示細胞毒性，且表5之所有丹蔘萃取物在濃度為200μg/mL的情況下皆未顯示細胞毒性。因此，該些萃取物具備高選擇指數，適合用於預防及治療腺病毒與腸病毒感染所引發的疾病及緩和相關症狀。
實施例3 含紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物之組合物之抗病毒活性
本實施例進一步以病毒蝕斑試驗驗證本發明紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物依不同比例組合之抗病毒活性。表6顯示紫錐花地上部的水萃取物(簡稱EPA-W)與丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物(簡稱SMf-2-E)之不同比例組合物對抗人類腺病毒3型與腸病毒71型之效果。依據表6，EPA-W與SMf-2-E依重量比1：9至9：1之比例混合所得之組合物皆具有相當低的抗人類腺病毒3型與抗腸病毒71型之IC50與IC90。當EPA-W與SMf-2-E依重量比3：7混合，所得組合物對人類腺病毒3型及腸病毒71型的抗病毒效果分別如圖4A及圖4B所示。該組合物在表6中具有抗腸病毒71型之最低IC50與IC90，以及抗人類腺病毒3型之次低IC50與最低IC90。該些結果顯示將紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物依特定比例混合可製備對腸病毒與腺病毒皆有極佳抑制效果之抗病毒組合物。
實施例4 含紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物之組合物之抗腺病毒活性
本實施例以病毒蝕斑試驗評估本發明紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物之組合對抗不同種類腺病毒之活性。表7顯示紫錐花地上部的水萃取物與丹蔘根部及根莖的70%乙醇萃取物依重量比3：7混合後，所得組合物對抗人類腺病毒1、2、3、4、7型之效果。依據表7，對於多種人類腺病毒，前述組合物皆呈現相當低的IC50與IC90，再次證實本發明將紫錐花的水萃取物與丹蔘的乙醇萃取物依特定比例混合，可製備對腺病毒具有極佳抑制效果之抗病毒組合物。
實施例5 紫錐花萃取物與丹蔘萃取物之病毒滅殺效果
以下實施例5-7係探討本發明紫錐花萃取物與丹蔘萃取物之抗病毒機制。本實施例以人類腺病毒3型及腸病毒71型為例，利用病毒滅殺試驗測試紫錐花萃取物與丹蔘萃取物的病毒滅殺效果。實驗時，將106PFU之人類腺病毒3型或107PFU之腸病毒71型與不同濃度的EPA-W或SMf-2-E在37℃下混合2小時，並以再以病毒蝕斑試驗測定各該混合物的殘餘感染力。
圖5A及圖5B分別顯示EPA-W與SMf-2-E對人類腺病毒3型的病毒滅殺效果。依據圖5A，濃度為50μg/mL以上的EPA-W具有滅殺人類腺病毒3型的效果。依據圖5B，濃度為100μg/mL以上的SMf-2-E具有滅殺人類腺病毒3型的效果。有鑑於EPA-W對抗人類腺病毒3型之IC50為3.4μg/mL及SMf-2-E對抗人類腺病毒3型之IC50為4.6μg/mL(見表5)，此結果顯示紫錐花萃取物對人類腺病毒3型具有部分的滅殺效力，但丹蔘萃取物對人類腺病毒3型僅有少許滅殺效力。
圖5C及圖5D分別顯示EPA-W與SMf-2-E對腸病毒71型的病毒滅殺效果。依據圖5C-5D，濃度為1000μg/mL以上的EPA-W以及濃度為200μg/mL以上的SMf-2-E皆不具有滅殺腸病毒71型的效果。有鑑於EPA-W對抗腸病毒71型之IC50為82.2μg/mL及SMf-2-E對抗腸病毒71型之IC50僅為8.3μg/mL(見表5)，此結果顯示紫錐花萃取物與丹蔘萃取物並非透過直接滅殺病毒的方式造成抗腸病毒71型的效果。
實施例6 紫錐花萃取物與丹蔘萃取物對病毒吸附的影響
本實施例以人類腺病毒3型及腸病毒71型為例，利用吸附試驗測試紫錐花萃取物與丹蔘萃取物是否影響病毒對宿主細胞的吸附，其結果如圖6A-6D所示。進行人類腺病毒3型之吸附試驗時，在添加或未添加經連續稀釋之EPA-W或SMf-2-E的情況下，將病毒依200PFU/孔接種於單層Vero細胞。進行腸病毒71型之吸附試驗時，在添加或未添加經連續稀釋之EPA-W或SMf-2-E的情況下，將病毒依100PFU/孔接種於單層Vero細胞。
依據圖6A-6B，EPA-W能抑制人類腺病毒3型及腸病毒71型對Vero細胞的吸附。依據圖6C-6D，SMf-2-E對於人類腺病毒3型吸附Vero細胞表現出些許抑制效果，然其能有效抑制腸病毒71型之吸附。此結果顯示紫錐花萃取物與丹蔘萃取物皆能抑制腺病毒與腸病毒吸附細胞，並因此具備顯著的抗病毒活性。
實施例7 紫錐花萃取物與丹蔘萃取物對病毒侵入細胞的影響
本實施例以人類腺病毒3型及腸病毒71型為例，利用穿透試驗測試紫錐花萃取物與丹蔘萃取物是否影響病毒穿透或侵入宿主細胞。依據圖5A-5D，20μg/mL的EPA-W及50μg/mL的SMf-2-E對人類腺病毒3型沒有顯著滅殺作用，且1000μg/mL的EPA-W及200μg/mL的SMf-2-E對腸病毒71型沒有顯著滅殺作用。因此，進行人類腺病毒3型之穿透試驗時，EPA-W的使用濃度小於或等於20μg/mL，且SMf-2-E的使用濃度小於或等於50μg/mL；進行腸病毒71型之穿透試驗時，EPA-W的使用濃度小於或等於1000μg/mL，且SMf-2-E的使用濃度小 於或等於200μg/mL。穿透試驗中以200PFU之人類腺病毒3型及100PFU之腸病毒71型分別感染Vero細胞。
圖7A及圖7B分別顯示濃度為10μg/mL的EPA-W對人類腺病毒3型及濃度為200μg/mL的EPA-W對腸病毒71型的細胞穿透抑制效果。圖7C及圖7D分別顯示濃度為10μg/mL的SMf-2-E對人類腺病毒3型及濃度為50μg/mL的SMf-2-E對腸病毒71型的細胞穿透抑制效果。各該萃取物對病毒穿透細胞的抑制效果係在其添加至細胞10分鐘後由觀察結果決定。依據圖7A，EPA-W對人類腺病毒3型穿透細胞有部分抑制效力，約達35%。依據圖7C，SMf-2-E對人類腺病毒3型穿透細胞亦有部分抑制效力。依據圖7D，SMf-2-E能抑制腸病毒71型穿透細胞，且此抑制效力(約80%)在SMf-2-E添加至細胞後10分鐘後即可觀察到。此結果顯示紫錐花萃取物與丹蔘萃取物皆能透過抑制腺病毒或腸病毒穿透或侵入細胞達到抗病毒效果。
承上述實施例5-7之實驗結果，紫錐花萃取物對腺病毒之抗病毒機制主要為抑制病毒吸附細胞，以及部分的病毒滅殺作用與抑制病毒穿透細胞；其對腸病毒之抗病毒機制主要為抑制病毒吸附細胞。丹蔘萃取物對腸病毒之抗病毒機制主要為抑制病毒穿透，以及部份的抑制病毒吸附細胞；其對腺病毒之抗病毒機制包含抑制病毒吸附及穿透細胞。
綜上所述，本發明利用紫錐花萃取物、丹蔘萃取物、或其組合製備一種能有效抑制腺病毒及腸病毒感染的抗病毒組台物。該抗病毒組合物可藉由滅殺腺病毒、抑制腺病毒與腸病毒吸附與穿透宿主細胞等方式降低腺病毒與腸病毒感染率，並且具備預防及治療一個體因腺病毒與腸病毒感染所引發病症的潛力。因此，本發明所提供植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途及該抗病毒組合物之製備方法確具產業上之利用價值。

Claims (21)

  1. 一種植物萃取物用於製備抗病毒組合物之用途，其中該植物萃取物包含一紫錐花水萃取物、一丹蔘萃取物、或其組合，且該病毒包含一腺病毒。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該病毒進一步包含一腸病毒。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該腺病毒為人類腺病毒1型、2型、3型、4型、或7型，該腸病毒為腸病毒71型。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該紫錐花水萃取物係萃取一乾燥紫錐花的地上部。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該丹蔘萃取物係以水或一醇水混合物萃取一丹蔘而製得。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該丹蔘萃取物係萃取一丹蔘的根部或根莖。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中該醇水混合物包含1-95%(v/v)之乙醇。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該植物萃取物包含該紫錐花水萃取物與一丹蔘的70%乙醇萃取物，其重量比為1：9至9：1。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之用途，其中該紫錐花水萃取物與該丹蔘的70%乙醇萃取物之重量比為3：7。
  10. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該紫錐花水萃取物係抑制該腺病毒及該腸病毒吸附一細胞。
  11. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該紫錐花水萃取物係抑制該腺病毒穿透一細胞。
  12. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該紫錐花水萃取物係滅殺該腺病毒。
  13. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該丹蔘萃取物係抑制該腺病毒及該腸病毒吸附一細胞。
  14. 如申請專利範圍第2項所述之用途，其中該丹蔘萃取物係抑制該腺病毒及該腸病毒穿透一細胞。
  15. 一種對抗腺病毒及腸病毒之抗病毒組合物之製備方法，包含如下步驟：(a)以水萃取一紫錐花而獲得一紫錐花水萃取物；(b)以水或一醇水混合物萃取一丹蔘而獲得一丹蔘萃取物；以及(c)以一特定比例混合該紫錐花水萃取物與該丹蔘萃取物而獲得一抗病毒組合物。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之製備方法，其中步驟(a)的萃取起始溫度為95℃以上，而後降溫至60-80℃。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之製備方法，其中步驟(a)係以水萃取一乾燥紫錐花，該乾燥紫錐花與水之重量比為1：5至1：20。
  18. 如申請專利範圍第15項所述之製備方法，其中步驟(b)係以一70%乙醇水溶液進行萃取，萃取溫度為10-60℃。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之製備方法，其中步驟(b)之該丹蔘與該70%乙醇水溶液之重量比為1：5至1：10。
  20. 如申請專利範圍第15項所述之製備方法，其中步驟(c)之該特定比例係該紫錐花水萃取物與一丹蔘的70%乙醇萃取物的重量比為1：9至9：1。
  21. 如申請專利範圍第20項所述之製備方法，其中步驟(c)之該特定比例係該紫錐花水萃取物與該丹蔘的70%乙醇萃取物的重量比為3：7。
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